JP2022521363A - 芳香族ニトロ化合物の還元方法 - Google Patents

Abstract

芳香族ニトロ化合物を還元する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）芳香族ニトロ化合物を触媒と接触させる工程を含み、触媒は、（ａ）不均化剤及び（ｂ）生体触媒を含む。本方法で使用するための生体触媒、芳香族ニトロ化合物を還元するための触媒としての（ａ）不均化剤及び（ｂ）生体触媒の使用、並びに（ａ）不均化剤及び（ｂ）生体触媒を含むキットもまた開示される。【選択図】図２Ａ

Description

本発明は、不均化剤及び生体触媒を含む触媒を使用して基質を還元する方法、基質を還元するための触媒の使用、及び触媒を含むキットに関する。本発明はまた、本方法で使用するための生体触媒にも関する。

芳香族ニトロ化合物の還元は、化学産業、医薬品産業、及び農業化学産業において必須の中間体である、芳香族アミン化合物の製造のための迅速かつ効率的な方法として注目されている。しかしながら、還元プロセスは複雑である。概ね受け入れられている機構は、スキーム１に示されるように、電気化学モデルに基づく。このモデルによれば、２つの並行化学経路が、アミン生成物へのニトロ出発物質の変換に関与する（Ｈａｂｅｒ）。

主要経路は、ニトロ基２をニトロソ基７、ヒドロキシルアミン３、及び最終的にアミン官能基１に段階的に還元することを伴う。３つの工程は異なる速度を有し、ヒドロキシルアミン３の還元が最も遅い工程である。これにより、ヒドロキシルアミン３の中間体が著しく蓄積される。

並行経路は縮合経路を伴い、この縮合経路では、ニトロソ７とヒドロキシルアミン３中間体との間の縮合によってアゾキシ中間体６が形成される。アゾキシ中間体６は、アゾ化合物４、ヒドラゾ化合物５、及び最終的にアミン生成物１に段階的に還元される。

芳香族ニトロ化合物を芳香族アミン化合物に還元するための工業的に好ましい方法は、担持金属触媒を用いて高圧で水素ガスを使用する触媒的水素化法である。典型的な水素化触媒としては、Ｐｄ／Ｃ又はＰｄ／Ａｌ_２Ｏ_３（Ｈｏｏｇｅｎｒａａｄ ａｔ ａｌ．）が挙げられる。加えて、市販配合物のＮｉ（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ａｕ／ＴｉＯ_２及びＡｕ／Ｆｅ_２Ｏ_３などの担持ナノ粒子（Ｃｏｒｍａ ａｎｄ Ｓｅｒｎａ）、又は市販の硫化Ｐｔ触媒（Ｋａｓｐａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．；Ｂｏｙｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．）が既知である。触媒的移動水素化法は、ＮａＢＨ_４、ヒドラジン水和物又はギ酸を使用して、水素ガスをｉｎ ｓｉｔｕ生成することにより、高圧で水素ガスを取り扱うための特殊な装置を必要としない（Ｋａｄａｍ ｅｔ ａｌ．）。

改善された触媒的水素化法は、Ｓｔｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｕｄｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ）により開発され、触媒量のバナジウム化合物が、貴金属、ニッケル、又はコバルト水素化触媒と組み合わせて使用される。バナジウム化合物は、ヒドロキシルアミン３のアニリン１及びニトロソ７への不均化を促進すると考えられる。

しかしながら、触媒化学還元法では、生成物と有機廃棄物流との両方において残留金属汚染が存在することが大きな懸念事項である。

残留金属汚染は、金属を使用しない還元戦略を開発することで防止することができる。しかし、これらの方法は、通常、反応時間が長く、高温を使用するという問題がある（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．）。

芳香族ニトロ化合物を芳香族アミン化合物に還元する代替の方法は、フラビン依存性ニトロ還元酵素（ＮＲ）の使用である。フラビン依存性ニトロ還元酵素（ＮＲ）は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、又は他のフラビンなどのフラビン補因子の汎用性を利用して、広範囲の芳香族ニトロ化合物を還元できる酵素である。ある程度までは、ニトロ還元酵素と同じフラビン補因子を共有するバクテリアのエン酸還元酵素も、芳香族ニトロ基を還元することができる（Ｔｏｏｇｏｏｄ ａｎｄ Ｓｃｒｕｔｔｏｎ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ）。

しかし、ニトロ還元酵素を用いて芳香族ニトロ化合物を還元しようとするこれまでの試みは、中程度の成功にとどまり、所望のアミンへの完全な変換は依然として研究者を悩ませている（Ｈｏｏｇｅｎｒａａｄ ａｔ ａｌ；Ｐｉｔｓａｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｙａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．）。概して、ニトロ還元酵素は、対応するヒドロキシルアミン３への芳香族ニトロ化合物２の還元を触媒することができるだけである。加えて、これらの反応性中間体は、一連の副生成物を蓄積し、形成し、生体触媒プロセスの効率を低下させる。非常に稀な場合、還元は芳香族アミン１に進むことがあるが、これは、関与する特定の基質に非常に依存する（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）。

したがって、芳香族ニトロ化合物の還元は、水素化の程度の効率的な制御、及び他の官能基の存在下でのニトロ基の選択的水素化が依然として大きな課題となっている。

本発明者らは、芳香族ニトロ化合物を還元するための触媒法を開発し、この方法では、生体触媒によるニトロ還元後に生成されたヒドロキシルアミンが、不均化剤によって触媒される不均化サイクルに速やかに入り、最終的な芳香族アミン生成物が蓄積される。この方法は、様々な基質で実証され、反応の強化（スケールアップ）も実証された。

本発明の第１の態様では、芳香族ニトロ化合物を還元する方法であって、
（ｉ）芳香族ニトロ化合物を触媒と接触させる工程であって、
該触媒が、
（ａ）不均化剤、及び
（ｂ）生体触媒を含む、
工程を含む、方法が提供される。

不均化剤は、金属、具体的には、第３族～第１３族から選択される金属、より好ましくは、第３族～第１２族から選択される遷移金属を含み得る。

不均化剤は、第５族～第１１族、好ましくは第５族から選択される金属を含み得る。

不均化剤は、バナジウム、クロム、モリブデン、鉄、コバルト、ニッケル、又は銅から選択される金属、好ましくは、バナジウム、モリブデン、鉄、コバルト、又は銅から選択される金属、より好ましくはバナジウムを含んでもよい。

不均化剤は、ＣｕＣｌ_２、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２、Ｃｕ_２Ｏ、Ｃｕ（０）（銅金属）、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＣｌ_３、Ｆｅ（ａｃａｃ）_３、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＳＯ_４、Ｆｅ（０）（鉄金属）、ＮａＭｏＯ_４、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、Ｖ（ａｃａｃ）_３、Ｖ_２Ｏ_５、Ｖ（０）（バナジウム金属）、及びＣｏＣｌ_２から選択されてもよい。好ましくは、不均化剤は、ＣｕＣｌ_２、ＦｅＣｌ_２、ＮａＭｏＯ_４、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、Ｖ（ａｃａｃ）_３、Ｖ_２Ｏ_５、及びＣｏＣｌ_２から選択される。より好ましくは、不均化剤は、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、及びＶ_２Ｏ_５から選択される。

生体触媒は、芳香族ニトロ化合物の芳香族ヒドロキシルアミン化合物への還元を触媒することができるポリペプチドであってもよく、又はこれを含んでもよい。任意選択的に、この生体触媒は、芳香族アミン化合物への芳香族ニトロ化合物の還元を触媒することができるポリペプチドであるか、又はそれを含む。

生体触媒は、酸化還元酵素であってもよい。好ましくは、生体触媒は、ニトロ還元酵素である。

生体触媒は、ＧＯ：００１６４９１に属するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよい。好ましくは、生体触媒は、ＧＯ：００１６６５７に属するポリペプチドであるか、又はそれを含む。

生体触媒は、ＥＣ １．Ｘ．Ｘ．Ｘに属するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよく、式中、Ｘは任意のサブファミリーを示す。任意選択的に、この生体触媒は、ＥＣ １．５．１．Ｘ、１．６．９９．Ｘ、又はＥＣ １．３．１．Ｘに属するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよく、式中、Ｘは任意のサブクラスを示す。

生体触媒は、ＣＡＴＨスーパーファミリー３．４０．１０９．１０、３．２０．２０．７０、又は３．４０．５０．３６０に属するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよい。

生体触媒は、ＰＦ００７２４、ＰＦ００８８１、又はＰＦ０２５２５に属するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよい。好ましくは、生体触媒は、ＰＦ００８８１に属するポリペプチドであるか、又はそれを含む。

生体触媒は、以下の配列モチーフ（１）：
（１）Ａ－ｘ（３，４）－Ｇ－ｘ－［ＡＤＥＧＱＳＴ］－ｘ（４）－［ＡＤＥＧＮＱＳＴ］－［ＡＥＧＮＱＳＴ］
［式中、
ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
ｘ（ｎ）は、長さｎの任意のアミノ酸残基からなるセグメントを表し、
［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、
アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって表される］
を有するポリペプチであってもよく、又はそれを含んでもよい。

生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］の
５、３９、４０、４１、４２、６４、６５、６７、１１２、１３２、１３５、１３６、１３８、２２０、２２４、２２９、２３０
に対応する位置に配列番号１［ＮＲ－４］のものと類似又は同一の少なくとも９個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよい。

生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］の
１３、１５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、６４、６５、６７、６９、１０４、１１２、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１７２、２２０、２２１、２２４、２２５、２２９、２３０、２３３
に対応する位置に配列番号１［ＮＲ－４］のものと類似又は同一の少なくとも１５個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよい。

生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも５０％の類似性又は同一性を有し、配列番号１［ＮＲ－４］の以下の位置に対応する残基に以下のアミノ酸を有するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよい：
４１ ［ＳＩＭＶＡＨＮＴＷＬ］；
１３６ ［ＧＳＡＮ］；
２２４ ［ＫＡＴＹＦＲＥＧＩＱＶ］；
２２９ ［ＳＫＲＹＡＱＣＧＨＮＴＶ］；
２３０ ［ＲＫＹＥ］
［式中、
［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、
アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって表される］。

生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］、２［ＮＲ－１４］、３［ＮＲ－１７］、又は４［ＮＲ－２４］と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、又はそれを含んでもよい。

本方法は、芳香族ニトロ化合物を還元して芳香族ヒドロキシルアミン化合物を生成する方法であってもよい。

本方法は、芳香族ニトロ化合物を還元して芳香族アミン化合物を生成する方法であってもよい。

本方法は、生成物を単離する工程を更に含んでもよい。

本方法は、触媒を単離する工程を更に含んでもよい。

本方法は、生体触媒を補基質と接触させる工程を更に含んでもよい。

補基質は補因子であってもよく、本方法は、還元型補因子再生系を使用して補因子を再生する工程を更に含んでもよい。

芳香族ニトロ化合物を触媒と接触させる工程は、芳香族ニトロ化合物の独立した部分を触媒に添加することを含んでもよい。

芳香族ニトロ化合物を触媒と接触させる工程は、芳香族ニトロ化合物を触媒に連続的に添加することを含んでもよい。

温度は、０～１００℃、好ましくは１０～８０℃、より好ましくは２０～４５℃、更により好ましくは２０～３５℃の範囲に維持され得る。

ｐＨは、３．０～１０．０、好ましくは５．０～９．０、より好ましくは６．５～８．０の範囲に維持され得る。

本発明の更なる態様では、芳香族ニトロ化合物を還元するための触媒としての
（ａ）不均化剤、及び
（ｂ）生体触媒
の使用が提供される。

本発明の更なる態様では、
（ａ）不均化剤、及び
（ｂ）生体触媒を含む、
キットが提供される。

本発明の更なる態様では、本方法で使用するための生体触媒が提供され、該生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも７０％の類似性又は同一性を有し、配列番号１［ＮＲ－４］の以下の位置に対応する残基に以下のアミノ酸を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む：
４１ ［ＳＭＶＡＨＮＴＷＬ］；
１３６ ［ＳＡＮ］；
２２４ ［ＫＴＹＦＲＥＧＩＱＶ］；
２２９ ［ＳＫＲＹＡＱＣＧＨＮＴ］；
２３０ ［ＲＹＥ］
［式中、
［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、
アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって表される］。

