JP2022514863A - タンパク質をコードするrna - Google Patents
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Abstract
Description
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、mRNAに関する。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、転写単位または発現ベクターにも関する。また本発明は、前記タンパク質にとって異種のタンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位または発現ベクターであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドである、転写単位または発現ベクターにも関する。また本発明は、mRNA、および/または転写単位もしくは発現ベクターを含む、治療用組成物およびキットにも関する。また本発明は、医薬として使用するための、mRNA、転写単位または発現ベクター、治療用組成物および/またはキットにも関し、特に、医薬として使用するための、i)IGF1;およびii)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むmRNAにも関する。また本発明は、骨格筋損傷を処置する方法での使用のためのmRNAおよびその治療用組成物にも関する。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、mRNAを提供する。
i)タンパク質;および
ii)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAであって、
前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、mRNAを提供し、特に、本発明は、
i)タンパク質;および
ii)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAであって、
前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、カルボキシペプチダーゼ;サイトカイン;細胞外のリガンドおよび輸送体;細胞外マトリックスタンパク質;グルコシダーゼ;グリコシルトランスフェラーゼ;増殖因子;増殖因子結合タンパク質;ヘパリン結合タンパク質;ホルモン;ヒドロラーゼ;免疫グロブリン;イソメラーゼ;キナーゼ;リアーゼ;金属酵素阻害剤;メタロプロテアーゼ;乳タンパク質;神経刺激性タンパク質;プロテアーゼ;プロテアーゼ阻害剤;タンパク質ホスファターゼ;エステラーゼ;トランスフェラーゼ;および血管作動性タンパク質からなる群から選択される、mRNAを提供する。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、転写単位または発現ベクターを提供する。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、mRNAは、タンパク質およびその天然の相同なシグナルペプチドをコードするmRNAでトランスフェクトされた細胞によるタンパク質の分泌と比較して、このmRNAでトランスフェクトされた細胞によるタンパク質のより効率的な分泌を提供することを見出した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、i)タンパク質;およびii)前記タンパク質にとって異種のBDNFシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むmRNAは、タンパク質の天然の相同なシグナルペプチドと比べて、このmRNAでトランスフェクトされた細胞によるタンパク質のより効率的な分泌を提供することを見出した。分泌タンパク質の量は、同じタンパク質およびタンパク質の天然の相同なシグナルペプチドを含むmRNAと比較して、最大で6倍多い。この予想外の発見は、所望のタンパク質をコードするmRNAを効果的に送達し、細胞中で発現させ、タンパク質の天然の相同なシグナルペプチドを有するものより多くの量の分泌タンパク質を得るのに非常に有用である。本発明によって提供される同じ量のmRNAを用いて得られた、より多くの量の分泌タンパク質は、治療用量を、組織に局所適用するのに必要な用量より少なくし、それによって起こり得るmRNA関連の副作用に対するその安全性の枠を増加させるために極めて有用である。さらにこれは、本出願を、制御放出のための製剤やデバイスのコーティングにより適したものにしている。さらにこれは、mRNA関連の免疫原性のリスクを低減し、本出願を、限られた体積しか注射できない組織に対して、またはこれまで処理しにくい組織により適したものにしている。本発明者らはまた、mRNA、特にヒトIGF-1をコードするmRNAを骨格筋に効果的に送達し、発現させることを可能にし、それによって骨格筋における所望のポリペプチドの発現を可能にし、意味のある機能的な利益が筋肉に提供されることも見出した。mRNAは、好ましくは液体組成物で、好ましくは裸の形態で存在する。この液体組成物は、例えば注射によって骨格筋に直接送達することができ、mRNAのための遺伝子移入ベクターまたは担体、またはエレクトロトランスファーまたは超音波のような組織への移入を強化するための方法をまったく必要としない。さらに、損傷を受けた骨格筋へのmRNAの注射は、回復プロセスを促進し、骨格筋の機能の増加をもたらすことが示された。驚くべきことに、IGF-1をコードするmRNAで処置した動物は、16日間の間に(by 16 days)健康な範囲の機能的なレベルに到達した。対照的に、ビヒクルで処置した対照動物は、28日目でさえも十分な機能的な回復を達成しなかった。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、mRNAを提供する。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド、または前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列、または少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド、または前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列、または少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド、または前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列、または少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
長さ16~40アミノ酸のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、前記アミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9は、2を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択され、
少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換による修飾は、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端の、アミノ酸1~11の範囲内で、好ましくはアミノ酸1~10の範囲内で、より好ましくはアミノ酸1~9の範囲内で、さらにより好ましくはアミノ酸1~8の範囲内で、特にアミノ酸1~7の範囲内で、より特にアミノ酸1~6の範囲内で、さらにより特にアミノ酸1~5の範囲内で、特に好ましくはアミノ酸1~4の範囲内で、さらに特に好ましくはアミノ酸1~3の範囲内で、より一層特に好ましくはアミノ酸1~2の範囲内でなされる。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)、インスリン(INS)、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン-4(IL-4)およびインターロイキン-10(IL-10)からなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド、
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質は、IGF1である、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド、
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)、インスリン(INS)、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン-4(IL-4)およびインターロイキン-10(IL-10)からなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、グルカゴン受容体(GL-R)のコード配列であり、タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、インスリン増殖因子1(IGF1)のプロペプチドであり、タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列
から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、ニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチド、線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチド、インスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチド、前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチド、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチド、ならびに補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドからなる群から選択され、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、C-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)のシグナルペプチド、インスリン増殖因子2(IGF2)のシグナルペプチド、インスリン(INS)のシグナルペプチド、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドからなる群から選択され、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、インスリン増殖因子1(IGF1)のシグナルペプチド、インスリン(INS)のシグナルペプチド、エリスロポエチン(EPO)のシグナルペプチド、インターロイキン4(IL-4)のシグナルペプチド、およびインターロイキン10(IL-10)のシグナルペプチドからなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、グルカゴン受容体(GL-R)のコード配列である、天然に存在するアミノ酸配列;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列は、インスリン増殖因子1(IGF1)のプロペプチドである、天然に存在するアミノ酸配列;ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列は、腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)のプロペプチドである、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、ニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチド、線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチド、インスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチド、前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチド、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチド、ならびに補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質は、サイトカイン、増殖因子およびホルモンからなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、C-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)のシグナルペプチド、インスリン増殖因子2(IGF2)のシグナルペプチド、インスリン(INS)のシグナルペプチド、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質は、サイトカイン、増殖因子およびホルモンからなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドおよび前記タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)のシグナルペプチドおよびIGF1、インスリンのシグナルペプチドおよびINS、エリスロポエチン(EPO)のシグナルペプチドおよびEPO、インターロイキン4(IL-4)のシグナルペプチドおよびIL-4、インターロイキン10(IL-10)のシグナルペプチドおよびIL-10からなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)シグナルペプチドが、グルカゴン受容体(GL-R)のコード配列であり、前記タンパク質が、サイトカイン;増殖因子;およびホルモンからなる群から選択され、好ましくは増殖因子である、自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列は、インスリン増殖因子1(IGF1)のプロペプチドであり、前記タンパク質は、サイトカイン、増殖因子およびホルモンからなる群から選択され、好ましくは増殖因子である、天然に存在するアミノ酸配列;ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列は、腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)のプロペプチドであり、前記タンパク質は、サイトカイン、増殖因子およびホルモンからなる群から選択され、好ましくは増殖因子である、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、ニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチド、線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチド、インスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチド、前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチド、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチド、ならびに補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)、インスリン(INS)、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン4(IL-4)、およびインターロイキン10(IL-10)からなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、C-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)のシグナルペプチド、インスリン増殖因子2(IGF2)のシグナルペプチド、インスリン(INS)のシグナルペプチド、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質はインスリン増殖因子1(IGF1)である、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドおよび前記タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)のシグナルペプチドおよびIGF1、インスリンのシグナルペプチドおよびINS、エリスロポエチン(EPO)のシグナルペプチドおよびEPO、インターロイキン4(IL-4)のシグナルペプチドおよびIL-4、インターロイキン10(IL-10)のシグナルペプチドおよびIL-10からなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、グルカゴン受容体(GL-R)のコード配列であり、前記タンパク質はインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列はインスリン増殖因子1(IGF1)のプロペプチドであり、前記タンパク質はインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列;ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列は腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)のプロペプチドであり、前記タンパク質はインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドおよび前記タンパク質が、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドおよびIGF1、インスリン、EPO、またはIL-10、ニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチドおよびIGF1、線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチドおよびIGF1またはIL4、インスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチドおよびIGF1、前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチドおよびIGF1、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチドおよびIGF1、ならびに補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドおよびIGF1からなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドおよび前記タンパク質は、C-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)のシグナルペプチドおよびIGF1、インスリン増殖因子2(IGF2)のシグナルペプチドおよびIGF1、インスリン(INS)のシグナルペプチドおよびIGF1、ならびに脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドおよびIGF1からなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドおよび前記タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)のシグナルペプチドおよびIGF1、インスリンのシグナルペプチドおよびINS、エリスロポエチン(EPO)のシグナルペプチドおよびEPO、インターロイキン4(IL-4)のシグナルペプチドおよびIL-4、インターロイキン10(IL-10)のシグナルペプチドおよびIL-10からなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、グルカゴン受容体(GL-R)のコード配列であり、前記タンパク質はインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列はインスリン増殖因子1(IGF1)のプロペプチドであり、前記タンパク質はインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列;ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、天然に存在するアミノ酸配列は腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)のプロペプチドであり、前記タンパク質はインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、配列番号30に示される脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、配列番号102に示されるニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチド、配列番号87に示される線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチド、配列番号97に示されるインスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチド、配列番号107に示される前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチド、配列番号112に示される細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチド、ならびに配列番号92に示される補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドからなる群から選択され、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、配列番号132に示されるC-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)のシグナルペプチド、配列番号127に示されるインスリン増殖因子2(IGF2)のシグナルペプチド、配列番号147に示されるインスリン(INS)のシグナルペプチド、および配列番号137に示される脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドからなる群から選択され、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、配列番号122に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)の修飾されたシグナルペプチド、配列番号147に示されるインスリン(INS)の修飾されたシグナルペプチド、配列番号152に示されるエリスロポエチン(EPO)の修飾されたシグナルペプチド、配列番号166に示されるインターロイキン4(IL-4)の修飾されたシグナルペプチド、および配列番号174に示されるインターロイキン10(IL-10)の修飾されたシグナルペプチドからなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、配列番号117に示されるグルカゴン受容体(GL-R)のコード配列である、天然に存在するアミノ酸配列;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、修飾された天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号142に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)の修飾されたプロペプチドである、天然に存在するアミノ酸配列;ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、修飾された天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号189に示される腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)の修飾されたプロペプチドである、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、配列番号30に示される脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、配列番号102に示されるニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチド、配列番号87に示される線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチド、配列番号97に示されるインスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチド、配列番号107に示される前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチド、配列番号112に示される細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチド、ならびに配列番号92に示される補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質は、サイトカイン、増殖因子およびホルモンからなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質にとって異種の修飾されたシグナルペプチドは、配列番号132に示されるC-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)の修飾されたシグナルペプチド、配列番号127に示されるインスリン増殖因子2(IGF2)の修飾されたシグナルペプチド、配列番号147に示されるインスリン(INS)の修飾されたシグナルペプチド、および配列番号137に示される脳由来神経栄養因子(BDNF)の修飾されたシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質は、サイトカイン増殖因子およびホルモンからなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質に相同な修飾されたシグナルペプチドおよび前記タンパク質は、配列番号122に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号188に示されるIGF1、配列番号147に示されるインスリンの修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号185に示されるインスリン(INS)、配列番号152に示されるエリスロポエチン(EPO)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