JP2022519711A - ステロイドの１，２－脱水素のための微生物の生物工学的最適化 - Google Patents
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Abstract
本発明は、遺伝子改変された細菌、及び特にステロイド類の１，２－脱水素におけるその工業的応用に関する。
Description
本発明は、遺伝子改変された細菌、及び特にステロイドの１，２－脱水素におけるその工業的利用に関する。
ステロイド類の１，２－脱水素（Δ１－脱水素とも呼ばれる）は、適切な酵素系を有する細菌を用いた生体内変換により行われ得る。例えばこの変換は、ノカルジオイド科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ）の微生物により触媒され得、これは細菌懸濁液として又は細菌懸濁液の細胞溶解後の上清として製造され使用される。残念ながら、微生物は、ステロイド分子上の第二の（望まれない）反応を触媒する酵素も発現し、この反応は２０位のケト基の還元であり、本明細書では「２０－ＯＨ不純物」と呼ばれる副生成物の生成をもたらす。これら２つの反応は本明細書以後においてヒドロコルチゾンの例を用いて図式化される。
ステロイド類において２０位でケト還元をもたらす酵素２０β－ＨＳＤＨ （２０－ベータ－ヒドロキシステロイド脱水素酵素）は、この副反応の原因であると同定された。
本発明者らは、副反応活性の原因である遺伝子を同定し、そしてこの活性を持たない微生物を遺伝子操作した。ステロイド変換において使用される場合、これはもはや望まない副生成物を生成せず、そして上記の本発明に従う遺伝子操作された微生物を、いずれの潜在的な成熟工程もなくステロイド変換において直接使用することができる。不要な副生成物を除去するための生成物の精製のためのさらなる工程も省略することができる。生体内変換の生成物は、製造後にそのまま使用することができる。結論として、これはより高い生成物収率、より高い生成物品質、及びより単純な製造プロセスをもたらす。
発明の説明
したがって本発明の第一の態様は、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の発現が、対応する未改変の細菌と比較して減少しているか又は抑制されている遺伝子改変細菌に関し、ここで対応する未改変の細菌は、Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有する。
したがって本発明の第一の態様は、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の発現が、対応する未改変の細菌と比較して減少しているか又は抑制されている遺伝子改変細菌に関し、ここで対応する未改変の細菌は、Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有する。
本明細書で使用されるように、用語「対応する未改変の細菌」は、その後に遺伝子改変を受ける未改変の細菌と同じ細菌株を示す。
用語「細菌」は原核微生物を意味する。未改変の細菌は、２０β－ＨＳＤＨ活性及びΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有する。一実施形態において、細菌は、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、エアロモナス目（Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、パスツレラ目（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、バシラス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、ラクトバシラス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）、ビフィドバクテリウム目（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）及びコリオバクテリウム目（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）の中から選択される目由来である。１つの好ましい実施形態において、細菌は放線菌目由来である。例えば、細菌は、ノカルジオイデス シンプレックス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）のようなノカルジオイド科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）のようなストレプロマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）又はマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）及び特にマイコバクテリウム・アビウム亜種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．）パラ結核症（ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＭＡＰ４のようなマイコバクテリア科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）であってよい。特定の実施形態において、細菌はノカルジオイド科、好ましくはノカルジオイド属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）由来であり、そして最も好ましくは細菌はノカルジオイデス・シンプレックスである。
用語「ノカルジオイド科由来の細菌」は、２０β－ＨＳＤＨ活性及びΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有するこの科由来の任意の細菌を意味し、例えば、アクチノポリモルファ（Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）属、アエロミクロビウム（Ａｅｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、フリンデルシエラ（Ｆｌｉｎｄｅｒｓｉｅｌｌａ）属、フリードマンニエラ（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ）属、クリブベラ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ）属、マルモリコラ（Ｍａｒｍｏｒｉｃｏｌａ）属、ミクロプルイナ（Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ）属、ムミア（Ｍｕｍｉａ）属、ノカルジオイド属、ピメロバクテル（Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ）属、プロピオニシセラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ）、プロピオニシモナス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ）属、テンッゲリミセス（Ｔｅｎｇｇｅｒｉｍｙｃｅｓ）属又はテルマスポロミセス（Ｔｈｅｒｍａｓｐｏｒｏｍｙｃｅｓ）由来の細菌である。