JP2022520237A - 自然免疫機能を支持するトランスジェニックマウスモデル - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所によって支給された助成金番号1R01132963の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2019年2月13日出願の米国仮特許出願第62/805257号(これは、その全体において本明細書に参考として援用される)の利益を主張する。
fms関連チロシンキナーゼ3(FLT3)レセプターを介するシグナル伝達は、造血前駆細胞および樹状細胞(DC)の生存、増殖、および分化を支持する(1,2)。ヒトDCは、抗原をヒトT細胞に提示するために必要であり、強いヒト免疫応答の発生に要求される(4)。成熟ヒトDCはまた、インターロイキン15ならびにナチュラルキラー(NK)細胞およびヒト自然免疫系の他の成分の発生を支持する他の因子を生成する(5)。
いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lをコードする核酸(例えば、ヒトFLT3L導入遺伝子を含む)および不活性化マウスFlt3アレルを含む免疫不全NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSGTM)マウス(「NOD scid ガンマ」マウス)が、本明細書で提供される。上記NSGTMマウスは、ヒト造血幹細胞(HSC)生着を支持するが、それは、ヒトHSCの、樹状細胞(DC)集団への発生の障害を示す(3)。ヒトHSCの、DC集団への発生を支持するマウスモデルを提供するために、ヒトFLT3Lを発現するトランスジェニックNSGTMマウス(NSGTM-Tg(Hu-FLT3L))を生成した。しかし、予測外なことに、ヒトHSCの生着は、NSGTMコントロールと比較して、NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて有意に低かった。NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて観察された表現型を理解するために、FLT3Lの内因性マウスレセプター-Flt3-を、ノックアウトした。驚くべきことに、このトランスジェニック系(本明細書でNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)といわれる)のヒトHSCによる生着は、(1)ヒトCD3+ T細胞およびヒトCD33+ 骨髄系細胞の両方の有意に増加したパーセンテージ、(2)ヒトCD123+ 形質細胞様樹状細胞、CD56+ ヒトナチュラルキラー(NK)細胞、CD14+ ヒト単球マクロファージ、およびCD11C+ HLA-DR+ ヒト骨髄系樹状細胞の増加したパーセンテージ、ならびに(3)小腸におけるヒトCD45+ 細胞の粘膜生着の支持、を生じる。理論によって縛られないが、NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)の減少したヒトHSC生着は、宿主マウスFLT3レセプター、宿主マウスDCおよびおそらくは他の自然免疫のマウス成分を介するヒトFLT3L活性化の結果であった可能性がある。
NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウス
本開示は、ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化マウスFlt3アレルを含むNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSGTM)マウスを提供する。このマウスは、本明細書でNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスといわれる。
本開示のNSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、いくつかの実施形態において、ヒトCD34+ HSCの生着およびヒト自然免疫系の発生を支持するために使用される。ヒト免疫系は、自然免疫系および適応免疫系を含む。自然免疫系は、感染部位への免疫細胞の動員、補体カスケードの活性化、異物の同定および白血球による身体からの除去、適応免疫系の活性化、ならびに感染性因子に対する物理的および化学的バリアとしての作用に関与する。
いくつかの局面において、ヒトFLT3Lを発現するトランスジェニック動物を生成する方法が、本明細書で提供される。トランスジェニック動物は、本明細書において、そのゲノムの中に挿入されている(中に組み込まれている)外来(外因性)核酸(例えば、導入遺伝子)を有する動物をいう。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、トランスジェニック齧歯類(例えば、マウスまたはラット)である。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物はマウスである。例えば、トランスジェニックマウスを生成する方法は、周知である。トランスジェニック動物を生成するために使用される3つの従来からの方法としては、DNAマイクロインジェクション(Gordon and Ruddle, Science 1981: 214: 1244-124(本明細書に参考として援用される))、胚性幹細胞媒介性遺伝子移入(Gosslerら., Proc. Natl. Acad. Sci. 1986; 83: 9065-9069(本明細書に参考として援用される))およびレトロウイルス媒介性遺伝子移入(Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. 1976; 73: 1260-1264(本明細書に参考として援用される))が挙げられ、これらはいずれも、本明細書で提供されるように使用され得る。
本明細書で提供されるマウスモデルは、任意の数の適用のために使用され得る。例えば、上記NSGTM Flt3null--Tg(Hu-FLT3L)マウスは、特定の薬剤(例えば、治療剤)または医療手順(例えば、組織移植)が、ヒト自然免疫系(例えば、ヒト自然免疫細胞応答)にどのように影響を及ぼすかを試験するために使用され得る。
ヒトDC発生および自然免疫機能を支持するために、ヒトFLT3リガンド(FLT3L)を発現するトランスジェニックNSGTMマウス系の一団を生成した。これらのトランスジェニックマウス系を生成するために、CHORI BACPAKから得た細菌人工染色体(BAC)クローンRP11-360G9に由来する13.8キロベース(kb) BamHI制限フラグメントを、pBluescriptへとサブクローニングして、上記BACにおける他の遺伝子を排除した。次いで、精製し、直線状にしたDNAを、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSGTM)受精卵の前核に注入した。
次いで、ヒトFLT3Lを発現するトランスジェニックNSGTMマウス(NSGTM-Tg(Hu-FLT3L))に、ヒト臍帯血CD34+ HSCを生着させた。NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスおよびNSGTM非トランスジェニックコントロールマウスのコホートを、致死量未満で照射し(200cGy)、100,000 ヒト臍帯血HSCを静脈内注射した。生着させたマウスに由来する末梢血のフローサイトメトリーを、生着後6週間、9週間、12週間、および15週間で行った。予測外なことに、ヒトCD45+ 細胞のパーセンテージは、試験した全ての時点で、NSGTMコントロールと比較して、上記NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて有意に低かった(図2)。
NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて減少したヒトHSC生着が、宿主マウスDCおよびおそらく他の自然免疫マウス成分を活性化するヒトFLT3Lの結果であるかどうかを試験するために、マウスFLT3レセプターをコードする遺伝子(Flt3)をノックアウトした(ヒトFLT3LがマウスFLT3レセプターに結合し、マウス自然免疫を活性化させないようにするため)。理論によって縛られないが、上記マウスFLT3レセプターがなければ、ヒトFLT3LおよびマウスFLT3Lの両方が、ヒトFLT3レセプターに結合するために利用可能であろう。
ヒトFLT3L導入遺伝子を発現し、マウスFLT3レセプターを欠く上記NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスの血清のELISAアッセイは、15,175±1,137pg/mL~17,120±92.7pg/mLの範囲に及ぶヒトFLT3Lのレベルを示した。上記NSGTM 非トランスジェニックコントロールマウスの血清は、検出可能なFLT3Lレベルを示さなかった(図4A~4B)。マウスFLT3Lのレベルは、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)において6,000~8,000pg/mLの範囲に及んだが、NSGTMコントロールにおけるマウスFLT3Lのレベルは、約1,000pg/mLであった。
ATCCCCCAGTGCTGGTGACCTTGAACACAGGGTCTGCCCTGAGCAGTGCTGACAGCCTGTTAGCTGTCATTTTGAAGCATTTCCTGAAGGAAACTTACCTTATCATTGCAGCTGTAAAGAAGAAGGCCCTGCTGTTGTCAGAAAGGAGGAAAAGGTACTTCATGAGTTGTTCGGAACAGACATCAGATGCTGTGCTAGAAATGCACTGGGCCGCGAATGCACCAAGCTGTTCACCATAGGTAATGGGGGACTGTCGGCTATGTGTCCTTAGTGACGGTTCCTAAGGGACCGGTGATAGCTTCTGTGTGGGTAATCATTCCACTTCAGAAAGATGATGGAAAGTTATACTGAAATCCGAATCTAGATCGAATAGTCCACATTCTGACATAAAAGCAATTGAACACACAGGTATGGCCAAGCTTGGTGGCCCGGGCTTTTAATCCTTCTTTCATAGGACTTTGATTTGATTCAATTTGATTTGATTTGATTTGACTTAGGTGCTGGGCTCAAACCCAGGGACTCAGAGCATCTGCTTTGCCACTGAGTTCCACTCCAGATCTTTTGCACCACTTTATTTATTTATTTATTGTGTGTGTGTATACACACATTAAATACACACACATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGCTACAGCATGTAATGTGGATGTCAGGTTCTCTTCTTGTCATATGGGGCCCCTGGATCAAATTCAGGTCAGTCTGGCAGCGGCAGGCACCTCCACCCACTGAGCCATCTTGATGCCCCGTTCATACCATTTACAATGTAACACTGTAGATTCTGTAAGGGAGGATTTCTGCAACAAAGGGTATTCCATCTCGAGTGGGTGGTTTTACTCTGTCGCTTTTTTTTTTTTAGTTTTGTGCTGCTCTGTGACTCCAGGTCTTCTCCAGGCCAGCCTCTTTTACCCTGATCTTCTCAGCTCTGCATTGTTTGGCTTGATTAGTGATGGCAGGGATGCTGACACCATTGCTTTTCAAAACGTTTGCGACACTTCTGAGCTGAGGCAAAAGTTTTTAAAAAAAAGATGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCTTCTTTGGGATATTTTTATCTTCTAGATCTAAACCAGGCTCCTCAGAGCACACTGCCCCAGTTATTCCTGAAAGTGGGGGAACCCTTGTGGATCAGGTGTAAGGCCATCCATGTGAACCATGGATTCGGGCTCACCTGGGAGCTGGAAGACAAAGCCCTGGAGGAGGTAACAGCGCCCACCCGTGGTGTTTACCGTAAGCTCTCAGCGTGGGCTGGAAACCCGGAATACAGACTCCCCTTTCATTAATACTCAGGGCAGCTACTTTGAGATGAGTACCTACTCCACAAACAGGACCATGATTCGGATTCTCTTGGCCTTTGTGTCTTCCGTGGGAAGGAACGACACCGGATATTACACCTGCTCTTCCTCAAAGCACCCCAGCCAGTCAGCGTTGGTGACCA(配列番号5)
CCAACCTGAACTGTATGGAGATAGCTTGTCTATGGGGAAAAAAAATCACCAAATAAAATAAAATCTAAAATATTAAATAATAAAGTAATACTGTAACATTATCCTAATTAGATACAGAGTAGCTAGCTGGTCCCTGCAGATTCCAGGCTGGATACAGTTGAGTTAATTTTTCATCTGCTCTTTTCTTCCATCCCTAAAAATATACTTTGTAACTTCATCCCCTAAACATACTGGGTCCCCCCACCCCATCCTAGGTAACGGGCTCACGAAATTTGGGGTTGGTTGGTTTGTTTGTTTTTAATGCTGTCCTGGAACTCGCTGTGTAGATTGGTTGGCCTTGAACTCACAGAAATCTACCAGCATCTGCCTCCCCAGTGCTGGGATTAAAGGCACAGGCCACCAAGCTTGACTCTGCTTGTGTCTTTAGTGGCTTTCCCTGTGG(配列番号6)
GATCCCTGTGCTCCTCCGAGTGGCACAGGAAACTTGGCTGATAGAGGCGCTCTCTCCATGCATCCTCCACCATCCACTCCCCGGTCCCTTAGACTTCCATTCAGAAGTGACACCTGTCACCTCCACCCTCATGTGACTGGCCAAAGTGAGTGTGGCCATGTCCGAGTTCCCCAGGATGGGACCTCGAATCCTCCTGCTGGGGGGGTGGGGGCAGCAGATGTTTCAGGACAGTCTGCCACGGATCAGATGGGTGAGCAAGAGATTCAGGATGGGCGTGATGGGTCACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCGAGGCAGGCTGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGATCAGCCTGGCCAACATAGTGAAACCTCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCACGCACCTGCAATTCCAGCTACTTGGGAGCCTGAGGCACAAGAATTGCTTAAGCCCAGGAGGCGGAGGTTGCCGTGAGCCGAGACTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACCCCATCTAAAAAAAAAAAATGCTTCAGAGATTCAGAGATCCACAGATGTGGAAGAGAGCTTCTATTTTGTCTCATGTACCACCTCACCCCTCAGTTTGGAGTTGGAGAAGCCGAGGCTTAGAGAGGTCAAGGGGCTGGCCAAGCTCCCACAGTGATAAAGCTAGTGCTAGGGCGACACCTGCCAGGCCCAATGTGACAAGATGCATCCTGAGTCCTGTGTGCCAAGCCTTGGCGGGGCAAAGTTGGGGCCCGGAGGACGGTAAGACACAGCAACTGCGAGTTCCCAGAGACAGATCCGGGTTCCAGCCCCAGCTCACCATGCACTGGGCGTGCCACCCAGGGAGTCAGCCCCACTGCAGCCCCCGCTGCGGGGCGTCCGGAGAACGCGCCATCTGCGGCGTGAGCGGCCGCCTCTCACCACCAGGGGGCGCGCTCCGCCTGGGCCCAGATTCCACCCCTTGACTGTCTCCCCCCAAAAATTTCCTTTCACTTTCGGTCTCTGGCTGTCACCCGGCTTGGCCCCTTCCACACCCAACTGGGGCAAGCCTGGTGCGTGAGGAGACTTGGACTCTAGGTCCCCAAGGGGCGGAGCCAGGGTCCCCACTCCTGGGGCAGGGGGAGCAGAGGGTGGGGGGCTGGGTTCCCGGGTCCCTAACCTGGGGAGGGTTCTGGGGACCAGACGTCGAGGTTCTTAGAAGTGGAGATGAAGAGTTTTCACCGTAACTGGGGCAGACGCAGGAAGCCTGGGGGAGGAAGGGGCGGAAACTCAGCCACATCAATGGGACGCGGGAGGGGCGGGGAGGCAAAGGGGCGGGCAGGGCAGGGGCTGGGGCATGAGGGTCCGAGACTTGTTCTTCTGTCCCTTCCAAGACCCGGCGACAGGAGGCATGAGGGGCCCCCGGCCGAAATGACAGTGCTGGCGCCAGCCTGGAGCCCAACAGTGCGTAAACCCCAGGGACAAGATCAGGGGAGAGGGGAGGCACAATGTCAGGATGGGGCAGAGATGAGGGGAGATGGACGGGAGAACAGATGGACAGATGACGAGGAAATAGGAGGGGAGATGGACAGATGTGAGGGGAGATGGATAGGAGAGGAGACGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGATGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATAGAGGAGAGGGAGATAGAGAGGAGTGGGAGATGGACAGGAGCGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGCAGATGAACAGAGGAGAGGGAGATAAAGAGGAGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGATGGACAGAGAAGGGGGAGATGGACAGAGGTGGGGGAGATGGACAGGAGGGAAGATGGAGAGGAGGGGGTATGGACAGAGGAGAGGGGAGATGGACAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAGATGAAGAGGAGGGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGACGGACAGAGGAGAGGAAGAGAGACAGAGGAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAAAAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAAGGTGGACAGAGCCAAGAACAAATGAAGAGGACGTGGACCAAGATCAAGAGAGAAGCAGGCAACAGTGGTGTAGAAGGCAGAGGGAGGGACAGAGCTGGAGGAACCCGGGCGAGGAAACCAGACGTGAAGATGAGGTGGTTGGAGAGAGACCAGCAGAGTGGGGGAGATGGGGAGAGAGAGGGGTGGGGCAGAGGGGGATGCAAACTGGACAGCATTGGACCAGAGGCAGAGAGAAACCGGGAAAGACAGGCAGAGATGGGGCCATGTCTCCAGAAAGTGTGGAAGAGGCAGAAGGACACCCAGGGAAGGAGGAGCGGGGAAGACAGAACAGTACAGGTGGGAAGCCCGGAGGAGGGGGCTGTGTGTGGAACAGCAGAGGGCTCCCCCAGCACCCGCTCCCCTGCAGACCTATCTCCTCCTGCTGCTGCTGCTGAGCTCGGGACTCAGTGGGACCCAGGACTGCTCCTTCCAACACAGCCCCATCTCCTCCGACTTCGCTGTCAAAATCCGTGAGCTGGTGAGCGGCGCTGCCCCGGACCCCCTCATGTGATCCCCCTTCCCCCCACTTTTTTTTTTAAGTAGAGATGGGGTCTCTCTCCCTGTGTTTCCCAGGGTGGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCTTAGGGGTGTCATCCCTTTTTAAGGGCAAGGTTCTGTGGCTTCTTCTGGGCTCCCCCTCTCTTGGTCTTGTCCCTCTCTCTCTGGATCTCTGCTGCCACCTCTGGGTCCCCACAGTTCTGTTTCTCGCTGTTTTCAGCCAGGCCTGATCCTGTTTTCTCCCGCAGTCTGACTACCTGCTTCAAGATTACCCAGTCACCGTGGCCTCCAACCTGCAGGACGTAAGTCATGTTGGGAGGGACCTGGGATGGAGGTGGGGACCACAGACTCAAGATGCTCCACCGAGGCGAGTGGATAACCAGGCCCTCCCCTCCCCAAACCCAGGAATCAGAGTCCTCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGCCCCGGCCCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGCAGCCCCGTGCCCAGCTCCTCCCTCAGACCCGTGGGTTCTCCCCTCTAGGAGGAGCTCTGCGGGGGCCTCTGGCGGCTGGTCCTGGCACAGCGCTGGATGGAGCGGCTCAAGACTGTCGCTGGGTCCAAGATGCAAGGCTTGCTGGAGCGCGTGAACACGGAGATACACTTTGTCACCAAATGTGCCTTTCAGGTCAGCCCTCAACTTAGGGGACAAGTGAGGGGAGGGAGATGCCTTCCTACGAATTAGAAGTAAAGCTCCACTAGGCCTTATTGGCGATTTGGACCATAGCCACCCAACGAAGGTAGAGCGAGAAGCGCCACCCTGCAGAGCCCTGTTCCTACAGAACAACACGTCCCCAGGCACCGGTGATGGGGAGCAGTCTGGTCCCATTCTGGGGCCCCGGTTTCCTAGGCCATGATGAAGGGTGCCACTGAGGGGTTCTTCCCCCAAAAAAAAACAGGGAGAGAAGGGGTCTCTAAACTGAGGAGGCCGGGCGTGGTGGCTCACTCCTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGATGAAATCCCGGCTGTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCTCAGGAGGCTGAGGCACAGGAATCGCTTGAACCCGGGAGCCAGAGGCTGCAGTGAGCCGAGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGGAGACAGAGTGAAACTGTCTCAAAAACAAAACAAACAAACAAAAACCTCTCTCTGAGGGCTGGGTGCAGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTCGGAGGCCAAGGTGGGAGGATTATTTGAGCCCAGGAGTTCAAGACCAGCCCGGGTAACACAGTGAAACCTCATCTCTGCACAAAAATAAAAATAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGCCCACCTGTGGTCCCAGCTACTCAGAAGGCTGAGGTGGGAGGATCACTTGAGCCCTGGAGGTCGAGGCTGCGATGAGCTATGATTGGGCCACTGCACTCCAGCTTGAGCGACAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAACATAGAATAGGCCGTGTATGGTGGCTCACGACTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATTGCCTGAGCTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTCGGCAACGTGATGAAAACCATCTCTACTAAAATACAAAAACAAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGGGCACCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGACTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACACCACTGCCCTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCATCTCCAAAAAAATAAAAATAAAATAAAAGCCTGGGTACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCGAGGCGGGCAGATCACGAGGTCAGGAGTTTGAGACCACCCTGGCCAATGTGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGCGCGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGAATTCCTTGAACCCGGGAGGTAGAAGTTGCAGTAAGCCGAGATCGTGCCACTGTACTCCAGCCAGGGTGACAGAGCAAGACTCTGTCCCCAAAAAATAAATAAATAATAAAGTAACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGAGTCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATAGAGAAACCCCGTTTCTACTAAAAAATATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAGGCTGGGCACGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCACACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACAAGGTCAGGAGATCAAGACCATCCTGGCTAACACAATGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAACAATTAGCCGGGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAGTCCCAACTACCTGGGAGGCTGAGGCAGGTGAATGGCGTGAAACCAGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATTGCGCCACTGTACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCGAGACTCTGTCTTAAAAATAAATAAATAAATAAATATGGCCAAGCACGGTGGCTCATGCCTACAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGAGAAACCCCGTCTCTACTACAAATACAAAAAATAGCTGGGCATGGTGGTGGGCACCTATAGTCCCAACCACTGAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCATTTCACCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACTCTATCTCAAAAAAAAATTAATTAATTAAATAAATAAACTCTGAGAGCCAGAGCTCACTGGGCCCTGTTGCTGGGCATCGCCAGCAGGGAAGGGCCTTTGGCCTGCGGAGGGGCGGTGGGGGGATGACGTGGTGGTGACGTCTCCCTCCCCTGCTCCCAGCCCCCCCCCAGCTGTCTTCGCTTCGTCCAGACCAACATCTCCCGCCTCCTGCAGGAGACCTCCGAGCAGCTGGTGGCGCTGAAGCCCTGGATCACTCGCCAGAACTTCTCCCGGTGCCTGGAGCTGCAGTGTCAGCCCGGTAAAGGCTTCCAGGCACCCCCACTCCTTCCCCTCCTGTCCTCACGGCCGCTCCTCCTCTCTGCACAGTGCATCCCAGACCCCATCTTTCTCATATTGGTTGTGACAAGGGCAAGCTTATTCCTCTTTCTGGAGCTCAGTTTACCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCACTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTTGGCTCACTGCAAGCTCCGCCTCTCGGGTTCATGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACCACAGGCGCCCGCCACCACACCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTTACCGAGTTAAACCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTTGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACAGTGCCCAGCCTACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTCCCCCAGGCTGGAGTGCAGGGGTGCTATCTCGGCTCACTGCAAGCTCTGCCTCCTGGGTTCACGCCATTCTCTTGCCTCAGCCTCCCCAGCAGCTGGGACTACAGGCGCCTGCCACCTCACGCGGCTAATTTTTTTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGTGTTTCACCGTGTCAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGATGTGAGCCACCGCGCCCAGCCTATTGTTTTTTTTTTCTAAGTCGGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCAATCTTGGCTCACTGCAACCTCCATCTCCAGGGTTCAAGCGAATCTTCTGCCTCAGCCTTCCGAGTACCTGGGATTACAGATGCGCATACCATGCCTGGCTAGTTTTTGTGTTTTTAGTAGAGATGGGTTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCGCTCAGCCTATTCACTCATTTAATTTGTGACAGTCTGATGAGGTAGGTACAATGATTATCCTAGTTTTACAGATGAGCAAACTGAGGCACAGAGAGGCCAAGCAGCCCATCCAAGGTCACACAGCCAGTGGCAGCCAGGCCTCTCTTTCCTTCCTTACCCCAGCCCTTCTCCTTGGTCACCCAGCCTCCTCTTTCTCCCCAGACTCCTCAACCCTGCCACCCCCATGGAGTCCCCGGCCCCTGGAGGCCACAGCCCCGACAGCCCCGCAGCCCCCTCTGCTCCTCCTACTGCTGCTGCCCGTGGGCCTCCTGCTGCTGGCCGCTGCCTGGTGCCTGCACTGGCAGAGGACGCGGCGGAGGACACCCCGCCCTGGGGAGCAGGTGAGCAGGCTGGGAAGAGGGGGTGAGGGGGCCGAGAGGGTGGCCCACTTGTGGCTGACACTTTGGGGCCCACAGGTGCCCCCCGTCCCCAGTCCCCAGGACCTGCTGCTTGTGGAGCACTGACCTGGCCAAGGCCTCATCCTGGTGAGTCCTTCCTGGGCTATGGGGCCTGGACTTTGTGTCTGCAGGTTGGGAGGGTCACTAGGAGGCCATGGAAGGGTGGTGAGCAGTGGAGGGGCAGGGGCAGCTCTAGGTGCAGAAAGACCCCTCTGGGGCCAGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGCAAACCCCAGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAACTGGGCATAGTGGTGTGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGAAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATTGCGCCACTGGACTCCAGCCTGAGTGACAGAGCTAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGGAAAGACCCCTCTGGGGCCACGGAGACAGACTGGAGACCAAGCCGGAGGCTGTGGGAAGGCCCAGGGTGAGGACCATGACTGAGCCAGGGCTGGGACCATGGGATGGAGTGGAGTGGATGGGCAGAGAGTCAGGGGTCAGAGATCAGGAGGGACCGGCCTGGGGCCTGACAGGCTTGAGTTGGCACAGATAGCCCTGGTCCAGTGATGGGGTGGACAGGGGGGAACCTGGGGGAGGAGTCAGATTAGGGAAAGACATGGAGCTCACTGGGGACCTGAAGGAGCAAGGGGCCCTGGGGAGATCTGTGGATGTGGGAGTTTGCAAGCCTCCTGGGACAGGAAGGAAATGGCATTCCAGAAAGAGGGAACTGCCTTTGGAAGCCCTTTGGTATGAGAAAGCTCAGGGTGTTCCAGTAACTTGGGCCAGCGTGGGGCAGCAAGGAGCCATGGGAGGTGTGAGAGGGAGGAAAGGAGCTGGGAACAGGTGTGGAGGGTGCAGGCAGGTAGGCAGGTGGGCCAGGAGGGAAGAAGGAGGGGAGGCCCCAGCGGGTCCCCTAACATTTCAAATCTAACATTTTGTAGTAATTGCTCGCACATATAGTGCCTTGGTAATGCAGGCCTCATGTGGGGCTGGCTTGCTTGCTTTATTTTTTTTTGAGATGGACTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGGGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCGCCCGCCACCATGCCTGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCGCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGATCTCAGCTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATGACAGGTGTGAGCCACTGTTCCTGGCCCATGCTGGGCTTTCCACAAATGAACTCACTTCCTTGAGAAGTTCGTGCCATTATGATCCCAAGGCATAGAGAGGTAAATAATTTGCCAAAAGTCACACAGCTCAAGGGTGACAACCAAGATTTGACTTCAGGTTGTCTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGTAGTGCAGTGGCATGATCTCGGCTCACTGCAGCCCCCGCCTCCCAGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTGGGATTACAGGTACCCACCACCACACTCGGCTAATTTTTGTATTTGTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTTAGCTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCACGCCCGGCCTCGAGTTTGTCTTGATCCAGCATCTGTGCCCTTCACTCTGCTGCCTCAGTTTCCTGATCTGTACAAAAGGCTCTAATAATAGTCCTTCCACCATAGGGTTGTTATGGGGTGAAGTGAAGTGACACAGGCAAGGCTCTTAGAGCAACGCAGTGGAAACGGCATGTGAGCCACCTGTGCGATTTTCACTTTCCTGGTAGCCACATTTTTTTTTTTTTTTTCCTGAGATGGAGTCTCACTCTGTCGCCAGGTTGAAGTGCAGTGGTGTGATCTCAGCTCACTGCAACCTCCACCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCTTCAGTCTACCGAGTAGCTGGGATTACAGGCACGCGCCATCACGCCCGGCTAATTTTTTGTGTTTTTAGTAGAGACAAGGTTTCACCATGTTGGTCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCATGATCCACCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCGGGGTCACAGTTTTTAAAAAAGGAAAAAGAAGCAGGTAACTTTATTTTATGCAGTATATCCAAAATGTTGTTATTTCAACATGTAATCAGTATTTCTCAATGATTAATGAGACATTAATCAGTTGGAATCATTCATCATTTTGGGATATTTTACATTCTTTTGTCATACTAAGCCTTCAGCATCCAACGTATAGTTTATTTATTTATTTATTTTTCCTTTTGAGATGGATTCTCGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTCAGCTCACTGCAACCTCGGACTCCCTGGTTCAGGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTACCTGGGATTACGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTACTTTTAGTAGAGACCGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGATGATCTCCATCCCCTGACCTCGTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGATTACAAGTGTAAGCCACCGCGCCCAGCCCAGACAATAAATTTTTATC
AGAAATGCTTCATCTATATTTAAATTTCATGAAATTTACAGTTGCCAAAAGTAGACTCACATAGTCAAGTTGTTCAAAACATACATTAAACCAGCCTGGGCCACATGGTGAAACCCCATCTCTACAAAAAATTTTAAAAAGTAGCTGGGTGTGGTGGCACATGCCTGCAGTCCCAGCTACTTAGGAGGCAAAGTAGGAGGATTGCTTGAGCCCAGGAGGTCGAGGCTGCAGTGAGCCCTGATTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGAGAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAAACAAAAAAACCACACAGAAGAGTTTAGAATCCCAGTTGCTATCTCTGGGAATCATCATGATTGCTAAGACCGGTATCTATCCAACAACAACAAAAATAATTAGTGCACTCCAGCCTGGGCAATAGAGGGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATCAAAGACCAGTATCTAAATTGCTCTGTCGCCCAGGGTGGAGTGCAGTGGCACGATCTCGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCTTGGACTACAGGCGCGTGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGGTAGGGTTTCACTATGTTTGCCAGGATTGTCTCGATCTCTTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTATAGGCGTGAGCCACCACGCCCAGCCTATCTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAAAGGTAATACATTGAGCAGTTTTCCTCCCAACCTAGTCCCTGTCCAATCTGTTTCCTGTCTTAAATTTATTTTTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAGACTTTTGCTCTTGTTAGCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCTATCTTGACTCACGGCAACCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTTGGATTACAAGCGCCTGCCACCACGCCCAACTAATTTAGTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCTTTTGTTGTTGTTGTTGTTTTTGAGACGGAGTCTCACTCTATTGCCCAGGCTGGAGTGCAACGGCACGATCTCGGCTCACTGCAACATCTGCCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTACTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGCACACACCACCACACCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGATCTCGAACTCCTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTTGACCTCCCAAAGTGATAGGATTACAGCCATGAGCCGCCCTGCCCAACTAATACCTGATATTAATTTTATTGTATCTCACCCAGCATGGTGGCTCACACCTGTAACTCCTTGGCAGATCGCTTGAGCCTAAGAGTTCAAGACCAGCTTGGGCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATATAAAAATGAGCTGGGCATGGTGGCGTGCACCCGTAATCCCAGCTAACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAAGAATGGCTTGAACCCGGGAGGCAGAGGCTGCAGTGAGCTGAGATCATGCCACTGCATTCCAGCCTGAAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAGAAGTTTAAGTCCAGCCTCAAACTCCTGGACTCAAGTGATCCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGTGCACCGGCCCCATCTCAAGTGTTCAGTATTCACATGTGGCTTGTTACTCCCGTATTAAAGAGCAAAAATAGAGAACGTTTCTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGGAGTTTCGCTCTTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGACATGCACCACCATGCCTAGCAAATTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTCTTTTGAGACAGACTTTTGCTTTTATTGCCAAGGCTGGAGTGCAATGGTGCAATCTCGACTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCTAATTTTGTAGTTTTAGTAGAAACGGTTTCTCCATGTTAGCTAGGCTGGTCTCAAACTCCCAACCTCAGGTGATCCGCCCGCCTCGACCTCCTAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCCTGGCCCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCTCCCTGTTGGTCAGGCTGGTCTCAAACTCCCAACCTAAGGTGATCCACCAGCCTCAGCCTCCCAAACTGCTGGGATTATAGGCATGAGCCACCGCGCCCGGGGAAATATAGGGAACATTTCTATCATGGCCACGTTCTCTTGGACAGCAATGCCCTAGCACATAGTAAGCGCTTGCTGGGAATGGAGTTGTTTTGGGCATAAATCTGTGGCCCGCCCCAAGCTAAGCTACTTTCCCTCTCCTCTCTCAGCGGAGCCTTAAACAACGCAGTGAGACAGACATCTATCATCCCATTTTACAGGGGAGGATACTGAGGCACACAGAGGGGAGTCACCAGCCAGAGGATGCATAGCCTGGACACAGAGGAAGTTGGCTAGAGGCCGGTCCCTTCCTTGGGCCCCTCTCATTCCCTCCCCAGAATGGAGGCAACGCCAGAATCCAGCACCGGCCCCATTTACCCAACTCTGTACAAAGCCCTTGTCCCCATGAAATTGTATATAAATCATCCTTTTCTACCAGCTCTGGCCAGGTCTGTCTATGGATGGGTGTGAATGGGGTAGTTTTGATTTCAGAATCTTGGTTTTTGAATTGCAATGCAATGTTTCATTCAATACGTGTTTTCTGAGGTCCCCTGGAGCCCCGGGCCGGCGCTGGGCAATGTCAGAGCCTGGATTTGAGTCAGAACCAGCCCAGGTGCCCCAGGTCTCCTTGGCTATGGACGAGAAGACAAGGGATTCAGCGAGCCTGGGTGCAGGATGCCATAGGCTACTATGGAGATAAAACAGAGGCAGTGTGAGGGGCAACTCACCCAGGCAGGGAGAGCAGAGAGGCTTTCCAGAGCCAAATGGCATTGCGATGGTGACAAGCCAGATTTGGAGGGGGTGGGGAGGGCATCCTGGGCAAGGGACCCAGCTGAAGCAAAGGCCGACAGTCCAGAAAGTGAGAAGTTCCTCTGAGGAACGCTCAGTGGATTGGTGCAGCCAGGCAACTAGAAGCCATTCCTTGATCCACTCTTAGAGCCCCTGGGGAAGACCACCTCCATCTGTTTTACAGATGGATAAACTGAGGCCCAGATAAGGCCAAGGGTTTCTCCAGGTCACAGTGAAGTCGACCAGACACAGGAATCCAAATCTCTAAGCCTAGAATGGGCAAGGCTCCGGGGCTCACGCCGGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAACGGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAGTTCGAGATCAGCCTGGCCAACATGTCAGACTCCCCCCGTTCCCGGGCCACAACAAAATATATATATATATATATATTAGCCAGGCATGGTGGCGCGCCCCTGTAGTCCAAGTTACTCGAGAGGCTGAGGCAGGAG(配列番号7)
1. P. Tsapogas, C. J. Mooney, G. Brown, A. Rolink, The Cytokine Flt3-Ligand in Normal and Malignant Hematopoiesis. International journal of molecular sciences 18, (2017).
2. C. J. Mooney, A. Cunningham, P. Tsapogas, K. M. Toellner, G. Brown, Selective Expression of Flt3 within the Mouse Hematopoietic Stem Cell Compartment. International journal of molecular sciences 18, (2017).
3. L. D. Shultz, M. A. Brehm, J. V. Garcia-Martinez, D. L. Greiner, Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nat Rev Immunol 12, 786-798 (2012).
4. K. Palucka, J. Banchereau, Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature reviews. Cancer 12, 265-277 (2012).
5. J. S. Do, B. Min, IL-15 produced and trans-presented by DCs underlies homeostatic competition between CD8 and {gamma}{delta} T cells in vivo. Blood 113, 6361-6371 (2009).
6. J. C. Oliveros et al., Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic acids research 44, W267-271 (2016).
7. P. D. Hsu et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827--832 (2013).
8. Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung, Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature biotechnology 32, 279-284 (2014).
9. B. E. Low, P. M. Kutny, M. V. Wiles, Simple, Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing in Mice: Strategies and Methods. Methods Mol Biol 1438, 19-53 (2016).