号184に示されるEPO、配列番号166に示されるインターロイキン4(IL-4)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号186に示されるIL-4、配列番号174に示されるインターロイキン10(IL-10)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号187に示されるIL-10からなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号117に示されるグルカゴン受容体(GL-R)のコード配列であり、前記タンパク質は、サイトカイン;増殖因子;およびホルモンからなる群から選択され、好ましくは増殖因子である、天然に存在するアミノ酸配列;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、修飾された天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号142に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)の修飾されたプロペプチドであり、前記タンパク質は、サイトカイン;増殖因子;およびホルモンからなる群から選択され、好ましくは増殖因子である、天然に存在するアミノ酸配列;ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、修飾された天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号189に示される腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)の修飾されたプロペプチドであり、前記タンパク質は、サイトカイン;増殖因子;およびホルモンからなる群から選択され、好ましくは増殖因子である、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、配列番号30に示される脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、配列番号102に示されるニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチド、配列番号87に示される線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチド、配列番号97に示されるインスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチド、配列番号107に示される前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチド、配列番号112に示される細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチド、ならびに配列番号92に示される補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質は、配列番号188に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)、配列番号185に示されるインスリン、配列番号184に示されるエリスロポエチン(EPO)、配列番号186に示されるインターロイキン4(IL-4)、および配列番号187に示されるインターロイキン10(IL-10)からなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質にとって異種の修飾されたシグナルペプチドは、配列番号132に示されるC-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)の修飾されたシグナルペプチド、配列番号127に示されるインスリン増殖因子2(IGF2)の修飾されたシグナルペプチド、配列番号147に示されるインスリン(INS)の修飾されたシグナルペプチド、および配列番号137に示される脳由来神経栄養因子(BDNF)の修飾されたシグナルペプチドからなる群から選択され、前記タンパク質は、配列番号188に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)である、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、前記タンパク質に相同な修飾されたシグナルペプチドおよび前記タンパク質は、配列番号122に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号188に示されるIGF1、配列番号147に示されるインスリンの修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号185に示されるインスリン(INS)、配列番号152に示されるエリスロポエチン(EPO)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号184に示されるEPO、配列番号166に示されるインターロイキン4(IL-4)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号186に示されるIL-4、配列番号174に示されるインターロイキン10(IL-10)の修飾されたシグナルペプチドおよび配列番号187に示されるIL-10からなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号117に示されるグルカゴン受容体(GL-R)のコード配列であり、前記タンパク質は、配列番号188に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列;
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、修飾された天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号142に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)の修飾されたプロペプチドであり、前記タンパク質は、配列番号188に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列、ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾され、修飾された天然に存在するアミノ酸配列は、配列番号189に示される腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)の修飾されたプロペプチドであり、前記タンパク質は、配列番号188に示されるインスリン増殖因子1(IGF1)である、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される。
i)タンパク質;および
ii)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、タンパク質がオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNA、
特に、
i)タンパク質;ならびに
ii)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、タンパク質は、カルボキシペプチダーゼ;サイトカイン;細胞外のリガンドおよび輸送体;細胞外マトリックスタンパク質;グルコシダーゼ;グリコシルトランスフェラーゼ;増殖因子;増殖因子結合タンパク質;ヘパリン結合タンパク質;ホルモン;ヒドロラーゼ;免疫グロブリン;イソメラーゼ;キナーゼ;リアーゼ;金属酵素阻害剤;メタロプロテアーゼ;乳タンパク質;神経刺激性タンパク質;プロテアーゼ;プロテアーゼ阻害剤;タンパク質ホスファターゼ;エステラーゼ;トランスフェラーゼ;および血管作動性タンパク質からなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAを提供する。
PLA2G7、PNLIP、PNLIPRP2、PNLIPRP3、PON1、PON3、PPT1、SMPDL3A、THEM6、THSD1、およびTHSD4からなる群から選択されるヒドロラーゼ;免疫グロブリンが、IGSF10、IGKV1-12、IGKV1-16、IGKV1-33、IGKV1-6、IGKV1D-12、IGKV1D-39、IGKV1D-8、IGKV2-30、IGKV2D-30、IGKV3-11、IGKV3D-20、IGKV5-2、IGLC1、IGLC2、およびIGLC3からなる群から選択される免疫グロブリン;イソメラーゼが、NAXE、PPIA、およびPTGDSからなる群から選択されるイソメラーゼ;キナーゼが、ADCK1、ADPGK、FAM20C、ICOS、およびPKDCCからなる群から選択されるキナーゼ;リアーゼが、PM20D1、PAM、およびCA6からなる群から選択されるリアーゼ;金属酵素阻害剤が、FETUB、SPOCK3、TIMP2、TIMP3、TIMP4、WFIKKN1、およびWFIKKN2からなる群から選択される金属酵素阻害剤;メタロプロテアーゼが、ADAM12、ADAM28、ADAM9、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、CLCA1、CLCA2、CLCA4、IDE、MEP1B、MMEL1、MMP1、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP16、MMP17、MMP19、MMP2、MMP20、MMP21、MMP24、MMP25、MMP26、MMP28、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、PAPPA、PAPPA2、TLL1、およびTLL2からなる群から選択されるメタロプロテアーゼ;乳タンパク質が、CSN1S1、CSN2、CSN3、およびLALBAからなる群から選択される乳タンパク質;神経刺激性タンパク質が、CARTPT、NMS、NMU、NPB、NPFF、NPS、NPVF、NPW、NPY、PCSK1N、PDYN、PENK、PNOC、POMC、PROK2、PTH2、PYY2、PYY3、QRFP、TAC1、およびTAC3からなる群から選択される神経刺激性タンパク質;プロテアーゼが、ADAMTS6、C1R、C1RL、C2、CASP4、CELA1、CELA2A、CELA2B、CFB、CFD、CFI、CMA1、CORIN、CTRB1、CTRB2、CTSB、CTSD、DHH、F10、F11、F12、F2、F3、F7、F8、F9、FAP、FURIN、GZMA、GZMK、GZMM、HABP2、HGFAC、HTRA3、HTRA4、IHH、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLKB1、MASP1、MASP2、MST1L、NAPSA、OVCH1、OVCH2、PCSK2、PCSK5、PCSK6、PCSK9、PGA3、PGA4、PGA5、PGC、PLAT、PLAU、PLG、PROC、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS22、PRSS23、PRSS27、PRSS29P、PRSS3、PRSS33、PRSS36、PRSS38、PRSS3P2、PRSS42、PRSS44、PRSS47、PRSS48、PRSS53、PRSS57、PRSS58、PRSS8、PRTN3、RELN、REN、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS2、TPSAB1、TPSB2、およびTPSD1からなる群から選択されるプロテアーゼ;プロテアーゼ阻害剤が、A2M、A2ML1、AMBP、ANOS1、COL28A1、COL6A3、COL7A1、CPAMD8、CST1、CST2、CST3、CST4、CST5、CST6、CST7、CST8、CST9、CST9L、CST9LP1、CSTL1、EPPIN、GPC3、HMSD、ITIH1、ITIH2、ITIH3、ITIH4、ITIH5、ITIH6、KNG1、OPRPN、OVOS1、OVOS2、PAPLN、PI15、PI16、PI3、PZP、R3HDML、SERPINA1、SERPINA10、SERPINA11、SERPINA12、SERPINA13P、SERPINA3、SERPINA4、SERPINA5、SERPINA7、SERPINA9、SERPINB2、SERPINB5、SERPINC1、SERPINE1、SERPINE2、SERPINE3、SERPINF2、SERPING1、SERPINI1、SERPINI2、SPINK1、SPINK13、SPINK14、SPINK2、SPINK4、SPINK5、SPINK6、SPINK7、SPINK8、SPINK9、SPINT1、SPINT3、SPINT4、SPOCK1、SPOCK2、SPP2、SSPO、TFPI、TFPI2、WFDC1、WFDC10A、WFDC13、WFDC2、WFDC3、WFDC5、WFDC6、およびWFDC8からなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤;タンパク質ホスファターゼが、ACP7、ACPP、PTEN、およびPTPRZ1からなる群から選択されるタンパク質ホスファターゼ;エステラーゼが、BCHE、CEL、CES4A、CES5A、NOTUM、およびSIAEからなる群から選択されるエステラーゼ;トランスフェラーゼが、METTL24、FKRP、CHSY1、CHST9、およびB3GAT1からなる群から選択されるトランスフェラーゼ;ならびに血管作動性タンパク質が、AGGF1、AGT、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL4、ANGPTL6、EDN1、EDN2、EDN3、およびNTSからなる群から選択される血管作動性タンパク質からなる群から選択される。