好ましくは、ノカルジオイド科由来の細菌はノカルジオイデス・シンプレックス（以前はアルスロバクター・シンプレックス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ）又はコリネバクテリウム・シンプレックス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｍｐｌｅｘ）又はピメロバクター・シンプレックス（Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ）と呼ばれた）である。好ましくは、細菌はノカルジオイデス・シンプレックスＡＴＣＣ６９４６である。他の好ましい細菌としては、フリードマンニエラ・フラバ（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ ｆｌａｖａ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１０３６１８１）、フリードマンニエラ・サガミハレンシス（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ ｓａｇａｍｉｈａｒｅｎｓｉｓ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：５４６８７４）、ノカルジオイデス ドクドネンシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｄｏｋｄｏｎｅｎｓｉｓ）ＦＲ１４３６（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１３００３４７）、ノカルジオイデス・リアンケンゲンシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｌｉａｎｃｈｅｎｇｅｎｓｉｓ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１０４５７７４）、ノカルジオイデス プシクロトレランス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１００５９４５）、ノカルジオイデス・スゼクワネンシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｚｅｃｈｗａｎｅｎｓｉｓ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１００５９４４）、コリネバクテリウム コイルエア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｙｌｅａｅ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：５３３７４）、コリネバクテリウム・グリシニフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｙｃｉｎｉｐｈｉｌｕｍ）ＡＪ ３１７０ （Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１４０４２４５）、コリネバクテリウム・クロッペンステドチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ）ＤＳＭ ４４３８５（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：６４５１２７）、コリネバクテリウム・ロウィイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｗｉｉ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１５４４４１３）、コリネバクテリウム・スフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１８５７６１）、コリネバクテリウム・ビタエルミニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔａｅｒｕｍｉｎｉｓ）ＤＳＭ ２０２９４（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１２２４１６４）、アエロミクロビウム マリヌム（Ａｅｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）ＤＳＭ １５２７２（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：５８５５３１）、ノカルジオイデス ルトイス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｌｕｔｅｕｓ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１８４４）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＹＩＭ ７００９３ ＝ ＤＳＭ ４４６８３（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１１２１３６２）、コリネバクテリウム マリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｓ）ＤＳＭ ４５１９０（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１２２４１６３）、コリネバクテリウム・リエゲリイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｉｅｇｅｌｉｉ）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ ＩＤ：１５６９７６）が挙げられる。
用語「遺伝子」は、１つ又はそれ以上のタンパク質又は酵素の全て又は一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードするか又はそれらに対応するＤＮＡ配列を意味し、そしてこれは例えば遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列のような制御ＤＮＡ配列を含んでいても含んでいなくてもよい。特に、用語遺伝子は、タンパク質をコードするゲノム配列、すなわち、制御因子、プロモーター、イントロン及びエクソン配列を含む配列を意図され得る。
