JP2022513352A - タンパク質－タンパク質相互作用をトランスダクションするための新規の方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列（ここで、前記第１の変異型が膜貫通ドメインを含まない）、ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（ここで、前記第２の変異型が膜貫通ドメインを含まない）、及び前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列を含む細胞に関する。本発明はさらに、本発明の細胞の使用に関する。【選択図】図４Ａ
Description
本出願は、２０１８年１０月１５日に提出された欧州特許出願第１８２００３５７．４号の優先権の利益を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、タンパク質－タンパク質相互作用を評価又はそれに応答するための、及び目的の遺伝子の発現にこの相互作用をトランスダクションするための方法及び手段に関する。
タンパク質－タンパク質相互作用などの分子相互作用は、生細胞のほぼすべての細胞プロセスに関与している。タンパク質－タンパク質相互作用の特性評価は、生物学的システムをよりよく理解し、かつ制御するための重要な工程である。検出可能なシグナル又は目的の遺伝子の発現に対するタンパク質－タンパク質相互作用のトランスダクションは、細胞ベースのバイオセンサー又は細胞治療として使用される新しい機能を備えた細胞の開発及び新薬の発見に重要である。
様々な細胞内経路は、タンパク質－タンパク質相互作用を促進又は抑制する化合物の有無によって調節される。タンパク質－タンパク質の相互作用を調節する分子を同定することは、創薬及び開発に用いられる主要な手段の一つである。さらに、新規の応答へのタンパク質－タンパク質相互作用のトランスダクションは、治療を目的とした細胞工学の主要な手段である。
化合物によって調節されるタンパク質相互作用の例は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と、βーアレスチンなどの下流経路タンパク質との間の相互作用である。ＧＰＣＲは、様々なリガンド（内因性ホルモン、成長因子、天然又は合成の小分子）を検出できる哺乳類細胞の膜受容体である。ＧＰＣＲとそのリガンドとの相互作用に続いて、細胞内の異なるカスケードが誘導され、細胞活性を調節する。細胞内のＧＰＣＲの中心的な機能により、多くの薬剤がＧＰＣＲに対して標的として作用する。ＧＰＣＲアゴニスト及びアンタゴニストを同定及び特性評価するために、様々なアッセイが開発されている。これらのアッセイのいくつかは、ＧＰＣＲと、そのタンパク質のパートナーの１つとの相互作用をレポーター遺伝子の発現にトランスダクションする。
さらに、タンパク質－タンパク質相互作用は、様々なシグナルを感知し、これらのシグナルを特定の応答にトランスダクションできるキメラセンサーを設計するために使用されてきた。所定の入力から特定の出力へと情報を誘導するこの能力は、細胞ベースのバイオセンサーを生成して新しいインビトロの診断ツールを作成したり、又はより良好な安全性及び有効性を持つ新しい細胞療法を生成したりするなど、多くの適用に使用することができる。バイオセンサーの分野では様々な開発が行われているが、その多くは人間による手動の読み取り及び解釈を必要とする単に検出可能なシグナルを生成するだけである。シグナルを遺伝子発現などの下流の生物学的活性にトランスダクションするバイオセンサーについては、これまでほとんど進展が見られなかった。これまでに記載された人工シグナル伝達システムでは、主に融合タンパク質の切断作用を利用して、転写活性化因子を放出し、これにより、次いで目的の遺伝子の発現を調節する。
二成分系（ＴＣＳ）シグナル伝達カスケードは、ヒスチジン残基でのヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）受容体タンパク質のリガンド誘発性自己リン酸化によって開始され、続いて応答制御（（ＲＲ：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）タンパク質のアスパラギン酸残基へのリン酸転移が行われる。いくつかの例外はあるが、ＨＫセンサーは、細胞膜でホモ二量体を形成し、ＨＫ自己リン酸化の構造的基礎は、２つの異なるＨＫ二量体コンフォメーションが存在することである。刺激されていない状態では、触媒性ＡＴＰ結合（ＣＡ：ｃａｔａｌｙｔｉｃ ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメインが二量体化及びヒスチジン含有リン酸転移（ＤＨｐ：ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒ）ドメインのヒスチジン残基から離れているようなコンフォメーションであるため（図１ａ）、自己リン酸化は起こらない。リガンドが結合すると、ＣＡドメイン及び結合したＡＴＰがＤＨｐのヒスチジンに近接し、ホスホリル転移が可能になる。次に、同族の応答制御因子（ＲＲ）が、リン酸化されたＤＨｐドメインに結合し、該リン酸が、ヒスチジンからＲＲのレシーバードメインの１つのアスパラギン酸に転移し、リン酸化されたＲＲがその標的プロモーターに結合して、遺伝子発現を調節する。さらに、リン酸化されたＲＲが、リン酸化されていないＤＨｐドメインと結合する場合、このＤＨｐドメインはアスパラギン酸残基の脱リン酸化を触媒し、よってシグナル伝達を積極的に閉鎖する。したがって、ＨＫは、キナーゼ活性及びホスファターゼ活性を持つ２つの機能を持った酵素であり、この２つの間のバランスがシグナル伝達の強度及び力学を決定する。
ヒトの疾患におけるＧＰＣＲシグナル伝達の重要性に鑑み、ＧＰＣＲと相互作用する分子を検出及び同定するための様々なアッセイが開発されている。開発された様々な方法の中には、β－アレスチンがリガンド活性化ＧＰＣＲと相互作用することを利用したものもある。生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）アッセイ、ＴＡＮＧＯアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（図５）、ＣｈａＣｈａシステムがそれらの例である。１番目のシステムは、タンパク質－タンパク質相互作用を検出可能な蛍光シグナルにトランスダクションするものである。後の２つのアッセイは、タンパク質－タンパク質相互作用を、レポーター遺伝子など目的の遺伝子の発現にトランスダクションするものである。