本発明のより好ましい実施形態では、mRNAは、IGF1のプロペプチド、好ましくはヒトIGF1のプロペプチドをコードする核酸配列、およびIGF1の成熟タンパク質、好ましくはヒトIGF1の成熟タンパク質をコードする核酸配列を含み、IGF1のEペプチドをコードする核酸配列を含まず、好ましくはIGF1のヒトEペプチドをコードする核酸配列を含まない。
本発明のさらにより好ましい実施形態では、mRNAは、IGF1のプロペプチド、好ましくはヒトIGF1のプロペプチドをコードする核酸配列、IGF1の成熟タンパク質、好ましくはヒトIGF1の成熟タンパク質をコードする核酸配列を含む。好ましくはmRNAは、IGF1のEペプチドをコードする核酸配列を含まず、より好ましくはIGF1のヒトEペプチドをコードする核酸配列を含まない。本発明のさらにより好ましい実施形態では、mRNAは、IGF1のプロペプチド、好ましくはヒトIGF1のプロペプチドをコードする核酸配列、IGF1の成熟タンパク質、好ましくはヒトIGF1の成熟タンパク質をコードする核酸配列、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。好ましくはmRNAは、IGF1のEペプチドをコードする核酸配列を含まず、より好ましくはIGF1のヒトEペプチドをコードする核酸配列を含まない。
本発明のさらにより好ましい実施形態では、mRNAは、IGF1の、好ましくは27個のアミノ酸を有するヒトIGF1のプロペプチド(プロドメインとも呼ばれる)をコードするヌクレオチド酸配列、成熟IGF1、好ましくは70個のアミノ酸を有する成熟ヒトIGF1をコードするヌクレオチド配列、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。好ましくはmRNAは、IGF1のEペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まず、より好ましくはIGF1のヒトEペプチドをコードする核酸配列を含まない。
i)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド;
ii)必要に応じて、タンパク質のプロドメイン;および
iii)成熟タンパク質
をコードする核酸配列含む。
i)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド;
ii)必要に応じて、ヒトIGFのプロドメイン;および
iii)成熟ヒトIGF
をコードする核酸配列を含む。
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって必要に応じて修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;ならびに
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって必要に応じて修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクターを提供する。
本発明はまた、mRNAまたはmRNAを含むもしくは含有する治療用組成物を対象に投与することを含む、対象における骨格筋損傷を処置する方法も提供する。
筋断裂では、筋肉が過剰で伸張性の張力を受け、筋線維の過度の緊張につながり、その結果、筋腱接合部(MTJ)付近の筋線維の断裂に至る。筋断裂は、医師によって処置される最も一般的な愁訴の1つであり、全てのスポーツ関連損傷の大部分を占める。ハムストリング筋複合体(HMC)の損傷は、走っている間の急速な加速および減速を余儀なくさせ、伸張性筋収縮を必要とするスポーツに関与するアスリートにしばしば影響を与える。軽度の損傷は保存的処置によって容易に対処することができ、よりひどい損傷はハムストリング筋の完全断裂である。ハムストリング筋断裂は、分類のされ方に応じて保存的または外科的に処置される。軽度、中程度、または重度の断裂がある。軽度から中程度の断裂は保存的に処置され得るが、重度の断裂は外科的処置の明らかな適応となる。保存的処置は臨床症状によって決定され、凍結療法、圧迫包帯、固定、および弾性包帯の前の非ステロイド薬、抗炎症薬により直ちに開始し、患者が安定したら理学療法を開始する。超音波治療は治療選択肢として広く論じられているが、再生の最終転帰に対する有意な効果は見出されなかった。2週間以内に、疼痛の明らかな減少があるはずであるため、理学療法を増やして上述したような積極的な運動を含めることができる。しかし、外科的処置はリスクがないわけではなく、候補は慎重に選択されなければならないことが現場では認識されている(Jarvinen TA、Jarvinen TL、Kaariainen M、Aarimaa V、Vaittinen S、Kalimo H、Jarvinen M(2007)Muscle injuries:optimising recovery. Best Pract Res Clin Rheumatol 21(2):317~331頁. DOI:10.1016/j.berh.2006.12.004;Horst K、Dienstknecht T、Sellei RM、Pape HC(2014) Partial rupture of the hamstring muscle complex:a literature review on treatment options. Eur J Orthop Surg Traumatol 24(3):285-9. DOI:10.1007/s00590-013-1315-x)。現在の治療選択肢は、身体自体の治癒過程以上のものはほとんど提供しておらず、実際に、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)が治癒過程を損なうことはあり得る。今日、利用可能な有効な薬学的治療がないため、満たされていない医療ニーズは高い。特に、回復過程を加速させ、損傷した筋肉の機能の増加をもたらす骨格筋損傷を処置するための有効な方法を提供する必要がある。
i)IGF1、好ましくはヒトIGF1;および
ii)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、好ましくはヒトBDNFのシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAを提供する。
本発明はまた、対象における骨格筋損傷を処置するための医薬の製造のための、
i)IGF1、好ましくはヒトIGF1;および
ii)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、好ましくはヒトBDNFのシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAの使用も提供する。
i)IGF1、好ましくはヒトIGF1;および
ii)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、好ましくはヒトBDNFのシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAを対象に投与することを含む、対象における骨格筋損傷を処置する方法も提供する。
好ましくは本発明は、骨格筋損傷を処置するための方法での使用のための、
i)成熟IGF1、好ましくは成熟ヒトIGF1;
ii)必要に応じてIGF1の、好ましくはヒトIGF1のプロドメイン;
iii)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、好ましくはヒトBDNFのシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAを提供する。
本発明はまた、対象における骨格筋損傷を処置するための医薬の製造のための、
i)成熟IGF1、好ましくは成熟ヒトIGF1;
ii)必要に応じてIGF1の、好ましくはヒトIGF1のプロドメイン;
iii)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、好ましくはヒトBDNFのシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAの使用も提供する。
i)成熟IGF1、好ましくは成熟ヒトIGF1;
ii)必要に応じてIGF1の、好ましくはヒトIGF1のプロドメイン;
iii)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、好ましくはヒトBDNFのシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAを対象に投与することを含む、対象における骨格筋損傷を処置する方法も提供する。
方法および材料
IGF1のクローニングおよびシグナル伝達ペプチドの交換
IGF1は、小胞体で合成され、ゴルジ装置を介して分泌されて細胞外増殖因子として自己分泌および傍分泌的に作用する70個のアミノ酸ポリペプチドである。トランスフェクトされた細胞からのmRNA誘導IGF1の適切な発現および分泌を確保するために、mRNA配列はヒトIGF1の天然のN末端プレ-プロ配列(プレ-プロ-IGF1)を含んだ。この配列は、21個のアミノ酸(ヌクレオチド1~63)を有するヒトIGF1のプレドメイン(シグナル伝達ペプチド)をコードする配列、および27個のアミノ酸(ヌクレオチド64~144)を有するヒトプロドメインをコードする配列からなった。さらに、コンストラクトは、70個のアミノ酸(ヌクレオチド145~354)を有する成熟ヒトIGF1の完全コード配列をコードする配列を含有した。Cpd.2~7では、プレドメイン(シグナル伝達ペプチド、ヌクレオチド1~63)を、IGF2、ALB、BDNF、CXCL12のそれぞれのプレドメイン、または合成シグナル伝達ペプチド1もしくは2に交換した。C末端Eドメインは、コンストラクトに加えなかった。要約すると、クローニングベクターは、ヒトプレ-プロ-IGF1 DNAのコピーをEペプチド情報なしで含有し、Cpd.1として定義されたのに対し、Cpd.2~7は代替プレドメイン(シグナル伝達ペプチド)を含有した。図1は、そのプレドメイン、プロドメインおよびコードドメインによってコードされるIGF1のDNAおよびRNA配列を図示する。図2は、IGF2プレドメインによってコードされるIGF1ならびにそのプロドメインおよびコードドメインのDNAおよびRNA配列を図示する。図3は、ALBプレドメインによってコードされるIGF1ならびにそのプロドメインおよびコードドメインのDNAおよびRNA配列を図示する。図4は、BDNFプレドメインによってコードされるIGF1ならびにそのプロドメインおよびコードドメインのDNAおよびRNA配列を図示する。図5 は、CXCL12プレドメインによってコードされるIGF1ならびにそのプロドメインおよびコードドメインのDNAおよびRNA配列を図示する。図6は、合成シグナル伝達ペプチド1プレドメインによってコードされるIGF1ならびにそのプロドメインおよびコードドメインのDNAおよびRNA配列を図示する。図7は、合成シグナル伝達ペプチド2プレドメインによってコードされるIGF1ならびにそのプロドメインおよびコードドメインのDNAおよびRNA配列を図示する。図8は、Cpd.1インサートを含むpVAX.A120ベクター(www.thermofisher.com)を図示する。図9は、Cpd.2インサートを含むpMA-Tベクター(www.thermofisher.com)を図示する。図10は、Cpd.3インサートを含むpMA-Tベクターを図示する。図11は、Cpd.4インサートを含むpMA-Tベクターを図示する。図12は、Cpd.5インサートを含むpMA-Tベクターを図示する。図13は、Cpd.6インサートを含むpMA-RQベクター(www.thermofisher.com)を図示する。図14は、Cpd.6インサートを含むpMA-RQベクター(www.thermofisher.com)を図示する。図15は、Cpd.2~7を増幅するのに利用されたプライマーを示す。図16は、遺伝子名、UniProt数、プレドメインのDNAおよびアミノ酸配列ならびにベクターを示して種々のプレドメインの識別をまとめている。Cpd.6およびCpd.7に関して、これらが人工プレドメインであったため遺伝子名は存在しない。Cpd.1~7のDNAおよびmRNA配列のコドン最適化は、GeneOptimizer(登録商標)(ThermoFischer、MA)を使用して行った。
Cpd.8~26およびCpd.39では、IGF1のプレドメイン(シグナル伝達ペプチド、ヌクレオチド 1~63)(すなわち、Cpd.1)を、LTBP2(Cpd.8;Uniprot ID:Q14767)、IGFALS(Cpd.9;Uniprot ID:P35858)、INS(Cpd.10;Uniprot ID:P01308)、)、Epo(Cpd.11;Uniprot ID:P01588)、CSF3(Cpd.12;Uniprot ID:P09919)、NGF(Cpd.13;Uniprot ID:P01138)、FGF5(Cpd.14;Uniprot ID:P12034)、FHR2(Cpd.15;Uniprot ID:P36980)、IBP5(Cpd.16;Uniprot ID:P24593)、NTF3(Cpd.17;Uniprot ID:P20783)、PATE2(Cpd.18;Uniprot ID:Q6UY27)、SOD3(Cpd.19;Uniprot ID:P08294)、GLRのコード配列の一部(Cpd.20;Uniprot ID:P47871)、IGF1の修飾プレドメイン配列(Cpd.21;Uniprot ID:P05019)、IGF2の修飾プレドメイン配列(Cpd.22;Uniprot ID:P01344)、CXCL12の修飾プレドメイン配列(Cpd.23;Uniprot ID:P48061)、BDNFの修飾プレドメイン配列(Cpd.24;Uniprot ID:P23560)、IGF1の修飾プロドメイン配列(Cpd.25;Uniprot ID:P05019)、ALPIの修飾プロドメイン配列(Cpd.39;Uniprot ID:P09923)およびINSの修飾プレドメイン配列(Cpd.26;Uniprot ID:P01308)のそれぞれのプレドメインに交換した。Cpd.1と同様に、全ての上記に指定した化合物はEペプチドがなかった。Cpd.8~26およびCpd.39のDNAおよびmRNA配列のコドン最適化は、GeneOptimizer(登録商標)(ThermoFischer、MA)を使用して行った。