本明細書で使用されるように、用語「２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子」は、任意の細菌の２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子に相当する。好ましくは、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子は、配列番号１の配列と少なくとも６０％の同一性を有し、より好ましくは、配列番号１の配列と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％より高い、そして最も好ましくは９９％より高い同一性を有する。一実施形態によれば、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子は、配列番号３の配列と少なくとも６０％の同一性を有し、より好ましくは、配列番号３の配列と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％より高い、そして最も好ましくは９９％より高い同一性を有する。
「参照配列と少なくともｘ％の同一性を有する遺伝子」により、その核酸配列が、その全長にわたって参照配列の各１００ヌクレオチドあたり１００－ｘ個までのヌクレオチドの変更により参照配列と異なるということが意図される。換言すると、参照配列と少なくともｘ％の配列同一性を有する核酸を得るために、対象配列におけるヌクレオチドの１００－ｘ％までが、別のアミノ酸又はヌクレオチドを挿入、欠失されるか又は置換されていてもよい。
参照配列と「少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である」核酸配列は、参照配列と比較して、欠失、挿入及び／又は置換のような変異を含み得る。置換の場合、置換は好ましくは、サイレント置換であるか、又は翻訳されたアミノ酸配列において保存的置換をもたらす置換に対応する。
２つ又はそれ以上の配列の同一性を比較するための方法は、科学コミュニティにおいて周知である。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１において利用可能なプログラム、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰは、２つの配列間の同一性パーセンテージを決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの「ローカルホモロジー」アルゴリズムを使用し、そして２つの配列間の類似性の最良の単一領域を見出す。配列間の同一性を決定するための他のプログラムも当該分野において公知であり、例えば、Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３において記載されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムに基づくものであり、例えば以下のパラメーターをポリヌクレオチド配列比較に用いる：比較マトリックス：ＤＮＡＦＵＬＬ；ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、末端ギャップペナルティ：偽、末端ギャップオープンペナルティ＝１０、末端ギャップ伸長ペナルティ＝０．５。
用語「遺伝子改変された」は、遺伝子材料、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは任意のプロセス、機序における任意の検出可能な変化、又はこのような変化の結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が変更される遺伝子変異、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子又はＤＮＡ、及び改変された遺伝子又はＤＮＡ配列により発現される任意の発現産物（例えば、タンパク質又は酵素）が含まれる。一般に、変異は対象において、対照集団における対応する核酸又はポリペプチドと、該対象により発現される核酸又はポリペプチドの配列とを比較することにより同定される。
用語「２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の発現が減少しているか又は抑制されている」は、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子によりコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及び／又はタンパク質の発現レベルの減少又は抑制を意味する。２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の発現は、未改変細菌と比較して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％だけ減少され得る。好ましくは、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の発現は１００％減少され、したがって発現の抑制に相当する。
遺伝子又は核酸の発現レベルは、当業者に周知の方法により測定することができ、これらとしては、特に直接ハイブリダイゼーションベースのアッセイ及び増幅ベースのアッセイが挙げられる。
２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の発現は、この遺伝子の不活化又は欠失により、未改変の細菌と比較して減少又は抑制され得る。特定の実施形態において、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子は変異し、そして好ましくはトランケートされている。
好ましくは、遺伝子改変された細菌はいずれの外来ＤＮＡも含まない。
遺伝子の不活化、欠失又はトランケーションのための実験室手法は当該分野で周知である。
本明細書において意図されるように、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子が変異しかつ、又はトランケートされている場合、これは完全に機能性の２０β－ＨＳＤＨタンパク質をコードしないかもしれないが、同じ条件で測定して対応する天然２０β－ＨＳＤＨタンパク質の活性より低い活性を有する２０β－ＨＳＤＨをコードし、特にコードされた２０β－ＨＳＤＨタンパク質は活性を有していないかもしれない。
本発明に従う遺伝子改変された細菌は、好ましくはΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有するが、未改変細菌と比較して減少した２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有するか又は２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有していない。
したがって、本出願において容易に明らかとなるように、本発明は、遺伝子改変された細菌に関し、ここで：
－ 対応する未改変細菌は、Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有し、
