CN103642861B - 一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用，所述硝基还原酶具有如SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸残基序列。本发明提供的硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用，当苯环上硝基取代基的数目大于等于1时，本发明提供的硝基还原酶都对其具有还原活性，不仅包括对硝基苯甲醛类，硝基甲苯类，硝基苯胺类，硝基酚类，硝基呋喃类，硝基苯类的还原，还包括抗癌前药CB1954，开辟了其作为前药激活剂在基因治疗中的潜在应用。

Description

一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域和基因工程技术领域，更具体地涉及一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌被称为“活着的氧化催化剂”，可不完全氧化各种醇、醛等化合物，在工业上的有着很重要的应用，也是工业生物技术中被广泛应用的微生物种之一。

硝基芳香化合物广泛存在于自然界中，主要应用于染料、杀虫剂、炸药、农药、医药及其他化工产品的生产(SHUHEIZENNOetal,1996)。随着工农业的迅速发展，进入环境中的硝基芳香化合物日益富集，给人类赖以生存的生态环境造成了严重的污染，因硝基的存在而使其难以降解(CHARLESC.SOMERVILLEetal1995)。硝基基团作为生物医药、抗菌剂和杀虫剂中常见的官能基团，对该硝基基团的还原是实现硝芳基污染物降解的关键步骤。硝基还原酶是一类以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或尼克酰胺二核苷酸(NADPH/NADH)为氢供体的黄素蛋白。近年来，因硝基还原酶参与了爆炸物、硝基化合物类环境污染物的降解，而逐渐走进人们的视野。随着基因治疗新技术的发展，L.M.CoBB（1969）合成出CB1954，人们开始挖掘硝基还原酶/CB1954在基因治疗中的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用，不再仅仅局限于对环境的净化，并且开辟了硝基还原酶在基因治疗新技术领域中的发展。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用，所述硝基还原酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸残基序列。

所述硝基还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述芳香族硝基化合物包括：硝基苯甲醛类，硝基甲苯类，硝基苯胺类，硝基酚类，硝基呋喃类，硝基苯类。

所述芳香族硝基化合物还包括抗癌前药CB1954。

所述硝基还原酶以NADPH为辅酶。

所述硝基还原酶的辅因子是FMN。

所述硝基还原酶在30℃～70℃温度范围内保持最高酶活50%以上的酶活。

优选地，所述硝基还原酶的最适温度是60℃。

所述硝基还原酶在pH6～9.5范围内保持最高酶活50%以上的酶活。

优选地，所述硝基还原酶的最适pH是8.5。

本发明提供的硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用，本发明的硝基还原酶底物谱宽泛，能够还原多种芳香族硝基化合物，不仅包括对硝基苯甲醛类，硝基甲苯类，硝基苯胺类，硝基酚类，硝基呋喃类，硝基苯类的还原，还对抗癌前药CB1954表现良好的还原酶活性，开辟了其作为前药激活剂在基因治疗中的潜在应用。

附图说明

图1是本发明的硝基还原酶基因的DNA电泳图谱；

图2是本发明的质粒pET28a-gox0834的构建图；

图3是本发明的基因工程菌发酵表达的粗酶液的SDS-PAGE验证图；

图4是本发明的基因工程菌发酵表达的粗酶液经过镍柱纯化所得纯硝基还原酶的SDS-PAGE验证图；

图5是本发明的硝基还原酶在不同温度下的相对活力；

图6是本发明的硝基还原酶在不同pH值下的相对活力；

图7A、图7B和图7C是测定gox0834辅因子的HPLC洗脱图，其中图7A是FMN，图7B是FAD，图7C是gox0834的辅因子，横坐标代表时间，单位是分钟；

图8A和图8B是本发明的硝基还原酶还原间二硝基苯产物鉴定的GC-MS图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

1、氧化葡萄糖酸杆菌总DNA的提取

将氧化葡萄酸杆菌GluconobacteroxydansDSM2003（德国微生物菌种保藏中心）接种于培养基，30℃200rpm振荡过夜培养收集菌体，用TIANampBacteriaDNAKit（TIANGEN）提取基因组DNA，作为扩增基因的模板。

