JP2022520237A - 自然免疫機能を支持するトランスジェニックマウスモデル - Google Patents
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Abstract
いくつかの局面において、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含むＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマまたはＮＳＧＴＭ）マウス、上記マウスを生成する方法、および上記マウスを使用する方法が、本明細書で提供される。ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ）マウスであって、前記マウスは、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸、および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含むマウス。
Description
政府の許認可の権利
本発明は、国立衛生研究所によって支給された助成金番号１Ｒ０１１３２９６３の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって支給された助成金番号１Ｒ０１１３２９６３の下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年２月１３日出願の米国仮特許出願第６２／８０５２５７号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年２月１３日出願の米国仮特許出願第６２／８０５２５７号（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
背景
ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）レセプターを介するシグナル伝達は、造血前駆細胞および樹状細胞（ＤＣ）の生存、増殖、および分化を支持する（１，２）。ヒトＤＣは、抗原をヒトＴ細胞に提示するために必要であり、強いヒト免疫応答の発生に要求される（４）。成熟ヒトＤＣはまた、インターロイキン１５ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびヒト自然免疫系の他の成分の発生を支持する他の因子を生成する（５）。
ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）レセプターを介するシグナル伝達は、造血前駆細胞および樹状細胞（ＤＣ）の生存、増殖、および分化を支持する（１，２）。ヒトＤＣは、抗原をヒトＴ細胞に提示するために必要であり、強いヒト免疫応答の発生に要求される（４）。成熟ヒトＤＣはまた、インターロイキン１５ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびヒト自然免疫系の他の成分の発生を支持する他の因子を生成する（５）。
P. Tsapogas, C. J. Mooney, G. Brown, A. Rolink, The Cytokine Flt3－Ligand in Normal and Malignant Hematopoiesis. International journal of molecular sciences 18, (2017).
C. J. Mooney, A. Cunningham, P. Tsapogas, K. M. Toellner, G. Brown, Selective Expression of Flt3 within the Mouse Hematopoietic Stem Cell Compartment. International journal of molecular sciences 18, (2017).
K. Palucka, J. Banchereau, Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature reviews. Cancer 12, 265－277 (2012).
J. S. Do, B. Min, IL－15 produced and trans－presented by DCs underlies homeostatic competition between CD8 and {gamma}{delta} T cells in vivo. Blood 113, 6361－6371 (2009).
要旨
いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸（例えば、ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を含む）および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含む免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧＴＭ）マウス（「ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ」マウス）が、本明細書で提供される。上記ＮＳＧＴＭマウスは、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）生着を支持するが、それは、ヒトＨＳＣの、樹状細胞（ＤＣ）集団への発生の障害を示す（３）。ヒトＨＳＣの、ＤＣ集団への発生を支持するマウスモデルを提供するために、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現するトランスジェニックＮＳＧＴＭマウス（ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ））を生成した。しかし、予測外なことに、ヒトＨＳＣの生着は、ＮＳＧＴＭコントロールと比較して、ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて有意に低かった。ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて観察された表現型を理解するために、ＦＬＴ３Ｌの内因性マウスレセプター－Ｆｌｔ３－を、ノックアウトした。驚くべきことに、このトランスジェニック系（本明細書でＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）といわれる）のヒトＨＳＣによる生着は、（１）ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞およびヒトＣＤ３３＋ 骨髄系細胞の両方の有意に増加したパーセンテージ、（２）ヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞、ＣＤ５６＋ ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ１４＋ ヒト単球マクロファージ、およびＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ ヒト骨髄系樹状細胞の増加したパーセンテージ、ならびに（３）小腸におけるヒトＣＤ４５＋ 細胞の粘膜生着の支持、を生じる。理論によって縛られないが、ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）の減少したヒトＨＳＣ生着は、宿主マウスＦＬＴ３レセプター、宿主マウスＤＣおよびおそらくは他の自然免疫のマウス成分を介するヒトＦＬＴ３Ｌ活性化の結果であった可能性がある。
いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸（例えば、ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を含む）および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含む免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧＴＭ）マウス（「ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ」マウス）が、本明細書で提供される。上記ＮＳＧＴＭマウスは、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）生着を支持するが、それは、ヒトＨＳＣの、樹状細胞（ＤＣ）集団への発生の障害を示す（３）。ヒトＨＳＣの、ＤＣ集団への発生を支持するマウスモデルを提供するために、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現するトランスジェニックＮＳＧＴＭマウス（ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ））を生成した。しかし、予測外なことに、ヒトＨＳＣの生着は、ＮＳＧＴＭコントロールと比較して、ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて有意に低かった。ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて観察された表現型を理解するために、ＦＬＴ３Ｌの内因性マウスレセプター－Ｆｌｔ３－を、ノックアウトした。驚くべきことに、このトランスジェニック系（本明細書でＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）といわれる）のヒトＨＳＣによる生着は、（１）ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞およびヒトＣＤ３３＋ 骨髄系細胞の両方の有意に増加したパーセンテージ、（２）ヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞、ＣＤ５６＋ ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ１４＋ ヒト単球マクロファージ、およびＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ ヒト骨髄系樹状細胞の増加したパーセンテージ、ならびに（３）小腸におけるヒトＣＤ４５＋ 細胞の粘膜生着の支持、を生じる。理論によって縛られないが、ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）の減少したヒトＨＳＣ生着は、宿主マウスＦＬＴ３レセプター、宿主マウスＤＣおよびおそらくは他の自然免疫のマウス成分を介するヒトＦＬＴ３Ｌ活性化の結果であった可能性がある。
従って、本開示のいくつかの局面は、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含むＮＳＧＴＭマウス（ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ））を提供する。このマウスモデルは、ＨＳＣの、樹状細胞を含め、ヒト自然免疫系の多くの異なる細胞タイプへの発生を支持する。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、マウスＦｌｔ３アレルを不活性化するゲノム改変を含む。上記ゲノム改変は、いくつかの実施形態において、コード領域、非コード領域、および調節領域から選択されるマウスＦｌｔ３アレルのうちの少なくとも１つの領域にある。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変は、マウスＦｌｔ３アレルのうちの少なくとも１つのコード領域にある。例えば、上記ゲノム改変は、エキソン６、エキソン７、および／またはエキソン８にあり得る。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変は、ゲノム欠失、ゲノム挿入、ゲノム置換、およびこれらの組み合わせから選択される。例えば、上記ゲノム改変は、ゲノム欠失であり得る。上記マウスＦｌｔ３アレルは、例えば、エキソン６、エキソン７、およびエキソン８におけるヌクレオチド配列のゲノム欠失を含み得る。
いくつかの実施形態において、配列番号５の核酸配列は、マウスＦｌｔ３アレルから欠失されている。
いくつかの実施形態において、上記改変されたマウスＦｌｔ３アレルは、配列番号６の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子は、配列番号７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現する。上記ヒトＦＬＴ３Ｌは、例えば、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、上記ヒトＦＬＴ３Ｌは、１０，０００ｐｇ／ｍｌ～３０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される。例えば、上記ヒトＦＬＴ３Ｌは、１５，０００±１０００ｐｇ／ｍＬ～１７，０００±１００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現され得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、マウスＦＬＴ３Ｌを発現する。いくつかの実施形態において、上記マウスＦＬＴ３Ｌは、少なくとも２，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される。例えば、上記マウスＦＬＴ３Ｌは、５，０００ｐｇ／ｍｌ～１０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、上記マウスＦＬＴ３Ｌは、６，０００ｐｇ／ｍｌ～８，０００ｍｌのレベルで発現される。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３を発現しない。いくつかの実施形態において、上記マウスによって発現される検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３は、１，０００ｐｇ／ｍｌ未満である。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、検出可能な数のＣＤ１３５＋ 複能性前駆細胞を欠いている。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトＣＤ３４＋ 造血幹細胞をさらに含む。上記ヒトＣＤ３４＋ 造血幹細胞は、いくつかの実施形態において、ヒト臍帯血、骨髄、または動員された末梢血に由来する。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団を含む。上記ヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団は、いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞および／またはヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ 骨髄系細胞を含む。
いくつかの実施形態において、上記ヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団は、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記ヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団は、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ 骨髄系細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ 骨髄系細胞のパーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージを含む。例えば、上記マウスにおけるヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージのパーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加し得る。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞を含む。例えば、上記マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加する。
いくつかの実施形態において、上記マウスは、上記マウスの小腸においてヒトＣＤ４５＋ 細胞の粘膜生着を示す。
本開示の他の局面は、請求項１～２３のいずれか１項に記載のマウスを致死量未満で照射する工程、および上記マウスにヒトＣＤ３４＋ 造血幹細胞を注射する工程を包含する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記マウスに、目的の薬剤を投与する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記マウスにおいてヒト免疫細胞に対する上記薬剤の効果を評価する工程を包含する。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ヒト免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージから選択されることをさらに含む。
本開示のなお他の局面は、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ）マウスの前核にヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸を注入する工程、ＮＳＧ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスを生成する工程、および上記ＮＳＧ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいてマウスＦｌｔ３アレルを不活性化する工程を包含する方法を提供する。
本開示のさらに他の局面は、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ）マウスにおいてマウスＦｌｔ３アレルを不活性化して、ＮＳＧ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ マウスを生成する工程、および上記ＮＳＧ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ マウスの前核にヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸を注入する工程を包含する方法を提供する。