－ 少なくとも１つの遺伝子改変は、２０－ベータ－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（２０β－ＨＳＤＨ）をコードする遺伝子の減少された又は抑制された発現を誘導し、そして
－ 好ましくは、上記遺伝子改変された細菌は、そのΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を維持する。
－ 対応する未改変細菌は、Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有し、
－ 少なくとも１つの遺伝子改変は、２０－ベータ－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（２０β－ＨＳＤＨ）をコードする遺伝子の減少された又は抑制された発現を誘導し、そして
－ 好ましくは、上記遺伝子改変された細菌は、そのΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を維持する。
好ましくは、本発明に従う遺伝子改変された細菌はΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有するが、遺伝子改変に起因して、未改変の細菌と比較して減少した２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有するか、又は２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有していない。
本発明の第二の局面は、本発明に従う遺伝子改変された細菌の製造方法に関し、該方法は：
ａ） Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有する細菌を供給すること；並びに
ｂ） ２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子を不活化するか又は欠失させること
を含む。
ａ） Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有する細菌を供給すること；並びに
ｂ） ２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子を不活化するか又は欠失させること
を含む。
本発明に従う遺伝子改変された細菌の製造方法の工程ｂは、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の変異、トランケーション又は欠失で構成され得る。変異又はトランケーションは、当業者に公知の任意の方法により、そして好ましくは２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子のダブルクロスオーバーにより実現され得る。
好ましくは、得られた遺伝子改変された細菌はいずれの外来ＤＮＡも含まない。
別の局面において、本発明は、
ａ） １，２－脱水素されていないステロイドを供給すること；
ｂ） １，２－脱水素されていない該ステロイドを、本発明に従う細菌又はその抽出物と、１，２－脱水素されたステロイドを得るために十分な条件下で接触させること
を含む、１，２－脱水素されたステロイドの製造方法に関する。
ａ） １，２－脱水素されていないステロイドを供給すること；
ｂ） １，２－脱水素されていない該ステロイドを、本発明に従う細菌又はその抽出物と、１，２－脱水素されたステロイドを得るために十分な条件下で接触させること
を含む、１，２－脱水素されたステロイドの製造方法に関する。
好ましくは、本発明に従う１，２－脱水素されたステロイドの製造方法において使用される１，２－脱水素されていないステロイドは副腎皮質ステロイドである。
特定の実施形態において、該方法において使用される１，２－脱水素されていないステロイドは、プロゲステロン、テストステロン、アンドロステンジオンまたはこれらの分子の誘導体であり、これらは１，２位の間で脱水素されていない６個の炭素原子の環Ａを含有するステロイド骨格を含有する。
特定の実施形態において、１，２－脱水素されていないステロイドは：
－ １１ベータ １７，２１－トリヒドロキシプレグナ－４－エン－３，２０－ジオン （ヒドロコルチゾン）であり、そして上記方法は、１１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （プレドニゾロン）の製造のためのものである；又は
－ １７アルファ，２１－ジヒドロキシ－４－プレグネン－３，１１，２０－トリオン （コルチゾン）であり、そして上記方法は、１７アルファ，２１－ジヒドロキシ－１，４プレグナジエン－３，１１，２０－トリオン （プレドニゾン）の製造のためのものである；又は
－ プレグナ－４－エン－３，２０－ジオンであり、そして上記方法はプレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオンの製造のためのものである；又は
－ １１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－メチル－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （６－メチルプレドニゾロン）の製造のための、１１ベータ，１７，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－１，４－プレグネン－３，２０－ジオン （６－メチル－ヒドロコルチゾン）である；又は
－ ９，１１－デヒドロコルテキソロンであり、そして上記方法は１，２－９，１１－デヒドロコルゲキソロンの製造のためのものである；又は
－ ９，１１ デヒドロコルテキソロン－１７，２１－ジアセテートであり、そして上記方法は１，２－９，１１ デヒドロコルテキソロンの製造のためのものである；又は
－ ９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートであり、そして上記方法は、１，２－９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートの製造のためのものである；又は
－ １６－アルファ－メチルヒドロコルチゾンであり、そして上記方法は１６－アルファ－メチルプレドニゾロンの製造のためのものである。
－ １１ベータ １７，２１－トリヒドロキシプレグナ－４－エン－３，２０－ジオン （ヒドロコルチゾン）であり、そして上記方法は、１１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （プレドニゾロン）の製造のためのものである；又は
－ １７アルファ，２１－ジヒドロキシ－４－プレグネン－３，１１，２０－トリオン （コルチゾン）であり、そして上記方法は、１７アルファ，２１－ジヒドロキシ－１，４プレグナジエン－３，１１，２０－トリオン （プレドニゾン）の製造のためのものである；又は