ＴＡＮＧＯアッセイは、ＧＰＣＲの細胞内ドメインに、タンパク質切断可能人工転写因子（ＧＡＬ４－ＶＰ１６）を融合させること、及びβ－アレスチンにＴＥＶプロテアーゼを融合させることで実現している。リガンドによるＧＰＣＲの活性化は、β－アレスチンのＧＰＣＲへの動員を誘導し、ＴＥＶプロテアーゼをＧＰＣＲの切断可能なリンカーの近傍に結合させ、ＧＡＬ４－ＶＰ１６の放出を可能にする。人工転写因子は、ＧＡＬ４－ＶＰ１６が標的とするキメラプロモーターによって作動されるレポーター遺伝子（β－ラクタマーゼ）の発現を誘導するであろう。
ＣｈａＣｈａシステムは、ＴＡＮＧＯアッセイの派生として近年開発された。このシステムでは、ＶＰ６４、ｐ６５活性化ドメイン、及びＲｔａで構成される三者転写活性化因子に連結したｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９－ＶＰＲ）（ＤＮＡを切断できないが、それになお結合することができる）は、β－アレスチンに融合し、一方でＧＰＣＲの細胞内ドメインは、ＴＥＶプロテアーゼに融合する。このシステムではまた、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現も必要であり、これにより、目的の遺伝子の発現を作動するプロモーターにｄＣａｓ９を動員することを可能にする。ＧＰＣＲとβ－アレスチン－ｄＣａｓ９－ＶＲＰ融合の間の相互作用により、ｄＣａｓ９－ＶＲＰを放出する。ｄＣａｓ９－ＶＲＰは、細胞内で共発現されるｇＲＮＡによって標的化される目的の遺伝子の発現を調節する。プロモーターは、内因性又はキメラのプロモーターであり得る。
例えば細胞質における一般的なタンパク質－タンパク質相互作用の精査に関して、異なる方法も同様に開発されてきた。最も一般的なものの１つは、酵母２ハイブリッド（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ）アプローチである。この方法では、通常餌（ｂａｉｔ）及び獲物（ｐｒｅｙ）と呼ばれる２つの可能な相互作用タンパク質を融合して、特定の検出可能な生物活性を持つタンパク質のサブユニットを分割する。分割されたサブユニット単独のそれぞれは、対象の生物学的活性を示さない。餌と獲物の間の相互作用は、それぞれ、餌と獲物に融合したドメインの適切な再構成を可能にする。餌と獲物の配置に応じて、様々なレポーターシステムが開発されている：
－ 核局在化を精査するために、分割されたタンパク質はレポーター遺伝子の転写活性化を再構成する；
－ 細胞質又は膜で起こるタンパク質－タンパク質相互作用について、レポーターシステムは、Ｒａｓシグナル伝達、ウラシル要求性、又は抗生物質耐性を活性化することによる酵母の増殖に基づいている。
－ 核局在化を精査するために、分割されたタンパク質はレポーター遺伝子の転写活性化を再構成する；
－ 細胞質又は膜で起こるタンパク質－タンパク質相互作用について、レポーターシステムは、Ｒａｓシグナル伝達、ウラシル要求性、又は抗生物質耐性を活性化することによる酵母の増殖に基づいている。
酵母２ハイブリッドアプローチの欠点の１つは、相互作用が酵母細胞で定量化されるが、哺乳類の天然の細胞環境での相互作用を忠実に再現できない可能性があるという事実である。
したがって、本発明の目的は、タンパク質－タンパク質相互作用に応答するための、及び／又はそれを評価するための手段及び方法を提供することである。
本発明の説明
この目的は、独立請求項に特定された細胞及びその方法によって解決される。有利な実施形態は、従属請求項及び以下の説明に記載されている。
この目的は、独立請求項に特定された細胞及びその方法によって解決される。有利な実施形態は、従属請求項及び以下の説明に記載されている。
本発明の第１の態様は、組換え細胞に関する。該細胞は、２つのポリペプチド又はタンパク質のペアの互いの相互作用の分析を容易にする。これらの相互作用パートナーは、以下では「第１のポリペプチド」及び「第２のポリペプチド」と呼ばれる。これらのポリペプチドのそれぞれは、核酸配列によってコードされ、これらのポリペプチドのそれぞれは、他のポリペプチドとの相互作用の分析の対象となるポリペプチド部分、及びＤＨｐ及びＣＡ活性を保持するヒスチジンキナーゼ変異型の断片を含む融合タンパク質の一部である。
本発明に従う細胞は、以下を含む：
－ ヒスチジンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．１３．３）の第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列。このヒスチジンキナーゼは、ＤＨｐ（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒ：二量体化及びヒスチジン含有リン酸基転移）ドメイン、及びＣＡ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ：触媒性ＡＴＰ結合）ドメインを含む。
該細胞は、さらに以下を含む：
－ ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
－ 第１又は前記第２のヒスチジンキナーゼの変異型のＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列。
－ ヒスチジンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．１３．３）の第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列。このヒスチジンキナーゼは、ＤＨｐ（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒ：二量体化及びヒスチジン含有リン酸基転移）ドメイン、及びＣＡ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ：触媒性ＡＴＰ結合）ドメインを含む。
該細胞は、さらに以下を含む：
－ ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
－ 第１又は前記第２のヒスチジンキナーゼの変異型のＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列。
言い換えれば、本発明のこの態様は、以下を含む細胞に関する：
－ 第１の核酸配列、ここで第１の核酸配列は、
ｏ ＮからＣへの方向において、ヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードし（第１のポリペプチドの第２のポリペプチドとの相互作用が分析の対象である）、ここで、ヒスチジンキナーゼはＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含み、かつＤＨｐドメインとＣＡドメインの両方は第１の変異型内で保持されている、
－ ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、ここで、ＤＨｐドメインとＣＡドメインとの両方が第２の変異型にも保持されている、及び
－ 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列。
－ 第１の核酸配列、ここで第１の核酸配列は、
ｏ ＮからＣへの方向において、ヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードし（第１のポリペプチドの第２のポリペプチドとの相互作用が分析の対象である）、ここで、ヒスチジンキナーゼはＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含み、かつＤＨｐドメインとＣＡドメインの両方は第１の変異型内で保持されている、
－ ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、ここで、ＤＨｐドメインとＣＡドメインとの両方が第２の変異型にも保持されている、及び
－ 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列。
特定の実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、上記のヒスチジンキナーゼのいかなる部分も含まず、特に膜貫通ドメイン、センサードメイン又は伝達ドメインを含まない。
本発明の細胞の特定の実施形態において、第１の変異型及び／又は第２の変異型は、ヒスチジンキナーゼの膜貫通ドメインを含まない。
本発明の細胞の特定の実施形態では、
－ 前記第１の変異型は、ヒスチジンキナーゼの機能的伝達ドメイン及び／又は機能的センサードメインを含まない、及び／又は；
－ 前記第２の変異型は、ヒスチジンキナーゼの機能伝達ドメイン及び／又は機能センサードメインを含まない。
－ 前記第１の変異型は、ヒスチジンキナーゼの機能的伝達ドメイン及び／又は機能的センサードメインを含まない、及び／又は；
－ 前記第２の変異型は、ヒスチジンキナーゼの機能伝達ドメイン及び／又は機能センサードメインを含まない。
特定の実施形態では、ヒスチジンキナーゼの天然に存在するセンサー及び伝達ドメインは、目的の２つのタンパク質によって置き換えられ、それらの相互作用は評価される必要がある。これらのタンパク質間に特異的な相互作用がある場合、それらの間の結合は、ヒスチジンキナーゼの短縮型変異型の二量体化を促進し、それによって、ＡＴＰを有するＣＡドメインとＤＨｐドメインの空間的近接性が達成される。これにより、ＤＨｐドメインのリン酸化が起こり、これは、次いで、同族リガンド、応答制御因子ドメイン、特に応答制御タンパク質のレシーバードメインをリン酸化することができる。
あるいは、目的の２つのタンパク質が人工的なシグナルトランスダクション経路を形成することができ、目的の２つのタンパク質の結合は、２つの目的のタンパク質の一方又は両方によって特異的に認識可能であるリガンドなどの刺激によって誘発される。リガンドの認識は、応答制御タンパク質の活性によって媒介される所望の応答につながり得る。そのような応答は、細胞、又はサイトカイン若しくは抗体などのタンパク質の細胞プロセスに影響を与えるマイクロＲＮＡの発現であり得る。特定の実施形態では、このような細胞は、医療用途に使用することができ、例えば、疾患関連抗原などの疾患関連化合物によって、有益な反応又は治療反応が特異的に誘発され得る。
あるいは、既知の相互作用タンパク質に対する化合物の作用は、本発明の細胞によって評価することができ、該化合物の作用は、応答制御タンパク質の活性によって決定することができる。
特に、応答制御タンパク質は、エフェクター機能を含み、これは、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用を評価するために決定することができ、あるいは、上述の刺激に応答して所望の応答を引き出すために使用することができる。このようなエフェクター機能の非限定的な例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は酵素、例えば、ｃＡＭＰの形成などを触媒する酵素との結合を含む。
特定の実施形態では、エフェクター機能は、プロモーター配列への特異的な結合、及び目的の遺伝子の発現の誘導を含む。
本発明の細胞の特定の実施形態では、応答制御タンパク質は、エフェクタードメインに融合したレシーバードメインを含み、レシーバードメインは、第１又は第２のヒスチジンキナーゼ変異型のＤＨｐドメインによってリン酸化されることが可能であり、かつエフェクタードメインは、リン酸化されたレシーバードメインによって調節、特に活性化又は阻害されることが可能である。特に、エフェクタードメインの活性は、レシーバードメインのリン酸化状態に応じて変化し、よって、エフェクタードメインの活性は、レシーバードメインのリン酸化によって増加し得、又はスイッチが入り得、又は減少し得、又は阻害され得る。
本発明の細胞の特定の実施形態では、
－ エフェクタードメインは、転写活性化ドメインであり、かつ
－ 細胞は、転写活性化ドメインによって認識可能である誘導性プロモーターの制御下の目的の遺伝子を含む第４の核酸配列を含み、
転写活性化ドメインの活性化により、目的の遺伝子の発現が誘導される。
－ エフェクタードメインは、転写活性化ドメインであり、かつ