Cpd.1を含有するpVAX.A120ベクター(配列番号15)は、T7プロモーターおよび120bp長のポリAテールも有し、in vitro転写(IVT)を使用したmRNA生産の前にポリAテールの下流でXhoI酵素を用いて該ベクターを直線状にした。pMA-TおよびpMA-RQベクターについては、相同なプライマー対(配列番号22および23)をPCRベースのIVT-mRNA生産に使用した(図15)。リバースプライマーは、ポリAテールを成熟mRNAに含めるために120bpポリAを含有した。直線状プラスミドおよびPCRアンプリコンの両方を、MEGAscript T7キットのT7 RNAポリメラーゼ(www.ambion.com)によって行われるIVTの鋳型として使用した。全てのmRNAは、5’末端のアンチリバースCAPアナログ(ARCA;[m7G(5’)G])を用いて生産し、100% N1-メチルシュード-UTP(www.trilink.com)を用いて化学的に修飾した。MEGAclearキット(www.ambion.com)を使用してin vitro転写mRNAを精製し、Agilent 2100 BioanalyzerのRNA 6000 Nanoキット(www.agilent.com)を使用して品質および濃度について分析した。
Cpd.1(配列番号40; pVAX.A120ベクターへのサブクローニング前)およびCpd.8~Cpd.39をコードするpMA-TおよびpMA-RQベクターについては、相同なプライマー対(配列番号22および23)をPCRベースのIVT-mRNA生産に使用した(図15)。リバースプライマーは、ポリAテールを成熟mRNAに含めるために120bpポリAを含有した。PCRアンプリコンを、MEGAscript T7キットのT7 RNAポリメラーゼ(www.ambion.com)によって行われるIVTの鋳型として使用した。全てのmRNAは、5’末端のアンチリバースCAPアナログ(ARCA;[m7G(5’)G])を用いて生産し、100% N1-メチルシュード-UTP(www.trilink.com)を用いて化学的に修飾した。MEGAclearキット(www.ambion.com)を使用してin vitro転写mRNAを精製し、RNAアガロースゲル電気泳動を使用して品質および濃度について分析した。
ヒト胎児性腎細胞293(HEK293T;ATCC、CRL-1573、ロックビル、MD、USA)は、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、およびペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンB混合物(882087、Biozym、オルデンドルフ、ドイツ)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、www.biochrom.com)で維持した。細胞を96ウェル培養プレートに7,000~20,000細胞/ウェルで播種し、トランスフェクションの前に5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。トランスフェクションの前に培養密度<60%に達するように、抗生物質なしで10%のFBSを含有するDMEM増殖培地で細胞を増殖させた。
HSkMC細胞を、マイクロタイタープレートの96ウェルあたり40.000細胞の密度でSkM増殖培地(PromoCell、ハイデルベルク、ドイツ)にプレーティングした。細胞を、加湿雰囲気中、37℃インキュベーターおよび5% CO2で>90%のコンフルエンスまで1日増殖させた。トランスフェクション当日、リポフェクタミン2000(www.invitrogen.com)を使用して、細胞を2μgの種々のmRNA変異体(Cpd.1または4)で処理した。したがって、100μl培地を除去し、1μlリポフェクタミン/ウェルを2μg mRNA/ウェルと一緒にOPTIMEM培地(www.thermofisher.com)に添加した。細胞を次いで加湿雰囲気中、37℃および5% CO2で24時間インキュベートした。
トランスフェクションの24時間前に、ヒト白色人種神経芽細胞腫IMR32細胞(カタログ番号86041809、ECACC、UK)を、10%(v/v)加熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン(2mM)および非必須アミノ酸(NEAA、1×)を補充したイーグル最小必須培地(EMEM、Bioconcept カタログ番号1-31S01-I、www.bioconcept.ch)に、96プレコートBRANDマイクロタイタープレート(カタログ番号782082)の1ウェルあたり密度60,000細胞でプレーティングした。細胞を、5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で一晩増殖させた。JetMessenger(www.polyplus-transfection.com)を使用して製造者の使用説明書に従って、0.3μgのmRNAコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。簡単には、0.1μg mRNAコンストラクトあたり0.25μl JetMessenger試薬を混合して、mRNA/JetMessenger複合体を形成した。室温で15分間インキュベート後、JetMessenger複合体を10μlとして添加し、トランスフェクション5時間後、培地/mRNA/JetMessengerをウェルから除去し、新鮮な100μl増殖培地と置き換え、プレートを5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。
ヒト肺癌細胞株(Sigma-Aldrich、ブフス スイス カタログ番号6012804)を、10% FBS(Thermofischer、バーゼル、スイス カタログ番号10500-064)を補充したダルベッコ改変イーグル培地-高グルコース(DMEM、Sigma-Aldrich、ブフス スイス カタログ番号D0822)で維持した。トランスフェクションの24時間前に、A549細胞を通常の増殖培地に10,000細胞/ウェルの密度でプレーティングした。その後、リポフェクタミン2000(www.invitrogen.com)を使用して製造者の使用説明書に従って、種々のmRNA(0.3~0.6μg)を細胞にトランスフェクトした。DMEM 100μlを除去した。Opti-MEM(www.thermofisher.com)50μlを各ウェルに添加し、その後、Opti-MEM中50μl mRNAおよびリポフェクタミン2000複合体を添加した。インキュベーションの5時間後、培地を新鮮な増殖培地に置き換え、5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で24時間、プレートをインキュベートした。
ヒト単球白血病細胞株THP-1(Sigma-Aldrich、ブフス スイス、カタログ番号88081201)を、増殖培地(10% FBSおよび2mMグルタミンを補充したRPMI 1640で維持した。トランスフェクションの72時間前に、細胞を96ウェル細胞培養物プレートに30,000 THP-1細胞で播種し、増殖培地に希釈したホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)(Sigma-Aldrich、ブフス スイス、カタログ番号P8139)50nMで活性化した。リポフェクタミン2000(www.thermofisher.com)を使用して、mRNA(300~600ng/ウェル)を細胞にトランスフェクトし、DMEM 100μlを除去した。Opti-MEM(www.thermofisher.com)50μlを各ウェルに添加し、その後、Opti-MEM中50μl mRNAおよびリポフェクタミン2000複合体を添加した。5時間後、培地を50nM PMAを補充した新鮮な増殖培地に置き換え、5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で24時間、プレートをインキュベートした。
妊娠したメスの野生型ウィスターラット(Janvier labs、フランス)または妊娠14日のSOD1G93A Sprague Dawleyラット(Taconic Bioscience)を、CO2による深麻酔および頸椎脱臼を使用して屠殺した。胎児を子宮から取り出し、2%ペニシリン(10,000U/mL)およびストレプトマイシン(10mg/mL)溶液(PS)および1%ウシ血清アルブミン(BSA)を補充した氷冷Leibovitz培地に直ちに入れた。脊髄を切断し、0.05%トリプシン-0.02% EDTAで37℃、20分間処理した。グルコース4.5g/l、0.5mg/mL DNAase IおよびII、ならびに10%ウシ胎児血清(FCS)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の添加によって解離を停止した。10mLピペットの先端を強制的に3回通過させて細胞を機械的に解離した。さらに、細胞を4℃、515gで10分間遠心分離した。得られたペレットを、B27サプリメントの2%溶液、グルタミン2mmol/l、2%のPS溶液、および脳由来神経栄養因子(BDNF)10ng/mlを含有するneurobasal培地からなる既知組成培地に再懸濁した。細胞を、96ウェルポリ-D-リジンプレコートプレートに1ウェルあたり20,000細胞で播種し、5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で培養した。培地を2日おきに置き換えた。培養下11~12日後、製造者の説明書に従ってJetMessenger(www.polyplus-transfection.com)を使用してmRNAコンストラクト(0.3μg)をトランスフェクトした。
ヒト関節軟骨細胞(Sigma/Cell Applications、ブフス、スイス カタログ番号402~05A)を、Chondrocyte増殖培地(Sigma Aldrich、ブフス、スイス カタログ番号411~500)で維持した。細胞を、5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。細胞を分化培地のアルギネートビーズ(Sigma Aldrich、ブフス、スイス カタログ番号A411D-250)で最低3週間増殖させて、細胞を分化させた。アルギネートビーズの調製については、4×106軟骨細胞あたり、1.2%滅菌アルギネート溶液(0.9% NaCl中1.2%アルギネート Sigma Aldrich、ブフス スイス カタログ番号 A-2033)1mlを使用した。細胞を相応の容量の1.2%アルギネート溶液に再懸濁し、22ゲージ針を通じて6ウェル未処理細胞培養物プレート中100mM CaCl2溶液に液滴分注した。15分後、重合ビーズを0.9% NaClで5回、および分化培地で2回洗浄した。軟骨細胞/アルギネートビーズを分化のため、5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で最低3週間インキュベートし、培地は2日おきに交換した。トランスフェクションの24時間前に、分化軟骨細胞を0.9% NaClで2×洗浄し、アルギネート溶解バッファー(55mMクエン酸ナトリウム、150mM NaCl、30mM EDTA pH6.8)で約5分間インキュベートして、分化軟骨細胞をアルギネートビーズから放出した。細胞を0.9% NaClで2×洗浄した。1ウェルあたり30,000細胞を、96ウェルTPPプレート(Sigma Aldrich、ブフス、スイス カタログ番号 92096)の100μl増殖培地に播種し、一晩増殖させた。製造者の使用説明書に従ってJetMessenger(www.polyplus-transfection.com)を使用して、細胞にmRNAコンストラクト0.6μgをトランスフェクトした。mRNA/JetMessenger複合体を10μlとして4通りに添加した。mRNA/JetMessenger複合体は、0.1μg mRNAコンストラクトあたり0.25μl JetMessenger試薬を混合し、室温で15分間インキュベートして形成した。トランスフェクション後の5時間後、トランスフェクション複合体(培地/mRNA/JetMessenger)をウェルから除去し、100μl増殖培地と置き換えた。プレートを5% CO2を含有する加湿雰囲気中、37℃で24時間インキュベートした。
トランスフェクション後24時間時点で、トランスフェクトされた細胞からの上清を回収し、凍結し、IGF1(カタログ番号E20、Mediagnost、ロイトリンゲン、ドイツ)、エリスロポエチン(EPO;カタログ番号BMS2035、ThermoFisher、バーゼル、スイス)、インスリン(INS、カタログ番号RAB0327、Sigma-Aldrich、ブフス、スイス)、インターロイキン4(IL-4、カタログ番号88-7046-22、ThermoFisher、バーゼル、スイス)およびインターロイキン10(IL-10、カタログ番号キット10947 Sino Biological、中国)の、製造者の使用説明書に従ってELISAによる定量分析まで20℃で保管した。それぞれのELISAバッファーで希釈した後、細胞上清を分析した。