－ プレグナ－４－エン－３，２０－ジオンであり、そして上記方法はプレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオンの製造のためのものである；又は
－ １１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－メチル－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （６－メチルプレドニゾロン）の製造のための、１１ベータ，１７，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－１，４－プレグネン－３，２０－ジオン （６－メチル－ヒドロコルチゾン）である；又は
－ ９，１１－デヒドロコルテキソロンであり、そして上記方法は１，２－９，１１－デヒドロコルゲキソロンの製造のためのものである；又は
－ ９，１１ デヒドロコルテキソロン－１７，２１－ジアセテートであり、そして上記方法は１，２－９，１１ デヒドロコルテキソロンの製造のためのものである；又は
－ ９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートであり、そして上記方法は、１，２－９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートの製造のためのものである；又は
－ １６－アルファ－メチルヒドロコルチゾンであり、そして上記方法は１６－アルファ－メチルプレドニゾロンの製造のためのものである。
一実施形態において、１，２－脱水素されたステロイドの製造のための方法の工程ｂ）は、本発明に従う細菌の抽出物を用いて行われる。この抽出物は、優先的にΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有し、そして優先的に減少した２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有するか、又は２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有していない。特に、このような抽出物は、本発明に従う細菌の細胞溶解、及び場合により、Δ１－デヒドロゲナーゼ活性を濃縮するため又はΔ１－デヒドロゲナーゼ活性の精製を容易にするために、場合により細胞溶解生成物を分画することにより得ることができる。
１，２－脱水素されたステロイドの製造方法は、該１，２－脱水素されたステロイドを回収しそして精製することをさらに含んでいてもよい。
好ましくは、１，２－脱水素されたステロイドの製造方法は、２０β－脱水素されたステロイドの除去の工程を含まない。実際には、２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子の発現が有意に減少される場合、この工程は不必要な場合がある。
さらに、１，２－脱水素されたステロイドの製造方法は、１，２－脱水素されたステロイドを製剤化して医薬組成物にすることを含んでいてもよい。
別の態様において、本発明は、１，２－脱水素されていないステロイドから１，２－脱水素されたステロイドを製造するための、本発明に従う細菌又はその抽出物の使用に関する。
上記抽出物は、優先的にΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有し、そして優先的に減少した２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有するか又は２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有していない。特に、このような抽出物は、本発明に従う細菌の細胞溶解により、そして場合により、Δ１－デヒドロゲナーゼ活性を濃縮するため又はΔ１－デヒドロゲナーゼ活性の精製を容易にするために細胞溶解生成物を分画した後に得ることができる。
好ましくは、１，２－脱水素されていないステロイドは副腎皮質ステロイドである。
特定の実施形態において、１，２－脱水素されていないステロイドは、プロゲステロン、テストステロン、アンドロステンジオン又はこれらの分子の誘導体であり、これらは、１，２位の間で脱水素されていない６個の炭素原子の環Ａを含有するステロイド骨格を含有する。
特定の実施形態において、１，２－脱水素されていないステロイドは：
－ １１ベータ １７，２１－トリヒドロキシプレグナ－４－エン－３，２０－ジオン （ヒドロコルチゾン）であり、そして１１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （プレドニゾロン）が製造される；又は
－ １７アルファ，２１－ジヒドロキシ－４－プレグネン－３，１１，２０－トリオン （コルチゾン）であり、そして１７アルファ，２１－ジヒドロキシ－１，４ プレグナジエン－３，１１，２０－トリオン （プレドニゾン）が製造される；又は
－ プレグナ－４－エン－３，２０－ジオンであり、そしてプレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオンが製造される；又は
－ １１ベータ，１７，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－１，４－プレグネン－３，２０－ジオン （６－メチル－ヒドロコルチゾン）であり、そして１１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－メチル－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （６－メチルプレドニゾロン）が製造される；又は
－ ９，１１－デヒドロコルテキソロンであり、そして１，２－９，１１－デヒドロコルテキソロンが製造される；又は
－ ９，１１デヒドロコルテキソロン－１７，２１－ジアセテートであり、そして１，２－９，１１ デヒドロコルテキソロンが製造される；又は
－ ９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートであり、そして１，２－９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートが製造される；又は
－ １６－アルファ－メチルヒドロコルチゾンであり、そして１６－アルファ－メチルプレドニゾロンが製造される。
－ １１ベータ １７，２１－トリヒドロキシプレグナ－４－エン－３，２０－ジオン （ヒドロコルチゾン）であり、そして１１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （プレドニゾロン）が製造される；又は
－ １７アルファ，２１－ジヒドロキシ－４－プレグネン－３，１１，２０－トリオン （コルチゾン）であり、そして１７アルファ，２１－ジヒドロキシ－１，４ プレグナジエン－３，１１，２０－トリオン （プレドニゾン）が製造される；又は
－ プレグナ－４－エン－３，２０－ジオンであり、そしてプレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオンが製造される；又は
