JP2022515742A - α－ガラクトシダーゼバリアント - Google Patents

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ジュディ ヴィクトリア アントニオ ヴィドゥヤ，
チンピン チェン，
アントワネット セロ，
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Abstract

本発明は、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチド、およびその組成物を提供する。操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、血清安定性、改善された細胞取り込み、酸性（ｐＨ＜４）と塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下における安定性、低下した免疫原性、および細胞からのグロボトリアオシルセラミドの改善された除去を実現するために最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。

Description

本出願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮出願第６２／７８２，５５３号（これによって、参照により、その全体があらゆる目的のために本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
本発明は、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチド、およびその組成物を提供する。操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、血清安定性、低下した免疫原性、改善された細胞取り込み、および酸性（ｐＨ＜４）と塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下における安定性、ならびに細胞からのグロボトリアオシルセラミドの改善されたクリアランスを実現するために最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。
配列表、表、またはコンピュータープログラムに対する言及
配列表の公式のコピーを、ファイル名が「ＣＸ７－１８４ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日が２０１９年１２月１９日、かつサイズが１．６７メガバイトのＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂによって、明細書と併せて提出している。ＥＦＳ－Ｗｅｂによって提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
ヒトαガラクトシダーゼ（「ＧＬＡ」；ＥＣ３．２．１．２２）は、糖脂質および糖タンパク質からの末端αガラクトシル部分の加水分解を担うリソソーム糖タンパク質である。このヒトαガラクトシダーゼは、様々なヒト組織に存在する多くの基質に作用する。ファブリー病（びまん性体幹被角血管腫、アンダーソン－ファブリー病、遺伝性異所性リピドーシス（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｄｙｓｔｏｐｉｃ ｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）、α－ガラクトシダーゼＡ欠損症、ＧＬＡ欠損症、およびセラミドトリヘキソシダーゼ欠損症とも呼ばれる）は、α－ガラクトシダーゼＡの欠失または活性の欠如に起因する、スフィンゴ糖脂質異化のＸ連鎖先天異常である。ファブリー病に罹患した患者は、血漿中、ならびに血管、組織、および器官の細胞リソソーム中にグロボトリアオシルセラミド（本明細書において、「Ｇｂ３」および「Ｇｂ３」と呼ばれる）および関連するスフィンゴ糖脂質を蓄積する（例えば、Ｎａｎｃｅら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６３：４５３－４５７［２００６］を参照のこと）。患者が年を取るにつれて、これらの脂質の蓄積によって血管は次第に細くなり、組織への、特に皮膚、腎臓、心臓、脳、および神経系の組織への血流および栄養が減少する。よって、ファブリー病は、腎不全、心疾患、脳血管疾患、小径線維末梢性ニューロパチー、および皮膚病変、ならびにその他の障害として顕在化する全身性障害である（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，１２２：６５－７７［２００９］を参照のこと）。罹患した患者は、手足の痛み、皮膚上の小さな暗赤色の斑点のクラスター、発汗能の低下、角膜混濁、胃腸の問題、耳鳴り、および難聴などの症状を示す。生命をおびやかす恐れのある合併症としては、進行性腎損傷、心臓発作、および脳卒中があげられる。男性の４０，０００～６０，０００人に１人がこの疾患に冒されていると推定されるが、女性にも起こる。実際に、ファブリー病に罹患しているヘテロ接合の女性は、神経系異常、慢性疼痛、疲労、高血圧、心臓病、腎不全、および脳卒中を含む重大な命に関わる状態を経験し、それゆえに医学的処置を必要とする（例えば、Ｗａｎｔら、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，１３：４５７－４８４［２０１１］を参照のこと）。ファブリー病の徴候は、乳児期以降のいかなる時点でも始まる可能性があり、通常は４～８歳の間に徴候が現れ始めるが、一部の患者は、より軽度で遅発性の疾患を発症する。ファブリー病の処置は一般的に支持的であり、かつファブリー病には治療法がないため、安全で有効な処置が依然として必要とされている。
Ｎａｎｃｅら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６３：４５３－４５７［２００６］ Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，１２２：６５－７７［２００９］ Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，１３：４５７－４８４［２０１１］
本発明は、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチド、およびその組成物を提供する。操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、血清安定性、低下した免疫原性、改善された細胞取り込み、および酸性（ｐＨ＜４）と塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下における安定性、ならびに細胞からのグロボトリアオシルセラミドの改善されたクリアランスを実現するために最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。
本発明は、配列番号８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えαガラクトシダーゼＡおよび／または生物学的に活性な組換えαガラクトシダーゼＡフラグメントを提供する。本発明は、配列番号８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えαガラクトシダーゼＡおよび／または生物学的に活性な組換えαガラクトシダーゼＡフラグメントを提供する。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、４４、４４／２１７、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２、４４／２１７／３２２／３３７、４４／２４７、４４／２４７／３０２、４４／２４７／３０２／３２２、４４／２４７／３２２、４４／２４７／３３７、４４／２４７／３６２、４４／３０２、４４／３３７、４４／３７３、２１７／３２２、２１７／３７３、２４７／３２２、２４７／３６２、３０２／３２２／３６２／３７３、３０２／３３７、３１６、３１６／３３７、３２２、３２２／３３７、３６２／３７３、および３７３（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、４４Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ／３３７Ａ、４４Ｌ／２４７Ｎ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３０２Ｑ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３３７Ａ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３６２Ｋ、４４Ｌ／３０２Ｑ、４４Ｌ／３３７Ａ、４４Ｌ／３７３Ｒ、２１７Ｆ／３２２Ｍ、２１７Ｆ／３７３Ｒ、２４７Ｎ／３２２Ｍ、２４７Ｎ／３６２Ｋ、３０２Ｑ／３２２Ｍ／３６２Ｋ／３７３Ｒ、３０２Ｑ／３３７Ａ、３１６Ｌ、３１６Ｌ／３３７Ａ、３２２Ｍ、３２２Ｍ／３３７Ａ、３６２Ｋ／３７３Ｒ、および３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｒ４４Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｋ３０２Ｑ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｑ３６２Ｋ、Ｒ４４Ｌ／Ｋ３０２Ｑ、Ｒ４４Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｋ３７３Ｒ、Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３７３Ｒ、Ｄ２４７Ｎ／Ｉ３２２Ｍ、Ｄ２４７Ｎ／Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ／Ｑ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ、Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｄ３１６Ｌ、Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｉ３２２Ｍ、Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｑ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ、およびＫ３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０／３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／２１７／２４７／２６１／２７１／３０２／３１６／３２２／３３７／３６２／３６８／３７３／３９２、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２／３３７、１６６／３６２、２１７／３７３、および３６２／３７３（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３０２Ｑ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ／３６２Ｋ／３６８Ｗ／３７３Ｒ／３９２Ｍ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１６６Ａ／３６２Ｋ、２１７Ｆ／３７３Ｒ、および３６２Ｋ／３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ／Ｑ３６２Ｋ／Ａ３６８Ｗ／Ｋ３７３Ｒ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１６６Ａ／Ｑ３６２Ｋ、Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３７３Ｒ、およびＱ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、７、７／４８／６８、７／４８／６８／１２０／２８２／２９９、７／４８／１３０／２８２、７／４８／１８０、７／６８／１３０／２８２／３６５、７／６８／１８０、７／８８／１２０／３０５／３６５、７／１２０、７／１３０、７／２８２、７／３０５、７／３０５／３６５、７／３６５、３９、４７、４７／８７／９５／９６／１５８／１６２、４７／９５、４７／２７３、４７／３４３、４８、４８／６８、４８／１８０／２８２、４８／２８２、４８／２８２／３０５、６７／１８０、６８、６８／２９９／３００、７１、８７／９１／９５／９６／１５８／１６２、８７／９１／９５／９６／２０６／３４３、８７／９６／１５５／２７３／３４３、８８、９１／９５、９１／９５／９６、９２、９３、９６、９６／２７３、９６／３１２／３４３、１２０、１２０／２９９／３０５、１５１、１５８、１５８／１６２／２７３、１６２、１６２／２７３、１６２／３４３、１６６、１７８、１８０、１８１、２０６、２１７、２７１、２７３、２７３／３４３、２８２、２８２／３６５、２９３／３９１、２９９／３００、２９９／３００／３０５／３６５、３００、３０１、３０５、３０５／３６５、３１４、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３６３、３６５、３７０、３８９、３９３、３９４、３９６／３９８、３９７、および３９８，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、７Ｌ、７Ｌ／４８Ｄ／６８Ｅ、７Ｌ／４８Ｄ／６８Ｅ／１２０Ｈ／２８２Ｎ／２９９Ｒ、７Ｌ／４８Ｄ／１３０Ｅ／２８２Ｎ、７Ｌ／４８Ｄ／１８０Ｇ、７Ｌ／６８Ｅ／１３０Ｅ／２８２Ｎ／３６５Ｖ、７Ｌ／６８Ｅ／１８０Ｇ、７Ｌ／８８Ａ／１２０Ｈ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、７Ｌ／１２０Ｈ、７Ｌ／１３０Ｅ、７Ｌ／２８２Ｎ、７Ｌ／３０５Ｇ、７Ｌ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、７Ｌ／３６５Ｖ、３９Ｖ、４７Ｄ、４７Ｄ／８７Ｋ／９５Ｅ／９６Ｌ／１５８Ｒ／１６２Ｈ、４７Ｄ／９５Ｅ、４７Ｄ／２７３Ｐ、４７Ｄ／３４３Ｇ、４７Ｖ、４８Ｄ、４８Ｄ／６８Ｅ、４８Ｄ／１８０Ｇ／２８２Ｎ、４８Ｄ／２８２Ｎ、４８Ｄ／２８２Ｎ／３０５Ｇ、６７Ｔ／１８０Ｇ、６８Ｅ、６８Ｅ／２９９Ｒ／３００Ｉ、７１Ｐ、８７Ｋ／９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ／１５８Ａ／１６２Ｋ、８７Ｋ／９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ／２０６Ｓ／３４３Ｇ、８７Ｋ／９６Ｉ／１５５Ｎ／２７３Ｐ／３４３Ｇ、８８Ａ、９１Ｑ／９５Ｅ、９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ、９２Ｆ、９２Ｔ、９３Ｉ、９６Ｌ、９６Ｌ／２７３Ｐ、９６Ｌ／３１２Ｑ／３４３Ｇ、１２０Ｈ、１２０Ｈ／２９９Ｒ／３０５Ｇ、１５１Ｌ、１５８Ａ、１５８Ａ／１６２Ｋ／２７３Ｇ、１５８Ｒ、１６２Ｈ／３４３Ｄ、１６２Ｋ、１６２Ｋ／２７３Ｐ、１６２Ｓ、１６６Ｋ、１７８Ｇ、１７８Ｓ、１８０Ｇ、１８０Ｌ、１８０Ｔ、１８０Ｖ、１８１Ａ、２０６Ｋ、２０６Ｓ、２１７Ｋ、２７１Ｒ、２７３Ｐ、２７３Ｐ／３４３Ｇ、２８２Ｎ、２８２Ｎ／３６５Ｖ、２９３Ｐ／３９１Ａ、２９９Ｒ／３００Ｉ、２９９Ｒ／３００Ｉ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、３００Ｉ、３０１Ｍ、３０５Ｇ、３０５Ｇ／３６５Ｖ、３１４Ａ、３３３Ｆ、３３３Ｇ、３３６Ｖ、３３７Ｒ、３４３Ｄ、３４３Ｇ、３４５Ａ、３４５Ｑ、３６３Ｑ、３６５Ａ、３６５Ｑ、３６５Ｖ、３７０Ｇ、３８９Ｋ、３９３Ｖ、３９４Ｋ、３９６Ｇ／３９８Ｔ、３９７Ａ、３９８Ａ、３９８Ｐ、３９８Ｓ、および３９８Ｖ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｒ７Ｌ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｙ１２０Ｈ／Ｄ２８２Ｎ／Ｑ２９９Ｒ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｄ１３０Ｅ／Ｄ２８２Ｎ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｆ１８０Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｑ６８Ｅ／Ｄ１３０Ｅ／Ｄ２８２Ｎ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｑ６８Ｅ／Ｆ１８０Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｑ８８Ａ／Ｙ１２０Ｈ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｙ１２０Ｈ、Ｒ７Ｌ／Ｄ１３０Ｅ、Ｒ７Ｌ／Ｄ２８２Ｎ、Ｒ７Ｌ／Ｎ３０５Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｆ３６５Ｖ、Ｅ３９Ｖ、Ｔ４７Ｄ、Ｔ４７Ｄ／Ｒ８７Ｋ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ｌ１５８Ｒ／Ｒ１６２Ｈ、Ｔ４７Ｄ／Ｓ９５Ｅ、Ｔ４７Ｄ／Ｓ２７３Ｐ、Ｔ４７Ｄ／Ｋ３４３Ｇ、Ｔ４７Ｖ、Ｅ４８Ｄ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｅ４８Ｄ／Ｆ１８０Ｇ／Ｄ２８２Ｎ、Ｅ４８Ｄ／Ｄ２８２Ｎ、Ｅ４８Ｄ／Ｄ２８２Ｎ／Ｎ３０５Ｇ、Ｐ６７Ｔ／Ｆ１８０Ｇ、Ｑ６８Ｅ、Ｑ６８Ｅ／Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ、Ｓ７１Ｐ、Ｒ８７Ｋ／Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ｌ１５８Ａ／Ｒ１６２Ｋ、Ｒ８７Ｋ／Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ａ２０６Ｓ／Ｋ３４３Ｇ、Ｒ８７Ｋ／Ｋ９６Ｉ／Ｈ１５５Ｎ／Ｓ２７３Ｐ／Ｋ３４３Ｇ、Ｑ８８Ａ、Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ、Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ、Ｈ９２Ｆ、Ｈ９２Ｔ、Ｖ９３Ｉ、Ｋ９６Ｌ、Ｋ９６Ｌ／Ｓ２７３Ｐ、Ｋ９６Ｌ／Ｐ３１２Ｑ／Ｋ３４３Ｇ、Ｙ１２０Ｈ、Ｙ１２０Ｈ／Ｑ２９９Ｒ／Ｎ３０５Ｇ、Ｄ１５１Ｌ、Ｌ１５８Ａ、Ｌ１５８Ａ／Ｒ１６２Ｋ／Ｓ２７３Ｇ、Ｌ１５８Ｒ、Ｒ１６２Ｈ／Ｋ３４３Ｄ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｋ／Ｓ２７３Ｐ、Ｒ１６２Ｓ、Ｐ１６６Ｋ、Ｗ１７８Ｇ、Ｗ１７８Ｓ、Ｆ１８０Ｇ、Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｔ、Ｆ１８０Ｖ、Ｑ１８１Ａ、Ａ２０６Ｋ、Ａ２０６Ｓ、Ｒ２１７Ｋ、Ａ２７１Ｒ、Ｓ２７３Ｐ、Ｓ２７３Ｐ／Ｋ３４３Ｇ、Ｄ２８２Ｎ、Ｄ２８２Ｎ／Ｆ３６５Ｖ、Ｌ２９３Ｐ／Ｑ３９１Ａ、Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ、Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｌ３００Ｉ、Ｒ３０１Ｍ、Ｎ３０５Ｇ、Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３３３Ｆ、Ｓ３３３Ｇ、Ｉ３３６Ｖ、Ｐ３３７Ｒ、Ｋ３４３Ｄ、Ｋ３４３Ｇ、Ｖ３４５Ａ、Ｖ３４５Ｑ、Ｌ３６３Ｑ、Ｆ３６５Ａ、Ｆ３６５Ｑ、Ｆ３６５Ｖ、Ｓ３７０Ｇ、Ｔ３８９Ｋ、Ｓ３９３Ｖ、Ｌ３９４Ｋ、Ｄ３９６Ｇ／Ｌ３９８Ｔ、Ｌ３９７Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｌ３９８Ｐ、Ｌ３９８Ｓ、およびＬ３９８Ｖ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号１５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、２４／２０２、３９／４７、３９／４７／２１７、３９／１５１、３９／２８２／３３７／３９８、３９／３３７／３４３／３９８、３９／３９３／３９８、４７／１３０、４７／１５１、４７／３４３／３４５／３９３、４８、４８／６８、４８／６８／２１７／３３３／３９１／３９３、４８／６８／３３３、４８／２１７、４８／３３３、４８／３４５／３９３、４８／３９３、５９／１４３、６８、６８／３４５、１３０、１３０／１５８、１３０／１５８／３９３、１３０／３４５／３９３、１４３／２７１、１４３／３３３、１４３／３８７、１５１、１５１／１５８／２１７／３４３／３４５／３９３、１５１／２０６／２８２／３３７／３４３／３４５／３９８、１５１／２８２／３９３、１５１／３４５／３９３／３９８、１５１／３９３、１５８、１５８／３９３、２０２、２０６、２０６／２１７、２１７、２１７／３３３、２１７／３３７／３４５／３９８、２７１、２８２／３９３、３３３、３３３／３４５、３３７／３４３／３４５／３９８、３４３、３４３／３４５／３９３／３９８、３９３、および３９３／３９８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号１５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、２４Ｓ／２０２Ｎ、３９Ｖ／４７Ｄ、３９Ｖ／４７Ｖ／２１７Ｋ、３９Ｖ／１５１Ｌ、３９Ｖ／２８２Ｎ／３３７Ｒ／３９８Ａ、３９Ｖ／３３７Ｒ／３４３Ｇ／３９８Ａ、３９Ｖ／３９３Ｖ／３９８Ａ、４７Ｖ／１３０Ｅ、４７Ｖ／１５１Ｌ、４７Ｖ／３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、４８Ｄ、４８Ｄ／６８Ｅ、４８Ｄ／６８Ｅ／２１７Ｋ／３３３Ｆ／３９１Ａ／３９３Ｖ、４８Ｄ／６８Ｅ／３３３Ｆ、４８Ｄ／２１７Ｋ、４８Ｄ／３３３Ｆ、４８Ｄ／３３３Ｇ、４８Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、４８Ｄ／３９３Ｖ、５９Ａ／１４３Ｓ、６８Ｅ、６８Ｅ／３４５Ｑ、１３０Ｅ、１３０Ｅ／１５８Ｒ、１３０Ｅ／１５８Ｒ／３９３Ｖ、１３０Ｅ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、１４３Ｓ／２７１Ｎ、１４３Ｓ／３３３Ｎ、１４３Ｓ／３８７Ｎ、１５１Ｌ、１５１Ｌ／１５８Ｒ／２１７Ｋ／３４３Ｇ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、１５１Ｌ／２０６Ｓ／２８２Ｎ／３３７Ｒ／３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９８Ａ、１５１Ｌ／２８２Ｎ／３９３Ｖ、１５１Ｌ／３４５Ｑ／３９３Ｖ／３９８Ａ、１５１Ｌ／３９３Ｖ、１５８Ｒ、１５８Ｒ／３９３Ｖ、２０２Ｎ、２０６Ｓ、２０６Ｓ／２１７Ｋ、２１７Ｋ、２１７Ｋ／３３３Ｆ、２１７Ｋ／３３３Ｇ、２１７Ｋ／３３７Ｒ／３４５Ｑ／３９８Ａ、２７１Ｎ、２８２Ｎ／３９３Ｖ、３３３Ｆ／３４５Ｑ、３３３Ｇ、３３３Ｎ、３３７Ｒ／３４３Ｇ／３４５Ｑ／３９８Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ／３９８Ａ、３９３Ｖ、および３９３Ｖ／３９８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｄ２４Ｓ／Ｄ２０２Ｎ、Ｅ３９Ｖ／Ｔ４７Ｄ、Ｅ３９Ｖ／Ｔ４７Ｖ／Ｒ２１７Ｋ、Ｅ３９Ｖ／Ｄ１５１Ｌ、Ｅ３９Ｖ／Ｄ２８２Ｎ／Ｐ３３７Ｒ／Ｌ３９８Ａ、Ｅ３９Ｖ／Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｇ／Ｌ３９８Ａ、Ｅ３９Ｖ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｔ４７Ｖ／Ｄ１３０Ｅ、Ｔ４７Ｖ／Ｄ１５１Ｌ、Ｔ４７Ｖ／Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｆ／Ｑ３９１Ａ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｓ３３３Ｆ、Ｅ４８Ｄ／Ｒ２１７Ｋ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３３３Ｆ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３３３Ｇ、Ｅ４８Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３９３Ｖ、Ｃ５９Ａ／Ｃ１４３Ｓ、Ｑ６８Ｅ、Ｑ６８Ｅ／Ｖ３４５Ｑ、Ｄ１３０Ｅ、Ｄ１３０Ｅ／Ｌ１５８Ｒ、Ｄ１３０Ｅ／Ｌ１５８Ｒ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１３０Ｅ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｃ１４３Ｓ／Ａ２７１Ｎ、Ｃ１４３Ｓ／Ｓ３３３Ｎ、Ｃ１４３Ｓ／Ｅ３８７Ｎ、Ｄ１５１Ｌ、Ｄ１５１Ｌ／Ｌ１５８Ｒ／Ｒ２１７Ｋ／Ｋ３４３Ｇ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１５１Ｌ／Ａ２０６Ｓ／Ｄ２８２Ｎ／Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ｄ１５１Ｌ／Ｄ２８２Ｎ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１５１Ｌ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｄ１５１Ｌ／Ｓ３９３Ｖ、Ｌ１５８Ｒ、Ｌ１５８Ｒ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ２０２Ｎ、Ａ２０６Ｓ、Ａ２０６Ｓ／Ｒ２１７Ｋ、Ｒ２１７Ｋ、Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｆ、Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｇ、Ｒ２１７Ｋ／Ｐ３３７Ｒ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ａ２７１Ｎ、Ｄ２８２Ｎ／Ｓ３９３Ｖ、Ｓ３３３Ｆ／Ｖ３４５Ｑ、Ｓ３３３Ｇ、Ｓ３３３Ｎ、Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｇ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ｋ３４３Ｄ、Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｓ３９３Ｖ、およびＳ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０、１０／３９／４４／３２２、１０／３９／９２／２０６／２１７／２７１、１０／３９／９２／２４７、１０／３９／９２／２４７／２７１／３１６、１０／４４、１０／４４／４７／９２／２４７、１０／４４／４７／２６１／３０２／３２２／３６８、１０／４４／９２／３１６／３２２、１０／４４／２６１／３０２／３１６、１０／４４／３０２／３３７／３６８、１０／４７／２１７／２４７／３１６／３９２、１０／４７／２１７／３２２、１０／４７／２７１、１０／９２、１０／９２／２０６／２１７／２４７、１０／９２／２０６／２４７／３１６／３２２／３９２、１０／９２／２０６／２４７／３２２／３６８、１０／９２／２１７／２６１／３０２／３３７、１０／２０６／２１７／２７１、１０／２０６／２４７、１０／２０６／２６１／２７１／３１６、１０／２６１、１０／２７１／３０２、１０／３０２、１０／３０２／３１６、１０／３０２／３２２／３３７、１０／３１６／３２２、１０／３３７／３９２、１０／３６８、３９／４４／９２／１６２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４４／９２／２１７／３２２、３９／４４／９２／２４７／２７１／３０２、３９／４７／９２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／２４７／３０２／３１６／３３７／３６８、３９／９２／３１６／３２２、３９／２４７／２７１、３９／２４７／２７１／３１６、３９／３２２、４４／４７／９２／２０６／２１７／３１６／３２２、４４／４７／９２／２４７／２６１／２７１／３１６／３３７／３６８、４４／４７／２０６／２１７／２４７／２７１／３２２、４４／４７／２４７／３２２／３６８、４４／４７／３０２／３１６／３２２、４４／９２／２０６／２４７／３６８、４４／２０６／３３７、４４／２４７／２６１／３０２／３１６、４４／２４７／２６１／３０２／３１６／３２２、４７／９２／２４７／２７１、４７／２１７／３０２、４７／２４７、４７／２４７／２７１、８９／２１７／２４７／２６１／３０２／３１６、９２／２１７／２７１、９２／２４７、９２／２４７／２７１／３２２、９２／２４７／３０２／３２２／３３７、９２／２７１／３３７、９２／３０２、９２／３１６、２０６／２１７／２７１／３９２、２１７／２４７／３１６／３２２／３３７／３６８、２４７、２４７／２７１、２４７／３０２、２７１、２７１／３０２／３２２、２７１／３１６／３２２、３０２／３２２／３６８、および３６８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｐ、１０Ｐ／３９Ｅ／４４Ｒ／３２２Ｉ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３１６Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ、１０Ｐ／４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ／４７Ｔ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３６８Ａ、１０Ｐ／４４Ｒ／９２Ｈ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、１０Ｐ／４４Ｒ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ／３０２Ｋ／３３７Ｐ／３６８Ａ、１０Ｐ／４７Ｔ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３９２Ｔ、１０Ｐ／４７Ｔ／２１７Ｒ／３２２Ｉ、１０Ｐ／４７Ｔ／２７１Ａ、１０Ｐ／９２Ｈ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２４７Ｄ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３２２Ｉ／３９２Ｔ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３２２Ｉ／３６８Ａ、１０Ｐ／９２Ｈ／２１７Ｒ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３３７Ｐ、１０Ｐ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ、１０Ｐ／２０６Ａ／２４７Ｄ、１０Ｐ／２０６Ａ／２６１Ｇ／２７１Ａ／３１６Ｄ、１０Ｐ／２６１Ｇ、１０Ｐ／２７１Ａ／３０２Ｋ、１０Ｐ／３０２Ｋ、１０Ｐ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、１０Ｐ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３３７Ｐ、１０Ｐ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、１０Ｐ／３３７Ｐ／３９２Ｔ、１０Ｐ／３６８Ａ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／１６２Ｍ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／２１７Ｒ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３０２Ｋ、３９Ｅ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４７Ｔ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／３６８Ａ、３９Ｅ／４７Ｔ／２４７Ｄ、３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３３７Ｐ／３６８Ａ、３９Ｅ／９２Ｈ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／２４７Ｄ／２７１Ａ、３９Ｅ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３１６Ｄ、３９Ｅ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／２７１Ａ／３１６Ｄ／３３７Ｐ／３６８Ａ、４４Ｒ／４７Ｔ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／２４７Ｄ／３２２Ｉ／３６８Ａ、４４Ｒ／４７Ｔ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４４Ｒ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３６８Ａ、４４Ｒ／２０６Ａ／３３７Ｐ、４４Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、４４Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ、４７Ｔ／２１７Ｒ／３０２Ｋ、４７Ｔ／２４７Ｄ、４７Ｔ／２４７Ｄ／２７１Ａ、８９Ｉ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、９２Ｈ／２１７Ｒ／２７１Ａ、９２Ｈ／２４７Ｄ、９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３２２Ｉ、９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３３７Ｐ、９２Ｈ／２７１Ａ／３３７Ｐ、９２Ｈ／３０２Ｋ、９２Ｈ／３１６Ｄ、２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ／３９２Ｔ、２１７Ｒ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３２２Ｉ／３３７Ｐ／３６８Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｄ／２７１Ａ、２４７Ｄ／３０２Ｋ、２７１Ａ、２７１Ａ／３０２Ｋ／３２２Ｉ、２７１Ａ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３０２Ｋ／３２２Ｉ／３６８Ａ、および３６８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｔ１０Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｑ３０２Ｋ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ａ３３７Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ａ２６１Ｇ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ａ２６１Ｇ、Ｔ１０Ｐ／Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ａ３３７Ｐ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｒ１６２Ｍ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ、Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｍ３９Ｅ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｋ２０６Ａ／Ａ３３７Ｐ、Ｌ４４Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｌ４４Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｑ３０２Ｋ、Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ、Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｌ８９Ｉ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３２２Ｉ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ、Ｙ９２Ｈ／Ｈ２７１Ａ／Ａ３３７Ｐ、Ｙ９２Ｈ／Ｑ３０２Ｋ、Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ、Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３９２Ｔ、Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｎ２４７Ｄ、Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ、Ｈ２７１Ａ、Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ、Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、およびＷ３６８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０／３６／９２／１６６／２４７／２６１／３１６／３９２、１０／３９、１０／３９／４４／４７／９２／２０６／２１７、１０／３９／４４／４７／３１６、１０／３９／４４／４７／３３７、１０／３９／４４／９２／１６６／２６１／３１６／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３９２、１０／３９／４４／９２／２１７／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／３０２／３２２、１０／３９／４４／１６６／２６１／２７１／３１６／３２２、１０／３９／４４／３９２、１０／３９／４７／９２／３３７、１０／３９／９２／１３１／１６６／２７１／３１６／３２２、１０／３９／９２／１６６／２１７／２４７／２７１、１０／３９／９２／２１７／３１６、１０／４４／４７／１６６／２６１／２７１、１０／４４／４７／１６６／２７１／３２２／３６８、１０／４４／４７／２１７／２７１／３１６／３２２、１０／４４／９２、１０／４４／９２／２１７／２４７／２７１／３０２／３１６／３９２、１０／４４／１６６／３０２、１０／４４／２０６／３１６／３２２、１０／４７／９２／１６６／２７１／３１６／３３７、１０／４７／９２／２７１／３０２、１０／４７／９２／３１６／３２２／３９２、１０／４７／１６６／２７１、１０／４７／１６６／３１６、１０／９２／１６６、１０／９２／１６６／２１７／２４７／２６１／２７１、１０／９２／１６６／２６１／２７１／３９２、１０／９２／１６６／２６１／３１６／３２２／３３７、１０／９２／１６６／３３７／３６８、１０／９２／３０２／３３７、１０／９２／３１６／３２２、１０／２０６、１０／２０６／２４７／２６１、１０／２１７／３２２、１０／２６１、１０／２６１／３３７／３９２、１０／３１６／３９２、１０／３６８、３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