－ 細胞は、転写活性化ドメインによって認識可能である誘導性プロモーターの制御下の目的の遺伝子を含む第４の核酸配列を含み、
転写活性化ドメインの活性化により、目的の遺伝子の発現が誘導される。
本発明の細胞の特定の実施形態では、目的の遺伝子は、目的のタンパク質、特に蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、又は目的のＲＮＡをコードしている。
そのような目的のタンパク質は、蛍光タンパク質又は発光タンパク質であり得、それにより、第１及び第２のポリペプチド間の相互作用の成功は、目的のタンパク質の蛍光又は発光を介して決定又は観察され得る。
あるいは、目的のタンパク質又は目的のＲＮＡは、上述の刺激に応答して所望の応答、例えば、所望の治療応答（サイトカイン、抗体、反応性オキシゲン種の産生など）であり得る、又はそれを起こし得る。
本発明の細胞の特定の実施形態では、
－ 第１の変異型及び第２の変異型は、ＥｎｖＺキナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＥＪ４）の変異型であり、応答制御タンパク質は、ＯｍｐＲ応答制御（ＲＲ）タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０ＡＡ１６）を含む、又はそれである、又は
－ 第１の変異型及び第２の変異型は、ＮａｒＸキナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＦＡ２）の変異型であり、レシーバードメインは、ＮａｒＬ応答制御（ＲＲ）タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０ＡＦ２８）を含む、又はそれであり、かつエフェクタードメインは、ＶＰ１６転写活性化ドメイン（Ｖｐ４８、配列番号７）である、又はそれを含む。
－ 第１の変異型及び第２の変異型は、ＥｎｖＺキナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＥＪ４）の変異型であり、応答制御タンパク質は、ＯｍｐＲ応答制御（ＲＲ）タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０ＡＡ１６）を含む、又はそれである、又は
－ 第１の変異型及び第２の変異型は、ＮａｒＸキナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＦＡ２）の変異型であり、レシーバードメインは、ＮａｒＬ応答制御（ＲＲ）タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０ＡＦ２８）を含む、又はそれであり、かつエフェクタードメインは、ＶＰ１６転写活性化ドメイン（Ｖｐ４８、配列番号７）である、又はそれを含む。
前述のとおり、エフェクタードメインは、ＶＰ１６と融合されるＮａｒＬの一部であり得る。
本発明の細胞の特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、配列番号７によって特徴づけられるアミノ酸であるか、それからなるか、又はそれを含む。
本発明の細胞の特定の実施形態では、第１の変異型又は第２の変異型は、ＥｎｖＺ１８０～４５０（配列番号８）、ＥｎｖＺ２２３～４５０（配列番号９）、ＮａｒＸ１７６～５９８（配列番号１０）及びＮａｒＸ３７９～５９８（配列番号１１）から選択される変異型、又は配列番号８～１１の任意の１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する機能的に等価のポリペプチドである、又はそれを含む。
本発明の細胞の特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、ＯｍｐＲプロモーター（配列番号１）及びＮａｒＬ－ＲＥプロモーター（配列番号２）から選択される。
本発明の細胞の特定の実施形態では、第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列及び／又は第３の核酸配列は、細胞のコドンの使用に向けて最適化されている。
本発明の細胞の特定の実施形態では、第１の核酸配列及び／又は第２の核酸配列及び／又は第３の核酸配列は、構成的プロモーターの転写制御下にある。
本発明の細胞の特定の実施形態では、構成的プロモーターは、ＣＭＶ（配列番号３）、ＥＦ１α（配列番号４）、及びＥＦ１α－Ｖ１（配列番号５）から選択される。
本発明の細胞の特定の実施形態では、第１の変異型と第２の変異型とは同一である。
本発明の細胞の特定の実施形態では、ヒスチジンキナーゼはトランスリン酸化ファミリーに属している。
本発明の細胞の特定の実施形態では、
－ 第１の変異型は、ヒスチジンキナーゼの第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインがアクセス可能なヒスチジン残基を含まないＤＨｐドメインを含み、及び／又は
－ 第２の変異型は、ＡＴＰを結合できないＣＡドメインを含む。
－ 第１の変異型は、ヒスチジンキナーゼの第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインがアクセス可能なヒスチジン残基を含まないＤＨｐドメインを含み、及び／又は
－ 第２の変異型は、ＡＴＰを結合できないＣＡドメインを含む。
本発明の細胞の特定の実施形態では、
－ 第１の変異型は、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｈ３９９Ｑ）（配列番号１２）、又は（配列番号１２）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する機能的に等価のポリペプチドであるか、又はそれを含む、及び／又は
－ 第２の変異型は、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｎ５０９Ａ）（配列番号１３）、又は（配列番号１３）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する機能的に等価のポリペプチドであるか、又はそれを含む。