これらの態様及び他の態様は、以下に詳細に記載される。

ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４又はＮＲ＿３６）及び不均化剤を含む触媒を使用した、ニトロ基質２ａ－ｅの、アゾキシ（６ａ－ｅ）及びヒドロキシルアミン（３ａ－ｅ）副生成物と共に、アミン生成物１ａ－ｅへの変換率を示す：（Ａ）ＣｕＣｌ_２；（Ｂ）ＦｅＣｌ_２；（Ｃ）ＮａＭｏＯ_４；（Ｄ）Ｖ_２Ｏ_５及び（Ｅ）ＣｏＣｌ_２。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４又はＮＲ＿３６）及び不均化剤を含む触媒を使用した、ニトロ基質２ａ－ｅの、アゾキシ（６ａ－ｅ）及びヒドロキシルアミン（３ａ－ｅ）副生成物と共に、アミン生成物１ａ－ｅへの変換率を示す：（Ａ）ＣｕＣｌ_２；（Ｂ）ＦｅＣｌ_２；（Ｃ）ＮａＭｏＯ_４；（Ｄ）Ｖ_２Ｏ_５及び（Ｅ）ＣｏＣｌ_２。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４又はＮＲ＿３６）及び不均化剤を含む触媒を使用した、ニトロ基質２ａ－ｅの、アゾキシ（６ａ－ｅ）及びヒドロキシルアミン（３ａ－ｅ）副生成物と共に、アミン生成物１ａ－ｅへの変換率を示す：（Ａ）ＣｕＣｌ_２；（Ｂ）ＦｅＣｌ_２；（Ｃ）ＮａＭｏＯ_４；（Ｄ）Ｖ_２Ｏ_５及び（Ｅ）ＣｏＣｌ_２。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４又はＮＲ＿３６）及び不均化剤を含む触媒を使用した、ニトロ基質２ａ－ｅの、アゾキシ（６ａ－ｅ）及びヒドロキシルアミン（３ａ－ｅ）副生成物と共に、アミン生成物１ａ－ｅへの変換率を示す：（Ａ）ＣｕＣｌ_２；（Ｂ）ＦｅＣｌ_２；（Ｃ）ＮａＭｏＯ_４；（Ｄ）Ｖ_２Ｏ_５及び（Ｅ）ＣｏＣｌ_２。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４又はＮＲ＿３６）及び不均化剤を含む触媒を使用した、ニトロ基質２ａ－ｅの、アゾキシ（６ａ－ｅ）及びヒドロキシルアミン（３ａ－ｅ）副生成物と共に、アミン生成物１ａ－ｅへの変換率を示す：（Ａ）ＣｕＣｌ_２；（Ｂ）ＦｅＣｌ_２；（Ｃ）ＮａＭｏＯ_４；（Ｄ）Ｖ_２Ｏ_５及び（Ｅ）ＣｏＣｌ_２。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なオルソ置換基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ａ及び（Ｂ）基質２ｂ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なオルソ置換基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ａ及び（Ｂ）基質２ｂ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なオルソアルキル置換基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｃ；（Ｂ）基質２ｄ、及び（Ｃ）基質２ｅ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なオルソアルキル置換基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｃ；（Ｂ）基質２ｄ、及び（Ｃ）基質２ｅ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なオルソアルキル置換基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｃ；（Ｂ）基質２ｄ、及び（Ｃ）基質２ｅ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なビニル置換基質２ｌの、対応する生成物への変換率を示す。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なクロロ含有基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｆ；（Ｂ）基質２ｇ、及び（Ｃ）基質２ｈ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なクロロ含有基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｆ；（Ｂ）基質２ｇ、及び（Ｃ）基質２ｈ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なクロロ含有基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｆ；（Ｂ）基質２ｇ、及び（Ｃ）基質２ｈ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、ニトリル置換基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｋ及び（Ｂ）基質２ｊ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、ニトリル置換基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｋ及び（Ｂ）基質２ｊ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、ニトロピリジン基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｍ及び（Ｂ）基質２ｏ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、ニトロピリジン基質の、対応する生成物への変換率を示す：（Ａ）基質２ｍ及び（Ｂ）基質２ｏ。 （左）ニトロ還元酵素及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）、又は（右）ニトロ還元酵素のみを含む触媒を用いて、ニトロピリジン基質の、対応する生成物に変換した際の^１Ｈ ＮＭＲである：（Ａ）基質２ｍ及び（Ｂ）基質２ｏ。 （左）ニトロ還元酵素及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）、又は（右）ニトロ還元酵素のみを含む触媒を用いて、ニトロピリジン基質の、対応する生成物に変換した際の^１Ｈ ＮＭＲである：（Ａ）基質２ｍ及び（Ｂ）基質２ｏ。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示的なイソキノリン基質２ｐの、対応する生成物への変換率を示す。 ニトロ還元酵素としてＮＲ＿０４を含む触媒を使用した例の反応混合物の^１Ｈ ＮＭＲである。 ニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、ＮＲ＿２４）及び酸化バナジウム（Ｖ）（Ｖ_２Ｏ_５）を含む触媒を使用した、例示したベンジルエーテル基質２ｎの、対応する生成物への変換率を示す。

配列の概要
本発明の方法は、以下に列挙される配列識別番号を参照して本明細書に記載される。配列は配列表に開示されている。
配列番号１ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－４）
配列番号２ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－１４）
配列番号３ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－１７）
配列番号４ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－２０）
配列番号５ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－２３）
配列番号６ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－２４）
配列番号７ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－３１）
配列番号８ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－３６）
配列番号９ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ａ５）
配列番号１０ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ａ１１）
配列番号１１ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ａ１２）
配列番号１２ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ｃ３）
配列番号１３ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ｄ６）
配列番号１４ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ｅ７）
配列番号１５ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ｆ５）
配列番号１６ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－Ｉ－Ｈ５）
配列番号１７ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－ＩＩ－Ａ１）
配列番号１８ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－ＩＩ－Ｂ１０）
配列番号１９ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－ＩＩ－Ｄ４）
配列番号２０ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－ＩＩ－Ｄ１１）
配列番号２１ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－ＩＩ－Ｄ１２）
配列番号２２ ニトロ還元酵素アミノ酸配列（ＮＲ－ＩＩ－Ｅ１）
配列番号２３ ＥＮＥ－還元酵素アミノ酸配列（ＥＮＥ－１０１）

本発明は、芳香族ニトロ化合物を還元する方法であって、芳香族ニトロ化合物を触媒と接触させて生成物を提供する工程を含む、方法を提供する。以下に更に詳細に記載されるように、触媒は、不均化剤及び生体触媒を含む。本方法は、高収率、例えば９０％超の変換率で生成物の生成を可能にする。本方法は、広範囲の芳香族ニトロ化合物の還元を可能にするものであり、大規模で実施することができる。更に、本方法は、水素ガスを必要とせずに、周囲温度及び圧力で実施することができる。

不均化剤
触媒は、不均化剤を含む。不均化剤は、中間的な酸化状態を有する出発化合物から、出発化合物よりも高い酸化状態を有するものと低い酸化状態を有するものとの２種類の異なる生成化合物への反応を促進させることができる。

不均化剤の活性は、例えばクロマトグラフィー又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって、常法を用いて測定することができる。

不均化剤は、ヒドロキシルアミン中間体の、ニトロソ中間体及びアミン化合物への不均化を促進する。不均化剤は、ヒドラゾ中間体のアゾ化合物と１つ以上のアミン化合物への不均化を促進し得る。

不均化剤は、金属添加剤を含む。すなわち、不均化剤は、周期表の第３族～第１３族から選択される金属を含む。したがって、不均化剤は、ホウ素を含まない。好ましくは、不均化剤は、遷移金属添加剤を含む。すなわち、不均化剤は、周期表の第３族～第１２族から選択される遷移金属を含む。

より好ましくは、不均化剤は、周期表の第５族～第１１族、更により好ましくは周期表の第５族から選択される金属を含む。

不均化剤は、バナジウム、クロム、モリブデン、鉄、コバルト、ニッケル、又は銅から選択される金属を含んでもよい。好ましくは、不均化剤は、バナジウム、モリブデン、鉄、コバルト、又は銅から選択される金属を含む。より好ましくは、不均化剤は、バナジウムを含む。

不均化剤は、０～ＶＩの酸化状態を有する金属を含んでもよい。好ましくは、不均化剤は、ＩＩ～Ｖ、より好ましくはＩＶ又はＶの酸化状態を有する金属を含む。

不均化剤は、２つ以上のアクセス可能な酸化状態を有する金属を含んでもよい。不均化剤は、０、１又は２の酸化レベルによって分離されたアクセス可能な酸化状態を有する金属を含んでもよい。例えば、不均化剤は、アクセス可能な酸化状態０及びＩＩ、Ｉ及びＩＩＩ、又はＩＶ及びＶを有する金属を含んでもよい。

不均化剤は対イオンを含んでもよい。対イオンは、不均化剤中の金属の酸化状態を安定化するのに好適な任意の対イオンであってもよい。

典型的には、対イオンは負電荷を有する。すなわち、典型的には、対イオンはアニオンである。アニオンの典型的な例としては、ハロ、オキソ、ボレート、アルミネート、ナイトレート、ホスフェート、サルフェート、及びハイポクロライトなどの無機アニオンが挙げられる。アニオンの典型的な例としては、ホルメート、カルボキシレート、及びアセテートアセチルアセトネートなどの有機アニオンも挙げられる。

ハロアニオンの例としては、フルオレート、クロレート、ブロメート、及びアイオデートが挙げられる。

ボレートアニオンの例としては、テルヒドロキシボレート及びテトラフルオロボレートが挙げられる。

ホスフェートアニオンの例としては、ホスフェート（ＰＯ_４）^３－及びヘキサフルオロホスフェートが挙げられる。

あるいは、対イオンは正電荷を有する。すなわち、対イオンはカチオンである。カチオンの典型例としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、ホスホニウム、及びアンモニウムなどの無機カチオンが挙げられる。

アルカリ金属カチオンの例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、及びセシウムが挙げられる。

アルカリ土類金属カチオンの例としては、マグネシウム及びカルシウムが挙げられる。

ホスホニウムカチオンの例としては、テトラフェニルホスホニウムが挙げられる。

アンモニウムカチオンの例としては、アンモニウム（ＮＨ４）^＋、テトラメチルアンモニウム、及びテトラブチルアンモニウムが挙げられる。

不均化剤は、水を含んでもよい。すなわち、不均化剤は水和物であってもよい。

不均化剤は、１つ以上のリガンドを含んでもよい。典型的なリガンドとしては、ＥＤＴＡ、ジピコリン酸、イミダゾール、ヒスチジン、イミノ二酢酸、トリエチレントリアミン、メチルアミノエタノール、プロリン、Ｎ－（２－ヒドロキシベンゾイル）ピロリジン、及びジピバロイルメタンが挙げられる。

典型的な不均化剤としては、ＣｕＣｌ_２、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２、Ｃｕ_２Ｏ、Ｃｕ（０）（銅金属）、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＣｌ_３、Ｆｅ（ａｃａｃ）_３、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＳＯ_４、Ｆｅ（０）（鉄金属）、ＮａＭｏＯ_４、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、Ｖ（ａｃａｃ）_３、Ｖ_２Ｏ_５、Ｖ（０）（バナジウム金属）、又はＣｏＣｌ_２が挙げられる。好ましくは、不均化剤は、ＣｕＣｌ_２、ＦｅＣｌ_２、ＮａＭｏＯ_４、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、Ｖ（ａｃａｃ）_３、Ｖ_２Ｏ_５、又はＣｏＣｌ_２から選択される。

一実施形態では、不均化剤は、Ｖ_２Ｏ_５、ＶＯ_２、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、ＶＯ（ＮＯ_３）_３、Ｖ（ａｃａｃ）_３、ＶＯＸ_３、ＶＸ_４、ＶＸ_３、又はＶＸ_２から選択され、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒである。好ましくは、不均化剤は、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、及びＶ_２Ｏ_５から選択される。

本発明者らは、Ｖ（ＩＩＩ）及びＶＯＳＯ_４などのＶ（ＩＶ）不均化剤は、ＮＨ_４ＶＯ_３及びＶ_２Ｏ_５などのＶ（Ｖ）不均化剤よりも高い水溶性を有することを観察した。しかしながら、Ｖ（Ｖ）不均化剤、例えばＮＨ_４ＶＯ_３及びＶ_２Ｏ_５は、Ｖ（ＩＩＩ）及びＶ（ＩＶ）不均化剤よりも低い毒性を有する。

生体触媒－機能
触媒は、生体触媒を含む。すなわち、触媒は、酵素活性を有するポリペプチドを含む。

典型的には、生体触媒は、ニトロ還元酵素である。すなわち、生体触媒は、ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む。生体触媒は、ニトロ還元酵素活性を有する、本明細書に定義されるポリペプチド又はバリアントポリペプチドを含み得る。

ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、芳香族ニトロ基の芳香族ヒドロキシルアミン基への還元を触媒することができ、例えば、スキーム１において２から３の還元を触媒することができる。ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドはまた、芳香族ニトロ基の芳香族アミン基への還元を触媒することができ、例えば、スキーム１において２から１の還元を触媒することができる。

