JP2022520237A - 自然免疫機能を支持するトランスジェニックマウスモデル - Google Patents

自然免疫機能を支持するトランスジェニックマウスモデル Download PDF

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Abstract

いくつかの局面において、ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化マウスFlt3アレルを含むNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマまたはNSGTM)マウス、上記マウスを生成する方法、および上記マウスを使用する方法が、本明細書で提供される。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスであって、前記マウスは、ヒトFLT3Lをコードする核酸、および不活性化マウスFlt3アレルを含むマウス。

Description

政府の許認可の権利
本発明は、国立衛生研究所によって支給された助成金番号1R01132963の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2019年2月13日出願の米国仮特許出願第62/805257号(これは、その全体において本明細書に参考として援用される)の利益を主張する。
背景
fms関連チロシンキナーゼ3(FLT3)レセプターを介するシグナル伝達は、造血前駆細胞および樹状細胞(DC)の生存、増殖、および分化を支持する(1,2)。ヒトDCは、抗原をヒトT細胞に提示するために必要であり、強いヒト免疫応答の発生に要求される(4)。成熟ヒトDCはまた、インターロイキン15ならびにナチュラルキラー(NK)細胞およびヒト自然免疫系の他の成分の発生を支持する他の因子を生成する(5)。
P. Tsapogas, C. J. Mooney, G. Brown, A. Rolink, The Cytokine Flt3-Ligand in Normal and Malignant Hematopoiesis. International journal of molecular sciences 18, (2017). C. J. Mooney, A. Cunningham, P. Tsapogas, K. M. Toellner, G. Brown, Selective Expression of Flt3 within the Mouse Hematopoietic Stem Cell Compartment. International journal of molecular sciences 18, (2017). K. Palucka, J. Banchereau, Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature reviews. Cancer 12, 265-277 (2012). J. S. Do, B. Min, IL-15 produced and trans-presented by DCs underlies homeostatic competition between CD8 and {gamma}{delta} T cells in vivo. Blood 113, 6361-6371 (2009).
要旨
いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lをコードする核酸(例えば、ヒトFLT3L導入遺伝子を含む)および不活性化マウスFlt3アレルを含む免疫不全NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSGTM)マウス(「NOD scid ガンマ」マウス)が、本明細書で提供される。上記NSGTMマウスは、ヒト造血幹細胞(HSC)生着を支持するが、それは、ヒトHSCの、樹状細胞(DC)集団への発生の障害を示す(3)。ヒトHSCの、DC集団への発生を支持するマウスモデルを提供するために、ヒトFLT3Lを発現するトランスジェニックNSGTMマウス(NSGTM-Tg(Hu-FLT3L))を生成した。しかし、予測外なことに、ヒトHSCの生着は、NSGTMコントロールと比較して、NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて有意に低かった。NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて観察された表現型を理解するために、FLT3Lの内因性マウスレセプター-Flt3-を、ノックアウトした。驚くべきことに、このトランスジェニック系(本明細書でNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)といわれる)のヒトHSCによる生着は、(1)ヒトCD3 T細胞およびヒトCD33 骨髄系細胞の両方の有意に増加したパーセンテージ、(2)ヒトCD123 形質細胞様樹状細胞、CD56 ヒトナチュラルキラー(NK)細胞、CD14 ヒト単球マクロファージ、およびCD11C HLA-DR ヒト骨髄系樹状細胞の増加したパーセンテージ、ならびに(3)小腸におけるヒトCD45 細胞の粘膜生着の支持、を生じる。理論によって縛られないが、NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)の減少したヒトHSC生着は、宿主マウスFLT3レセプター、宿主マウスDCおよびおそらくは他の自然免疫のマウス成分を介するヒトFLT3L活性化の結果であった可能性がある。
従って、本開示のいくつかの局面は、ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化マウスFlt3アレルを含むNSGTMマウス(NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L))を提供する。このマウスモデルは、HSCの、樹状細胞を含め、ヒト自然免疫系の多くの異なる細胞タイプへの発生を支持する。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、マウスFlt3アレルを不活性化するゲノム改変を含む。上記ゲノム改変は、いくつかの実施形態において、コード領域、非コード領域、および調節領域から選択されるマウスFlt3アレルのうちの少なくとも1つの領域にある。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変は、マウスFlt3アレルのうちの少なくとも1つのコード領域にある。例えば、上記ゲノム改変は、エキソン6、エキソン7、および/またはエキソン8にあり得る。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変は、ゲノム欠失、ゲノム挿入、ゲノム置換、およびこれらの組み合わせから選択される。例えば、上記ゲノム改変は、ゲノム欠失であり得る。上記マウスFlt3アレルは、例えば、エキソン6、エキソン7、およびエキソン8におけるヌクレオチド配列のゲノム欠失を含み得る。
いくつかの実施形態において、配列番号5の核酸配列は、マウスFlt3アレルから欠失されている。
いくつかの実施形態において、上記改変されたマウスFlt3アレルは、配列番号6の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ヒトFLT3Lをコードする核酸は、ヒトFLT3L導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトFLT3L導入遺伝子は、配列番号7の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトFLT3Lを発現する。上記ヒトFLT3Lは、例えば、少なくとも10,000pg/mlのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、上記ヒトFLT3Lは、10,000pg/ml~30,000pg/mlのレベルで発現される。例えば、上記ヒトFLT3Lは、15,000±1000pg/mL~17,000±100pg/mlのレベルで発現され得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、マウスFLT3Lを発現する。いくつかの実施形態において、上記マウスFLT3Lは、少なくとも2,000pg/mlのレベルで発現される。例えば、上記マウスFLT3Lは、5,000pg/ml~10,000pg/mlのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、上記マウスFLT3Lは、6,000pg/ml~8,000mlのレベルで発現される。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、検出可能なレベルのマウスFLT3を発現しない。いくつかの実施形態において、上記マウスによって発現される検出可能なレベルのマウスFLT3は、1,000pg/ml未満である。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、検出可能な数のCD135 複能性前駆細胞を欠いている。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトCD34 造血幹細胞をさらに含む。上記ヒトCD34 造血幹細胞は、いくつかの実施形態において、ヒト臍帯血、骨髄、または動員された末梢血に由来する。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトCD45 細胞の集団を含む。上記ヒトCD45 細胞の集団は、いくつかの実施形態において、ヒトCD45/CD3 T細胞および/またはヒトCD45/CD33 骨髄系細胞を含む。
いくつかの実施形態において、上記ヒトCD45 細胞の集団は、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45/CD3 T細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトCD45/CD3 T細胞のパーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記ヒトCD45 細胞の集団は、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45/CD33 骨髄系細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトCD45/CD33 骨髄系細胞のパーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD123 形質細胞様樹状細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトCD123 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD56 ナチュラルキラー細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトCD56 ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD14 単球マクロファージを含む。例えば、上記マウスにおけるヒトCD14 単球マクロファージのパーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスの小腸においてヒトCD45 細胞の粘膜生着を示す。
本開示の他の局面は、請求項1~23のいずれか1項に記載のマウスを致死量未満で照射する工程、および上記マウスにヒトCD34 造血幹細胞を注射する工程を包含する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記マウスに、目的の薬剤を投与する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記マウスにおいてヒト免疫細胞に対する上記薬剤の効果を評価する工程を包含する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ヒト免疫細胞が、T細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージから選択されることをさらに含む。
本開示のなお他の局面は、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスの前核にヒトFLT3Lをコードする核酸を注入する工程、NSG Tg(Hu-FLT3L)マウスを生成する工程、および上記NSG Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいてマウスFlt3アレルを不活性化する工程を包含する方法を提供する。
本開示のさらに他の局面は、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスにおいてマウスFlt3アレルを不活性化して、NSG Flt3null マウスを生成する工程、および上記NSG Flt3null マウスの前核にヒトFLT3Lをコードする核酸を注入する工程を包含する方法を提供する。
本開示のなおも他の局面は、Prkdcscidに関してホモ接合性、Il2rgtm1Wjlに関してホモ接合性、Flt3nullに関してホモ接合性、およびヒトFLT3L導入遺伝子に関してホモ接合性の雌性マウスと、Prkdcscidに関してホモ接合性、X連鎖Il2rgtm1Wjlに関してヘミ接合性、Flt3nullに関してホモ接合性、およびヒトFLT3L導入遺伝子に関してホモ接合性の雄性マウスとを交配して、子孫マウスを生成する工程を包含する方法を提供する。
さらになお、本開示のいくつかの局面は、ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化内因性Flt3アレルを含むNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ細胞を提供する。
本開示のなお他の局面は、ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化内因性Flt3アレルを含む細胞を含むトランスジェニック齧歯類を提供する。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック齧歯類は、トランスジェニックマウスである。
本開示のいくつかの局面は、マウスFlt3を標的とするgRNAであって、必要に応じて、ここで上記gRNAは、マウスFlt3のエキソン6またはエキソン8を標的とするgRNAを提供する。いくつかの実施形態において、上記gRNAは、配列番号1の配列を含む。いくつかの実施形態において、上記gRNAは、配列番号2の配列を含む。
本明細書で記載されるgRNAのうちのいずれか1つを含むマウス卵母細胞がまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記マウス卵母細胞は、受精している。
いくつかの局面は、マウスFlt3のエキソン6を標的とする第1のgRNAおよびマウスFlt3のエキソン8を標的とする第2のgRNAを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで上記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞をさらに提供する。
マウス卵母細胞は、いくつかの実施形態において、Cas9 mRNAおよび/またはCas9タンパク質をさらに含む。
マウス卵母細胞は、いくつかの実施形態において、ヒトFLT3L導入遺伝子をさらに含む。