－ 第１の変異型は、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｈ３９９Ｑ）（配列番号１２）、又は（配列番号１２）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する機能的に等価のポリペプチドであるか、又はそれを含む、及び／又は
－ 第２の変異型は、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｎ５０９Ａ）（配列番号１３）、又は（配列番号１３）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する機能的に等価のポリペプチドであるか、又はそれを含む。
本発明の細胞の特定の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの特異的な結合は、第１のポリペプチド及び／又は第２のポリペプチドによって特異的に認識可能なリガンドによって誘発可能である。
本発明の細胞の特定の実施形態では、第１のポリペプチドは受容体であるか、又はそれを含み、かつ第２のポリペプチドは該受容体の結合パートナーであるか、又はそれを含み、受容体と結合パートナーとの結合が、受容体によって認識されるリガンドによって誘発可能である。
本発明の細胞の特定の実施形態では、受容体は膜貫通型受容体であり、結合パートナーは細胞質タンパク質である。この場合、受容体によって認識可能なリガンドと、結合パートナーである細胞質タンパク質とは、特に膜によって隔てられている。
本発明の細胞の特定の実施形態では、
－ 第１のポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体からなるか、又はそれを含み、かつ第２のポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体の細胞質リガンド、特にβ－アレスチンからなるか、又はそれを含み、又は
－ 前記第１のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体又はその構成要素の１つからなるか、又はそれを含み、第２のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体の細胞質リガンド、又はその構成要素、特にＺＡＰ－７０（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ４３４０３）であるか、又はそれを含む。
－ 第１のポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体からなるか、又はそれを含み、かつ第２のポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体の細胞質リガンド、特にβ－アレスチンからなるか、又はそれを含み、又は
－ 前記第１のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体又はその構成要素の１つからなるか、又はそれを含み、第２のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体の細胞質リガンド、又はその構成要素、特にＺＡＰ－７０（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ４３４０３）であるか、又はそれを含む。
本発明の細胞の特定の実施形態では、細胞は哺乳類細胞、特にヒト細胞である。
本発明の別の態様は、タンパク質－タンパク質相互作用を評価するための方法に関する。該方法は以下を含む：
－ 本発明に従う細胞を提供すること、該細胞は以下を含む：
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．１３．３）の第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
● 第１又は第２の変異型のＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列；及び
－ 応答制御（ＲＲ）タンパク質の活性を決定すること、
ここで、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが特異的に結合すると、第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインが第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインをリン酸化し、そして応答制御タンパク質の活性が、第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインによるリン酸化によって調節されるように、特に活性化若しくは阻害されるように、第１の変異型と第２の変異型とが二量体化する。
－ 本発明に従う細胞を提供すること、該細胞は以下を含む：
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．１３．３）の第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
● 第１又は第２の変異型のＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列；及び
－ 応答制御（ＲＲ）タンパク質の活性を決定すること、
ここで、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが特異的に結合すると、第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインが第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインをリン酸化し、そして応答制御タンパク質の活性が、第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインによるリン酸化によって調節されるように、特に活性化若しくは阻害されるように、第１の変異型と第２の変異型とが二量体化する。
本発明のさらなる態様は、タンパク質－タンパク質相互作用に対する化合物の作用を評価するための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