／３９２、３９／４４／４７／９２／２０６／２４７／２６１、３９／４４／４７／９２／２０６／３９２、３９／４４／４７／２０６／３３７／３６８／３９２、３９／４４／９２／１６６／２４７／２６１／３０２／３３７、３９／４４／１６６／２７１、３９／４４／１６６／２７１／３３７／３６８／３９２、３９／４７／９２／３１６／３２２、３９／４７／９２／３９２、３９／４７／１６６／２１７／２６１／３９２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／１６６／２１７／３９２、３９／９２／２６１／３０２、３９／１６６／２１７／２６１／３１６／３６８、３９／３２２、３９／３９２、４４／４７、４４／４７／９２／２１７／２７１、４４／４７／９２／２１７／３１６／３２２／３９２、４４／４７／９２／３９２、４４／４７／１６６、４４／４７／１６６／２７１、４４／４７／２４７／２７１／３９２、４４／３１６／３２２／３９２、４４／３３７、４７／１６６／２０６／２１７／２４７／３３７、４７／１６６／２１７／２７１／３３７、４７／２０６、４７／２１７／２４７／２６１、４７／２７１、５２／２１７／３０２／３１６、９２／１６６／２０６／２７１／３１６、９２／１６６／２１７／２６１／２７１／３９２、９２／１６６／２１７／３１６／３３７／３９２、９２／１６６／２４７、９２／１６６／３１６、９２／２０６／３２２、９２／２１７、９２／２１７／２７１／３３７、９２／２６１／２７１、９２／２７１、１６６／２１７／３１６／３２２／３３７、１６６／２４７／２７１／３１６、１６６／３１６／３２２／３３７、２０６／２１７、２１７／３９２、２４７／３１６、３１６／３２２／３６８、および３１６／３３７／３９２（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｔ／３６Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／２１７Ｆ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／３１６Ｌ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／３３７Ａ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３３７Ａ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／１３１Ｇ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２７１Ｈ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３２２Ｍ／３６８Ｗ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／４４Ｌ／９２Ｙ、１０Ｔ／４４Ｌ／９２Ｙ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３０２Ｑ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／４４Ｌ／１６６Ｓ／３０２Ｑ、１０Ｔ／４４Ｌ／２０６Ｋ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３３７Ａ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／２７１Ｈ／３０２Ｑ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、１０Ｔ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、１０Ｔ／４７Ｓ／１６６Ｓ／３１６Ｌ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ／２７１Ｈ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３３７Ａ／３６８Ｗ、１０Ｔ／９２Ｙ／３０２Ｑ／３３７Ａ、１０Ｔ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／２０６Ｋ、１０Ｔ／２０６Ｋ／２４７Ｎ／２６１Ａ、１０Ｔ／２１７Ｆ／３２２Ｍ、１０Ｔ／２６１Ａ、１０Ｔ／２６１Ａ／３３７Ａ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３６８Ｗ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／２４７Ｎ／２６１Ａ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／２０６Ｋ／３３７Ａ／３６８Ｗ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ／２６１Ａ／３０２Ｑ／３３７Ａ、３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３３７Ａ／３６８Ｗ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／３６８Ｗ、３９Ｍ／４７Ｓ／２４７Ｎ、３９Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／３９２Ｍ、３９Ｍ／９２Ｙ／２６１Ａ／３０２Ｑ、３９Ｍ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３６８Ｗ、３９Ｍ／３２２Ｍ、３９Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２１７Ｆ／２７１Ｈ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ、４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、４４Ｌ／４７Ｓ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、４４Ｌ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／３３７Ａ、４７Ｓ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／３３７Ａ、４７Ｓ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３３７Ａ、４７Ｓ／２０６Ｋ、４７Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ、４７Ｓ／２７１Ｈ、５２Ｎ／２１７Ｆ／３０２Ｑ／３１６Ｌ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２７１Ｈ／３１６Ｌ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３３７Ａ／３９２Ｍ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ、９２Ｙ／１６６Ｓ／３１６Ｌ、９２Ｙ／２０６Ｋ／３２２Ｍ、９２Ｙ／２１７Ｆ、９２Ｙ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３３７Ａ、９２Ｙ／２６１Ａ／２７１Ｈ、９２Ｙ／２７１Ｈ、１６６Ｓ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１６６Ｓ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３１６Ｌ、１６６Ｓ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、２０６Ｋ／２１７Ｆ、２１７Ｆ／３９２Ｍ、２４７Ｎ／３１６Ｌ、３１６Ｌ／３２２Ｍ／３６８Ｗ、および３１６Ｌ／３３７Ａ／３９２Ｍ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｐ１０Ｔ／Ｋ３６Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｗ１３１Ｇ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｉ３２２Ｍ／Ａ３６８Ｗ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ｋ３０２Ｑ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７

Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ａ２０６Ｋ、Ｐ１０Ｔ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｇ２６１Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｇ２６１Ａ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ２４７Ｎ、Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｇ２６１Ａ／Ｋ３０２Ｑ、Ｅ３９Ｍ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｉ３２２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ａ２０６Ｋ、Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｄ５２Ｎ／Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｉ３２２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ、Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ、Ｈ９２Ｙ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｈ９２Ｙ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ、Ｒ２１７Ｆ／Ｔ３９２Ｍ、Ｄ２４７Ｎ／Ｄ３１６Ｌ、Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ａ３６８Ｗ、およびＤ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のαガラクトシダーゼＡは、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１（表中、位置の番号は、配列番号２を基準にして付与されている）中に提供される少なくとも１つの位置において、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの追加の実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、ヒトαガラクトシダーゼＡに由来する。いくつかのさらなる実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、熱安定性が高い。いくつかの追加の実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、ｐＨ７において安定である。さらなるいくつかの追加の実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、ｐＨ４において安定である。さらにいくつかのさらなる実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、ｐＨ７において安定であり、かつｐＨ４において安定である。さらなる追加の実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、血清への曝露に対して安定である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、リソソームにおいて安定である。さらなるいくつかの追加の実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、細胞に取り込まれやすい。いくつかのさらなる実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、細胞から多くのグロボトリアオシルセラミドを除去する。さらなるいくつかの追加の実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４と比較して、細胞内への改善された取り込みを示す。いくつかのさらなる実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のαガラクトシダーゼＡよりも、免疫原性が低い。いくつかのさらなる実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、参照配列と比較して、ｉ）増強された酵素活性；ｉｉ）ｐＨ７に対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ４に対する増加した耐性；ｉｖ）血清に対する増加した耐性；ｖ）細胞内への改善された取り込み；ｖｉ）低下した免疫原性；もしくはｖｉｉ）細胞からのグロボトリアオシルセラミドの除去の増加；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）、またはｖｉｉ）のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも１つの改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、参照配列は、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４である。いくつかのさらなる実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、精製されている。
本発明は、本明細書において（例えば、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１中に）提供される少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする組換えポリヌクレオチド配列も提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡから選択される。
いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本発明は、本明細書（例えば、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１）において提供される少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。いくつかの実施形態において、前記組換えポリヌクレオチド配列は、調節配列に作動可能に連結されている。いくつかの追加の実施形態において、前記調節配列は、プロモーターである。いくつかのさらなる実施形態において、前記プロモーターは異種プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、本明細書において提供されるシグナル配列をさらに含む。
本発明は、本明細書において提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、本明細書（例えば、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１）において提供される少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、真核生物および原核生物から選択される。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、真核宿主細胞である。いくつかの追加の実施形態において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
本発明は、αガラクトシダーゼＡバリアントの産生方法であって、本明細書で提供される宿主細胞を、前記組換えポリヌクレオチドによってコードされるαガラクトシダーゼＡが産生される条件下で培養することを含む方法も提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、αガラクトシダーゼＡを回収するステップをさらに含む。いくつかのさらなる実施形態において、前記方法は、αガラクトシダーゼＡを精製するステップをさらに含む。本発明は、本明細書（例えば、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１）において提供される少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。いくつかの追加の実施形態において、本発明は、ファブリー病の処置のための医薬組成物であって、本明細書で提供される酵素組成物を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体および／または賦形剤をさらに含む。いくつかの追加の実施形態において、前記医薬組成物は、ヒトへの非経口注射または注入のために適している。
本発明は、対象におけるファブリー病の症状を処置および／または予防するための方法であって、ファブリー病を有する患者を準備すること、本明細書（例えば、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１）において提供される少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡを含む少なくとも１つの医薬組成物組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）を準備すること、および前記医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ファブリー病の症状は、対象において改善される。いくつかの追加の実施形態において、本発明の医薬組成物が投与された対象は、ファブリー病の症状が現れている対象が必要とする食事よりも、脂肪含有量の制限が少ない食事を食べることができる。いくつかの実施形態において、対象は、幼児または小児であるが、いくつかの代替的な実施形態において、対象は、成人または若年成人である。
本発明は、本明細書で提供される組成物の使用も提供する。
図１は、温度３０～５０℃で１時間のインキュベーション後の、ＧＬＡバリアントの相対活性を示すグラフを提供する。
図２は、ヒト血清によって、３７℃で０～２４時間チャレンジした後の、ＧＬＡバリアントの相対活性を示すグラフを提供する。
図３は、ヒトリソソーム抽出物によって、３７℃で０～２４時間チャレンジした後の、ＧＬＡバリアントの相対活性を示すグラフを提供する。
図４は、野生型と比較した相対活性として表した、ファブリー患者培養線維芽細胞と共に３７℃で４時間のインキュベーション後の、異なる精製ＧＬＡバリアントの細胞取り込みを示すグラフを提供する。
図５は、配列番号２と比較した、投与後１、２、および４週間における、ファブリーマウスの心臓におけるＧＬＡバリアントの活性を示すグラフを提供する。
図６は、投与後１および２週間における、ＧＬＡバリアントで処置したファブリーマウスの心臓における残存Ｇｂ３を示すグラフを提供する。
本発明は、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチド、およびその組成物を提供する。操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、血清安定性、改善された細胞取り込み、および酸性（ｐＨ＜４）と塩基性（ｐＨ＞７）の両方の条件下における安定性、低下した免疫原性、ならびに細胞からのグロボトリアオシルセラミドの改善されたクリアランスを実現するために最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。
いくつかの実施形態において、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドは、安定性を維持したまま、改善された細胞取り込みを提供するように最適化されている。本発明は、治療目的のための、操作されたヒトα－ガラクトシダーゼポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。
いくつかのケースにおいて、ファブリー病の処置のための酵素補充療法（例えば、ＦＡＢＲＡＺＹＭＥ（登録商標）アガルシダーゼベータ；Ｇｅｎｚｙｍｅ）は、適格な個体について検討される。現在使用されている酵素補充療法は、野生型ヒトＧＬＡの組換え発現形態である。静脈内投与されたＧＬＡは、循環し、受容体介在性エンドサイトーシス（主に、マンノース－６－リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ））によって細胞内に取り込まれ、標的器官のエンドソーム／リソソームに移行し、そこで、Ｇｂ３の蓄積を除去することが知られている。神経障害性疼痛および一過性脳虚血発作が引き続き低頻度で起こることから、これらの薬物は患者の症状を完全に取り除くものではない。加えて、高度に血管化してＭ６ＰＲに富む肝臓と比較すると、ほとんどの標的器官によるＧＬＡの取り込みは乏しく、この酵素（ＧＬＡ）は、血液およびリソソームのｐＨにおいて不安定である。よって、利用できる処置には問題が残されている。加えて、患者は免疫応答（投与された薬物を標的とするＩｇＧおよびＩｇＥ抗体）を起こすことがあり、重度のアレルギー（アナフィラキシー）反応、重篤な輸液反応に苦しみ、さらには死に至り得る。本発明は、現在利用できる処置と比較して、より安全で効果があり、さらには副作用が低減され、かつ予後が改善された、ファブリー病の処置に適した酵素を提供することを意図している。実際に、本発明は、血液（ｐＨ７．４）中での安定性が増加した（酵素は、血流中に入ったときに血液と接触する）、組換えＧＬＡ酵素を提供することを意図している。加えて、前記酵素は、リソソームのｐＨ（ｐＨ４．３）における安定性も増加している（リソソームは、この酵素が治療中に活性である場所である）。よって、安定性特性を維持し、グロボトリアオシルセラミドのクリアランスおよび細胞取り込みが改善された新たなＧＬＡバリアントを提供するために、多様な酵素バリアントライブラリーのハイスループットスクリーニングを採用し、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞における組換え発現されたヒトＧＬＡの定向進化を使用した。いくつかの実施形態において、前記ＧＬＡバリアントは低下した免疫原性を示す。
略語および定義：
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において用いられている命名法、ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験手順は、当該技術分野において周知であり、通常用いられているものである。このような技術は、周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な技術、またはその変形が、化学合成および化学分析に使用される。本明細書において言及されている（上記および下記の両方）全ての特許、特許出願、文献、および刊行物は、これによって、参照により本明細書中に明確に援用される。
本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等の、任意の適切な方法および材料が本発明の実施において使用されるが、いくつかの方法および材料は本明細書に記載されている。記載されている特定の方法論、プロトコル、および試薬は、当業者によって使用される状況に応じて変わることがあるため、本発明がそれらに限定されないことを理解すべきである。したがって、すぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より十分に説明される。本明細書において言及されている（上記および下記の両方）全ての特許、特許出願、文献、および刊行物は、これによって、参照により本明細書中に明確に援用される。
また、本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに文脈に反しないかぎり、複数形への言及を含む。
数値範囲には、その範囲を規定している数値が含まれる。よって、本明細書に開示されているあらゆる数値範囲は、そのようなより広い数値範囲に入る、より狭い数値範囲の全てが本明細書中に明確に記載されている場合と同程度に、そのようなより狭いあらゆる数値範囲を包含することが意図されている。本明細書に開示されているあらゆる最大（または最小）数値限定は、あたかもあらゆる数値限定の上限（または下限）が本明細書中に明確に記載されているかのように、あらゆる数値限定の上限（または下限）を含むことも意図されている。
用語「約」は、ある特定の値に対して許容できる誤差を意味する。いくつかの例において、「約」は、所与の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％の範囲内を意味する。いくつかの例において、「約」は、所与の値について、１、２、３、または４標準偏差の範囲内を意味する。
さらに、本明細書において示されている見出しは、本出願を全体として参照することによって把握され得る、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より十分に定義される。それでもなお、本発明の理解を助けるために、多くの用語が以下に定義されている。
別段の定めがない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’の向きに、左から右に記述され；アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の向きに、左から右に記述される。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および同語源の用語は、その包含的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同語源の用語と等価）。
「ＥＣ］番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ））の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢの生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく、酵素の数値的分類システムである。
「ＡＴＣＣ」は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指し、そのバイオレポジトリーコレクションには、遺伝子および株が含まれる。
「ＮＣＢＩ」は、（米国）国立生物学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）およびそこで提供されている配列データベースを指す。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、本明細書において、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミノ結合によって共有結合された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために用いられる。
「アミノ酸」は、本明細書において、一般的に知られているアミノ酸の３文字符号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨されている１文字符号のいずれかによって参照される。ヌクレオチドも、同様に、一般に受け入れられているヌクレオチドの１文字コードによって参照され得る。
用語「操作された」、「組換え」、「天然に存在しない」、および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドに関連して用いられた場合、別段自然界には存在しないか、またはそれと同一であるが、合成材料から、および／もしくは組換え技法を使用する操作によって、産生もしくは得られる方法で改変された、材料またはその材料の自然もしくは天然形態に対応する材料を指す。
本明細書で使用される場合、「ＵＴＲ」は、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの非翻訳領域を指す。いくつかの実施形態において、「５’非翻訳領域」または「５’ＵＴＲ」は、「リーダー配列」または「リーダーＲＮＡ」と呼ばれる。このｍＲＮＡ領域は、開始コドンのすぐ上流である。いくつかの実施形態において、「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」は、終止コドンのすぐ下流のｍＲＮＡ領域である。種々の生物（例えば、原核生物、真核生物、およびウイルス）において、これらの領域は、両方とも、翻訳制御および細胞内輸送のために重要である。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然にみられる形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の起源から単離することができ、かつ人為的な操作によって意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードしている、核酸（例えば、遺伝子）のコード部分を指す。
用語「パーセント（％）配列同一性」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指し、この同一性は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定され、この比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、前記２つの配列の最適なアラインのための参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を求め、このマッチした位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、得られた結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出することができる。これに代えて、このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定するか、または核酸塩基またはアミノ酸残基がギャップを含んだ状態でアラインする位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、このマッチした位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、得られた結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出することができる。当業者は、２つの配列をアラインするための確立した多くのアルゴリズムが存在することを理解している。比較のための配列の最適なアラインは、当該技術分野で知られているように、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４［１９８８］）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、および視覚的な検査によって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムとしては、例えば、それらに限定されないが、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあげられ、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌらによって説明されている（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３８９－３４０２［１９７７］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、（米国）国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトによって一般に利用可能である。このアルゴリズムには、クエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって高スコアの配列ペア（ＨＳＰ（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ））を最初に同定することが含まれ、前記短いワードは、データベース配列中の長さが等しいワードとアラインした場合に、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはそれを満たす。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（前出のＡｌｔｓｃｈｕｌらを参照のこと）。これらの最初の隣接ワードヒットは、このヒットを含むより長いＨＳＰを見つけるための探索を開始するためのシードの役割を果たす。このワードヒットは、次いで、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチ残基のペアについての報酬スコア；常に＞０）およびパラメーターＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列については、累積スコアを算出するために、スコアリングマトリックスを用いる。各方向におけるワードヒットの伸長は、次の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大到達値から、量Ｘだけ減少した場合；累積スコアが、１つまたはそれを超える負のスコアリング残基アライメントの蓄積が原因で、ゼロまたはそれ未満に達した場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸによって、アライメントの感度および速度が決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、初期値として、ワード長（Ｗ）には１１、期待値（Ｅ）には１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、ワード長（Ｗ）には３、期待値（Ｅ）には１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）。配列アライメントおよび％配列同一性は、例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用して、提供された初期パラメーターを用いて決定することができる。
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定められた配列を指す。参照配列は、より長い配列のサブセットであってもよく、例えば、完全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基、長さが少なくとも１００残基、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）前記２つの配列の間で類似する配列（すなわち、完全な配列の一部）を含んでいてもよく、かつ（２）前記２つの配列の間で異なる配列をさらに含んでいてもよいため、２つの（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、典型的には、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して同定し、配列類似性の局所領域を比較することによって行う。いくつかの実施形態において、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づいていてもよく、この場合、前記参照配列は、前記一次アミノ酸配列中に１つまたはそれを超える変更を有し得る配列である。「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチドの位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントであり、そこで少なくとも２０個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と配列が比較され、この場合、比較ウィンドウ内の前記配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントについて参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウは、２０個の連続した残基を超える長さであってもよく、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウを含む。
「に対応する」、「を参照して」、または「に対する」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合は、前記所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を特定の参照配列と比較した場合、前記特定の参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の実際の数値的位置ではなくて、前記参照配列を参照して指定される。例えば、所与のアミノ酸配列（例えば、操作されたＧＬＡのアミノ酸配列など）と参照配列のアラインは、これら２つの配列の間の残基マッチを最適化するために、ギャップを挿入することによって行ってもよい。これらのケースにおいて、前記所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基は、ギャップが存在するにもかかわらず、アラインした前記参照配列に対して番号付けされる。
「アミノ酸の相違」または「残基の相違」は、ポリペプチド配列のある位置におけるアミノ酸残基の、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基に対する相違を指す。アミノ酸の相違の位置は、本明細書において、通常「Ｘｎ」（ここで、ｎは、この残基の相違の基準となる参照配列中の対応する位置を指す）と表される。例えば、「配列番号８と比較したときの位置Ｘ４４における残基の相違」は、配列番号８の位置４４に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。よって、配列番号８の参照ポリペプチドが位置４４にアルギニンを有する場合、「配列番号８と比較したときの位置Ｘ４４における残基の相違」、配列番号８の位置４４に対応するポリペプチドの位置における、アルギニン以外の任意の残基のアミノ酸置換。本明細書中のほとんどの例において、ある位置における特定のアミノ酸残基の相違は、「ＸｎＹ」として示され、この場合、「Ｘｎ」は上記のように対応する位置を特定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチド中に見いだされたアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドと異なる残基）の１文字識別子である。いくつかの例において（例えば、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および９－１に示されるように）、本開示は、従来の表記法「ＡｎＢ」で示された特定のアミノ酸の相違も提供し、この場合、Ａは、参照配列中の残基の１文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の１文字識別子である。いくつかの例において、本開示のポリペプチドは、参照配列に対して１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違を含んでいてもよく、その相違は、参照配列に対して残基の相違が存在する特定の位置のリストによって示される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの特定の残基位置において１つを超えるアミノ酸を使用することできる場合、使用することができる種々のアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ２４７Ｄ／Ｘ２４７ＮまたはＸ２４７Ｄ／Ｎ）。いくつかの実施形態において、酵素バリアントは、１つを超える置換を含む。これらの置換は、読みやすさのためにスラッシュ（／）によって区切られている（例えば、Ｄ２４Ｓ／Ｄ２０２Ｎ）。本出願には、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか、または両方を含む、１つまたはそれを超えるアミノ酸の相違を含む、操作されたポリペプチド配列が含まれる。
