JP2022517135A

JP2022517135A - Ａ型肝炎ウイルス（ｈａｖ）抗原を細胞培養物から抽出するための方法

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Publication number: JP2022517135A
Application number: JP2021547569A
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Inventors: フレーミクバートラム
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Filing date: 2020-02-11
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Abstract

本発明は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を細胞培養物から抽出するための方法と、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を細胞培養物から抽出するための組成物の使用とを対象とする。

Description

グローバルに主要な健康問題を生じさせるＡ型肝炎は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）によって引き起こされる。

Ａ型肝炎ウイルスは世界的に急性肝疾患を引き起こす最も普通な因子であり、その一次的な複製部位は肝臓である。Ａ型肝炎の発生率は国から国に大いに変動し、衛生の品質および飲み水へのアクセスに影響する社会経済的因子と関連する。

疾患の重症度は年齢と強く関連し、年長児童および成人は多くの場合に症候性疾患を経験する。Ａ型肝炎ウイルス感染は単純な黄疸から急性肝不全（ＡＬＦ）へと進行し得る。

Ａ型肝炎ウイルスの感染は通常は糞口伝播経路によって起こり、３から６週の潜伏期間の間の、および病の早期の時期まで延びる糞便中のウイルスの大規模な排出と関連している。より少ない量のウイルスが数週および数ヶ月に渡って糞便によって排泄され、長い期間に渡って血中にもまた存在し得る。これは、低い衛生水準がＡ型肝炎ウイルスの伝播を促進する地域における感染の高い有病率を説明する。

Ａ型肝炎ウイルスは、常温において、および低いｐＨにおいて並外れて安定である。ウイルスのこれらの特徴は、環境において生残する、ならびに汚染された食物および飲料水によって伝播されるその能力を説明する。酸ｐＨおよび洗剤に対する耐性は、胃を通過し胆道から宿主を出るその能力をもまた説明する。これらはＡ型肝炎の発症機序に大いに寄与する重要な特徴である。

Ａ型肝炎ウイルスは、特にポリプロテインプロセシングおよびビリオン形態形成のそのメカニズムの観点からピコルナウイルス科の中でそれを独特にし、かつ蓋然的にはその病理生物学に寄与するいくつかの特徴を有する。

Ａ型肝炎ウイルスおよびピコルナウイルスの起源の概要は、Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔａｌ．（２０１５）（“ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｏｒｉｇｉｎｓｏｆｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ５１７（７５３２），ｐａｇｅｓ８５ｔｏ８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３８０６）に見出され得る。

Ａ型肝炎ウイルスは７．５キロベース（ｋｂ）長の一本鎖（＋）ＲＮＡゲノムを有する。ウイルスゲノムはおよそ２５０ｋＤａのポリプロテインをコードする単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。完全なＡ型肝炎ウイルスゲノムの核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＭ１４７０７．１によって入手可能である。

ウイルス蛋白質はメッセンジャーセンスゲノムＲＮＡから直接的に翻訳され、これはウイルス粒子のアンコーティング後に細胞質に送達される。

Ａ型肝炎ウイルス遺伝子発現および蛋白質アセンブリはポリプロテインからの翻訳共役的および翻訳後蛋白質分解による個々の蛋白質の成熟を要求し、これは、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３として公知の３つの主要領域からなる。Ｐ１領域は、ウイルスカプシドＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３という３つの構造蛋白質、およびＶＰ４と呼称されかつビリオン形成にとって必須であるが成熟ウイルス粒子には存在しないウイルスカプシド蛋白質へとプロセシングされる。

構造蛋白質は、Ｐ３領域にコードされるウイルスプロテアーゼ３Ｃによって切断される。非構造蛋白質はＰ２およびＰ３領域からプロセシングされ、ＲＮＡ合成およびビリオンアセンブリのために要求される。Ｐ３セグメントは、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄ蛋白質を含む。

Ａ型肝炎ウイルスの分子的特徴の概要は、Ｖａｕｇｈａｎ，Ｇ．ｅｔａｌ．（２０１４）（“ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓ：ｈｏｓｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ２２７ｔｏ２４３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｅｅｇｉｄ．２０１３．１０．０２３）に見出され得る。

Ａ型肝炎ウイルスはメインの保存された抗原性の中和部位を所有することが示されており、結果として、世界の異なる地域からの全ての分離株は単一の血清型に属する。

抗原性バリアントを代表し、かつ異なるモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）に対する変動する耐性度を見せるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）免疫逃避変異体による実験は、新たな血清型の出現にとって必要なより大規模な遺伝子バリエーションを妨げるＨＡＶカプシドにおける重度の構造的制約の存在を示唆し、なぜなら、全ての観察された免疫逃避バリアントはＶＰ３蛋白質上の置換を共有したからである。