－ 本発明に従う細胞を提供する工程であり、該細胞は以下を含む：
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
● 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、及び
－ 細胞を化合物に接触させる工程、及び
－ 前記応答制御タンパク質の活性を決定する工程、
ここで、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが特異的に結合すると、第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインが第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインをリン酸化し、そして応答制御タンパク質の活性が、前記第１の変異型又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによるリン酸化によって調節されるように、特に活性化若しくは阻害されるように、第１の変異型と第２の変異型とが二量体化し、及び
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの特異的な結合に対する化合物の作用は、応答制御タンパク質の活性によって決定される。
－ 本発明に従う細胞を提供する工程であり、該細胞は以下を含む：
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
● 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、及び
－ 細胞を化合物に接触させる工程、及び
－ 前記応答制御タンパク質の活性を決定する工程、
ここで、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが特異的に結合すると、第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインが第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインをリン酸化し、そして応答制御タンパク質の活性が、前記第１の変異型又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによるリン酸化によって調節されるように、特に活性化若しくは阻害されるように、第１の変異型と第２の変異型とが二量体化し、及び
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの特異的な結合に対する化合物の作用は、応答制御タンパク質の活性によって決定される。
有利なことに、上記の方法は、任意の目的のタンパク質－タンパク質相互作用に対する任意の化合物の作用を評価するためのスクリーニングアッセイとして使用することができる。
本発明のさらに別の態様は、刺激に応答して所望の応答を引き出すための方法を提供する。本発明のこの態様に従う方法は、以下の工程を含む：
－ 本発明に従う細胞を提供する工程であり、該細胞は以下を含む：
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
ここで、第１ポリペプチドと第２のポリペプチドとの特異的な結合は、刺激によって誘発される、及び
● 第１又は第２の変異型のＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、
ここで、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが特異的に結合すると、第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインが第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインをリン酸化し、そして応答制御タンパク質の活性が、第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインによるリン酸化によって調節されるように、特に活性化される若しくは阻害されるように、第１の変異型と第２の変異型とが二量体化する、及び
－ 細胞を刺激に暴露する工程であり、ここで、所望の応答は、応答制御タンパク質の活性によって媒介される、又は応答制御タンパク質の活性である。
－ 本発明に従う細胞を提供する工程であり、該細胞は以下を含む：
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
ここで、第１ポリペプチドと第２のポリペプチドとの特異的な結合は、刺激によって誘発される、及び
● 第１又は第２の変異型のＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、
ここで、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが特異的に結合すると、第１の変異型又は第２の変異型のＣＡドメインが第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインをリン酸化し、そして応答制御タンパク質の活性が、第１の変異型又は第２の変異型のＤＨｐドメインによるリン酸化によって調節されるように、特に活性化される若しくは阻害されるように、第１の変異型と第２の変異型とが二量体化する、及び
－ 細胞を刺激に暴露する工程であり、ここで、所望の応答は、応答制御タンパク質の活性によって媒介される、又は応答制御タンパク質の活性である。
好ましくは、第１ポリペプチド又は第２ポリペプチドは、刺激を認識する受容体、例えば疾患関連抗原を認識するＴ細胞受容体、又はＧ共役型受容体であり、他のポリペプチドは、この受容体のリガンド、例えば、それぞれ、β－アレスチン又はＺＡＰ－７０であり得る。
「第１のポリペチドと第２のポリペチドとの特異的な結合」という用語は、特に、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、又は１０－９Ｍ未満のＫｄを有する結合を意味する。