－ １１ベータ，１７，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－１，４－プレグネン－３，２０－ジオン （６－メチル－ヒドロコルチゾン）であり、そして１１ベータ，１７アルファ，２１－トリヒドロキシ－６アルファ－メチル－１，４－プレグナジエン－３，２０－ジオン （６－メチルプレドニゾロン）が製造される；又は
－ ９，１１－デヒドロコルテキソロンであり、そして１，２－９，１１－デヒドロコルテキソロンが製造される；又は
－ ９，１１デヒドロコルテキソロン－１７，２１－ジアセテートであり、そして１，２－９，１１ デヒドロコルテキソロンが製造される；又は
－ ９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートであり、そして１，２－９，１１－１６，１７－デヒドロコルテキソロン－２１－アセテートが製造される；又は
－ １６－アルファ－メチルヒドロコルチゾンであり、そして１６－アルファ－メチルプレドニゾロンが製造される。
本明細書で使用されるように、用語「医薬組成物」は、生理学的に適した担体及び賦形剤のような他の化学成分を用いた１，２－脱水素されたステロイドの調製物を指す。医薬組成物の目的は、上記１，２－脱水素されたステロイドの生物への投与を容易にすることである。
本発明の医薬組成物は、当該分野で周知の方法により、例えば、従来の混合、溶解、造粒、粉砕、微粉砕、糖衣錠製造、水簸、乳化、カプセル封入、封入又は凍結乾燥プロセスを用いて製造され得る。
典型的には、医薬組成物は、本発明の１，２－脱水素されたステロイド及び薬学的に許容しうるビヒクルを含み得る。
本発明は、以下の図面及び実施例によりさらに説明される。
配列表：
配列番号１はＮ．シンプレックスのＮＯＳＩＭ５１６９の配列に相当する。
配列番号２はＮ．シンプレックスのＮＯＳＩＭ３７３５の配列に相当する。
配列番号３は、ミコバクテリウム アビウム亜種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．）パラ結核症ＭＡＰ４の２０β－ＨＳＤＨの遺伝子の配列に相当する。
配列番号１はＮ．シンプレックスのＮＯＳＩＭ５１６９の配列に相当する。
配列番号２はＮ．シンプレックスのＮＯＳＩＭ３７３５の配列に相当する。
配列番号３は、ミコバクテリウム アビウム亜種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．）パラ結核症ＭＡＰ４の２０β－ＨＳＤＨの遺伝子の配列に相当する。
Ｎ．シンプレックスのゲノムを分析して、２０β－ＨＳＤＨについての２つの可能な遺伝子を見出し、ＮＯＳＩＭ５１６９（配列番号１の配列に相当）及びＮＯＳＩＭ３７３５（配列番号２の配列に相当）と名付けた。これらは両方ともミコバクテリウム アビウム亜種パラ結核症ＭＡＰ４の２０β－ＨＳＤＨの原因である遺伝子の配列（配列番号３の配列に相当）と類似性を共有する。
１．プラスミド構築（ＮＯＳＩＭ５１６９）
ＮＯＳＩＭ５１６９の不活化のためのプラスミドを以下のように構築した：２．０及び１．７ｋｂｐサイズの相同なショルダーをＰＣＲにより増幅した。一方のショルダーの増幅のために使用したプライマーはＸｂａｌ及びＥｃｏＲＶ制限部位を含有しており、そして第二の相同ショルダーのためのプライマーを、ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩ制限部位を含有するように設計した。
ＮＯＳＩＭ５１６９の不活化のためのプラスミドを以下のように構築した：２．０及び１．７ｋｂｐサイズの相同なショルダーをＰＣＲにより増幅した。一方のショルダーの増幅のために使用したプライマーはＸｂａｌ及びＥｃｏＲＶ制限部位を含有しており、そして第二の相同ショルダーのためのプライマーを、ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩ制限部位を含有するように設計した。
その後ショルダーを第一のプラスミドにクローン化した。
新しい第二のプラスミドを得るために、ハイグロマイシン抵抗性のための遺伝子をＥｃｏＲＶ制限部位に平滑末端クローニングした。
ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含まないプラスミドを「第二のプラスミド－ｈｙｇ」と名付けた。
２．Ｎ．シンプレックスのためのエレクトロポレーションプロトコル
このプロトコルは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）について記載された手順（Ｚｈａｎｇら、２０１１年）に基づく。エレクトロコンピテントセルの製造のための最適化された手順は以下のとおりであった：Ｎ．シンプレックスの細胞を、ＬＢ＋Ｐｈ（ＬＢは溶原性ブロスを表し、そしてＰｈはホスホマイシンを表す）２０ｍｌ中に播種し、そして静止期に達するまで培養した。次いで前培養からの１％種菌を新鮮なＬＢ培地に播種し、そして６００ｎｍで０．４～０．５の光学密度に達するまで培養した。次いでアンピシリン（Ａｐ）及びグリシンをそれぞれ最終濃度３０μｇ／Ｉ及び５ｇ／Ｉまで添加し、そして培養を継続した。３時間後に、培養物を氷上に置き、そして遠心分離により採取した（４５００ｒｐｍ、６分、４℃）。氷冷エレクトロポレーション緩衝液（０．５Ｍソルビトール、１０％グリセロール）中で３回洗浄した後、細胞を遠心分離により１００倍濃縮した。最後に、懸濁液を６０μｌアリコートに分配し、そして氷上で保存した（このプロトコルをＮ．シンプレックスＮＯＳＩＭ５１６９－ｈｙｇの生成のために使用した）。
このプロトコルは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）について記載された手順（Ｚｈａｎｇら、２０１１年）に基づく。エレクトロコンピテントセルの製造のための最適化された手順は以下のとおりであった：Ｎ．シンプレックスの細胞を、ＬＢ＋Ｐｈ（ＬＢは溶原性ブロスを表し、そしてＰｈはホスホマイシンを表す）２０ｍｌ中に播種し、そして静止期に達するまで培養した。次いで前培養からの１％種菌を新鮮なＬＢ培地に播種し、そして６００ｎｍで０．４～０．５の光学密度に達するまで培養した。次いでアンピシリン（Ａｐ）及びグリシンをそれぞれ最終濃度３０μｇ／Ｉ及び５ｇ／Ｉまで添加し、そして培養を継続した。３時間後に、培養物を氷上に置き、そして遠心分離により採取した（４５００ｒｐｍ、６分、４℃）。氷冷エレクトロポレーション緩衝液（０．５Ｍソルビトール、１０％グリセロール）中で３回洗浄した後、細胞を遠心分離により１００倍濃縮した。最後に、懸濁液を６０μｌアリコートに分配し、そして氷上で保存した（このプロトコルをＮ．シンプレックスＮＯＳＩＭ５１６９－ｈｙｇの生成のために使用した）。