本開示のなおも他の局面は、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄに関してホモ接合性、Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌに関してホモ接合性、Ｆｌｔ３ｎｕｌｌに関してホモ接合性、およびヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子に関してホモ接合性の雌性マウスと、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄに関してホモ接合性、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌに関してヘミ接合性、Ｆｌｔ３ｎｕｌｌに関してホモ接合性、およびヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子に関してホモ接合性の雄性マウスとを交配して、子孫マウスを生成する工程を包含する方法を提供する。
さらになお、本開示のいくつかの局面は、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸および不活性化内因性Ｆｌｔ３アレルを含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ細胞を提供する。
本開示のなお他の局面は、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸および不活性化内因性Ｆｌｔ３アレルを含む細胞を含むトランスジェニック齧歯類を提供する。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック齧歯類は、トランスジェニックマウスである。
本開示のいくつかの局面は、マウスＦｌｔ３を標的とするｇＲＮＡであって、必要に応じて、ここで上記ｇＲＮＡは、マウスＦｌｔ３のエキソン６またはエキソン８を標的とするｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、上記ｇＲＮＡは、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ｇＲＮＡは、配列番号２の配列を含む。
本明細書で記載されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを含むマウス卵母細胞がまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、上記マウス卵母細胞は、受精している。
いくつかの局面は、マウスＦｌｔ３のエキソン６を標的とする第１のｇＲＮＡおよびマウスＦｌｔ３のエキソン８を標的とする第２のｇＲＮＡを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで上記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞をさらに提供する。
マウス卵母細胞は、いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をさらに含む。
マウス卵母細胞は、いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子をさらに含む。
詳細な説明
ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウス
本開示は、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ （ＮＳＧＴＭ）マウスを提供する。このマウスは、本明細書でＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスといわれる。
ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウス
本開示は、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ （ＮＳＧＴＭ）マウスを提供する。このマウスは、本明細書でＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスといわれる。
上記ＮＳＧＴＭマウスは、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠き、複数のサイトカインシグナル伝達経路に欠陥があり、自然免疫に多くの欠陥を有する免疫不全マウスである（例えば、Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤら． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００７； ７ （２）： １１８－１３０； Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤら． ２００５； Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４ （１０）： ６４７７－８９；およびＳｈｕｌｔｚ ＬＤら． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５； １５４ （１）： １８０－９１を参照のこと）。上記ＮＳＧＴＭマウス（非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス系統ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪに由来する（例えば、Ｍａｋｉｎｏ Ｓら． Ｊｉｋｋｅｎ Ｄｏｂｕｔｓｕ １９８０； ２９ （１）： １－１３を参照のこと））は、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ変異（「重症複合免疫不全」変異または「ｓｃｉｄ」変異ともいわれる）およびＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ 標的化変異を含む。上記Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ 変異は、ヒトＰＲＫＤＣ遺伝子のマウスホモログにおける機能喪失型変異である － この変異は、適応免疫を本質的に排除する（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＤＬら． １９９８； Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １６ （３）： １６６－１７７；およびＢｌｕｎｔ Ｔら． １９９５； Ｃｅｌｌ ８０ （５）： ８１３－２３を参照のこと）。Ｔｈｅ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ 変異は、ＮＫ細胞分化を遮断し、それによって、初代ヒト細胞の効率的生着を防止する障害を除去する、インターロイキン２レセプターγ鎖（ＩＬ２Ｒγ、ヒトにおけるＩＬ２ＲＧに相同）をコードする遺伝子におけるｎｕｌｌ変異である（Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤら． ２００５； Ｇｒｅｉｎｅｒら． １９９８；およびＣａｏ Ｘ．ら． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９５； ２ （３）： ２２３－３８）。機能喪失型変異は、当該分野で公知のように、機能をほとんどまたは全く有しない遺伝子生成物を生じる。比較によれば、ｎｕｌｌ変異は、機能を有しない遺伝子生成物を生じる。不活性化アレルは、機能喪失型アレルまたはｎｕｌｌアレルであり得る。
本明細書で提供されるＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸を含む。ＦＬＴ３Ｌ（例えば、ＮＣ＿００００１９．１０； 染色体：ＧＲＣｈ３８：１９：４９４７３６０７：４９４８６８３１：１）は、ＦＬＴ３レセプターを結合および活性化することによって、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の生成を刺激するサイトカインおよび成長因子である（例えば、Ｋｌｅｉｎ Ｏ．ら． Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３； ４３（２）： ５３３－５３９を参照のこと）。ＦＬＴ３Ｌは、定常状態の樹状細胞の発生にとって重要である。いくつかの実施形態において、上記ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を含む。驚くべきことに、本明細書で記載されるデータは、ヒトＦＬＴ３ＬがマウスＦＬＴ３を結合し得るが、これが理論によって縛られないが、自然マウス免疫を活性化し得ることを示す。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＮＳＧＴＭマウスは、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）および不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含む。
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡのキメラであり得る。いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、ＦＬＴ３Ｌをコードする遺伝子を含む。遺伝子は、機能を有する分子（例えば、タンパク質）をコードするヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列である。遺伝子は、内因性（宿主生物の中に天然に存在する）であっても、外因性（天然にまたは遺伝子操作を介して宿主生物へと移入される）であってもよい。アレルは、変異によって生じ、染色体上の同じ遺伝子座において見出される遺伝子の２またはこれより多くの代替形態のうちの１つである。遺伝子は、いくつかの実施形態において、プロモーター配列、コード領域（例えば、エキソン）、非コード領域（例えば、イントロン）、および調節領域（調節配列ともいわれる）を含む。当該分野で公知のように、プロモーター配列は、遺伝子の転写が始まるＤＮＡ配列である。プロモーター配列は、代表的には、転写開始部位（転写部位の５’末端）の直ぐ上流に位置する。エキソンは、アミノ酸をコードする遺伝子の領域である。イントロン（および他の非コードＤＮＡ）は、アミノ酸をコードしない遺伝子の領域である。
ヒト遺伝子を含むマウスは、ヒト導入遺伝子を含むと考えられる。導入遺伝子は、宿主生物に対して外因性の遺伝子である。すなわち、導入遺伝子は、天然にまたは遺伝子操作を介して宿主生物に移入されている遺伝子である。導入遺伝子は、宿主生物（上記導入遺伝子を含む生物、例えば、マウス）において天然に存在しない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるとおりのマウスは、ＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子（例えば、ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子）を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子は、マウスゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、上記ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子は、配列番号７の核酸配列を含む。
不活性化アレルは、機能的遺伝子生成物（例えば、機能的タンパク質）の検出可能なレベルを生じないアレルである。いくつかの実施形態において、不活性化アレルは、転写されない。いくつかの実施形態において、不活性化アレルは、機能的タンパク質をコードしない。従って、不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含むマウスは、検出可能なレベルの機能的ＦＬＴ３を生じない。いくつかの実施形態において、不活性化マウスＦｌｔ３アレルを含むマウスは、いかなる機能的ＦＬＴ３をも生じない。
いくつかの実施形態において、マウス（例えば、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウス）は、上記マウスＦｌｔ３アレルを不活性化するゲノム改変を含む。改変は、核酸に関しては、その相当する野生型核酸（例えば、天然に存在する核酸）に対する核酸の任意の操作である。従って、ゲノム改変は、ゲノム中のその相当する野生型核酸（例えば、天然に存在する核酸）に対する、ゲノム中の核酸の任意の操作である。核酸（例えば、ゲノム）改変の非限定的な例としては、欠失、挿入、「インデル（ｉｎｄｅｌ）」（欠失および挿入）、および置換（例えば、点変異）が挙げられる。いくつかの実施形態において、遺伝子における欠失、挿入、インデル、または他の改変は、その遺伝子がもはや機能的生成物（例えば、タンパク質）をコードしないように、フレームシフト変異を生じる。改変はまた、化学的改変、例えば、少なくとも１個の核酸塩基の化学的改変を含む。核酸改変の方法（例えば、遺伝子不活性化を生じるもの）は、公知であり、ＲＮＡ干渉、化学的改変、および遺伝子編集（例えば、リコンビナーゼまたは他のプログラム可能なヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＺＦＮ）を使用する）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集は、本明細書中の他の箇所で記載されるように、マウスＦｌｔ３アレルを不活性化するために使用される。
いくつかの実施形態において、ゲノム改変（例えば、欠失またはインデル）は、コード領域、非コード領域、および調節領域から選択されるマウスＦｌｔ３アレルのうちの（少なくとも１つの）領域にある。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変（例えば、欠失またはインデル）は、マウスＦｌｔ３アレルのコード領域である。例えば、上記ゲノム改変（例えば、欠失またはインデル）は、マウスＦｌｔ３アレルのエキソン６、エキソン７、エキソン８にあってもよいし、エキソン６～８にまたがっていてもよい。いくつかの実施形態において、上記ゲノム改変は、ゲノム欠失である。例えば、上記マウスＦｌｔ３アレルは、エキソン６、エキソン７、およびエキソン８におけるヌクレオチド配列のゲノム欠失を含み得る。いくつかの実施形態において、配列番号５のヌクレオチド配列は、不活性化マウスＦｌｔ３アレルから欠失されている。いくつかの実施形態において、不活性化マウスＦｌｔ３アレルは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。
本明細書で提供されるＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現する。いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌは、少なくとも５，０００ｐｇ／ｍｌまたは少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される。例えば、ヒトＦＬＴ３Ｌは、少なくとも５，０００ｐｇ／ｍｌ、７，５００ｐｇ／ｍｌ、１０，０００ｐｇ／ｍｌ、１２，５００ｐｇ／ｍｌ、１５，０００ｐｇ／ｍｌ、１７，５００ｐｇ／ｍｌ、２０，０００ｐｇ／ｍｌ、２２，５００ｐｇ／ｍｌ、２５，０００ｐｇ／ｍｌ、２７，５００ｐｇ／ｍｌ、３０，０００ｐｇ／ｍｌ、３２，５００ｐｇ／ｍｌ、３５，０００ｐｇ／ｍｌ、３７，５００ｐｇ／ｍｌ、４０，０００ｐｇ／ｍｌ、４２，５００ｐｇ／ｍｌ、４５，０００ｐｇ／ｍｌ、４７，５００ｐｇ／ｍｌ、または５０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌは、１０，０００ｐｇ／ｍｌ～３０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される。いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌは、１５，０００±１０００ｐｇ／ｍＬ～１７，０００±１００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される。ＦＬＴ３Ｌタンパク質発現を検出する方法は公知であり、本明細書で提供されるように使用され得る。例えば、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体を使用するフローサイトメトリーおよび／またはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）は、マウス組織および／または血液中に存在するヒトＦＬＴＬ３タンパク質のレベルを検出するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスはまた、マウスＦＬＴＬ３を発現し得る。いくつかの実施形態において、マウスＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１，０００ｐｇ／ｍｌまたは少なくとも２，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される。例えば、マウスＦＬＴ３Ｌは、３，０００ｐｇ／ｍｌ、４，０００ｐｇ／ｍｌ、５，０００ｐｇ／ｍｌ、６，０００ｐｇ／ｍｌ、７，０００ｐｇ／ｍｌ、８，０００ｐｇ／ｍｌ、９，０００ｐｇ／ｍｌ、または１０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現され得る。いくつかの実施形態において、マウスＦＬＴ３Ｌは、５，０００ｐｇ／ｍｌ～１０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される。いくつかの実施形態において、マウスＦＬＴ３Ｌは、６，０００ｐｇ／ｍｌ～８，０００ｍｌのレベルで発現される。
いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３を発現しない。検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３は、標準的なタンパク質検出アッセイ（例えば、フローサイトメトリーおとび／またはＥＬＩＳＡ）を使用して検出されるＦＬＴ３タンパク質の任意のレベルである。いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、検出不能なレベルまたは低レベルのマウスＦＬＴ３を発現する。例えば、マウスは、１，０００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３を発現し得る。いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、５００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３または１００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３を発現する。マウスＦＬＴ３レセプターはまた、分化抗原群ＣＤ１３５といわれる。従って、いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ＣＤ１３５＋ 複能性前駆（ＭＰＰ３）細胞を含まない（ＣＤ１３５＋ 複能性前駆（ＭＰＰ３）細胞が存在しない）。
ヒト自然免疫系モデル