Ａ型肝炎ウイルスに対する適応免疫応答はロバストであり、ウイルスを排除することにおいて極めて有効である。一般的に、ウイルスに対する中和抗体（抗ＨＡＶ）は、血清アミノトランスフェラーゼ上昇および肝細胞障害の最も早期の証拠と同時的に血清中に現れる。抗ＨＡＶ－ＩｇＧは一生に渡って持続し、再感染に対する、少なくとも第２の病に対する防御を授ける。

過去に、工業国では、Ａ型肝炎ワクチン接種が、Ａ型肝炎を獲得する増大したリスクがある者に推奨されており、それらは高いＡ型肝炎エンデミック性の地域への旅行者、違法薬物のユーザー、ホモセクシュアル的に活発な男性、および凝固因子濃縮製剤を受ける凝固因子異常の患者を包含する。

免疫化は、Ａ型肝炎ウイルスに感染する場合に劇症疾患を発生する増大したリスクがある者についてもまた推奨されている。

細胞培養による増殖に適応しているウイルスを用いて、弱毒化生ＨＡＶワクチンが開発されている。しかしながら、ワクチン候補は不十分に免疫原性であった。弱毒化ワクチンはいくつかの利点を有し得るが、不活化ワクチンは良く働く。

不活化ＨＡＶワクチンは、細胞培養によって生産、精製され、ホルマリンによって不活化され、水酸化アルミニウムなどのアジュバントに吸着されるウイルス粒子を含有する。

不活化ＨＡＶワクチンは高度に免疫原性であり、感染および疾患の両方から防御する。この防御は、蓋然的には主として抗体に基づき、Ａ型肝炎ウイルスの全ての株を幅広く指向し、ヒトの株の間におけるＡ型肝炎ウイルスの単一の血清型の同定と整合している。

細胞培養によって生産されたホルマリン不活化ウイルスを含有する有効性のあるワクチンが複数国において認可されているが、その使用はコストの問題によって限定されていて、とりわけ、それは困難な培養条件からもたらされる。

Ａ型肝炎ウイルスは、非肝臓または非霊長類的起源の細胞を包含する培養哺乳類細胞の多くの型において複製するように適応している。その複製サイクルのいくつかの特徴は、それをポリオウイルスおよび多くの他の良く研究されているピコルナウイルスから区別し、そのゆっくりとしたかつ長引く経時変化、低いウイルス収量、および細胞培養において持続的感染を確立する傾向を包含する。

野生型ウイルスの増殖は培養細胞において一般的に不良であり、ウイルスは効率的な複製ができるようになる前に好ましくは適応のプロセスを受ける。

Ａ型肝炎ウイルスの少数の高度に細胞培養に適応している急速に複製する株が単離されている。このウイルスは細胞変性性であり、アポトーシスを誘導することによって細胞死を引き起こすように見える。しかしながら、ほとんどのＨＡＶ感染した細胞では、細胞培養において、およびおそらくまたインビボにおいての両方で、細胞変性効果はない。明らかに、ウイルスは、その増殖に普通に用いられる細胞、例えばアカゲザル胎児腎臓（ＦＲｈＫ－４）細胞、またはヒト肺線維芽細胞細胞株、例えばＭＲＣ－５において、その複製を下方制御する。

ワクチンの相対的に高いコストは、部分的には、Ａ型肝炎ウイルスを細胞培養によって増殖させることに内在する困難に関連するが、現行の限定された製造スケールにもまた関連する。

ＨＡＶワクチンの開発の概要は、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．ａｎｄＬｅｍｏｎ，Ｓ．Ｍ．（２００６）（“ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓ：Ｆｒｏｍｄｉｓｃｏｖｅｒｙｔｏｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４３（２），ｐａｇｅｓ１６４ｔｏ１７２，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｈｅｐ．２１０５２）に見出され得る。

Ａ型肝炎ビリオンの精製のためのプロセスがＥＰ０３０２６９２Ａ２に記載されている。

ＥＰ０５２２２９１Ａ１は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を精製するためのプロセスおよびＡ型肝炎ウイルスを含有するワクチン組成物を開示している。

ＵＳ５，７３１，１８７Ａは、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原およびワクチンを調製するためのプロセスを対象としている。

当分野において公知の方法は、培養基質上におけるＨＡＶ感染した細胞の増殖に依拠し、細胞の掻き取りまたは細胞のトリプシン処理が、ＨＡＶ感染した細胞の懸濁液を収穫することの要件である。ＨＡＶ感染した細胞は、通例では遠心分離の手段によって収集される。