「保存的アミノ酸置換」は、類似する側鎖を有する他の残基による残基の置換を指し、よって、典型的には、同じまたは類似する定められたアミノ酸クラス内のアミノ酸による、ポリペプチド中のアミノ酸の置換を含む。例示としてであって限定のためではないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）によって置換されてもよく；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ鎖（例えば、セリンおよびスレオニン）によって置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）によって置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性（ｂａｓｉｓ）側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）によって置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）によって置換され；および／または疎水性または親水性アミノ酸は、別の疎水性または親水性アミノ酸によって置き換えられる。
「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖の特性を有するアミノ酸による、ポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換には、前記定義されたアミノ酸グループ内ではなくて、グループ間のアミノ酸が用いられてもよく、（ａ）置換された場所におけるペプチド骨格の構造（例えば、プロリンによるグリシンの置換）、（ｂ）電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さに影響する。例示としてであって限定のためではないが、例示的な非保存的置換は、酸性アミノ酸の塩基性または脂肪族アミノ酸による置換；芳香族アミノ酸の小さなアミノ酸による置換；および親水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換であり得る。
「欠失」は、参照ポリペプチドからの、１個またはそれを超えるアミノ酸の除去による、ポリペプチドに対する改変を指す。欠失は、酵素活性が保持され、および／または操作された酵素の改善された特性が保持されている限り、参照酵素を形作っているアミノ酸の総数の１０％まで、または総数の２０％までの、１個またはそれを超えるアミノ酸、２個またはそれを超えるアミノ酸、５個またはそれを超えるアミノ酸、１０個またはそれを超えるアミノ酸、１５個またはそれを超えるアミノ酸、または２０個またはそれを超えるアミノ酸の除去を含んでいてもよい。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に対するものであり得る。種々の実施形態において、欠失は、連続するセグメントを含んでいてもよく、不連続であってもよい。
「挿入」は、参照ポリペプチドに対する、１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加による、ポリペプチドに対する改変を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分における挿入であってもよく、またはカルボキシまたはアミノ末端に対する挿入であってもよい。挿入には、本明細書で使用される場合、当該技術分野で知られている融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであってもよく、天然に存在するポリペプチドにおける１つまたはそれを超えるアミノ酸によって隔てられていてもよい。
本明細書において互換的に使用される「機能的フラグメント」または「生物学的に活性なフラグメント」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端の欠失（単数または複数）ならびに／または内部の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が比較対象の配列（例えば、本発明の完全長の操作されたＧＬＡ）における対応する位置と同一であり、かつその完全長のポリペプチドの実質的に全ての活性を保持しているポリペプチドを指す。
「単離されたポリペプチド」は、天然においてポリペプチドと一緒に存在するその他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、ポリペプチドが天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されたポリペプチド、または精製されたポリペプチドを包含する。組換えＧＬＡポリペプチドは、細胞内に存在してもよく、細胞培地中に存在してもよく、または種々の形態（例えば、ライセートまたは単離された調製物など）で調製されてもよい。よって、いくつかの実施形態において、組換えＧＬＡポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が主要な存在種（すなわち、組成物において、モルまたは重量基準で、その他の個々の高分子種よりも大量に存在する）である組成物を指し、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを対象となる種が構成する場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、一般に、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なＧＬＡ組成物は、モルまたは重量％で、組成物中に存在する全ての高分子の約６０％またはそれを超える、約７０％またはそれを超える、約８０％またはそれを超える、約９０％またはそれを超える、約９５％またはそれを超える、約９８％またはそれを超える部分を構成する。いくつかの実施形態において、対象種は、本質的に均一（すなわち、組成物において、従来の検出方法によって混在種を検出することができない）になるまで精製され、その場合、組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。いくつかの実施形態において、単離された組換えＧＬＡポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「改善された酵素特性」は、参照ＧＬＡポリペプチドおよび／または野生型ＧＬＡポリペプチドもしくは別の操作されたＧＬＡポリペプチドと比較して、何らかの酵素特性において改善を示す操作されたＧＬＡポリペプチドを指す。改善された特性としては、それらに限定されないが、増加した遺伝子発現、増加したタンパク質産生、増加した熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、増加した熱安定性、種々のｐＨレベルにおける増加した活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、基質および／または生成物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性、中性、または塩基性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する低下した感受性）、減少した凝集、増加した溶解度、低下した免疫原性、改善された翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）、変化した温度プロファイル、増加した細胞取り込み、増加したリソソーム安定性、細胞からＧｂ３を除去する増加した能力、ＧＬＡ産生細胞からの増加した分泌などがあげられる。
「増加した酵素活性」または「増強された酵素活性」は、操作されたＧＬＡポリペプチドの改善された特性を指し、参照ＧＬＡ酵素と比較して、比活性が増加していること（例えば、産生された生成物／時間／タンパク質重量）、基質から生成物へのパーセント変換が増加していること（例えば、特定の量のＧＬＡを用いた、特定の時間内における、基質の出発量から生成物へのパーセント変換）によって示され得る。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に示されている。酵素活性に関するあらゆる特性（古典的な酵素活性であるＫｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔが含まれる）が影響を受ける可能性があり、その特性の変化が、増加した酵素活性をもたらし得る。酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、天然に存在するＧＬＡまたはそのＧＬＡポリペプチドの起源である別の操作されたＧＬＡの酵素活性に対して、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれを超える酵素活性までであり得る。
いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、少なくとも０．１／秒、少なくとも０．５／秒、少なくとも１．０／秒、少なくとも５．０／秒、少なくとも１０．０／秒のｋｃａｔを有し、いくつかの好ましい実施形態において、１０．０／秒より大きいｋｃａｔを有する。いくつかの実施形態において、Ｋｍは、約１μＭ～約５ｍＭの範囲内；約５μＭ～約２ｍＭの範囲内；約１０μＭ～約２ｍＭの範囲内；または約１０μＭ～約１ｍＭの範囲内である。いくつかの特定の実施形態において、操作されたＧＬＡ酵素は、ある特定の条件に曝露した後、参照ＧＬＡ酵素（例えば、野生型ＧＬＡ、または任意の他の参照ＧＬＡ（例えば配列番号８など））の酵素活性に対して、１．５～１０倍の範囲内、１．５～２５倍の範囲内、１．５～５０倍の範囲内、１．５～１００倍の範囲内、またはそれより大きい改善された酵素活性を示す。ＧＬＡ活性は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法（例えば、反応物または生成物の分光光度的特性の変化をモニタリングするなどの標準的なアッセイ）によって測定することができる。いくつかの実施形態において、産生された生成物の量は、ＵＶ吸光度または蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離によって、直接またはｏ－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化後に測定することができる。いくつかの実施形態において、産生された生成物の量は、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４－ＭＵＧａｌ）分子の加水分解後に、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニタリングすることによって測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳述するように、酵素の定義された調製物、設定された条件下における定義されたアッセイ、および１つまたはそれを超える定義された基質を用いて行われる。一般に、ライセートが比較される場合、宿主細胞によって産生され、ライセート中に存在する酵素量の変動を最小化するために、アッセイされる細胞数およびタンパク質量が決定されると共に、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用される。
用語「酸性ｐＨに対する改善された耐性」は、本発明による組換えＧＬＡが、参照ＧＬＡまたは別の酵素と比較して、増加した安定性（酸性ｐＨに特定の期間（１時間から、最大２４時間）曝露した後に保持される、約ｐＨ４．８における活性がより高い）を有することを意味する。
用語「改善された細胞取り込み」は、本明細書で提供される組換えＧＬＡが示す細胞内へのエンドサイトーシスが、参照ＧＬＡ（野生型ＧＬＡを含む）または別の酵素と比較して、亢進していること意味する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ファブリー患者培養線維芽細胞（参照ＧＬＡまたは別の酵素と比較して、特定の期間にわたって培養細胞と共にインキュベートした後に保持される細胞内活性がより高い）である。いくつかの追加の実施形態において、本明細書で提供される組換えＧＬＡが示す、特定の期間にわたって培養細胞と共に保持される細胞内活性は、参照ＧＬＡ（野生型ＧＬＡを含む）または別の酵素と比較して、より高い。いくつかの追加の実施形態において、前記期間は約４時間であるが、いくつかの他の実施形態において、前記期間は４時間未満（例えば、１、２、または３時間）であり、いくつかの代替的な実施形態において、前記期間は４時間を超える（例えば、５、６、７、８、またはそれを超える時間）。
「生理的ｐＨ」は、本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒト）の血液において一般に検出されるｐＨ範囲を意味する。
用語「塩基性ｐＨ」（例えば、塩基性ｐＨ条件に対する改善された安定性、または塩基性ｐＨに対する増加した耐性に関連して用いられる）は、約７～１１のｐＨ範囲を意味する。
用語「酸性ｐＨ」（例えば、酸性ｐＨ条件に対する改善された安定性、または酸性ｐＨに対する増加した耐性に関連して用いられる）は、約１．５～４．５のｐＨ範囲を意味する。
「変換」は、基質（単数または複数）の、対応する生成物（単数または複数）への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「パーセント変換」は、特定の条件下で、ある期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。よって、ＧＬＡポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間内の、基質の生成物への「パーセント変換」として表され得る。
「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件（例えば洗浄条件）を指す。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシー条件下で行った後、多様であるがより高いストリンジェンシーの洗浄を行う。用語「中ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡを、その標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸、ならびに標的ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性を有する相補的核酸に結合させる条件を指す。例示的な中ストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で、４２℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で、４２℃で洗浄を行う場合と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、定められたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから、約１０℃またはそれ未満の条件を指す。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列だけをハイブリダイゼーションさせる条件を指す（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で、６５℃で安定でない場合、本明細書において意図されているように、そのハイブリッドは高ストリンジェンシー条件下において安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃に等価な条件におけるハイブリダイゼーションと、その後の０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄によってもたらすことができる。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイズに等価な条件におけるハイブリダイズおよび０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄ある。その他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中ストリンジェント条件は、上記で引用した文献に記載されている。
「コドン最適化」は、目的とする生物および／または細胞において、コードされているタンパク質がより効率的に発現されるように、そのタンパク質をコードしているポリヌクレオチドのコドンが変更されていることを指す。ほとんどのアミノ酸は数種類のコドンによって表される（「同義語（ｓｙｎｏｎｙｍｓ）」または「同義（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）」コドンと呼ばれる）という点で遺伝暗号は縮重しているにもかかわらず、特定の生物によるコドン使用頻度は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに対して偏りがあることがよく知られている。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、機能または起源となる祖先が共通している遺伝子、高発現しているタンパク質対コピー数が少ないタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して、より高い可能性がある。いくつかの実施形態において、ＧＬＡ酵素をコードしているポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物および／または細胞型からの産生を最適化するためにコドン最適化されてもよく、それがＧＣ含量、潜在的なスプライス部位、転写終結シグナル、ＲＮＡ安定性に影響し得るモチーフ、および核酸の二次構造、ならびに目的とする他の任意の因子に影響を及ぼす。
「調節配列」は、本明細書において、本出願のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現のために必要または有利である全てのコンポーネントを含む意味である。各調節配列は、ポリペプチドをコードしている核酸配列に対して、天然であってもよく、または外来性であってもよい。このような調節配列としては、それらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列、および転写ターミネーターがあげられる。最低でも、調節配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。調節配列は、ポリペプチドをコードしている核酸配列のコード領域と調節配列とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーと共に提供されてもよい。
「作動可能に連結された」は、本明細書において、目的とするポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節配列が指示または制御するように、調節配列が、目的とするポリヌクレオチドに対して適切な位置に配置されている（すなわち、機能的な関係がある）構成と定義される。
「プロモーター配列」は、目的とするポリヌクレオチド（例えばコード配列など）の発現のための、宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的とするポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選ばれた宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列（変異プロモーター、切断型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含む）であってもよく、宿主細胞と同種または異種のいずれかの、細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。
「適切な反応条件」は、酵素的変換反応溶液における条件（例えば、酵素負荷の範囲、温度、ｐＨ、バッファー、共溶媒など）であって、その条件下で、本出願のＧＬＡポリペプチドが基質を所望の生成化合物に変換することができる条件を指し、例示的な「適切な反応条件」は、本出願中に示され、実施例によって例証されている。「酵素負荷」は、反応開始時における反応混合物中のコンポーネントの濃度または量を指す。酵素的変換反応プロセスの文脈における「基質」は、ＧＬＡポリペプチドが作用する化合物または分子を指す。酵素的変換プロセスの文脈における「生成物」は、ＧＬＡポリペプチドの基質に対する作用によって生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、微生物細胞、哺乳動物細胞、またはその他の適切な細胞の集団を、任意の適切な条件下で（例えば、液体培地、ゲル培地、または固体培地を用いて）成長させることを指す。
組換えポリペプチドは、当該技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して産生され得る。目的とする野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、ベクター（例えば、プラスミド）にクローニングされ、所望の宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ細胞、またはＣＨＯ細胞）など）において発現され得る。組換えポリペプチドのバリアントは、当該技術分野で知られている種々の方法によって生成され得る。実際に、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術が存在する。加えて、変異誘発キットは、多くの分子生物学供給業者からも入手が可能である。定められたアミノ酸における特定の置換（部位特異的）、遺伝子の限局された領域における特異的またはランダム変異（位置特異的）、または遺伝子全体にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を生じさせるための方法が利用可能である。酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法が当業者に知られており、そのような方法としては、それらに限定されないが、ＰＣＲを用いた一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異導入、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、および化学的飽和変異誘発、または当業者に知られている任意の他の適切な方法があげられる。ＤＮＡおよびタンパク質工学に用いられる方法の非限定的な例は、以下の特許：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号に示されている。バリアントは、産生後、任意の所望の特性（例えば、高いもしくは増加した活性または低いもしくは低下した活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングしてもよい。いくつかの実施形態において、「組換えＧＬＡポリペプチド」（本明細書において、「操作されたＧＬＡポリペプチド」、「バリアントＧＬＡ酵素」、および「ＧＬＡバリアント」とも呼ばれる）が使用される。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡコンストラクトである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされているポリペプチドを適切な宿主内で発現させることできる、適切な調節配列に作動可能に連結されている、発現ベクターである。いくつかの実施形態において、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を促進するための、ＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されているプロモーター配列を有し、いくつかの実施形態において、転写終結配列も含む。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法ベクター」は、ポリヌクレオチド配列を細胞に送達するために適切なビヒクルまたはキャリアを指す。いくつかの実施形態において、ベクターは、細胞または組織に送達するために、遺伝子（例えば、治療遺伝子）またはポリヌクレオチド配列をカプセル化し、ベクターには、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）、および非ウイルスベクター（例えば、リポソーム）が含まれるが、それらに限定されない。所与の設定のために適切な任意のビヒクルが用いられるため、本発明は、いかなる特定の遺伝子療法ベクターに限定されることも意図するものではない。遺伝子療法ベクターは、遺伝子を特定の種または宿主に送達するために設計されてもよく、またはより一般的な利用可能性が見いだされ得る。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含み、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、用語「産生する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」は、細胞による、タンパク質および／またはその他の化合物の産生を指す。この用語は、それらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含むことが意図されている。いくつかの実施形態において、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、転写終結配列など）は、その配列が作動可能に連結されている別の配列と天然では結合されていない場合、その別の配列に対して「組換え」または「異種」である。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、ＧＬＡバリアントをコードしているポリヌクレオチド）を含む発現ベクターのために適切な宿主を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、当該技術分野で知られている組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。
用語「アナログ」は、参照ポリペプチドに対して、７０％を超える配列同一性を有するが１００％未満の配列同一性（例えば、７５％超、７８％超、８０％超、８３％超、８５％超、８８％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、「アナログ」は、１つまたはそれを超える天然に存在しないアミノ酸残基（ホモアルギニン、オルニチン、およびノルバリンが含まれるが、それらに限定されない）、ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態において、アナログは、１つまたはそれを超えるＤ－アミノ酸残基と、２つまたはそれより多いアミノ酸残基間の非ペプチド結合も含有する。
用語「治療薬」は、病変の徴候または症状が現れている対象に投与される化合物であって、有益なまたは望ましい医学的効果を有する化合物を指す。
用語「医薬組成物」は、本発明に包含される医薬的有効量の操作されたＧＬＡポリペプチドと、許容され得るキャリアとを含み、哺乳動物対象（例えば、ヒト）における医薬用途に適した組成物を指す。
用語「遺伝子療法」は、疾患の処置または予防のために（ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｓｅａｓｅ）細胞または組織を改変するために、遺伝子、ポリデオキシリボヌクレオチド、またはポリヌクレオチド配列を、それらの細胞または組織に、遺伝子療法ベクターを用いて送達することを指す。遺伝子療法は、疾患の原因となる変異遺伝子をその遺伝子の健常なコピーで置き換えること、または不適切に機能している変異遺伝子を不活性化もしくは「ノックアウトすること」を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子療法は、患者における疾患の処置に用いられる。
用語「ｍＲＮＡ療法」は、疾患の処置または予防のために細胞または組織を改変するために、ｍＲＮＡポリリボヌクレオチド配列を、それらの細胞または組織に送達することを指す。いくつかの実施形態において、細胞または組織に送達するためのｍＲＮＡポリヌクレオチド配列は、例えば、それらに限定されないが、リポソームに製剤化される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ療法は、患者における疾患の処置に用いられる。
用語「細胞療法」は、疾患の処置または予防のために、外因的に改変された生細胞を患者に送達して、欠損している遺伝子を供給することを指す。改変された細胞は、次に、体内に再導入される。
用語「有効量」は、所望の結果をもたらすために十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験方法を用いることによって、有効量がどの程度であるかを決定することができる。
用語「単離された」および「精製された」は、分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）またはその他のコンポーネントであって、天然でその分子またはコンポーネントと一緒に存在する少なくとも１つのその他のコンポーネントから取り出された分子またはその他のコンポーネントを指すために用いられる。用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とはせず、むしろ相対的な定義を意図している。
用語「対象」は、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、および実験動物（例えば、げっ歯類およびウサギ（ｌａｇａｍｏｒｐｈｓ））を包含する。この用語は、雌ならびに雄を包含することが意図されている。
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、疾患について評価されているか、処置されているか、または疾患を経験しているあらゆる対象を意味する。
用語「乳児」は、生後１か月からおよそ１歳までの期間の小児を指す。本明細書で使用される場合、用語「新生児」は、出生から生後２８日目までの期間の小児を指す。用語「未熟児」は、妊娠満２０週後であるが妊娠満期には至らず、一般に出生時体重が約５００～約２４９９ｇの乳児を指す。「極低出生体重乳児」は、出生時体重が１５００ｇ未満の乳児を指す。
本明細書で使用される場合、用語「小児」は、処置または研究手順の同意に関する法的年齢に達していない者を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、出生から青年期までの者を指す。
本明細書で使用される場合、用語「成人」は、前記に関係する法域に関する法的年齢（例えば、米国では１８歳）に達した者を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、完全に成長して成熟したあらゆる生物を指す。いくつかの実施形態において、用語「若年成人」は、１８歳未満であるが、性的成熟に達した者を指す。
本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、少なくとも１つの本発明の操作されたＧＬＡを含む製品であって、任意の適切な使用を意図する製品（例えば、医薬組成物、食事／栄養サプリメント、飼料）を包含する。
用語「投与」および組成物を「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、本発明の組成物を対象に（例えば、ファブリー病の影響に苦しんでいる者に）与えることを意味する。
用語「キャリア」は、医薬組成物に関連して使用される場合、任意の標準的な医薬キャリア、バッファー、および賦形剤（例えば、安定剤、保存剤、アジュバント）を意味する。
用語「医薬的に許容され得る」は、いかなる望ましくない生物学的影響も引き起こすことなく、またはその材料を含有する成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく投与することができる材料であって、所望の生物学的活性を有する材料を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、活性医薬成分（ＡＰＩ（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）；例えば、本発明の操作されたＧＬＡポリペプチド）とは異なる、任意の医薬的に許容され得る添加剤、キャリア、希釈剤、アジュバント、またはその他の成分を指す。賦形剤は，典型的には、製剤化および／または投与目的で含有させる。
用語「治療有効量」は、疾患／状態の症状に関連して使用される場合、疾患／状態の１つまたはそれを超える症状を改善、減弱、もしくは解消させるか、または症状（単数または複数）の発症を予防するもしくは遅らせる化合物（例えば、操作されたＧＬＡポリペプチド）の量および／または濃度を指す。
用語「治療有効量」は、疾患／状態に関連して使用される場合、疾患／状態を改善、減弱、もしくは解消させる組成物（例えば、操作されたＧＬＡポリペプチド）の量および／または濃度を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、研究者、医師、獣医、またはその他の臨床家が探索する組織、系、または動物対象による生物学的（例えば、医学的）応答を誘発する組成物の量に関して使用される。
用語「処置すること」、「処置する」、および「処置」は、防止的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）（例えば、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））処置、ならびに待機的処置を包含することが意図されている。
操作されたＧＬＡの発現および活性：
酵母コドン最適化成熟ヒトＧＬＡの分泌発現は、合成マウスＩＧシグナルペプチドを用いて実現された。クローンは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｐＣＤＮＡ３．１（＋））ベクターから発現させた。この手法によって、蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４－ＭＵＧａｌ）に対して測定可能な活性を有する上清が得られた。
いくつかの実施形態において、配列番号８と比較して、類似の安定性および改善された細胞取り込みを有する変異の多様性を同定するために、コンビナトリアルライブラリーを構築し、配列番号８に由来するＧＬＡバリアントを生成させた。等しい体積の上清を、非チャレンジ条件（インキュベーションなし、ｐＨ４．６）において、または低ｐＨ（３．９～４．２）、中性ｐＨ（７．０～７．６）、もしくはヒト血清（生理的ｐＨ７．１～８．２）環境で１時間インキュベートした後にスクリーニングした。親ＧＬＡに対するＧＬＡバリアントの改善（倍数）に基づいて、増加したＧＬＡの発現またはＧＬＡの比活性による活性を有するＧＬＡバリアントを同定した。チャレンジ条件下で観察された改善（倍数）を、非チャレンジ条件下で観察された改善（倍数）で除算することによって、増加した安定性を有するＧＬＡバリアントが同定された。この手法によって、増加した発現に基づく、しかしながら極端なｐＨにおける比活性の変化を伴わない、バリアントの選択に対するバイアスが低減される。その後のＧＬＡライブラリーへの登録のために、複合活性スコア（全３条件についての改善（倍数）の積）および安定性（安定性スコアの積）を使用して、改善されたバリアントにおける変異をランク付けした。追加の実施形態において、実施例に記載されている追加の方法および配列を使用した。
操作されたＧＬＡ：