本開示のＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣの生着およびヒト自然免疫系の発生を支持するために使用される。ヒト免疫系は、自然免疫系および適応免疫系を含む。自然免疫系は、感染部位への免疫細胞の動員、補体カスケードの活性化、異物の同定および白血球による身体からの除去、適応免疫系の活性化、ならびに感染性因子に対する物理的および化学的バリアとしての作用に関与する。
本開示のＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣの生着およびヒト自然免疫系の発生を支持するために使用される。ヒト免疫系は、自然免疫系および適応免疫系を含む。自然免疫系は、感染部位への免疫細胞の動員、補体カスケードの活性化、異物の同定および白血球による身体からの除去、適応免疫系の活性化、ならびに感染性因子に対する物理的および化学的バリアとしての作用に関与する。
いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、内在するマウスＨＳＣを殺滅するために致死量未満で照射され（例えば、１００～３００ｃＧｙ）、次いで、その照射されたマウスは、ヒト自然免疫系の発生を開始するために、ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣ（例えば、５０，０００～２００，０００ ＨＳＣ）を生着させる。従って、いくつかの実施形態において、上記マウスは、ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣをさらに含む。ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣは、ヒト臍帯血、動員された末梢血、および骨髄が挙げられるが、これらに限定されない任意の供給源に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来する。
ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣの、多様な免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞）への分化は、連続する発生工程が、複数のサイトカインによって調節される複雑なプロセスである。このプロセスは、分化抗原群（ＣＤ）のような細胞表面を通じてモニターされ得る。例えば、ＣＤ４５は、ＨＳＣ、マクロファージ、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞の表面上で発現されるので、生着を示すマーカーとして使用され得る。Ｔ細胞上では、ＣＤ４５は、Ｔ細胞レセプターシグナル伝達、細胞成長、および細胞分化を調節する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ヒトＣＤ４５＋ 細胞を含む。予測外なことに、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、小腸においてヒトＣＤ４５＋ 細胞の粘膜生着を示す。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスはまた、肺、胸腺、脾臓、および／またはリンパ節の組織へのヒトＣＤ４５＋ 細胞の生着を示す。
ＣＤ４５＋ 細胞が成熟するにつれて、それらは、種々の発生ステージおよび分化している細胞タイプを示すさらなる生体マーカーを発現し始める。例えば、分化しているＴ細胞はまた、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８を発現する。別の例として、発生している骨髄系細胞は、ＣＤ３３＋を発現する。本開示のＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、有利なことには、ヒトＣＤ４５＋ 細胞を含むのみならず、ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ 二重陽性Ｔ細胞、ならびにヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ 二重陽性骨髄系細胞をも含む。
従って、いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団は、ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団は、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも２５％増加する。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも１００％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％、または７５％～１００％増加する。
いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団は、ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団は、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも２５％増加する。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも１００％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％、または７５％～１００％増加する。
本明細書で提供されるＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスはまた、驚くべきことに、樹状細胞（例えば、形質細胞様樹状細胞および骨髄系樹状細胞）、ナチュラルキラー細胞、および単球由来マクロファージ（単球マクロファージ）の生着を支持し得る。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、高レベルのインターフェロンαを分泌する；骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）は、インターロイキン１２、インターロイキン６、腫瘍壊死因子、およびケモカインを分泌する；ナチュラルキラー細胞は、損傷した宿主細胞（例えば、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞）を破壊する；そしてマクロファージは、実質的な数の細菌または他の細胞または微生物を消費する。
いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも２５％増加する。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも１００％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％、または７５％～１００％増加する。
いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも２５％増加する。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも１００％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％、または７５％～１００％増加する。
いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージを含む。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージのパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも２５％増加する。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージのパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージのパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージのパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも１００％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージのパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％、または７５％～１００％増加する。
いくつかの実施形態において、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも２５％増加する。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、少なくとも１００％増加する。いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞のパーセンテージは、ＮＳＧＴＭコントロールマウスに対して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％、または７５％～１００％増加する。
トランスジェニック動物を生成する方法
いくつかの局面において、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現するトランスジェニック動物を生成する方法が、本明細書で提供される。トランスジェニック動物は、本明細書において、そのゲノムの中に挿入されている（中に組み込まれている）外来（外因性）核酸（例えば、導入遺伝子）を有する動物をいう。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、トランスジェニック齧歯類（例えば、マウスまたはラット）である。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物はマウスである。例えば、トランスジェニックマウスを生成する方法は、周知である。トランスジェニック動物を生成するために使用される３つの従来からの方法としては、ＤＮＡマイクロインジェクション（Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８１： ２１４： １２４４－１２４（本明細書に参考として援用される））、胚性幹細胞媒介性遺伝子移入（Ｇｏｓｓｌｅｒら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９８６； ８３： ９０６５－９０６９（本明細書に参考として援用される））およびレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９７６； ７３： １２６０－１２６４（本明細書に参考として援用される））が挙げられ、これらはいずれも、本明細書で提供されるように使用され得る。
いくつかの局面において、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現するトランスジェニック動物を生成する方法が、本明細書で提供される。トランスジェニック動物は、本明細書において、そのゲノムの中に挿入されている（中に組み込まれている）外来（外因性）核酸（例えば、導入遺伝子）を有する動物をいう。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、トランスジェニック齧歯類（例えば、マウスまたはラット）である。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物はマウスである。例えば、トランスジェニックマウスを生成する方法は、周知である。トランスジェニック動物を生成するために使用される３つの従来からの方法としては、ＤＮＡマイクロインジェクション（Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８１： ２１４： １２４４－１２４（本明細書に参考として援用される））、胚性幹細胞媒介性遺伝子移入（Ｇｏｓｓｌｅｒら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９８６； ８３： ９０６５－９０６９（本明細書に参考として援用される））およびレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９７６； ７３： １２６０－１２６４（本明細書に参考として援用される））が挙げられ、これらはいずれも、本明細書で提供されるように使用され得る。
上記ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、いくつかの実施形態において、ヒトＦＬＴ３Ｌをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター（例えば、構成的に活性なプロモーター）を含むヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を生成するために使用される上記ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸は、ベクター（例えば、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ））上に存在し、これは、例えば、上記核酸が動物ゲノムの中にランダムに組み込まれる受精胚の前核／核に送達される。いくつかの実施形態において、上記核酸（例えば、ＢＡＣ上で運ばれる）は、ＮＳＧＴＭ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスを生成するために、ＮＳＧＴＭマウスの受精胚に送達される。受精胚の注入後に、その受精胚は、偽妊娠雌性マウスに移入され、その後、ヒトＦＬＴＬ３をコードする核酸を含む子孫が産まれる。ヒトＦＬＴＬ３をコードする核酸の存在または非存在は、例えば、任意の数の遺伝子型決定法（例えば、配列決定および／またはゲノムＰＣＲ）を使用して確認され得る。
内因性Ｆｌｔ３アレルを不活性化する方法がまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、内因性Ｆｌｔ３アレルは、トランスジェニック動物において不活性化される。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、ＮＳＧＴＭ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスである。従って、いくつかの実施形態において、上記方法は、ＮＳＧＴＭ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいてマウスＦｌｔ３アレルを不活性化して、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスを生成する工程を包含する。遺伝子（アレル）不活性化の方法は公知であり、これらのうちのいずれも、本明細書で提供されるように使用され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子／ゲノム編集法が使用される。本明細書で提供されるように使用され得る操作されたヌクレアーゼベースの遺伝子編集システムとしては、例えば、クラスター化した規則的な配置の短いパリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ Ｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ２０１１； １８８（４）： ７７３－７８２； Ｊｏｕｎｇ ＪＫら． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１３； １４（１）： ４９－５５；およびＧａｊ Ｔら． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３ Ｊｕｌ； ３１（７）： ３９７－４０５（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、内因性Ｆｌｔ３アレルを不活性化して、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスを生成するために使用される。例えば、Ｈａｒｍｓ ＤＷら．， Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． ２０１４； ８３： １５．７．１－１５．７．２７；およびＩｎｕｉ Ｍら．， Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１４； ４： ５３９６（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはタンパク質および１または複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、Ｆｌｔ３遺伝子への正確なゲノム編集を生成するために、マウス胚へと直接注入され得る。これらの胚から発生するマウスは、それらが所望の変異（複数可）を有するかどうかを決定するために遺伝子型決定または配列決定され、その変異を有する胚は、生殖細胞系列伝達を確認するために交配される。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、原核生物における天然に存在する防御機構であり、これは、遺伝子編集のためのＲＮＡガイドＤＮＡ標的化プラットフォーム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ－ＤＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）として再利用されている。操作されたＣＲＩＳＰＲシステムは、２つの主要な成分を含む：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）。そのｇＲＮＡは、短い合成ＲＮＡであり、これは、ヌクレアーゼ結合および改変されるべきゲノム標的を定義するユーザー定義のヌクレオチドスペーサー（例えば、約１５～２５ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）のための足場配列から構成される。従って、ｇＲＮＡに存在する標的配列を単に変化させることによって、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変化させ得る。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、およびＣ２ｃ３から選択される。いくつかの実施形態において、上記Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