図1は、ファウンダー系7および8に由来するヒトFLT3Lに関してヘミ接合性(Hetと表示)またはホモ接合性(homと表示)であるヒトFLT3Lを発現するNSGTM-トランスジェニックマウス(NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)の血清におけるヒトFLT3Lレベルを示す。各バーは、5~15週齢の3~4匹の雌性マウスまたは雄性マウスからの値を表す。 図2は、血中のヒトCD45 細胞のパーセンテージとして表されるホモ接合性NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒト造血幹細胞(HSC)生着の減少したレベルを示す。各データ点は、生着後6~15週間で試験した個々のマウスにおけるヒトCD45 細胞のパーセンテージを表す。雄性マウスおよび雌性マウスの両方を試験した。 図3は、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウス骨髄におけるマウスCD135 骨髄系複能性(MMP3)前駆細胞が存在しないことを示す。各バーは、10週齢の3匹の雌性マウスからの値を表す。 図4Aは、NSGTMFlt3null-Tg(Hu-FLT3L)およびNSGTMコントロールマウスにおけるマウスFLT3Lのレベルを示す。図4Bは、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L) and NSGTMコントロールマウスにおけるヒトFLT3Lのレベルを示す。 図5Aは、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45 T細胞発生およびNSGTMコントロールマウスにおけるCD45 T細胞発生を示す。8匹のNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスおよび10匹のNSGTMコントロールマウスに、8~12週齢で注射した。雄性マウスおよび雌性マウスの両方を使用した。図5Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したパーセンテージのヒトCD3 T細胞発生を示す。図5Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて減少したパーセンテージのヒトCD20 B細胞発生を示す。これは、適応免疫系細胞(例えば、T細胞およびB細胞)とは対照的に、自然免疫系細胞(例えば、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、好中球)へと分化するHSCのパーセンテージの増加に起因し得る。図5Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したパーセンテージのヒトCD33 骨髄系細胞発生を示す。 図6Aは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD123 形質細胞様樹状細胞(DC)発生を示す。8匹のNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスおよび10匹のNSGTMコントロールマウスに、8~12週齢で注射した。雄性マウスおよび雌性マウスの両方を使用した。図6Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD56 ナチュラルキラー細胞(NK)発生を示す。図6Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD14 単球/マクロファージ細胞発生を示す。図6Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD11c/HLA-DR 骨髄系DC細胞発生を示す。 図7は、HSCに伴う粘膜生着を示すNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスおよびNSGTMコントロールマウスの小腸を示す。8匹のNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスおよび10匹のNSGTMコントロールマウスに、8~12週齢で注射した。雄性マウスおよび雌性マウスの両方を使用した。 図8Aは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて匹敵するヒトCD45 細胞発生を示す。図8Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD33 骨髄系細胞発生を示す。図8Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD3 T細胞発生を示す。図8Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD14 単球細胞発生を示す。図8Eは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD11c HLA-DR 骨髄系樹状細胞発生を示す。図8Fは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD56 ナチュラルキラー(NK)細胞発生を示す。 図8Aは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて匹敵するヒトCD45 細胞発生を示す。図8Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD33 骨髄系細胞発生を示す。図8Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD3 T細胞発生を示す。図8Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD14 単球細胞発生を示す。図8Eは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD11c HLA-DR 骨髄系樹状細胞発生を示す。図8Fは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD56 ナチュラルキラー(NK)細胞発生を示す。 図8Aは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて匹敵するヒトCD45 細胞発生を示す。図8Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD33 骨髄系細胞発生を示す。図8Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD3 T細胞発生を示す。図8Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD14 単球細胞発生を示す。図8Eは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD11c HLA-DR 骨髄系樹状細胞発生を示す。図8Fは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD56 ナチュラルキラー(NK)細胞発生を示す。 図8Aは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて匹敵するヒトCD45 細胞発生を示す。図8Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD33 骨髄系細胞発生を示す。図8Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD3 T細胞発生を示す。図8Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD14 単球細胞発生を示す。図8Eは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD11c HLA-DR 骨髄系樹状細胞発生を示す。図8Fは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD56 ナチュラルキラー(NK)細胞発生を示す。 図8Aは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて匹敵するヒトCD45 細胞発生を示す。図8Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD33 骨髄系細胞発生を示す。図8Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD3 T細胞発生を示す。図8Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD14 単球細胞発生を示す。図8Eは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD11c HLA-DR 骨髄系樹状細胞発生を示す。図8Fは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD56 ナチュラルキラー(NK)細胞発生を示す。 図8Aは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて匹敵するヒトCD45 細胞発生を示す。図8Bは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD33 骨髄系細胞発生を示す。図8Cは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD3 T細胞発生を示す。図8Dは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD14 単球細胞発生を示す。図8Eは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD11c HLA-DR 骨髄系樹状細胞発生を示す。図8Fは、NSGTMコントロールマウスと比較して、ヒトHSCを生着させたNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて増加したヒトCD56 ナチュラルキラー(NK)細胞発生を示す。
詳細な説明
NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウス
本開示は、ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化マウスFlt3アレルを含むNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSGTM)マウスを提供する。このマウスは、本明細書でNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスといわれる。
上記NSGTMマウスは、成熟T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞を欠き、複数のサイトカインシグナル伝達経路に欠陥があり、自然免疫に多くの欠陥を有する免疫不全マウスである(例えば、Shultz LDら. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7 (2): 118-130; Shultz LDら. 2005; J. Immunol. 174 (10): 6477-89;およびShultz LDら. J. Immunol. 1995; 154 (1): 180-91を参照のこと)。上記NSGTMマウス(非肥満糖尿病(NOD)マウス系統NOD/ShiLtJに由来する(例えば、Makino Sら. Jikken Dobutsu 1980; 29 (1): 1-13を参照のこと))は、Prkdcscid変異(「重症複合免疫不全」変異または「scid」変異ともいわれる)およびIl2rgtm1Wjl 標的化変異を含む。上記Prkdcscid 変異は、ヒトPRKDC遺伝子のマウスホモログにおける機能喪失型変異である - この変異は、適応免疫を本質的に排除する(例えば、Greiner DLら. 1998; Stem Cells 16 (3): 166-177;およびBlunt Tら. 1995; Cell 80 (5): 813-23を参照のこと)。The Il2rgtm1Wjl 変異は、NK細胞分化を遮断し、それによって、初代ヒト細胞の効率的生着を防止する障害を除去する、インターロイキン2レセプターγ鎖(IL2Rγ、ヒトにおけるIL2RGに相同)をコードする遺伝子におけるnull変異である(Shultz LDら. 2005; Greinerら. 1998;およびCao X.ら. Immunity 1995; 2 (3): 223-38)。機能喪失型変異は、当該分野で公知のように、機能をほとんどまたは全く有しない遺伝子生成物を生じる。比較によれば、null変異は、機能を有しない遺伝子生成物を生じる。不活性化アレルは、機能喪失型アレルまたはnullアレルであり得る。
本明細書で提供されるNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、ヒトFLT3Lをコードする核酸を含む。FLT3L(例えば、NC_000019.10; 染色体:GRCh38:19:49473607:49486831:1)は、FLT3レセプターを結合および活性化することによって、免疫細胞(例えば、B細胞およびT細胞)の生成を刺激するサイトカインおよび成長因子である(例えば、Klein O.ら. Eur J Immunol. 2013; 43(2): 533-539を参照のこと)。FLT3Lは、定常状態の樹状細胞の発生にとって重要である。いくつかの実施形態において、上記ヒトFLT3Lをコードする核酸は、ヒトFLT3L導入遺伝子を含む。驚くべきことに、本明細書で記載されるデータは、ヒトFLT3LがマウスFLT3を結合し得るが、これが理論によって縛られないが、自然マウス免疫を活性化し得ることを示す。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるNSGTMマウスは、ヒトFLT3Lをコードする核酸(例えば、DNA)および不活性化マウスFlt3アレルを含む。
核酸は、DNA、RNA、またはDNAおよびRNAのキメラであり得る。いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lをコードする核酸(例えば、DNA)は、FLT3Lをコードする遺伝子を含む。遺伝子は、機能を有する分子(例えば、タンパク質)をコードするヌクレオチド(DNAまたはRNA)の配列である。遺伝子は、内因性(宿主生物の中に天然に存在する)であっても、外因性(天然にまたは遺伝子操作を介して宿主生物へと移入される)であってもよい。アレルは、変異によって生じ、染色体上の同じ遺伝子座において見出される遺伝子の2またはこれより多くの代替形態のうちの1つである。遺伝子は、いくつかの実施形態において、プロモーター配列、コード領域(例えば、エキソン)、非コード領域(例えば、イントロン)、および調節領域(調節配列ともいわれる)を含む。当該分野で公知のように、プロモーター配列は、遺伝子の転写が始まるDNA配列である。プロモーター配列は、代表的には、転写開始部位(転写部位の5’末端)の直ぐ上流に位置する。エキソンは、アミノ酸をコードする遺伝子の領域である。イントロン(および他の非コードDNA)は、アミノ酸をコードしない遺伝子の領域である。
ヒト遺伝子を含むマウスは、ヒト導入遺伝子を含むと考えられる。導入遺伝子は、宿主生物に対して外因性の遺伝子である。すなわち、導入遺伝子は、天然にまたは遺伝子操作を介して宿主生物に移入されている遺伝子である。導入遺伝子は、宿主生物(上記導入遺伝子を含む生物、例えば、マウス)において天然に存在しない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるとおりのマウスは、FLT3L導入遺伝子(例えば、ヒトFLT3L導入遺伝子)を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトFLT3L導入遺伝子は、マウスゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、上記ヒトFLT3L導入遺伝子は、配列番号7の核酸配列を含む。
不活性化アレルは、機能的遺伝子生成物(例えば、機能的タンパク質)の検出可能なレベルを生じないアレルである。いくつかの実施形態において、不活性化アレルは、転写されない。いくつかの実施形態において、不活性化アレルは、機能的タンパク質をコードしない。従って、不活性化マウスFlt3アレルを含むマウスは、検出可能なレベルの機能的FLT3を生じない。いくつかの実施形態において、不活性化マウスFlt3アレルを含むマウスは、いかなる機能的FLT3をも生じない。