いくつかの実施形態において、改善された特性を示す操作されたＧＬＡは、配列番号２、８、４８、１５８、３７２、および／または３７４と、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号２、８、４８、１５８、３７２、および／または３７４と比較して、１つまたはそれを超えるアミノ酸位置において（例えば、配列番号２、８、４８、１５８、３７２、および／もしくは３７４、または配列番号２、８、４８、１５８、３７２、および／もしくは３７４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはそれより大きいアミノ酸配列同一性を有する配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０、またはそれより多くのアミノ酸位置において）、アミノ酸残基の相違を有する。いくつかの実施形態において、配列番号５と比較した、１つまたはそれを超える位置における残基の相違は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１に列挙されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、配列番号２、８、４８、１５８、３７２、および／または３７４を含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、４４、４４／２１７、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２、４４／２１７／３２２／３３７、４４／２４７、４４／２４７／３０２、４４／２４７／３０２／３２２、４４／２４７／３２２、４４／２４７／３３７、４４／２４７／３６２、４４／３０２、４４／３３７、４４／３７３、２１７／３２２、２１７／３７３、２４７／３２２、２４７／３６２、３０２／３２２／３６２／３７３、３０２／３３７、３１６、３１６／３３７、３２２、３２２／３３７、３６２／３７３、および３７３（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、４４Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ／３３７Ａ、４４Ｌ／２４７Ｎ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３０２Ｑ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３３７Ａ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３６２Ｋ、４４Ｌ／３０２Ｑ、４４Ｌ／３３７Ａ、４４Ｌ／３７３Ｒ、２１７Ｆ／３２２Ｍ、２１７Ｆ／３７３Ｒ、２４７Ｎ／３２２Ｍ、２４７Ｎ／３６２Ｋ、３０２Ｑ／３２２Ｍ／３６２Ｋ／３７３Ｒ、３０２Ｑ／３３７Ａ、３１６Ｌ、３１６Ｌ／３３７Ａ、３２２Ｍ、３２２Ｍ／３３７Ａ、３６２Ｋ／３７３Ｒ、および３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｒ４４Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｋ３０２Ｑ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｑ３６２Ｋ、Ｒ４４Ｌ／Ｋ３０２Ｑ、Ｒ４４Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｋ３７３Ｒ、Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３７３Ｒ、Ｄ２４７Ｎ／Ｉ３２２Ｍ、Ｄ２４７Ｎ／Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ／Ｑ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ、Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｄ３１６Ｌ、Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｉ３２２Ｍ、Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｑ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ、およびＫ３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０／３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／２１７／２４７／２６１／２７１／３０２／３１６／３２２／３３７／３６２／３６８／３７３／３９２、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２／３３７、１６６／３６２、２１７／３７３、および３６２／３７３（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３０２Ｑ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ／３６２Ｋ／３６８Ｗ／３７３Ｒ／３９２Ｍ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１６６Ａ／３６２Ｋ、２１７Ｆ／３７３Ｒ、および３６２Ｋ／３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ／Ｑ３６２Ｋ／Ａ３６８Ｗ／Ｋ３７３Ｒ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１６６Ａ／Ｑ３６２Ｋ、Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３７３Ｒ、およびＱ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、７、７／４８／６８、７／４８／６８／１２０／２８２／２９９、７／４８／１３０／２８２、７／４８／１８０、７／６８／１３０／２８２／３６５、７／６８／１８０、７／８８／１２０／３０５／３６５、７／１２０、７／１３０、７／２８２、７／３０５、７／３０５／３６５、７／３６５、３９、４７、４７／８７／９５／９６／１５８／１６２、４７／９５、４７／２７３、４７／３４３、４８、４８／６８、４８／１８０／２８２、４８／２８２、４８／２８２／３０５、６７／１８０、６８、６８／２９９／３００、７１、８７／９１／９５／９６／１５８／１６２、８７／９１／９５／９６／２０６／３４３、８７／９６／１５５／２７３／３４３、８８、９１／９５、９１／９５／９６、９２、９３、９６、９６／２７３、９６／３１２／３４３、１２０、１２０／２９９／３０５、１５１、１５８、１５８／１６２／２７３、１６２、１６２／２７３、１６２／３４３、１６６、１７８、１８０、１８１、２０６、２１７、２７１、２７３、２７３／３４３、２８２、２８２／３６５、２９３／３９１、２９９／３００、２９９／３００／３０５／３６５、３００、３０１、３０５、３０５／３６５、３１４、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３６３、３６５、３７０、３８９、３９３、３９４、３９６／３９８、３９７、および３９８，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、７Ｌ、７Ｌ／４８Ｄ／６８Ｅ、７Ｌ／４８Ｄ／６８Ｅ／１２０Ｈ／２８２Ｎ／２９９Ｒ、７Ｌ／４８Ｄ／１３０Ｅ／２８２Ｎ、７Ｌ／４８Ｄ／１８０Ｇ、７Ｌ／６８Ｅ／１３０Ｅ／２８２Ｎ／３６５Ｖ、７Ｌ／６８Ｅ／１８０Ｇ、７Ｌ／８８Ａ／１２０Ｈ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、７Ｌ／１２０Ｈ、７Ｌ／１３０Ｅ、７Ｌ／２８２Ｎ、７Ｌ／３０５Ｇ、７Ｌ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、７Ｌ／３６５Ｖ、３９Ｖ、４７Ｄ、４７Ｄ／８７Ｋ／９５Ｅ／９６Ｌ／１５８Ｒ／１６２Ｈ、４７Ｄ／９５Ｅ、４７Ｄ／２７３Ｐ、４７Ｄ／３４３Ｇ、４７Ｖ、４８Ｄ、４８Ｄ／６８Ｅ、４８Ｄ／１８０Ｇ／２８２Ｎ、４８Ｄ／２８２Ｎ、４８Ｄ／２８２Ｎ／３０５Ｇ、６７Ｔ／１８０Ｇ、６８Ｅ、６８Ｅ／２９９Ｒ／３００Ｉ、７１Ｐ、８７Ｋ／９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ／１５８Ａ／１６２Ｋ、８７Ｋ／９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ／２０６Ｓ／３４３Ｇ、８７Ｋ／９６Ｉ／１５５Ｎ／２７３Ｐ／３４３Ｇ、８８Ａ、９１Ｑ／９５Ｅ、９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ、９２Ｆ、９２Ｔ、９３Ｉ、９６Ｌ、９６Ｌ／２７３Ｐ、９６Ｌ／３１２Ｑ／３４３Ｇ、１２０Ｈ、１２０Ｈ／２９９Ｒ／３０５Ｇ、１５１Ｌ、１５８Ａ、１５８Ａ／１６２Ｋ／２７３Ｇ、１５８Ｒ、１６２Ｈ／３４３Ｄ、１６２Ｋ、１６２Ｋ／２７３Ｐ、１６２Ｓ、１６６Ｋ、１７８Ｇ、１７８Ｓ、１８０Ｇ、１８０Ｌ、１８０Ｔ、１８０Ｖ、１８１Ａ、２０６Ｋ、２０６Ｓ、２１７Ｋ、２７１Ｒ、２７３Ｐ、２７３Ｐ／３４３Ｇ、２８２Ｎ、２８２Ｎ／３６５Ｖ、２９３Ｐ／３９１Ａ、２９９Ｒ／３００Ｉ、２９９Ｒ／３００Ｉ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、３００Ｉ、３０１Ｍ、３０５Ｇ、３０５Ｇ／３６５Ｖ、３１４Ａ、３３３Ｆ、３３３Ｇ、３３６Ｖ、３３７Ｒ、３４３Ｄ、３４３Ｇ、３４５Ａ、３４５Ｑ、３６３Ｑ、３６５Ａ、３６５Ｑ、３６５Ｖ、３７０Ｇ、３８９Ｋ、３９３Ｖ、３９４Ｋ、３９６Ｇ／３９８Ｔ、３９７Ａ、３９８Ａ、３９８Ｐ、３９８Ｓ、および３９８Ｖ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｒ７Ｌ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｙ１２０Ｈ／Ｄ２８２Ｎ／Ｑ２９９Ｒ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｄ１３０Ｅ／Ｄ２８２Ｎ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｆ１８０Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｑ６８Ｅ／Ｄ１３０Ｅ／Ｄ２８２Ｎ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｑ６８Ｅ／Ｆ１８０Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｑ８８Ａ／Ｙ１２０Ｈ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｙ１２０Ｈ、Ｒ７Ｌ／Ｄ１３０Ｅ、Ｒ７Ｌ／Ｄ２８２Ｎ、Ｒ７Ｌ／Ｎ３０５Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｆ３６５Ｖ、Ｅ３９Ｖ、Ｔ４７Ｄ、Ｔ４７Ｄ／Ｒ８７Ｋ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ｌ１５８Ｒ／Ｒ１６２Ｈ、Ｔ４７Ｄ／Ｓ９５Ｅ、Ｔ４７Ｄ／Ｓ２７３Ｐ、Ｔ４７Ｄ／Ｋ３４３Ｇ、Ｔ４７Ｖ、Ｅ４８Ｄ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｅ４８Ｄ／Ｆ１８０Ｇ／Ｄ２８２Ｎ、Ｅ４８Ｄ／Ｄ２８２Ｎ、Ｅ４８Ｄ／Ｄ２８２Ｎ／Ｎ３０５Ｇ、Ｐ６７Ｔ／Ｆ１８０Ｇ、Ｑ６８Ｅ、Ｑ６８Ｅ／Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ、Ｓ７１Ｐ、Ｒ８７Ｋ／Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ｌ１５８Ａ／Ｒ１６２Ｋ、Ｒ８７Ｋ／Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ａ２０６Ｓ／Ｋ３４３Ｇ、Ｒ８７Ｋ／Ｋ９６Ｉ／Ｈ１５５Ｎ／Ｓ２７３Ｐ／Ｋ３４３Ｇ、Ｑ８８Ａ、Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ、Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ、Ｈ９２Ｆ、Ｈ９２Ｔ、Ｖ９３Ｉ、Ｋ９６Ｌ、Ｋ９６Ｌ／Ｓ２７３Ｐ、Ｋ９６Ｌ／Ｐ３１２Ｑ／Ｋ３４３Ｇ、Ｙ１２０Ｈ、Ｙ１２０Ｈ／Ｑ２９９Ｒ／Ｎ３０５Ｇ、Ｄ１５１Ｌ、Ｌ１５８Ａ、Ｌ１５８Ａ／Ｒ１６２Ｋ／Ｓ２７３Ｇ、Ｌ１５８Ｒ、Ｒ１６２Ｈ／Ｋ３４３Ｄ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｋ／Ｓ２７３Ｐ、Ｒ１６２Ｓ、Ｐ１６６Ｋ、Ｗ１７８Ｇ、Ｗ１７８Ｓ、Ｆ１８０Ｇ、Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｔ、Ｆ１８０Ｖ、Ｑ１８１Ａ、Ａ２０６Ｋ、Ａ２０６Ｓ、Ｒ２１７Ｋ、Ａ２７１Ｒ、Ｓ２７３Ｐ、Ｓ２７３Ｐ／Ｋ３４３Ｇ、Ｄ２８２Ｎ、Ｄ２８２Ｎ／Ｆ３６５Ｖ、Ｌ２９３Ｐ／Ｑ３９１Ａ、Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ、Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｌ３００Ｉ、Ｒ３０１Ｍ、Ｎ３０５Ｇ、Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３３３Ｆ、Ｓ３３３Ｇ、Ｉ３３６Ｖ、Ｐ３３７Ｒ、Ｋ３４３Ｄ、Ｋ３４３Ｇ、Ｖ３４５Ａ、Ｖ３４５Ｑ、Ｌ３６３Ｑ、Ｆ３６５Ａ、Ｆ３６５Ｑ、Ｆ３６５Ｖ、Ｓ３７０Ｇ、Ｔ３８９Ｋ、Ｓ３９３Ｖ、Ｌ３９４Ｋ、Ｄ３９６Ｇ／Ｌ３９８Ｔ、Ｌ３９７Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｌ３９８Ｐ、Ｌ３９８Ｓ、およびＬ３９８Ｖ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号１５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、２４／２０２、３９／４７、３９／４７／２１７、３９／１５１、３９／２８２／３３７／３９８、３９／３３７／３４３／３９８、３９／３９３／３９８、４７／１３０、４７／１５１、４７／３４３／３４５／３９３、４８、４８／６８、４８／６８／２１７／３３３／３９１／３９３、４８／６８／３３３、４８／２１７、４８／３３３、４８／３４５／３９３、４８／３９３、５９／１４３、６８、６８／３４５、１３０、１３０／１５８、１３０／１５８／３９３、１３０／３４５／３９３、１４３／２７１、１４３／３３３、１４３／３８７、１５１、１５１／１５８／２１７／３４３／３４５／３９３、１５１／２０６／２８２／３３７／３４３／３４５／３９８、１５１／２８２／３９３、１５１／３４５／３９３／３９８、１５１／３９３、１５８、１５８／３９３、２０２、２０６、２０６／２１７、２１７、２１７／３３３、２１７／３３７／３４５／３９８、２７１、２８２／３９３、３３３、３３３／３４５、３３７／３４３／３４５／３９８、３４３、３４３／３４５／３９３／３９８、３９３、および３９３／３９８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号１５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、２４Ｓ／２０２Ｎ、３９Ｖ／４７Ｄ、３９Ｖ／４７Ｖ／２１７Ｋ、３９Ｖ／１５１Ｌ、３９Ｖ／２８２Ｎ／３３７Ｒ／３９８Ａ、３９Ｖ／３３７Ｒ／３４３Ｇ／３９８Ａ、３９Ｖ／３９３Ｖ／３９８Ａ、４７Ｖ／１３０Ｅ、４７Ｖ／１５１Ｌ、４７Ｖ／３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、４８Ｄ、４８Ｄ／６８Ｅ、４８Ｄ／６８Ｅ／２１７Ｋ／３３３Ｆ／３９１Ａ／３９３Ｖ、４８Ｄ／６８Ｅ／３３３Ｆ、４８Ｄ／２１７Ｋ、４８Ｄ／３３３Ｆ、４８Ｄ／３３３Ｇ、４８Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、４８Ｄ／３９３Ｖ、５９Ａ／１４３Ｓ、６８Ｅ、６８Ｅ／３４５Ｑ、１３０Ｅ、１３０Ｅ／１５８Ｒ、１３０Ｅ／１５８Ｒ／３９３Ｖ、１３０Ｅ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、１４３Ｓ／２７１Ｎ、１４３Ｓ／３３３Ｎ、１４３Ｓ／３８７Ｎ、１５１Ｌ、１５１Ｌ／１５８Ｒ／２１７Ｋ／３４３Ｇ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、１５１Ｌ／２０６Ｓ／２８２Ｎ／３３７Ｒ／３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９８Ａ、１５１Ｌ／２８２Ｎ／３９３Ｖ、１５１Ｌ／３４５Ｑ／３９３Ｖ／３９８Ａ、１５１Ｌ／３９３Ｖ、１５８Ｒ、１５８Ｒ／３９３Ｖ、２０２Ｎ、２０６Ｓ、２０６Ｓ／２１７Ｋ、２１７Ｋ、２１７Ｋ／３３３Ｆ、２１７Ｋ／３３３Ｇ、２１７Ｋ／３３７Ｒ／３４５Ｑ／３９８Ａ、２７１Ｎ、２８２Ｎ／３９３Ｖ、３３３Ｆ／３４５Ｑ、３３３Ｇ、３３３Ｎ、３３７Ｒ／３４３Ｇ／３４５Ｑ／３９８Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ／３９８Ａ、３９３Ｖ、および３９３Ｖ／３９８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｄ２４Ｓ／Ｄ２０２Ｎ、Ｅ３９Ｖ／Ｔ４７Ｄ、Ｅ３９Ｖ／Ｔ４７Ｖ／Ｒ２１７Ｋ、Ｅ３９Ｖ／Ｄ１５１Ｌ、Ｅ３９Ｖ／Ｄ２８２Ｎ／Ｐ３３７Ｒ／Ｌ３９８Ａ、Ｅ３９Ｖ／Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｇ／Ｌ３９８Ａ、Ｅ３９Ｖ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｔ４７Ｖ／Ｄ１３０Ｅ、Ｔ４７Ｖ／Ｄ１５１Ｌ、Ｔ４７Ｖ／Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｆ／Ｑ３９１Ａ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｓ３３３Ｆ、Ｅ４８Ｄ／Ｒ２１７Ｋ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３３３Ｆ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３３３Ｇ、Ｅ４８Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３９３Ｖ、Ｃ５９Ａ／Ｃ１４３Ｓ、Ｑ６８Ｅ、Ｑ６８Ｅ／Ｖ３４５Ｑ、Ｄ１３０Ｅ、Ｄ１３０Ｅ／Ｌ１５８Ｒ、Ｄ１３０Ｅ／Ｌ１５８Ｒ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１３０Ｅ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｃ１４３Ｓ／Ａ２７１Ｎ、Ｃ１４３Ｓ／Ｓ３３３Ｎ、Ｃ１４３Ｓ／Ｅ３８７Ｎ、Ｄ１５１Ｌ、Ｄ１５１Ｌ／Ｌ１５８Ｒ／Ｒ２１７Ｋ／Ｋ３４３Ｇ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１５１Ｌ／Ａ２０６Ｓ／Ｄ２８２Ｎ／Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ｄ１５１Ｌ／Ｄ２８２Ｎ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１５１Ｌ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｄ１５１Ｌ／Ｓ３９３Ｖ、Ｌ１５８Ｒ、Ｌ１５８Ｒ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ２０２Ｎ、Ａ２０６Ｓ、Ａ２０６Ｓ／Ｒ２１７Ｋ、Ｒ２１７Ｋ、Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｆ、Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｇ、Ｒ２１７Ｋ／Ｐ３３７Ｒ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ａ２７１Ｎ、Ｄ２８２Ｎ／Ｓ３９３Ｖ、Ｓ３３３Ｆ／Ｖ３４５Ｑ、Ｓ３３３Ｇ、Ｓ３３３Ｎ、Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｇ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ｋ３４３Ｄ、Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｓ３９３Ｖ、およびＳ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０、１０／３９／４４／３２２、１０／３９／９２／２０６／２１７／２７１、１０／３９／９２／２４７、１０／３９／９２／２４７／２７１／３１６、１０／４４、１０／４４／４７／９２／２４７、１０／４４／４７／２６１／３０２／３２２／３６８、１０／４４／９２／３１６／３２２、１０／４４／２６１／３０２／３１６、１０／４４／３０２／３３７／３６８、１０／４７／２１７／２４７／３１６／３９２、１０／４７／２１７／３２２、１０／４７／２７１、１０／９２、１０／９２／２０６／２１７／２４７、１０／９２／２０６／２４７／３１６／３２２／３９２、１０／９２／２０６／２４７／３２２／３６８、１０／９２／２１７／２６１／３０２／３３７、１０／２０６／２１７／２７１、１０／２０６／２４７、１０／２０６／２６１／２７１／３１６、１０／２６１、１０／２７１／３０２、１０／３０２、１０／３０２／３１６、１０／３０２／３２２／３３７、１０／３１６／３２２、１０／３３７／３９２、１０／３６８、３９／４４／９２／１６２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４４／９２／２１７／３２２、３９／４４／９２／２４７／２７１／３０２、３９／４７／９２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／２４７／３０２／３１６／３３７／３６８、３９／９２／３１６／３２２、３９／２４７／２７１、３９／２４７／２７１／３１６、３９／３２２、４４／４７／９２／２０６／２１７／３１６／３２２、４４／４７／９２／２４７／２６１／２７１／３１６／３３７／３６８、４４／４７／２０６／２１７／２４７／２７１／３２２、４４／４７／２４７／３２２／３６８、４４／４７／３０２／３１６／３２２、４４／９２／２０６／２４７／３６８、４４／２０６／３３７、４４／２４７／２６１／３０２／３１６、４４／２４７／２６１／３０２／３１６／３２２、４７／９２／２４７／２７１、４７／２１７／３０２、４７／２４７、４７／２４７／２７１、８９／２１７／２４７／２６１／３０２／３１６、９２／２１７／２７１、９２／２４７、９２／２４７／２７１／３２２、９２／２４７／３０２／３２２／３３７、９２／２７１／３３７、９２／３０２、９２／３１６、２０６／２１７／２７１／３９２、２１７／２４７／３１６／３２２／３３７／３６８、２４７、２４７／２７１、２４７／３０２、２７１、２７１／３０２／３２２、２７１／３１６／３２２、３０２／３２２／３６８、および３６８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｐ、１０Ｐ／３９Ｅ／４４Ｒ／３２２Ｉ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３１６Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ、１０Ｐ／４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ／４７Ｔ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３６８Ａ、１０Ｐ／４４Ｒ／９２Ｈ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、１０Ｐ／４４Ｒ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ／３０２Ｋ／３３７Ｐ／３６８Ａ、１０Ｐ／４７Ｔ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３９２Ｔ、１０Ｐ／４７Ｔ／２１７Ｒ／３２２Ｉ、１０Ｐ／４７Ｔ／２７１Ａ、１０Ｐ／９２Ｈ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２４７Ｄ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３２２Ｉ／３９２Ｔ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３２２Ｉ／３６８Ａ、１０Ｐ／９２Ｈ／２１７Ｒ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３３７Ｐ、１０Ｐ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ、１０Ｐ／２０６Ａ／２４７Ｄ、１０Ｐ／２０６Ａ／２６１Ｇ／２７１Ａ／３１６Ｄ、１０Ｐ／２６１Ｇ、１０Ｐ／２７１Ａ／３０２Ｋ、１０Ｐ／３０２Ｋ、１０Ｐ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、１０Ｐ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３３７Ｐ、１０Ｐ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、１０Ｐ／３３７Ｐ／３９２Ｔ、１０Ｐ／３６８Ａ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／１６２Ｍ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／２１７Ｒ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３０２Ｋ、３９Ｅ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４７Ｔ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／３６８Ａ、３９Ｅ／４７Ｔ／２４７Ｄ、３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３３７Ｐ／３６８Ａ、３９Ｅ／９２Ｈ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／２４７Ｄ／２７１Ａ、３９Ｅ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３１６Ｄ、３９Ｅ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／２７１Ａ／３１６Ｄ／３３７Ｐ／３６８Ａ、４４Ｒ／４７Ｔ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／２４７Ｄ／３２２Ｉ／３６８Ａ、４４Ｒ／４７Ｔ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４４Ｒ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３６８Ａ、４４Ｒ／２０６Ａ／３３７Ｐ、４４Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、４４Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ、４７Ｔ／２１７Ｒ／３０２Ｋ、４７Ｔ／２４７Ｄ、４７Ｔ／２４７Ｄ／２７１Ａ、８９Ｉ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、９２Ｈ／２１７Ｒ／２７１Ａ、９２Ｈ／２４７Ｄ、９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３２２Ｉ、９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３３７Ｐ、９２Ｈ／２７１Ａ／３３７Ｐ、９２Ｈ／３０２Ｋ、９２Ｈ／３１６Ｄ、２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ／３９２Ｔ、２１７Ｒ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３２２Ｉ／３３７Ｐ／３６８Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｄ／２７１Ａ、２４７Ｄ／３０２Ｋ、２７１Ａ、２７１Ａ／３０２Ｋ／３２２Ｉ、２７１Ａ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３０２Ｋ／３２２Ｉ／３６８Ａ、および３６８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｔ１０Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｑ３０２Ｋ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ａ３３７Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ａ２６１Ｇ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ａ２６１Ｇ、Ｔ１０Ｐ／Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ａ３３７Ｐ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｒ１６２Ｍ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ、Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｍ３９Ｅ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｋ２０６Ａ／Ａ３３７Ｐ、Ｌ４４Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｌ４４Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｑ３０２Ｋ、Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ、Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｌ８９Ｉ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３２２Ｉ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ、Ｙ９２Ｈ／Ｈ２７１Ａ／Ａ３３７Ｐ、Ｙ９２Ｈ／Ｑ３０２Ｋ、Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ、Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３９２Ｔ、Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｎ２４７Ｄ、Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ、Ｈ２７１Ａ、Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ、Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、およびＷ３６８Ａ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
本発明は、組換えαガラクトシダーゼＡも提供し、前記は、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０／３６／９２／１６６／２４７／２６１／３１６／３９２、１０／３９、１０／３９／４４／４７／９２／２０６／２１７、１０／３９／４４／４７／３１６、１０／３９／４４／４７／３３７、１０／３９／４４／９２／１６６／２６１／３１６／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３９２、１０／３９／４４／９２／２１７／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／３０２／３２２、１０／３９／４４／１６６／２６１／２７１／３１６／３２２、１０／３９／４４／３９２、１０／３９／４７／９２／３３７、１０／３９／９２／１３１／１６６／２７１／３１６／３２２、１０／３９／９２／１６６／２１７／２４７／２７１、１０／３９／９２／２１７／３１６、１０／４４／４７／１６６／２６１／２７１、１０／４４／４７／１６６／２７１／３２２／３６８、１０／４４／４７／２１７／２７１／３１６／３２２、１０／４４／９２、１０／４４／９２／２１７／２４７／２７１／３０２／３１６／３９２、１０／４４／１６６／３０２、１０／４４／２０６／３１６／３２２、１０／４７／９２／１６６／２７１／３１６／３３７、１０／４７／９２／２７１／３０２、１０／４７／９２／３１６／３２２／３９２、１０／４７／１６６／２７１、１０／４７／１６６／３１６、１０／９２／１６６、１０／９２／１６６／２１７／２４７／２６１／２７１、１０／９２／１６６／２６１／２７１／３９２、１０／９２／１６６／２６１／３１６／３２２／３３７、１０／９２／１６６／３３７／３６８、１０／９２／３０２／３３７、１０／９２／３１６／３２２、１０／２０６、１０／２０６／２４７／２６１、１０／２１７／３２２、１０／２６１、１０／２６１／３３７／３９２、１０／３１６／３９２、１０／３６８、３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／３９２、３９／４４／４７／９２／２０６／２４７／２６１、３９／４４／４７／９２／２０６／３９２、３９／４４／４７／２０６／３３７／３６８／３９２、３９／４４／９２／１６６／２４７／２６１／３０２／３３７、３９／４４／１６６／２７１、３９／４４／１６６／２７１／３３７／３６８／３９２、３９／４７／９２／３１６／３２２、３９／４７／９２／３９２、３９／４７／１６６／２１７／２６１／３９２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／１６６／２１７／３９２、３９／９２／２６１／３０２、３９／１６６／２１７／２６１／３１６／３６８、３９／３２２、３９／３９２、４４／４７、４４／４７／９２／２１７／２７１、４４／４７／９２／２１７／３１６／３２２／３９２、４４／４７／９２／３９２、４４／４７／１６６、４４／４７／１６６／２７１、４４／４７／２４７／２７１／３９２、４４／３１６／３２２／３９２、４４／３３７、４７／１６６／２０６／２１７／２４７／３３７、４７／１６６／２１７／２７１／３３７、４７／２０６、４７／２１７／２４７／２６１、４７／２７１、５２／２１７／３０２／３１６、９２／１６６／２０６／２７１／３１６、９２／１６６／２１７／２６１／２７１／３９２、９２／１６６／２１７／３１６／３３７／３９２、９２／１６６／２４７、９２／１６６／３１６、９２／２０６／３２２、９２／２１７、９２／２１７／２７１／３３７、９２／２６１／２７１、９２／２７１、１６６／２１７／３１６／３２２／３３７、１６６／２４７／２７１／３１６、１６６／３１６／３２２／３３７、２０６／２１７、２１７／３９２、２４７／３１６、３１６／３２２／３６８、および３１６／３３７／３９２（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｔ／３６Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／２１７Ｆ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／３１６Ｌ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／３３７Ａ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３３７Ａ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／１３１Ｇ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２７１Ｈ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３２２Ｍ／３６８Ｗ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／４４Ｌ／９２Ｙ、１０Ｔ／４４Ｌ／９２Ｙ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３０２Ｑ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／４４Ｌ／１６６Ｓ／３０２Ｑ、１０Ｔ／４４Ｌ／２０６Ｋ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３３７Ａ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／２７１Ｈ／３０２Ｑ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、１０Ｔ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、１０Ｔ／４７Ｓ／１６６Ｓ／３１６Ｌ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ／２７１Ｈ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３３７Ａ／３６８Ｗ、１０Ｔ／９２Ｙ／３０２Ｑ／３３７Ａ、１０Ｔ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／２０６Ｋ、１０Ｔ／２０６Ｋ／２４７Ｎ／２６１Ａ、１０Ｔ／２１７Ｆ／３２２Ｍ、１０Ｔ／２６１Ａ、１０Ｔ／２６１Ａ／３３７Ａ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３６８Ｗ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／２４７Ｎ／２６１Ａ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／２０６Ｋ／３３７Ａ／３６８Ｗ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ／２６１Ａ／３０２Ｑ／３３７Ａ、３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３３７Ａ／３６８Ｗ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／３６８Ｗ、３９Ｍ／４７Ｓ／２４７Ｎ、３９Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／３９２Ｍ、３９Ｍ／９２Ｙ／２６１Ａ／３０２Ｑ、３９Ｍ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３６８Ｗ、３９Ｍ／３２２Ｍ、３９Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２１７Ｆ／２７１Ｈ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ、４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、４４Ｌ／４７Ｓ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、４４Ｌ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／３３７Ａ、４７Ｓ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／３３７Ａ、４７Ｓ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３３７Ａ、４７Ｓ／２０６Ｋ、４７Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ、４７Ｓ／２７１Ｈ、５２Ｎ／２１７Ｆ／３０２Ｑ／３１６Ｌ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２７１Ｈ／３１６Ｌ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３３７Ａ／３９２Ｍ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ、９２Ｙ／１６６Ｓ／３１６Ｌ、９２Ｙ／２０６Ｋ／３２２Ｍ、９２Ｙ／２１７Ｆ、９２Ｙ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３３７Ａ、９２Ｙ／２６１Ａ／２７１Ｈ、９２Ｙ／２７１Ｈ、１６６Ｓ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１６６Ｓ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３１６Ｌ、１６６Ｓ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、２０６Ｋ／２１７Ｆ、２１７Ｆ／３９２Ｍ、２４７Ｎ／３１６Ｌ、３１６Ｌ／３２２Ｍ／３６８Ｗ、および３１６Ｌ／３３７Ａ／３９２Ｍ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｐ１０Ｔ／Ｋ３６Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｗ１３１Ｇ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｉ３２２Ｍ／Ａ３６８Ｗ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ｋ３０２Ｑ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７

Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ａ２０６Ｋ、Ｐ１０Ｔ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｇ２６１Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｇ２６１Ａ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ２４７Ｎ、Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｇ２６１Ａ／Ｋ３０２Ｑ、Ｅ３９Ｍ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｉ３２２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ａ２０６Ｋ、Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｄ５２Ｎ／Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｉ３２２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ、Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ、Ｈ９２Ｙ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｈ９２Ｙ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ、Ｒ２１７Ｆ／Ｔ３９２Ｍ、Ｄ２４７Ｎ／Ｄ３１６Ｌ、Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ａ３６８Ｗ、およびＤ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡポリペプチド配列は、配列番号４～７０２のうちの偶数番号の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、本発明に包含される操作されたＧＬＡポリペプチドの機能的フラグメントを含む。機能的フラグメントは、その機能的フラグメントが由来する操作されたＧＬＡポリペプチド（すなわち、親の操作されたＧＬＡ）の活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を有する。機能的フラグメントは、操作されたＧＬＡの親配列の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらには９９％を含む。いくつかの実施形態において、機能的フラグメントは、５未満、１０未満、１５未満、１０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、および５０未満のアミノ酸だけ切り詰められている。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、遺伝子発現を調節してポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生じさせる、１つまたはそれを超える異種または同種制御配列に作動可能に連結されている。操作されたＧＬＡポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現コンストラクトは、対応するＧＬＡポリペプチドを発現させるために、適切な宿主細胞に導入することができる。
当業者に明らかなように、タンパク質配列が利用できること、および各種のアミノ酸に対応するコドンの知識から、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドが説明される。遺伝暗号の縮重（縮重においては、同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる）によって、その全てが操作されたＧＬＡポリペプチドをコードする、極めて多数の核酸を作成することが可能になる。よって、当業者は、特定のアミノ酸配列の知識を持っていれば、タンパク質のアミノ酸配列を変えないやり方で、１つまたはそれを超えるコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作成することが可能である。この点で、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする、可能なコドンの選択に基づいて組み合わせを選択することによって作成し得る、ポリヌクレオチドの可能な各バリエーションの全てを具体的に意図しており、全てのそのようなバリエーションが本明細書に記載のあらゆるポリペプチド（表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１中に提供されるバリアントが含まれる）について具体的に開示されているものと考えるべきである。
種々の実施形態において、コドンは、タンパク質が産生される宿主細胞に適合するように選択されることが好ましい。例えば、バクテリアにおいて用いられる好ましいコドンが、バクテリアにおける発現のために用いられる。結果として、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、完全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超において、好ましいコドンを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、コドンがヒト細胞または組織における発現のために最適化された、組換えポリヌクレオチド配列を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号７に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号３～７０１のうちの奇数番号の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、４４、４４／２１７、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２、４４／２１７／３２２／３３７、４４／２４７、４４／２４７／３０２、４４／２４７／３０２／３２２、４４／２４７／３２２、４４／２４７／３３７、４４／２４７／３６２、４４／３０２、４４／３３７、４４／３７３、２１７／３２２、２１７／３７３、２４７／３２２、２４７／３６２、３０２／３２２／３６２／３７３、３０２／３３７、３１６、３１６／３３７、３２２、３２２／３３７、３６２／３７３、および３７３（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、４４Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ／３３７Ａ、４４Ｌ／２４７Ｎ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３０２Ｑ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３２２Ｍ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３３７Ａ、４４Ｌ／２４７Ｎ／３６２Ｋ、４４Ｌ／３０２Ｑ、４４Ｌ／３３７Ａ、４４Ｌ／３７３Ｒ、２１７Ｆ／３２２Ｍ、２１７Ｆ／３７３Ｒ、２４７Ｎ／３２２Ｍ、２４７Ｎ／３６２Ｋ、３０２Ｑ／３２２Ｍ／３６２Ｋ／３７３Ｒ、３０２Ｑ／３３７Ａ、３１６Ｌ、３１６Ｌ／３３７Ａ、３２２Ｍ、３２２Ｍ／３３７Ａ、３６２Ｋ／３７３Ｒ、および３７３Ｒ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｒ４４Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｋ３０２Ｑ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ２４７Ｎ／Ｑ３６２Ｋ、Ｒ４４Ｌ／Ｋ３０２Ｑ、Ｒ４４Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｒ４４Ｌ／Ｋ３７３Ｒ、Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３７３Ｒ、Ｄ２４７Ｎ／Ｉ３２２Ｍ、Ｄ２４７Ｎ／Ｑ３６２Ｋ、Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ／Ｑ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ、Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｄ３１６Ｌ、Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｉ３２２Ｍ、Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｑ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ、およびＫ３７３Ｒ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０／３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／２１７／２４７／２６１／２７１／３０２／３１６／３２２／３３７／３６２／３６８／３７３／３９２、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２／３３７、１６６／３６２、２１７／３７３、および３６２／３７３，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３０２Ｑ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ／３６２Ｋ／３６８Ｗ／３７３Ｒ／３９２Ｍ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、４４Ｌ／２１７Ｆ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１６６Ａ／３６２Ｋ、２１７Ｆ／３７３Ｒ、および３６２Ｋ／３７３Ｒ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ／Ｑ３６２Ｋ／Ａ３６８Ｗ／Ｋ３７３Ｒ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｒ４４Ｌ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１６６Ａ／Ｑ３６２Ｋ、Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３７３Ｒ、およびＱ３６２Ｋ／Ｋ３７３Ｒ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号５７に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号５７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、７、７／４８／６８、７／４８／６８／１２０／２８２／２９９、７／４８／１３０／２８２、７／４８／１８０、７／６８／１３０／２８２／３６５、７／６８／１８０、７／８８／１２０／３０５／３６５、７／１２０、７／１３０、７／２８２、７／３０５、７／３０５／３６５、７／３６５、３９、４７、４７／８７／９５／９６／１５８／１６２、４７／９５、４７／２７３、４７／３４３、４８、４８／６８、４８／１８０／２８２、４８／２８２、４８／２８２／３０５、６７／１８０、６８、６８／２９９／３００、７１、８７／９１／９５／９６／１５８／１６２、８７／９１／９５／９６／２０６／３４３、８７／９６／１５５／２７３／３４３、８８、９１／９５、９１／９５／９６、９２、９３、９６、９６／２７３、９６／３１２／３４３、１２０、１２０／２９９／３０５、１５１、１５８、１５８／１６２／２７３、１６２、１６２／２７３、１６２／３４３、１６６、１７８、１８０、１８１、２０６、２１７、２７１、２７３、２７３／３４３、２８２、２８２／３６５、２９３／３９１、２９９／３００、２９９／３００／３０５／３６５、３００、３０１、３０５、３０５／３６５、３１４、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３６３、３６５、３７０、３８９、３９３、３９４、３９６／３９８、３９７、および３９８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、７Ｌ、７Ｌ／４８Ｄ／６８Ｅ、７Ｌ／４８Ｄ／６８Ｅ／１２０Ｈ／２８２Ｎ／２９９Ｒ、７Ｌ／４８Ｄ／１３０Ｅ／２８２Ｎ、７Ｌ／４８Ｄ／１８０Ｇ、７Ｌ／６８Ｅ／１３０Ｅ／２８２Ｎ／３６５Ｖ、７Ｌ／６８Ｅ／１８０Ｇ、７Ｌ／８８Ａ／１２０Ｈ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、７Ｌ／１２０Ｈ、７Ｌ／１３０Ｅ、７Ｌ／２８２Ｎ、７Ｌ／３０５Ｇ、７Ｌ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、７Ｌ／３６５Ｖ、３９Ｖ、４７Ｄ、４７Ｄ／８７Ｋ／９５Ｅ／９６Ｌ／１５８Ｒ／１６２Ｈ、４７Ｄ／９５Ｅ、４７Ｄ／２７３Ｐ、４７Ｄ／３４３Ｇ、４７Ｖ、４８Ｄ、４８Ｄ／６８Ｅ、４８Ｄ／１８０Ｇ／２８２Ｎ、４８Ｄ／２８２Ｎ、４８Ｄ／２８２Ｎ／３０５Ｇ、６７Ｔ／１８０Ｇ、６８Ｅ、６８Ｅ／２９９Ｒ／３００Ｉ、７１Ｐ、８７Ｋ／９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ／１５８Ａ／１６２Ｋ、８７Ｋ／９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ／２０６Ｓ／３４３Ｇ、８７Ｋ／９６Ｉ／１５５Ｎ／２７３Ｐ／３４３Ｇ、８８Ａ、９１Ｑ／９５Ｅ、９１Ｑ／９５Ｅ／９６Ｌ、９２Ｆ、９２Ｔ、９３Ｉ、９６Ｌ、９６Ｌ／２７３Ｐ、９６Ｌ／３１２Ｑ／３４３Ｇ、１２０Ｈ、１２０Ｈ／２９９Ｒ／３０５Ｇ、１５１Ｌ、１５８Ａ、１５８Ａ／１６２Ｋ／２７３Ｇ、１５８Ｒ、１６２Ｈ／３４３Ｄ、１６２Ｋ、１６２Ｋ／２７３Ｐ、１６２Ｓ、１６６Ｋ、１７８Ｇ、１７８Ｓ、１８０Ｇ、１８０Ｌ、１８０Ｔ、１８０Ｖ、１８１Ａ、２０６Ｋ、２０６Ｓ、２１７Ｋ、２７１Ｒ、２７３Ｐ、２７３Ｐ／３４３Ｇ、２８２Ｎ、２８２Ｎ／３６５Ｖ、２９３Ｐ／３９１Ａ、２９９Ｒ／３００Ｉ、２９９Ｒ／３００Ｉ／３０５Ｇ／３６５Ｖ、３００Ｉ、３０１Ｍ、３０５Ｇ、３０５Ｇ／３６５Ｖ、３１４Ａ、３３３Ｆ、３３３Ｇ、３３６Ｖ、３３７Ｒ、３４３Ｄ、３４３Ｇ、３４５Ａ、３４５Ｑ、３６３Ｑ、３６５Ａ、３６５Ｑ、３６５Ｖ、３７０Ｇ、３８９Ｋ、３９３Ｖ、３９４Ｋ、３９６Ｇ／３９８Ｔ、３９７Ａ、３９８Ａ、３９８Ｐ、３９８Ｓ、および３９８Ｖ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｒ７Ｌ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｙ１２０Ｈ／Ｄ２８２Ｎ／Ｑ２９９Ｒ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｄ１３０Ｅ／Ｄ２８２Ｎ、Ｒ７Ｌ／Ｅ４８Ｄ／Ｆ１８０Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｑ６８Ｅ／Ｄ１３０Ｅ／Ｄ２８２Ｎ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｑ６８Ｅ／Ｆ１８０Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｑ８８Ａ／Ｙ１２０Ｈ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｙ１２０Ｈ、Ｒ７Ｌ／Ｄ１３０Ｅ、Ｒ７Ｌ／Ｄ２８２Ｎ、Ｒ７Ｌ／Ｎ３０５Ｇ、Ｒ７Ｌ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｒ７Ｌ／Ｆ３６５Ｖ、Ｅ３９Ｖ、Ｔ４７Ｄ、Ｔ４７Ｄ／Ｒ８７Ｋ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ｌ１５８Ｒ／Ｒ１６２Ｈ、Ｔ４７Ｄ／Ｓ９５Ｅ、Ｔ４７Ｄ／Ｓ２７３Ｐ、Ｔ４７Ｄ／Ｋ３４３Ｇ、Ｔ４７Ｖ、Ｅ４８Ｄ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｅ４８Ｄ／Ｆ１８０Ｇ／Ｄ２８２Ｎ、Ｅ４８Ｄ／Ｄ２８２Ｎ、Ｅ４８Ｄ／Ｄ２８２Ｎ／Ｎ３０５Ｇ、Ｐ６７Ｔ／Ｆ１８０Ｇ、Ｑ６８Ｅ、Ｑ６８Ｅ／Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ、Ｓ７１Ｐ、Ｒ８７Ｋ／Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ｌ１５８Ａ／Ｒ１６２Ｋ、Ｒ８７Ｋ／Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ／Ａ２０６Ｓ／Ｋ３４３Ｇ、Ｒ８７Ｋ／Ｋ９６Ｉ／Ｈ１５５Ｎ／Ｓ２７３Ｐ／Ｋ３４３Ｇ、Ｑ８８Ａ、Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ、Ｎ９１Ｑ／Ｓ９５Ｅ／Ｋ９６Ｌ、Ｈ９２Ｆ、Ｈ９２Ｔ、Ｖ９３Ｉ、Ｋ９６Ｌ、Ｋ９６Ｌ／Ｓ２７３Ｐ、Ｋ９６Ｌ／Ｐ３１２Ｑ／Ｋ３４３Ｇ、Ｙ１２０Ｈ、Ｙ１２０Ｈ／Ｑ２９９Ｒ／Ｎ３０５Ｇ、Ｄ１５１Ｌ、Ｌ１５８Ａ、Ｌ１５８Ａ／Ｒ１６２Ｋ／Ｓ２７３Ｇ、Ｌ１５８Ｒ、Ｒ１６２Ｈ／Ｋ３４３Ｄ、Ｒ１６２Ｋ、Ｒ１６２Ｋ／Ｓ２７３Ｐ、Ｒ１６２Ｓ、Ｐ１６６Ｋ、Ｗ１７８Ｇ、Ｗ１７８Ｓ、Ｆ１８０Ｇ、Ｆ１８０Ｌ、Ｆ１８０Ｔ、Ｆ１８０Ｖ、Ｑ１８１Ａ、Ａ２０６Ｋ、Ａ２０６Ｓ、Ｒ２１７Ｋ、Ａ２７１Ｒ、Ｓ２７３Ｐ、Ｓ２７３Ｐ／Ｋ３４３Ｇ、Ｄ２８２Ｎ、Ｄ２８２Ｎ／Ｆ３６５Ｖ、Ｌ２９３Ｐ／Ｑ３９１Ａ、Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ、Ｑ２９９Ｒ／Ｌ３００Ｉ／Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｌ３００Ｉ、Ｒ３０１Ｍ、Ｎ３０５Ｇ、Ｎ３０５Ｇ／Ｆ３６５Ｖ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３３３Ｆ、Ｓ３３３Ｇ、Ｉ３３６Ｖ、Ｐ３３７Ｒ、Ｋ３４３Ｄ、Ｋ３４３Ｇ、Ｖ３４５Ａ、Ｖ３４５Ｑ、Ｌ３６３Ｑ、Ｆ３６５Ａ、Ｆ３６５Ｑ、Ｆ３６５Ｖ、Ｓ３７０Ｇ、Ｔ３８９Ｋ、Ｓ３９３Ｖ、Ｌ３９４Ｋ、Ｄ３９６Ｇ／Ｌ３９８Ｔ、Ｌ３９７Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｌ３９８Ｐ、Ｌ３９８Ｓ、およびＬ３９８Ｖ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１５７に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１５７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号１５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、２４／２０２、３９／４７、３９／４７／２１７、３９／１５１、３９／２８２／３３７／３９８、３９／３３７／３４３／３９８、３９／３９３／３９８、４７／１３０、４７／１５１、４７／３４３／３４５／３９３、４８、４８／６８、４８／６８／２１７／３３３／３９１／３９３、４８／６８／３３３、４８／２１７、４８／３３３、４８／３４５／３９３、４８／３９３、５９／１４３、６８、６８／３４５、１３０、１３０／１５８、１３０／１５８／３９３、１３０／３４５／３９３、１４３／２７１、１４３／３３３、１４３／３８７、１５１、１５１／１５８／２１７／３４３／３４５／３９３、１５１／２０６／２８２／３３７／３４３／３４５／３９８、１５１／２８２／３９３、１５１／３４５／３９３／３９８、１５１／３９３、１５８、１５８／３９３、２０２、２０６、２０６／２１７、２１７、２１７／３３３、２１７／３３７／３４５／３９８、２７１、２８２／３９３、３３３、３３３／３４５、３３７／３４３／３４５／３９８、３４３、３４３／３４５／３９３／３９８、３９３、および３９３／３９８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号１５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、２４Ｓ／２０２Ｎ、３９Ｖ／４７Ｄ、３９Ｖ／４７Ｖ／２１７Ｋ、３９Ｖ／１５１Ｌ、３９Ｖ／２８２Ｎ／３３７Ｒ／３９８Ａ、３９Ｖ／３３７Ｒ／３４３Ｇ／３９８Ａ、３９Ｖ／３９３Ｖ／３９８Ａ、４７Ｖ／１３０Ｅ、４７Ｖ／１５１Ｌ、４７Ｖ／３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、４８Ｄ、４８Ｄ／６８Ｅ、４８Ｄ／６８Ｅ／２１７Ｋ／３３３Ｆ／３９１Ａ／３９３Ｖ、４８Ｄ／６８Ｅ／３３３Ｆ、４８Ｄ／２１７Ｋ、４８Ｄ／３３３Ｆ、４８Ｄ／３３３Ｇ、４８Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、４８Ｄ／３９３Ｖ、５９Ａ／１４３Ｓ、６８Ｅ、６８Ｅ／３４５Ｑ、１３０Ｅ、１３０Ｅ／１５８Ｒ、１３０Ｅ／１５８Ｒ／３９３Ｖ、１３０Ｅ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、１４３Ｓ／２７１Ｎ、１４３Ｓ／３３３Ｎ、１４３Ｓ／３８７Ｎ、１５１Ｌ、１５１Ｌ／１５８Ｒ／２１７Ｋ／３４３Ｇ／３４５Ｑ／３９３Ｖ、１５１Ｌ／２０６Ｓ／２８２Ｎ／３３７Ｒ／３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９８Ａ、１５１Ｌ／２８２Ｎ／３９３Ｖ、１５１Ｌ／３４５Ｑ／３９３Ｖ／３９８Ａ、１５１Ｌ／３９３Ｖ、１５８Ｒ、１５８Ｒ／３９３Ｖ、２０２Ｎ、２０６Ｓ、２０６Ｓ／２１７Ｋ、２１７Ｋ、２１７Ｋ／３３３Ｆ、２１７Ｋ／３３３Ｇ、２１７Ｋ／３３７Ｒ／３４５Ｑ／３９８Ａ、２７１Ｎ、２８２Ｎ／３９３Ｖ、３３３Ｆ／３４５Ｑ、３３３Ｇ、３３３Ｎ、３３７Ｒ／３４３Ｇ／３４５Ｑ／３９８Ａ、３４３Ｄ、３４３Ｄ／３４５Ｑ／３９３Ｖ／３９８Ａ、３９３Ｖ、および３９３Ｖ／３９８Ａ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｄ２４Ｓ／Ｄ２０２Ｎ、Ｅ３９Ｖ／Ｔ４７Ｄ、Ｅ３９Ｖ／Ｔ４７Ｖ／Ｒ２１７Ｋ、Ｅ３９Ｖ／Ｄ１５１Ｌ、Ｅ３９Ｖ／Ｄ２８２Ｎ／Ｐ３３７Ｒ／Ｌ３９８Ａ、Ｅ３９Ｖ／Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｇ／Ｌ３９８Ａ、Ｅ３９Ｖ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｔ４７Ｖ／Ｄ１３０Ｅ、Ｔ４７Ｖ／Ｄ１５１Ｌ、Ｔ４７Ｖ／Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｆ／Ｑ３９１Ａ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ／Ｑ６８Ｅ／Ｓ３３３Ｆ、Ｅ４８Ｄ／Ｒ２１７Ｋ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３３３Ｆ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３３３Ｇ、Ｅ４８Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｅ４８Ｄ／Ｓ３９３Ｖ、Ｃ５９Ａ／Ｃ１４３Ｓ、Ｑ６８Ｅ、Ｑ６８Ｅ／Ｖ３４５Ｑ、Ｄ１３０Ｅ、Ｄ１３０Ｅ／Ｌ１５８Ｒ、Ｄ１３０Ｅ／Ｌ１５８Ｒ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１３０Ｅ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｃ１４３Ｓ／Ａ２７１Ｎ、Ｃ１４３Ｓ／Ｓ３３３Ｎ、Ｃ１４３Ｓ／Ｅ３８７Ｎ、Ｄ１５１Ｌ、Ｄ１５１Ｌ／Ｌ１５８Ｒ／Ｒ２１７Ｋ／Ｋ３４３Ｇ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１５１Ｌ／Ａ２０６Ｓ／Ｄ２８２Ｎ／Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ｄ１５１Ｌ／Ｄ２８２Ｎ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ１５１Ｌ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｄ１５１Ｌ／Ｓ３９３Ｖ、Ｌ１５８Ｒ、Ｌ１５８Ｒ／Ｓ３９３Ｖ、Ｄ２０２Ｎ、Ａ２０６Ｓ、Ａ２０６Ｓ／Ｒ２１７Ｋ、Ｒ２１７Ｋ、Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｆ、Ｒ２１７Ｋ／Ｓ３３３Ｇ、Ｒ２１７Ｋ／Ｐ３３７Ｒ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ａ２７１Ｎ、Ｄ２８２Ｎ／Ｓ３９３Ｖ、Ｓ３３３Ｆ／Ｖ３４５Ｑ、Ｓ３３３Ｇ、Ｓ３３３Ｎ、Ｐ３３７Ｒ／Ｋ３４３Ｇ／Ｖ３４５Ｑ／Ｌ３９８Ａ、Ｋ３４３Ｄ、Ｋ３４３Ｄ／Ｖ３４５Ｑ／Ｓ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ、Ｓ３９３Ｖ、およびＳ３９３Ｖ／Ｌ３９８Ａ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７１に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０、１０／３９／４４／３２２、１０／３９／９２／２０６／２１７／２７１、１０／３９／９２／２４７、１０／３９／９２／２４７／２７１／３１６、１０／４４、１０／４４／４７／９２／２４７、１０／４４／４７／２６１／３０２／３２２／３６８、１０／４４／９２／３１６／３２２、１０／４４／２６１／３０２／３１６、１０／４４／３０２／３３７／３６８、１０／４７／２１７／２４７／３１６／３９２、１０／４７／２１７／３２２、１０／４７／２７１、１０／９２、１０／９２／２０６／２１７／２４７、１０／９２／２０６／２４７／３１６／３２２／３９２、１０／９２／２０６／２４７／３２２／３６８、１０／９２／２１７／２６１／３０２／３３７、１０／２０６／２１７／２７１、１０／２０６／２４７、１０／２０６／２６１／２７１／３１６、１０／２６１、１０／２７１／３０２、１０／３０２、１０／３０２／３１６、１０／３０２／３２２／３３７、１０／３１６／３２２、１０／３３７／３９２、１０／３６８、３９／４４／９２／１６２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４４／９２／２１７／３２２、３９／４４／９２／２４７／２７１／３０２、３９／４７／９２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／２４７／３０２／３１６／３３７／３６８、３９／９２／３１６／３２２、３９／２４７／２７１、３９／２４７／２７１／３１６、３９／３２２、４４／４７／９２／２０６／２１７／３１６／３２２、４４／４７／９２／２４７／２６１／２７１／３１６／３３７／３６８、４４／４７／２０６／２１７／２４７／２７１／３２２、４４／４７／２４７／３２２／３６８、４４／４７／３０２／３１６／３２２、４４／９２／２０６／２４７／３６８、４４／２０６／３３７、４４／２４７／２６１／３０２／３１６、４４／２４７／２６１／３０２／３１６／３２２、４７／９２／２４７／２７１、４７／２１７／３０２、４７／２４７、４７／２４７／２７１、８９／２１７／２４７／２６１／３０２／３１６、９２／２１７／２７１、９２／２４７、９２／２４７／２７１／３２２、９２／２４７／３０２／３２２／３３７、９２／２７１／３３７、９２／３０２、９２／３１６、２０６／２１７／２７１／３９２、２１７／２４７／３１６／３２２／３３７／３６８、２４７、２４７／２７１、２４７／３０２、２７１、２７１／３０２／３２２、２７１／３１６／３２２、３０２／３２２／３６８、および３６８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｐ、１０Ｐ／３９Ｅ／４４Ｒ／３２２Ｉ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ、１０Ｐ／３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３１６Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ、１０Ｐ／４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ／４７Ｔ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３６８Ａ、１０Ｐ／４４Ｒ／９２Ｈ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、１０Ｐ／４４Ｒ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、１０Ｐ／４４Ｒ／３０２Ｋ／３３７Ｐ／３６８Ａ、１０Ｐ／４７Ｔ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３９２Ｔ、１０Ｐ／４７Ｔ／２１７Ｒ／３２２Ｉ、１０Ｐ／４７Ｔ／２７１Ａ、１０Ｐ／９２Ｈ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２４７Ｄ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３２２Ｉ／３９２Ｔ、１０Ｐ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３２２Ｉ／３６８Ａ、１０Ｐ／９２Ｈ／２１７Ｒ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３３７Ｐ、１０Ｐ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ、１０Ｐ／２０６Ａ／２４７Ｄ、１０Ｐ／２０６Ａ／２６１Ｇ／２７１Ａ／３１６Ｄ、１０Ｐ／２６１Ｇ、１０Ｐ／２７１Ａ／３０２Ｋ、１０Ｐ／３０２Ｋ、１０Ｐ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、１０Ｐ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３３７Ｐ、１０Ｐ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、１０Ｐ／３３７Ｐ／３９２Ｔ、１０Ｐ／３６８Ａ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／１６２Ｍ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／２１７Ｒ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４４Ｒ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３０２Ｋ、３９Ｅ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／４７Ｔ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／３６８Ａ、３９Ｅ／４７Ｔ／２４７Ｄ、３９Ｅ／９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３３７Ｐ／３６８Ａ、３９Ｅ／９２Ｈ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３９Ｅ／２４７Ｄ／２７１Ａ、３９Ｅ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３１６Ｄ、３９Ｅ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２０６Ａ／２１７Ｒ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／２７１Ａ／３１６Ｄ／３３７Ｐ／３６８Ａ、４４Ｒ／４７Ｔ／２０６Ａ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３２２Ｉ、４４Ｒ／４７Ｔ／２４７Ｄ／３２２Ｉ／３６８Ａ、４４Ｒ／４７Ｔ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４４Ｒ／９２Ｈ／２０６Ａ／２４７Ｄ／３６８Ａ、４４Ｒ／２０６Ａ／３３７Ｐ、４４Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、４４Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、４７Ｔ／９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ、４７Ｔ／２１７Ｒ／３０２Ｋ、４７Ｔ／２４７Ｄ、４７Ｔ／２４７Ｄ／２７１Ａ、８９Ｉ／２１７Ｒ／２４７Ｄ／２６１Ｇ／３０２Ｋ／３１６Ｄ、９２Ｈ／２１７Ｒ／２７１Ａ、９２Ｈ／２４７Ｄ、９２Ｈ／２４７Ｄ／２７１Ａ／３２２Ｉ、９２Ｈ／２４７Ｄ／３０２Ｋ／３２２Ｉ／３３７Ｐ、９２Ｈ／２７１Ａ／３３７Ｐ、９２Ｈ／３０２Ｋ、９２Ｈ／３１６Ｄ、２０６Ａ／２１７Ｒ／２７１Ａ／３９２Ｔ、２１７Ｒ／２４７Ｄ／３１６Ｄ／３２２Ｉ／３３７Ｐ／３６８Ａ、２４７Ｄ、２４７Ｄ／２７１Ａ、２４７Ｄ／３０２Ｋ、２７１Ａ、２７１Ａ／３０２Ｋ／３２２Ｉ、２７１Ａ／３１６Ｄ／３２２Ｉ、３０２Ｋ／３２２Ｉ／３６８Ａ、および３６８Ａ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｔ１０Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ４４Ｒ／Ｑ３０２Ｋ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ｓ４７Ｔ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ａ３３７Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｋ２０６Ａ／Ａ２６１Ｇ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ａ２６１Ｇ、Ｔ１０Ｐ／Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｔ１０Ｐ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ、Ｔ１０Ｐ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｔ１０Ｐ／Ａ３３７Ｐ／Ｍ３９２Ｔ、Ｔ１０Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｒ１６２Ｍ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ、Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｍ３９Ｅ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｍ３９Ｅ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ、Ｍ３９Ｅ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｓ４７Ｔ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｌ４４Ｒ／Ｙ９２Ｈ／Ｋ２０６Ａ／Ｎ２４７Ｄ／Ｗ３６８Ａ、Ｌ４４Ｒ／Ｋ２０６Ａ／Ａ３３７Ｐ、Ｌ４４Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｌ４４Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｓ４７Ｔ／Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｓ４７Ｔ／Ｆ２１７Ｒ／Ｑ３０２Ｋ、Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ、Ｓ４７Ｔ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｌ８９Ｉ／Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ａ２６１Ｇ／Ｑ３０２Ｋ／Ｌ３１６Ｄ、Ｙ９２Ｈ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３２２Ｉ、Ｙ９２Ｈ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ、Ｙ９２Ｈ／Ｈ２７１Ａ／Ａ３３７Ｐ、Ｙ９２Ｈ／Ｑ３０２Ｋ、Ｙ９２Ｈ／Ｌ３１６Ｄ、Ｋ２０６Ａ／Ｆ２１７Ｒ／Ｈ２７１Ａ／Ｍ３９２Ｔ、Ｆ２１７Ｒ／Ｎ２４７Ｄ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ／Ａ３３７Ｐ／Ｗ３６８Ａ、Ｎ２４７Ｄ、Ｎ２４７Ｄ／Ｈ２７１Ａ、Ｎ２４７Ｄ／Ｑ３０２Ｋ、Ｈ２７１Ａ、Ｈ２７１Ａ／Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ、Ｈ２７１Ａ／Ｌ３１６Ｄ／Ｍ３２２Ｉ、Ｑ３０２Ｋ／Ｍ３２２Ｉ／Ｗ３６８Ａ、およびＷ３６８Ａ，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２