代替的には、懸濁細胞培養物が用いられることができ、ＨＡＶ感染した細胞が遠心分離によって細胞培養培地から収穫される。

全てのケースにおいて、ＨＡＶ感染した細胞は、収穫された細胞から十分量のＨＡＶ抗原が放出するために、低張緩衝液に対する暴露、ボルテックス、凍結融解サイクル、およびソニケーションを包含するがこれらに限定されない種々の技術のいずれか１つ以上によってリシスされ、細胞破片が遠心分離の手段によってライセートから取り除かれる。

それから、上清が抽出手順に付される。かかる抽出は、他の混入物の中でも、脂質および脂質様物質を取り除く。好適な抽出手順は、有機溶媒による有機抽出、クロマトグラフィー、ゲル濾過、および／または遠心分離を包含する。

しかしながら、当分野において公知の方法は相対的に時間がかかり、ＨＡＶ抗原の収量の有意な損失を有する。

よって、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を細胞培養物から抽出するための方法を提供することが本発明の目的であり、これは増大した量のＨＡＶ抗原を提供し、かつ、好ましくは得られるＨＡＶ抗原の抗原性を縮減することなしに大スケール抗原生産もまた実行可能とする。

本発明の目的は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を細胞培養物から抽出するための請求項１の方法の提供によって解決され、その方法は：
ａ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞を提供するステップと、
ｂ）少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤と細胞を接触させることによって、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞をリシスするステップと、
ｃ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を含むライセートを収集するステップと、
を含む。

本発明の方法の好ましい実施形態は従属請求項２から１０に開示されている。

本発明の目的は、さらに、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を細胞培養物から抽出するための組成物の請求項１１に従う使用の提供によって解決され、その組成物は少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤を含む。

本発明の使用の好ましい実施形態は従属請求項１２から１４に開示されている。

ＨＡＶ抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞を含む細胞培養物からＨＡＶ抗原を抽出するための本発明の方法では、少なくとも１つの哺乳類細胞は、少なくとも１つの哺乳類細胞を、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤と、好ましくは少なくとも１０時間に渡って、好ましくは少なくとも１２時間に渡って、好ましくは１０時間から３６時間の期間に渡って、さらに好ましくは１２時間から２４時間の期間に渡って、好ましくは少なくとも２０℃の温度で、好ましくは少なくとも２５℃の温度で、好ましくは少なくとも３７℃の温度で、さらに好ましくは２０℃から３８℃の範囲の温度で、さらに好ましくは２５℃から３７℃の範囲の温度で接触させることによってリシスされる。

本発明の発明者は、少なくとも１つの哺乳類細胞を、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤の組み合わせによって、十分な時間の期間に渡って、好ましくは少なくとも１０時間に渡って、さらに好ましくは少なくとも１２時間に渡って、好ましくは１０時間から３６時間の期間に渡って、さらに好ましくは１２時間から２４時間の期間に渡って、好ましくは少なくとも２０℃の温度で、好ましくは少なくとも２５℃の温度で、好ましくは少なくとも３７℃の温度で、さらに好ましくは２０℃から３８℃の範囲の温度で、さらに好ましくは２５℃から３７℃の範囲の温度で、リシスすることによって、さらに好ましくは例えば破砕された宿主細胞のリシス後の重力または遠心分離による沈降の手段によって細胞破片を沈殿させる必要性なしに、ＨＡＶ抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞から、ＨＡＶ抗原が効率的に放出され得るということを見出した。

十分な時間の期間に渡って、好ましくは少なくとも１０時間に渡って、好ましくは少なくとも１２時間に渡って、好ましくは１０時間から３６時間の期間に渡って、さらに好ましくは１２時間から２４時間の期間に渡っての、好ましくは少なくとも２０℃の温度で、好ましくは少なくとも２５℃の温度で、好ましくは少なくとも３７℃の温度で、さらに好ましくは２０℃から３８℃の範囲の温度で、さらに好ましくは２５℃から３７℃の範囲の温度での、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤の組み合わせ適用は、ＨＡＶ抗原発現宿主細胞の効率的破砕を提供し、これによって、好ましくは、宿主細胞からのいずれかのＨＡＶ抗原が、本発明の方法のステップｂ）において得られるライセート中に放出される。

本発明に従うと、「組み合わせ適用」は、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤が、好ましくはＨＡＶ感染したＨＡＶ発現哺乳類細胞に対して実質的に同時に作用し得るということを意味する。つまり、少なくとも１つのプロテアーゼおよび／または少なくとも１つの界面活性剤は、好ましくはＨＡＶ感染したＨＡＶ発現哺乳類細胞に続けて添加もされ得る。少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤が、好ましくはＨＡＶ感染したＨＡＶ発現哺乳類細胞のリシスの間に十分な時間の期間に渡って一緒に作用するということのみが重要である。