2、硝基还原酶基因的克隆和筛选

根据氧化葡萄糖酸杆菌DSM2003的硝基还原酶编码基因gox0834（其氨基酸残基序列如SEQIDNO.1所示，基因序列如SEQIDNO.2所示）设计引物，得到两条引物（上海捷瑞生物工程有限公司），引物序列分别为：

5’-ACGGAATTCATGTCGGGCACCTCTTCC（带下划线的碱基为EcoRⅠ识别位点）；

5’-ATTAAGCTTTTAGCGGAGCGGAAAGCCGAGCCTG（带下划线的碱基为HindⅢ识别位点，粗体为终止密码子）。

取步骤1中提取的氧化葡萄酸杆菌基因组DNA为模板，采用上述引物PCR扩增本发明的硝基还原酶编码基因。其中，50μlPCR反应体系为：模板（100ng/μl）2μl；PCRmix（东盛）25μl；引物（各20ng/μl）1.5μl；ddH₂O20μl。PCR反应程序如下：第一阶段变性95℃，5min；第二阶段变性95℃，30s，退火58℃，30s，延伸72℃，1min，共进行25个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中Marker购自东盛，分子量从小到大分别为200bp，500bp，800bp，1200bp，2000bp，3000bp，4500bp。

PCR产物用EcoRⅠ和HindⅢ（TAKARA）双酶切，用Cycle-PureKit（OMEGA）直接回收酶切片段，与经同样限制性内切酶酶切并直接回收的质粒pET28a链接，转化感受态大肠杆菌（E.coli）DH5α后，涂布于含有Kan的LB固体培养基上。37℃培养14h，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到5mlLB液体培养基过夜培养，然后用PlasmidMiniKit（OMEGA）提取质粒鉴定和测序。经测序正确的质粒命名为pET28a-gox0834，如图2，并转化到感受态大肠杆菌（E.coli）BL21，构建出含有重组质粒的菌株Gox0834-pET28a。

其中酶切及连接反应体系如表1所示。

表1

3、重组菌株的培养以及硝基还原酶的表达

将步骤2中获得的阳性克隆接种于5ml液体培养基，接种量1%，37℃200rpm培养8小时，后转接200ml摇瓶，培养1-2小时，至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入一定量IPTG，25℃培养12小时。然后离心收集菌体，再用20mMPBS（pH7.4）缓冲液洗涤两次，最后沉淀用75ml50mMPBS（pH7.4）悬浮，再经超声破碎获得粗酶液，其超声功率为300W，超声3min，停5min，超声99个循环。粗酶液用SDS-PAGE鉴定，如图3所示，泳道1，2，3，4均为粗酶液。其中Marker购自TaKaRa，分子量从小到大分别为14.4KD，18.4KD，2KD，35KD，45KD，66.2KD，116.0KD。

4、硝基还原酶纯化

取步骤3中所得粗酶液10,000rpm离心30分钟，上清液用于镍柱纯化。所用镍柱为安捷伦HisTrap，流程为常规流程，所得样品用SDS-PAGE鉴定，鉴定结果如图4所示，泳道1中的明显条带即为纯化所得的硝基还原酶纯酶，其分子量约为30KD。其中Marker购自TaKaRa，分子量从大到小分别为14.4KD，18.4KD，2KD，35KD，45KD，66.2KD，116.0KD。

5、硝基还原酶的活性测定及功能鉴定

将步骤4中所得纯酶用于酶活研究，硝基还原酶以NADPH、NADH为辅酶，用酶标仪测定单位时间内340nm处的光吸收值来评价硝基还原酶的活力。所用酶标仪为MD1900，测定方法为：在50mMPBS（pH8.5）缓冲液195ul中，加纯硝基还原酶1ul（5ug），37℃温育10min，后加NADPH或NADH（10mM）（Roche）3ul，底物1ul（20mM，溶解于DMSO），立即振荡5s后酶标仪检测1min内340nm吸光值的变化。酶活力单位定义为：在上述条件下，每分钟消耗1molNADPH为一个酶活力单位。