あるいは、ストレプトマイセス・アルブス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）ＡＴＣＣ ２１８３８のためのプロトコル（Ｉｚｕｍｉｋａｗａら、２００３年）を適用することができる。この場合、エレクトロコンピテントセルの製造のための手順を、Ｎ．シンプレックス生理学に適合するように改変した：Ｎ．シンプレックスの静止期前培養からの１％種菌を、新鮮なＬＢ＋Ｐｈ培地に播種し、そして培養した。光学密度が６００ｎｍで０．４～０．５に達したら、培養物を遠心分離により採取し（４５００ｒｐｍ、６分、４℃）、そして滅菌氷冷水で３回洗浄した。次いで菌糸体を冷エレクトロポレーション緩衝液（１０％スクロース、１５％グリセロール）２５ｍｌに懸濁し、そしてリゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。２０分３７℃でインキュベーションした後、細胞を遠心分離により集め、そしてエレクトロポレーション緩衝液中で１００倍濃縮した。最後に、懸濁液を６０μｌアリコートに分配し、そして氷上で保存した。
両方の場合における最適化されたエレクトロポレーション手順は以下のとおりであった： エレクトロコンピテントセルを、ＤＮＡ ５００ｎｇ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＢ２００５から製造された）と混合し、そしてこの混合物を予め冷却したエレクトロポレーションキュベット（０．１ｃｍ電極）に移した。この混合物をエッペンドルフパルサーを使用して２．１ｋＶ／ｃｍで単一パルスにかけた。電気パルスの直後に、細胞懸濁液を室温にした回収培地（ＳＯＣ）８００μｌを入れたエッペンドルフチューブ中に移し、そして８５０ｒｐｍで振盪しながら１２時間３０℃でインキュベートした。形質転換された細胞の選択のために、細菌の段階希釈を、アプラマイシン（Ａｍ）を含有するＬＢ寒天プレート上に広げた。実験の各セットで、プラスミドＤＮＡの添加を省略することによりネガティブコントロールを行った。
３．シングルクロスオーバー変異体（ＮＯＳＩＭ５１６９）
第二のプラスミドを用いたＮ．シンプレックス株のエレクトロポレーション後に、シングルクロスオーバー形質転換体を得、そしてＬＢ＋Ａｍ＋Ｘ－Ｇｌｕｃ寒天プレートに適用した（略図については図１を参照のこと）（Ｘ－Ｇｌｕｃは一水和物、Ｘ－ＧｌｃＡを表す）。アプラマイシン上で成長する能力及びβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（例えば、Ｍｙｒｏｎｏｖｓｋｙｉら、２０１１年）反応を行う能力は、形質転換体がシングルクロスオーバー変異体であることを裏付けた。この後、変異体をＬＢ＋Ｐｈ培地１００ｍｌに播種し、そして４８時間２８℃、２００ｒｐｍにてインキュベートした。
第二のプラスミドを用いたＮ．シンプレックス株のエレクトロポレーション後に、シングルクロスオーバー形質転換体を得、そしてＬＢ＋Ａｍ＋Ｘ－Ｇｌｕｃ寒天プレートに適用した（略図については図１を参照のこと）（Ｘ－Ｇｌｕｃは一水和物、Ｘ－ＧｌｃＡを表す）。アプラマイシン上で成長する能力及びβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（例えば、Ｍｙｒｏｎｏｖｓｋｙｉら、２０１１年）反応を行う能力は、形質転換体がシングルクロスオーバー変異体であることを裏付けた。この後、変異体をＬＢ＋Ｐｈ培地１００ｍｌに播種し、そして４８時間２８℃、２００ｒｐｍにてインキュベートした。
４．ダブルクロスオーバー変異体（ＮＯＳＩＭ５１６９）
次いで、培養物１ｍｌを新鮮なＬＢ＋Ｐｈ培地中に移し、そして同じ条件でさらに４８時間インキュベートした。この工程を数回繰り返した。最後のインキュベーションの後、ＬＢ＋Ｘ－Ｇｌｕｃ寒天プレートでの変異体の段階希釈を行った。
次いで、培養物１ｍｌを新鮮なＬＢ＋Ｐｈ培地中に移し、そして同じ条件でさらに４８時間インキュベートした。この工程を数回繰り返した。最後のインキュベーションの後、ＬＢ＋Ｘ－Ｇｌｕｃ寒天プレートでの変異体の段階希釈を行った。
ＧＵＳ活性を示さなかった変異体を新しいＬＢ＋Ｘ－Ｇｌｕｃに移し、そして再度確認した。ＧＵＳ活性が無いことは、それらの変異体においてダブルクロスオーバーが起こり、そしてそれらがプラスミド骨格を失ったということを意味する。
第二の試験に合格した変異体をＬＢで増殖させ、それらのｇＤＮＡを単離し、次いでＮ．シンプレックスの染色体ＤＮＡと相同なプライマーを使用したＰＣＲにより解析した。
５．外来ＤＮＡを含まないダブルクロスオーバー変異体（ＮＯＳＩＭ５１６９）
第二のプラスミドの代わりに、「第二プラスミド－ｈｙｇ」を使用して形質転換を行った。抗生物質耐性遺伝子（ハイグロマイシン耐性）の存在は、ダブルクロスオーバー変異体のさらなる同定を容易にし得る。しかし、この耐性遺伝子はＮ．シンプレックスのゲノムにおいて不活性となる場合がある。
第二のプラスミドの代わりに、「第二プラスミド－ｈｙｇ」を使用して形質転換を行った。抗生物質耐性遺伝子（ハイグロマイシン耐性）の存在は、ダブルクロスオーバー変異体のさらなる同定を容易にし得る。しかし、この耐性遺伝子はＮ．シンプレックスのゲノムにおいて不活性となる場合がある。
したがって、ダブルクロスオーバー後は、得られた変異体はいずれの外来ＤＮＡも含有しないはずであり、そしてさらなる工業的応用に利用可能だろう（図１）。
「第二プラスミド－ｈｙｇ」のＮ．シンプレックスへの導入後に、アプラマイシン耐性コロニーを得た。
この変異体をＬＢ＋Ｐｈ培地での６回の培養で継代し、その後ＬＢ＋Ｘ－Ｇｌｕｃでの培養物の段階希釈を行った。
アプラマイシンで増殖することができず、かつＧＵＳ活性を有していない得られたコロニーをＰＣＲによるさらなる解析にかけた。ＮＯＳＩＭ５１６９に隣接したＮ．シンプレックスのｇＤＮＡの領域に相同な２つのプライマーを使用して増幅を行った。
６．ＮＯＳＩＭ３７３５の不活化
ＮＯＳＩＭ３７３５の上流のＤＮＡ領域はＰＣＲによるその増幅のためにアクセスできなかったので、ＮＯＳＩＭ３７３５が不活化された株の構築のために以前に記載された方法を適用することができなかった。この課題を克服するために、Ｎ．シンプレックスゲノムのフラグメントを含有するコスミドライブラリーを注文し、そして配列決定した。
ＮＯＳＩＭ３７３５の上流のＤＮＡ領域はＰＣＲによるその増幅のためにアクセスできなかったので、ＮＯＳＩＭ３７３５が不活化された株の構築のために以前に記載された方法を適用することができなかった。この課題を克服するために、Ｎ．シンプレックスゲノムのフラグメントを含有するコスミドライブラリーを注文し、そして配列決定した。
ＮＯＳＩＭ３７３５を不活化するために、コスミドライブラリからの適切なコスミドを含有する遺伝子を同定し（ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｎｓｔａｎｚによる約１５００のコスミドのサンガー配列決定）、そしてＥ．ｃｏｌｉにおけるλ媒介組み換えを使用してその遺伝子をクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子ｃａｔで置き換えた（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ、１９９８）。次いで、改変されたコスミドをＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼにより消化した。このようにして、フラグメントの混合物を得て、その中で、Ｎ．シンプレックスゲノムとの相同組み換えのための２つの３ｋｂショルダーに隣接したＮＯＳＩＭ３７３５の代わりにｃａｔ遺伝子を含有するフラグメントを得た。それらのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、そして７～８ｋｂフラクションを精製し、そしてＢａｍＨＩ－直線化プラスミドに連結した。ｃａｔ遺伝子を含む構築物を含有する変異体を選択するために、ＬＢ＋Ａｍ＋Ｃｍを増殖培地として使用した。得られた変異体をＰＣＲにより解析し、配列決定した。得られたプラスミドのうちの１つをＮＯＳＩＭ３７３５の不活化のためにさらに使用した。