結果として、かなり高い量のＨＡＶ抗原が本発明の方法によって得られる。

本発明に従うと、用語「Ａ型肝炎ウイルス抗原」または「ＨＡＶ抗原」は、少なくとも、免疫原性を提供するＡ型肝炎ウイルスカプシド蛋白質の部分を指す。好ましくは、そのＨＡＶ抗原は、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ１カプシド蛋白質、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ２カプシド蛋白質、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ３カプシド蛋白質、および／またはそれらの混合物の少なくとも１つ、好ましくは、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ１カプシド蛋白質および／またはＡ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ３カプシド蛋白質の少なくとも１つを含む。

Ａ型肝炎ウイルスポリプロテインのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＱ６７８２５，ｖｅｒｓｉｏｎ１０６によって入手可能である。

Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ１カプシド蛋白質、成熟ＶＰ２カプシド蛋白質、および成熟ＶＰ３カプシド蛋白質は、好ましくは、プロテアーゼによる酵素的切断によってＨＡＶポリプロテインから作出される。

同義的にヘパトウイルスＡと呼称されるＡ型肝炎ウイルスのヌクレオチド配列は公知であり、例えば、Ｇｒａｆｆ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９４）（“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｗｉｌｄ－ｔｙｐｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓＧＢＭｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｔｗｏｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ－ａｄａｐｔｅｄｖａｒｉａｎｔｓ”．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（１），ｐａｇｅ５４８ｔｏ５５４）に開示されていて、その開示は参照によってここに組み込まれる。それぞれの核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＸ７５２１４．１、Ｘ７５２１５．１、およびＸ７５２１６．１によって入手可能である。

用語「Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）をコードする核酸」は、ＨＡＶの変異体および／または機能的均等物を含むことをもまた意味される。「機能的均等物」は、野生型ＨＡＶのワクチン接種または適用と比較して、人間へのワクチン接種または適用後に実質的に同じ免疫反応を誘発する短縮または変異したＨＡＶ抗原をコードする核酸配列を意味する。

好ましくは、ＨＡＶ発現哺乳類細胞のコード配列は野生型Ａ型肝炎ウイルスＧＢＭ株のポリプロテインのＰ１領域をコードする核酸配列を含み、これは好ましくはＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＸ７５２１５．１によって入手可能な核酸配列のヌクレオチド位置６８８から３０６０に対応する。

本発明の方法に従うと、ＨＡＶ抗原が、ＨＡＶ抗原をコードする核酸を発現する好ましくはＨＡＶ感染した少なくとも１つの哺乳類細胞を含む細胞培養物から抽出される。

好ましくは、ＨＡＶ抗原をコードする核酸を発現する好ましくはＨＡＶ感染した少なくとも１つの哺乳類細胞を含む細胞培養物は、接着細胞培養物または懸濁細胞培養物、好ましくは接着細胞培養物である。

造血細胞株および少数の他のものを例外として、哺乳類に由来する細胞の大多数は、好ましくは足場依存性細胞であり、さらに好ましくは細胞接着および細胞の広がりを許すための当分野で公知の方法によって特に処理されている好適な基質上で培養される。

しかしながら、多くの細胞株は懸濁培養にも適応し得る。

懸濁培養される細胞は、組織培養処理されていない培養フラスコ中で維持され得るが、表面積に対する培養体積は充分なガス交換が妨げられるのを超えて増大するので、培地は例えば磁力式攪拌子または回転スピナーフラスコの手段による攪拌を要求する。

好ましくは、ステップａ）において、ＨＡＶ抗原を発現する好ましくはＨＡＶ感染した少なくとも１つの哺乳類細胞は、接着細胞培養物として提供され、これにおいては、ＨＡＶ抗原をコードする核酸を発現する好ましくはＨＡＶ感染した少なくとも１つの哺乳類細胞が、当分野において公知の条件下の好適な増殖培地中で単層として増殖される。

本発明の方法のステップａ）において提供されるＨＡＶ抗原を発現する好ましくはＨＡＶ感染した少なくとも１つの哺乳類細胞は、当分野において公知の方法によって、例えば少なくとも１つの哺乳類細胞を十分量のＡ型肝炎ウイルスに感染させることによって、得られ得る。

ＨＡＶ感染した細胞は、種々の従来からの細胞培養技術のいずれか１つ以上によって増殖および収穫される。

好ましくは、ＨＡＶ抗原を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞を得るために用いられるＡ型肝炎ウイルスは、細胞培養による増殖に、好ましくはＨＡＶ抗原を発現するために用いられる細胞株に適応している。