いくつかの実施形態において、マウス(例えば、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウス)は、上記マウスFlt3アレルを不活性化するゲノム改変を含む。改変は、核酸に関しては、その相当する野生型核酸(例えば、天然に存在する核酸)に対する核酸の任意の操作である。従って、ゲノム改変は、ゲノム中のその相当する野生型核酸(例えば、天然に存在する核酸)に対する、ゲノム中の核酸の任意の操作である。核酸(例えば、ゲノム)改変の非限定的な例としては、欠失、挿入、「インデル(indel)」(欠失および挿入)、および置換(例えば、点変異)が挙げられる。いくつかの実施形態において、遺伝子における欠失、挿入、インデル、または他の改変は、その遺伝子がもはや機能的生成物(例えば、タンパク質)をコードしないように、フレームシフト変異を生じる。改変はまた、化学的改変、例えば、少なくとも1個の核酸塩基の化学的改変を含む。核酸改変の方法(例えば、遺伝子不活性化を生じるもの)は、公知であり、RNA干渉、化学的改変、および遺伝子編集(例えば、リコンビナーゼまたは他のプログラム可能なヌクレアーゼ系(例えば、CRISPR/Cas、TALEN、および/またはZFN)を使用する)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、CRISPR/Cas遺伝子編集は、本明細書中の他の箇所で記載されるように、マウスFlt3アレルを不活性化するために使用される。
いくつかの実施形態において、ゲノム改変(例えば、欠失またはインデル)は、コード領域、非コード領域、および調節領域から選択されるマウスFlt3アレルのうちの(少なくとも1つの)領域にある。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変(例えば、欠失またはインデル)は、マウスFlt3アレルのコード領域である。例えば、上記ゲノム改変(例えば、欠失またはインデル)は、マウスFlt3アレルのエキソン6、エキソン7、エキソン8にあってもよいし、エキソン6~8にまたがっていてもよい。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変は、ゲノム欠失である。例えば、上記マウスFlt3アレルは、エキソン6、エキソン7、およびエキソン8におけるヌクレオチド配列のゲノム欠失を含み得る。いくつかの実施形態において、配列番号5のヌクレオチド配列は、不活性化マウスFlt3アレルから欠失されている。いくつかの実施形態において、不活性化マウスFlt3アレルは、配列番号6のヌクレオチド配列を含む。
本明細書で提供されるNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lを発現する。いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lは、少なくとも5,000pg/mlまたは少なくとも10,000pg/mlのレベルで発現される。例えば、ヒトFLT3Lは、少なくとも5,000pg/ml、7,500pg/ml、10,000pg/ml、12,500pg/ml、15,000pg/ml、17,500pg/ml、20,000pg/ml、22,500pg/ml、25,000pg/ml、27,500pg/ml、30,000pg/ml、32,500pg/ml、35,000pg/ml、37,500pg/ml、40,000pg/ml、42,500pg/ml、45,000pg/ml、47,500pg/ml、または50,000pg/mlのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lは、10,000pg/ml~30,000pg/mlのレベルで発現される。いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lは、15,000±1000pg/mL~17,000±100pg/mlのレベルで発現される。FLT3Lタンパク質発現を検出する方法は公知であり、本明細書で提供されるように使用され得る。例えば、抗FLT3L抗体を使用するフローサイトメトリーおよび/またはELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)は、マウス組織および/または血液中に存在するヒトFLTL3タンパク質のレベルを検出するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3null--Tg(Hu-FLT3L)マウスはまた、マウスFLTL3を発現し得る。いくつかの実施形態において、マウスFLT3Lは、少なくとも1,000pg/mlまたは少なくとも2,000pg/mlのレベルで発現される。例えば、マウスFLT3Lは、3,000pg/ml、4,000pg/ml、5,000pg/ml、6,000pg/ml、7,000pg/ml、8,000pg/ml、9,000pg/ml、または10,000pg/mlのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、マウスFLT3Lは、5,000pg/ml~10,000pg/mlのレベルで発現される。いくつかの実施形態において、マウスFLT3Lは、6,000pg/ml~8,000mlのレベルで発現される。
いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、検出可能なレベルのマウスFLT3を発現しない。検出可能なレベルのマウスFLT3は、標準的なタンパク質検出アッセイ(例えば、フローサイトメトリーおとび/またはELISA)を使用して検出されるFLT3タンパク質の任意のレベルである。いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、検出不能なレベルまたは低レベルのマウスFLT3を発現する。例えば、マウスは、1,000pg/ml未満のマウスFLT3を発現し得る。いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、500pg/ml未満のマウスFLT3または100pg/ml未満のマウスFLT3を発現する。マウスFLT3レセプターはまた、分化抗原群CD135といわれる。従って、いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、CD135 複能性前駆(MPP3)細胞を含まない(CD135 複能性前駆(MPP3)細胞が存在しない)。
ヒト自然免疫系モデル
本開示のNSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、いくつかの実施形態において、ヒトCD34 HSCの生着およびヒト自然免疫系の発生を支持するために使用される。ヒト免疫系は、自然免疫系および適応免疫系を含む。自然免疫系は、感染部位への免疫細胞の動員、補体カスケードの活性化、異物の同定および白血球による身体からの除去、適応免疫系の活性化、ならびに感染性因子に対する物理的および化学的バリアとしての作用に関与する。
いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、内在するマウスHSCを殺滅するために致死量未満で照射され(例えば、100~300cGy)、次いで、その照射されたマウスは、ヒト自然免疫系の発生を開始するために、ヒトCD34 HSC(例えば、50,000~200,000 HSC)を生着させる。従って、いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトCD34 HSCをさらに含む。ヒトCD34 HSCは、ヒト臍帯血、動員された末梢血、および骨髄が挙げられるが、これらに限定されない任意の供給源に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記ヒトCD34 HSCは、ヒト臍帯血に由来する。
ヒトCD34 HSCの、多様な免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、樹状細胞)への分化は、連続する発生工程が、複数のサイトカインによって調節される複雑なプロセスである。このプロセスは、分化抗原群(CD)のような細胞表面を通じてモニターされ得る。例えば、CD45は、HSC、マクロファージ、単球、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞の表面上で発現されるので、生着を示すマーカーとして使用され得る。T細胞上では、CD45は、T細胞レセプターシグナル伝達、細胞成長、および細胞分化を調節する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、ヒトCD45 細胞を含む。予測外なことに、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、小腸においてヒトCD45 細胞の粘膜生着を示す。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスはまた、肺、胸腺、脾臓、および/またはリンパ節の組織へのヒトCD45 細胞の生着を示す。
CD45 細胞が成熟するにつれて、それらは、種々の発生ステージおよび分化している細胞タイプを示すさらなる生体マーカーを発現し始める。例えば、分化しているT細胞はまた、CD3、CD4、およびCD8を発現する。別の例として、発生している骨髄系細胞は、CD33を発現する。本開示のNSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、有利なことには、ヒトCD45 細胞を含むのみならず、ヒトCD45/CD3 二重陽性T細胞、ならびにヒトCD45/CD33 二重陽性骨髄系細胞をも含む。
従って、いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45 細胞の集団は、ヒトCD45/CD3 T細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトCD45 細胞の集団は、NSGTMコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45/CD3 T細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD3 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも25%増加する。例えば、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD3 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%増加し得る。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD3 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも50%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD3 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも100%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD3 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、25%~100%、25%~75%、25%~50%、50%~100%、50%~75%、または75%~100%増加する。
いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45 細胞の集団は、ヒトCD45/CD33 T細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトCD45 細胞の集団は、NSGTMコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45/CD33 T細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD33 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも25%増加する。例えば、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD33 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%増加し得る。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD33 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも50%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD33 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも100%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD45/CD33 T細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、25%~100%、25%~75%、25%~50%、50%~100%、50%~75%、または75%~100%増加する。
本明細書で提供されるNSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスはまた、驚くべきことに、樹状細胞(例えば、形質細胞様樹状細胞および骨髄系樹状細胞)、ナチュラルキラー細胞、および単球由来マクロファージ(単球マクロファージ)の生着を支持し得る。形質細胞様樹状細胞(pDC)は、高レベルのインターフェロンαを分泌する;骨髄系樹状細胞(mDC)は、インターロイキン12、インターロイキン6、腫瘍壊死因子、およびケモカインを分泌する;ナチュラルキラー細胞は、損傷した宿主細胞(例えば、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞)を破壊する;そしてマクロファージは、実質的な数の細菌または他の細胞または微生物を消費する。
いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、NSGTMコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD123 形質細胞様樹状細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD123 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも25%増加する。例えば、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD123 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%増加し得る。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD123 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも50%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD123 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも100%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD123 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、25%~100%、25%~75%、25%~50%、50%~100%、50%~75%、または75%~100%増加する。
いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、NSGTMコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD56 ナチュラルキラー細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD56 ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも25%増加する。例えば、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD56 ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%増加し得る。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD56 ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも50%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD56 ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも100%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD56 ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、25%~100%、25%~75%、25%~50%、50%~100%、50%~75%、または75%~100%増加する。
いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、NSGTMコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD14 単球マクロファージを含む。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD14 単球マクロファージのパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも25%増加する。例えば、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD14 単球マクロファージのパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%増加し得る。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD14 単球マクロファージのパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも50%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD14 単球マクロファージのパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも100%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD14 単球マクロファージのパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、25%~100%、25%~75%、25%~50%、50%~100%、50%~75%、または75%~100%増加する。
いくつかの実施形態において、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、NSGTMコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも25%増加する。例えば、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%増加し得る。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも50%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、少なくとも100%増加する。いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスにおけるヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、NSGTMコントロールマウスに対して、25%~100%、25%~75%、25%~50%、50%~100%、50%~75%、または75%~100%増加する。
トランスジェニック動物を生成する方法
いくつかの局面において、ヒトFLT3Lを発現するトランスジェニック動物を生成する方法が、本明細書で提供される。トランスジェニック動物は、本明細書において、そのゲノムの中に挿入されている(中に組み込まれている)外来(外因性)核酸(例えば、導入遺伝子)を有する動物をいう。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、トランスジェニック齧歯類(例えば、マウスまたはラット)である。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物はマウスである。例えば、トランスジェニックマウスを生成する方法は、周知である。トランスジェニック動物を生成するために使用される3つの従来からの方法としては、DNAマイクロインジェクション(Gordon and Ruddle, Science 1981: 214: 1244-124(本明細書に参考として援用される))、胚性幹細胞媒介性遺伝子移入(Gosslerら., Proc. Natl. Acad. Sci. 1986; 83: 9065-9069(本明細書に参考として援用される))およびレトロウイルス媒介性遺伝子移入(Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. 1976; 73: 1260-1264(本明細書に参考として援用される))が挙げられ、これらはいずれも、本明細書で提供されるように使用され得る。
上記ヒトFLT3Lをコードする核酸は、いくつかの実施形態において、ヒトFLT3Lをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター(例えば、構成的に活性なプロモーター)を含むヒトFLT3L導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物(例えば、マウス)を生成するために使用される上記ヒトFLT3Lをコードする核酸は、ベクター(例えば、プラスミド、細菌人工染色体(BAC)、または酵母人工染色体(YAC))上に存在し、これは、例えば、上記核酸が動物ゲノムの中にランダムに組み込まれる受精胚の前核/核に送達される。いくつかの実施形態において、上記核酸(例えば、BAC上で運ばれる)は、NSGTM Tg(Hu-FLT3L)マウスを生成するために、NSGTMマウスの受精胚に送達される。受精胚の注入後に、その受精胚は、偽妊娠雌性マウスに移入され、その後、ヒトFLTL3をコードする核酸を含む子孫が産まれる。ヒトFLTL3をコードする核酸の存在または非存在は、例えば、任意の数の遺伝子型決定法(例えば、配列決定および/またはゲノムPCR)を使用して確認され得る。
内因性Flt3アレルを不活性化する方法がまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、内因性Flt3アレルは、トランスジェニック動物において不活性化される。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、NSGTM Tg(Hu-FLT3L)マウスである。従って、いくつかの実施形態において、上記方法は、NSGTM Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいてマウスFlt3アレルを不活性化して、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスを生成する工程を包含する。遺伝子(アレル)不活性化の方法は公知であり、これらのうちのいずれも、本明細書で提供されるように使用され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子/ゲノム編集法が使用される。本明細書で提供されるように使用され得る操作されたヌクレアーゼベースの遺伝子編集システムとしては、例えば、クラスター化した規則的な配置の短いパリンドローム反復(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR)システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)が挙げられる。例えば、Carroll D Genetics. 2011; 188(4): 773-782; Joung JKら. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013; 14(1): 49-55;およびGaj Tら. Trends Biotechnol. 2013 Jul; 31(7): 397-405(これらの各々は、本明細書に参考として援用される)を参照のこと。
いくつかの実施形態において、CRISPRシステムは、例えば、内因性Flt3アレルを不活性化して、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスを生成するために使用される。例えば、Harms DWら., Curr Protoc Hum Genet. 2014; 83: 15.7.1-15.7.27;およびInui Mら., Sci Rep. 2014; 4: 5396(これらの各々は、本明細書に参考として援用される)を参照のこと。例えば、Cas9 mRNAまたはタンパク質および1または複数のガイドRNA(gRNA)が、Flt3遺伝子への正確なゲノム編集を生成するために、マウス胚へと直接注入され得る。これらの胚から発生するマウスは、それらが所望の変異(複数可)を有するかどうかを決定するために遺伝子型決定または配列決定され、その変異を有する胚は、生殖細胞系列伝達を確認するために交配される。
CRISPR/Casシステムは、原核生物における天然に存在する防御機構であり、これは、遺伝子編集のためのRNAガイドDNA標的化プラットフォーム(RNA-guided-DNA-targeting platform)として再利用されている。操作されたCRISPRシステムは、2つの主要な成分を含む:ガイドRNA(gRNA)およびCRISPR関連エンドヌクレアーゼ(例えば、Casタンパク質)。そのgRNAは、短い合成RNAであり、これは、ヌクレアーゼ結合および改変されるべきゲノム標的を定義するユーザー定義のヌクレオチドスペーサー(例えば、約15~25ヌクレオチド、または約20ヌクレオチド)のための足場配列から構成される。従って、gRNAに存在する標的配列を単に変化させることによって、Casタンパク質のゲノム標的を変化させ得る。いくつかの実施形態において、上記CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、Cas9、Cpf1、C2c1、およびC2c3から選択される。いくつかの実施形態において、上記Casヌクレアーゼは、Cas9である。
ガイドRNAは少なくとも、標的核酸配列(例えば、Flt3アレルの領域、例えば、プロモーター配列、コード配列、または非コード配列)にハイブリダイズする(または結合する)スペーサー配列、および上記エンドヌクレアーゼを結合し、上記エンドヌクレアーゼを上記標的核酸配列へとガイドするCRISPR反復配列を含む。当業者によって理解されるように、各gRNAは、そのゲノム標的配列(例えば、上記Flt3アレルの領域)に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、Jinekら., Science, 2012; 337: 816-821およびDeltchevaら. Nature, 2100; 471: 602-607(これらの各々は、本明細書に参考として援用される)を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法において使用されるgRNAは、マウスFlt3アレルのエキソン6に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法において使用されるgRNAは、マウスFlt3アレルのエキソン7に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法において使用されるgRNAは、マウスFlt3アレルのエキソン8に結合する。いくつかの実施形態において、複数のgRNAが、上記Flt3アレルの複数の領域を標的とするために使用される。いくつかの実施形態において、2つのgRNAが使用される(一方は上記Flt3アレルエキソン6に結合し、一方はエキソン8に結合する)。いくつかの実施形態において、本開示のgRNAは、配列番号1のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のgRNAは、配列番号2のヌクレオチド配列を含む。
使用方法
本明細書で提供されるマウスモデルは、任意の数の適用のために使用され得る。例えば、上記NSGTM Flt3null--Tg(Hu-FLT3L)マウスは、特定の薬剤(例えば、治療剤)または医療手順(例えば、組織移植)が、ヒト自然免疫系(例えば、ヒト自然免疫細胞応答)にどのように影響を及ぼすかを試験するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、ヒト自然免疫系発生に対する薬剤の影響を評価するために使用される。従って、上記NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスに薬剤を投与する工程、および上記マウスにおいてヒト自然免疫系発生に対する上記薬剤の影響を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。薬剤の効果は、例えば、ヒト自然免疫細胞(例えば、T細胞および/または樹状細胞)応答(例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など)を測定することによって評価され得る。薬剤の非限定的な例としては、治療剤(例えば、抗がん剤および抗炎症剤)、予防剤(例えば、免疫原性組成物(例えば、ワクチン))が挙げられる。
他の実施形態において、上記NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、ヒト腫瘍に対する免疫治療応答を評価するために使用される。従って、ヒト腫瘍を有するNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスに薬剤を投与する工程、および上記ヒト自然免疫系および/または上記マウスにおける腫瘍に対する上記薬剤の効果を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。薬剤の効果は、ヒト自然免疫細胞(例えば、T細胞および/または樹状細胞)応答および/または腫瘍細胞応答(例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など)を測定することによって評価され得る。いくつかの実施形態において、上記薬剤は、抗がん剤である。
さらに他の実施形態において、上記NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、感染性微生物に対するヒト自然免疫応答を評価するために使用される。従って、上記NSGTM Flt3null-Tg(Hu--FLT3L)マウスを感染性微生物(例えば、細菌および/またはウイルス)に曝す工程、および上記ヒト自然免疫応答に対する上記感染性微生物の影響を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。感染性微生物の影響は、ヒト自然免疫細胞(例えば、T細胞および/または樹状細胞)応答(例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など)を測定することによって評価され得る。これらの方法は、薬物または抗微生物剤(例えば、抗細菌剤または抗ウイルス剤)を上記マウスに投与する工程、および上記感染性微生物に対する上記薬物または抗微生物剤の効果を評価する工程をさらに包含し得る。
なおさらなる実施形態において、上記NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、組織移植に対するヒト免疫応答を評価するために使用される。従って、組織(例えば、同種異系組織)をNSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスに移植する工程、および上記ヒト自然免疫応答に対する移植した組織の影響を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。移植した組織の影響は、移植した組織に対するヒト自然免疫細胞(例えば、T細胞および/または樹状細胞)応答(例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など)を測定することによって評価され得る。