ニトロ還元酵素活性は、芳香族ニトロ化合物の芳香族ヒドロキシルアミン化合物への還元を測定することによって決定することができる。これは、例えば、２０５ｎｍ（芳香族基による吸着を測定）、３４０ｎｍ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによる吸着を測定）での吸収の観察、又は比色分析法（例えば、本明細書に記載されるＩＮＴ色素アッセイ）といった、常法によって行うことができる。

例えば、ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、以下の反応条件で、３－ニトロスチレン（１－エテニル－３－ニトロベンゼン）を３－ビニラニリン（３－エテニルアニリン）に３０％超の収率で還元することを触媒することができる：３７５μＬの緩衝液２５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０；７．０又は８．０）＋１ｍＭ ＮＡＤＰ^＋及び１ｍＭ ＮＡＤ^＋、１００ｍＭ Ｄ－グルコース、１ｍｇ／ｍＬ ＧＤＨ＋５ｍｇ／ｍＬポリペプチド＋２５μＬ ３－ニトロスチレン溶液（ＭＴＢＥ中０．４Ｍ、基質の最終濃度２０ｍＭ）を３５℃で１８時間。

ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍが運営する遺伝子オントロジーデータベースを用いて分類することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）。ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、酸化還元酵素であり、ＧＯ：００１６４９１のメンバーであり、ＧＯ：００１６６５７のメンバーとして更に分類され得る（例えば、２０１８年１１月のＧＯバージョン２０１８１１０８）。ＧＯ：００１６６５７は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが水素又は電子供与体として作用し、窒素系基を還元する酸化還元（レドックス）反応を触媒することができる酵素を定義することができる。

ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、国際生化学・分子生物学連合が管理する酵素委員会番号を用いて分類することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｃｓ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／）。ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、ＥＣ １（酸化還元酵素）のメンバーであってもよい。ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、１．５．１．Ｘ（受容体としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを有するＣＨ－ＮＨ基の供与体に作用する酸化還元酵素）及び１．６．９９．Ｘ（他の受容体を有するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに作用する酸化還元酵素）を含む個別の詳細なＥＣ番号に更に分類することができる。更に、ニトロ還元酵素活性を有するポリペプチドは、これらの酵素の無差別的な側の副次的活性として、Ｅ．Ｃ １．３．１．Ｘ（受容体としてＮＡＤ又はＮＡＤＰを有するＣＨ－ＣＨ基の供与体に作用する酸化還元酵素）に属する場合がある。

生体触媒－構造
生体触媒は、Ｏｒｅｎｇｏ ｇｒｏｕｐ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎが運営するＣＡＴＨタンパク質構造分類データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｔｈｄｂ．ｉｎｆｏ／）を用いて分類することができる。生体触媒は、ＣＡＴＨスーパーファミリー３．４０．１０９．１０、３．２０．２０．７０、又は３．４０．５０．３６０に属すると分類される構造を有するポリペプチドを含み得る（例えば、２０１７年５月リリースのＣＡＴＨ－Ｐｌｕｓ ４．２．０）。好ましくは、生体触媒は、３．４０．１０９．１０（ＣＡＴＨ－ＰＬＵＳ ４．２．０）に属するポリペプチドである。

生体触媒は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが運営するタンパク質ファミリーデータベース（Ｐｆａｍ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）を用いて分類することができる。生体触媒は、ＰＦ００７２４（旧黄色酵素構造ファミリー）、ＰＦ００８８１（ニトロ還元酵素ファミリー）又はＰＦ０２５２５（フラボドキシン様フォールドファミリー）（例えば、２０１７年３月リリースのＰｆａｍバージョン３１．０）に属するものとして分類される構造を有するポリペプチドを含んでもよい。好ましくは、生体触媒は、ＰＦ００８８１（バージョン３１．０）に属するポリペプチドである。

生体触媒－モチーフ配列
生体触媒は、ＰＦ００８８１に属し、特性モチーフ（１）：
（１）Ａ－ｘ（３，４）－Ｇ－ｘ－［ＡＤＥＧＱＳＴ］－ｘ（４）－［ＡＤＥＧＮＱＳＴ］－［ＡＥＧＮＱＳＴ］
［式中、ｘは任意のアミノ酸残基を表し、ｘ（ｎ）は長さｎの任意のアミノ酸残基からなるセグメントを表す（残基は互いに同じであっても異なっていてもよい）；［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって表される］
を有するポリペプチドを含み得る。これは、ポリペプチドが、以下の順序で；（位置１）アラニン；（位置２～４／５）任意のアミノ酸の３つ又は４つの残基；（位置５／６）グリシン；（位置６／７）任意のアミノ酸の１つの残基；（位置７／８）アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、グルタミン、セリン、トレオニンのうちのいずれか１つである１つの残基；（位置８／９～１１／１２）任意のアミノ酸の４つの残基；（位置１２／１３）アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンのうちのいずれか１つである１つの残基、及び（位置１３／１４）アラニン、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンのうちのいずれか１つである１つの残基、
である１３又は１４アミノ酸のモチーフを含むことを意味する。

モチーフ（１）は、ＰＦ００８８１に属するポリペプチドのフラビン補因子結合ドメインを特定する。モチーフ（１）を含むポリペプチドは、ＦＭＮ補因子などのフラビン補因子に結合することができる。

モチーフ（１）を含むポリペプチドは、ＰＲＯＳＩＴＥスキャンツールを使用して特定され得る（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）。ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）でモチーフ（１）を有するポリペプチドをスキャンすることで、潜在的なニトロ還元酵素を特定することができる。ニトロ還元酵素活性は、上記に要約したものなどの常法を用いて確認することができる。

この生体触媒は、モチーフ（１）を有し、ニトロ還元酵素活性を有する、ＰＦ００８８１に属するポリペプチドを含み得る。

生体触媒－活性部位配列
ＮＲ－４の活性部位領域を定義する１７個のアミノ酸残基を、構造モデリングを用いて基質に近接させて特定した。これらは、配列番号１［ＮＲ－４］のアミノ酸残基１５、３９、４０、４１、４２、６４、６５、６７、１１２、１３２、１３５、１３６、１３８、２２０、２２４、２２９、２３０である。

この生体触媒は、ＮＲ－４の活性部位領域の１７個のアミノ酸残基と同一又は類似のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。したがって、生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］の残基１５、３９、４０、４１、４２、６４、６５、６７、１１２、１３２、１３５、１３６、１３８、２２０、２２４、２２９、２３０に対応する位置に配列番号１［ＮＲ－４］のものと類似又は同一のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。この生体触媒は、ＮＲ－４の活性部位領域の１７個のアミノ酸残基に対応する位置において、ＮＲ－４のものと類似又は同一の少なくとも９個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。すなわち、ニトロ還元酵素は、ＮＲ－４の活性部位領域の１７個のアミノ酸残基に対応する位置において、ＮＲ－４のものと少なくとも５０％類似又は同一のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含み得る。この生体触媒は、ＮＲ－４の活性部位領域の１７個のアミノ酸残基に対応する位置において、ＮＲ－４のものと類似又は同一の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１５、１４、１５、１６又は１７個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。

生体触媒は、ＮＲ－４の活性部位領域と同一又は類似のアミノ酸残基を有し、ニトロ還元酵素活性を有する、ＰＦ００８８１に属するポリペプチドであってもよい。

ＮＲ－４の拡張した活性部位領域を定義する３０個のアミノ酸残基を、構造モデリングを用いて基質に近接させて特定した。これらは、配列番号１［ＮＲ－４］のアミノ酸残基１３、１５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、６４、６５、６７、６９、１０４、１１２、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１７２、２２０、２２１、２２４、２２５、２２９、２３０、２３３である。

生体触媒は、ＮＲ－４の拡張した活性部位領域の３０個のアミノ酸残基と同一又は類似であるアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。したがって、生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］のアミノ酸残基１３、１５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、６４、６５、６７、６９、１０４、１１２、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１７２、２２０、２２１、２２４、２２５、２２９、２３０、２３３に対応する位置に配列番号１［ＮＲ－４］のものと類似する又は同一のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。この生体触媒は、ＮＲ－４の拡張した活性部位領域の３０個のアミノ酸残基に対応する位置に、ＮＲ－４のものと類似又は同一の少なくとも１５個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。すなわち、ニトロ還元酵素は、ＮＲ－４の拡張した活性部位領域の３０個のアミノ酸残基に対応する位置に、ＮＲ－４のものと少なくとも５０％類似又は同一のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。この生体触媒は、ＮＲ－４の拡張した活性部位領域の３０個のアミノ酸残基に対応する位置に、ＮＲ－４のものと類似又は同一の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい。

この生体触媒は、ＮＲ－４の拡張した活性部位領域と同一又は類似のアミノ酸残基を有し、ニトロ還元酵素活性を有する、ＰＦ００８８１に属するポリペプチドを含んでもよい。

ＮＲ－４の保存された活性部位領域を定義する５つのアミノ酸残基を、構造モデリングを用いて基質に近接させて特定した。これらは、配列番号１［ＮＲ－４］のアミノ酸残基４１、１３６、２２４、２２９、２３０である。

この生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも７０％の類似性又は同一性を有し、配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位残基に対応する以下の位置に、以下のアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでもよい：
４１ ［ＳＩＭＶＡＨＮＴＷＬ］；
１３６ ［ＧＳＡＮ］；
２２４ ［ＫＡＴＹＦＲＥＧＩＱＶ］；
２２９ ［ＳＫＲＹＡＱＣＧＨＮＴＶ］；
２３０ ［ＲＫＹＥ］
［式中、［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって示される］。これは、ポリペプチドが、以下の順序で；（位置４１）セリン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジン、アスパラギン、トレオニン、トリプトファン、ロイシンのうちのいずれか１つである１つの残基；（位置１３６）グリシン、セリン、アラニン、アスパラギンのうちのいずれか１つである１つの残基；（位置２２４）リジン、アラニン、トレオニン、チロシン、フェニルアラニン、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、グルタミン、バリンのうちのいずれか１つである１つの残基；（位置２２９）セリン、リジン、アルギニン、チロシン、アラニン、グルタミン、システイン、グリシン、ヒスチジン、アスパラギン、トレオニン、バリンのうちのいずれか１つである１つの残基；及び（位置２３０）アルギニン、リジン、チロシン、グルタミン酸のうちのいずれか１つである１つの残基；
を含むことを意味する。

この生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％類似性又は同一性を有し、配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置に上記アミノ酸残基を有するポリペプチドを含み得る。

この生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも７０％の類似性又は同一性を有し、配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置に上記アミノ酸残基を有し、ニトロ還元酵素活性を有する、ポリペプチドを含み得る。

好ましい生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも７０％の類似性又は同一性を有し、表１に記載の配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置にアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。

好ましい生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも７０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、表１に記載の配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置にアミノ酸残基を有するポリペプチドを含む。

生体触媒－グローバル配列
生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］、２［ＮＲ－１４］、３［ＮＲ－１７］、又は４［ＮＲ－２４］に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］、２［ＮＲ－１４］、３［ＮＲ－１７］、又は４［ＮＲ－２４］と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、バリアントポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］、２［ＮＲ－１４］、３［ＮＲ－１７］、又は４［ＮＲ－２４］と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、バリアントポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］、２［ＮＲ－１４］、３［ＮＲ－１７］、又は４［ＮＲ－２４］と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、表１に記載の配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置にアミノ酸残基を有する、バリアントポリペプチドを含んでもよい。

生体触媒は、配列番号１［ＮＲ－４］に記載のＮＲ－４のアミノ酸配列を有し、１つ以上のアミノ酸置換を含む、バリアントポリペプチドを含んでもよい。

生体触媒は、配列番号１４［ＮＲ－Ｉ－Ｅ７］に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号１４［ＮＲ－Ｉ－Ｅ７］に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号１４［ＮＲ－Ｉ－Ｅ７］に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号１４［ＮＲ－Ｉ－Ｅ７］に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、表１に記載の配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置にアミノ酸残基を有する、バリアントポリペプチドを含んでもよい。

生体触媒は、配列番号２２［ＮＲ－ＩＩ－Ｅ１］に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号２２［ＮＲ－ＩＩ－Ｅ１］に対して、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号２２［ＮＲ－ＩＩ－Ｅ１］に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントポリペプチドを含んでもよい。生体触媒は、配列番号２２［ＮＲ－ＩＩ－Ｅ１］に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、表１に記載の配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置にアミノ酸残基を有する、バリアントポリペプチドを含んでもよい。

好ましい生体触媒は、ニトロ還元酵素活性を有し、モチーフ（１）を有し、ＮＲ－４の活性部位領域と同一のアミノ酸残基を有する。好ましい生体触媒は、ニトロ還元酵素活性を有し、モチーフ（１）を有し、配列番号１［ＮＲ－４］に対して、少なくとも７０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、表１に記載の配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位領域に対応する５つの位置にアミノ酸残基を有する、ポリペプチドを含む。