ガイドＲＮＡは少なくとも、標的核酸配列（例えば、Ｆｌｔ３アレルの領域、例えば、プロモーター配列、コード配列、または非コード配列）にハイブリダイズする（または結合する）スペーサー配列、および上記エンドヌクレアーゼを結合し、上記エンドヌクレアーゼを上記標的核酸配列へとガイドするＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。当業者によって理解されるように、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的配列（例えば、上記Ｆｌｔ３アレルの領域）に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、Ｊｉｎｅｋら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１２； ３３７： ８１６－８２１およびＤｅｌｔｃｈｅｖａら． Ｎａｔｕｒｅ， ２１００； ４７１： ６０２－６０７（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法において使用されるｇＲＮＡは、マウスＦｌｔ３アレルのエキソン６に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法において使用されるｇＲＮＡは、マウスＦｌｔ３アレルのエキソン７に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法において使用されるｇＲＮＡは、マウスＦｌｔ３アレルのエキソン８に結合する。いくつかの実施形態において、複数のｇＲＮＡが、上記Ｆｌｔ３アレルの複数の領域を標的とするために使用される。いくつかの実施形態において、２つのｇＲＮＡが使用される（一方は上記Ｆｌｔ３アレルエキソン６に結合し、一方はエキソン８に結合する）。いくつかの実施形態において、本開示のｇＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、本開示のｇＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
使用方法
本明細書で提供されるマウスモデルは、任意の数の適用のために使用され得る。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、特定の薬剤（例えば、治療剤）または医療手順（例えば、組織移植）が、ヒト自然免疫系（例えば、ヒト自然免疫細胞応答）にどのように影響を及ぼすかを試験するために使用され得る。
本明細書で提供されるマウスモデルは、任意の数の適用のために使用され得る。例えば、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、特定の薬剤（例えば、治療剤）または医療手順（例えば、組織移植）が、ヒト自然免疫系（例えば、ヒト自然免疫細胞応答）にどのように影響を及ぼすかを試験するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ヒト自然免疫系発生に対する薬剤の影響を評価するために使用される。従って、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスに薬剤を投与する工程、および上記マウスにおいてヒト自然免疫系発生に対する上記薬剤の影響を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。薬剤の効果は、例えば、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）を測定することによって評価され得る。薬剤の非限定的な例としては、治療剤（例えば、抗がん剤および抗炎症剤）、予防剤（例えば、免疫原性組成物（例えば、ワクチン））が挙げられる。
他の実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ヒト腫瘍に対する免疫治療応答を評価するために使用される。従って、ヒト腫瘍を有するＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスに薬剤を投与する工程、および上記ヒト自然免疫系および／または上記マウスにおける腫瘍に対する上記薬剤の効果を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。薬剤の効果は、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答および／または腫瘍細胞応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）を測定することによって評価され得る。いくつかの実施形態において、上記薬剤は、抗がん剤である。
さらに他の実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、感染性微生物に対するヒト自然免疫応答を評価するために使用される。従って、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－－ＦＬＴ３Ｌ）マウスを感染性微生物（例えば、細菌および／またはウイルス）に曝す工程、および上記ヒト自然免疫応答に対する上記感染性微生物の影響を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。感染性微生物の影響は、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）を測定することによって評価され得る。これらの方法は、薬物または抗微生物剤（例えば、抗細菌剤または抗ウイルス剤）を上記マウスに投与する工程、および上記感染性微生物に対する上記薬物または抗微生物剤の効果を評価する工程をさらに包含し得る。
なおさらなる実施形態において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、組織移植に対するヒト免疫応答を評価するために使用される。従って、組織（例えば、同種異系組織）をＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスに移植する工程、および上記ヒト自然免疫応答に対する移植した組織の影響を評価する工程を包含する方法が、本明細書で提供される。移植した組織の影響は、移植した組織に対するヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）を測定することによって評価され得る。
実施例１： ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスの生成
ヒトＤＣ発生および自然免疫機能を支持するために、ヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を発現するトランスジェニックＮＳＧＴＭマウス系の一団を生成した。これらのトランスジェニックマウス系を生成するために、ＣＨＯＲＩ ＢＡＣＰＡＫから得た細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ１１－３６０Ｇ９に由来する１３．８キロベース（ｋｂ） ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへとサブクローニングして、上記ＢＡＣにおける他の遺伝子を排除した。次いで、精製し、直線状にしたＤＮＡを、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧＴＭ）受精卵の前核に注入した。
ヒトＤＣ発生および自然免疫機能を支持するために、ヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を発現するトランスジェニックＮＳＧＴＭマウス系の一団を生成した。これらのトランスジェニックマウス系を生成するために、ＣＨＯＲＩ ＢＡＣＰＡＫから得た細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ１１－３６０Ｇ９に由来する１３．８キロベース（ｋｂ） ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへとサブクローニングして、上記ＢＡＣにおける他の遺伝子を排除した。次いで、精製し、直線状にしたＤＮＡを、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧＴＭ）受精卵の前核に注入した。
１１個のファウンダーを、ＰＣＲによって同定した。これらのファウンダーのうち、４個のファウンダー系（系３、７、８、および１０）は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって試験したときに、検出可能なレベルの循環ヒトＦＬＴ３Ｌを有した。これらのファウンダーを、ＮＳＧ非トランスジェニックマウスと交配した。この交配のトランスジェニック子孫を、循環ヒトＦＬＴ３Ｌレベルに関してＥＬＩＳＡによって試験した。上記ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子に関してヘミ接合性またはホモ接合性であったトランスジェニックＮＳＧマウス（系７および８）におけるＦＬＴ３Ｌのレベルは、４００～６００ｐｇ／ｍＬの範囲に及んだ（図１）。
実施例２： ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ヒトＨＳＣの発生の障害を示す
次いで、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現するトランスジェニックＮＳＧＴＭマウス（ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ））に、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋ ＨＳＣを生着させた。ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスおよびＮＳＧＴＭ非トランスジェニックコントロールマウスのコホートを、致死量未満で照射し（２００ｃＧｙ）、１００，０００ ヒト臍帯血ＨＳＣを静脈内注射した。生着させたマウスに由来する末梢血のフローサイトメトリーを、生着後６週間、９週間、１２週間、および１５週間で行った。予測外なことに、ヒトＣＤ４５＋ 細胞のパーセンテージは、試験した全ての時点で、ＮＳＧＴＭコントロールと比較して、上記ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて有意に低かった（図２）。
次いで、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現するトランスジェニックＮＳＧＴＭマウス（ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ））に、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋ ＨＳＣを生着させた。ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスおよびＮＳＧＴＭ非トランスジェニックコントロールマウスのコホートを、致死量未満で照射し（２００ｃＧｙ）、１００，０００ ヒト臍帯血ＨＳＣを静脈内注射した。生着させたマウスに由来する末梢血のフローサイトメトリーを、生着後６週間、９週間、１２週間、および１５週間で行った。予測外なことに、ヒトＣＤ４５＋ 細胞のパーセンテージは、試験した全ての時点で、ＮＳＧＴＭコントロールと比較して、上記ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて有意に低かった（図２）。
実施例３： ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスの生成
ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて減少したヒトＨＳＣ生着が、宿主マウスＤＣおよびおそらく他の自然免疫マウス成分を活性化するヒトＦＬＴ３Ｌの結果であるかどうかを試験するために、マウスＦＬＴ３レセプターをコードする遺伝子（Ｆｌｔ３）をノックアウトした（ヒトＦＬＴ３ＬがマウスＦＬＴ３レセプターに結合し、マウス自然免疫を活性化させないようにするため）。理論によって縛られないが、上記マウスＦＬＴ３レセプターがなければ、ヒトＦＬＴ３ＬおよびマウスＦＬＴ３Ｌの両方が、ヒトＦＬＴ３レセプターに結合するために利用可能であろう。
ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいて減少したヒトＨＳＣ生着が、宿主マウスＤＣおよびおそらく他の自然免疫マウス成分を活性化するヒトＦＬＴ３Ｌの結果であるかどうかを試験するために、マウスＦＬＴ３レセプターをコードする遺伝子（Ｆｌｔ３）をノックアウトした（ヒトＦＬＴ３ＬがマウスＦＬＴ３レセプターに結合し、マウス自然免疫を活性化させないようにするため）。理論によって縛られないが、上記マウスＦＬＴ３レセプターがなければ、ヒトＦＬＴ３ＬおよびマウスＦＬＴ３Ｌの両方が、ヒトＦＬＴ３レセプターに結合するために利用可能であろう。
上記ＦＬＴ３レセプターをコードするマウスＦｌｔ３遺伝子を、ヒトＦＬＴ３リガンドを発現する上記ＮＳＧＴＭ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）ホモ接合性系統において直接ノックアウトした。上記マウスＦｌｔ３遺伝子をノックアウトするために、２種の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ。以下の表１を参照のこと）を、その転写物が保持され、ハイポモルフ（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈ）が生じるとしても、免疫グロブリン様ドメインを排除するはずであるエキソン６および８を標的とするように設計した。上記ｓｇＲＮＡを、オフターゲット切断の可能性を最小限にするためにｂｒｅａｋｉｎｇ Ｃａｓ（６）およびＺｉｆｉｔ（７）ソフトフトウェアを使用して設計し、ヒト配列に対してもチェックして、上記ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子が標的とされないことを確実にした。両方のｓｇＲＮＡを、各々、オフターゲット切断の可能性をさらに低減するために、１９塩基の認識部位のみを有するＴｒｕ－Ｇｕｉｄｅｓ（「短縮型」）として設計した（８）。上記ｓｇＲＮＡを、以前に記載されるように（９）調製した。
マウスＦｌｔ３ノックアウトのスクリーニングを、目的の領域（例えば、エキソン６～８）に隣接するＰＣＲプライマー（以下の表１を参照のこと）を使用して行った。上記ＰＣＲプライマーは、変異体ドロップアウト（「ＤＯ」）アレルに関して６７０ｂｐの推定サイズとともに、１９４２塩基対（ｂｐ）野生型アンプリコンを生じる。ＰＣＲ後に、サンプルを、同じプライマーを使用してＳａｎｇｅｒ配列決定法によってスクリーニングした。ノックアウトアレルを有する３つのファウンダーが、ＰＣＲによって同定され、その後、配列決定された。３つのノックアウト系を、最も大きな欠失を有するファウンダーに由来するＮ２マウスを交雑することによって樹立した（系１、２、および４）。ノックアウトを、ＰＣＲによってタイプ分けし、最終的に、単一ノックアウト系を拡大し、検証し、特徴付けし（ＮＰＤ．Ｃｇ－Ｆｌｔ３ｅｍ１ＭｖｗＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）７Ｓｚ）、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスと略した。
改変されたＦｌｔ３ｎｕｌｌ アレルは、エキソン６の前に始まり、エキソン８の最後の直前に終結する１５００ｂｐを失った。その欠失した遺伝子配列は、配列番号５として示される（１５００塩基対が、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ－Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスのマウスＦｌｔ３レセプター遺伝子において欠失した）。上記改変されたＦｌｔ３ｎｕｌｌ アレルに関して得られるＰＣＲ生成物は、４４２ｂｐである。このＰＣＲ生成物の配列は、配列番号６（標的化マウスＦｌｔ３遺伝子欠失から生じるＰＣＲ生成物）として示される。マウスＦＬＴ３レセプターは、分化抗原群ＣＤ１３５といわれる。上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスを、ＣＤ１３５＋ 複能性前駆（ＭＰＰ３）細胞の非存在によって、骨髄樹状細胞のフローサイトメトリーによってマウスＦＬＴ３の欠如に関して検証した（図３）。
実施例４： ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、樹状細胞発生を支持する
ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を発現し、マウスＦＬＴ３レセプターを欠く上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスの血清のＥＬＩＳＡアッセイは、１５，１７５±１，１３７ｐｇ／ｍＬ～１７，１２０±９２．７ｐｇ／ｍＬの範囲に及ぶヒトＦＬＴ３Ｌのレベルを示した。上記ＮＳＧＴＭ 非トランスジェニックコントロールマウスの血清は、検出可能なＦＬＴ３Ｌレベルを示さなかった（図４Ａ～４Ｂ）。マウスＦＬＴ３Ｌのレベルは、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）において６，０００～８，０００ｐｇ／ｍＬの範囲に及んだが、ＮＳＧＴＭコントロールにおけるマウスＦＬＴ３Ｌのレベルは、約１，０００ｐｇ／ｍＬであった。
ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を発現し、マウスＦＬＴ３レセプターを欠く上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスの血清のＥＬＩＳＡアッセイは、１５，１７５±１，１３７ｐｇ／ｍＬ～１７，１２０±９２．７ｐｇ／ｍＬの範囲に及ぶヒトＦＬＴ３Ｌのレベルを示した。上記ＮＳＧＴＭ 非トランスジェニックコントロールマウスの血清は、検出可能なＦＬＴ３Ｌレベルを示さなかった（図４Ａ～４Ｂ）。マウスＦＬＴ３Ｌのレベルは、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌＴｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）において６，０００～８，０００ｐｇ／ｍＬの範囲に及んだが、ＮＳＧＴＭコントロールにおけるマウスＦＬＴ３Ｌのレベルは、約１，０００ｐｇ／ｍＬであった。
上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスが、ヒトＣＤ３４＋ ＨＳＣによる生着およびヒト免疫系の発生を支持する能力を決定するために、８～１２週齢のＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスの群（ｎ＝８）およびＮＳＧＴＭコントロールマウスの群（ｎ＝１０）を、致死量未満で照射（２００ｃＧｙ）し、１００，０００ ヒト臍帯血ＣＤ３４＋ ＨＳＣを静脈内注射（ＩＶ）した。生着後６週間、９週間、１２週間、１５週間、および１８週間での生着させたマウスの末梢血のフローサイトメトリー分析は、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）およびＮＳＧＴＭコントロールマウスが、ヒトＣＤ４５＋ 白血球の同様のパーセンテージを有することを示した。しかし、ヒトＣＤ４５＋ 細胞集団において、上記ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスは、ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞およびヒトＣＤ３３＋ 骨髄系細胞の両方の有意に増加したパーセンテージを有した（図５Ａ～５Ｄおよび図８Ａ～８Ｃ）。
ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスはまた、ヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞、ＣＤ５６＋ ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ１４＋ ヒト単球マクロファージ、およびＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ ヒト骨髄系樹状細胞の増加したパーセンテージを示した（図６Ａ～６Ｄ。８Ｄ～８Ｆ）。さらに、生着させたマウスに由来する組織の組織化学的分析から、予測外なことに、ＮＳＧＴＭ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスの小腸においてヒトＣＤ４５＋ 細胞の粘膜生着が示された（図７）。
配列
ATCCCCCAGTGCTGGTGACCTTGAACACAGGGTCTGCCCTGAGCAGTGCTGACAGCCTGTTAGCTGTCATTTTGAAGCATTTCCTGAAGGAAACTTACCTTATCATTGCAGCTGTAAAGAAGAAGGCCCTGCTGTTGTCAGAAAGGAGGAAAAGGTACTTCATGAGTTGTTCGGAACAGACATCAGATGCTGTGCTAGAAATGCACTGGGCCGCGAATGCACCAAGCTGTTCACCATAGGTAATGGGGGACTGTCGGCTATGTGTCCTTAGTGACGGTTCCTAAGGGACCGGTGATAGCTTCTGTGTGGGTAATCATTCCACTTCAGAAAGATGATGGAAAGTTATACTGAAATCCGAATCTAGATCGAATAGTCCACATTCTGACATAAAAGCAATTGAACACACAGGTATGGCCAAGCTTGGTGGCCCGGGCTTTTAATCCTTCTTTCATAGGACTTTGATTTGATTCAATTTGATTTGATTTGATTTGACTTAGGTGCTGGGCTCAAACCCAGGGACTCAGAGCATCTGCTTTGCCACTGAGTTCCACTCCAGATCTTTTGCACCACTTTATTTATTTATTTATTGTGTGTGTGTATACACACATTAAATACACACACATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGCTACAGCATGTAATGTGGATGTCAGGTTCTCTTCTTGTCATATGGGGCCCCTGGATCAAATTCAGGTCAGTCTGGCAGCGGCAGGCACCTCCACCCACTGAGCCATCTTGATGCCCCGTTCATACCATTTACAATGTAACACTGTAGATTCTGTAAGGGAGGATTTCTGCAACAAAGGGTATTCCATCTCGAGTGGGTGGTTTTACTCTGTCGCTTTTTTTTTTTTAGTTTTGTGCTGCTCTGTGACTCCAGGTCTTCTCCAGGCCAGCCTCTTTTACCCTGATCTTCTCAGCTCTGCATTGTTTGGCTTGATTAGTGATGGCAGGGATGCTGACACCATTGCTTTTCAAAACGTTTGCGACACTTCTGAGCTGAGGCAAAAGTTTTTAAAAAAAAGATGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCTTCTTTGGGATATTTTTATCTTCTAGATCTAAACCAGGCTCCTCAGAGCACACTGCCCCAGTTATTCCTGAAAGTGGGGGAACCCTTGTGGATCAGGTGTAAGGCCATCCATGTGAACCATGGATTCGGGCTCACCTGGGAGCTGGAAGACAAAGCCCTGGAGGAGGTAACAGCGCCCACCCGTGGTGTTTACCGTAAGCTCTCAGCGTGGGCTGGAAACCCGGAATACAGACTCCCCTTTCATTAATACTCAGGGCAGCTACTTTGAGATGAGTACCTACTCCACAAACAGGACCATGATTCGGATTCTCTTGGCCTTTGTGTCTTCCGTGGGAAGGAACGACACCGGATATTACACCTGCTCTTCCTCAAAGCACCCCAGCCAGTCAGCGTTGGTGACCA（配列番号５）
CCAACCTGAACTGTATGGAGATAGCTTGTCTATGGGGAAAAAAAATCACCAAATAAAATAAAATCTAAAATATTAAATAATAAAGTAATACTGTAACATTATCCTAATTAGATACAGAGTAGCTAGCTGGTCCCTGCAGATTCCAGGCTGGATACAGTTGAGTTAATTTTTCATCTGCTCTTTTCTTCCATCCCTAAAAATATACTTTGTAACTTCATCCCCTAAACATACTGGGTCCCCCCACCCCATCCTAGGTAACGGGCTCACGAAATTTGGGGTTGGTTGGTTTGTTTGTTTTTAATGCTGTCCTGGAACTCGCTGTGTAGATTGGTTGGCCTTGAACTCACAGAAATCTACCAGCATCTGCCTCCCCAGTGCTGGGATTAAAGGCACAGGCCACCAAGCTTGACTCTGCTTGTGTCTTTAGTGGCTTTCCCTGTGG（配列番号６）
GATCCCTGTGCTCCTCCGAGTGGCACAGGAAACTTGGCTGATAGAGGCGCTCTCTCCATGCATCCTCCACCATCCACTCCCCGGTCCCTTAGACTTCCATTCAGAAGTGACACCTGTCACCTCCACCCTCATGTGACTGGCCAAAGTGAGTGTGGCCATGTCCGAGTTCCCCAGGATGGGACCTCGAATCCTCCTGCTGGGGGGGTGGGGGCAGCAGATGTTTCAGGACAGTCTGCCACGGATCAGATGGGTGAGCAAGAGATTCAGGATGGGCGTGATGGGTCACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCGAGGCAGGCTGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGATCAGCCTGGCCAACATAGTGAAACCTCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCACGCACCTGCAATTCCAGCTACTTGGGAGCCTGAGGCACAAGAATTGCTTAAGCCCAGGAGGCGGAGGTTGCCGTGAGCCGAGACTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACCCCATCTAAAAAAAAAAAATGCTTCAGAGATTCAGAGATCCACAGATGTGGAAGAGAGCTTCTATTTTGTCTCATGTACCACCTCACCCCTCAGTTTGGAGTTGGAGAAGCCGAGGCTTAGAGAGGTCAAGGGGCTGGCCAAGCTCCCACAGTGATAAAGCTAGTGCTAGGGCGACACCTGCCAGGCCCAATGTGACAAGATGCATCCTGAGTCCTGTGTGCCAAGCCTTGGCGGGGCAAAGTTGGGGCCCGGAGGACGGTAAGACACAGCAACTGCGAGTTCCCAGAGACAGATCCGGGTTCCAGCCCCAGCTCACCATGCACTGGGCGTGCCACCCAGGGAGTCAGCCCCACTGCAGCCCCCGCTGCGGGGCGTCCGGAGAACGCGCCATCTGCGGCGTGAGCGGCCGCCTCTCACCACCAGGGGGCGCGCTCCGCCTGGGCCCAGATTCCACCCCTTGACTGTCTCCCCCCAAAAATTTCCTTTCACTTTCGGTCTCTGGCTGTCACCCGGCTTGGCCCCTTCCACACCCAACTGGGGCAAGCCTGGTGCGTGAGGAGACTTGGACTCTAGGTCCCCAAGGGGCGGAGCCAGGGTCCCCACTCCTGGGGCAGGGGGAGCAGAGGGTGGGGGGCTGGGTTCCCGGGTCCCTAACCTGGGGAGGGTTCTGGGGACCAGACGTCGAGGTTCTTAGAAGTGGAGATGAAGAGTTTTCACCGTAACTGGGGCAGACGCAGGAAGCCTGGGGGAGGAAGGGGCGGAAACTCAGCCACATCAATGGGACGCGGGAGGGGCGGGGAGGCAAAGGGGCGGGCAGGGCAGGGGCTGGGGCATGAGGGTCCGAGACTTGTTCTTCTGTCCCTTCCAAGACCCGGCGACAGGAGGCATGAGGGGCCCCCGGCCGAAATGACAGTGCTGGCGCCAGCCTGGAGCCCAACAGTGCGTAAACCCCAGGGACAAGATCAGGGGAGAGGGGAGGCACAATGTCAGGATGGGGCAGAGATGAGGGGAGATGGACGGGAGAACAGATGGACAGATGACGAGGAAATAGGAGGGGAGATGGACAGATGTGAGGGGAGATGGATAGGAGAGGAGACGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGATGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATAGAGGAGAGGGAGATAGAGAGGAGTGGGAGATGGACAGGAGCGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGCAGATGAACAGAGGAGAGGGAGATAAAGAGGAGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGATGGACAGAGAAGGGGGAGATGGACAGAGGTGGGGGAGATGGACAGGAGGGAAGATGGAGAGGAGGGGGTATGGACAGAGGAGAGGGGAGATGGACAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAGATGAAGAGGAGGGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGACGGACAGAGGAGAGGAAGAGAGACAGAGGAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAAAAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAAGGTGGACAGAGCCAAGAACAAATGAAGAGGACGTGGACCAAGATCAAGAGAGAAGCAGGCAACAGTGGTGTAGAAGGCAGAGGGAGGGACAGAGCTGGAGGAACCCGGGCGAGGAAACCAGACGTGAAGATGAGGTGGTTGGAGAGAGACCAGCAGAGTGGGGGAGATGGGGAGAGAGAGGGGTGGGGCAGAGGGGGATGCAAACTGGACAGCATTGGACCAGAGGCAGAGAGAAACCGGGAAAGACAGGCAGAGATGGGGCCATGTCTCCAGAAAGTGTGGAAGAGGCAGAAGGACACCCAGGGAAGGAGGAGCGGGGAAGACAGAACAGTACAGGTGGGAAGCCCGGAGGAGGGGGCTGTGTGTGGAACAGCAGAGGGCTCCCCCAGCACCCGCTCCCCTGCAGACCTATCTCCTCCTGCTGCTGCTGCTGAGCTCGGGACTCAGTGGGACCCAGGACTGCTCCTTCCAACACAGCCCCATCTCCTCCGACTTCGCTGTCAAAATCCGTGAGCTGGTGAGCGGCGCTGCCCCGGACCCCCTCATGTGATCCCCCTTCCCCCCACTTTTTTTTTTAAGTAGAGATGGGGTCTCTCTCCCTGTGTTTCCCAGGGTGGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCTTAGGGGTGTCATCCCTTTTTAAGGGCAAGGTTCTGTGGCTTCTTCTGGGCTCCCCCTCTCTTGGTCTTGTCCCTCTCTCTCTGGATCTCTGCTGCCACCTCTGGGTCCCCACAGTTCTGTTTCTCGCTGTTTTCAGCCAGGCCTGATCCTGTTTTCTCCCGCAGTCTGACTACCTGCTTCAAGATTACCCAGTCACCGTGGCCTCCAACCTGCAGGACGTAAGTCATGTTGGGAGGGACCTGGGATGGAGGTGGGGACCACAGACTCAAGATGCTCCACCGAGGCGAGTGGATAACCAGGCCCTCCCCTCCCCAAACCCAGGAATCAGAGTCCTCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGCCCCGGCCCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGCAGCCCCGTGCCCAGCTCCTCCCTCAGACCCGTGGGTTCTCCCCTCTAGGAGGAGCTCTGCGGGGGCCTCTGGCGGCTGGTCCTGGCACAGCGCTGGATGGAGCGGCTCAAGACTGTCGCTGGGTCCAAGATGCAAGGCTTGCTGGAGCGCGTGAACACGGAGATACACTTTGTCACCAAATGTGCCTTTCAGGTCAGCCCTCAACTTAGGGGACAAGTGAGGGGAGGGAGATGCCTTCCTACGAATTAGAAGTAAAGCTCCACTAGGCCTTATTGGCGATTTGGACCATAGCCACCCAACGAAGGTAGAGCGAGAAGCGCCACCCTGCAGAGCCCTGTTCCTACAGAACAACACGTCCCCAGGCACCGGTGATGGGGAGCAGTCTGGTCCCATTCTGGGGCCCCGGTTTCCTAGGCCATGATGAAGGGTGCCACTGAGGGGTTCTTCCCCCAAAAAAAAACAGGGAGAGAAGGGGTCTCTAAACTGAGGAGGCCGGGCGTGGTGGCTCACTCCTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGATGAAATCCCGGCTGTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCTCAGGAGGCTGAGGCACAGGAATCGCTTGAACCCGGGAGCCAGAGGCTGCAGTGAGCCGAGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGGAGACAGAGTGAAACTGTCTCAAAAACAAAACAAACAAACAAAAACCTCTCTCTGAGGGCTGGGTGCAGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTCGGAGGCCAAGGTGGGAGGATTATTTGAGCCCAGGAGTTCAAGACCAGCCCGGGTAACACAGTGAAACCTCATCTCTGCACAAAAATAAAAATAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGCCCACCTGTGGTCCCAGCTACTCAGAAGGCTGAGGTGGGAGGATCACTTGAGCCCTGGAGGTCGAGGCTGCGATGAGCTATGATTGGGCCACTGCACTCCAGCTTGAGCGACAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAACATAGAATAGGCCGTGTATGGTGGCTCACGACTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATTGCCTGAGCTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTCGGCAACGTGATGAAAACCATCTCTACTAAAATACAAAAACAAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGGGCACCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGACTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACACCACTGCCCTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCATCTCCAAAAAAATAAAAATAAAATAAAAGCCTGGGTACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCGAGGCGGGCAGATCACGAGGTCAGGAGTTTGAGACCACCCTGGCCAATGTGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGCGCGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGAATTCCTTGAACCCGGGAGGTAGAAGTTGCAGTAAGCCGAGATCGTGCCACTGTACTCCAGCCAGGGTGACAGAGCAAGACTCTGTCCCCAAAAAATAAATAAATAATAAAGTAACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGAGTCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATAGAGAAACCCCGTTTCTACTAAAAAATATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAGGCTGG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ATCCCCCAGTGCTGGTGACCTTGAACACAGGGTCTGCCCTGAGCAGTGCTGACAGCCTGTTAGCTGTCATTTTGAAGCATTTCCTGAAGGAAACTTACCTTATCATTGCAGCTGTAAAGAAGAAGGCCCTGCTGTTGTCAGAAAGGAGGAAAAGGTACTTCATGAGTTGTTCGGAACAGACATCAGATGCTGTGCTAGAAATGCACTGGGCCGCGAATGCACCAAGCTGTTCACCATAGGTAATGGGGGACTGTCGGCTATGTGTCCTTAGTGACGGTTCCTAAGGGACCGGTGATAGCTTCTGTGTGGGTAATCATTCCACTTCAGAAAGATGATGGAAAGTTATACTGAAATCCGAATCTAGATCGAATAGTCCACATTCTGACATAAAAGCAATTGAACACACAGGTATGGCCAAGCTTGGTGGCCCGGGCTTTTAATCCTTCTTTCATAGGACTTTGATTTGATTCAATTTGATTTGATTTGATTTGACTTAGGTGCTGGGCTCAAACCCAGGGACTCAGAGCATCTGCTTTGCCACTGAGTTCCACTCCAGATCTTTTGCACCACTTTATTTATTTATTTATTGTGTGTGTGTATACACACATTAAATACACACACATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACGCTACAGCATGTAATGTGGATGTCAGGTTCTCTTCTTGTCATATGGGGCCCCTGGATCAAATTCAGGTCAGTCTGGCAGCGGCAGGCACCTCCACCCACTGAGCCATCTTGATGCCCCGTTCATACCATTTACAATGTAACACTGTAGATTCTGTAAGGGAGGATTTCTGCAACAAAGGGTATTCCATCTCGAGTGGGTGGTTTTACTCTGTCGCTTTTTTTTTTTTAGTTTTGTGCTGCTCTGTGACTCCAGGTCTTCTCCAGGCCAGCCTCTTTTACCCTGATCTTCTCAGCTCTGCATTGTTTGGCTTGATTAGTGATGGCAGGGATGCTGACACCATTGCTTTTCAAAACGTTTGCGACACTTCTGAGCTGAGGCAAAAGTTTTTAAAAAAAAGATGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCTTCTTTGGGATATTTTTATCTTCTAGATCTAAACCAGGCTCCTCAGAGCACACTGCCCCAGTTATTCCTGAAAGTGGGGGAACCCTTGTGGATCAGGTGTAAGGCCATCCATGTGAACCATGGATTCGGGCTCACCTGGGAGCTGGAAGACAAAGCCCTGGAGGAGGTAACAGCGCCCACCCGTGGTGTTTACCGTAAGCTCTCAGCGTGGGCTGGAAACCCGGAATACAGACTCCCCTTTCATTAATACTCAGGGCAGCTACTTTGAGATGAGTACCTACTCCACAAACAGGACCATGATTCGGATTCTCTTGGCCTTTGTGTCTTCCGTGGGAAGGAACGACACCGGATATTACACCTGCTCTTCCTCAAAGCACCCCAGCCAGTCAGCGTTGGTGACCA（配列番号５）