本発明の方法の特定の実施形態では、応答制御タンパク質は、エフェクタードメインに融合したレシーバードメインを含み、レシーバードメインは、第１又は第２の変異型のＤＨｐドメインによってリン酸化可能であり、かつエフェクタードメインは、リン酸化されたレシーバードメインによって活性化可能である。
本発明の方法の特定の実施形態では、
－ 応答制御タンパク質は、エフェクタードメインに融合したレシーバードメインを含み、レシーバードメインは、前記第１又は第２の変異型のＤＨｐドメインによってリン酸化可能であり、かつエフェクタードメインは、リン酸化されたレシーバードメインによって活性化可能であり；
－ エフェクタードメインは、転写活性化ドメインであり、
－ 細胞は、前記転写活性化ドメインによって認識可能である誘導性プロモーターの制御下の目的の遺伝子をコードする第４の核酸配列をさらに含み、
－ 転写活性化ドメインの活性化により、目的の遺伝子の発現が誘導される。
－ 応答制御タンパク質は、エフェクタードメインに融合したレシーバードメインを含み、レシーバードメインは、前記第１又は第２の変異型のＤＨｐドメインによってリン酸化可能であり、かつエフェクタードメインは、リン酸化されたレシーバードメインによって活性化可能であり；
－ エフェクタードメインは、転写活性化ドメインであり、
－ 細胞は、前記転写活性化ドメインによって認識可能である誘導性プロモーターの制御下の目的の遺伝子をコードする第４の核酸配列をさらに含み、
－ 転写活性化ドメインの活性化により、目的の遺伝子の発現が誘導される。
本発明の方法の特定の実施形態では、目的の遺伝子の発現産物の存在は、応答制御タンパク質の活性として決定される。
本発明の方法の特定の実施形態では、目的の遺伝子の発現産物は、光学的品質を有し、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の場合のように、発光部分を含む。
本発明の方法の特定の実施形態では、目的の遺伝子の発現産物は、セルリアンである。
本発明の方法の特定の実施形態では、目的の遺伝子の発現産物は、所望の反応であるか、又は所望の反応を媒介する。例えば、発現産物は、細胞による免疫応答を引き出すことを目的としたサイトカインであり得る。発現産物はまた、シグナルカスケードのさらに下流の所望の応答を引き出すシグナルカスケードの成分であり得る。発現産物はまた、所望の応答を引き出すことができるＲＮＡであってもよく、例えば、それ自体が内因性遺伝子を制御するマイクロＲＮＡ又はガイドＲＮＡであってもよい。
さらに、本発明は、哺乳類細胞、特にヒト細胞をトランスフェクション又はトランスダクションするのに特に適したベクターを提供する。該ベクターは、以下を含む：
－ 本発明の細胞内に含まれるような第１の核酸配列、
－ 本発明の細胞内に含まれるような第２の核酸配列、
－ 本発明の細胞内に含まれるような第３の核酸配列、及び
－ 任意に、本発明の細胞内に含まれるような第４の核酸配列。
－ 本発明の細胞内に含まれるような第１の核酸配列、
－ 本発明の細胞内に含まれるような第２の核酸配列、
－ 本発明の細胞内に含まれるような第３の核酸配列、及び
－ 任意に、本発明の細胞内に含まれるような第４の核酸配列。
本発明のさらなる態様によれば、融合タンパク質が提供される。変異型は、ＤＨｐ（二量体化及びヒスチジン含有リン酸基転移）ドメイン及びＣＡ（触媒性ＡＴＰ結合）ドメインを含むヒスチジンキナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．１３．３）の変異型に融合したポリペプチドを含む。
特に、該ポリペプチドは、上記のヒスチジンキナーゼのいずれの一部、特に膜貫通ドメイン、センサードメイン、伝達ドメインを含まない。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、変異型はヒスチジンキナーゼの膜貫通ドメインを含まない。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、変異型は、ヒスチジンキナーゼの機能的な伝達ドメイン及び／又は機能的なセンサードメインを含まない。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、変異型は、ＥｎｖＺキナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＥＪ４）の変異型であるか、又はＮａｒＸキナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＦＡ２）の変異型である。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、変異型は、ＥｎｖＺ１８０～４５０（配列番号８）、ＥｎｖＺ２２３～４５０（配列番号９）、ＮａｒＸ１７６～５９８（配列番号１０）及びＮａｒＸ３７９～５９８（配列番号１１）から選択される変異型、又は配列番号８～１１の任意の１つに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する機能的に等価のポリペプチドであるか、又はそれを含む。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、ヒスチジンキナーゼはトランスリン酸化ファミリーに属している。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、変異型は、該変異型のＣＡドメイン又はヒスチジンキナーゼの別の変異型によってアクセス可能なヒスチジン残基を含まないＤＨｐドメインを含む、又はＡＴＰを結合することができないＣＡドメインを含む。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、変異型は、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｈ３９９Ｑ）（配列番号１２）、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｎ５０９Ａ）（配列番号１３）、又は配列番号１２若しくは１３に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する機能的に等価のポリペプチドであるか、又はそれを含む。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体又はＧタンパク質共役型受容体の細胞質リガンド、特にβ－アレスチンからなるか、又はそれを含む。