標準または試料中のタンパク質(IGF1、EPO、INS、IL-4、IL-10)レベルの推定のために、ブランクの平均吸光度値を、標準または試料の平均吸光度から減算した。検量線を生成し、製造者のプロトコールに従って4つのパラメータ非線形回帰を使用してプロットした。各試料中のタンパク質(IGF1、EPO、INS、IL-4、IL-10)の濃度を決定するために、種々のタンパク質の濃度を検量線から補間した。試料の最終タンパク質濃度を、希釈係数を乗算して算出した。全ての算出は、GraphPad Prism 8(サンディエゴ、USA)を使用して行った。内因性シグナル伝達ペプチドコンストラクトと比べた増加倍数の表示のために、個々のコンストラクトによって産生されるタンパク質のレベルを、同じ濃度で内因性シグナル伝達ペプチドコンストラクトによって生成されるタンパク質のレベルで除算した。
IGF1のクローニング
pVAX.A120への全てのインサートのクローニングの成功を、サンガー配列決定によって確認した。全てのテストしたクローンは、IGF1インサートの正しい配向を100%の配列精度でもたらした。IVT mRNA生産のために陽性クローンを選択した。
シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9、アミノ酸1~7およびアミノ酸1~5ならびにC末端の最後の9個のアミノ酸に対するCpd.1~39の平均疎水性、ならびにN末端のアミノ酸1~9に対するCpd.1~39の平均極性は、以下の表2~5に示されている通りである。
IGF1_pVAX.A120プラスミドをXhoIで直線状にし、IVT系を使用してIGF1 mRNA(Cpd.1)を生産した。同様に、変化したプレドメイン(シグナル伝達ペプチドを有するIGF1 mRNAである、ベクターpMA-TおよびpMA-RQにコードされたCpd.2~Cpd.7(図16)を、PCRベースのIVTを使用するin vitroトランスフェクション実験用に50~200μg範囲で生産した。同様に、Cpd.1(配列番号40)ならびにpMA-TおよびpMA-RQベクターにコードされたCpd.8~26についても、変化したシグナル伝達ペプチドを有するIGF1 mRNAを、PCRベースのIVTを使用するin vitroトランスフェクション実験用に50~200μg範囲で生産した。IGF1 mRNAに加えて、内因性のまたは変化したシグナル伝達ペプチドを有する、エリスロポエチン(EPO、Cpd.27~29)、インスリン(INS、Cpd.30~32)、インターロイキン4(IL4、Cpd.33~35)およびインターロイキン10(IL10、Cpd.36~38)のためのmRNAを、in vitroトランスフェクション実験用に50~200μg範囲で生産した。
HEK293T細胞をCpd.1~Cpd.7 mRNAと24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図17)。Cpd.1は、IGF1分泌を最大50ng/ml誘導することができた。Cpd.4は、Cpd.1より有意に高いIGF1分泌を誘導した(3.3倍、0.001)。Cpd.1およびCpd.4の濃度依存性を評価するために、Cpd.1およびCpd.4両方の種々の濃度(0.02~2μg/ウェル)を、上清中へのIGF1分泌の誘導に関してテストした(図18)。Cpd.1は0.89μgのEC50を、Cpd.4については0.13μgのEC50を示し、HEK293T細胞からのIGF1分泌の誘導においてCpd.4は6.8倍効力があることを示した。まとめると、図17および18のデータは、Cpd.4がCpd.1より強くて効力があるHEK293T細胞でのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、このシグナル伝達ペプチドが、この細胞型における産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
C2C12細胞をCpd.1~Cpd.7 mRNAと24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図19)。Cpd.1は、IGF1分泌を最大60ng/ml誘導することができた。Cpd.4は、Cpd.1より有意に高いIGF1分泌を誘導した(6.1倍、0.001)。データは、Cpd.4がCpd.1より強いC2C12細胞でのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、このシグナル伝達ペプチドが、この細胞型においても産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
HSkMC細胞をCpd.1またはCpd.4 mRNAと24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図20)。Cpd.1は、IGF1分泌を最大30ng/ml誘導することができた。Cpd.4は、Cpd.1より有意に高いIGF1分泌を誘導した(3.1倍、p<0.05)。データは、Cpd.4がCpd.1より強い初代HSkMC細胞でのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、このシグナル伝達ペプチドが、この細胞型においても産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
別のセットのテストでは、Cpd.8~Cpd.26を、HEK293T細胞からのIGF1分泌の調節に対するその可能性について分析した。対照としてのCpd.1およびテストmRNAとしてのCpd.8~Cpd.26と24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図22)。Cpd.1応答を1に正規化し、データをCpd.1の倍数変化として表した。Cpd.8、Cpd.9、Cpd.10、Cpd.11、Cpd.12およびCpd13がIGF1分泌の低下を示したのに対し、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.17、Cpd.18、Cpd.19、Cpd.20、Cpd.21、Cpd.23、Cpd.24、Cpd.25およびCpd.26は、Cpd.1と比べて最大2.6倍有意に高いIGF1分泌を誘導することができた。それに関して、Cpd.15およびCpd.21は、Cpd.4と同じような誘導を示した(図17参照)。まとめると、データは、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.17、Cpd.18、Cpd.19、Cpd.20、Cpd.21、Cpd.23、Cpd.24、Cpd.25およびCpd.26が、Cpd.1より強くて効力があるHEK293T細胞でのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、この細胞型における産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
HepG2細胞を、対照としてのCpd.1およびテストmRNAとしてのCpd.4~Cpd.26と24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図23)。Cpd.1応答を1に正規化し、データをCpd.1の倍数変化として表した。Cpd.8、Cpd.9、およびCpd.12がIGF1分泌の低下を示したのに対し、Cpd.4、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.17、Cpd.18、Cpd.19、Cpd.20、Cpd.21、Cpd.22、Cpd.23、Cpd.24、Cpd.25およびCpd.26は、Cpd.1と比べて最大8.3倍有意に高いIGF1分泌を誘導することができた。まとめると、データは、Cpd.4、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.17、Cpd.18、Cpd.19、Cpd.20、Cpd.21、Cpd.22、Cpd.23、Cpd.24、Cpd.25およびCpd.26が、Cpd.1より強いHepG2細胞でのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、この細胞型における産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
IMR324神経細胞を、対照としてのCpd.1およびテストmRNAとしてのCpd.4~Cpd.24と24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図24)。Cpd.1応答を1に正規化し、データをCpd.1の倍数変化として表した。Cpd.4、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.17、Cpd.20、Cpd.22、Cpd.23およびCpd.24は、Cpd.1と比べて最大2.6倍有意に高いIGF1分泌を誘導することができた。まとめると、データは、Cpd.4、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.17、Cpd.20、Cpd.22、Cpd.23およびCpd.24が、Cpd.1より強いIMR32神経細胞でのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、この細胞型における産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
軟骨細胞を、対照としてのCpd.1およびテストmRNAとしてのCpd.4~Cpd.25と24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図25)。Cpd.1応答を1に正規化し、データをCpd.1の倍数変化として表した。Cpd.4、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.20、Cpd.21、Cpd.22、Cpd.24およびCpd.25は、Cpd.1と比べて最大1.9倍有意に高いIGF1分泌を誘導することができた。まとめると、データは、Cpd.4、Cpd.14、Cpd.15、Cpd.16、Cpd.20、Cpd.21、Cpd.22、Cpd.24およびCpd.25が、Cpd.1より強い軟骨細胞でのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、この細胞型における産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
ラット運動ニューロンまたはラットトランスジェニック/遺伝子組換えSOD1G93A(図26B)を、対照としてのCpd.1ならびに、テストmRNAとしての、野生型に対するCpd.4、Cpd.14およびCpd.17(図26A)またはトランスジェニック/遺伝子組換えSOD1G93A(図26B)に対するCpd.14およびCpd.17と48時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図26AおよびB)。Cpd.1応答を1に正規化し、データをCpd.1の倍数変化として表した。Cpd.4、Cpd.14およびCpd.17は、Cpd.1と比べてIGF1分泌を野生型で最大4.3倍、またはトランスジェニック/遺伝子組換えSOD1GS93Aで最大9.3倍誘導することができた。まとめると、データは、Cpd.4、Cpd.14およびCpd.17が、Cpd.1より強い運動ニューロンでのIGF1分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、この細胞型における産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
HEK293T、HepG2またはA549細胞を、対照としてのCpd.27およびテストmRNAとしてのCpd.28およびCpd.29と24時間インキュベーションした後、分泌されたエリスロポエチン(EPO)レベルを細胞培養物の上清で評価した(図27)。Cpd.27応答を1に正規化し、データをCpd.27の倍数変化として表した。Cpd.28は、HEK293T細胞(図27A)、HepG2細胞(図27B)およびA549細胞(図27C)においてCpd.27と比べてEPO分泌を最大1.8倍誘導することができ、Cpd.29は、HEK293T細胞(図27A)およびHepG2細胞(図27B)においてCpd.27と比べてEPO分泌を最大1.4倍誘導した。まとめると、データは、Cpd.28およびCpd.29が、Cpd.27より強いEPO分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、これらの細胞型における産生されたEPOの細胞排出を容易にすることを示唆している。
HEK293T細胞を、対照としてのCpd.30ならびにテストmRNAとしてのCpd.31およびCpd.32と24時間インキュベーションした後、分泌されたインスリン(INS)レベルを細胞培養物の上清で評価した(図28)。Cpd.30応答を1に正規化し、データをCpd.30の倍数変化として表した。Cpd.31およびCpd.32は、HEK293T細胞においてCpd.30と比べてINS分泌を最大3.9倍誘導することができた。まとめると、データは、Cpd.31およびCpd.32が、Cpd.30より強いINS分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、この細胞型における産生されたINSの細胞排出を容易にすることを示唆している。