Ａ型肝炎ウイルスは、当分野において公知の方法によって好ましくは培養細胞の多くの型において複製するように適応しており、例えば、Ｇｒａｆｆ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９４），Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｉ．（１９８９），（“ＡｔｔｅｎｕａｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｄａｐｔａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓ（ＨＡＶ）：ａｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈＨＡＶｃＤＮＡ”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３（１２），ｐａｇｅｓ５３６４ｔｏ５３７０）、またはＦｌｅｈｍｉｇ，Ｂ．ｅｔａｌ．（１９８１）（“ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ．ＩＩＩ．ＰｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｉｎｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｔｒａｉｎｓ”，Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（２），ｐａｇｅｓ８３ｔｏ８９）に開示される通りである。

培地の選択を包含する増殖条件は、採用されるそれぞれの細胞株の要求に依存し、当業者に公知である。

さらに好ましくは、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞を、ステップｂ）において少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤と接触させる前に、培養培地は取り除かれる。

好適な細胞株は、公知の哺乳類細胞株、例えば、ヒト胎児腎臓細胞、アカゲザル胎児腎臓（ＦＲｈＫ－４）細胞、ヒト肺線維芽細胞細胞株、好ましくはＭＲＣ－５、アフリカグリーンモンキーの腎臓からのバッファローグリーンモンキー腎臓（ＢＧＭＫ）細胞、およびそれらの混合物を包含する。

例えば、ＭＲＣ－５細胞は基材への付着を要求する。その結果、本発明の方法のステップｂ）においては、細胞培養支持体に付着している細胞を少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤の組み合わせと接触させることによって、ＨＡＶ抗原が、ＨＡＶ抗原を発現するＭＲＣ－５細胞から効率的に抽出され得る。

本発明に従うと、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤を含む組成物が、好ましくは、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの洗剤の、同時、順次、または組み合わせ適用によって、細胞培養物からＨＡＶ抗原を抽出するために用いられる。

好ましくは、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの洗剤は、好ましくは液体のリシス組成物の形態で、少なくとも１つの細胞に適用される。

好ましくは、ＨＡＶ抗原をコードする核酸が発現される好ましくはＨＡＶ感染した少なくとも１つの哺乳類細胞を、前述の条件下で本発明の方法のステップｂ）において少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤の組み合わせと接触させることによって、著しい量のＨＡＶ抗原が含まれるライセートが提供される。

好ましくは、少なくとも１つのプロテアーゼとの組み合わせで本発明の方法に用いられる少なくとも１つの界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される。

さらに好ましくは、少なくとも１つの界面活性剤は、アルコキシル化直鎖アルコール、アルコキシル化アルキルフェノール、アルコキシル化チオール、脂肪酸アルコキシレート、アルコキシル化アミンおよび／または脂肪酸アミド、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、ポリヒドロキシ化合物の脂肪酸エステル、ポリヒドロキシ化合物のアルキルエーテル、アミンオキシド、スルホキシド、ホスフィンオキシド、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される非イオン性界面活性剤である。

さらに好ましくは、少なくとも１つの界面活性剤は、ポリヒドロキシ化合物の脂肪酸エステル、ポリヒドロキシ化合物のアルキルエーテル、およびそれらの混合物、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、アルコキシル化ソルビタン脂肪酸エステル、およびそれらの混合物からなる群から選択され、これらは例えばＣｒｏｄａＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰＬＣ（Ｓｎａｉｔｈ，ＵＫ）による商標Ｔｗｅｅｎ（登録商標）によって市販されている。

好適な非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ポリオキシエチレン（４）ソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２１）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、ポリオキシエチレン（４）ソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６１）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリステアレート（ポリソルベート６５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレン（５）ソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８１、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８１）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート（ポリソルベート８５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノイソステアレート（ポリソルベート１２０）、またはそれらの混合物、好ましくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートである。

好ましくは、少なくとも１つの界面活性剤は、それぞれリシス組成物の総体積のｍＬ当たりの少なくとも１つの界面活性剤の体積に基づいて、ｍＬ当たり少なくとも０．０５ｖｏｌ％、好ましくはｍＬ当たり少なくとも０．１ｖｏｌ％、好ましくはｍＬ当たり０．０５ｖｏｌ％からｍＬ当たり５．０ｖｏｌ％、さらに好ましくはｍＬ当たり０．１ｖｏｌ％からｍＬ当たり１．５ｖｏｌ％の濃度で用いられる。

好ましくは、少なくとも１つの界面活性剤との組み合わせで本発明の方法に用いられる少なくとも１つのプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。

さらに好ましくは、少なくとも１つのプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。

好ましくは、少なくとも１つのプロテアーゼは、それぞれリシス組成物の総体積当たりの少なくとも１つのプロテアーゼの乾燥重量に基づいて、ｍＬ当たり少なくとも０．０５ｖｏｌ％、好ましくはｍＬ当たり少なくとも０．１ｗｔ％、好ましくはｍＬ当たり少なくとも０．５ｗｔ％、さらに好ましくはｍＬ当たり０．０５ｗｔ％から５．０ｗｔ％、さらに好ましくはｍＬ当たり０．１ｖｏｌ％からｍＬ当たり１．５ｖｏｌ％、さらに好ましくはｍＬ当たり０．５ｖｏｌ％からｍＬ当たり１．０ｖｏｌ％の濃度で用いられる。