生体触媒－全般情報
本明細書に記載の全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで報告される。

「ＮＲ－４の残基１３に対応する」などのポリペプチドの残基「に対応する」と言う言及は、クエリ配列が全長のＮＲ－４配列と最適にアラインメントされたときに、ＮＲ－４の残基１３に対応するクエリ配列の位置を意味すると解釈されるべきである。

用語「配列同一性」又は「類似性」は、当業者が参照配列から推測できるように、文脈に応じて核酸配列同一性又はアミノ酸配列同一性を意味する。

アミノ酸配列同一性及び類似性並びに核酸配列同一性は、自由に入手可能なＥＭＢＯＳＳ、又はＢＬＡＳＴソフトウェアツールなどの標準的なバイオインフォマティクスソフトウェアツールを使用して測定することができる。デフォルトパラメータが、概ね使用される。例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅペアワイズ配列アラインメントを使用して、アミノ酸配列同一性を決定することができる。ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅペアワイズ配列アラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を使用して、例えば、デフォルトのパラメータを使用して、かつ、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスなどのＢＬＯＳＵＭスコアリングマトリクスを使用して、アミノ酸配列の類似性を決定することができる。デフォルトパラメータは、ギャップ生成ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４と共に使用されてもよい。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用）、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）を使用してもよく、概ねデフォルトのパラメータを用いる。

参照配列に対するアミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最大配列同一性パーセントを達成するために配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合と定義される。同一性パーセントの値は、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０－４８０（１９９６））によって決定され得る。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは、以下の値：オーバーラップ・スパン＝１、オーバーラップ・フラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１で設定される。アミノ酸配列同一性％値は、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２によって決定される一致する同一残基の数によって決定され、それは参照配列の残基の総数で除算して（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２によって参照配列に導入されたギャップは無視される）、１００を乗じたものである。

参照配列に対するアミノ酸配列のアラインメントカバレッジのパーセント（％）は、配列をアラインメントした後、参照配列のアミノ酸残基数と比較した候補配列のアミノ酸残基数の割合と定義される。

バリアントポリペプチドは、切断型ポリペプチドであってよい。切断型ポリペプチドがニトロ還元酵素活性を有する限り、任意の切断を使用することができる。切断は、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端から１つ以上の残基を除去することができ、この残基は、ニトロ還元酵素活性に必須ではない。適切な切断は、Ｎ末端及び／又はＣ末端からの長さが異なる配列を系統的に切断することによって日常的に同定され得る。

バリアントポリペプチドは、１つ以上の追加のアミノ酸を含んでもよい。バリアントポリペプチドは、ポリヒスチジンタグ、Ｔ７タグ、又はＧＳＴタグなど、バリアントポリペプチドを精製するための親和性タグを含んでもよい。親和性タグは、Ｎ末端又はＣ末端に位置してもよい。代替的に又は追加的に、バリアントポリペプチドは、Ｎ末端にリーダー配列を更に含んでもよい。リーダー配列は、組み換え発現系におけるポリペプチドの分泌及び／又は細胞内標的化を誘導するのに有用であり得る。リーダー配列は、シグナルペプチドとしても知られており、当該技術分野において周知である。代替的に又は追加的に、ポリペプチドは、蛍光標識などの標識を更に含んでもよい。

アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、所与の配列のアミノ酸は、類似の特性を有するアミノ酸により置換される。例えば、疎水性アミノ酸（例えば、Ｌｅｕ）が、別の疎水性アミノ酸（例えば、Ｉｌｅ）で置換されている場合である。アミノ酸及び保存的置換を以下の表に示す。保存的置換は、アミノ酸クラス内の置換、及び／又はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスで正のスコアを示す置換と定義することができる。

生体触媒－調製
生体触媒は、純粋な、又は実質的に純粋な形態で提供されてもよい。純粋な、又は実質的に純粋な形態の生体触媒は、タンパク質（例えば、リボソーム、細胞膜成分）に自然に付随する他の分子又は細胞成分から分離される。

生体触媒は、生体触媒調製物として比較的粗製の形態で提供されてもよく、例えば、生体触媒調製物は、生体触媒を発現する組み換え細胞のライセート又は清澄化ライセートであってもよい。生体触媒調製物は、生体触媒を発現する組換え細胞のホモジネート又はペーストであってもよい。

生体触媒は、宿主細胞に含まれてもよい。生体触媒は、遊離形態で、又は固定化形態で提供されてもよい。固定化形態では、生体触媒は、セルロース粉末又はポリエテンなどの合成ポリマーなどの不活性担体に付着してもよい（Ｌａｌｏｎｄｅ ａｎｄ Ｍａｒｇｏｌｉｎ，２００２）。

本明細書では、生体触媒を生成する方法であって、宿主細胞中の生体触媒をコードする核酸を発現させることと、宿主細胞から生体触媒を単離することと、を含む、方法が提供される。本方法は、宿主細胞を溶解して細胞ライセートを提供することを含み得、更に、宿主細胞残屑を除去（例えば、遠心分離により）して清澄化細胞ライセートを提供することを含んでもよい。細胞を溶解する工程は、超音波処理を使用してもよい。宿主細胞を溶解する工程は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む溶解緩衝液を使用してもよく、例えば、溶解緩衝液は、約１～５０μＭのＦＭＮ、又は約５～２５μＭのＦＭＮ、又は約２０μＭのＦＭＮを含み得る。追加的に又は代替的に、宿主細胞を溶解する工程は、ＭｇＳＯ_４を含有する溶解緩衝液を使用してもよく、例えば、溶解緩衝液は、約１～５０ｍＭのＭｇＳＯ_４、約１～５ｍＭのＭｇＳＯ_４、又は約５ｍＭのＭｇＳＯ_４を含んでもよい。溶解緩衝液は、ＦＭＮ及びＭｇＳＯ_４を含み得る。

生体触媒又は生体触媒調製物は、使用前に精製されてもよく、例えば、Ｎ末端Ｎｉｓタグを含む生体触媒は、好適な親和性カラムを使用して精製され得る。

水は、生体触媒又は触媒調製物から除去され得、凍結乾燥形態で生体触媒を提供してもよい。生体触媒は、凍結乾燥物として提供されてもよい。生体触媒又は生体触媒調製物は、凍結させてもよい。

基質
本発明は、芳香族ニトロ化合物を還元する方法を提供する。したがって、本方法は、基質の反応を含む。

基質は、芳香族ニトロ化合物である。すなわち、基質は、ニトロ基（－ＮＯ_２）の窒素原子が、Ｃ_５～１４カルボアリール又はヘテロアリール基などの芳香族基の炭素環原子に直接結合した化合物である。

接頭辞（例えば、Ｃ_５～１４、Ｃ_５～７、Ｃ_５～６）は、炭素原子かヘテロ原子かにかかわらず、環原子の数、又は環原子数の範囲を示す。例えば、本明細書で使用するとき、用語「Ｃ_５～６アリール」は、５個又は６個の環原子を有するアリール基に関する。

Ｃ_５～１４カルボアリール基は、環原子の全てが炭素原子である芳香環を含む。Ｃ_５～１４カルボアリール基は、Ｃ_６～１４又はＣ_６～１０カルボアリール基であってもよい。単環式Ｃ_５～１４カルボアリール基の例としては、ベンゼンから誘導されるもの（すなわち、フェニル）が挙げられる。

Ｃ_５～１４カルボアリール基は、縮合環系の一部であってもよい。縮合環系において、カルボアリール基は、２つ以上の環を含む環系を有し、環のうちの少なくとも１つは芳香環であり、各環は、それぞれの隣接する環（縮合）環と隣接する２つの環原子を共有する。したがって、橋頭原子は直接結合される。縮合環を含むＣ_５～１４カルボアリール基の例としては、以下に由来する基が挙げられる：
（Ｃ９基）インダン（２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン）、インデン、イソインデン；
（Ｃ１０基）ナフタレン、ジアリン（１，２－ジヒドロナフタレン）、テトラリン（１，２，３，４－テトラヒドロナフタレン）、アズレン；
（Ｃ１２基）アセナフテン；
（Ｃ１３基）フルオレン、フェナレン、並びに
（Ｃ１４基）アントラセン及びフェナントレン。

Ｃ_５～１４ヘテロアリール基は、１個以上の環原子がヘテロ原子である芳香環を含む。Ｃ_５～１４ヘテロアリール基は、Ｃ_５～１４、Ｃ_５～１０、又はＣ_５～６ヘテロアリール基であり得る。単環式Ｃ_５～１４ヘテロアリール基の例としては、以下に由来する基が挙げられる：
（窒素含有Ｃ５基）ピロール（アゾール）、ピラゾール（１，２－ジアゾール）、イミダゾール（１，３－ジアゾール）、トリアゾール、テトラゾール；
（酸素又は硫黄を含有するＣ５基）フラン（オキソール）；チオフェン（チオール）；
（窒素及び酸素を含有するＣ５基）オキサゾール、イソオキサゾール、オキサジアゾール（例えば、フラザン）、オキサトリアゾール；
（窒素及び硫黄を含有するＣ５基）チアゾール、イソチアゾール；
（窒素を含有するＣ６基）ピリジン（アジン）、ピリダジン（１，２－ジアジン）、ピリミジン（１，３－ジアジン）、ピラジン（１，４－ジアジン）、トリアジン；及び
（窒素及び酸素を含有するＣ６基）イソオキサジン。

Ｃ_５～１４ヘテロアリール基は、縮合環系の一部であってもよい。縮合環系において、ヘテロアリール基は、２つ以上の環を含む環系を有し、環のうちの少なくとも１つは芳香環であり、各環は、それぞれの隣接する環（縮合）環と隣接する２つの環原子を共有する。したがって、橋頭原子は直接結合される。縮合環を含むＣ_５～１４ヘテロアリール基の例としては、以下に由来する基が挙げられる：
（２つの縮合環を有するＣ９基）ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、インドリジン、インドリン、イソインドリン、プリン、ベンゾイミダゾール、インダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンジソキサゾール、ベンゾジオキソール、ベンゾフラザン、ベンゾトリアゾール、ベンゾチオフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾチアゾール；
（２つの縮合環を有するＣ１０基）クロメン、イソクロメン、クロマン、イソクロマン、ベンゾジオキサン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、ベンゾオキサジン、ベンゾジアジン、ピリドピリジン、キノキサリン、キナゾリンシンノリン、フタラジン、ナフチリジン、プテリジン；
（２つの縮合環を有するＣ１１）ベンゾジアゼピン；
（３つの縮合環を有するＣ１３基）カルバゾール、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、カルボリン、ペリミジン、ピリドインドール、及び
（３つの縮合環を有するＣ１４基）アクリジン、キサンテン、チオキサンテン、オキサントレン、フェノキサチイン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、チアントレン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン。

Ｃ_５～１４カルボアリール基又はヘテロアリール基は、任意選択的に置換されてもよい。Ｃ_５～１４カルボアリール又はヘテロアリール基は、１つ、２つ、又は３つの置換基を有してもよい。すなわち、Ｃ_５～１４のカルボアリール基又はヘテロアリール基は、一置換、二置換、又は三置換であってもよい。

炭素原子がＣ_５～１４カルボアリール又はヘテロアリール基中に存在する場合、その炭素原子は、非置換（ＣＨ）であってもよく、又は以下に記載される任意の置換基で任意選択的に置換されてもよい。

窒素原子がＣ_５～１４ヘテロアリール基中に存在する場合、その窒素原子は、非置換（ＮＨ）であってもよく、又は以下に記載される、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アシル、及びアシルオキシで任意選択的に置換されてもよい。

置換基
アルキル基は、直鎖又は分枝鎖である飽和炭化水素基である。アルキル基は、Ｃ_１～２０アルキル基、例えば、Ｃ_１～１０、Ｃ_１～６、又はＣ_１～４アルキル基であり得る。直鎖アルキル基の例としては、メチル（－Ｍｅ）、エチル（－Ｅｔ）、ｎ－プロピル（－ｎＰｒ）、ｎ－ブチル（－ｎＢｕ）、ｎ－ペンチル（－Ａｍｙｌ）、ｎ－ヘキシル、及びｎ－ヘプチルが挙げられる。分枝鎖アルキル基の例としては、イソ－プロピル（－ｉＰｒ）、イソ－ブチル（－ｉＢｕ）、ｓｅｃ－ブチル（－ｓＢｕ）、ｔｅｒｔ－ブチル（－ｔＢｕ）、イソ－ペンチル、及びネオ－ペンチルが挙げられる。