结果显示gox0834只在以NADPH为辅酶时，才对一系列芳香族硝基化合物表现还原活性；而以NADH为辅酶，则没有酶活。

其中底物及针对不同底物硝基还原酶比活力如下表所示：

表2

以上结果显示，本发明的硝基还原酶底物谱宽泛，能够还原多种芳香族硝基化合物，底物涵盖硝基苯甲醛类、甲苯类、苯胺类、呋喃类、氯苯类、苯酚类、苯类等苯环硝基取代化合物。另外硝基取代基在苯环上不同位置取代，酶比活力不同，间位取代效果最优。本发明提供的硝基还原酶，当苯环上硝基取代基数目大于等于1时，都有还原活性。本发明提供的硝基还原酶对抗癌前药CB1954表现良好的还原酶活性，显示其作为前药激活剂（predrugactivation）在基因治疗中的潜在应用。

6、硝基还原酶酶学性质研究

6.1、测定本发明硝基还原酶在不同温度下的比活力

反应体系为：在50mMTris-HCl（pH8.5）缓冲液195ul中，加纯硝基还原酶1ul（5ug），不同温度孵育10min，后加NADPH（10mM）3ul，底物1ul（20mM，溶解于DMSO），立即振荡5s后分光光度计检测1min内340nm吸光值的变化。不同温度包括30℃，37℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，70℃，结果如图5所示。从图上可以看出硝基还原酶gox0834在30℃到70℃温度范围内温育10min仍然保持最高酶活50%以上的酶活，其中最适温度为60℃。

6.2、测定本发明硝基还原酶在不同pH下的比活力

反应体系与本发明硝基还原酶在不同温度下比活力相同，其中温度设置为37℃，缓冲液包括PBS和Tris-HCl，PBS涵盖6，6.5，7，7.5，8五个pH，Tris-HCl涵盖8，8.5，9，9.5四个pH，测定结果如图6所示。从图上可以看出gox0834在pH6到pH9.5范围内温育10min仍然保持最高酶活50%以上的酶活，其中最适pH为8.5。

6.3、测定本发明硝基还原酶的动力学参数

按照酶活测定方法，在37℃，pH8.5条件下，添加10mMNADPH，分别设定CB1954的浓度为0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.5mM，1mM，5mM，检测反应初速度，按照Lineweaver-Burk双倒数法作图，获得本发明提供的硝基还原酶对CB1954的Km值，如下表所示：

表3

上表所列分别为本发明提供以及已发表文献报道的硝基还原酶对CB1954的Km值，从上表可以看出，本发明提供的硝基还原酶对CB1954的亲和力优于已报道的硝基还原酶。

6.4、硝基还原酶辅因子的确定

取步骤4中所得硝基还原酶纯酶，加2%高氯酸静置10min，0.22um滤膜过滤，经HPLC检测辅因子，流动相是20mM乙酸铵，9%乙腈，流速0.8ml/min，C-18反向柱（SB-Aq）。FMN保留时间10.507min，FAD保留时间15.525min，gox0834洗脱下来的辅因子保留时间11.243min，因此可以推断，gox0834辅因子是FMN，结果如图7A-7C所示。

7、硝基还原酶还原产物的鉴定

酶促反应总体积为10ml，含有间二硝基苯60mM，100mmol/l磷酸缓冲液（pH7.4），4mg硝基还原酶gox-0834纯蛋白，4mg葡萄糖酸脱氢酶，0.05mMNADP。室温下反应30min，加入等体积的乙酸乙酯，振荡萃取10min，5000rpm离心，取上层有机相，旋蒸浓缩后用气相检测。气相条件为：进样口温度280℃，色谱柱，DB-5，柱温90-180℃（30℃/min），FID检测器，载气为氮气。质谱条件：IE，70eV。结果见图8A-图8B，间二硝基苯出峰时间为7.897，产物出峰时间为8.199，经质谱确认为硝基苯胺。因此，可以得出结论，本发明硝基还原酶能够还原间二硝基苯的一个硝基为氨基。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (6)

1.一种硝基还原酶在芳香族硝基化合物降解还原中的应用，其特征在于，所述硝基还原酶具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸残基序列，所述硝基还原酶以NADPH为辅酶，辅因子是FMN，所述芳香族硝基化合物是：硝基苯甲醛类，硝基甲苯类，硝基苯胺类，硝基酚类，硝基呋喃类，硝基苯类或抗癌前药CB1954。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述硝基还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述硝基还原酶在30℃～70℃温度范围内保持最高酶活50％以上的酶活。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述硝基还原酶的最适温度是60℃。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述硝基还原酶在pH6～9.5范围内保持最高酶活50％以上的酶活。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述硝基还原酶的最适pH是8.5。