さらに好ましくは、リシス組成物は、少なくとも、それぞれリシス組成物の総体積のｍＬ当たりのＴｗｅｅｎ２０の体積に基づいて、ｍＬ当たり０．１ｖｏｌ％からｍＬ当たり１．５ｖｏｌ％、さらに好ましくはｍＬ当たり０．５ｖｏｌ％からｍＬ当たり１．０ｖｏｌ％の濃度のＴｗｅｅｎ２０と、少なくとも、それぞれリシス組成物の総体積当たりのトリプシンの乾燥重量に基づいて、ｍＬ当たり０．１ｖｏｌ％からｍＬ当たり１．５ｖｏｌ％、さらに好ましくはｍＬ当たり０．５ｖｏｌ％からｍＬ当たり１．０ｖｏｌ％の濃度のトリプシンとを含む。

好ましくは、プロテアーゼの活性は、少なくとも１つのキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の添加によって制御され得る。

さらに好ましくは、本発明の方法のステップｂ）において、ＨＡＶ抗原を発現する少なくとも１つの脊椎動物細胞をリシスすることが、少なくとも１つのキレート剤の存在下において、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤と細胞を接触させることによって達成される。

好ましくは、細胞のリシスは、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの洗剤の組み合わせ作用によってのみ、好ましくは、例えば超音波リシスまたはフレンチプレス細胞リシスなどの機械的リシスのいかなるさらなる作用もなしに、成就される。

好ましくは、ＨＡＶ抗原を含む本発明の方法のステップｂ）において得られるライセートは、本発明の方法のステップｃ）において収集され、保存され得るかまたは直接的に爾後の適用に用いられ得る。

従来からの、および周知の特性の追加のプロセシングステップが、精製されたＨＡＶ抗原を調製するために適用され得る。

さらに好ましくは、ステップｃ）において得られるライセートに含まれるＨＡＶ抗原は、ステップｄ）において、好ましくは、濾過、クロマトグラフィー、透析、電気泳動、遠心分離、またはそれらの組み合わせの手段によって濃縮され得る。

さらなる精製ステップは、ライセートからのリポ蛋白質の抽出のためのクロロホルムなどの少なくとも１つの極性液体の使用である。

ライセートおよびクロロホルムなどの少なくとも１つの極性液体、好ましくは、４部のライセート、１部のクロロホルムなどの極性液体、が一緒に混合され、強く振盪され、その後に、ライセートおよびクロロホルムなどの極性液体は、例えば遠心分離によって分離され、ライセートはさらなる目的に用いられる。

例えば、ホルマリンによる処理、滅菌濾過、および担体またはアジュバントへの吸着は、ホルマリン不活化ワクチンを調製するための典型的な基本ステップであり、例えば、Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９７９）（“ＰｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｉｎｖｉｔｒｏ”；Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１６０（２），ｐａｇｅｓ２１３ｔｏ２２１）およびＰｒｏｖｏｓｔ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８６）（“ＡｎｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒａｌｖａｃｃｉｎｅｏｆｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｏｒｉｇｉｎ”；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１９（１），ｐａｇｅｓ２３ｔｏ３１）に記載されている通りである。

ＨＡＶ抗原は、例えば、熱、ｐＨ変化、有機溶媒による処理、紫外線照射、ならびに／または、ホルムアルデヒドなどのアルデヒドおよび／もしくはホルムアルデヒドを放出する薬剤などのアルデヒドを放出する薬剤への暴露によって不活化され得る。

さらに好ましくは、本発明の方法によって得られるＨＡＶ抗原は、ＨＡＶ抗原を、少なくとも１つのアルデヒドおよび／またはアルデヒドを放出する薬剤、好ましくはホルムアルデヒドおよび／またはホルムアルデヒドを放出する薬剤と、十分な時間の期間、好ましくは少なくとも７日、好ましくは少なくとも９日、さらに好ましくは少なくとも１１日に渡って、少なくとも２０℃の温度で、好ましくは３７℃の温度で、さらに好ましくは少なくとも２１日に渡って接触させることによって、不活化される。

本発明の方法は、弱毒化されているか否かにかかわらず、いずれかの公知のＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）株にも適用され得る。弱毒化株は、細胞、動物における連続継代によって、または他の方法によって単離され得る。弱毒化の詳細については、例えば、Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｐ：Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８２）（“Ｐｒｏｇｒｅｓｓｔｏｗａｒｄａｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｈｕｍａｎｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖａｃｃｉｎｅ”；Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１７０（１），ｐａｇｅｓ８ｔｏ１４）およびＰｒｏｖｏｓｔ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８６）（“Ｎｅｗｆｉｎｄｉｎｇｓｉｎｌｉｖｅ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”；．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２０（２），ｐａｇｅｓ１６５ｔｏ１７５）を見よ。