アルケニル基は、１つ以上の炭素－炭素二重結合を含有するアルキル基である。アルケニル基は、Ｃ_２～２０アルケニル基、例えば、Ｃ_２～１０、Ｃ_２～６、又はＣ_２～４アルケニル基であり得る。アルケニル基は、直鎖又は分枝鎖であってもよい。アルケニル基の例としては、エテニル（ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル（アリル）、イソプロペニル（１－メチルビニル）、ブテニル、ペンテニル、及びヘキセニルが挙げられる。

アルキニルは、１つ以上の炭素－炭素三重結合を有するアルキル基である。アルキニル基は、Ｃ_２～２０アルキニル基、例えば、Ｃ_２～１０、Ｃ_２～６、又はＣ_２～４アルキニル基であり得る。アルキニル基は、直鎖又は分枝鎖であってもよい。アルキニル基の例としては、エチニル及び２－プロピニル（プロパルギル）が挙げられる。

ヘテロアルキル基は、１個以上の炭素原子がヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ及びＳで置換され、炭素原子を介して特許（置換）基に結合されるアルキル基である。ヘテロアルキル基は、Ｃ_１～２０ヘテロアルキル基、例えばＣ_１～１０、Ｃ_１～６、又はＣ_１～４ヘテロアルキル基であってもよい。窒素原子がヘテロアルキル基中に存在する場合、その窒素原子は、非置換（ＮＨ）であってもよく、又は以下に記載されるアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アシル、及びアシルオキシで任意選択的に置換されてもよい。硫黄原子がヘテロアルキル基中に存在する場合、その硫黄原子はＳ、Ｓ（＝Ｏ）、又はＳ（＝Ｏ）_２であってもよい。ヘテロアルキル基の例としては、－ＣＨ_３ＯＣＨ_３及び－ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３が挙げられる。

シクロアルキル基は、環原子の全てが炭素原子である環を含むアルキル基である。シクロアルキル基は、Ｃ_３～１４シクロアルキル基、例えば、Ｃ_３～１０、Ｃ_３～７、又はＣ_５～６シクロアルキル基であり得る。単環式シクロアルキル基の例としては、シクロプロパン、メチルシクロプロパン、ジメチルシクロプロパン、シクロブタン、メチルシクロブタン、ジメチルシクロブタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、ジメチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン及びシクロヘプタンが挙げられる。

シクロアルキル基は、スピロ環系の一部であってもよい。スピロ環系において、シクロアルキル基は、２つ以上の環を含む環系を有し、環のうちの少なくとも１つは、全ての環原子が炭素原子であり、各環は、それぞれの隣接する環（スピロ）環と単一の環原子を共有する。したがって、単一の橋頭原子が存在する。スピロ環を含むシクロアルキル基の例は、スピロ［４．４］ノナン、スピロ［４．５］デカン、及びスピロ［５．５］ウンデカンである。

シクロアルキル基は、縮合環系の一部であってもよい。縮合環系において、シクロアルキル基は、２つ以上の環を含む環系を有し、環のうちの少なくとも１つは、全ての環原子が炭素原子であり、各環は、それぞれの隣接する（縮合）環と隣接する２つの環原子を共有する。したがって、橋頭原子は直接結合される。縮合環を含むシクロアルキル基の例としては、デカリンが挙げられる。

シクロアルキル基は、架橋環系の一部であってもよい。架橋環系において、シクロアルキル基は、２つ以上の環を含む環系を有し、環のうちの少なくとも１つは、環原子の全てが炭素原子であり、各環は、それぞれの隣接する（架橋）環と３つ以上の隣接する環原子を共有する。したがって、橋頭原子は、１つ以上の環原子によって分離される。架橋環を含むシクロアルキル基の例としては、ノルボルナン、ボルナン、及びアダマンタンが挙げられる。

ヘテロシクリル基は、１つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ及びＳである環を含む。ヘテロシクリル基は、Ｃ_５～１０ヘテロシクリル基、例えば、Ｃ_５～７、Ｃ_５～６、又はＣ_６ヘテロシクリル基であってもよい。窒素環原子がヘテロシクリル基中に存在する場合、その窒素環原子は、非置換（ＮＨ）であってもよく、本明細書に記載のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、アシル、及びアシルオキシで任意選択的に置換されていてもよい。硫黄環原子がヘテロシクリル基中に存在する場合、その硫黄環原子は、Ｓ、Ｓ（＝Ｏ）又はＳ（＝Ｏ）_２であってもよい。単環式複素環の例としては、以下が挙げられる：
（窒素を含有するＣ３及びＣ４基）アジリジン、アゼチジン；
（酸素又は硫黄を含有するＣ３及びＣ４基）オキシラン、チイラン、オキセタン、チエタン；
（窒素を含有するＣ５基）ピロリジン（テトラヒドロピロール）、ピロリン（２，５－ジヒドロピロール）、イミダゾリジン、ピラゾリジン（ジアゾリジン）、イミダゾリン、ピラゾリン
（ジヒドロピラゾール）；
（酸素及び硫黄を含有するＣ５基）オキソラン（テトラヒドロフラン）、オキソール（ジヒドロフラン）、チオラン（テトラヒドロチオフェン）、ジオキソラン、ジオキソラン、オキサチオール；
（窒素及び酸素を含有するＣ５基）テトラヒドロオキサゾール、ジヒドロオキサゾール、テトラヒドロイソオキサゾール、ジヒドロイソオキサゾール；
（窒素及び硫黄を含有するＣ５基）チアゾリン、チアゾリジン；
（窒素を含有するＣ６基）ピペリジン、ジヒドロピリジン、テトラヒドロピリジン、ピペラジン；
（酸素及び硫黄を含有するＣ６基）オキサン（テトラヒドロピラン）、ジヒドロピラン、ピラン、チアン（テトラヒドロチオピラン）、ジオキサン、トリオキサン、オキサチアン（チオキサン）、オキサチアジン；
（窒素及び酸素を含有するＣ６基）モルホリン、テトラヒドロオキサジン、ジヒドロオキサジン、オキサジン、オキサジアジン；
（窒素及び硫黄を含有するＣ６基）チオモルホリン；
（窒素を含有するＣ７基）アゼピン、ジアゼピン、並びに
（酸素及び硫黄を含有するＣ７基）オキセピン、チエパン、及びジオキセパン。

ハロ基は、独立して、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、及び－Ｉから選択される。

ヒドロキシル基は、－ＯＨ又はこの基のヒドロキシド形態である。

オキシ基は、－ＯＲ基であり、式中、Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。式中、Ｒはアルキルであり、オキシ基はアルコキシ基である。アルコキシ基の例としては、－ＯＭｅ（メトキシ）、－ＯＥｔ（エトキシ）、－Ｏ（ｎ－Ｐｒ）（ｎ－プロポキシ）、－Ｏ（ｉＰｒ）（イソプロポキシ）、－Ｏ（ｎＢｕ）（ｎ－ブトキシ）、－Ｏ（ｓＢｕ）（ｓｅｃ－ブトキシ）、－Ｏ（ｉＢｕ）（ｉｓｏ－ブトキシ）、及び－Ｏ（ｔＢｕ）（ｔｅｒｔ－ブトキシ）が挙げられる。

チオ基は、－ＳＨ又は－ＳＲ基であり、式中、Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。

アミノ基は、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、及び－Ｎ（Ｒ）_２から選択される基であり、式中、各Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリール、例えばアルキル、シクロアルキル、及びアリールから選択される。

シアノ基（ニトリル）は－ＣＮである。

アシル基は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｒ基であり、式中、－Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。アシル基が窒素環原子の置換基である場合、アシル基は窒素環原子と共にアミド基を形成する。アシル基の例としては、ホルミル、アセチル（－Ａｃ）、ｔｅｒｔ－ブチリル、及びベンゾイル（－Ｂｚ）が挙げられる。

カルボキシ基は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨであるか、又はこの基のカルボン酸塩形態である。

アシルオキシ基（エステル）は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ基であり、式中、－Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及び又はアリールから選択される。アシル基が窒素環原子の置換基である場合、アシルオキシ基は、窒素環原子と共にカルバメート基を形成する。

オキシアシル基（逆のエステル）は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ基であり、式中、－Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。オキシアシル基の例としては、アセトキシ（－ＯＡｃ）が挙げられる。

アミド基は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２基であり、式中、－Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択され、又は２つのＲ基は、それらが窒素複素環から結合している窒素原子と一緒に、任意選択的に更に１つの環ヘテロ原子を含み得る。

アシルアミノ基は、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ、－ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ基であり、式中、－Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリール、例えば、アルキルから選択される。

スルホン酸基は、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＯＨ基、又はこの基のスルホネート形態である。

スルホニル基は、－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ基であり、式中、－Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。スルホニル基の例としては、メタンスルホニル（－ＯＭｓ）、トリフルオロメタンスルホニル（－ＯＴｆ）、及び４－メタンフェニルスルホニル（－ＯＴｓ）が挙げられる。

スルホンアミド基は、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨ_２、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨＲ、又は－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ_２基であり、式中、－Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。

スルホオキシミド基（スルホオキシミン）は、－Ｓ（＝Ｏ）＝ＮＲ基であり、式中、－Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。

ホスホネート基は、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）_２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲ）、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）_２基であり、式中、－Ｒは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールから選択される。

補基質
本発明の方法では、基質は、補基質と一緒に反応して、生成物を得ることができる。還元反応では、補基質は、還元のために水素化物（Ｈ^－）を形式上、提供し得る。補基質は、典型的には補因子である。

補因子
生体触媒は、還元反応のための還元当量を提供するために、補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを使用し得る。例えば、芳香族ニトロ基の還元を触媒する際、生体触媒は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈからの還元当量を使用することができ、それによりＮＡＤ（Ｐ）＋に酸化することができる。還元型補因子対酸化型補因子の比、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈ対ＮＡＤ（Ｐ）＋の比は、補因子の酸化、及び付随する基質の還元を有利とするために、比較的高くする必要がある。

補因子は補酵素としても知られており、補基質としても知られ得る。用語「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」は、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを示すために使用され、用語及び「ＮＡＤ（Ｐ）＋」は、ＮＡＤ＋及び／又はＮＡＤＰ＋を示すために使用される。例えば、補因子として「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」を使用する生体触媒は、補因子としてＮＡＤＨを使用してもよく、追加的に又は代替的に、補因子としてＮＡＤＰＨを使用してもよい。

一実施形態では、生体触媒は、補因子としてＮＡＤＰＨを使用する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応では、還元型補因子は、基質と共に化学量論的量で存在し得る。あるいは、還元型補因子は、基質と共に化学量論的量よりも著しく少ない量で存在し得る。還元型補因子は、還元型補因子再生系を使用して再生されてもよく、これは、反応中に酸化された補因子を還元させ、それにより、基質と共に化学量論的量よりも著しく少ない量で補因子が存在することを可能にする。還元型補因子再生系は、当該技術分野において既知である。このような系は、水素化物源を、任意選択的に、水素化物源から酸化型補因子に還元当量を移動させることができる酵素と共に含み得る。水素化物源には、糖、特にヘキソース、例えば、グルコース、マンノース、フルクトースが含まれ、水素化物源にはまた、酸化性アルコール、例えば、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールが含まれ、水素化物源にはまた、ホルメート、ホスファイト、及び水素分子も含まれる。このような系は、水素化物源として、任意選択的に、糖から酸化型補因子への還元当量の移動を触媒するために、適合性のある糖脱水素酵素と共に、糖を含んでもよい。補因子がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの場合、還元型補因子再生系は、グルコース及びグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を含んでもよい。補因子がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの場合、還元型補因子再生系は、ホルメート及びホルメート脱水素酵素を含んでもよい。補因子がＮＡＤＰＨの場合、補因子再生系は、グルコース－６－ホスフェート及びグルコース－６－ホスファターゼを含んでもよい。補因子がＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの場合、補因子再生系は、ホスファイト及びホスファイト脱水素酵素を含んでもよい。

ｉｎ ｖｉｖｏ反応では、生体触媒が細胞内に提供されるとき、還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、細胞内酵素によって再生される。このような酵素は、内在性又は組換えであってもよい。例えば、グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素などの解糖に関与する細胞内酵素が、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元し得る。

生体触媒は、フラビン依存性酵素であってもよい。すなわち、生体触媒は、フラビン補欠分子族、例えばフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、又は他のフラビンを介して芳香族ニトロ基を還元するために、補因子からの還元当量を受容し得る。

方法
本発明は、芳香族ニトロ化合物を、（ａ）不均化剤及び（ｂ）生体触媒を含む触媒と接触させる工程を含む、芳香族ニトロ化合物を還元する方法を提供する。したがって、本方法は、基質を触媒と接触させて生成物を生成することを含む、合成方法である。

一実施形態では、生成物は芳香族ヒドロキシルアミン化合物である。すなわち、本方法は、芳香族ニトロ化合物を還元して、更なる還元又は不均化を伴わずに芳香族ヒドロキシルアミン化合物を生成する方法である。