実施例1: NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスの生成
ヒトDC発生および自然免疫機能を支持するために、ヒトFLT3リガンド(FLT3L)を発現するトランスジェニックNSGTMマウス系の一団を生成した。これらのトランスジェニックマウス系を生成するために、CHORI BACPAKから得た細菌人工染色体(BAC)クローンRP11-360G9に由来する13.8キロベース(kb) BamHI制限フラグメントを、pBluescriptへとサブクローニングして、上記BACにおける他の遺伝子を排除した。次いで、精製し、直線状にしたDNAを、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSGTM)受精卵の前核に注入した。
11個のファウンダーを、PCRによって同定した。これらのファウンダーのうち、4個のファウンダー系(系3、7、8、および10)は、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)によって試験したときに、検出可能なレベルの循環ヒトFLT3Lを有した。これらのファウンダーを、NSG非トランスジェニックマウスと交配した。この交配のトランスジェニック子孫を、循環ヒトFLT3Lレベルに関してELISAによって試験した。上記ヒトFLT3L導入遺伝子に関してヘミ接合性またはホモ接合性であったトランスジェニックNSGマウス(系7および8)におけるFLT3Lのレベルは、400~600pg/mLの範囲に及んだ(図1)。
実施例2: NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスは、ヒトHSCの発生の障害を示す
次いで、ヒトFLT3Lを発現するトランスジェニックNSGTMマウス(NSGTM-Tg(Hu-FLT3L))に、ヒト臍帯血CD34 HSCを生着させた。NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスおよびNSGTM非トランスジェニックコントロールマウスのコホートを、致死量未満で照射し(200cGy)、100,000 ヒト臍帯血HSCを静脈内注射した。生着させたマウスに由来する末梢血のフローサイトメトリーを、生着後6週間、9週間、12週間、および15週間で行った。予測外なことに、ヒトCD45 細胞のパーセンテージは、試験した全ての時点で、NSGTMコントロールと比較して、上記NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて有意に低かった(図2)。
実施例3: NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスの生成
NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいて減少したヒトHSC生着が、宿主マウスDCおよびおそらく他の自然免疫マウス成分を活性化するヒトFLT3Lの結果であるかどうかを試験するために、マウスFLT3レセプターをコードする遺伝子(Flt3)をノックアウトした(ヒトFLT3LがマウスFLT3レセプターに結合し、マウス自然免疫を活性化させないようにするため)。理論によって縛られないが、上記マウスFLT3レセプターがなければ、ヒトFLT3LおよびマウスFLT3Lの両方が、ヒトFLT3レセプターに結合するために利用可能であろう。
上記FLT3レセプターをコードするマウスFlt3遺伝子を、ヒトFLT3リガンドを発現する上記NSGTM-Tg(Hu-FLT3L)ホモ接合性系統において直接ノックアウトした。上記マウスFlt3遺伝子をノックアウトするために、2種の単一ガイドRNA(sgRNA。以下の表1を参照のこと)を、その転写物が保持され、ハイポモルフ(hypomorph)が生じるとしても、免疫グロブリン様ドメインを排除するはずであるエキソン6および8を標的とするように設計した。上記sgRNAを、オフターゲット切断の可能性を最小限にするためにbreaking Cas(6)およびZifit(7)ソフトフトウェアを使用して設計し、ヒト配列に対してもチェックして、上記ヒトFLT3L導入遺伝子が標的とされないことを確実にした。両方のsgRNAを、各々、オフターゲット切断の可能性をさらに低減するために、19塩基の認識部位のみを有するTru-Guides(「短縮型」)として設計した(8)。上記sgRNAを、以前に記載されるように(9)調製した。
マウスFlt3ノックアウトのスクリーニングを、目的の領域(例えば、エキソン6~8)に隣接するPCRプライマー(以下の表1を参照のこと)を使用して行った。上記PCRプライマーは、変異体ドロップアウト(「DO」)アレルに関して670bpの推定サイズとともに、1942塩基対(bp)野生型アンプリコンを生じる。PCR後に、サンプルを、同じプライマーを使用してSanger配列決定法によってスクリーニングした。ノックアウトアレルを有する3つのファウンダーが、PCRによって同定され、その後、配列決定された。3つのノックアウト系を、最も大きな欠失を有するファウンダーに由来するN2マウスを交雑することによって樹立した(系1、2、および4)。ノックアウトを、PCRによってタイプ分けし、最終的に、単一ノックアウト系を拡大し、検証し、特徴付けし(NPD.Cg-Flt3em1MvwPrkdcscidIl2rgtm1WjlTg(Hu-FLT3L)7Sz)、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスと略した。
改変されたFlt3null アレルは、エキソン6の前に始まり、エキソン8の最後の直前に終結する1500bpを失った。その欠失した遺伝子配列は、配列番号5として示される(1500塩基対が、NSGTM Flt3null-Tg(Hu-FLT3L)マウスのマウスFlt3レセプター遺伝子において欠失した)。上記改変されたFlt3null アレルに関して得られるPCR生成物は、442bpである。このPCR生成物の配列は、配列番号6(標的化マウスFlt3遺伝子欠失から生じるPCR生成物)として示される。マウスFLT3レセプターは、分化抗原群CD135といわれる。上記NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスを、CD135 複能性前駆(MPP3)細胞の非存在によって、骨髄樹状細胞のフローサイトメトリーによってマウスFLT3の欠如に関して検証した(図3)。
Figure 2022520237000002
実施例4: NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)マウスは、樹状細胞発生を支持する
ヒトFLT3L導入遺伝子を発現し、マウスFLT3レセプターを欠く上記NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスの血清のELISAアッセイは、15,175±1,137pg/mL~17,120±92.7pg/mLの範囲に及ぶヒトFLT3Lのレベルを示した。上記NSGTM 非トランスジェニックコントロールマウスの血清は、検出可能なFLT3Lレベルを示さなかった(図4A~4B)。マウスFLT3Lのレベルは、NSGTM Flt3nullTg(Hu-FLT3L)において6,000~8,000pg/mLの範囲に及んだが、NSGTMコントロールにおけるマウスFLT3Lのレベルは、約1,000pg/mLであった。
上記NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスが、ヒトCD34 HSCによる生着およびヒト免疫系の発生を支持する能力を決定するために、8~12週齢のNSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスの群(n=8)およびNSGTMコントロールマウスの群(n=10)を、致死量未満で照射(200cGy)し、100,000 ヒト臍帯血CD34 HSCを静脈内注射(IV)した。生着後6週間、9週間、12週間、15週間、および18週間での生着させたマウスの末梢血のフローサイトメトリー分析は、上記NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)およびNSGTMコントロールマウスが、ヒトCD45 白血球の同様のパーセンテージを有することを示した。しかし、ヒトCD45 細胞集団において、上記NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスは、ヒトCD3 T細胞およびヒトCD33 骨髄系細胞の両方の有意に増加したパーセンテージを有した(図5A~5Dおよび図8A~8C)。
NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスはまた、ヒトCD123 形質細胞様樹状細胞、CD56 ヒトナチュラルキラー(NK)細胞、CD14 ヒト単球マクロファージ、およびCD11C HLA-DR ヒト骨髄系樹状細胞の増加したパーセンテージを示した(図6A~6D。8D~8F)。さらに、生着させたマウスに由来する組織の組織化学的分析から、予測外なことに、NSGTM Flt3null Tg(Hu-FLT3L)マウスの小腸においてヒトCD45 細胞の粘膜生着が示された(図7)。
配列
ATCCCCCAGTGCTGGTGACCTTGAACACAGGGTCTGCCCTGAGCAGTGCTGACAGCCTGTTAGCTGTCATTTTGAAGCATTTCCTGAAGGAAACTTACCTTATCATTGCAGCTGTAAAGAAGAAGGCCCTGCTGTTGTCAGAAAGGAGGAAAAGGTACTTCATGAGTTGTTCGGAACAGACATCAGATGCTGTGCTAGAAATGCACTGGGCCGCGAATGCACCAAGCTGTTCACCATAGGTAATGGGGGACTGTCGGCTATGTGTCCTTAGTGACGGTTCCTAAGGGACCGGTGATAGCTTCTGTGTGGGTAATCATTCCACTTCAGAAAGATGATGGAAAGTTATACTGAAATCCGAATCTAGATCGAATAGTCCACATTCTGACATAAAAGCAATTGAACACACAGGTATGGCCAAGCTTGGTGGCCCGGGCTTTTAATCCTTCTTTCATAGGACTTTGATTTGATTCAATTTGATTTGATTTGATTTGACTTAGGTGCTGGGCTCAAACCCAGGGACTCAGAGCATCTGCTTTGCCACTGAGTTCCACTCCAGATCTTTTGCACCACTTTATTTATTTATTTATTGTGTGTGTGTATACACACATTAAATACACACACATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGCTACAGCATGTAATGTGGATGTCAGGTTCTCTTCTTGTCATATGGGGCCCCTGGATCAAATTCAGGTCAGTCTGGCAGCGGCAGGCACCTCCACCCACTGAGCCATCTTGATGCCCCGTTCATACCATTTACAATGTAACACTGTAGATTCTGTAAGGGAGGATTTCTGCAACAAAGGGTATTCCATCTCGAGTGGGTGGTTTTACTCTGTCGCTTTTTTTTTTTTAGTTTTGTGCTGCTCTGTGACTCCAGGTCTTCTCCAGGCCAGCCTCTTTTACCCTGATCTTCTCAGCTCTGCATTGTTTGGCTTGATTAGTGATGGCAGGGATGCTGACACCATTGCTTTTCAAAACGTTTGCGACACTTCTGAGCTGAGGCAAAAGTTTTTAAAAAAAAGATGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCTTCTTTGGGATATTTTTATCTTCTAGATCTAAACCAGGCTCCTCAGAGCACACTGCCCCAGTTATTCCTGAAAGTGGGGGAACCCTTGTGGATCAGGTGTAAGGCCATCCATGTGAACCATGGATTCGGGCTCACCTGGGAGCTGGAAGACAAAGCCCTGGAGGAGGTAACAGCGCCCACCCGTGGTGTTTACCGTAAGCTCTCAGCGTGGGCTGGAAACCCGGAATACAGACTCCCCTTTCATTAATACTCAGGGCAGCTACTTTGAGATGAGTACCTACTCCACAAACAGGACCATGATTCGGATTCTCTTGGCCTTTGTGTCTTCCGTGGGAAGGAACGACACCGGATATTACACCTGCTCTTCCTCAAAGCACCCCAGCCAGTCAGCGTTGGTGACCA(配列番号5)

CCAACCTGAACTGTATGGAGATAGCTTGTCTATGGGGAAAAAAAATCACCAAATAAAATAAAATCTAAAATATTAAATAATAAAGTAATACTGTAACATTATCCTAATTAGATACAGAGTAGCTAGCTGGTCCCTGCAGATTCCAGGCTGGATACAGTTGAGTTAATTTTTCATCTGCTCTTTTCTTCCATCCCTAAAAATATACTTTGTAACTTCATCCCCTAAACATACTGGGTCCCCCCACCCCATCCTAGGTAACGGGCTCACGAAATTTGGGGTTGGTTGGTTTGTTTGTTTTTAATGCTGTCCTGGAACTCGCTGTGTAGATTGGTTGGCCTTGAACTCACAGAAATCTACCAGCATCTGCCTCCCCAGTGCTGGGATTAAAGGCACAGGCCACCAAGCTTGACTCTGCTTGTGTCTTTAGTGGCTTTCCCTGTGG(配列番号6)

GATCCCTGTGCTCCTCCGAGTGGCACAGGAAACTTGGCTGATAGAGGCGCTCTCTCCATGCATCCTCCACCATCCACTCCCCGGTCCCTTAGACTTCCATTCAGAAGTGACACCTGTCACCTCCACCCTCATGTGACTGGCCAAAGTGAGTGTGGCCATGTCCGAGTTCCCCAGGATGGGACCTCGAATCCTCCTGCTGGGGGGGTGGGGGCAGCAGATGTTTCAGGACAGTCTGCCACGGATCAGATGGGTGAGCAAGAGATTCAGGATGGGCGTGATGGGTCACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCGAGGCAGGCTGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGATCAGCCTGGCCAACATAGTGAAACCTCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCACGCACCTGCAATTCCAGCTACTTGGGAGCCTGAGGCACAAGAATTGCTTAAGCCCAGGAGGCGGAGGTTGCCGTGAGCCGAGACTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACCCCATCTAAAAAAAAAAAATGCTTCAGAGATTCAGAGATCCACAGATGTGGAAGAGAGCTTCTATTTTGTCTCATGTACCACCTCACCCCTCAGTTTGGAGTTGGAGAAGCCGAGGCTTAGAGAGGTCAAGGGGCTGGCCAAGCTCCCACAGTGATAAAGCTAGTGCTAGGGCGACACCTGCCAGGCCCAATGTGACAAGATGCATCCTGAGTCCTGTGTGCCAAGCCTTGGCGGGGCAAAGTTGGGGCCCGGAGGACGGTAAGACACAGCAACTGCGAGTTCCCAGAGACAGATCCGGGTTCCAGCCCCAGCTCACCATGCACTGGGCGTGCCACCCAGGGAGTCAGCCCCACTGCAGCCCCCGCTGCGGGGCGTCCGGAGAACGCGCCATCTGCGGCGTGAGCGGCCGCCTCTCACCACCAGGGGGCGCGCTCCGCCTGGGCCCAGATTCCACCCCTTGACTGTCTCCCCCCAAAAATTTCCTTTCACTTTCGGTCTCTGGCTGTCACCCGGCTTGGCCCCTTCCACACCCAACTGGGGCAAGCCTGGTGCGTGAGGAGACTTGGACTCTAGGTCCCCAAGGGGCGGAGCCAGGGTCCCCACTCCTGGGGCAGGGGGAGCAGAGGGTGGGGGGCTGGGTTCCCGGGTCCCTAACCTGGGGAGGGTTCTGGGGACCAGACGTCGAGGTTCTTAGAAGTGGAGATGAAGAGTTTTCACCGTAACTGGGGCAGACGCAGGAAGCCTGGGGGAGGAAGGGGCGGAAACTCAGCCACATCAATGGGACGCGGGAGGGGCGGGGAGGCAAAGGGGCGGGCAGGGCAGGGGCTGGGGCATGAGGGTCCGAGACTTGTTCTTCTGTCCCTTCCAAGACCCGGCGACAGGAGGCATGAGGGGCCCCCGGCCGAAATGACAGTGCTGGCGCCAGCCTGGAGCCCAACAGTGCGTAAACCCCAGGGACAAGATCAGGGGAGAGGGGAGGCACAATGTCAGGATGGGGCAGAGATGAGGGGAGATGGACGGGAGAACAGATGGACAGATGACGAGGAAATAGGAGGGGAGATGGACAGATGTGAGGGGAGATGGATAGGAGAGGAGACGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGATGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATAGAGGAGAGGGAGATAGAGAGGAGTGGGAGATGGACAGGAGCGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGCAGATGAACAGAGGAGAGGGAGATAAAGAGGAGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGATGGACAGAGAAGGGGGAGATGGACAGAGGTGGGGGAGATGGACAGGAGGGAAGATGGAGAGGAGGGGGTATGGACAGAGGAGAGGGGAGATGGACAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAGATGAAGAGGAGGGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGACGGACAGAGGAGAGGAAGAGAGACAGAGGAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAAAAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAAGGTGGACAGAGCCAAGAACAAATGAAGAGGACGTGGACCAAGATCAAGAGAGAAGCAGGCAACAGTGGTGTAGAAGGCAGAGGGAGGGACAGAGCTGGAGGAACCCGGGCGAGGAAACCAGACGTGAAGATGAGGTGGTTGGAGAGAGACCAGCAGAGTGGGGGAGATGGGGAGAGAGAGGGGTGGGGCAGAGGGGGATGCAAACTGGACAGCATTGGACCAGAGGCAGAGAGAAACCGGGAAAGACAGGCAGAGATGGGGCCATGTCTCCAGAAAGTGTGGAAGAGGCAGAAGGACACCCAGGGAAGGAGGAGCGGGGAAGACAGAACAGTACAGGTGGGAAGCCCGGAGGAGGGGGCTGTGTGTGGAACAGCAGAGGGCTCCCCCAGCACCCGCTCCCCTGCAGACCTATCTCCTCCTGCTGCTGCTGCTGAGCTCGGGACTCAGTGGGACCCAGGACTGCTCCTTCCAACACAGCCCCATCTCCTCCGACTTCGCTGTCAAAATCCGTGAGCTGGTGAGCGGCGCTGCCCCGGACCCCCTCATGTGATCCCCCTTCCCCCCACTTTTTTTTTTAAGTAGAGATGGGGTCTCTCTCCCTGTGTTTCCCAGGGTGGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCTTAGGGGTGTCATCCCTTTTTAAGGGCAAGGTTCTGTGGCTTCTTCTGGGCTCCCCCTCTCTTGGTCTTGTCCCTCTCTCTCTGGATCTCTGCTGCCACCTCTGGGTCCCCACAGTTCTGTTTCTCGCTGTTTTCAGCCAGGCCTGATCCTGTTTTCTCCCGCAGTCTGACTACCTGCTTCAAGATTACCCAGTCACCGTGGCCTCCAACCTGCAGGACGTAAGTCATGTTGGGAGGGACCTGGGATGGAGGTGGGGACCACAGACTCAAGATGCTCCACCGAGGCGAGTGGATAACCAGGCCCTCCCCTCCCCAAACCCAGGAATCAGAGTCCTCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGCCCCGGCCCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGCAGCCCCGTGCCCAGCTCCTCCCTCAGACCCGTGGGTTCTCCCCTCTAGGAGGAGCTCTGCGGGGGCCTCTGGCGGCTGGTCCTGGCACAGCGCTGGATGGAGCGGCTCAAGACTGTCGCTGGGTCCAAGATGCAAGGCTTGCTGGAGCGCGTGAACACGGAGATACACTTTGTCACCAAATGTGCCTTTCAGGTCAGCCCTCAACTTAGGGGACAAGTGAGGGGAGGGAGATGCCTTCCTACGAATTAGAAGTAAAGCTCCACTAGGCCTTATTGGCGATTTGGACCATAGCCACCCAACGAAGGTAGAGCGAGAAGCGCCACCCTGCAGAGCCCTGTTCCTACAGAACAACACGTCCCCAGGCACCGGTGATGGGGAGCAGTCTGGTCCCATTCTGGGGCCCCGGTTTCCTAGGCCATGATGAAGGGTGCCACTGAGGGGTTCTTCCCCCAAAAAAAAACAGGGAGAGAAGGGGTCTCTAAACTGAGGAGGCCGGGCGTGGTGGCTCACTCCTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGATGAAATCCCGGCTGTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCTCAGGAGGCTGAGGCACAGGAATCGCTTGAACCCGGGAGCCAGAGGCTGCAGTGAGCCGAGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGGAGACAGAGTGAAACTGTCTCAAAAACAAAACAAACAAACAAAAACCTCTCTCTGAGGGCTGGGTGCAGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTCGGAGGCCAAGGTGGGAGGATTATTTGAGCCCAGGAGTTCAAGACCAGCCCGGGTAACACAGTGAAACCTCATCTCTGCACAAAAATAAAAATAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGCCCACCTGTGGTCCCAGCTACTCAGAAGGCTGAGGTGGGAGGATCACTTGAGCCCTGGAGGTCGAGGCTGCGATGAGCTATGATTGGGCCACTGCACTCCAGCTTGAGCGACAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAACATAGAATAGGCCGTGTATGGTGGCTCACGACTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATTGCCTGAGCTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTCGGCAACGTGATGAAAACCATCTCTACTAAAATACAAAAACAAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGGGCACCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGACTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACACCACTGCCCTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCATCTCCAAAAAAATAAAAATAAAATAAAAGCCTGGGTACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCGAGGCGGGCAGATCACGAGGTCAGGAGTTTGAGACCACCCTGGCCAATGTGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGCGCGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGAATTCCTTGAACCCGGGAGGTAGAAGTTGCAGTAAGCCGAGATCGTGCCACTGTACTCCAGCCAGGGTGACAGAGCAAGACTCTGTCCCCAAAAAATAAATAAATAATAAAGTAACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGAGTCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATAGAGAAACCCCGTTTCTACTAAAAAATATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAGGCTGGGCACGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCACACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACAAGGTCAGGAGATCAAGACCATCCTGGCTAACACAATGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAACAATTAGCCGGGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAGTCCCAACTACCTGGGAGGCTGAGGCAGGTGAATGGCGTGAAACCAGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATTGCGCCACTGTACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCGAGACTCTGTCTTAAAAATAAATAAATAAATAAATATGGCCAAGCACGGTGGCTCATGCCTACAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGAGAAACCCCGTCTCTACTACAAATACAAAAAATAGCTGGGCATGGTGGTGGGCACCTATAGTCCCAACCACTGAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCATTTCACCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACTCTATCTCAAAAAAAAATTAATTAATTAAATAAATAAACTCTGAGAGCCAGAGCTCACTGGGCCCTGTTGCTGGGCATCGCCAGCAGGGAAGGGCCTTTGGCCTGCGGAGGGGCGGTGGGGGGATGACGTGGTGGTGACGTCTCCCTCCCCTGCTCCCAGCCCCCCCCCAGCTGTCTTCGCTTCGTCCAGACCAACATCTCCCGCCTCCTGCAGGAGACCTCCGAGCAGCTGGTGGCGCTGAAGCCCTGGATCACTCGCCAGAACTTCTCCCGGTGCCTGGAGCTGCAGTGTCAGCCCGGTAAAGGCTTCCAGGCACCCCCACTCCTTCCCCTCCTGTCCTCACGGCCGCTCCTCCTCTCTGCACAGTGCATCCCAGACCCCATCTTTCTCATATTGGTTGTGACAAGGGCAAGCTTATTCCTCTTTCTGGAGCTCAGTTTACCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCACTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTTGGCTCACTGCAAGCTCCGCCTCTCGGGTTCATGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACCACAGGCGCCCGCCACCACACCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTTACCGAGTTAAACCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTTGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACAGTGCCCAGCCTACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTCCCCCAGGCTGGAGTGCAGGGGTGCTATCTCGGCTCACTGCAAGCTCTGCCTCCTGGGTTCACGCCATTCTCTTGCCTCAGCCTCCCCAGCAGCTGGGACTACAGGCGCCTGCCACCTCACGCGGCTAATTTTTTTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGTGTTTCACCGTGTCAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGATGTGAGCCACCGCGCCCAGCCTATTGTTTTTTTTTTCTAAGTCGGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCAATCTTGGCTCACTGCAACCTCCATCTCCAGGGTTCAAGCGAATCTTCTGCCTCAGCCTTCCGAGTACCTGGGATTACAGATGCGCATACCATGCCTGGCTAGTTTTTGTGTTTTTAGTAGAGATGGGTTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCGCTCAGCCTATTCACTCATTTAATTTGTGACAGTCTGATGAGGTAGGTACAATGATTATCCTAGTTTTACAGATGAGCAAACTGAGGCACAGAGAGGCCAAGCAGCCCATCCAAGGTCACACAGCCAGTGGCAGCCAGGCCTCTCTTTCCTTCCTTACCCCAGCCCTTCTCCTTGGTCACCCAGCCTCCTCTTTCTCCCCAGACTCCTCAACCCTGCCACCCCCATGGAGTCCCCGGCCCCTGGAGGCCACAGCCCCGACAGCCCCGCAGCCCCCTCTGCTCCTCCTACTGCTGCTGCCCGTGGGCCTCCTGCTGCTGGCCGCTGCCTGGTGCCTGCACTGGCAGAGGACGCGGCGGAGGACACCCCGCCCTGGGGAGCAGGTGAGCAGGCTGGGAAGAGGGGGTGAGGGGGCCGAGAGGGTGGCCCACTTGTGGCTGACACTTTGGGGCCCACAGGTGCCCCCCGTCCCCAGTCCCCAGGACCTGCTGCTTGTGGAGCACTGACCTGGCCAAGGCCTCATCCTGGTGAGTCCTTCCTGGGCTATGGGGCCTGGACTTTGTGTCTGCAGGTTGGGAGGGTCACTAGGAGGCCATGGAAGGGTGGTGAGCAGTGGAGGGGCAGGGGCAGCTCTAGGTGCAGAAAGACCCCTCTGGGGCCAGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGCAAACCCCAGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAACTGGGCATAGTGGTGTGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGAAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATTGCGCCACTGGACTCCAGCCTGAGTGACAGAGCTAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGGAAAGACCCCTCTGGGGCCACGGAGACAGACTGGAGACCAAGCCGGAGGCTGTGGGAAGGCCCAGGGTGAGGACCATGACTGAGCCAGGGCTGGGACCATGGGATGGAGTGGAGTGGATGGGCAGAGAGTCAGGGGTCAGAGATCAGGAGGGACCGGCCTGGGGCCTGACAGGCTTGAGTTGGCACAGATAGCCCTGGTCCAGTGATGGGGTGGACAGGGGGGAACCTGGGGGAGGAGTCAGATTAGGGAAAGACATGGAGCTCACTGGGGACCTGAAGGAGCAAGGGGCCCTGGGGAGATCTGTGGATGTGGGAGTTTGCAAGCCTCCTGGGACAGGAAGGAAATGGCATTCCAGAAAGAGGGAACTGCCTTTGGAAGCCCTTTGGTATGAGAAAGCTCAGGGTGTTCCAGTAACTTGGGCCAGCGTGGGGCAGCAAGGAGCCATGGGAGGTGTGAGAGGGAGGAAAGGAGCTGGGAACAGGTGTGGAGGGTGCAGGCAGGTAGGCAGGTGGGCCAGGAGGGAAGAAGGAGGGGAGGCCCCAGCGGGTCCCCTAACATTTCAAATCTAACATTTTGTAGTAATTGCTCGCACATATAGTGCCTTGGTAATGCAGGCCTCATGTGGGGCTGGCTTGCTTGCTTTATTTTTTTTTGAGATGGACTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGGGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCGCCCGCCACCATGCCTGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCGCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGATCTCAGCTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATGACAGGTGTGAGCCACTGTTCCTGGCCCATGCTGGGCTTTCCACAAATGAACTCACTTCCTTGAGAAGTTCGTGCCATTATGATCCCAAGGCATAGAGAGGTAAATAATTTGCCAAAAGTCACACAGCTCAAGGGTGACAACCAAGATTTGACTTCAGGTTGTCTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGTAGTGCAGTGGCATGATCTCGGCTCACTGCAGCCCCCGCCTCCCAGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTGGGATTACAGGTACCCACCACCACACTCGGCTAATTTTTGTATTTGTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTTAGCTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCACGCCCGGCCTCGAGTTTGTCTTGATCCAGCATCTGTGCCCTTCACTCTGCTGCCTCAGTTTCCTGATCTGTACAAAAGGCTCTAATAATAGTCCTTCCACCATAGGGTTGTTATGGGGTGAAGTGAAGTGACACAGGCAAGGCTCTTAGAGCAACGCAGTGGAAACGGCATGTGAGCCACCTGTGCGATTTTCACTTTCCTGGTAGCCACATTTTTTTTTTTTTTTTCCTGAGATGGAGTCTCACTCTGTCGCCAGGTTGAAGTGCAGTGGTGTGATCTCAGCTCACTGCAACCTCCACCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCTTCAGTCTACCGAGTAGCTGGGATTACAGGCACGCGCCATCACGCCCGGCTAATTTTTTGTGTTTTTAGTAGAGACAAGGTTTCACCATGTTGGTCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCATGATCCACCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCGGGGTCACAGTTTTTAAAAAAGGAAAAAGAAGCAGGTAACTTTATTTTATGCAGTATATCCAAAATGTTGTTATTTCAACATGTAATCAGTATTTCTCAATGATTAATGAGACATTAATCAGTTGGAATCATTCATCATTTTGGGATATTTTACATTCTTTTGTCATACTAAGCCTTCAGCATCCAACGTATAGTTTATTTATTTATTTATTTTTCCTTTTGAGATGGATTCTCGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTCAGCTCACTGCAACCTCGGACTCCCTGGTTCAGGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTACCTGGGATTACGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTACTTTTAGTAGAGACCGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGATGATCTCCATCCCCTGACCTCGTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGATTACAAGTGTAAGCCACCGCGCCCAGCCCAGACAATAAATTTTTATC
AGAAATGCTTCATCTATATTTAAATTTCATGAAATTTACAGTTGCCAAAAGTAGACTCACATAGTCAAGTTGTTCAAAACATACATTAAACCAGCCTGGGCCACATGGTGAAACCCCATCTCTACAAAAAATTTTAAAAAGTAGCTGGGTGTGGTGGCACATGCCTGCAGTCCCAGCTACTTAGGAGGCAAAGTAGGAGGATTGCTTGAGCCCAGGAGGTCGAGGCTGCAGTGAGCCCTGATTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGAGAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAAACAAAAAAACCACACAGAAGAGTTTAGAATCCCAGTTGCTATCTCTGGGAATCATCATGATTGCTAAGACCGGTATCTATCCAACAACAACAAAAATAATTAGTGCACTCCAGCCTGGGCAATAGAGGGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATCAAAGACCAGTATCTAAATTGCTCTGTCGCCCAGGGTGGAGTGCAGTGGCACGATCTCGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCTTGGACTACAGGCGCGTGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGGTAGGGTTTCACTATGTTTGCCAGGATTGTCTCGATCTCTTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTATAGGCGTGAGCCACCACGCCCAGCCTATCTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAAAGGTAATACATTGAGCAGTTTTCCTCCCAACCTAGTCCCTGTCCAATCTGTTTCCTGTCTTAAATTTATTTTTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAGACTTTTGCTCTTGTTAGCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCTATCTTGACTCACGGCAACCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTTGGATTACAAGCGCCTGCCACCACGCCCAACTAATTTAGTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCTTTTGTTGTTGTTGTTGTTTTTGAGACGGAGTCTCACTCTATTGCCCAGGCTGGAGTGCAACGGCACGATCTCGGCTCACTGCAACATCTGCCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTACTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGCACACACCACCACACCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGATCTCGAACTCCTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTTGACCTCCCAAAGTGATAGGATTACAGCCATGAGCCGCCCTGCCCAACTAATACCTGATATTAATTTTATTGTATCTCACCCAGCATGGTGGCTCACACCTGTAACTCCTTGGCAGATCGCTTGAGCCTAAGAGTTCAAGACCAGCTTGGGCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATATAAAAATGAGCTGGGCATGGTGGCGTGCACCCGTAATCCCAGCTAACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAAGAATGGCTTGAACCCGGGAGGCAGAGGCTGCAGTGAGCTGAGATCATGCCACTGCATTCCAGCCTGAAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAGAAGTTTAAGTCCAGCCTCAAACTCCTGGACTCAAGTGATCCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGTGCACCGGCCCCATCTCAAGTGTTCAGTATTCACATGTGGCTTGTTACTCCCGTATTAAAGAGCAAAAATAGAGAACGTTTCTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGGAGTTTCGCTCTTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGACATGCACCACCATGCCTAGCAAATTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTCTTTTGAGACAGACTTTTGCTTTTATTGCCAAGGCTGGAGTGCAATGGTGCAATCTCGACTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCTAATTTTGTAGTTTTAGTAGAAACGGTTTCTCCATGTTAGCTAGGCTGGTCTCAAACTCCCAACCTCAGGTGATCCGCCCGCCTCGACCTCCTAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCCTGGCCCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCTCCCTGTTGGTCAGGCTGGTCTCAAACTCCCAACCTAAGGTGATCCACCAGCCTCAGCCTCCCAAACTGCTGGGATTATAGGCATGAGCCACCGCGCCCGGGGAAATATAGGGAACATTTCTATCATGGCCACGTTCTCTTGGACAGCAATGCCCTAGCACATAGTAAGCGCTTGCTGGGAATGGAGTTGTTTTGGGCATAAATCTGTGGCCCGCCCCAAGCTAAGCTACTTTCCCTCTCCTCTCTCAGCGGAGCCTTAAACAACGCAGTGAGACAGACATCTATCATCCCATTTTACAGGGGAGGATACTGAGGCACACAGAGGGGAGTCACCAGCCAGAGGATGCATAGCCTGGACACAGAGGAAGTTGGCTAGAGGCCGGTCCCTTCCTTGGGCCCCTCTCATTCCCTCCCCAGAATGGAGGCAACGCCAGAATCCAGCACCGGCCCCATTTACCCAACTCTGTACAAAGCCCTTGTCCCCATGAAATTGTATATAAATCATCCTTTTCTACCAGCTCTGGCCAGGTCTGTCTATGGATGGGTGTGAATGGGGTAGTTTTGATTTCAGAATCTTGGTTTTTGAATTGCAATGCAATGTTTCATTCAATACGTGTTTTCTGAGGTCCCCTGGAGCCCCGGGCCGGCGCTGGGCAATGTCAGAGCCTGGATTTGAGTCAGAACCAGCCCAGGTGCCCCAGGTCTCCTTGGCTATGGACGAGAAGACAAGGGATTCAGCGAGCCTGGGTGCAGGATGCCATAGGCTACTATGGAGATAAAACAGAGGCAGTGTGAGGGGCAACTCACCCAGGCAGGGAGAGCAGAGAGGCTTTCCAGAGCCAAATGGCATTGCGATGGTGACAAGCCAGATTTGGAGGGGGTGGGGAGGGCATCCTGGGCAAGGGACCCAGCTGAAGCAAAGGCCGACAGTCCAGAAAGTGAGAAGTTCCTCTGAGGAACGCTCAGTGGATTGGTGCAGCCAGGCAACTAGAAGCCATTCCTTGATCCACTCTTAGAGCCCCTGGGGAAGACCACCTCCATCTGTTTTACAGATGGATAAACTGAGGCCCAGATAAGGCCAAGGGTTTCTCCAGGTCACAGTGAAGTCGACCAGACACAGGAATCCAAATCTCTAAGCCTAGAATGGGCAAGGCTCCGGGGCTCACGCCGGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAACGGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAGTTCGAGATCAGCCTGGCCAACATGTCAGACTCCCCCCGTTCCCGGGCCACAACAAAATATATATATATATATATATTAGCCAGGCATGGTGGCGCGCCCCTGTAGTCCAAGTTACTCGAGAGGCTGAGGCAGGAG(配列番号7)
参考文献
1. P. Tsapogas, C. J. Mooney, G. Brown, A. Rolink, The Cytokine Flt3-Ligand in Normal and Malignant Hematopoiesis. International journal of molecular sciences 18, (2017).
2. C. J. Mooney, A. Cunningham, P. Tsapogas, K. M. Toellner, G. Brown, Selective Expression of Flt3 within the Mouse Hematopoietic Stem Cell Compartment. International journal of molecular sciences 18, (2017).