CCAACCTGAACTGTATGGAGATAGCTTGTCTATGGGGAAAAAAAATCACCAAATAAAATAAAATCTAAAATATTAAATAATAAAGTAATACTGTAACATTATCCTAATTAGATACAGAGTAGCTAGCTGGTCCCTGCAGATTCCAGGCTGGATACAGTTGAGTTAATTTTTCATCTGCTCTTTTCTTCCATCCCTAAAAATATACTTTGTAACTTCATCCCCTAAACATACTGGGTCCCCCCACCCCATCCTAGGTAACGGGCTCACGAAATTTGGGGTTGGTTGGTTTGTTTGTTTTTAATGCTGTCCTGGAACTCGCTGTGTAGATTGGTTGGCCTTGAACTCACAGAAATCTACCAGCATCTGCCTCCCCAGTGCTGGGATTAAAGGCACAGGCCACCAAGCTTGACTCTGCTTGTGTCTTTAGTGGCTTTCCCTGTGG（配列番号６）
GATCCCTGTGCTCCTCCGAGTGGCACAGGAAACTTGGCTGATAGAGGCGCTCTCTCCATGCATCCTCCACCATCCACTCCCCGGTCCCTTAGACTTCCATTCAGAAGTGACACCTGTCACCTCCACCCTCATGTGACTGGCCAAAGTGAGTGTGGCCATGTCCGAGTTCCCCAGGATGGGACCTCGAATCCTCCTGCTGGGGGGGTGGGGGCAGCAGATGTTTCAGGACAGTCTGCCACGGATCAGATGGGTGAGCAAGAGATTCAGGATGGGCGTGATGGGTCACACCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCGAGGCAGGCTGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGATCAGCCTGGCCAACATAGTGAAACCTCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCACGCACCTGCAATTCCAGCTACTTGGGAGCCTGAGGCACAAGAATTGCTTAAGCCCAGGAGGCGGAGGTTGCCGTGAGCCGAGACTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACCCCATCTAAAAAAAAAAAATGCTTCAGAGATTCAGAGATCCACAGATGTGGAAGAGAGCTTCTATTTTGTCTCATGTACCACCTCACCCCTCAGTTTGGAGTTGGAGAAGCCGAGGCTTAGAGAGGTCAAGGGGCTGGCCAAGCTCCCACAGTGATAAAGCTAGTGCTAGGGCGACACCTGCCAGGCCCAATGTGACAAGATGCATCCTGAGTCCTGTGTGCCAAGCCTTGGCGGGGCAAAGTTGGGGCCCGGAGGACGGTAAGACACAGCAACTGCGAGTTCCCAGAGACAGATCCGGGTTCCAGCCCCAGCTCACCATGCACTGGGCGTGCCACCCAGGGAGTCAGCCCCACTGCAGCCCCCGCTGCGGGGCGTCCGGAGAACGCGCCATCTGCGGCGTGAGCGGCCGCCTCTCACCACCAGGGGGCGCGCTCCGCCTGGGCCCAGATTCCACCCCTTGACTGTCTCCCCCCAAAAATTTCCTTTCACTTTCGGTCTCTGGCTGTCACCCGGCTTGGCCCCTTCCACACCCAACTGGGGCAAGCCTGGTGCGTGAGGAGACTTGGACTCTAGGTCCCCAAGGGGCGGAGCCAGGGTCCCCACTCCTGGGGCAGGGGGAGCAGAGGGTGGGGGGCTGGGTTCCCGGGTCCCTAACCTGGGGAGGGTTCTGGGGACCAGACGTCGAGGTTCTTAGAAGTGGAGATGAAGAGTTTTCACCGTAACTGGGGCAGACGCAGGAAGCCTGGGGGAGGAAGGGGCGGAAACTCAGCCACATCAATGGGACGCGGGAGGGGCGGGGAGGCAAAGGGGCGGGCAGGGCAGGGGCTGGGGCATGAGGGTCCGAGACTTGTTCTTCTGTCCCTTCCAAGACCCGGCGACAGGAGGCATGAGGGGCCCCCGGCCGAAATGACAGTGCTGGCGCCAGCCTGGAGCCCAACAGTGCGTAAACCCCAGGGACAAGATCAGGGGAGAGGGGAGGCACAATGTCAGGATGGGGCAGAGATGAGGGGAGATGGACGGGAGAACAGATGGACAGATGACGAGGAAATAGGAGGGGAGATGGACAGATGTGAGGGGAGATGGATAGGAGAGGAGACGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGATGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATAGAGGAGAGGGAGATAGAGAGGAGTGGGAGATGGACAGGAGCGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGCAGATGAACAGAGGAGAGGGAGATAAAGAGGAGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGATGGACAGAGAAGGGGGAGATGGACAGAGGTGGGGGAGATGGACAGGAGGGAAGATGGAGAGGAGGGGGTATGGACAGAGGAGAGGGGAGATGGACAGGAGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAGATGAAGAGGAGGGGGAGGTGGACAGGAGGAGGGAGACGGACAGAGGAGAGGAAGAGAGACAGAGGAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGGGGGAGATGGACAGAAAAGGGGGGAGATGGACAGAGGAGAGGGAAGGTGGACAGAGCCAAGAACAAATGAAGAGGACGTGGACCAAGATCAAGAGAGAAGCAGGCAACAGTGGTGTAGAAGGCAGAGGGAGGGACAGAGCTGGAGGAACCCGGGCGAGGAAACCAGACGTGAAGATGAGGTGGTTGGAGAGAGACCAGCAGAGTGGGGGAGATGGGGAGAGAGAGGGGTGGGGCAGAGGGGGATGCAAACTGGACAGCATTGGACCAGAGGCAGAGAGAAACCGGGAAAGACAGGCAGAGATGGGGCCATGTCTCCAGAAAGTGTGGAAGAGGCAGAAGGACACCCAGGGAAGGAGGAGCGGGGAAGACAGAACAGTACAGGTGGGAAGCCCGGAGGAGGGGGCTGTGTGTGGAACAGCAGAGGGCTCCCCCAGCACCCGCTCCCCTGCAGACCTATCTCCTCCTGCTGCTGCTGCTGAGCTCGGGACTCAGTGGGACCCAGGACTGCTCCTTCCAACACAGCCCCATCTCCTCCGACTTCGCTGTCAAAATCCGTGAGCTGGTGAGCGGCGCTGCCCCGGACCCCCTCATGTGATCCCCCTTCCCCCCACTTTTTTTTTTAAGTAGAGATGGGGTCTCTCTCCCTGTGTTTCCCAGGGTGGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCTTAGGGGTGTCATCCCTTTTTAAGGGCAAGGTTCTGTGGCTTCTTCTGGGCTCCCCCTCTCTTGGTCTTGTCCCTCTCTCTCTGGATCTCTGCTGCCACCTCTGGGTCCCCACAGTTCTGTTTCTCGCTGTTTTCAGCCAGGCCTGATCCTGTTTTCTCCCGCAGTCTGACTACCTGCTTCAAGATTACCCAGTCACCGTGGCCTCCAACCTGCAGGACGTAAGTCATGTTGGGAGGGACCTGGGATGGAGGTGGGGACCACAGACTCAAGATGCTCCACCGAGGCGAGTGGATAACCAGGCCCTCCCCTCCCCAAACCCAGGAATCAGAGTCCTCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGCCCCGGCCCAGCCCCTCCTCCCTCAGACCCAGCAGCCCCGTGCCCAGCTCCTCCCTCAGACCCGTGGGTTCTCCCCTCTAGGAGGAGCTCTGCGGGGGCCTCTGGCGGCTGGTCCTGGCACAGCGCTGGATGGAGCGGCTCAAGACTGTCGCTGGGTCCAAGATGCAAGGCTTGCTGGAGCGCGTGAACACGGAGATACACTTTGTCACCAAATGTGCCTTTCAGGTCAGCCCTCAACTTAGGGGACAAGTGAGGGGAGGGAGATGCCTTCCTACGAATTAGAAGTAAAGCTCCACTAGGCCTTATTGGCGATTTGGACCATAGCCACCCAACGAAGGTAGAGCGAGAAGCGCCACCCTGCAGAGCCCTGTTCCTACAGAACAACACGTCCCCAGGCACCGGTGATGGGGAGCAGTCTGGTCCCATTCTGGGGCCCCGGTTTCCTAGGCCATGATGAAGGGTGCCACTGAGGGGTTCTTCCCCCAAAAAAAAACAGGGAGAGAAGGGGTCTCTAAACTGAGGAGGCCGGGCGTGGTGGCTCACTCCTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGATGAAATCCCGGCTGTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCTCAGGAGGCTGAGGCACAGGAATCGCTTGAACCCGGGAGCCAGAGGCTGCAGTGAGCCGAGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGGAGACAGAGTGAAACTGTCTCAAAAACAAAACAAACAAACAAAAACCTCTCTCTGAGGGCTGGGTGCAGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTCGGAGGCCAAGGTGGGAGGATTATTTGAGCCCAGGAGTTCAAGACCAGCCCGGGTAACACAGTGAAACCTCATCTCTGCACAAAAATAAAAATAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGCCCACCTGTGGTCCCAGCTACTCAGAAGGCTGAGGTGGGAGGATCACTTGAGCCCTGGAGGTCGAGGCTGCGATGAGCTATGATTGGGCCACTGCACTCCAGCTTGAGCGACAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAACATAGAATAGGCCGTGTATGGTGGCTCACGACTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATTGCCTGAGCTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTCGGCAACGTGATGAAAACCATCTCTACTAAAATACAAAAACAAAATTAGCCAGGCATGGTGGTGGGCACCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGACTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACACCACTGCCCTCCAGCCTGGGCGACAGAGCAAGACTCCATCTCCAAAAAAATAAAAATAAAATAAAAGCCTGGGTACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCGAGGCGGGCAGATCACGAGGTCAGGAGTTTGAGACCACCCTGGCCAATGTGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGCGCGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGAATTCCTTGAACCCGGGAGGTAGAAGTTGCAGTAAGCCGAGATCGTGCCACTGTACTCCAGCCAGGGTGACAGAGCAAGACTCTGTCCCCAAAAAATAAATAAATAATAAAGTAACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGAGTCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATAGAGAAACCCCGTTTCTACTAAAAAATATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAGGCTGGGCACGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCACACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACAAGGTCAGGAGATCAAGACCATCCTGGCTAACACAATGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAACAATTAGCCGGGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAGTCCCAACTACCTGGGAGGCTGAGGCAGGTGAATGGCGTGAAACCAGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCCGAGATTGCGCCACTGTACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCGAGACTCTGTCTTAAAAATAAATAAATAAATAAATATGGCCAAGCACGGTGGCTCATGCCTACAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGAGAAACCCCGTCTCTACTACAAATACAAAAAATAGCTGGGCATGGTGGTGGGCACCTATAGTCCCAACCACTGAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCATTTCACCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACTCTATCTCAAAAAAAAATTAATTAATTAAATAAATAAACTCTGAGAGCCAGAGCTCACTGGGCCCTGTTGCTGGGCATCGCCAGCAGGGAAGGGCCTTTGGCCTGCGGAGGGGCGGTGGGGGGATGACGTGGTGGTGACGTCTCCCTCCCCTGCTCCCAGCCCCCCCCCAGCTGTCTTCGCTTCGTCCAGACCAACATCTCCCGCCTCCTGCAGGAGACCTCCGAGCAGCTGGTGGCGCTGAAGCCCTGGATCACTCGCCAGAACTTCTCCCGGTGCCTGGAGCTGCAGTGTCAGCCCGGTAAAGGCTTCCAGGCACCCCCACTCCTTCCCCTCCTGTCCTCACGGCCGCTCCTCCTCTCTGCACAGTGCATCCCAGACCCCATCTTTCTCATATTGGTTGTGACAAGGGCAAGCTTATTCCTCTTTCTGGAGCTCAGTTTACCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCACTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTTGGCTCACTGCAAGCTCCGCCTCTCGGGTTCATGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACCACAGGCGCCCGCCACCACACCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTTACCGAGTTAAACCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTTGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACAGTGCCCAGCCTACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTCCCCCAGGCTGGAGTGCAGGGGTGCTATCTCGGCTCACTGCAAGCTCTGCCTCCTGGGTTCACGCCATTCTCTTGCCTCAGCCTCCCCAGCAGCTGGGACTACAGGCGCCTGCCACCTCACGCGGCTAATTTTTTTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGTGTTTCACCGTGTCAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGATGTGAGCCACCGCGCCCAGCCTATTGTTTTTTTTTTCTAAGTCGGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCAATCTTGGCTCACTGCAACCTCCATCTCCAGGGTTCAAGCGAATCTTCTGCCTCAGCCTTCCGAGTACCTGGGATTACAGATGCGCATACCATGCCTGGCTAGTTTTTGTGTTTTTAGTAGAGATGGGTTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCGCTCAGCCTATTCACTCATTTAATTTGTGACAGTCTGATGAGGTAGGTACAATGATTATCCTAGTTTTACAGATGAGCAAACTGAGGCACAGAGAGGCCAAGCAGCCCATCCAAGGTCACACAGCCAGTGGCAGCCAGGCCTCTCTTTCCTTCCTTACCCCAGCCCTTCTCCTTGGTCACCCAGCCTCCTCTTTCTCCCCAGACTCCTCAACCCTGCCACCCCCATGGAGTCCCCGGCCCCTGGAGGCCACAGCCCCGACAGCCCCGCAGCCCCCTCTGCTCCTCCTACTGCTGCTGCCCGTGGGCCTCCTGCTGCTGGCCGCTGCCTGGTGCCTGCACTGGCAGAGGACGCGGCGGAGGACACCCCGCCCTGGGGAGCAGGTGAGCAGGCTGGGAAGAGGGGGTGAGGGGGCCGAGAGGGTGGCCCACTTGTGGCTGACACTTTGGGGCCCACAGGTGCCCCCCGTCCCCAGTCCCCAGGACCTGCTGCTTGTGGAGCACTGACCTGGCCAAGGCCTCATCCTGGTGAGTCCTTCCTGGGCTATGGGGCCTGGACTTTGTGTCTGCAGGTTGGGAGGGTCACTAGGAGGCCATGGAAGGGTGGTGAGCAGTGGAGGGGCAGGGGCAGCTCTAGGTGCAGAAAGACCCCTCTGGGGCCAGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGCAAACCCCAGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAACTGGGCATAGTGGTGTGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGAAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATTGCGCCACTGGACTCCAGCCTGAGTGACAGAGCTAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGGAAAGACCCCTCTGGGGCCACGGAGACAGACTGGAGACCAAGCCGGAGGCTGTGGGAAGGCCCAGGGTGAGGACCATGACTGAGCCAGGGCTGGGACCATGGGATGGAGTGGAGTGGATGGGCAGAGAGTCAGGGGTCAGAGATCAGGAGGGACCGGCCTGGGGCCTGACAGGCTTGAGTTGGCACAGATAGCCCTGGTCCAGTGATGGGGTGGACAGGGGGGAACCTGGGGGAGGAGTCAGATTAGGGAAAGACATGGAGCTCACTGGGGACCTGAAGGAGCAAGGGGCCCTGGGGAGATCTGTGGATGTGGGAGTTTGCAAGCCTCCTGGGACAGGAAGGAAATGGCATTCCAGAAAGAGGGAACTGCCTTTGGAAGCCCTTTGGTATGAGAAAGCTCAGGGTGTTCCAGTAACTTGGGCCAGCGTGGGGCAGCAAGGAGCCATGGGAGGTGTGAGAGGGAGGAAAGGAGCTGGGAACAGGTGTGGAGGGTGCAGGCAGGTAGGCAGGTGGGCCAGGAGGGAAGAAGGAGGGGAGGCCCCAGCGGGTCCCCTAACATTTCAAATCTAACATTTTGTAGTAATTGCTCGCACATATAGTGCCTTGGTAATGCAGGCCTCATGTGGGGCTGGCTTGCTTGCTTTATTTTTTTTTGAGATGGACTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGGGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCGCCCGCCACCATGCCTGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCGCCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGATCTCAGCTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATGACAGGTGTGAGCCACTGTTCCTGGCCCATGCTGGGCTTTCCACAAATGAACTCACTTCCTTGAGAAGTTCGTGCCATTATGATCCCAAGGCATAGAGAGGTAAATAATTTGCCAAAAGTCACACAGCTCAAGGGTGACAACCAAGATTTGACTTCAGGTTGTCTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGTAGTGCAGTGGCATGATCTCGGCTCACTGCAGCCCCCGCCTCCCAGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTGGGATTACAGGTACCCACCACCACACTCGGCTAATTTTTGTATTTGTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTTAGCTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCACGCCCGGCCTCGAGTTTGTCTTGATCCAGCATCTGTGCCCTTCACTCTGCTGCCTCAGTTTCCTGATCTGTACAAAAGGCTCTAATAATAGTCCTTCCACCATAGGGTTGTTATGGGGTGAAGTGAAGTGACACAGGCAAGGCTCTTAGAGCAACGCAGTGGAAACGGCATGTGAGCCACCTGTGCGATTTTCACTTTCCTGGTAGCCACATTTTTTTTTTTTTTTTCCTGAGATGGAGTCTCACTCTGTCGCCAGGTTGAAGTGCAGTGGTGTGATCTCAGCTCACTGCAACCTCCACCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCTTCAGTCTACCGAGTAGCTGGGATTACAGGCACGCGCCATCACGCCCGGCTAATTTTTTGTGTTTTTAGTAGAGACAAGGTTTCACCATGTTGGTCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCATGATCCACCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCGGGGTCACAGTTTTTAAAAAAGGAAAAAGAAGCAGGTAACTTTATTTTATGCAGTATATCCAAAATGTTGTTATTTCAACATGTAATCAGTATTTCTCAATGATTAATGAGACATTAATCAGTTGGAATCATTCATCATTTTGGGATATTTTACATTCTTTTGTCATACTAAGCCTTCAGCATCCAACGTATAGTTTATTTATTTATTTATTTTTCCTTTTGAGATGGATTCTCGCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTCAGCTCACTGCAACCTCGGACTCCCTGGTTCAGGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTACCTGGGATTACGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTACTTTTAGTAGAGACCGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGATGATCTCCATCCCCTGACCTCGTGATCCGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGATTACAAGTGTAAGCCACCGCGCCCAGCCCAGACAATAAATTTTTATC
AGAAATGCTTCATCTATATTTAAATTTCATGAAATTTACAGTTGCCAAAAGTAGACTCACATAGTCAAGTTGTTCAAAACATACATTAAACCAGCCTGGGCCACATGGTGAAACCCCATCTCTACAAAAAATTTTAAAAAGTAGCTGGGTGTGGTGGCACATGCCTGCAGTCCCAGCTACTTAGGAGGCAAAGTAGGAGGATTGCTTGAGCCCAGGAGGTCGAGGCTGCAGTGAGCCCTGATTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGAGAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAAACAAAAAAACCACACAGAAGAGTTTAGAATCCCAGTTGCTATCTCTGGGAATCATCATGATTGCTAAGACCGGTATCTATCCAACAACAACAAAAATAATTAGTGCACTCCAGCCTGGGCAATAGAGGGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATCAAAGACCAGTATCTAAATTGCTCTGTCGCCCAGGGTGGAGTGCAGTGGCACGATCTCGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCTTGGACTACAGGCGCGTGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGGTAGGGTTTCACTATGTTTGCCAGGATTGTCTCGATCTCTTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTATAGGCGTGAGCCACCACGCCCAGCCTATCTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAAAGGTAATACATTGAGCAGTTTTCCTCCCAACCTAGTCCCTGTCCAATCTGTTTCCTGTCTTAAATTTATTTTTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAGACTTTTGCTCTTGTTAGCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCTATCTTGACTCACGGCAACCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCTGGAGTAGCTTGGATTACAAGCGCCTGCCACCACGCCCAACTAATTTAGTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCTTTTGTTGTTGTTGTTGTTTTTGAGACGGAGTCTCACTCTATTGCCCAGGCTGGAGTGCAACGGCACGATCTCGGCTCACTGCAACATCTGCCTCCCGGGTTCAAGCGATTCTACTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGCACACACCACCACACCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGATCTCGAACTCCTGACCTCGTGATCTGCCCGCCTTGACCTCCCAAAGTGATAGGATTACAGCCATGAGCCGCCCTGCCCAACTAATACCTGATATTAATTTTATTGTATCTCACCCAGCATGGTGGCTCACACCTGTAACTCCTTGGCAGATCGCTTGAGCCTAAGAGTTCAAGACCAGCTTGGGCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATATAAAAATGAGCTGGGCATGGTGGCGTGCACCCGTAATCCCAGCTAACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAAGAATGGCTTGAACCCGGGAGGCAGAGGCTGCAGTGAGCTGAGATCATGCCACTGCATTCCAGCCTGAAACAGAGCAAGACTGTCTCAAAAGAAGTTTAAGTCCAGCCTCAAACTCCTGGACTCAAGTGATCCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGTGCACCGGCCCCATCTCAAGTGTTCAGTATTCACATGTGGCTTGTTACTCCCGTATTAAAGAGCAAAAATAGAGAACGTTTCTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGGAGTTTCGCTCTTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGACATGCACCACCATGCCTAGCAAATTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTCTTTTGAGACAGACTTTTGCTTTTATTGCCAAGGCTGGAGTGCAATGGTGCAATCTCGACTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCTAATTTTGTAGTTTTAGTAGAAACGGTTTCTCCATGTTAGCTAGGCTGGTCTCAAACTCCCAACCTCAGGTGATCCGCCCGCCTCGACCTCCTAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACTGTGCCTGGCCCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCTCCCTGTTGGTCAGGCTGGTCTCAAACTCCCAACCTAAGGTGATCCACCAGCCTCAGCCTCCCAAACTGCTGGGATTATAGGCATGAGCCACCGCGCCCGGGGAAATATAGGGAACATTTCTATCATGGCCACGTTCTCTTGGACAGCAATGCCCTAGCACATAGTAAGCGCTTGCTGGGAATGGAGTTGTTTTGGGCATAAATCTGTGGCCCGCCCCAAGCTAAGCTACTTTCCCTCTCCTCTCTCAGCGGAGCCTTAAACAACGCAGTGAGACAGACATCTATCATCCCATTTTACAGGGGAGGATACTGAGGCACACAGAGGGGAGTCACCAGCCAGAGGATGCATAGCCTGGACACAGAGGAAGTTGGCTAGAGGCCGGTCCCTTCCTTGGGCCCCTCTCATTCCCTCCCCAGAATGGAGGCAACGCCAGAATCCAGCACCGGCCCCATTTACCCAACTCTGTACAAAGCCCTTGTCCCCATGAAATTGTATATAAATCATCCTTTTCTACCAGCTCTGGCCAGGTCTGTCTATGGATGGGTGTGAATGGGGTAGTTTTGATTTCAGAATCTTGGTTTTTGAATTGCAATGCAATGTTTCATTCAATACGTGTTTTCTGAGGTCCCCTGGAGCCCCGGGCCGGCGCTGGGCAATGTCAGAGCCTGGATTTGAGTCAGAACCAGCCCAGGTGCCCCAGGTCTCCTTGGCTATGGACGAGAAGACAAGGGATTCAGCGAGCCTGGGTGCAGGATGCCATAGGCTACTATGGAGATAAAACAGAGGCAGTGTGAGGGGCAACTCACCCAGGCAGGGAGAGCAGAGAGGCTTTCCAGAGCCAAATGGCATTGCGATGGTGACAAGCCAGATTTGGAGGGGGTGGGGAGGGCATCCTGGGCAAGGGACCCAGCTGAAGCAAAGGCCGACAGTCCAGAAAGTGAGAAGTTCCTCTGAGGAACGCTCAGTGGATTGGTGCAGCCAGGCAACTAGAAGCCATTCCTTGATCCACTCTTAGAGCCCCTGGGGAAGACCACCTCCATCTGTTTTACAGATGGATAAACTGAGGCCCAGATAAGGCCAAGGGTTTCTCCAGGTCACAGTGAAGTCGACCAGACACAGGAATCCAAATCTCTAAGCCTAGAATGGGCAAGGCTCCGGGGCTCACGCCGGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAACGGGAGGATCGCTTGAGCCCAGGAGTTCGAGATCAGCCTGGCCAACATGTCAGACTCCCCCCGTTCCCGGGCCACAACAAAATATATATATATATATATATTAGCCAGGCATGGTGGCGCGCCCCTGTAGTCCAAGTTACTCGAGAGGCTGAGGCAGGAG（配列番号７）
参考文献
1. P. Tsapogas, C. J. Mooney, G. Brown, A. Rolink, The Cytokine Flt3－Ligand in Normal and Malignant Hematopoiesis. International journal of molecular sciences 18, (2017).