に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７３に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３７３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、組換えαガラクトシダーゼＡをコードし、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０／３６／９２／１６６／２４７／２６１／３１６／３９２、１０／３９、１０／３９／４４／４７／９２／２０６／２１７、１０／３９／４４／４７／３１６、１０／３９／４４／４７／３３７、１０／３９／４４／９２／１６６／２６１／３１６／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３９２、１０／３９／４４／９２／２１７／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／３０２／３２２、１０／３９／４４／１６６／２６１／２７１／３１６／３２２、１０／３９／４４／３９２、１０／３９／４７／９２／３３７、１０／３９／９２／１３１／１６６／２７１／３１６／３２２、１０／３９／９２／１６６／２１７／２４７／２７１、１０／３９／９２／２１７／３１６、１０／４４／４７／１６６／２６１／２７１、１０／４４／４７／１６６／２７１／３２２／３６８、１０／４４／４７／２１７／２７１／３１６／３２２、１０／４４／９２、１０／４４／９２／２１７／２４７／２７１／３０２／３１６／３９２、１０／４４／１６６／３０２、１０／４４／２０６／３１６／３２２、１０／４７／９２／１６６／２７１／３１６／３３７、１０／４７／９２／２７１／３０２、１０／４７／９２／３１６／３２２／３９２、１０／４７／１６６／２７１、１０／４７／１６６／３１６、１０／９２／１６６、１０／９２／１６６／２１７／２４７／２６１／２７１、１０／９２／１６６／２６１／２７１／３９２、１０／９２／１６６／２６１／３１６／３２２／３３７、１０／９２／１６６／３３７／３６８、１０／９２／３０２／３３７、１０／９２／３１６／３２２、１０／２０６、１０／２０６／２４７／２６１、１０／２１７／３２２、１０／２６１、１０／２６１／３３７／３９２、１０／３１６／３９２、１０／３６８、３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／３９２、３９／４４／４７／９２／２０６／２４７／２６１、３９／４４／４７／９２／２０６／３９２、３９／４４／４７／２０６／３３７／３６８／３９２、３９／４４／９２／１６６／２４７／２６１／３０２／３３７、３９／４４／１６６／２７１、３９／４４／１６６／２７１／３３７／３６８／３９２、３９／４７／９２／３１６／３２２、３９／４７／９２／３９２、３９／４７／１６６／２１７／２６１／３９２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／１６６／２１７／３９２、３９／９２／２６１／３０２、３９／１６６／２１７／２６１／３１６／３６８、３９／３２２、３９／３９２、４４／４７、４４／４７／９２／２１７／２７１、４４／４７／９２／２１７／３１６／３２２／３９２、４４／４７／９２／３９２、４４／４７／１６６、４４／４７／１６６／２７１、４４／４７／２４７／２７１／３９２、４４／３１６／３２２／３９２、４４／３３７、４７／１６６／２０６／２１７／２４７／３３７、４７／１６６／２１７／２７１／３３７、４７／２０６、４７／２１７／２４７／２６１、４７／２７１、５２／２１７／３０２／３１６、９２／１６６／２０６／２７１／３１６、９２／１６６／２１７／２６１／２７１／３９２、９２／１６６／２１７／３１６／３３７／３９２、９２／１６６／２４７、９２／１６６／３１６、９２／２０６／３２２、９２／２１７、９２／２１７／２７１／３３７、９２／２６１／２７１、９２／２７１、１６６／２１７／３１６／３２２／３３７、１６６／２４７／２７１／３１６、１６６／３１６／３２２／３３７、２０６／２１７、２１７／３９２、２４７／３１６、３１６／３２２／３６８、および３１６／３３７／３９２（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、１０Ｔ／３６Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／２１７Ｆ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／３１６Ｌ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／３３７Ａ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／３０２Ｑ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４４Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３３７Ａ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／１３１Ｇ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２７１Ｈ、１０Ｔ／３９Ｍ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３１６Ｌ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３２２Ｍ／３６８Ｗ、１０Ｔ／４４Ｌ／４７Ｓ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／４４Ｌ／９２Ｙ、１０Ｔ／４４Ｌ／９２Ｙ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３０２Ｑ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／４４Ｌ／１６６Ｓ／３０２Ｑ、１０Ｔ／４４Ｌ／２０６Ｋ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３１６Ｌ／３３７Ａ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／２７１Ｈ／３０２Ｑ、１０Ｔ／４７Ｓ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、１０Ｔ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、１０Ｔ／４７Ｓ／１６６Ｓ／３１６Ｌ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ／２７１Ｈ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１０Ｔ／９２Ｙ／１６６Ｓ／３３７Ａ／３６８Ｗ、１０Ｔ／９２Ｙ／３０２Ｑ／３３７Ａ、１０Ｔ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、１０Ｔ／２０６Ｋ、１０Ｔ／２０６Ｋ／２４７Ｎ／２６１Ａ、１０Ｔ／２１７Ｆ／３２２Ｍ、１０Ｔ／２６１Ａ、１０Ｔ／２６１Ａ／３３７Ａ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３１６Ｌ／３９２Ｍ、１０Ｔ／３６８Ｗ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／２４７Ｎ／２６１Ａ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２０６Ｋ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／４７Ｓ／２０６Ｋ／３３７Ａ／３６８Ｗ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４４Ｌ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ／２６１Ａ／３０２Ｑ／３３７Ａ、３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、３９Ｍ／４４Ｌ／１６６Ｓ／２７１Ｈ／３３７Ａ／３６８Ｗ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３１６Ｌ／３２２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／９２Ｙ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／３９２Ｍ、３９Ｍ／４７Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／３６８Ｗ、３９Ｍ／４７Ｓ／２４７Ｎ、３９Ｍ／９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／３９２Ｍ、３９Ｍ／９２Ｙ／２６１Ａ／３０２Ｑ、３９Ｍ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／３１６Ｌ／３６８Ｗ、３９Ｍ／３２２Ｍ、３９Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２１７Ｆ／２７１Ｈ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ／９２Ｙ／３９２Ｍ、４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ、４４Ｌ／４７Ｓ／１６６Ｓ／２７１Ｈ、４４Ｌ／４７Ｓ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、４４Ｌ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３９２Ｍ、４４Ｌ／３３７Ａ、４７Ｓ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／３３７Ａ、４７Ｓ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３３７Ａ、４７Ｓ／２０６Ｋ、４７Ｓ／２１７Ｆ／２４７Ｎ／２６１Ａ、４７Ｓ／２７１Ｈ、５２Ｎ／２１７Ｆ／３０２Ｑ／３１６Ｌ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２０６Ｋ／２７１Ｈ／３１６Ｌ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／２６１Ａ／２７１Ｈ／３９２Ｍ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３３７Ａ／３９２Ｍ、９２Ｙ／１６６Ｓ／２４７Ｎ、９２Ｙ／１６６Ｓ／３１６Ｌ、９２Ｙ／２０６Ｋ／３２２Ｍ、９２Ｙ／２１７Ｆ、９２Ｙ／２１７Ｆ／２７１Ｈ／３３７Ａ、９２Ｙ／２６１Ａ／２７１Ｈ、９２Ｙ／２７１Ｈ、１６６Ｓ／２１７Ｆ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、１６６Ｓ／２４７Ｎ／２７１Ｈ／３１６Ｌ、１６６Ｓ／３１６Ｌ／３２２Ｍ／３３７Ａ、２０６Ｋ／２１７Ｆ、２１７Ｆ／３９２Ｍ、２４７Ｎ／３１６Ｌ、３１６Ｌ／３２２Ｍ／３６８Ｗ、および３１６Ｌ／３３７Ａ／３９２Ｍ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。いくつかの実施形態において、組換えαガラクトシダーゼＡは、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡは、Ｐ１０Ｔ／Ｋ３６Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｋ３０２Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｗ１３１Ｇ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｉ３２２Ｍ／Ａ３６８Ｗ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ

／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ｋ３０２Ｑ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ４４Ｌ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２７１Ｈ／Ｋ３０２Ｑ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ａ２０６Ｋ、Ｐ１０Ｔ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｒ２１７Ｆ／Ｉ３２２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｇ２６１Ａ、Ｐ１０Ｔ／Ｇ２６１Ａ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ｄ３１６Ｌ／Ｔ３９２Ｍ、Ｐ１０Ｔ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ／Ｋ３０２Ｑ／Ｐ３３７Ａ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｅ３９Ｍ／Ｒ４４Ｌ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ／Ａ３６８Ｗ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ２４７Ｎ、Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｔ３９２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｈ９２Ｙ／Ｇ２６１Ａ／Ｋ３０２Ｑ、Ｅ３９Ｍ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ｄ３１６Ｌ／Ａ３６８Ｗ、Ｅ３９Ｍ／Ｉ３２２Ｍ、Ｅ３９Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｈ９２Ｙ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｒ４４Ｌ／Ｔ４７Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｔ３９２Ｍ、Ｒ４４Ｌ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ａ２０６Ｋ、Ｔ４７Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ２４７Ｎ／Ｇ２６１Ａ、Ｔ４７Ｓ／Ａ２７１Ｈ、Ｄ５２Ｎ／Ｒ２１７Ｆ／Ｋ３０２Ｑ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ａ２０６Ｋ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ／Ｔ３９２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ、Ｈ９２Ｙ／Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ、Ｈ９２Ｙ／Ａ２０６Ｋ／Ｉ３２２Ｍ、Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ、Ｈ９２Ｙ／Ｒ２１７Ｆ／Ａ２７１Ｈ／Ｐ３３７Ａ、Ｈ９２Ｙ／Ｇ２６１Ａ／Ａ２７１Ｈ、Ｈ９２Ｙ／Ａ２７１Ｈ、Ｐ１６６Ｓ／Ｒ２１７Ｆ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ｐ１６６Ｓ／Ｄ２４７Ｎ／Ａ２７１Ｈ／Ｄ３１６Ｌ、Ｐ１６６Ｓ／Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ｐ３３７Ａ、Ａ２０６Ｋ／Ｒ２１７Ｆ、Ｒ２１７Ｆ／Ｔ３９２Ｍ、Ｄ２４７Ｎ／Ｄ３１６Ｌ、Ｄ３１６Ｌ／Ｉ３２２Ｍ／Ａ３６８Ｗ、およびＤ３１６Ｌ／Ｐ３３７Ａ／Ｔ３９２Ｍ（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む。
いくつかの実施形態において、上記のように、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性を有し、ＧＬＡ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、前記ポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４）に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列、または表２．１および／または５．１において開示される任意のバリアントのアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８の参照ポリペプチド、または表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して、１つまたはそれを超える残基の相違（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるアミノ酸残基位置）を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性を有し、ＧＬＡ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、前記ポリペプチドは、参照配列配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のポリペプチドと最適にアラインされた場合、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４と比較して、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１に提供される残基位置から選択される残基位置において、１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、高ストリンジェント条件下で、参照ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態において、前記参照配列は、配列番号１、７、５７、１５７、３７１、および／もしくは３７３、またはその相補配列、または本明細書で提供される任意のバリアントＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列から選択される。いくつかの実施形態において、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能な前記ポリヌクレオチドは、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および／または３７４と比較して、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１に記載の任意の位置から選択される残基位置において、１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含むＧＬＡポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される任意の操作されたＧＬＡポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすために、種々のやり方で操作される。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を制御するために１つまたはそれを超える調節配列が存在する発現ベクターとして提供される。発現ベクターに応じて、ベクターへの挿入に先立って、単離されたポリヌクレオチドを操作することが望ましいか、または必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当該技術分野において周知である。
いくつかの実施形態において、調節配列としては、配列の中でも特に、プロモーター、コザック配列、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、遺伝子療法維持のためのＤＮＡベースの制御エレメント、および転写ターミネーターがあげられる。当該技術分野で知られているように、適切なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性α－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ アルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得たプロモーター（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照のこと）、ならびに、ＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α－アミラーゼとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、およびそれらの変異プロモーター、切断型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターがあげられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子由来であり得る遺伝子由来であり得る（ｃａｎ ｂｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ）。酵母宿主細胞のためのその他の有用なプロモーターは、当該技術分野で知られている（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ８：４２３－４８８［１９９２］を参照のこと）。哺乳動物細胞において用いるための例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、ＣＭＶエンハンサーと融合させたトリβ－アクチンプロモーター、サル空胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、βアクチン、伸長因子１α、もしくはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ由来のプロモーター、またはＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓのβ－アクチン由来のプロモーターがあげられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、調節配列は、適切な転写終結配列（すなわち宿主細胞によって認識され、転写を終結させる配列）である。転写終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選ばれた宿主細胞において機能する任意のターミネーターが、本発明において使用される。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ αグルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロームＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のためのその他の有用なプロモーターは、当該技術分野で知られている（例えば、前出のＲｏｍａｎｏｓらを参照のこと）。哺乳動物細胞のための例示的なターミネーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サル空胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ成長ホルモン ｈＧＨ、ウシ成長ホルモン ＢＧＨ、およびヒトまたはウサギβグロブリン由来のターミネーターがあげられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、前記調節配列は、適切なリーダー配列、５’キャップ修飾、５’ＵＴＲなどである。いくつかの実施形態において、これらの制御配列エレメントは、ｍＲＮＡ輸送および翻訳に関わる分子への結合を媒介し、５’エキソヌクレアーゼ分解を阻害し、デキャッピングに対する抵抗性を与える。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選ばれた宿主細胞において機能する任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の適切なリーダーとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセレートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α－因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるリーダーがあげられるが、それらに限定されない。哺乳動物宿主細胞のための適切なリーダーとしては、オルソポックスウイルスｍＲＮＡに存在する５’－ＵＴＲエレメントがあげられるが、それに限定されない。
いくつかの実施形態において、調節配列は、３’非翻訳核酸領域およびポリＡテール配列（ｍＲＮＡ輸送および翻訳ならびにｍＲＮＡ半減期に関わるタンパク質に対する結合を媒介する、タンパク質をコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列）を含む。選ばれた宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列および３’ＵＴＲを本発明において使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ αグルコシダーゼの遺伝子由来のポリアデニル化配列があげられるが、それらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列も当該技術分野で知られている（例えば、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：５９８３－５９９０［１９９５］を参照のこと）。哺乳動物宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列および３’ＵＴＲ配列としては、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、翻訳を促進する数個の配列エレメントを含んでいるαおよびβグロビンｍＲＮＡの３’－ＵＴＲがあげられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そのコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導く、シグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレーム内で天然に連結されているシグナルペプチドコード領域を固有に含有していてもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含有していてもよい。発現されたポリペプチドを選ばれた宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域が、本明細書において提供される操作されたＧＬＡポリペプチドの発現のために使用される。糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域があげられるが、それらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するシグナルペプチドがあげられるが、それらに限定されない。哺乳動物宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）の遺伝子に由来するシグナルペプチドがあげられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「酵素原」と呼ばれる場合がある）。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟した活性ポリペプチドに変換され得る。
別の態様において、本発明は、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、導入される宿主の種類に応じた１つまたはそれを超える発現制御領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製開始点など）とを含む、組換え発現ベクターも提供する。いくつかの実施形態において、上記の種々の核酸および調節配列は、互いに連結して、１つまたはそれを超える使いやすい制限部位を含む組換え発現ベクターを生成し、前記制限部位は、その部位において、バリアントＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列（単数または複数）は、そのポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現させる。発現ベクターの作成において、コード配列は、そのコード配列が発現のための適切な調節配列と作動可能に連結されるように、ベクター中に配置される。
組換え発現ベクターは、都合よく組換えＤＮＡ手順にかけることができ、バリアントＧＬＡポリヌクレオチド配列を発現させることができる、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス（アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）が含まれるが、それらに限定されない）、および非ウイルスベクター（リポソームなど）が含まれる）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対する、ベクターの適合性に依存する。ベクターは、直鎖状プラスミドまたは閉環状プラスミドであり得る。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり、その複製は染色体複製とは独立している（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。いくつかの代替的な実施形態において、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、ゲノム中に組み込まれ、そのベクターが組み込まれた染色体（単数または複数）と共に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つまたはそれを超えるベクターもしくはプラスミド（それらは、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する）、またはトランスポゾンが使用され得る。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、好ましくは１つまたはそれを超える選択マーカーを含有し、その選択マーカーによって、形質転換細胞の容易な選択が可能になる。「選択マーカー」は、遺伝子であって、その産物が、殺生物剤耐性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株への原栄養性などをもたらす遺伝子である。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３があげられるが、それらに限定されない。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ（ｓｕｌｆａｔｅ ａｄｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物があげられるが、それらに限定されない。別の態様において、本発明は、本出願の少なくとも１つの操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞における操作されたＧＬＡ酵素の発現のための１つまたはそれを超える調節配列と作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現に使用するための宿主細胞は、当該技術分野において周知であり、真菌細胞、たとえば酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ［例えば、ＡＴＣＣ寄託番号２０１１７８］）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）、植物細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ、およびＢＨＫ）、およびヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ヒト線維芽細胞、ＴＨＰ－１、Ｊｕｒｋａｔ細胞株、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞株）が含まれるが、それらに限定されない。
したがって、別の態様において、本発明は、操作されたＧＬＡポリペプチドを産生するための方法を提供し、前記方法は、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されているように、ＧＬＡポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。
上記宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当該技術分野において周知である。ＧＬＡポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られている種々の方法によって、細胞内に導入してもよい。技術としては、とりわけ、エレクトロポレーション、微粒子銃衝撃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合があげられる。
本明細書に開示される特性を有する操作されたＧＬＡは、天然に存在するまたは操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で知られ、本明細書に記載されているように、変異誘発および／または定向進化法にかけることによって得ることができる。例示的な定向進化技術は、変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７、および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用することができるその他の定向進化手順としては、とりわけ、互い違い伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ、ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８－２６１［１９９８］を参照のこと）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，３：Ｓ１３６－Ｓ１４０［１９９４］を参照のこと）、およびカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３５２５－３５２９［１９９６］を参照のこと）があげられる。
例えば、変異誘発および定向進化法は、発現され、スクリーニングされ、およびアッセイされ得るバリアントライブラリーを生成するために、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発および定向進化法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許番号第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８９，１４６、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，７１６，６３１、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、７，１４８，０５４、７，２８８，３７５、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、 ７，９５７，９１２、８，３８３，３４６、８，５０４，４９８、８，８４９，５７５、８，８７６，０６６、８，７６８，８７１、９，５９３，３２６、および全ての非米国の対応出願； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７－７８ ［１９９７］； Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５７：３６９－７４ ［１９９６］； Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３－４６２ ［１９８５］； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３－１２０１ ［１９８５］； Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２３７：１－７ ［１９８６］； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、３８：８７９－８８７ ［１９８４］； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、３４：３１５－３２３ ［１９８５］； Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、３：２８４－２９０ ［１９９９］； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：２５９－２６４ ［１９９９］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８－２９１ ［１９９８］； Ｃｒａｍｅｒｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：４３６－４３８ ［１９９７］； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５０４－４５０９ ［１９９７］； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３１５－３１９ ［１９９６］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９－３９１ ［１９９４］； Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］；米国特許出願公開第２００８／０２２０９９０、ＵＳ ２００９／０３１２１９６、ＵＳ２０１４／０００５０５７、ＵＳ２０１４／０２１４３９１、ＵＳ２０１４／０２２１２１６； ＵＳ２０１５／００５０６５８、ＵＳ２０１５／０１３３３０７、ＵＳ２０１５／０１３４３１５および全ての非米国の対応出願； ＷＯ ９５／２２６２５、ＷＯ ９７／００７８、ＷＯ ９７／３５９６６、ＷＯ ９８／２７２３０、ＷＯ ００／４２６５１、ＷＯ ０１／７５７６７、およびＷＯ ２００９／１５２３３６を参照のこと（これらの全ては、参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、変異誘発処理後に得た酵素バリアントは、その酵素バリアントを定められた温度（または、その他のアッセイ条件）に曝露し、熱処理またはその他のアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次いで、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡは、宿主細胞から単離され、シーケンシングしてヌクレオチド配列の変化（もしあれば）が同定され、前記とは異なるまたは同じ宿主細胞中で酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技術）を使用して行うことができる。
配列が既知の操作されたポリペプチドについて、前記酵素をコードするポリヌクレオチドは、既知の合成方法に従って、標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態において、約１００塩基までのフラグメントを個別に合成し、次いで（例えば、酵素的または化学的ライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）方法、またはポリメラーゼを利用した方法によって）連結し、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、古典的なホスホラミダイト法を用いた化学合成（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９－６９［１９８１］；およびＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．，３：８０１－０５［１９８４］を参照のこと）によって（この方法が、自動化された合成方法において一般に実行されるため）調製することができる。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適切なベクター中にクローニングされる。
したがって、いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドを調製するための方法は、以下の（ａ）および（ｂ）、すなわち（ａ）表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、および／または９－１中に提供される任意のバリアントのアミノ酸配列、ならびに配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること、および（ｂ）前記ポリヌクレオチドにコードされるＧＬＡポリペプチドを発現させること、を含んでいてもよい。本方法のいくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、１個から数個（例えば、３、４、５個まで、または１０個まで）のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有していてもよい。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、必要に応じて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、または１～５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態において、前記置換は、保存的または非保存的置換であり得る。
発現された操作されたＧＬＡポリペプチドは、任意の所望の改善された特性（例えば、活性、選択性、安定性、酸耐性、プロテアーゼ感受性など）について、当該技術分野で知られた任意のアッセイ（本明細書に記載のアッセイおよび条件が含まれるが、それらに限定されない）を用いて評価され得る。
いくつかの実施形態において、宿主細胞中で発現された操作されたＧＬＡポリペプチドは、いずれも、タンパク質精製のための周知の技術（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、ろ過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーが含まれる）の１つまたはそれを超えるいずれかの技術を用いて、細胞および／または培養培地から回収される。
ＧＬＡポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー 高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーがあげられる。特定の酵素を精製するための条件は、部分的には、例えば、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に依存し、それらは当業者には明らかである。いくつかの実施形態において、改善されたバリアントＧＬＡ酵素を単離するために、アフィニティー技術を用いてもよい。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するいくつかの実施形態において、バリアントＧＬＡポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するいくつかの実施形態において、ＧＬＡに共有結合したグリカンに結合するタンパク質が使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製を利用するさらに他の実施形態において、ＧＬＡ活性部位に結合する任意の小分子が使用される。抗体の生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、それらに限定されない）が、ＧＬＡポリペプチド（例えば、ＧＬＡバリアント）、またはそのフラグメントを注射することによって免役される。いくつかの実施形態において、ＧＬＡポリペプチドまたはフラグメントは、側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーによって、適切なキャリア（例えば、ＢＳＡ）に結合される。
いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、本明細書に記載の操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）、またはＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（例えば、ＣＨＯ））を、前記操作されたＧＬＡポリペプチドの産生を促す条件下で培養すること、および前記細胞および／または培養培地から前記操作されたＧＬＡポリペプチドを回収することを含む方法によって、前記宿主細胞中で産生される。
いくつかの実施形態において、本発明は、操作されたＧＬＡポリペプチドの産生方法であって、参照配列（例えば、配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４）に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、かつ配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のアミノ酸配列と最適にアラインされた場合、配列番号８と比較して、表２－１、５－１、６－１、７－１、８－１、９－１に提供されるアミノ酸残基の相違および／またはその組み合わせから選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違を有する、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真核細胞を、前記操作されたＧＬＡポリペプチドの産生を可能にする適切な培養条件下で培養すること、ならびに、必要に応じて、培養物および／または培養細胞から前記操作されたＧＬＡポリペプチドを回収することを含む、方法を包含する。
いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドが組換え宿主細胞または細胞培養培地から回収されたら、その回収された操作されたＧＬＡポリペプチドは、当該技術分野で知られている任意の適切な方法によってさらに精製される。いくつかの追加の実施形態において、精製ＧＬＡポリペプチドは、異なる用途および使用（例えば、医薬組成物）に適切なように、その他の成分および化合物と組み合わされて、操作されたＧＬＡポリペプチドを含む組成物および製剤が提供される。いくつかの追加の実施形態において、精製された操作されたＧＬＡポリペプチド、または製剤化された操作されたＧＬＡポリペプチドは、凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、体内（すなわち、ヒトまたは別の動物などの体内の細胞）で直接産生され、精製は行われない。しかしながら、いくつかの代替的な実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、体内（すなわち、ヒトまたは別の動物などの体内の細胞）で産生され、その体から、当該技術分野で知られている方法を用いて収集される。いくつかの追加の実施形態において、これらの収集された操作されたＧＬＡポリペプチドは、精製される。さらにいくつかのさらなる実施形態において、これらの収集および／または精製された操作されたポリペプチドは、別の動物（例えば、ヒトまたは別の動物）に導入されるか、またはその収集および／または精製された操作されたポリペプチドが産生された元の体内に再導入される。
組成物：
本発明は、種々の組成物およびフォーマット（下記のものが含まれるが、それらに限定されない）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物およびその他の組成物（例えば、食事／栄養サプリメント）における使用に適した、操作されたＧＬＡポリペプチドを提供する。
投与モードに応じて、本発明による治療有効量の操作されたＧＬＡを含むこれらの組成物は、固体、半固体、または液体の形態である。いくつかの実施形態において、組成物は、その他の医薬的に許容され得るコンポーネント、例えば、希釈剤、バッファー、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、フィラー、およびその他の成分を含有する。製剤化および投与のため技術についての詳細は、当該技術分野において周知であり、文献に記載されている。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、遺伝子療法としてヒトの体に導入された後、その体内で直接生成される。
いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、医薬組成物において使用するために製剤化される。操作されたＧＬＡポリペプチドの送達において使用するための任意の適切なフォーマットが本発明で使用され、丸薬、錠剤、ジェルタブ（ｇｅｌ ｔａｂ）剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、糖衣錠、粉剤・散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、ソフトゲル剤、ゾルゲル剤、ゲル剤、乳剤、埋込剤、パッチ剤、スプレー剤、軟膏剤、リニメント剤、クリーム剤、ペースト剤、ゼリー剤、ペイント剤、エアロゾル剤、チューインガム剤、粘滑剤、スティック剤、液剤、懸濁剤（油性懸濁剤、水中油型乳剤などが含まれるが、それらに限定されない）、スラリー剤、シロップ剤、放出調節製剤、坐剤などがあげられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、注射または注入に適したフォーマット（すなわち、注射可能製剤）で提供される。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドのためのポリヌクレオチド配列は、注射に適したフォーマットで提供される。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、ゾルゲル（シリカベースの（例えば、オキシシラン）ゾルゲルが含まれる）などの生体適合性マトリックスで提供される。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、カプセル化される。いくつかの代替的な実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、ナノ構造（例えば、ナノチューブ、ナノ細管（ｎａｎｏｔｕｂｕｌｅ）、ナノカプセルまたはマイクロカプセル、ミクロスフェア、リポソームなど）内にカプセル化される。もっとも、本発明は、いかなる特定の送達製剤および／または送達手段に限定されることも意図されていない。当該技術分野で知られている任意の適切な手段（非経口、経口、局所、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、インプラントによる手段が含まれるが、これらに限定されない）によって操作されたＧＬＡポリペプチドが投与されることが意図されている。
いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、グリコシル化、化学架橋試薬、ペグ化（すなわち、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］または活性化ＰＥＧなどによる修飾）またはその他の化合物によって化学的に修飾される（例えば、Ｉｋｅｄａ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２９：２８３－２８７［２００５］；米国特許第７，５３１，３４１号、米国特許第７，５３４，５９５号、米国特許第７，５６０，２６３号、および米国特許第７，５３，６５３号；米国特許出願公開第２０１３／００３９８９８号、米国特許出願公開第２０１２／０１７７７２２号などを参照のこと）。もっとも、本発明は、いかなる特定の送達方法および／またはメカニズムに限定されることも意図されていない。
いくつかの追加の実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、遺伝子療法による細胞または組織への送達のために提供される（ウイルス送達ベクター（アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ＬＶ）が含まれるが、それらに限定されない）、または非ウイルスベクター（例えば、リポソーム）が含まれる）。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、ポリリボヌクレオチド配列をカプセル化された送達物（例えば、リポソームなど）中に製剤化した後、ｍＲＮＡ療法によって細胞または組織に送達するために提供される。いくつかの追加の実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、細胞療法によって細胞または組織に送達するために提供され、この場合、操作されたＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、外来性細胞に導入され、その細胞（または複数の細胞）が、レシピエント（例えば、ファブリー病を発症しているか、発症のリスクがある患者）に導入される。
いくつかの追加の実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、マトリックス安定化酵素結晶を含む製剤で提供される。いくつかの実施形態において、製剤は、架橋された結晶の操作されたＧＬＡ酵素、および前記酵素結晶に接着する反応性部分を有するポリマーを含む。本発明は、ポリマー中の操作されたＧＬＡポリペプチドも提供する。
いくつかの実施形態において、本発明の操作されたＧＬＡポリペプチドを含む組成物は、１つまたはそれを超える通常用いられるキャリア化合物を含有し、キャリア化合物としては、それらに限定されないが、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、および／またはソルビトール）、デンプン（例えば、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、またはその他の植物デンプン）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ゴム（例えば、アラビア、トラガカント、グアーなど）、および／またはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲンなど）があげられる。
いくつかの実施形態において、本発明は、体液（例えば、血液、脳脊髄液など）中の糖脂質の濃度を低下させるための使用に適した操作されたＧＬＡポリペプチドを提供する。操作されたＧＬＡポリペプチド（単数または複数）の投与量は、状態または疾患、対象の全身状態、および当業者に知られているその他の因子に依存する。いくつかの実施形態において、組成物は、単回投与または複数回投与を意図するものである。いくつかの実施形態において、ファブリー病のヒトに投与される組成物（単数または複数）中の操作されたＧＬＡポリペプチド（単数または複数）の濃度は、疾患（例えば、ファブリー病）を効果的に処置および／または改善するために十分であることが意図される。いくつかの実施形態において、操作されたＧＬＡポリペプチドは、他の医薬組成物および／または食物組成物と組み合わせて投与される。
以下の実施例（実験および得られた結果が含まれる）は、単に例示を目的として提供されており、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
以下の実験に関する開示において、下記の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；℃（セ氏温度）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般的に使用される実験室用大腸菌株、ＣＧＳＣ（ｔｈｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）；）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）；ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＰＭＢＳ（ポリミキシンＢ硫酸塩）；ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）；ＧＩＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）；ＦＩＯＰＣ（ポジティブコントロールに対する改善の倍数）；ＰＢＭＣ（末梢血単核球）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）；ＭｅＯＨ（メタノール）；Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）；ＰｒｏＳｐｅｃ（ＰｒｏＳｐｅｃ Ｔａｎｙ Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｎｋｅｒｓ，ＮＹ）；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｌ，Ｃｏｒｐ．，Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）；Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｈｎｅｒ，ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ａｘｙｇｅｎ（Ａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一部），Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ），Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）；Ｇｉｂｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（現在は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）；ＸｅｎｏＴｅｃｈ（Ｓｅｋｉｓｕｉ ＸｅｎｏＴｅｃｈ，ＬＬＣ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＫＳ）；Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）；ＶＷＲ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）；Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）；Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；ＬＩ－ＣＯＲ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）；Ａｍｉｃｕｓ（Ａｍｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ）；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）；Ｏｐｔｉｍａｌ（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）；ａｎｄ Ｂｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
以下のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本発明において使用される。いくつかのケースにおいて（下記のように）、ポリヌクレオチド配列に、コードされているポリペプチドが続く。
完全長ヒトＧＬＡ ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列（配列番号１）：
Figure 2022515742000002
 完全長ヒトＧＬＡのポリペプチド配列：
Figure 2022515742000003
 成熟酵母コドン最適化（ｙＣＤＳ）ヒトＧＬＡのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000004
Figure 2022515742000005
 成熟ヒトＧＬＡ（天然ｈＣＤＳ）のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000006
 成熟ヒトＧＬＡのポリペプチド配列：
Figure 2022515742000007
 ｐＣＫ１１０９００ｉ Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000008
Figure 2022515742000009
Figure 2022515742000010
 ｐＹＴ－７２Ｂｇｌ分泌酵母発現ベクターのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000011
Figure 2022515742000012
Figure 2022515742000013
Figure 2022515742000014
Figure 2022515742000015
Figure 2022515742000016
 バリアント番号７３ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000017
 バリアント番号７３のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000018
Figure 2022515742000019
 バリアント番号７３のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000020
 バリアント番号２１８ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000021
 バリアント番号２１８ ｈＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000022
Figure 2022515742000023
 バリアント番号２１８のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000024
 バリアント番号３２６ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000025
 バリアント番号３２６のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000026
Figure 2022515742000027
 バリアント番号２０６ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000028
 バリアント番号２０６ ｈＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000029
 バリアント番号２０６のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000030
 バリアント番号２０５ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000031
 バリアント番号２０５ ｈＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000032
Figure 2022515742000033
 バリアント番号２０５のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000034
 バリアント番号７６ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000035
 バリアント番号７６ ｈＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000036
Figure 2022515742000037
 バリアント番号７６のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000038
 Ｍｆαシグナルペプチドのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000039
 Ｍｆαシグナルペプチドのポリペプチド配列：
Figure 2022515742000040
 ＭＭＯ４３５のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000041
 ＭＭＯ４３９のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000042
 ＭＭＯ５１４のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000043
 ＭＭＯ４８１のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000044
 合成哺乳動物シグナルペプチドのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000045
 ＬＡＫＥ Ｆｗのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000046
 Ｂｒリバースのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000047
 Ｂｒ Ｆｗのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000048
 ｈＧＬＡ Ｒｖのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000049
 ＳＰ－ＧＬＡ（ｙＣＤＳ）のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000050
 ＭＦリーダー－ＧＬＡ（ｙＣＤＳ）のポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000051
Figure 2022515742000052
 ＭＦリーダーのポリペプチド配列：
Figure 2022515742000053
 バリアント番号３９５ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000054
 バリアント番号３９５のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000055
 バリアント番号４０２ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000056
 バリアント番号４０２のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000057
 バリアント番号６２５ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000058
Figure 2022515742000059
 バリアント番号６２５のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000060
 バリアント番号６４８ ｙＣＤＳのポリヌクレオチド配列：
Figure 2022515742000061
 バリアント番号６４８のポリペプチド配列：
Figure 2022515742000062
 実施例１
ＧＬＡ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
ＷＴヒトＧＬＡ配列（配列番号２）をコードする合成遺伝子（配列番号１）およびそれに由来するバリアント（配列番号４、配列番号６）を、以前に記述されているように構築した（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０３６０９００Ａ１号を参照のこと）。哺乳動物細胞における分泌発現および一過性トランスフェクションのために、異なるＧＬＡバリアントをコードする合成遺伝子に融合した合成マウスＩＧシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｐｌｏｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むキメラＧＬＡ発現コンストラクトを、以下のように作成した。オリゴヌクレオチドＢａｍＨＩ－ｐｃＤＮＡ－ＧＬＡ－Ｆ（配列番号６３）およびＸｈｏＩ－ｐｃＤＮＡ－ＧＬＡ－Ｒ（配列番号６４）を、シグナルペプチドをコードするフラグメントおよびＧＬＡバリアントの成熟形態のコード配列を増幅するために使用した。ＰＣＲ生成物を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ線状化哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にライゲーションした。当業者に一般に知られている定向進化技術を、このプラスミドコンストラクト内の配列番号８に由来する遺伝子バリアントを生成するために使用した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照のこと）。
実施例２
ハイスループット成長およびアッセイ
ＧＬＡおよびＧＬＡバリアントのハイスループット（ＨＴＰ）成長
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたリポフェクションを使用して、野生型ＧＬＡまたはＧＬＡバリアントに融合した合成マウスＩＧシグナルペプチドをコードするｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターでトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、成長培地（１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ［いずれもＣｏｒｎｉｎｇから入手した］）中で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を、１０５細胞／ウェル／２５０μＬ成長培地の密度で、ＮＵＮＣ（登録商標）Ｅｄｇｅ２．０ ９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で２４～７２時間インキュベートし、ＧＬＡバリアントを発現および分泌させた。ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクションから得た馴化培地（５０～１００μＬ）を、活性および／または安定性分析のために、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルソリッド黒プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。
上清のＨＴＰ分析
ＧＬＡバリアントの活性を、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＭＵＧａｌ）の加水分解を測定することによって決定した。非チャレンジアッセイについては、５０μＬのＨＥＫ２９３Ｔ馴化培地（上記のように作製した）を、５０μＬの１ｍＭ ＭＵＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９：１８３－１８６［１９２１］）中、ｐＨ４．８）と、９６ウェル黒不透明底マイクロタイタープレート中で混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で３０～１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）でクエンチした。加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして分析した。このアッセイの結果を表２－１に示す。
酸で前処理した上清のＨＴＰ分析
ＧＬＡバリアントを、リソソーム内でバリアントが遭遇する極端なｐＨをシミュレートするために、酸性バッファーでチャレンジした。まず、５０μＬのＨＥＫ２９３Ｔ馴化培地と５０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ３．３～４．３）を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに加えた。プレートをＰｌａｔｅＬｏｃ（登録商標）マイクロプレートヒートシーラー（Ａｇｉｌｅｎｔ）でシールし、３７℃で１～２時間インキュベートした。ｐＨ４チャレンジアッセイについては、５０μＬの酸性ｐＨチャレンジサンプルを５０μＬの１ｍＭ ＭＵＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー中、ｐＨ４．４）と混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で３０～１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）でクエンチした。加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして分析した。このアッセイの結果を表２－１に示す。
塩基で前処理した上清のＨＴＰ分析
ＧＬＡバリアントを、患者に投与した後に、血液中でバリアントが遭遇するｐＨをシミュレートするために、塩基性（中性）バッファーでチャレンジした。まず、５０μＬのＧＬＡバリアントのＨＥＫ２９３Ｔ馴化培地と５０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ７．０～８．２）を、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに加えた。プレートをシールし、３７℃で１～１８時間インキュベートした。ｐＨ７チャレンジアッセイについては、５０μＬの塩基性ｐＨチャレンジサンプルを、５０μＬの１ｍＭ ＭＵＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー中、ｐＨ４．４）と混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で３０～１８０分間インキュベートしてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）でクエンチした。加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして分析した。このアッセイの結果を表２－１に示す。
Figure 2022515742000063
Figure 2022515742000064
 実施例３
ＧＬＡバリアントの産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＬＡの産生
哺乳動物細胞おけるＧＬＡバリアントの分泌発現は、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって行った。細胞は、実施例１に記載されているように、Ｎ末端合成哺乳動物シグナルペプチドに融合したＧＬＡバリアント（配列番号３、４、９、１２、１７、２０、２３、および４１）でトランスフェクトし、哺乳動物発現ベクターｐＬＥＶ１１３にサブクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞は、プラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、当業者に知られている標準的な技術を用いて、懸濁状態で４日間成長させた。上清を集め、分析まで４℃で保存した。
実施例４
ＧＬＡバリアントの精製
哺乳動物細胞上清からのＧＬＡバリアントの精製
ＷＴ ＧＬＡ（配列番号２）を、哺乳動物培養上清から、文献（Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ，．３７：４９９－５０６［２００４］）に記載されているように精製した。全ての他のＧＬＡバリアントは、以下のように精製した。ＧＬＡバリアントは、基本的には当該技術分野で知られているように（Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ，．３７：４９９－５０６［２００４］を参照のこと）、哺乳動物培養上清から精製された。コンカナバリンＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２（ｐＨ６．０）（コンカナバリンＡ結合バッファー）で平衡化した。上清を、カラムに負荷する前に、０．２μｍボトムトップフィルターで滅菌ろ過した。負荷した後、カラムをカラム容量の１０倍のコンカナバリンＡ結合バッファーで洗浄し、結合したタンパク質は、０．９Ｍ メチル－α－Ｄーマンノピラノシドと０．９Ｍ メチル－α－Ｄーグルコピラノシドを加えたコンカナバリンＡ結合バッファーで溶出させた。溶出したタンパク質を濃縮し、分子量カットオフ３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を取り付けたＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １５ｍＬろ過ユニットを使用して、バッファーを保存バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１８５μＭ ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０非イオン性界面活性剤、ｐＨ６．０）に交換した。保存バッファー中のＧＬＡを、ＡＮＯＴＯＰ（登録商標）０．２μｍシリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）によって滅菌ろ過し、－８０℃で保存した。精製によって、培養上清１ｍｌあたり２．４～５０μｇ（ＢＣＡ定量による）の精製タンパク質が得られた。
ＢＣＡタンパク質アッセイによるタンパク質定量
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、精製ＧＬＡの定量に使用した。マイクロタイタープレートにおいて、適切に希釈した２５μＬのタンパク質スタンダードおよび精製ＧＬＡを、５０部（ｐａｒｔｓ）のＢＣＡ試薬Ａと１部のＢＣＡ試薬Ｂを含有するＷｏｒｋｉｎｇ試薬２００μＬと混合した。プレートは、プレートシェーカー上で、３０秒間、十分に混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを室温まで冷やした後、サンプルの吸光度を、プレートリーダーを使用して、５６２ｎｍで測定した。
実施例５
ＧＬＡバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付け
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現されたＧＬＡバリアントの熱安定性
ＧＬＡバリアントを、酵素の全体的な安定性を評価するために、種々の温度チャレンジに曝露した。まず、５０μＬ（１×ＰＢＳ中、ｐＨ６．２）の精製ＧＬＡおよびＧＬＡバリアント（ＨＥＫ２９３Ｔで発現されたもの）を、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｂｉｏｒａｄ、ＨＳＰ－９６０１）のウェルに加えた。プレートをシールし、サーモサイクラーの温度勾配プログラムを用いて、３０～５０℃で１時間インキュベートした。アッセイのために、２５μＬのチャレンジ上清を、２５μＬの１ｍＭ ＭＵＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー中、ｐＨ４．４）と混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で６０分間インキュベートしてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）でクエンチした。加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして分析した。残存活性のパーセントは、３０℃～５０℃の温度範囲における１時間のインキュベーションについて、チャレンジサンプルの活性を非チャレンジサンプルの活性で除算することによって算出した（ここで、「非チャレンジ」は、時間０において測定された加水分解であり、「チャレンジ」は、各バリアントについて、特定の温度において、１時間の時点で測定された加水分解である）。このアッセイの結果を表５－１に示す。図１は、種々の温度において１時間インキュベートした後の、ＧＬＡバリアントの残存活性を表すグラフを示す。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現されたＧＬＡバリアントの血清安定性
血液の存在下におけるバリアントの相対的安定性を評価するために、サンプルを血清に曝露した。まず、１００μＬの７．５μｇ／ｍＬ精製ＧＬＡバリアント（１×ＰＢＳ中、ｐＨ６．２）と９０μＬのヒト血清を、ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。プレートをシールし、３７℃で０～２４時間インキュベートした。アッセイのために、５０μＬのチャレンジ上清を５０μＬの１ｍＭ ＭＵＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー中、ｐＨ４．４）と混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で９０分間インキュベートしてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）でクエンチした。加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして分析した。２４時間後の血清中の残存活性のパーセントは、チャレンジサンプルの活性を非チャレンジサンプルの活性で除算することによって算出した（ここで、「非チャレンジ」は、時間０において測定された加水分解であり、「チャレンジ」は、各バリアントについて、特定の時点において測定された加水分解である）。結果を表５．１に示す。図２は、ヒト血清で０～２４時間チャレンジした後の、ＧＬＡバリアントの残存活性を表すグラフを示す。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現されたＧＬＡバリアントのリソソーム安定性