HEK293T、HepG2、THP-1またはA549細胞を、対照としてのCpd.33ならびにテストmRNAとしてのCpd.34およびCpd.35と24時間インキュベーションした後、分泌されたインターロイキン4(IL4)レベルを細胞培養物の上清で評価した(図29)。Cpd.33応答を1に正規化し、データをCpd.33の倍数変化として表した。Cpd.34は、HEK293T細胞(図29A)、HepG2細胞(図29B)、THP-1細胞(図29C)およびA549細胞(図29D)において、Cpd.33と比べてIL4分泌を最大2.2倍誘導することができ、Cpd.35は、HepG2細胞(図29B)およびTHP-1細胞(図29C)において、それぞれ、Cpd.33と比べてIL4分泌を最大1.3倍誘導した。まとめると、データは、Cpd.34およびCpd.35が、Cpd.33より強いIL4分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、これらの細胞型における産生されたIL4の細胞排出を容易にすることを示唆している。
HEK293T、HepG2またはTHP-1細胞を、対照としてのCpd.36ならびにテストmRNAとしてのCpd.37およびCpd.38と24時間インキュベーションした後、分泌されたインターロイキン10(IL10)レベルを細胞培養物の上清で評価した(図30)。Cpd.36応答を1に正規化し、データをCpd.36の倍数変化として表した。Cpd.37は、HEK293T細胞(図30A)、HepG2細胞(図30B)およびTHP-1細胞(図30C)において、Cpd.36と比べてIL10分泌を最大2.2倍誘導することができ、Cpd.38は、THP-1細胞(図30C)においてCpd.36と比べてIL10分泌を1.4倍誘導した。まとめると、データは、Cpd.37およびCpd.38が、Cpd.36より強いIL10分泌を誘導したことを立証しており、これらのシグナル伝達ペプチドが、これらの細胞型における産生されたIL10の細胞排出を容易にすることを示唆している。
HepG2または軟骨細胞を、対照としてのCpd.1およびテストmRNAとしてのCpd.39と24時間インキュベーションした後、分泌されたIGF1レベルを細胞培養物の上清で評価した(図31)。Cpd.1応答を1に正規化し、データをCpd.1の倍数変化として表した。Cpd.39は、HepG2(図31A)およびヒト初代軟骨細胞(図31B)において、Cpd.1と比べて最大1.4倍有意に高いIGF1分泌を誘導することができた。まとめると、データは、Cpd.39がCpd.1より強いIGF1分泌を誘導したことを立証しており、このシグナル伝達ペプチドが、これらの細胞型における産生されたIGF1の細胞排出を容易にすることを示唆している。
骨格筋損傷のマウスモデルにおける局所適用IGF-I mRNAの有効性をテストするために、8~10週齢のオスのC57BL6/Jマウスに、0日目に前脛骨筋(TA)のノテキシン誘導筋毒性損傷を受けさせた。損傷後1日目に、ビヒクルまたは1μg mRNA(Cpd.4)を、損傷した筋肉への筋肉内注射により適用し、損傷後4日目に反復した。TAの筋機能を、損傷後1、4、7、10、14、21および28日目で測定した。対側TA筋のサブセットも試験全体を通して評価して、TA筋機能の健康な対照レベルを評価した。
IGF-1のクローニングおよびIGF-1 mRNAのin vitro転写
IGF-1のクローニングおよびIGF-1 mRNAのin vitro転写は、実施例1に記載したように行った。pMA-TベクターにクローニングされるようにCpd.4のコドン最適化DNA(図4)を使用して、図11に示されているコンストラクトを得た。このコンストラクトを使用して、mRNA処置に使用されるin vitro転写mRNAを生産した。
ノテキシン(Latoxan、バランス、フランス)は、マウスごとに40μl食塩水中0.4μgの濃度で調製した。マウスの麻酔はチャンバーで誘発し(約4~5%イソフルラン、効果を与えるまで)、ノーズコーン(約2~3%イソフルラン、効果を与えるまで)により維持した。マウスを次いで、加熱した(37℃)手術台で維持した。TA筋の中腹の皮膚を脱毛クリームで準備し(Nair Hair Remover45秒間、その後、水による3回のすすぎ)、ベータダインおよび70%アルコールで3回交互に洗ってさらに準備し、皮膚細菌の軟組織への播種を予防した。ツベルクリンシリンジを使用して、調製したノテキシン0.04mlを右TAの腹部へ筋肉内注射した。手順の間、動物は観察可能な疼痛に苦しまず、その後適切な抗疼痛処置を施された(注射後48時間、12時間おきにブプレノルフィン0.05~0.1mg/kg)。鎮痛剤の初回投与は麻酔薬誘発時点で行って、回復時の鎮痛剤の存在を確保した。最初の48時間後、動物を少なくとも週2回調べて正常歩行の適切な治癒および回復を確実にした。
マウスをmRNAまたはビヒクル処置に無作為に割り付けた。マウスを上記に記載のイソフルランを使用して麻酔し、損傷したTA筋に、筋肉の真ん中へmRNAまたはビヒクル処置の筋肉内注射1回を投与した。
筋肉の性能を、損傷後1、4、7、10、14、21および28日目に305C筋肉レバーシステム(Aurora Scientific Inc.、オーロラ、カナダ)によりin vivoで測定した。マウスの麻酔は上記に記載したように達成し、マウスをサーモスタット制御台に置いた。脛骨頭に押し付けたピンを使用して膝を絶縁し、足をモーター軸のフットプレートにしっかり固定した。背屈筋群には、腓骨神経の経皮的電気刺激によって収縮を誘発した。最適な等尺性単収縮トルクを、疲労を避けるために収縮と収縮の間を最小30秒にし、電流を増加して決定した。次いで、一連の刺激を増加する刺激頻度で行った(0.2msパルス、500ms列持続時間):1、10、20、40、60、80、100、150Hz、その後、1Hzの最終刺激。最大ピーク等尺性筋力をプロットした。
データをグループ化し、平均および標準誤差を算出した。GraphPad Prism 8(サンディエゴ、USA)を使用して統計解析を行った。スチューデントのt検定を使用して比較を行った。
実施例2は、毒素(ノテキシン)によって誘発されたTA筋損傷のマウスモデルでは、筋損傷後早期の1日目および4日目のIGF-I mRNA筋肉内処置が、筋機能の回復の加速および完全な回復をもたらしたことを示している(図21)。1μg Cpd.4で処置した動物は、16日間の間に健康な範囲の機能レベルに達した。対照的に、ビヒクルで処置した対照動物および低用量処置マウスは、28日目まででも完全な機能回復を達成しなかった。データはそれ故に、IGF-I mRNA処置は筋損傷後の治癒を加速することができ、筋機能を完全に回復することによって慢性障害を予防できる可能性があることを示している。驚くべきことに、それには損傷後早期の2回の投与のみが必要である。
Claims (54)
- タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸配列を含むmRNAであって、
シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9は、2を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、mRNA。 - シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9が、6.1またはそれ未満の平均極性を有する、請求項1に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列のC末端の最後の9つのアミノ酸の平均疎水性スコアが、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9の平均疎水性スコアより少なくとも1.0単位低い、請求項1または2に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9、アミノ酸2~10、アミノ酸3~11、アミノ酸4~12およびアミノ酸5~13が、それぞれ1.5を超える平均疎水性スコアを有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸8~16の平均疎水性スコアが、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸3~11の平均疎水性スコアに等しいかまたはそれより低い、請求項1から4のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、長さ18~40アミノ酸のアミノ酸配列を含み、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸10~18の平均疎水性スコアは、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸3~11の平均疎水性スコアより少なくとも0.5単位低い、請求項1から4のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列のC末端の最後の9つのアミノ酸の平均疎水性スコアが、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸3~11の平均疎水性スコアより少なくとも1.5単位低い、請求項1から6のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列の任意の9つの連続するアミノ酸の平均疎水性スコアが、4.1を超えない、請求項1から7のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列のC末端の最後の9つのアミノ酸が、負の疎水性スコアを有する少なくとも1つのアミノ酸を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のmRNA。
- 負の疎水性スコアを有する少なくとも1つのアミノ酸が、G、Q、N、T、S、R、K、H、D、E、P、YおよびWからなる群から選択される、請求項9に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9の2番目のアミノ酸が、P、Y、W、S、T、G、A、M、C、F、L、VおよびIからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9の2番目のアミノ酸が、A、L、S、T、VおよびWからなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質に相同な修飾されたシグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9の平均疎水性スコアは、修飾を含まないシグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9の平均疎水性スコアより少なくとも1.0単位高い、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドである、請求項1から12のいずれか一項に記載のmRNA。
- 疎水性スコアが、カイト-デューリトルのスケールに従って計算され、極性が、ジマーマンの極性インデックスに従って計算される、請求項1から13または2から13のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド、ニューロトロフィン-3(NTF-3)のシグナルペプチド、線維芽細胞増殖因子5(FGF5)のシグナルペプチド、インスリン様成長因子結合タンパク質5(IBP5)のシグナルペプチド、前立腺および精巣発現タンパク質2(PATE2)のシグナルペプチド、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ(SOD3)のシグナルペプチド、および補体因子H関連タンパク質2(FHR2)のシグナルペプチドからなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドである、請求項1から14のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、C-X-Cモチーフケモカインリガンド12(CXCL12)のシグナルペプチド、インスリン増殖因子2(IGF2)のシグナルペプチド、インスリン(INS)のシグナルペプチド、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドからなる群から選択される、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドである、請求項1から14のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドおよび前記タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)のシグナルペプチドおよびIGF1、インスリンのシグナルペプチドおよびINS、エリスロポエチン(EPO)のシグナルペプチドおよびEPO、インターロイキン4(IL-4)のシグナルペプチドおよびIL-4、ならびにインターロイキン10(IL-10)のシグナルペプチドおよびIL-10からなる群から選択される、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドである、請求項1から14のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、天然に存在するアミノ酸配列は、インスリン増殖因子1(IGF1)のプロペプチド、グルカゴン受容体(GL-R)のコード配列および腸型アルカリホスファターゼ(ALPI)のプロペプチドからなる群から選択される、天然に存在するアミノ酸配列である、請求項1から14のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドを使用した場合の分泌タンパク質の量は、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドを使用した場合の前記分泌タンパク質の量より多い、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドである、請求項1から18のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質に相同な修飾されたシグナルペプチドを使用した場合の分泌タンパク質の量は、修飾を含まない前記タンパク質に相同なシグナルペプチドを使用した場合の前記分泌タンパク質の量より多い、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドである、請求項1から18のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列を使用した場合の分泌タンパク質の量は、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドを使用した場合の前記分泌タンパク質の量より多い、天然に存在するアミノ酸配列である、請求項1から18のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、必要に応じて、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸の数の50%未満の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドである、請求項1から21のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸の数の50%未満の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチドである、請求項1から21のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて、天然に存在するアミノ酸配列のアミノ酸配列のアミノ酸の数の50%未満の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列である、請求項1から21のいずれか一項に記載のmRNA。