別の実施形態では、生成物は芳香族アミン化合物である。すなわち、本方法は、芳香族ニトロ化合物を還元して芳香族アミン化合物を生成する方法である。より具体的には、本方法は、芳香族ニトロ化合物を還元して芳香族ヒドロキシルアミン化合物を生成し、続いて更に還元又は不均化して芳香族アミン化合物を生成する方法である。

任意選択的に、基質は、補基質と一緒に反応して、生成物を提供してもよい。すなわち、本方法は、生体触媒を補基質と接触させる工程を更に含む。補基質は、還元のために水素化物（Ｈ^－）を形式上、提供し得る。したがって、反応中に補基質が酸化される。補基質は、典型的には補因子である。補因子は、本明細書に記載されるように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈであってもよい。

任意選択的に、補因子は、基質に対して化学量論的量未満で存在してもよい。補因子は、還元型補因子再生系を使用して再生されてもよい。すなわち、本方法は、本明細書に記載されるように、還元型補因子再生系を使用して補因子を再生する工程を含む。

任意選択的に、本方法は、生成物を単離する工程、例えば、生成物を触媒及び任意の残りの基質から単離する工程を更に含む。単離工程は、副生成物、例えば、部分的若しくは過剰な還元によって基質から誘導される生成物、又はＮ－グリコシル化などの更なる反応によって生成物から誘導される生成物、からの生成物の単離を含み得る。単離工程はまた、反応媒体から生成物を単離する工程を含んでもよい。

任意選択的に、本方法は、触媒を単離する工程を含む。触媒は、必要に応じて、本発明の更なる方法で、後で再使用されてもよい。

一実施形態では、本方法は、生体触媒を単離する工程を含む。例えば、生体触媒が固定化形態で提供される場合、例えば、セルロース粉末又はポリエチレンなどの合成ポリマーなどの不活性担体に付着している場合、生体触媒は濾過によって単離され得る。

別の実施形態では、本方法は、不均化剤を単離する工程を含む。例えば、不均化剤は、濾過によって単離されてもよい。

本発明の方法は、水又は有機溶媒中で実施してもよい。本発明の方法は、単一の溶媒中、又は共溶媒の混合物中で実施してもよい。反応媒体は、単相性又は二相性であり得る。

有機溶媒は、トルエン、キシレン、ｎ－ヘプタン、エタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２－メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸イソアミル、酢酸ｔｅｒｔ－ブチル、アセトニトリル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び水に混和性又は不混和性であるかどうかにかかわらず、他の有機溶媒からなる群から選択され得る。

一実施形態では、共溶媒は、トルエン、ＭＴＢＥ及びＤＭＳＯから選択される。

共溶媒は、少なくとも０．５体積％、少なくとも１体積％、又は少なくとも２体積％の量で存在し得る。

共溶媒は、最大で１０体積％、最大で１５体積％、又は最大で２５体積％の量で存在し得る。

一実施形態では、共溶媒は、約５体積％の量で存在する。

反応は、水が溶媒の総体積に対して５ｖ／ｖ％以下など、非常に少量で存在する反応媒体中で実施してもよい。これはあまり好ましくはない。

反応は、周囲温度、高温、又は低温で実施してもよい。

反応は、少なくとも３０℃、少なくとも２５℃、少なくとも２０℃、少なくとも１５℃、少なくとも１０℃、又は少なくとも０℃の温度で実施してもよい。

反応は、最高で３５℃、最高で４０℃、最高で４５℃、最高で５０℃、最高で６０℃、最高で７０℃、最高で８０℃、又は最高で１００℃の温度で実施してもよい。本発明者らは、本明細書に開示される生体触媒が、高温及び持続温度の許容範囲であることを見出した。しかしながら、高い温度及び持続温度は、概ね、例えば補因子再曝気システムが使用される場合、酵素活性の損失と関連する。

本発明者らは、触媒が上記の上限及び下限から選択される範囲、例えば２０℃～４５℃の範囲、又は２０～３５℃の範囲の温度で触媒が使用されるとき、最適な結果が得られることを見出した。

水性媒体中の反応は、限られた範囲内のｐＨで実施してもよい。

反応媒体のｐＨは、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも６．５、又は少なくとも７であってよい。

反応媒体のｐＨは、最高８、最高９、又は最高１０であってよい。

本発明者らは、触媒が上記の上限及び下限から選択される範囲、例えばｐＨ６．５～８の範囲で使用されるとき、最適な結果が得られることを見出した。

反応媒体のｐＨは、反応開始時の反応媒体のｐＨを指し得る。

反応は、緩衝液の存在下又は非存在下で実施してもよい。

反応媒体中に緩衝液を提供して、上記の上限値及び下限値から選択される範囲で反応媒体のｐＨを維持することができる。例示的な緩衝液としては、リン酸カリウム、トリス、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ及びＣＡＰＳを含有するものが挙げられる。

緩衝液は、反応開始時に反応媒体中に提供してもよく、又は反応が進行するにつれて反応媒体に添加してもよい。緩衝液は、バッチ式又は連続的に添加してもよい。

反応は、部分ごとに実施されてもよい。すなわち、基質は、触媒を含む反応混合物に別個の部分（バッチ）で添加してもよい。基質は、未希釈で、又は溶媒中の溶液として添加してもよい。

基質は、２～１０部分、例えば、２～８部分又は２～４部分で添加してもよい。

この部分は同じサイズであってもよく、又は異なっていてもよい。例えば、第１の部分は、全基質量の５０％を含んでもよく、続いて、それぞれが全基質量の２５％を含む２つの更なる部分を含んでもよい。

基質の添加する部分間の間隔（時間）は、同じであってもよく、異なっていてもよい。例えば、第１の部分と第２の部分との間の間隔は３０分であってもよく、第２の部分と第３の部分との間の間隔は１時間であってもよい。

この反応は、連続供給法で実施してもよい。すなわち、基質は、触媒を含む反応混合物に連続的に添加してもよい。例えば、基質は、滴下方式で添加してもよい。あるいは、基質は、ポンプ、例えばシリンジポンプを使用して添加してもよい。基質は、未希釈で、又は溶媒中の溶液として添加してもよい。

反応は、段階的に実施してもよい。それはすなわち、基質を最初に中間体に変換することができるということである。続いて、中間体を最終生成物に変換することができる。中間体は、最終生成物への変換前に単離してもよい。あるいは、中間体は、最終生成物への変換の前に、初期反応媒体中に残存してもよい。典型的には、中間体はヒドロキシルアミン化合物である。

基質は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、又は少なくとも５００ｍＭの濃度で存在してもよい。

基質は、最高で５０ｍＭ、最高で１００ｍＭ、最高で２００ｍＭ、最高で３００ｍＭ、最高で５００ｍＭ、最高で１，０００ｍＭ、最高で１，５００ｍＭ、又は最高で２，０００ｍＭの濃度で存在してもよい。

本発明者らは、基質が上記の上限及び下限から選択される範囲、例えば、２０ｍＭ～１，０００ｍＭ、例えば、２０ｍＭ～２００ｍＭＭといった範囲内の濃度で使用されるとき、最適な結果が得られることを見出した。

基質は、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、少なくとも４０ｇ／Ｌ、又は少なくとも５０ｇ／Ｌの濃度で存在してもよい。

基質は、最高で１，０００ｍｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、最高で１０ｇ／Ｌ、最高で２０ｇ／Ｌ、最高で３０ｇ／Ｌ、最高で５０ｇ／Ｌ、最高で１００ｇ／Ｌ、最高で１５０ｇ／Ｌ、又は最高で２００ｇ／Ｌの濃度で存在してもよい。

反応に必要とされる触媒の量は、存在する基質の量に対して少なくてもよく、反応媒体中のその濃度に関しては低くてもよい。

生体触媒は、少なくとも０．０５ｇ／Ｌ、少なくとも０．１０ｇ／Ｌ、少なくとも０．２５ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、又は少なくとも２．０ｇ／Ｌの濃度で存在してもよい。

生体触媒は、最高で０．０５ｇ／Ｌ、最高で０．５０ｇ／Ｌ、最高で１．０ｇ／Ｌ、最高で２．０ｇ／Ｌ、最高で５．０ｇ／Ｌ、又は最高で１０．０ｇ／Ｌの濃度で存在してもよい。

一実施形態では、生体触媒は、約５．０ｇ／Ｌの濃度で存在する。

不均化剤は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．２ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、又は少なくとも１００ｍＭの濃度で存在してもよい。

不均化剤は、最高で１ｍＭ、最高で２ｍＭ、最高で５ｍＭ、最高で１０ｍＭ、最高で２０ｍＭ、最高で５０ｍＭ、最高で１００ｍＭ、最高で２００ｍＭ、又は最高で５００ｍＭの濃度で存在してもよい。

一実施形態では、不均化剤は、約５ｍＭの濃度で存在する。

不均化剤は、基質に対して少なくとも０．００００１当量、少なくとも０．０００１当量、少なくとも０．００１当量、又は少なくとも０．０１当量の比で存在してもよい。

不均化剤は、基質に対して最大で０．１当量、最大で１当量、又は最大で１０当量の比で存在してもよい。

一実施形態では、不均化剤は、基質に対して約０．１当量の比で存在する。

反応は、望ましい量の材料の生成を可能にするのに十分な時間にわたって行われてもよい。続いて、反応混合物をワークアップして、生成物材料を単離してもよい。

一実施形態では、反応時間は、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも１時間、又は少なくとも２時間である。

一実施形態では、反応時間は、最大で１８時間、最大で２４時間、最大で３６時間、最大で４８時間、最大で７２時間、最大で９６時間、又は最大で１２０時間である。

反応の終了は、触媒及び生成物が単離される時点であり得る。

所望の生成物の収率が実質的に経時的に増加しない場合、反応は完了しているとみなすことができる。

一実施形態では、反応は、ｉｎ ｖｉｔｒｏなどのｅｘ ｖｉｖｏで実施される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応は、細胞外又は無細胞反応を指す。

使用
本発明は、芳香族ニトロ化合物を還元するための触媒としての（ａ）不均化剤及び（ｂ）生体触媒の使用を提供する。したがって、触媒は、基質を生成物に変換するための合成方法で使用することができる。

基質は、本明細書に記載の芳香族ニトロ化合物である。

一実施形態では、生成物は芳香族ヒドロキシルアミン化合物である。すなわち、触媒を使用して、更なる還元又は不均化を伴わずに芳香族ニトロ化合物を芳香族ヒドロキシルアミン化合物に還元することができる。

別の実施形態では、生成物は芳香族アミン化合物である。すなわち、触媒を使用して、芳香族ニトロ化合物を芳香族ヒドロキシルアミン化合物に還元し、続いて更なる還元又は不均化を行い、芳香族アミン化合物を得ることができる。

触媒は、補基質と組み合わせて使用してもよい。補基質は、還元のために水素化物（Ｈ－）を形式上、提供し得る。補基質は、典型的には補因子である。生体触媒は、本明細書に記載されるように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補因子として使用してもよい。

触媒は、本明細書に記載されるように、水又は有機溶媒中で、単一溶媒として、又は共溶媒の混合物のいずれかとして使用してもよい。

触媒は、本明細書に記載される、周囲温度、高温、又は低温で使用してもよい。

触媒は、本明細書に記載される、限定された範囲内のｐＨで、水性媒体中で使用してもよい。触媒は、本明細書に記載される、反応媒体のｐＨを範囲内に維持するために、緩衝液と組み合わせて使用してもよい。

触媒は、存在する基質の量に対して少なくてもよく、反応混合物中のその濃度に関しては低い量で使用してもよい。生体触媒及び不均化剤は、本明細書に記載される濃度で存在し得る。

触媒は、ｉｎ ｖｉｔｒｏなどのｅｘ ｖｉｖｏ反応で使用してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応は、細胞外又は無細胞反応を指す。

キット
本発明は、（ａ）不均化剤と、（ｂ）生体触媒と、を含むキットを提供する。したがって、キットは、基質を触媒と接触させて生成物を生成することを含む、合成方法を実施するために使用され得る。

不均化剤は、キット内の生体触媒から空間的に分離していてもよい。したがって、不均化剤は、ウェルプレートのウェル、又は別個のバイアル、又は他の容器内に提供してもよい。

キットは、本明細書に記載される方法を完了するための一連の指示書を含んでもよい。

キットは、触媒と共に使用するための追加の試薬を含んでもよい。

キットは、補基質、例えば還元剤を含んでもよい。還元剤は、還元反応のために水素化物（Ｈ－）を形式上、提供し得る。還元剤は、典型的には補因子である。キットは、本明細書に記載されるように、補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含んでもよい。