2. C. J. Mooney, A. Cunningham, P. Tsapogas, K. M. Toellner, G. Brown, Selective Expression of Flt3 within the Mouse Hematopoietic Stem Cell Compartment. International journal of molecular sciences 18, (2017).
3. L. D. Shultz, M. A. Brehm, J. V. Garcia－Martinez, D. L. Greiner, Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nat Rev Immunol 12, 786－798 (2012).
4. K. Palucka, J. Banchereau, Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature reviews. Cancer 12, 265－277 (2012).
5. J. S. Do, B. Min, IL－15 produced and trans－presented by DCs underlies homeostatic competition between CD8 and {gamma}{delta} T cells in vivo. Blood 113, 6361－6371 (2009).
6. J. C. Oliveros et al., Breaking－Cas－interactive design of guide RNAs for CRISPR－Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic acids research 44, W267－271 (2016).
7. P. D. Hsu et al., DNA targeting specificity of RNA－guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827－－832 (2013).
8. Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung, Improving CRISPR－Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature biotechnology 32, 279－284 (2014).
9. B. E. Low, P. M. Kutny, M. V. Wiles, Simple, Efficient CRISPR－Cas9－Mediated Gene Editing in Mice: Strategies and Methods. Methods Mol Biol 1438, 19－53 (2016).
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2. C. J. Mooney, A. Cunningham, P. Tsapogas, K. M. Toellner, G. Brown, Selective Expression of Flt3 within the Mouse Hematopoietic Stem Cell Compartment. International journal of molecular sciences 18, (2017).
3. L. D. Shultz, M. A. Brehm, J. V. Garcia－Martinez, D. L. Greiner, Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nat Rev Immunol 12, 786－798 (2012).
4. K. Palucka, J. Banchereau, Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature reviews. Cancer 12, 265－277 (2012).
5. J. S. Do, B. Min, IL－15 produced and trans－presented by DCs underlies homeostatic competition between CD8 and {gamma}{delta} T cells in vivo. Blood 113, 6361－6371 (2009).
6. J. C. Oliveros et al., Breaking－Cas－interactive design of guide RNAs for CRISPR－Cas experiments for ENSEMBL genomes. Nucleic acids research 44, W267－271 (2016).
7. P. D. Hsu et al., DNA targeting specificity of RNA－guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology 31, 827－－832 (2013).
8. Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung, Improving CRISPR－Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature biotechnology 32, 279－284 (2014).
9. B. E. Low, P. M. Kutny, M. V. Wiles, Simple, Efficient CRISPR－Cas9－Mediated Gene Editing in Mice: Strategies and Methods. Methods Mol Biol 1438, 19－53 (2016).
本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、主題に関して参考として援用され、上記主題に関して各々が引用され、上記主題は、いつかの場合に、文書の全体を包含し得る。
不定冠詞「ａ（ある、１つの）」および「ａｎ（ある、１つの）」は、本明細書および請求項において使用される場合、明らかにそうでないと示されなければ、「少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味すると理解されるべきである。
明らかにそうでないと示されなければ、本明細書で特許請求される１を超える工程または行為を含む任意の方法において、その方法の工程または行為の順序が、その方法の工程または行為の順序が記載される順序に必ずしも限定されないことはまた、理解されるべきである
請求項において、および上記の明細書において、全ての移行句（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「行う、有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関わる、伴う、要する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」など）は、開放系の制限がない、すなわち、が挙げられるが、これらに限定されない、を意味すると理解されるべきである。移行句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のみが、米国特許商標庁特許審査基準、第２１１１．０３節に示されるように、それぞれ、閉鎖系または半閉鎖系の移行句であるものとする。
数値の前にある用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、その記載される数値の±１０％を意味する。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上端と下端との間の各値は、本明細書中で具体的に企図され、記載されている。
Claims (55)
- ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ）マウスであって、前記マウスは、
ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸、および
不活性化マウスＦｌｔ３アレル、
を含むマウス。 - 前記マウスは、前記マウスＦｌｔ３アレルを不活性化するゲノム改変を含む、請求項１に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、コード領域、非コード領域、および調節領域から選択される前記マウスＦｌｔ３アレルのうちの少なくとも１つの領域にある、請求項２に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、前記マウスＦｌｔ３アレルのうちの少なくとも１個のコード領域にある、請求項３に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、エキソン６、エキソン７、および／またはエキソン８にある、請求項４に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、ゲノム欠失、ゲノム挿入、ゲノム置換、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項２～５のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記ゲノム改変は、ゲノム欠失である、請求項６に記載のマウス。
- 前記マウスＦｌｔ３アレルは、エキソン６、エキソン７、およびエキソン８におけるヌクレオチド配列のゲノム欠失を含む、請求項７に記載のマウス。
- 配列番号５の核酸配列は、前記マウスＦｌｔ３アレルから欠失されている、請求項８に記載のマウス。
- 前記改変されたマウスＦｌｔ３アレルは、配列番号６の核酸配列を含む、請求項９に記載のマウス。
- ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする前記核酸は、ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子は、配列番号７の核酸配列を含む、請求項１１に記載のマウス。
- 前記マウスは、ヒトＦＬＴ３Ｌを発現する、請求項１～１２のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記ヒトＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される、請求項１３に記載のマウス。
- 前記ヒトＦＬＴ３Ｌは、１０，０００ｐｇ／ｍｌ～３０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される、請求項１４に記載のマウス。
- 前記ヒトＦＬＴ３Ｌは、１５，０００±１０００ｐｇ／ｍＬ～１７，０００±１００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される、請求項１４または１５に記載のマウス。
- 前記マウスは、マウスＦＬＴ３Ｌを発現する、請求項１～１６のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスＦＬＴ３Ｌは、少なくとも２，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される、請求項１７に記載のマウス。
- 前記マウスＦＬＴ３Ｌは、５，０００ｐｇ／ｍｌ～１０，０００ｐｇ／ｍｌのレベルで発現される、請求項１８に記載のマウス。
- 前記マウスＦＬＴ３Ｌは、６，０００ｐｇ／ｍｌ～８，０００ｍｌのレベルで発現される、請求項１８に記載のマウス。
- 前記マウスは、検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３を発現しない、請求項１～２０のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスによって発現される検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３は、１，０００ｐｇ／ｍｌ未満である、請求項１～２１のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスは、検出可能な数のＣＤ１３５＋ 複能性前駆細胞を欠いている、請求項１～２２のいずれか１項に記載のマウス。
- ヒトＣＤ３４＋ 造血幹細胞をさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記ヒトＣＤ３４＋ 造血幹細胞は、ヒト臍帯血、骨髄、または動員された末梢血に由来する、請求項２４に記載のマウス。
- 前記マウスは、ヒトＣＤ４５＋ 細胞の集団を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載のマウス。
- ヒトＣＤ４５＋ 細胞の前記集団は、ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞および／またはヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ 骨髄系細胞を含む、請求項２６に記載のマウス。
- ヒトＣＤ４５＋ 細胞の前記集団は、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞を含む、請求項２７に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ Ｔ細胞の前記パーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加する、請求項２８に記載のマウス。
- ヒトＣＤ４５＋ 細胞の前記集団は、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ 骨髄系細胞を含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋ 骨髄系細胞の前記パーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加する、請求項３０に記載のマウス。
- 前記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトＣＤ１２３＋ 形質細胞様樹状細胞の前記パーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加する、請求項３２に記載のマウス。
- 前記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトＣＤ５６＋ ナチュラルキラー細胞の前記パーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加する、請求項３４に記載のマウス。
- 前記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージを含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトＣＤ１４＋ 単球マクロファージの前記パーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加する、請求項３６に記載のマウス。
- 前記マウスは、ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマコントロールマウスまたはＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ－Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌコントロールマウスに対して、増加したパーセンテージのヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載のマウス。
- 前記マウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ＋ ＨＬＡ－ＤＲ＋ 骨髄系樹状細胞の前記パーセンテージは、少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％増加する、請求項３８に記載のマウス。
- 前記マウスは、前記マウスの小腸においてヒトＣＤ４５＋ 細胞の粘膜生着を示す、請求項１～３９のいずれか１項に記載のマウス。
- 請求項１～２３のいずれか１項に記載のマウスを致死量未満で照射する工程および前記マウスにヒトＣＤ３４＋ 造血幹細胞を注射する工程を包含する、方法。
- 前記マウスに、目的の薬剤を投与する工程をさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
- 前記マウスにおいてヒト免疫細胞に対する前記薬剤の効果を評価する工程をさらに包含する、請求項４２に記載の方法。
- 前記ヒト免疫細胞は、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージから選択される、請求項４３に記載の方法。
- ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ）マウスの前核にヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸を注入する工程、ＮＳＧ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスを生成する工程、および前記ＮＳＧ Ｔｇ（Ｈｕ－ＦＬＴ３Ｌ）マウスにおいてマウスＦｌｔ３アレルを不活性化する工程を包含する、方法。
- ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ）マウスにおいてマウスＦｌｔ３アレルを不活性化して、ＮＳＧ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ マウスを生成する工程、および前記ＮＳＧ Ｆｌｔ３ｎｕｌｌ マウスの前核にヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸を注入する工程を包含する、方法。
- ヒトＦＬＴ３Ｌをコードする核酸および不活性化内因性Ｆｌｔ３アレルを含む、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ細胞。
- 請求項４７に記載の細胞を含むトランスジェニック齧歯類であって、必要に応じて、ここで前記トランスジェニック齧歯類は、トランスジェニックマウスである、トランスジェニック齧歯類。
- Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄに関してホモ接合性、Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌに関してホモ接合性、Ｆｌｔ３ｎｕｌｌに関してホモ接合性、およびヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子に関してホモ接合性の雌性マウスと、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄに関してホモ接合性、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌに関してヘミ接合性、Ｆｌｔ３ｎｕｌｌに関してホモ接合性、およびヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子に関してホモ接合性の雄性マウスとを交配して、子孫マウスを生成する工程を包含する、方法。
- マウスＦｌｔ３を標的とするｇＲＮＡであって、必要に応じて、ここで前記ｇＲＮＡは、エキソン６またはエキソン８またはマウスＦｌｔ３を標的とする、ｇＲＮＡ。
- 前記ｇＲＮＡは、配列番号１または配列番号２の配列を含む、請求項５０に記載のｇＲＮＡ。
- 請求項５０または５１に記載のｇＲＮＡを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで前記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞。
- マウスＦｌｔ３のエキソン６を標的とする第１のｇＲＮＡおよびマウスＦｌｔ３のエキソン８を標的とする第２のｇＲＮＡを含むマウス卵母細胞であって、必要に応じて、ここで前記マウス卵母細胞は受精している、マウス卵母細胞。
- Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をさらに含む、請求項５２または５３に記載のマウス卵母細胞。
- ヒトＦＬＴ３Ｌ導入遺伝子をさらに含む、請求項５２～５４のいずれか１項に記載のマウス卵母細胞。
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