ＮＯＳＩＭ５１６９の不活化のために以前に適応されたプロトコルに従って不活化を行った（ポイント２及び以下を参照のこと）。
この変異体をＬＢ＋Ｐｈ培地での数回の培養で継代し、次いでＬＢ＋Ｘ－Ｇｌｕｃでの培養物の段階希釈を行った。
アプラマイシン上で増殖することができず、かつＧＵＳ活性を有していない得られたコロニーをＰＣＲによりさらなる解析にかけた。ＮＯＳＩＭ３７３５に隣接したＮ．シンプレックスのｇＤＮＡの領域と相同な２つのプライマーを使用することにより増幅を行った。
７．ヒドロコルチゾンに対するＮＯＳＩＭ３７３５及びＮＯＳＩＭ５１６９の使用
クローンをヒドロコルチゾンからのプレドニゾロンの製造のための古典的プロセスにおいて使用する。
クローンをヒドロコルチゾンからのプレドニゾロンの製造のための古典的プロセスにおいて使用する。
手短には、ヒドロコルチゾンをテトラヒドロフラン中のメナジオン溶液と混合した。次いでこの懸濁液をｐＨ８，０に調整したリン酸緩衝液中で混合した。次いで細菌懸濁液を加えた。３０℃で撹拌下でインキュベートした後、リン酸を加えて反応を停止させた。プレドニゾロンの増加を測定し、そしてＨＰＬＣにより分析した。
Ｗａｔｅｒｓ－Ｘｂｒｉｇｄｅ ＲＰ１８カラムにより水／アセトニトリルグラジエントを移動相として使用してＨＰＬＣクロマトグラムを得た（クロマトグラムを図２～３に示す）。
あるいは、２０－ＯＨ－副生成物の製造の活性アッセイを実現した。プレドニゾロンをｐＨ８，０でリン酸緩衝液に懸濁し、そして細菌懸濁液とともにインキュベートした。６０分後にリン酸を加えることにより反応を停止した。次いで２０－ＯＨケト還元生成物の潜在的増加をＨＰＬＣにより測定した。
ＮＯＳＩＭ５１６９のトランケーションは、２０β－ＨＳＤＨ活性を全体的に抑制し、したがって２０－ＯＨ不純物を含まないプレドニゾロンを得ることを可能にする（図３）。
ＮＯＳＩＭ３７３５遺伝子をノックアウトしたが、この株は野生型株と同じ反応を示し、この遺伝子をノックアウトすることにより不要な副反応を止めることができた。
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Claims (15)
- ２０－ベータ－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（２０β－ＨＳＤＨ）をコードする遺伝子の発現が、対応する未改変の細菌と比較して減少しているか又は抑制されている遺伝子改変細菌であって、ここで対応する未改変細菌は、Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有する、上記遺伝子改変細菌。
- ２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子は不活化されているか又は欠失されている、請求項１に記載の遺伝子改変細菌。
- ２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子は変異している、請求項１又は２に記載の遺伝子改変細菌。
- ２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子はトランケートされている、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変細菌。
- 細菌はノカルジオイド科由来の細菌である、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子改変細菌。
- 遺伝子改変細菌はΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有するが、未改変細菌と比較して減少した２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有するか、又は２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有していない、請求項１～５のいずれか１項に記載の遺伝子改変細菌。
- ａ） Δ１－デヒドロゲナーゼ活性及び２０－β－デヒドロゲナーゼ活性を有する細菌を供給すること；並びに
ｂ） ２０β－ＨＳＤＨをコードする遺伝子を不活化するか又は欠失させること
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の遺伝子改変細菌の製造方法。 - ａ） １，２－脱水素されていないステロイドを供給すること；
ｂ） １，２－脱水素されていない該ステロイドを、請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌又はその抽出物と、１，２－脱水素されたステロイドを得るために十分な条件下で接触させること
を含む、１，２－脱水素されたステロイドの製造方法。 - １，２－脱水素されていないステロイドは副腎皮質ステロイドである、請求項８に記載の方法。
- １，２－脱水素されていないステロイドはヒドロコルチゾンであり、そして上記方法はプレドニゾロンの製造のためのものである、請求項８又は９に記載の方法。
- 上記１，２－脱水素されたステロイドを回収し、そして精製することをさらに含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
- ２０β－脱水素されたステロイドを除去する工程を含まない、請求項１１に記載の方法。
- １，２－脱水素されたステロイドを製剤化して医薬組成物にすることをさらに含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 上記抽出物はΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
- 上記抽出物は、請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌の細胞溶解、及びΔ１－デヒドロゲナーゼ活性を濃縮するため又はΔ１－デヒドロゲナーゼ活性の精製を容易にするために、場合により細胞溶解生成物を分画することにより得られる、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
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