キットは、本明細書に記載されるように、溶媒、例えば水を、典型的には別の溶媒（「共溶媒」）と共に含んでもよい。

キットは、本明細書に記載されるように、反応媒体のｐＨをある範囲内に維持するための緩衝液を含んでもよい。

キットは、異なる量の不均化剤及び生体触媒を含んでもよく、例えば、キットは、生体触媒よりも多量の不均化剤を含んでもよい。

キットは、１つ以上の更なる触媒を含んでもよい。更なる触媒は、本明細書に記載される芳香族ニトロ基の還元などの還元反応で使用することができる。追加的に又は代替的に、更なる触媒は、還元反応ではない反応、すなわち芳香族ニトロ基の還元ではない反応で使用するためのものであってもよい。

更なる触媒は、生体触媒であってもよい。したがって、更なる触媒は、酵素活性を有し得る。更なる触媒は、補因子再生活性を有し得る。

キットは、例えば、キット内の各触媒の活性を確立するために、基準基質を含んでもよい。

触媒は、キットの他の触媒又は他の構成要素から空間的に分離していてもよい。したがって、触媒は、ウェルプレートのウェル、又は別個のバイアル、又は他の容器内に提供してもよい。

他の実施形態
上記の実施形態の各及び全ての適合性のある組み合わせは、各組み合わせ及び全ての組み合わせが個別にかつ明示的に列挙されているかのように、本明細書に明示的に開示される。

本開示を考慮することで、本発明の様々な更なる態様及び実施形態が当業者に明らかになるであろう。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の有無にかかわらず解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書に個別に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。

文脈による別段の指示がない限り、上記に述べた特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。

本発明の特定の態様及び実施形態は、ここで例として、及び上記の図を参照して例示される。

実験
生体触媒－調製
本報で報告された生体触媒は、公的に入手可能なデータベースＮＣＢＩから特定され、ＮＣＢＩデータベースにおいて以下のＲｅｆＳｅｑアクセッション番号を有する：ＮＲ－４ ＷＰ＿００３１７８９５１．１、ＮＲ－１４ ＷＰ＿００６８８１３９１．１、ＮＲ－１７ ＷＰ＿００３６８３９６５．１、ＮＲ－２４ ＷＰ＿０１１１３５７９１．１、ＮＲ－３２ ＷＰ＿０５０８６４１３０．１及びＮＲ－３５ ＷＰ＿００１００１１７６．１、ＥＮＥ－１０１ ＷＰ＿０１３５９２５６９．１、ＥＮＥ－１０２ ＷＰ＿０１１１３７０４８．１、ＥＮＥ－１０３ ＷＰ＿００９７９４７２１．１。遺伝子ストリングは、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから取り寄せ、標準的なクローニング手順に従って、隣接する制限部位ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩを用いてプラスミドｐＪＥｘ４０１にクローニングした。生体触媒の発現には、プラスミドを大腸菌ＢＬ２１で形質転換し、ＬＢ－カナマイシンプレートからの１コロニーを用いて２ｍＬのＬＢ－カナマイシン液体培地プレ培養液を播種した。プレ培養液を３７℃及び１８０ｒｐｍで１８時間インキュベートした。全プレ培養液を用いて、１Ｌのバッフル付き振盪フラスコにおいて、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２００ｍＬのＴＢ培地を播種した。ＯＤ_６００が約１に達するまで３７℃及び１８０ｒｐｍで培養液をインキュベートし、次いで０．１ｍＭのＩＰＴＧを使用して誘導し、温度を３０℃まで下げた。一晩インキュベートした後、細胞を４２００ｒｐｍで２０分間回収し（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ Ｘ３Ｒ）、細胞を、リン酸カリウム緩衝液緩衝液１００ｍＭ ｐＨ７に再懸濁させた。Ｓｏｎｉｃａ Ｖｉｂｒａ Ｃｅｌｌ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（２分、５秒間パルス、２秒、６０％振幅パルス）を使用して超音波処理により細胞溶解を実施した。細胞溶解物を１１，０００ｒｐｍで１５分間清澄化し、上清を０．２２μｍシリンジフィルターを用いて濾過し、得られた清澄化細胞抽出物を－８０℃で凍結させた。Ｃｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ １－２ ＬＤｐｌｕｓ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒを使用して凍結乾燥を実施し、２４時間の単一乾燥サイクルを０．２７ｍｂａｒの真空圧で適用した。

精製目的のために、Ｎ末端Ｈｉｓタグを有する組み換え生体触媒を、上記の手順に従って発現させた。上清を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＬＰクロマトグラフィーシステム装置で酵素精製に使用した。粗抽出物を５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＧＥカラムにロードし、結合緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ ７．５）及び溶出緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾールを含む１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ ７．５）を使用して、セミリニアグラジエント（０～５００ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出相中、５ｍＬの画分を回収し、タンパク質ゲルを流して、生体触媒タンパク質を含有する画分を同定した。次いで、正確な画分を合わせ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）２０遠心濃縮機で濃縮し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＰＤ－１０カラムを使用して脱塩し、急速冷凍し、－８０℃で保存した。

タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（トリス－グリシン緩衝液系中１５％の分離ゲルと５％の濃縮ゲル）により分析したところ、９５％以上の純度であることが判明した。

ニトロ及びアミン出発物質
ニトロ化合物２ａ－２ｌ、２ｎ、２ｏ、２ｐ及び対応するアミン化合物をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。２－クロロ－３－ニトロピリジン２ｍ及び対応するアミンは、Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

分析ＨＰＬＣ法－ＨＰＬＣ設定
ＨＰＬＣ分析は、以下に示す条件を使用して、Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｐｈｅｎｙｌカラム５μｍ、４．６×２５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＪＡＳＣＯ Ｐｕ－２０８０ ｐｌｕｓで行った。
移動相（Ａ）：０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡを有する水
移動相（Ｂ）：０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡを有するアセトニトリル
流速：１ｍＬ／分。
カラム温度：２５℃
検出器：２２０ｎｍ。

ニトロ化合物の観察された保持時間を表３に示す。

生体触媒－初期スクリーニング
生体触媒の初期スクリーニングは、この生体触媒変換の潜在的な候補を特定するために、参照として２－エチル－ニトロベンゼン２ｄ及びニトロベンゼン２ｅを使用して実施した。各反応物は、４７５μＬの緩衝液２５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０；７．０又は８．０）＋１ｍＭのＮＡＤＰ^＋及び１ｍＭのＮＡＤ^＋、１００ｍＭのＤ－グルコース、１ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ＋５ｍｇ／ｍＬのＮＲ酵素＋２５μＬの基質２ｄ又は２ｅ溶液（ＭＴＢＥ中０．４Ｍ、基質の最終濃度２０ｍＭ）＋５０μＬのＶ_２Ｏ_５（２０ｍＭストック、最終濃度２ｍＭ）を含有した。反応物を、３５℃で１８時間振盪させた。反応物を、ＡＣＮ（１ｍＬ）でクエンチし、ボルテックスし、遠心分離した。次いで、試料を回収し、ＨＰＬＣにより分析した。スクリーニングの結果を表４及び表５に示す。

^ａ未補正値

^ａ未補正値

スクリーニングした酵素のうちの２つ、ＮＲ＿０４及びＮＲ＿２４は、２－エチル－ニトロベンゼン２ｄ（表４、項目２及び１８）の高い活性を示し、一方、他の酵素は、わずかな活性のみを示す。ニトロベンゼン２ｅは、酵素パネルによってはるかに良好に受容され、４０酵素のうちの１３酵素が、対応するアミン１ｅへの基質２ｅの７０％超の変換を示す。加えて、これらの実施例における出発物質の割合は非常に低く、典型的には５％未満であり、残りの２５％は中間体６ｅ（アザオキシ）及び４ｅ（ジアゾ）により形成される。

これらの結果は、特定の基質に対するそれらの選好に基づいて、今後の用途のための酵素の選択プロセスを可能にする。

不均化剤－初期スクリーニング
ヒドロキシルアミン中間体３の不均化のための金属添加剤の初期スクリーニングは、２つのニトロ還元酵素、ＮＲ＿０４及びＮＲ＿３６、並びに５つの金属添加剤（ＣｕＣｌ_２、ＦｅＣｌ_２、ＮａＭｏＯ_４、及びＣｏＣｌ_２、及びＶ_２Ｏ_５）の選択を用いて実施した。各反応物は、４７５μＬの緩衝液２５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０；７．０又は８．０）＋１ｍＭのＮＡＤＰ^＋及び１ｍＭのＮＡＤ^＋、１００ｍＭのＤ－グルコース、１ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ＋５ｍｇ／ｍＬのＮＲ酵素＋２５μＬの基質２ａ～ｅ溶液（ＭＴＢＥ中０．４Ｍ、基質の最終濃度２０ｍＭ）＋５０μＬの金属添加剤（２０ｍＭストック、最終濃度２ｍＭ）を含有した。反応物を、３５℃で１８時間振盪させた。反応物を、ＡＣＮ（１ｍＬ）でクエンチし、ボルテックスし、遠心分離した。次いで、試料を回収し、ＨＰＬＣにより分析した。このスクリーニングの結果を、表６に示す。

^ａ未補正値

様々な金属添加剤のスクリーニングは、ヒドロキシルアミン中間体の不均化が酵素／金属添加剤の組み合わせに強く依存していることを示した。概して、より多量のアミン生成物が、酸化バナジウム（Ｖ）及び酵素ＮＲ＿０４の存在下で得られ、一方、同じ金属と酵素ＮＲ＿３６とは、基質変換率がはるかに低いように見えるが、最終反応混合物はかなりの量の非変換ニトロ基質を含有する（図１Ｄ）。

基質２ｂは、調査した全ての金属で比較的良好な変換を示し、その一方で、その位置異性体２ａは、最良の金属添加剤としてＶ_２Ｏ_５を選好する。加えて、基質２ａを含有する反応物は、適度な量の非変換出発物質を有する、大量のアゾキシ中間体６ａを含有し、このことは、バナジウム以外の金属添加剤が使用される場合にヒドロキシルアミンの不均化が遅くなることを示唆している（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ）。立体的に困難のある基質２ｄは、ＣｕＣｌ_２又はＶ_２Ｏ_５のいずれかの存在下で、対応するアミン１ｄへの類似の変換率を与える一方で、単純なニトロベンゼン２ｅは、ＣｏＣｌ_２、ＮａＭｏＯ_４、又はＦｅＣｌ_２添加剤を使用した場合に、かなりの量のヒドロキシルアミン中間体が存在することを示す。

基質スペクトル試験
ニトロ還元酵素回収のスクリーニングは、広範な基質及び金属添加認容性を有する４つのニトロ還元酵素（ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１４、ＮＲ＿１７、及びＮＲ＿２４）を同定した。この酵素群を、以下に示す、拡張した基質パネルを調査するために使用した。

各反応物は、３２５μＬの緩衝液２５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０；７．０又は８．０）＋１ｍＭのＮＡＤＰ^＋及び１ｍＭのＮＡＤ^＋、１００ｍＭのＤ－グルコース、１ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ＋５ｍｇ／ｍＬのＮＲ酵素＋２５μＬの基質２溶液（ＭＴＢＥ中０．４Ｍ、基質の最終濃度２０ｍＭ）＋５０μＬのＶ_２Ｏ_５（２０ｍＭストック、最終濃度２ｍＭ）を含有した。反応物を、３５℃で１８時間振盪させた。反応物を、ＡＣＮ（１ｍＬ）でクエンチし、ボルテックスし、遠心分離した。次いで、試料を回収し、ＨＰＬＣにより分析した。金属添加剤を含まない反応物では、マスターミックス（緩衝液、補因子、ＧＤＨ、グルコース）の量は３７５μＬであり、全ての他の成分は上記のものと同一であった。

基質スペクトル試験－オルトメチル基及びクロロ基（２ａ及び２ｂ）
基質２ａ及び２ｂのニトロ還元の結果を表７及び表８に示す。

^ａ未補正値

^ａ未補正値

基質２ａ及び２ｂは、生体触媒によるニトロ還元反応にいくつかの課題を提起した。これらの基質は、ニトロ基のオルト位にメチル基を有し、ある一定の立体障害及びハロゲン原子をもたらすものであり、環での電子効果の原因となっている。基質２ａ及び２ｂの結果は、ハロゲンの位置が反応結果に影響し得ることを示唆しており、Ｃｌ原子がパラ位ではなくメタ位にあるとき、わずかに多いアミンが形成されるが、この効果は更に調査する必要がある（図２Ａ～Ｃ）。

最も活性な酵素はＮＲ＿０４であると考えられ、これは、非常に広範囲の基質上に最も高い活性を一貫して示す。対照的に、ＮＲ＿１４は、非常に良好なこれらの種類の化合物を受容するようではなく、非常に穏やかな活性を示す。興味深いことに、脱塩素化は観察されない。形成されたアゾキシ中間体は、バナジウム添加剤の存在下であってもかなり残り、異なる他の金属添加剤のスクリーニングは、バナジウムの結果の改善を示すことができなかった。