Claims (55)
- NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスであって、前記マウスは、
ヒトFLT3Lをコードする核酸、および
不活性化マウスFlt3アレル、
を含むマウス。 - 前記マウスは、前記マウスFlt3アレルを不活性化するゲノム改変を含む、請求項1に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、コード領域、非コード領域、および調節領域から選択される前記マウスFlt3アレルのうちの少なくとも1つの領域にある、請求項2に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、前記マウスFlt3アレルのうちの少なくとも1個のコード領域にある、請求項3に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、エキソン6、エキソン7、および/またはエキソン8にある、請求項4に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、ゲノム欠失、ゲノム挿入、ゲノム置換、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項2~5のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、ゲノム欠失である、請求項6に記載のマウス。
- 前記マウスFlt3アレルは、エキソン6、エキソン7、およびエキソン8におけるヌクレオチド配列のゲノム欠失を含む、請求項7に記載のマウス。
- 配列番号5の核酸配列は、前記マウスFlt3アレルから欠失されている、請求項8に記載のマウス。
- 前記改変されたマウスFlt3アレルは、配列番号6の核酸配列を含む、請求項9に記載のマウス。
- ヒトFLT3Lをコードする前記核酸は、ヒトFLT3L導入遺伝子を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記ヒトFLT3L導入遺伝子は、配列番号7の核酸配列を含む、請求項11に記載のマウス。
- 前記マウスは、ヒトFLT3Lを発現する、請求項1~12のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記ヒトFLT3Lは、少なくとも10,000pg/mlのレベルで発現される、請求項13に記載のマウス。
- 前記ヒトFLT3Lは、10,000pg/ml~30,000pg/mlのレベルで発現される、請求項14に記載のマウス。
- 前記ヒトFLT3Lは、15,000±1000pg/mL~17,000±100pg/mlのレベルで発現される、請求項14または15に記載のマウス。
- 前記マウスは、マウスFLT3Lを発現する、請求項1~16のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスFLT3Lは、少なくとも2,000pg/mlのレベルで発現される、請求項17に記載のマウス。
- 前記マウスFLT3Lは、5,000pg/ml~10,000pg/mlのレベルで発現される、請求項18に記載のマウス。
- 前記マウスFLT3Lは、6,000pg/ml~8,000mlのレベルで発現される、請求項18に記載のマウス。
- 前記マウスは、検出可能なレベルのマウスFLT3を発現しない、請求項1~20のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスによって発現される検出可能なレベルのマウスFLT3は、1,000pg/ml未満である、請求項1~21のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスは、検出可能な数のCD135+ 複能性前駆細胞を欠いている、請求項1~22のいずれか1項に記載のマウス。
- ヒトCD34+ 造血幹細胞をさらに含む、請求項1~23のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記ヒトCD34+ 造血幹細胞は、ヒト臍帯血、骨髄、または動員された末梢血に由来する、請求項24に記載のマウス。
- 前記マウスは、ヒトCD45+ 細胞の集団を含む、請求項1~25のいずれか1項に記載のマウス。
- ヒトCD45+ 細胞の前記集団は、ヒトCD45+/CD3+ T細胞および/またはヒトCD45+/CD33+ 骨髄系細胞を含む、請求項26に記載のマウス。
- ヒトCD45+ 細胞の前記集団は、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45+/CD3+ T細胞を含む、請求項27に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトCD45+/CD3+ T細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項28に記載のマウス。
- ヒトCD45+ 細胞の前記集団は、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45+/CD33+ 骨髄系細胞を含む、請求項27~29のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトCD45+/CD33+ 骨髄系細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項30に記載のマウス。
- 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD123+ 形質細胞様樹状細胞を含む、請求項1~31のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトCD123+ 形質細胞様樹状細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項32に記載のマウス。
- 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD56+ ナチュラルキラー細胞を含む、請求項1~33のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトCD56+ ナチュラルキラー細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項34に記載のマウス。
- 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD14+ 単球マクロファージを含む、請求項1~35のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトCD14+ 単球マクロファージの前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項36に記載のマウス。
- 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD11C+ HLA-DR+ 骨髄系樹状細胞を含む、請求項1~37のいずれか1項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトCD11C+ HLA-DR+ 骨髄系樹状細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項38に記載のマウス。
- 前記マウスは、前記マウスの小腸においてヒトCD45+ 細胞の粘膜生着を示す、請求項1~39のいずれか1項に記載のマウス。
- 請求項1~23のいずれか1項に記載のマウスを致死量未満で照射する工程および前記マウスにヒトCD34+ 造血幹細胞を注射する工程を包含する、方法。
- 前記マウスに、目的の薬剤を投与する工程をさらに包含する、請求項41に記載の方法。
- 前記マウスにおいてヒト免疫細胞に対する前記薬剤の効果を評価する工程をさらに包含する、請求項42に記載の方法。
- 前記ヒト免疫細胞は、T細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージから選択される、請求項43に記載の方法。
- NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスの前核にヒトFLT3Lをコードする核酸を注入する工程、NSG Tg(Hu-FLT3L)マウスを生成する工程、および前記NSG Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいてマウスFlt3アレルを不活性化する工程を包含する、方法。
- NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスにおいてマウスFlt3アレルを不活性化して、NSG Flt3null マウスを生成する工程、および前記NSG Flt3null マウスの前核にヒトFLT3Lをコードする核酸を注入する工程を包含する、方法。
- ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化内因性Flt3アレルを含む、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ細胞。
- 請求項47に記載の細胞を含むトランスジェニック齧歯類であって、必要に応じて、ここで前記トランスジェニック齧歯類は、トランスジェニックマウスである、トランスジェニック齧歯類。
- Prkdcscidに関してホモ接合性、Il2rgtm1Wjlに関してホモ接合性、Flt3nullに関してホモ接合性、およびヒトFLT3L導入遺伝子に関してホモ接合性の雌性マウスと、Prkdcscidに関してホモ接合性、X連鎖Il2rgtm1Wjlに関してヘミ接合性、Flt3nullに関してホモ接合性、およびヒトFLT3L導入遺伝子に関してホモ接合性の雄性マウスとを交配して、子孫マウスを生成する工程を包含する、方法。
- マウスFlt3を標的とするgRNAであって、必要に応じて、ここで前記gRNAは、エキソン6またはエキソン8またはマウスFlt3を標的とする、gRNA。
- 前記gRNAは、配列番号1または配列番号2の配列を含む、請求項50に記載のgRNA。
- 請求項50または51に記載のgRNAを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで前記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞。
- マウスFlt3のエキソン6を標的とする第1のgRNAおよびマウスFlt3のエキソン8を標的とする第2のgRNAを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで前記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞。
- Cas9 mRNAおよび/またはCas9タンパク質をさらに含む、請求項52または53に記載のマウス卵母細胞。
- ヒトFLT3L導入遺伝子をさらに含む、請求項52~54のいずれか1項に記載のマウス卵母細胞。
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