- タンパク質が、サイトカイン、増殖因子およびホルモンからなる群から選択される、請求項1から24のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、インスリン増殖因子1(IGF1)、インスリン(INS)、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン-4(IL-4)およびインターロイキン-10(IL-10)からなる群から選択される、請求項1から25のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質は、IGF1である、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドである、請求項1から25のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列は、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、前記タンパク質は、IGF1である、天然に存在するアミノ酸配列である、請求項1から27のいずれか一項に記載のmRNA。
- シグナルペプチドが、長さ16~40アミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項1から5および請求項7から28のいずれか一項に記載のmRNA。
- タンパク質およびシグナルペプチドをコードする核酸を含む転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクターであって、シグナルペプチドのアミノ酸配列のN末端のアミノ酸1~9は、2を超える平均疎水性スコアを有し、シグナルペプチドは、
i)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、必要に応じて、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されており、ただし前記タンパク質はオキシドレダクターゼではない、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド;
ii)前記タンパク質に相同なシグナルペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、前記タンパク質に相同なシグナルペプチド;および
iii)自然状態でシグナルペプチドの機能を有さない天然に存在するアミノ酸配列であって、必要に応じて少なくとも1つのアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって修飾されている、天然に存在するアミノ酸配列
からなる群から選択される、転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクター。 - 請求項1から29のいずれか一項に記載のmRNAおよび/または請求項30に記載の転写単位、発現ベクターもしくは遺伝子治療用ベクターを含む治療用組成物。
- 請求項1から29のいずれか一項に記載のmRNAおよび/もしくは請求項30に記載の転写単位、発現ベクターもしくは遺伝子治療用ベクター、ならびに/または請求項31に記載の治療用組成物および使用説明書、必要に応じてベクターマップ、必要に応じて宿主細胞、必要に応じて宿主細胞の培養のための培地、および/もしくは必要に応じてトランスフェクトされた宿主細胞を選択および培養するための選択培地を含むキット。
- i)タンパク質;および
ii)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAであって、
前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、mRNA。 - i)タンパク質;および
ii)前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチド
をコードする核酸配列を含むmRNAであって、
前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、カルボキシペプチダーゼ;サイトカイン;細胞外のリガンドおよび輸送体;細胞外マトリックスタンパク質;グルコシダーゼ;グリコシルトランスフェラーゼ;増殖因子;増殖因子結合タンパク質;ヘパリン結合タンパク質;ホルモン;ヒドロラーゼ;免疫グロブリン(immunoglobin);イソメラーゼ;キナーゼ;リアーゼ;金属酵素阻害剤;メタロプロテアーゼ;乳タンパク質;神経刺激性タンパク質;プロテアーゼ;プロテアーゼ阻害剤;タンパク質ホスファターゼ;エステラーゼ;トランスフェラーゼ;および血管作動性タンパク質からなる群から選択される、mRNA。 - タンパク質が、サイトカイン;増殖因子;増殖因子結合タンパク質;ヘパリン結合タンパク質;ホルモン;神経刺激性タンパク質;および血管作動性タンパク質からなる群から選択される、請求項33または34に記載のmRNA。
- タンパク質が、増殖因子である、請求項33または34に記載のmRNA。
- 増殖因子が、AMH、ARTN、BTC、CDNF、CFC1、CFC1B、CHRDL1、CHRDL2、CLEC11A、CNMD、EFEMP1、EGFL6、EGFL7、EGFL8、EPGN、EREG、EYS、FGF1、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FRZB、GDNF、GFER、GKN1、HBEGF、IGF1、IGF2、INHA、INHBA、INHBB、INHBC、INHBE、KITLG、MANF、MDK、MIA、NGF、NOV、NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、NRTN、NTF3、NTF4、OGN、PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD、PGF、PROK1、PSPN、PTN、SDF1、SDF2、SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、SFRP5、TDGF1、TFF1、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、THBS4、TIMP1、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、およびWISP3からなる群から選択される、請求項36に記載のmRNA。
- タンパク質が、IGF1である、請求項33または34に記載のmRNA。
- 脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドが、配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む、請求項33から38のいずれか一項に記載のmRNA。
- タンパク質をコードする核酸配列、および前記タンパク質にとって異種の脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドをコードする核酸配列が、作動可能に連結されている、請求項33から39のいずれか一項に記載のmRNA。
- 5’から3’に以下の順番で、
i)脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチド;
ii)必要に応じて、タンパク質のプロドメイン;および
iii)成熟タンパク質
をコードする核酸配列を含み、
脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドをコードする核酸配列、必要に応じた
タンパク質のプロドメインをコードする核酸配列、および成熟タンパク質をコードする核酸配列は、作動可能に連結されている、請求項33から40のいずれか一項に記載のmRNA。 - IGF1のプロペプチドをコードする核酸配列、成熟IGF1をコードする核酸配列、および脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、IGF1のEペプチドをコードする核酸配列を含まない、請求項33から41のいずれか一項に記載のmRNA。
- 脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドが、タンパク質の天然シグナルペプチドを置き換えている、請求項33から42のいずれか一項に記載のmRNA。
- タンパク質および前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクターであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、オキシドレダクターゼではない、転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクター。
- タンパク質および前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクターであって、前記タンパク質にとって異種のシグナルペプチドは、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドであり、前記タンパク質は、カルボキシペプチダーゼ;サイトカイン;細胞外のリガンドおよび輸送体;細胞外マトリックスタンパク質;グルコシダーゼ;グリコシルトランスフェラーゼ;増殖因子;増殖因子結合タンパク質;ヘパリン結合タンパク質;ホルモン;ヒドロラーゼ;免疫グロブリン(immunoglobin);イソメラーゼ;キナーゼ;リアーゼ;金属酵素阻害剤;メタロプロテアーゼ;乳タンパク質;神経刺激性タンパク質;プロテアーゼ;プロテアーゼ阻害剤;タンパク質ホスファターゼ;エステラーゼ;トランスフェラーゼ;および血管作動性タンパク質からなる群から選択される、転写単位、発現ベクターまたは遺伝子治療用ベクター。
- 請求項33から43のいずれか一項に記載のmRNAおよび/または請求項44または45に記載の転写単位、発現ベクターもしくは遺伝子治療用ベクターを含む治療用組成物。
- 請求項33から43のいずれか一項に記載のmRNAもしくは請求項44または45に記載の転写単位、発現ベクターもしくは遺伝子治療用ベクター、および/または請求項46に記載の治療用組成物および使用説明書、必要に応じてベクターマップ、必要に応じて宿主細胞、必要に応じて宿主細胞の培養のための培地、および/もしくは必要に応じてトランスフェクトされた宿主細胞を選択および培養するための選択培地を含むキット。
- 医薬として使用するための、請求項1から28または33から43のいずれか一項に記載のmRNA、請求項30または44から45のいずれか一項に記載の転写単位、発現ベクターもしくは遺伝子治療用ベクター、請求項31または46に記載の治療用組成物、または請求項32または47に記載のキット。
- 骨格筋損傷を処置するための方法での使用のための、請求項1から29または請求項38もしくは42のいずれか一項に記載のmRNA。
- 骨格筋損傷を処置する方法での使用のためのmRNA。
- 骨格筋損傷を処置する方法での使用のためのmRNAを含む治療用組成物。
- mRNAが、ヒトインスリン様成長因子1(IGF1)をコードするmRNAである、請求項50または51に記載の使用のためのmRNAまたは組成物。
- ヒトIGF1をコードするmRNAが、シグナルペプチドをコードする核酸配列、必要に応じてヒトIGF1のプロペプチドをコードする核酸配列、および成熟ヒトIGF1をコードする核酸配列を含む、請求項52に記載の使用のためのmRNAまたは組成物。
- シグナルペプチドをコードする核酸配列が、脳由来神経栄養因子(BDNF)のシグナルペプチドをコードする、請求項53に記載の使用のためのmRNAまたは組成物。
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