本発明の方法は、Ａ型肝炎ウイルスの弱毒化または非弱毒化株に直ちにかつ容易に適応可能である。

本発明の方法によって得られるＨＡＶ抗原は、Ａ型肝炎ウイルス抗体または不活化Ａ型肝炎ワクチンを作出するために用いられ得る。

次の例は例示的な目的でのみ与えられている。本発明は次の例に限定されると解釈されるべきではない。

例１：ＨＡＶ発現細胞の作出
ＭＲＣ－５ヒト２倍体線維芽細胞（ロット１）またはアカゲザル胎児腎臓（Ｆｒｈｋ－４）細胞（ロット２）が、それぞれ、Ｆｌｅｈｍｉｇ，Ｂ．（１９８０）（“ＨｅｐａｔｉｔｉｓＡ－ｖｉｒｕｓｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ：Ｉ．ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｐａｔｉｔｉｓＡ－ｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｉｎａｆｏｅｔａｌｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ（Ｆｒｈｋ－４）”；Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（４），ｐａｇｅｓ２３９ｔｏ２４８）に記載されている方法によってＡ型肝炎ウイルス（ＧＢＭ株）に感染させられた。

感染後に、細胞が２回継代され、２つの別々のベッセルＡおよびＢへと分割され、それぞれは、３週間のインキュベーション後に同一の細胞数を有した。

各ベッセル（１Ａおよび１Ｂ）から、ＨＡＶ抗原が、従来からの抽出方法または本発明の方法のどちらかの適用によって抽出された。

例２：本発明の方法によるＨＡＶ抗原の抽出
次の組成を有する予温された（３７℃）溶液の適用に先立って、細胞培養培地がアスピレーションによって取り除かれた：
０．５ｗｔ％トリプシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｄｅ）
０．１ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ－２０
ハンクス平衡塩溶液中、最終ｐＨ：７．４から７．６
細胞層をカバーするために十分な量（１０ｃｍ^２当たりおよそ０．５ｍＬ）による。

細胞が３７℃で一晩インキュベーションされた。

次の日に、ライセートが収集され、ＨＡＶ抗原の量が例４に記載されている方法によって決定された。

比較例３：従来からの抽出方法によるＨＡＶ抗原の抽出
次の組成を有する予温された（３７℃）溶液の適用に先立って、細胞培養培地がアスピレーションによって取り除かれた：
０．５ｗｔ％トリプシン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅＧｍｂｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，ＤＥ）
ハンクス平衡塩溶液中、最終ｐＨ：７．４から７．６
細胞層をカバーするために十分な量（１０ｃｍ^２当たりおよそ０．５ｍＬ）による。

細胞が３７℃で５分に渡ってインキュベーションされた。十分量のウシ胎児血清、好ましくは１％以上を添加することによって、トリプシンが不活性化された。

トリプシン処理された細胞は遠心分離によって収穫され、上清は捨てられた。もたらされた細胞ペレットは－２０℃から－７０℃の温度で一晩凍結された。

次の日に、凍結細胞ペレットは室温において融解され、およそ５分に渡って、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ分散機（ＩＫＡ－ＷｅｒｋｅＧｍｂＨ＆ＣＯ．ＫＧ，Ｓｔａｕｆｅｎ，ＤＥ）を用いる機械的破砕に付された。

機械的破砕後に、懸濁液は再度遠心分離され、上清が取り除かれ、収集された。

上清中のＨＡＶ抗原の量が例４に記載されている方法によって決定された。

例４：ＨＡＶ抗原の決定
ＨＡＶ抗原の決定が、ＭｅｄｉａｇｎｏｓｔＧｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔｆｕｅｒＦｏｒｓｃｈｕｎｇｕｎｄＨｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇｖｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｋａＧｍｂＨから市販のＨＡＶ抗原酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット、製品番号Ｅ１２を用いて、製造者の説明書に従って行われた。

手短には、例２および比較例３で得られた各細胞ライセートの５０μｌアリコートが、ＥＬＩＳＡキットに包含されるマイクロタイタープレートのウェルにピペッティングされた。

ウェルが、ＨＡＶ抗原を指向する抗体によってプレコーティングされた。それぞれの細胞ライセート中に存在するＨＡＶ抗原は固定された抗体に結合し、３７℃における２時間のインキュベーション期間後に、マイクロタイタープレートは、キットによって供給される洗浄緩衝液によって丁寧に洗浄された。