リソソームのプロテアーゼおよびリソソームのその他のコンポーネントの存在下におけるバリアントの相対的安定性を評価するために、ＧＬＡバリアントを、本明細書に記載のように、製造業者の指示に多少の変更を加えて、ヒトリソソームライセート（ＸｅｎｏＴｅｃｈ、＃Ｈ０６１０．Ｌ）に曝露した。簡潔に言えば、ＧＬＡバリアントを適切な濃度範囲（０．０６２５～０．００７８１２５ｍＭ）に希釈し、その希釈物１０μＬを、ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェル丸底プレート（＃３７９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、１０μＬのヒトリソソームライセート１：２０希釈物（２×異化バッファー（ＸｅｎｏＴｅｃｈ、＃Ｋ５２００）中）と組み合わせた。プレートをシールし、３７℃で０～２４時間インキュベートした。アッセイのために、５０μＬのチャレンジ上清を５０μＬの１ｍＭ ＭＵＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー中、ｐＨ４．４）と混合した。反応物を短時間混合し、３７℃で９０分間インキュベートしてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）でクエンチした。加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして分析した。２４時間後のリソソーム抽出物中の残存活性のパーセントは、チャレンジサンプルの活性を非チャレンジサンプルの活性で除算することによって算出した（ここで、「非チャレンジ」は、時間０において測定された加水分解であり、「チャレンジ」は、各バリアントについて、４時間および２４時間において測定された加水分解である）。結果を表５．１に示す。図３は、ヒトリソソーム抽出物で０～２４時間チャレンジした後の、ＧＬＡバリアントの残存活性を表すグラフを示す。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現された精製されたＧＬＡバリアントの、ファブリー線維芽細胞における細胞取り込み
ＧＬＡバリアントが培養細胞内にエンドサイトーシスされる全体的な能力を評価するために、参照酵素（ＷＴ ＧＬＡ［配列番号２］）と比較したＧＬＡバリアントの細胞取り込みを決定した。ファブリー線維芽細胞（ＧＭＯ２７７５、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、最小必須培地（ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＃１１０９５－０８０、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｇｉｂｃｏ ＃１１１４０－０５０）と１５％ウシ胎仔血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３５－０１６－ＣＶ））を添加）を含有する１２ウェル培養皿（ＶＷＲ、＃１０８６１－６９８）に播種し、コンフルエンシーまで成長させた（３７℃、５％ＣＯ２で２～３日）。コンフルエンシーに達した後、添加したＭＥＭを滅菌真空によって除去し、１ｍＬ／ウェルの無血清ＭＥＭ＋１％ＮＥＡＡで置き換えた。実施例４に記載されているように精製された酵素は、１０μｇ ＧＬＡ／ｍＬで細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。無血清培地を滅菌真空で吸引し、細胞を１ｍＬ １×ＰＢＳ／ウェルで短時間洗浄し、ＰＢＳを滅菌真空で吸引した。細胞を２００μＬ／ウェルの０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＶＷＲ ＃０２－０１５４－０１００）でトリプシン処理し、室温でおよそ５分間インキュベートしてプレートから接着細胞を取り除き、残存する細胞外ＧＬＡを分解した。次いで、５００μＬの無血清ＭＥＭを各ウェルに加え、サンプルを１．５ｍＬマイクロ遠心管に移した。サンプルを８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をペレット化した。培地を、１０００μＬピペットで穏やかに吸引した。細胞ペレットを、５００μＬの１×ＰＢＳに再度懸濁し、８０００ｒｐｍ、５分間で再度ペレット化し、ＰＢＳを穏やかに除去した。次いで、１００μＬの溶解バッファー（１×ＰＢＳ中に希釈した０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商標）非イオン界面活性剤（Ｓｉｇｍａ ＃９３４４３））を各サンプルに加えた後、１～２分間超音波処理し、１２，０００～１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を、タンパク質および活性アッセイのために、滅菌したＰＣＲチューブに移した。活性アッセイについては、１０μＬの細胞溶解サンプルを５０μＬの２．５ｍＭ ＭＵＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー中、ｐＨ４．６）と混合した。反応プレートをシールし、３７℃で６０分間インキュベートしてから、ウェルごとに１４０μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）で反応をクエンチした。ＭＵＧａｌの加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして決定した。タンパク質定量については、ＢＣＡアッセイを、製造業者の指示（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）に以下のような変更を加えて実施した：１０μＬの細胞溶解サンプルを１９０μＬのＢＣＡ Ｗｏｒｋｉｎｇ試薬と混合し、プレートをシールし、３７℃で６０分間インキュベートした。サンプルを、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、吸光度（５６２ｎｍ）をモニターして分析した。タンパク質濃度は、ＢＳＡ標準曲線から算出した。各ＧＬＡバリアントの細胞取り込みは、まず酵素処理サンプルから未処理細胞のバックグラウンドの非酵素的蛍光を差し引き、次いで、各ウェルにおけるタンパク質濃度に対して正規化した。細胞取り込みＦＩＯＰＣは、正規化したＧＬＡバリアントの細胞内活性を対照（ＷＴ）の対応する活性で除算することによって算出した。図４は、３７℃で４時間インキュベートした後のファブリー患者培養線維芽細胞における精製されたＧＬＡバリアントの細胞取り込みを、野生型（配列番号２）と比較した相対活性で表したグラフを示す。
Figure 2022515742000065
Figure 2022515742000066
 ファブリー線維芽細胞のライセートにおけるＧＬＡ活性のＨＴＰ分析
ＨＴＰ中で産生されたＧＬＡバリアントを、細胞内へ取り込まれ、２４～９６時間にわたって活性を保持するようにチャレンジした。ファブリー線維芽細胞（ＧＭＯ２７７５、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を蒔き、２４～７２時間にわたってコンフルエンシーまで成長させた。コンフルエンシーに達した後、ＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットを使用して培地を除去した。上記のように一過性トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの馴化培地をファブリー線維芽細胞に加え、細胞を、ＧＬＡバリアントと、３７℃、５％ＣＯ２で２～４時間インキュベートした。ＧＬＡ含有馴化培地をＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。次いで、細胞を１５０μＬ １×ＤＰＢＳ／ウェルで短時間洗浄し、ＤＰＢＳをＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。次いで、２００μＬの完全成長培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに２４～７２時間戻しておいた。インキュベーションの終了にあたり、完全成長培地をＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。細胞を１５０μＬ １×ＤＰＢＳ／ウェルで洗浄し、ＤＰＢＳをＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。細胞を、５０μＬのＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ４．４、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商標）非イオン界面活性剤（Ｓｉｇｍａ ＃９３４４３）を添加）を添加し、室温で３０分間撹拌することによって溶解した。活性は、５０μＬの１．５ｍＭ ＭｕＧａｌ（ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー、ｐＨ４．４）を加えることによって評価した。プレートをシールし、４００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で３６０分間インキュベートしてから、１００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．２）でクエンチした。加水分解は、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光（励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ）をモニターして分析した。細胞取り込みＦＩＯＰＣは、正規化したＧＬＡバリアントの細胞内活性を参照配列の対応する活性で除算することによって算出した。
ファブリー線維芽細胞における、ＧＬＡによって誘導されたグロボトリアオシルセラミドの除去のＨＴＰ分析
ＨＴＰ中で産生されたＧＬＡバリアントを、細胞内へ取り込まれ、グロボトリアオシルセラミドの細胞負荷を低減するようにチャレンジした。ファブリー線維芽細胞（ＧＭＯ２７７５、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を蒔き、２４～７２時間にわたってコンフルエンシーまで成長させた。コンフルエンシーに達した後、ＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットによって培地を除去した。上記のように一過性トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって生成された馴化培地を線維芽細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２～４時間インキュベートした。ＧＬＡ含有馴化培地をＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。次いで、細胞を１５０μＬ １×ＤＰＢＳ／ウェルで短時間洗浄し、ＤＰＢＳをＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。次いで、２００μＬの完全成長培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに２４～７２時間戻しておいた。インキュベーションの終了にあたり、完全成長培地をＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。次いで、細胞を１５０μＬ １×ＤＰＢＳ／ウェルで洗浄し、ＤＰＢＳをＢｉｏＭｅｋ ｉ５自動液体処理ロボットで除去した。グロボトリアオシルセラミドを、１０ｎｇ／ｍＬ Ｎ－ヘプタデカノイル－セラミドトリヘキソシドを添加したメタノール２００μＬ中に、穏やかに撹拌しながら、室温で３０分間抽出した。メタノール抽出物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ疎水性フィルタースタックを通して、９６ウェル丸底プレート中にろ過した。細胞のグロボトリアオシルセラミドを、基本的には当該技術分野で知られているように（Ｐｒｏｖｅｎｃａｌら、Ｂｉｏａｎａｌ．，８：１７９３－１８０７［２０１６］を参照のこと）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって定量した。各細胞サンプルについてのピーク積分値の合計を決定し、正規化したＧＬＡバリアントのグロボトリアオシルセラミドレベルの変化を参照配列で除算することによって、グロボトリアオシルセラミドＦＩＯＰＣを算出した。
実施例６
配列番号５８に由来するＧＬＡバリアント
本実施例において、ファブリー線維芽細胞におけるＧＬＡバリアントの活性およびＧＬＡバリアントによるＧｂ３クリアランスを評価するために行った実験を説明する。本実施例において、配列番号５８を参照配列として使用した（すなわち、バリアントにおけるアミノ酸の相違は配列番号５８と比較して示され、アッセイ結果は配列番号５８について得られた結果と比較して報告される）。これらの実験において、ＧＬＡバリアントは、実施例５に記載されているように、プレインキュベーションなしで、ＭＵ－Ｇａｌ活性について試験した。バリアントは、実施例５に記載されているように、ファブリー線維芽細胞におけるＧｂ３除去についても試験した。
Figure 2022515742000067
Figure 2022515742000068
Figure 2022515742000069
Figure 2022515742000070
Figure 2022515742000071
 実施例７
配列番号１５８に由来するＧＬＡバリアント
本実施例において、ファブリー線維芽細胞におけるＧＬＡバリアントの活性、ｐＨ７．４における安定性、および、細胞内活性を評価するために行われた実験を説明する。本実施例において、参照配列は配列番号１５８であった（すなわち、バリアントにおけるアミノ酸の相違は配列番号１５８と比較して示され、アッセイ結果は配列番号１５８についての結果と比較して報告される）。バリアントは、実施例５に記載されているように、プレインキュベーションなし（非チャレンジ）で、およびｐＨ７．４のプレインキュベーション後に、ＧＬＡ ＭＵ－Ｇａｌ活性について試験した。バリアントは、実施例５に記載されているように、ＧＬＡバリアントと共にインキュベートされたファブリー線維芽細胞の溶解後のＭＵ－Ｇａｌ活性についても試験した。
Figure 2022515742000072
Figure 2022515742000073
Figure 2022515742000074
 実施例８
配列番号３７２に由来するＧＬＡバリアント
本実施例において、ファブリー線維芽細胞におけるＧＬＡバリアントの活性、ｐＨ７．４における安定性、Ｇｂ３クリアランス、および細胞内活性を評価するために行われた実験を説明する。本実施例において、参照配列は配列番号３７２であった（すなわち、バリアントにおけるアミノ酸の相違は配列番号３７２と比較して示され、アッセイ結果は配列番号３７２についての結果と比較して報告される）。これらのバリアントは、実施例５に記載されているように、プレインキュベーションなし（「非チャレンジ」）で、およびｐＨ７．４のプレインキュベーション後に、ＭＵ－Ｇａｌ活性について試験した。バリアントは、実施例５（「ライセートＦＩＯＰＣ」）に記載されているように、ＧＬＡバリアントと共にインキュベートされたファブリー線維芽細胞におけるＭＵ－Ｇａｌ活性についても試験した。バリアントは、実施例５（「Ｇｂ３ ＦＩＯＰＣ」）に記載されているように、ＧＬＡバリアントとのインキュベーション後のファブリー線維芽細胞におけるＧｂ３の除去についても試験した。
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 実施例９
配列番号３７４に由来するＧＬＡバリアント
本実施例において、一連のチャレンジまたは個別のチャレンジ後の酵素活性をアッセイすることによってＧＬＡバリアントの活性を決定するために行われた実験を説明する。これらのバリアントは、実施例５に記載されているように、プレインキュベーションせずに、およびｐＨ７．４のプレインキュベーションの後に試験した。バリアントは、実施例５に記載されているように、バリアントと共にインキュベートされたファブリー線維芽細胞の溶解後のＭＵ－Ｇａｌ活性についても試験した。バリアントは、実施例５に記載されているように、インキュベーション後のファブリー線維芽細胞におけるＧｂ３除去についても試験した。
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 実施例１０
ＧＬＡバリアントのｉｎ ｖｉｖｏ特徴付け
ＧＬＡバリアントを、蓄積したＧｂ３に対する活性について、ｉｎ ｖｉｖｏで特徴付けした。ファブリーマウス（５月齢雌性；Ｊａｃｋｓｏｎ、系統＃３５３５）および、同齢同性で遺伝的背景が同一な野生型マウスを使用した。マウスに、尾静脈注射により、Ｃｏｄｅｘｉｓ酵素バリアント（１．０ｍｇ／ｋｇ）を単回投与した。動物を、予定された時点（注射後１および２週間）で、ＣＯ２麻酔を用いて屠殺し、疾患関連組織（例えば、心臓および腎臓）を２つの部分（一方は酵素活性アッセイ用、他方はＧｂ３定量用）に切り分け、ドライアイス上で冷凍し、分析まで－８０℃で保存した。酵素アッセイについては、マウス組織を、ガラスホモジナイザー内で、モーター駆動テフロン（登録商標）コート乳棒を使用して、２０倍の体積（ｗ／ｖ）の溶解バッファー（１×ＰＢＳ中に希釈した０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商標）非イオン界面活性剤（Ｓｉｇｍａ ＃９３４４３））中でホモジナイズした。ライセートを、超音波処理し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、その上清を酵素アッセイに使用した。α－Ｇａｌ Ａ活性は、標準的な蛍光定量的アッセイによって、５ｍＭ ４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドを使用して、ｐＨ４．４で、０．１Ｍ Ｎ－アセチルガラクトサミン（すなわち、α－ガラクトシダーゼＢの特異的阻害剤）の存在下で測定した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）を使用して測定した。活性は、タンパク質濃度に対して正規化し、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／時間で表した。Ｇｂ３濃度は、質量分析法によって、以前に記述されているように測定した（Ｄｕｒａｎｔら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，５２：１７４２－６［２０１１］を参照のこと）。簡潔に言えば、マウス組織を、ガラスホモジナイザー内で、氷冷した２０倍の体積の超純水中でホモジナイズし、全タンパク質２００μｇに相当するライセートをスフィンゴ糖脂質抽出にかけ、けん化し、続いて質量分析法によってＧｂ３を分析した。Ｇｂ３濃度は、ｎｇ／ｍｇタンパク質として表した。図５は、処置後１、２、および４週間における、Ｆａｂｒｙマウスモデルの心臓におけるｉｎ ｖｉｖｏ酵素活性を表すグラフを示す。図６は、未処置動物と比較した、処置後１および２週間における、Ｆａｂｒｙマウスモデルの心臓組織におけるＧｂ３の分解を表すグラフを示す

Claims (44)

  1. 配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えαガラクトシダーゼＡおよび／または生物学的に活性な組換えαガラクトシダーゼＡフラグメント。
  2. 前記組換えαガラクトシダーゼが、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡが、４４、４４／２１７、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２、４４／２１７／３２２／３３７、４４／２４７、４４／２４７／３０２、４４／２４７／３０２／３２２、４４／２４７／３２２、４４／２４７／３３７、４４／２４７／３６２、４４／３０２、４４／３３７、４４／３７３、２１７／３２２、２１７／３７３、２４７／３２２、２４７／３６２、３０２／３２２／３６２／３７３、３０２／３３７、３１６、３１６／３３７、３２２、３２２／３３７、３６２／３７３、および３７３，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む、請求項１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  3. 前記組換えαガラクトシダーゼが、配列番号８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡが、１０／３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／２１７／２４７／２６１／２７１／３０２／３１６／３２２／３３７／３６２／３６８／３７３／３９２、４４／２１７／３１６、４４／２１７／３２２／３３７、１６６／３６２、２１７／３７３、および３６２／３７３，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む、請求項１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  4. 前記組換えαガラクトシダーゼが、配列番号５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡが、７、７／４８／６８、７／４８／６８／１２０／２８２／２９９、７／４８／１３０／２８２、７／４８／１８０、７／６８／１３０／２８２／３６５、７／６８／１８０、７／８８／１２０／３０５／３６５、７／１２０、７／１３０、７／２８２、７／３０５、７／３０５／３６５、７／３６５、３９、４７、４７／８７／９５／９６／１５８／１６２、４７／９５、４７／２７３、４７／３４３、４８、４８／６８、４８／１８０／２８２、４８／２８２、４８／２８２／３０５、６７／１８０、６８、６８／２９９／３００、７１、８７／９１／９５／９６／１５８／１６２、８７／９１／９５／９６／２０６／３４３、８７／９６／１５５／２７３／３４３、８８、９１／９５、９１／９５／９６、９２、９３、９６、９６／２７３、９６／３１２／３４３、１２０、１２０／２９９／３０５、１５１、１５８、１５８／１６２／２７３、１６２、１６２／２７３、１６２／３４３、１６６、１７８、１８０、１８１、２０６、２１７、２７１、２７３、２７３／３４３、２８２、２８２／３６５、２９３／３９１、２９９／３００、２９９／３００／３０５／３６５、３００、３０１、３０５、３０５／３６５、３１４、３３３、３３６、３３７、３４３、３４５、３６３、３６５、３７０、３８９、３９３、３９４、３９６／３９８、３９７、および３９８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む、請求項１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  5. 前記組換えαガラクトシダーゼが、配列番号１５８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡが、２４／２０２、３９／４７、３９／４７／２１７、３９／１５１、３９／２８２／３３７／３９８、３９／３３７／３４３／３９８、３９／３９３／３９８、４７／１３０、４７／１５１、４７／３４３／３４５／３９３、４８、４８／６８、４８／６８／２１７／３３３／３９１／３９３、４８／６８／３３３、４８／２１７、４８／３３３、４８／３４５／３９３、４８／３９３、５９／１４３、６８、６８／３４５、１３０、１３０／１５８、１３０／１５８／３９３、１３０／３４５／３９３、１４３／２７１、１４３／３３３、１４３／３８７、１５１、１５１／１５８／２１７／３４３／３４５／３９３、１５１／２０６／２８２／３３７／３４３／３４５／３９８、１５１／２８２／３９３、１５１／３４５／３９３／３９８、１５１／３９３、１５８、１５８／３９３、２０２、２０６、２０６／２１７、２１７、２１７／３３３、２１７／３３７／３４５／３９８、２７１、２８２／３９３、３３３、３３３／３４５、３３７／３４３／３４５／３９８、３４３、３４３／３４５／３９３／３９８、３９３、および３９３／３９８，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号１５８に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む、請求項１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  6. 前記組換えαガラクトシダーゼが、配列番号３７２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡが、１０、１０／３９／４４／３２２、１０／３９／９２／２０６／２１７／２７１、１０／３９／９２／２４７、１０／３９／９２／２４７／２７１／３１６、１０／４４、１０／４４／４７／９２／２４７、１０／４４／４７／２６１／３０２／３２２／３６８、１０／４４／９２／３１６／３２２、１０／４４／２６１／３０２／３１６、１０／４４／３０２／３３７／３６８、１０／４７／２１７／２４７／３１６／３９２、１０／４７／２１７／３２２、１０／４７／２７１、１０／９２、１０／９２／２０６／２１７／２４７、１０／９２／２０６／２４７／３１６／３２２／３９２、１０／９２／２０６／２４７／３２２／３６８、１０／９２／２１７／２６１／３０２／３３７、１０／２０６／２１７／２７１、１０／２０６／２４７、１０／２０６／２６１／２７１／３１６、１０／２６１、１０／２７１／３０２、１０／３０２、１０／３０２／３１６、１０／３０２／３２２／３３７、１０／３１６／３２２、１０／３３７／３９２、１０／３６８、３９／４４／９２／１６２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４４／９２／２１７／３２２、３９／４４／９２／２４７／２７１／３０２、３９／４７／９２／２４７／３０２／３１６／３２２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／２４７／３０２／３１６／３３７／３６８、３９／９２／３１６／３２２、３９／２４７／２７１、３９／２４７／２７１／３１６、３９／３２２、４４／４７／９２／２０６／２１７／３１６／３２２、４４／４７／９２／２４７／２６１／２７１／３１６／３３７／３６８、４４／４７／２０６／２１７／２４７／２７１／３２２、４４／４７／２４７／３２２／３６８、４４／４７／３０２／３１６／３２２、４４／９２／２０６／２４７／３６８、４４／２０６／３３７、４４／２４７／２６１／３０２／３１６、４４／２４７／２６１／３０２／３１６／３２２、４７／９２／２４７／２７１、４７／２１７／３０２、４７／２４７、４７／２４７／２７１、８９／２１７／２４７／２６１／３０２／３１６、９２／２１７／２７１、９２／２４７、９２／２４７／２７１／３２２、９２／２４７／３０２／３２２／３３７、９２／２７１／３３７、９２／３０２、９２／３１６、２０６／２１７／２７１／３９２、２１７／２４７／３１６／３２２／３３７／３６８、２４７、２４７／２７１、２４７／３０２、２７１、２７１／３０２／３２２、２７１／３１６／３２２、３０２／３２２／３６８、および３６８（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７２に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む、請求項１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  7. 前記組換えαガラクトシダーゼが、配列番号３７４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含み、前記組換えαガラクトシダーゼＡが、１０／３６／９２／１６６／２４７／２６１／３１６／３９２、１０／３９、１０／３９／４４／４７／９２／２０６／２１７、１０／３９／４４／４７／３１６、１０／３９／４４／４７／３３７、１０／３９／４４／９２／１６６／２６１／３１６／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／１６６／３９２、１０／３９／４４／９２／２１７／３０２／３２２、１０／３９／４４／９２／３０２／３２２、１０／３９／４４／１６６／２６１／２７１／３１６／３２２、１０／３９／４４／３９２、１０／３９／４７／９２／３３７、１０／３９／９２／１３１／１６６／２７１／３１６／３２２、１０／３９／９２／１６６／２１７／２４７／２７１、１０／３９／９２／２１７／３１６、１０／４４／４７／１６６／２６１／２７１、１０／４４／４７／１６６／２７１／３２２／３６８、１０／４４／４７／２１７／２７１／３１６／３２２、１０／４４／９２、１０／４４／９２／２１７／２４７／２７１／３０２／３１６／３９２、１０／４４／１６６／３０２、１０／４４／２０６／３１６／３２２、１０／４７／９２／１６６／２７１／３１６／３３７、１０／４７／９２／２７１／３０２、１０／４７／９２／３１６／３２２／３９２、１０／４７／１６６／２７１、１０／４７／１６６／３１６、１０／９２／１６６、１０／９２／１６６／２１７／２４７／２６１／２７１、１０／９２／１６６／２６１／２７１／３９２、１０／９２／１６６／２６１／３１６／３２２／３３７、１０／９２／１６６／３３７／３６８、１０／９２／３０２／３３７、１０／９２／３１６／３２２、１０／２０６、１０／２０６／２４７／２６１、１０／２１７／３２２、１０／２６１、１０／２６１／３３７／３９２、１０／３１６／３９２、１０／３６８、３９／４４／４７／９２／１６６／２０６／３９２、３９／４４／４７／９２／２０６／２４７／２６１、３９／４４／４７／９２／２０６／３９２、３９／４４／４７／２０６／３３７／３６８／３９２、３９／４４／９２／１６６／２４７／２６１／３０２／３３７、３９／４４／１６６／２７１、３９／４４／１６６／２７１／３３７／３６８／３９２、３９／４７／９２／３１６／３２２、３９／４７／９２／３９２、３９／４７／１６６／２１７／２６１／３９２、３９／４７／２１７／２４７／３６８、３９／４７／２４７、３９／９２／１６６／２１７／３９２、３９／９２／２６１／３０２、３９／１６６／２１７／２６１／３１６／３６８、３９／３２２、３９／３９２、４４／４７、４４／４７／９２／２１７／２７１、４４／４７／９２／２１７／３１６／３２２／３９２、４４／４７／９２／３９２、４４／４７／１６６、４４／４７／１６６／２７１、４４／４７／２４７／２７１／３９２、４４／３１６／３２２／３９２、４４／３３７、４７／１６６／２０６／２１７／２４７／３３７、４７／１６６／２１７／２７１／３３７、４７／２０６、４７／２１７／２４７／２６１、４７／２７１、５２／２１７／３０２／３１６、９２／１６６／２０６／２７１／３１６、９２／１６６／２１７／２６１／２７１／３９２、９２／１６６／２１７／３１６／３３７／３９２、９２／１６６／２４７、９２／１６６／３１６、９２／２０６／３２２、９２／２１７、９２／２１７／２７１／３３７、９２／２６１／２７１、９２／２７１、１６６／２１７／３１６／３２２／３３７、１６６／２４７／２７１／３１６、１６６／３１６／３２２／３３７、２０６／２１７、２１７／３９２、２４７／３１６、３１６／３２２／３６８、および３１６／３３７／３９２，（ここで、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置の番号は、配列番号３７４に基づいて付与されている）から選択される１つまたはそれを超える位置に、少なくとも１つの置換または置換セットを含む、請求項１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  8. 前記αガラクトシダーゼＡが、表２．１、５．１、６．１、７．１、８．１、および／または９．１中に提供される少なくとも１つの位置において、少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  9. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、ヒトαガラクトシダーゼＡ由来である、請求項１～８のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  10. 配列番号８、５８、１５８、３７２、および／または３７４のポリペプチド配列を含む、組換えαガラクトシダーゼＡ。
  11. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、配列番号２のαガラクトシダーゼＡよりも、熱安定性が高い、請求項１～１０のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  12. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、配列番号２のαガラクトシダーゼＡよりも、ｐＨ７において安定である、請求項１～１１のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  13. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、配列番号２のαガラクトシダーゼＡよりも、ｐＨ４において安定である、請求項１～１２のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  14. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、配列番号２のαガラクトシダーゼＡよりも、血清への曝露に対して安定である、請求項１～１３のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  15. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、配列番号２のαガラクトシダーゼＡよりも、リソソームにおいて安定である、請求項１～１４のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  16. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、配列番号２のαガラクトシダーゼＡよりも、細胞に取り込まれやすい、請求項１～１５のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  17. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、配列番号２のαガラクトシダーゼＡよりも、細胞から多くのグロボトリアオシルセラミドを除去する、請求項１～１６のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  18. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、精製されている、請求項１～１７のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  19. 前記組換えαガラクトシダーゼＡが、参照配列と比較して、ｉ）増強された酵素活性；ｉｉ）ｐＨ７に対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ４に対する増加した耐性；ｉｖ）血清に対する増加した耐性；ｖ）細胞への取り込みの増加；ｖｉ）細胞からのグロボトリアオシルセラミドの除去の増加；ｖｉｉ）低下した免疫原性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）、および／またはｖｉｉ）のいずれかの組み合わせから選択される少なくとも１つの改善された特性を示す、請求項１～１８のいずれかに記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  20. 前記参照配列が、配列番号２、８、５８、１５８、３７２、および３７４から選択される、請求項１９に記載の組換えαガラクトシダーゼＡ。
  21. 請求項１～２０のいずれかに記載の少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡを含む、組成物。
  22. 請求項１～２１のいずれかに記載の少なくとも１つの組換えαガラクトシダーゼＡをコードする、組換えポリヌクレオチド配列。
  23. 前記ポリヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡから選択される、請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
  24. 前記ポリヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
  25. 請求項２２および／または２４に記載の組換えポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
  26. 前記組換えポリヌクレオチド配列が、１つまたはそれを超える調節配列に作動可能に連結されている、請求項２５に記載の発現ベクター。
  27. 前記調節配列が、プロモーターである、請求項２６に記載の発現ベクター。
  28. 前記プロモーターが、異種プロモーターである、請求項２７に記載の発現ベクター。
  29. 請求項２５～２８のいずれかに記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  30. 前記宿主細胞が、真核生物および原核生物から選択される、請求項２９に記載の宿主細胞。
  31. 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２９および／または３０に記載の宿主細胞。
  32. αガラクトシダーゼＡバリアントの産生方法であって、請求項２９～３１のいずれかに記載の宿主細胞を、前記組換えポリヌクレオチドにコードされる前記αガラクトシダーゼＡが産生される条件下で培養することを含む、方法。
  33. 前記αガラクトシダーゼＡを回収するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記αガラクトシダーゼＡを精製するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項２１に記載の組成物を含む、ファブリー病を処置するための医薬組成物。
  36. 医薬的に許容され得る担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 前記組成物が、ヒトへの非経口注射または注入に適している、請求項３５および／または３６に記載の医薬組成物。
  38. 請求項２２～２４のいずれかに記載の組換えポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  39. 対象におけるファブリー病の症状を処置および／または予防するための方法であって、ファブリー病を有する対象を準備すること、および請求項３５～３８のいずれかに記載の医薬組成物を前記対象に与えることを含む、方法。
  40. ファブリー病の前記症状が改善される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記対象が、ファブリー病の前記症状が現れている対象が必要とする食事よりも、脂肪含有量の制限が少ない食事を食べることができる、請求項３９および／または４０に記載の方法。
  42. 前記対象が、幼児または小児である、請求項３９～４１のいずれかに記載の方法。
  43. 前記対象が、成人または若年成人である、請求項３９～４１のいずれかに記載の方法。
  44. 請求項２１、および３５～３８のいずれかに記載の組成物の使用。
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