3. L. D. Shultz, M. A. Brehm, J. V. Garcia-Martinez, D. L. Greiner, Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nat Rev Immunol 12, 786-798 (2012).
4. K. Palucka, J. Banchereau, Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature reviews. Cancer 12, 265-277 (2012).
5. J. S. Do, B. Min, IL-15 produced and trans-presented by DCs underlies homeostatic competition between CD8 and {gamma}{delta} T cells in vivo. Blood 113, 6361-6371 (2009).
6. J. C. Oliveros et al., Breaking-Cas-interactive design of guide RNAs for CRISPR-Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic acids research 44, W267-271 (2016).
7. P. D. Hsu et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827--832 (2013).
8. Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung, Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature biotechnology 32, 279-284 (2014).
9. B. E. Low, P. M. Kutny, M. V. Wiles, Simple, Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing in Mice: Strategies and Methods. Methods Mol Biol 1438, 19-53 (2016).
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、主題に関して参考として援用され、上記主題に関して各々が引用され、上記主題は、いつかの場合に、文書の全体を包含し得る。
不定冠詞「a(ある、1つの)」および「an(ある、1つの)」は、本明細書および請求項において使用される場合、明らかにそうでないと示されなければ、「少なくとも1(at least one)」を意味すると理解されるべきである。
明らかにそうでないと示されなければ、本明細書で特許請求される1を超える工程または行為を含む任意の方法において、その方法の工程または行為の順序が、その方法の工程または行為の順序が記載される順序に必ずしも限定されないことはまた、理解されるべきである
請求項において、および上記の明細書において、全ての移行句(例えば、「含む、包含する(comprising)」、「含む、包含する、が挙げられる(including)」、「行う、有する(carrying)」、「有する(having)」、「含む、含有する(containing)」、「関わる、伴う、要する(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」など)は、開放系の制限がない、すなわち、が挙げられるが、これらに限定されない、を意味すると理解されるべきである。移行句「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」のみが、米国特許商標庁特許審査基準、第2111.03節に示されるように、それぞれ、閉鎖系または半閉鎖系の移行句であるものとする。
数値の前にある用語「約(about)」および「実質的に(substantially)」は、その記載される数値の±10%を意味する。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上端と下端との間の各値は、本明細書中で具体的に企図され、記載されている。

Claims (55)

  1. NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスであって、前記マウスは、
    ヒトFLT3Lをコードする核酸、および
    不活性化マウスFlt3アレル、
    を含むマウス。
  2. 前記マウスは、前記マウスFlt3アレルを不活性化するゲノム改変を含む、請求項1に記載のマウス。
  3. 前記ゲノム改変は、コード領域、非コード領域、および調節領域から選択される前記マウスFlt3アレルのうちの少なくとも1つの領域にある、請求項2に記載のマウス。
  4. 前記ゲノム改変は、前記マウスFlt3アレルのうちの少なくとも1個のコード領域にある、請求項3に記載のマウス。
  5. 前記ゲノム改変は、エキソン6、エキソン7、および/またはエキソン8にある、請求項4に記載のマウス。
  6. 前記ゲノム改変は、ゲノム欠失、ゲノム挿入、ゲノム置換、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項2~5のいずれか1項に記載のマウス。
  7. 前記ゲノム改変は、ゲノム欠失である、請求項6に記載のマウス。
  8. 前記マウスFlt3アレルは、エキソン6、エキソン7、およびエキソン8におけるヌクレオチド配列のゲノム欠失を含む、請求項7に記載のマウス。
  9. 配列番号5の核酸配列は、前記マウスFlt3アレルから欠失されている、請求項8に記載のマウス。
  10. 前記改変されたマウスFlt3アレルは、配列番号6の核酸配列を含む、請求項9に記載のマウス。
  11. ヒトFLT3Lをコードする前記核酸は、ヒトFLT3L導入遺伝子を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載のマウス。
  12. 前記ヒトFLT3L導入遺伝子は、配列番号7の核酸配列を含む、請求項11に記載のマウス。
  13. 前記マウスは、ヒトFLT3Lを発現する、請求項1~12のいずれか1項に記載のマウス。
  14. 前記ヒトFLT3Lは、少なくとも10,000pg/mlのレベルで発現される、請求項13に記載のマウス。
  15. 前記ヒトFLT3Lは、10,000pg/ml~30,000pg/mlのレベルで発現される、請求項14に記載のマウス。
  16. 前記ヒトFLT3Lは、15,000±1000pg/mL~17,000±100pg/mlのレベルで発現される、請求項14または15に記載のマウス。
  17. 前記マウスは、マウスFLT3Lを発現する、請求項1~16のいずれか1項に記載のマウス。
  18. 前記マウスFLT3Lは、少なくとも2,000pg/mlのレベルで発現される、請求項17に記載のマウス。
  19. 前記マウスFLT3Lは、5,000pg/ml~10,000pg/mlのレベルで発現される、請求項18に記載のマウス。
  20. 前記マウスFLT3Lは、6,000pg/ml~8,000mlのレベルで発現される、請求項18に記載のマウス。
  21. 前記マウスは、検出可能なレベルのマウスFLT3を発現しない、請求項1~20のいずれか1項に記載のマウス。
  22. 前記マウスによって発現される検出可能なレベルのマウスFLT3は、1,000pg/ml未満である、請求項1~21のいずれか1項に記載のマウス。
  23. 前記マウスは、検出可能な数のCD135 複能性前駆細胞を欠いている、請求項1~22のいずれか1項に記載のマウス。
  24. ヒトCD34 造血幹細胞をさらに含む、請求項1~23のいずれか1項に記載のマウス。
  25. 前記ヒトCD34 造血幹細胞は、ヒト臍帯血、骨髄、または動員された末梢血に由来する、請求項24に記載のマウス。
  26. 前記マウスは、ヒトCD45 細胞の集団を含む、請求項1~25のいずれか1項に記載のマウス。
  27. ヒトCD45 細胞の前記集団は、ヒトCD45/CD3 T細胞および/またはヒトCD45/CD33 骨髄系細胞を含む、請求項26に記載のマウス。
  28. ヒトCD45 細胞の前記集団は、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45/CD3 T細胞を含む、請求項27に記載のマウス。
  29. 前記マウスにおけるヒトCD45/CD3 T細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項28に記載のマウス。
  30. ヒトCD45 細胞の前記集団は、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD45/CD33 骨髄系細胞を含む、請求項27~29のいずれか1項に記載のマウス。
  31. 前記マウスにおけるヒトCD45/CD33 骨髄系細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項30に記載のマウス。
  32. 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD123 形質細胞様樹状細胞を含む、請求項1~31のいずれか1項に記載のマウス。
  33. 前記マウスにおけるヒトCD123 形質細胞様樹状細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項32に記載のマウス。
  34. 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD56 ナチュラルキラー細胞を含む、請求項1~33のいずれか1項に記載のマウス。
  35. 前記マウスにおけるヒトCD56 ナチュラルキラー細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項34に記載のマウス。
  36. 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD14 単球マクロファージを含む、請求項1~35のいずれか1項に記載のマウス。
  37. 前記マウスにおけるヒトCD14 単球マクロファージの前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項36に記載のマウス。
  38. 前記マウスは、NOD scid ガンマコントロールマウスまたはNOD scid ガンマ-Hu-FLT3Lコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞を含む、請求項1~37のいずれか1項に記載のマウス。
  39. 前記マウスにおけるヒトCD11C HLA-DR 骨髄系樹状細胞の前記パーセンテージは、少なくとも25%、少なくとも50%、または少なくとも100%増加する、請求項38に記載のマウス。
  40. 前記マウスは、前記マウスの小腸においてヒトCD45 細胞の粘膜生着を示す、請求項1~39のいずれか1項に記載のマウス。
  41. 請求項1~23のいずれか1項に記載のマウスを致死量未満で照射する工程および前記マウスにヒトCD34 造血幹細胞を注射する工程を包含する、方法。
  42. 前記マウスに、目的の薬剤を投与する工程をさらに包含する、請求項41に記載の方法。
  43. 前記マウスにおいてヒト免疫細胞に対する前記薬剤の効果を評価する工程をさらに包含する、請求項42に記載の方法。
  44. 前記ヒト免疫細胞は、T細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージから選択される、請求項43に記載の方法。
  45. NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスの前核にヒトFLT3Lをコードする核酸を注入する工程、NSG Tg(Hu-FLT3L)マウスを生成する工程、および前記NSG Tg(Hu-FLT3L)マウスにおいてマウスFlt3アレルを不活性化する工程を包含する、方法。
  46. NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NOD scid ガンマ)マウスにおいてマウスFlt3アレルを不活性化して、NSG Flt3null マウスを生成する工程、および前記NSG Flt3null マウスの前核にヒトFLT3Lをコードする核酸を注入する工程を包含する、方法。
  47. ヒトFLT3Lをコードする核酸および不活性化内因性Flt3アレルを含む、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ細胞。
  48. 請求項47に記載の細胞を含むトランスジェニック齧歯類であって、必要に応じて、ここで前記トランスジェニック齧歯類は、トランスジェニックマウスである、トランスジェニック齧歯類。
  49. Prkdcscidに関してホモ接合性、Il2rgtm1Wjlに関してホモ接合性、Flt3nullに関してホモ接合性、およびヒトFLT3L導入遺伝子に関してホモ接合性の雌性マウスと、Prkdcscidに関してホモ接合性、X連鎖Il2rgtm1Wjlに関してヘミ接合性、Flt3nullに関してホモ接合性、およびヒトFLT3L導入遺伝子に関してホモ接合性の雄性マウスとを交配して、子孫マウスを生成する工程を包含する、方法。
  50. マウスFlt3を標的とするgRNAであって、必要に応じて、ここで前記gRNAは、エキソン6またはエキソン8またはマウスFlt3を標的とする、gRNA。
  51. 前記gRNAは、配列番号1または配列番号2の配列を含む、請求項50に記載のgRNA。
  52. 請求項50または51に記載のgRNAを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで前記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞。
  53. マウスFlt3のエキソン6を標的とする第1のgRNAおよびマウスFlt3のエキソン8を標的とする第2のgRNAを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで前記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞。
  54. Cas9 mRNAおよび/またはCas9タンパク質をさらに含む、請求項52または53に記載のマウス卵母細胞。
  55. ヒトFLT3L導入遺伝子をさらに含む、請求項52~54のいずれか1項に記載のマウス卵母細胞。
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