結合したＨＡＶ抗原は、爾後に、これもまたキットによって供給されるペルオキシダーゼコンジュゲート化マウスモノクローナル抗ＨＡＶ－ＩｇＧ抗体の添加と、３７℃における別の２時間に渡ってのインキュベーションとによって同定された。

過剰なペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体が洗浄緩衝液による洗浄によって取り除かれた。爾後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含有する基質溶液がＥＬＩＳＡ発色のために添加された。

室温における３０分のインキュベーション後に、反応はストップ溶液を添加することによって終結された。ウェルの青色は黄色に変化し、吸光度がマイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍの波長において測定された。

色の強度は、結合したＨＡＶ抗原の濃度を指し示した。

力価は、ポジティブコントロールの１０％という上で指し示されている波長における消衰を有するＨＡＶ抗原調製物の希釈として定義される。図１Ａのポジティブコントロールは１．７６であり、この値の１０％は０．１７６％である。図１Ｂのポジティブコントロールは１．６であり、この値の１０％は０．１６０である。力価決定が、例３に記載されている通り調製されたＨＡＶ抽出物および例２に記載されている通り調製されたＨＡＶ抽出物からの２つの異なるロットによって行われた。

図１Ｂから見られ得る通り、例２に記載されている通り調製された抽出物の力価は、図１Ａに見られる例３に記載されている通り調製された抽出物と比較して実質的に高く、二倍近い。

より高いＨＡＶ－Ａｇ含量を有する２つの他のサンプルによって、力価値が表１に見られ得る通り達成される。また、これらのサンプルの中で、例２による抽出は例３と比較してかなり高い力価に達した。

各ベッセルのこれらの異なるロットの決定されたＨＡＶ抗原力価が下の表１にまとめられている。

図１Ａ：例３に記載されている通り調製されたＨＡＶ抽出物の力価図１Ｂ：例２に記載されている通り調製されたＨＡＶ抽出物の力価

Claims

Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を細胞培養物から抽出するための方法であって、
方法が：
ａ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞を提供するステップと、
ｂ）少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤と細胞を接触させることによって、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞をリシスするステップと、
ｃ）Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を含むライセートを収集するステップと、
を含む、方法。
少なくとも１つの界面活性剤が、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
少なくとも１つの界面活性剤が、アルコキシル化直鎖アルコール、アルコキシル化アルキルフェノール、アルコキシル化チオール、脂肪酸アルコキシレート、アルコキシル化アミンおよび／または脂肪酸アミド、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、ポリヒドロキシ化合物の脂肪酸エステル、ポリヒドロキシ化合物のアルキルエーテル、アミンオキシド、スルホキシド、ホスフィンオキシド、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、アルコキシル化ソルビタン脂肪酸エステル、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つのプロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
ステップａ）において、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの脊椎動物細胞が、接着細胞培養物としてまたは懸濁細胞培養物として提供される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
ステップｂ）において、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原をコードする核酸を発現する少なくとも１つの哺乳類細胞をリシスすることが、少なくとも１つのキレート剤の存在下において、少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤と細胞を接触させることによって達成される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
方法が、さらに：
ｄ）ステップｃ）において得られるライセートに含まれるＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を、好ましくは、濾過、クロマトグラフィー、透析、電気泳動、遠心分離、またはそれらの組み合わせの手段によって濃縮するステップ、
を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
方法が、さらに：
ｅ）少なくとも１つのアルデヒドおよび／またはアルデヒドを放出する薬剤、好ましくはホルムアルデヒドおよび／またはホルムアルデヒドを放出する薬剤と、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を接触させることによって、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を不活化するステップ、
を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原が、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ１カプシド蛋白質、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ２カプシド蛋白質、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ３カプシド蛋白質、および／またはそれらの混合物の少なくとも１つ、好ましくは、Ａ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ１カプシド蛋白質および／またはＡ型肝炎ウイルスの成熟ＶＰ３カプシド蛋白質の少なくとも１つを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原を細胞培養物から抽出するための組成物の使用であって、組成物が少なくとも１つのプロテアーゼおよび少なくとも１つの界面活性剤を含む、使用。
少なくとも１つの界面活性剤が、アルコキシル化直鎖アルコール、アルコキシル化アルキルフェノール、アルコキシル化チオール、脂肪酸アルコキシレート、アルコキシル化アミンおよび／または脂肪酸アミド、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、ポリヒドロキシ化合物の脂肪酸エステル、ポリヒドロキシ化合物のアルキルエーテル、アミンオキシド、スルホキシド、ホスフィンオキシド、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される非イオン性界面活性剤である、請求項１１に記載の使用。
少なくとも１つの界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、アルコキシル化ソルビタン脂肪酸エステル、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の使用。
少なくとも１つのプロテアーゼが、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の使用。