基質スペクトル試験－オルト－アルキル基（２ｃ、２ｄ及び２ｅ）
基質２ｃ、２ｄ及び２ｅのニトロ還元の結果を表９、表１０、及び表１１に示す。

^ａ未補正値

^ａ未補正値

^ａ未補正値

基質２ｃ、２ｄ、及び２ｅは、オルト位の基のニトロ基への立体障害効果を更に調査するように選択された。２－エチル－ニトロベンゼンを使用した以前のニトロ還元酵素のスクリーニングは、酵素ＮＲ＿０４、ＮＲ＿１７、及びＮＲ＿２４を、この基質の最適の活性な生体触媒として特定し、対応するアニリンへの良好な変換を行った。

２，４－ジメチル－ニトロベンゼン基質２ｃは、非常に興味深い挙動を示した。酵素によって十分に受容され、多量のヒドロキシルアミン３ｃが形成される（図３Ａ～Ｃを参照）ようであるが、反応物へのバナジウムの添加は、出発物質変換に悪影響を及ぼすように見える。具体的には、酵素ＮＲ＿１４及びＮＲ＿１７により触媒される反応は、ニトロ化合物の変換をほとんど又は全く生じない。

基質スペクトル試験－ビニル基（２ｌ）
基質２ｌのニトロ還元の結果を表１３に示す。

^ａ未補正値

３－ビニル－ニトロベンゼン２ｌを使用して、脂肪族二重結合の競合還元を調査した。基質は、反応終了時に検出された微量の非変換材料のみを用いて、酵素によって非常に良好な忍容性を示した（図４Ａ）。

バナジウム塩を添加したとき、アミン生成物への変換は９０％超の値に達し、副生成物は最小限に抑えられ、二重結合の還元の形跡はなかった。バナジウム添加剤を含まない反応中の相当量のアミンの存在は、ヒドロキシルアミン中間体のより速い不均化によって説明することができる。

基質スペクトル試験－クロロ基（２ｆ、２ｇ及び２ｈ）
基質２ｆ、２ｇ、及び２ｈのニトロ還元の結果を表１３、表１４及び表１５に示す。

^ａ未補正値

^ａ未補正値

^ａ未補正値

単純なクロロ－ニトロベンゼン２ｆ、２ｇ及び２ｈは、試験した酵素によって十分に受容され、脱塩素化は観察されなかった（図５Ａ～Ｃ）。バナジウムを反応物に添加すると、対応するアニリンへの完全な化学選択的及びほぼ定量的な変換が得られた。

基質スペクトル試験－ニトリル基（２ｊ及び２ｋ）
基質２ｊ及び２ｋのニトロ還元の結果を表１６及び表１７に示す。

^ａ未補正値

^ａ未補正値

ニトリル２ｊ及び２ｋもまた、酵素によって十分に受容され、ここでもまた副生成物の量も最小限に抑えられた（図６Ａ～Ｂ）。ニトリル基の還元は観察されなかった。

基質スペクトル試験－ニトロピリジン（２ｍ及び２ｏ）
基質２ｍ及び２ｏのニトロ還元の結果を表１８及び表１９に示す。

^ａ未補正値

^ａ未補正値

ニトロピリジン２ｍ及び２ｏは、対応するアニリンに良好な収率で容易に還元され、副生成物は最小限に抑えられた（図７Ａ～Ｂ）。上述のように、脱塩酸又は競合還元反応は観察されなかった。

基質スペクトル試験－ベンジルエーテル（２ｎ）
基質２ｎのニトロ還元の結果を表２０及び図１０に示す。

^ａ未補正値

ベンジル３－ニトロフェニルエーテル２ｎは、ＮＲ＿０４及びＮＲ＿１４によって適度に良好に受容され、バナジウム塩の存在下で、対応するアニリンへの変換が７０％を超えた。重要なことに、還元はニトロ基に対して非常に選択的であり、脱ベンジル化生成物は観察されなかった。

基質スペクトル試験－イソキノリン（２ｐ）
基質２ｐのニトロ還元の結果を表２１に示す。

^ａ未補正値

ニトロ－イソキノリン誘導体２ｐを同じ条件で試験したが、この生体触媒反応により、不利な結果が得られた。ＮＲ＿０４のみが、アミン１Ｐへの出発物質の限定的な変換を示した（図９Ａ）。

バナジウムの使用は、反応結果を改善しなかった。結果は、基質の非常に乏しい溶解度、及びその嵩高度によっても部分的に説明することができ、酵素の活性部位に適合することが困難になる。

この条件で、１０ｍＭ濃度の基質を使用して実験を実施した。

実験プロトコル：ニトロクロロイソキノリン２ｐ（１７．７ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、最終濃度２０ｍＭ）を０．４ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、リン酸緩衝液ｐＨ７に、ＮＲ＿０４ ５ｍｇ／ｍＬ、ＮＡＤＰ^＋１ｍＭ、ＮＡＤ^＋、ＧＤＨ １ｍｇ／ｍＬ、及びグルコース１００ｍＭを含有する反応混合液（４ｍＬ）に加えた。反応混合物を３５℃で２０ｈにわたって撹拌した後、それをＤＣＭ（２×５ｍＬ）中で抽出し、ブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮して、暗黄色粉末（３３．９ｍｇ）を得た。

所望の生成物の合成に向けて反応を最適化するために、表２１に示すように追加のニトロ還元酵素をスクリーニングした。基質２ｐの溶解度が非常に乏しいため、先の基質として２０ｍＭではなく、１０ｍＭ基質濃度スケールで反応を実施した。

実験プロトコル：各反応には、３２５μＬの緩衝液２５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７）＋１ｍＭ ＮＡＤＰ^＋及び１ｍＭのＮＡＤ^＋、１００ｍＭのＤ－グルコース、１ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ＋５ｍｇ／ｍＬ ＮＲ酵素＋２５μＬの基質２ｐ溶液（ＤＭＳＯ中０．２Ｍ、基質の最終濃度１０ｍＭ）＋５０μＬのＶ_２Ｏ_５（２０ｍＭストック、最終濃度２ｍＭ）が含まれていた。反応物を、３５℃で１８時間振盪させた。反応物を、ＡＣＮ（１ｍＬ）でクエンチし、ボルテックスし、遠心分離した。次いで、試料を回収し、ＨＰＬＣにより分析した。金属添加剤を含まない反応では、マスターミックス（緩衝液、補因子、ＧＤＨ、グルコース）の量は３７５μＬであり、全ての他の成分は上記のものと同一であった。

^ａ未補正値

興味深いことに、この基質に対しては、ＮＲ＿０４に加えて、主にＮＲ＿１７、ＮＲ＿２３、及びＮＲ＿２４といった、他の酵素の結合が、一定水準の活性を示した。ニトロ還元酵素ＮＲ＿２０は、分析中に検出された微量の出発物質のみを用いて、アミンへの８３％の変換率という見事な変換率を示した。しかしながら、ＮＲ＿０４及びＮＲ＿２０の両方は、質量バランスの約１５％を占めるいくつかの副生成物を示す。

最初のスケールアップ反応と比較して、ＮＲ＿０４は、バナジウム添加剤上の存在下で、小規模ではるかに良好な変換率を示し、これは^１ＨＮＭＲ分析によって確認された（図９Ｂ）。

参考文献
本発明及び本発明が関連する最先端技術を、より完全に説明及び開示するために、多数の刊行物が上に引用されている。これらの参考文献の完全な引用を以下に提供する。これらの参考文献のそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる。

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Claims (29)

1. 芳香族ニトロ化合物を還元する方法であって、
   （ｉ）芳香族ニトロ化合物を触媒と接触させる工程であって、前記触媒が、
   （ａ）不均化剤、及び
   （ｂ）生体触媒を含む、
   工程を含む、方法。
2. 前記不均化剤が、第３族～第１３族から選択される金属を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記不均化剤が、第５族～第１１族から選択される遷移金属を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記不均化剤が、バナジウム、クロム、モリブデン、鉄、コバルト、ニッケル、又は銅から選択される遷移金属を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記不均化剤が、ＣｕＣｌ_２、Ｃｕ（ＯＡｃ）_２、Ｃｕ_２Ｏ、Ｃｕ（０）（銅金属）、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＣｌ_３、Ｆｅ（ａｃａｃ）_３、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＳＯ_４、Ｆｅ（０）（鉄金属）、ＮａＭｏＯ_４、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、Ｖ（ａｃａｃ）_３、Ｖ_２Ｏ_５、Ｖ（０）（バナジウム金属）、及びＣｏＣｌ_２から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記不均化剤が、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＶＯＳＯ_４、及びＶ_２Ｏ_５から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記生体触媒が、ニトロ還元酵素である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記生体触媒が、以下のモチーフ（１）：
   （１）Ａ－ｘ（３，４）－Ｇ－ｘ－［ＡＤＥＧＱＳＴ］－ｘ（４）－［ＡＤＥＧＮＱＳＴ］－［ＡＥＧＮＱＳＴ］
   ［式中、ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
   ｘ（ｎ）は、長さｎの任意のアミノ酸残基からなるセグメントを表し、
   ［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、
   アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって表される］
   を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記生体触媒が、配列番号１［ＮＲ－４］の５、３９、４０、４１、４２、６４、６５、６７、１１２、１３２、１３５、１３６、１３８、２２０、２２４、２２９、２３０に対応する位置に配列番号１［ＮＲ－４］のものと類似又は同一の少なくとも９個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記生体触媒が、配列番号１［ＮＲ－４］の
    １３、１５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、６４、６５、６７、６９、１０４、１１２、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１７２、２２０、２２１、２２４、２２５、２２９、２３０、２３３
    に対応する位置に配列番号１［ＮＲ－４］のものと類似又は同一の少なくとも１５個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記生体触媒が、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも７０％の類似性又は同一性を有し、配列番号１［ＮＲ－４］における以下の位置に対応する残基に以下のアミノ酸を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む：
    ４１［ＳＩＭＶＡＨＮＴＷＬ］；
    １３６［ＧＳＡＮ］；
    ２２４［ＫＡＴＹＦＲＥＧＩＱＶ］；
    ２２９［ＳＫＲＹＡＱＣＧＨＮＴＶ］；
    ２３０［ＲＫＹＥ］
    ［式中、
    ［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、
    アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって表される］、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記生体触媒が、配列番号１［ＮＲ－４］、２［ＮＲ－１４］、３［ＮＲ－１７］、又は４［ＮＲ－２４］と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記方法が、芳香族ニトロ化合物を還元して芳香族ヒドロキシルアミン化合物を生成する方法である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記方法が、芳香族ニトロ化合物を還元して芳香族アミン化合物を生成する方法である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記生成物を単離する工程を更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記触媒を単離する工程を更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記生体触媒を補基質と接触させる工程を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記補基質が補因子であり、任意選択的に、還元型補因子再生系を使用して前記補因子を再生する工程を更に含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記芳香族ニトロ化合物を前記触媒と接触させる工程が、前記芳香族ニトロ化合物の独立した部分を前記触媒に添加することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記芳香族ニトロ化合物を前記触媒と接触させる工程が、前記芳香族ニトロ化合物を前記触媒に連続的に添加することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 温度が０～１００℃の範囲に維持される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ｐＨが３．０～９．０の範囲に維持される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 芳香族ニトロ化合物を還元するための触媒としての
    （ａ）不均化剤及び
    （ｂ）生体触媒
    の使用。
24. 前記不均化剤が、請求項２～６のいずれか一項に記載のとおりである、請求項２３に記載の使用。
25. 前記生体触媒が、請求項７～１２のいずれか一項に記載のとおりである、請求項２３又は２４に記載の使用。
26. （ａ）不均化剤、及び
    （ｂ）生体触媒
    を含む、キット。
27. 前記不均化剤が、請求項２～６のいずれか一項に記載のとおりである、請求項２６に記載のキット。
28. 前記生体触媒が、請求項７～１２のいずれか一項に記載のとおりである、請求項２６又は２７に記載のキット。
29. 前記生体触媒が、配列番号１［ＮＲ－４］と少なくとも７０％の類似性又は同一性を有し、配列番号１［ＮＲ－４］の保存された活性部位残基に対応する以下の位置に以下のアミノ酸を有するポリペプチドであるか、又はそれを含む：
    ４１［ＳＭＶＡＨＮＴＷＬ］；
    １３６［ＳＡＮ］；
    ２２４［ＫＴＹＦＲＥＧＩＱＶ］；
    ２２９［ＳＫＲＹＡＱＣＧＨＮＴ］；
    ２３０［ＲＹＥ］
    ［式中、［ａｂ］は、ａ又はｂから選択される単一の残基を表し、アミノ酸は、それらの単一の文字コードによって表される］、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法で使用するための生体触媒。

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