本発明の融合タンパク質の特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体若しくはその構成要素の１つ、又はＴ細胞受容体の細胞質リガンド若しくはその構成要素、特にＺＡＰ－７０（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ４３４０３）を含む。
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、これにより、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、バクテリアに存在する２成分系に由来する成分を用いて、哺乳類細胞の遺伝子発現にタンパク質－タンパク質相互作用をトランスダクションする新規のアプローチを提供する。本発明は、一般的なタンパク質－タンパク質相互作用のための、及び特にＧＰＣＲシグナル伝達の調節のための新しいスクリーニングアッセイの開発に使用することができる。本明細書にて記載されるシステムは、従来（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社のＴＡＮＧＯシステム）に比べてダイナミックレンジが優れていることを特徴とし、かつ構築ブロックのほぼ無制限の供給によって、ハイスループットな多重化に対し大きな可能性を有する。
本発明は、バクテリアに存在する２成分系に由来する成分を用いて、哺乳類細胞の遺伝子発現にタンパク質－タンパク質相互作用をトランスダクションする新規のアプローチを提供する。本発明は、一般的なタンパク質－タンパク質相互作用のための、及び特にＧＰＣＲシグナル伝達の調節のための新しいスクリーニングアッセイの開発に使用することができる。本明細書にて記載されるシステムは、従来（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社のＴＡＮＧＯシステム）に比べてダイナミックレンジが優れていることを特徴とし、かつ構築ブロックのほぼ無制限の供給によって、ハイスループットな多重化に対し大きな可能性を有する。
本発明は、低バックグラウンドレベル、高ダイナミックレンジ、及び可逆性などの特性を持つ、細胞ベースのバイオセンサー及び人工治療細胞における合成シグナルトランスダクションモジュールの基礎を提供することができる。このアプローチは多重化が可能であるため，複雑な論理ベースの回路を作ることができ、これにより改変細胞に新規の機能を提供することができる。
特に、本発明は３つの異なる特徴を含む：
－ ＨＫ（ヒスチジンキナーゼ）成分（２つの異なる変異体に分かれる）
－ ＲＲ成分
－ 目的の遺伝子の発現を可能にするキメラプロモーターを含有する遺伝子コンストラクト。
－ ＨＫ（ヒスチジンキナーゼ）成分（２つの異なる変異体に分かれる）
－ ＲＲ成分
－ 目的の遺伝子の発現を可能にするキメラプロモーターを含有する遺伝子コンストラクト。
２つの相互作用性タンパク質に融合したＨＫドメインは、ダイナミックレンジを増加するように変異されている。野生型のドメインも使用できるが、今のところダイナミックレンジが低下する結果となっている。それにも関わらず、システムがホモ二量体化を検出するために使用される場合、野生型ドメインの使用は、いくつかの利点をもたらす。さらに、目的のタンパク質のホモ二量体化の場合には、シスファミリーに属するＨＫを使用することができる。このアプローチの利点は、遺伝子コンストラクトの数を低減することである。それにもかかわらず、すべての場合において、本発明の重要な特徴は、目的のタンパク質の、サイズが縮小されたＨＫのドメインへの融合である（このドメインは、融合した成分の補助により強制的に二量体化させない限り、それ自体では二量体化せず、したがって、それ自体では転写活性をトランスダクションしない）。
本実験で使用したＲＲ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：応答制御タンパク質）は、哺乳類細胞で機能する転写活性化ドメインであるＶＰ４８と融合されている。他の転写活性化ドメインは、ＲＲに融合させることもでき、例えばｐ６５（ＲｅｌＡ）ドメイン又はＲｔａなどである。本実施例では、本発明者らはＤＮＡに直接結合するＲＲを使用したが、所望の読み出しに応じて他の種類のＲＲを使用することができる。例えば、一部のＲＲはＲＮＡに結合することができ、他のＲＲは酵素であり、これはサイクリックジ－ＧＭＰなどの二次シグナルトランスダクション鎖に供給される化合物の生成を触媒する。
目的の遺伝子（ＧＯＩ：ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を発現する遺伝子コンストラクトは２つの要素を含む。第１の部分は、キメラプロモーターである。本発明者らは、ＲＲのいくつかの結合部位を有する上流配列に連結された最小プロモーターを使用した。最小プロモーターとＲＥの数との間の距離を調節して、ＧＯＩの発現に合わせて上下に調整することができる。
実験で使用したＧＯＩは蛍光レポーターのセルリアンであるが、これは他のタンパク質又はＲＮＡをコードする遺伝子に置き換えることができる。例えば、ＧＯＩは、それ自体が内因性遺伝子を制御できるｍｉＲＮＡ又はガイドＲＮＡであり得る。
本発明は、前述のシステムのＴＡＮＧＯ及びＣｈａＣｈａとは、これらのそれぞれが、前もってＧＰＣＲ又はβ－アレスチンに融合された転写因子を放出し、この転写因子は時間と共に蓄積することにおいて異なる。反対に、本発明では、すべての要素は、タンパク質－タンパク質相互作用のある１つの作用の後も依然として機能的であり、したがって、それらは複数のターンオーバーを示す。ＴＡＮＧＯ及び本発明のシステムの両方によって調節される目的の遺伝子は、キメラプロモーターの制御下にある。ＣｈａＣｈａシステムでは、適切に設計されたｇＲＮＡを使用して、内在性の遺伝子を調節することもできる。本発明とＴＡＮＧＯアッセイとの間の別の違いは、本発明では、キメラＧＰＣＲ融合及びβ－アレスチン融合に加えて、ＲＲというさらなる成分を必要とすることである。
ＧＰＣＲ及びβ－アレスチンに融合したＨＫドメインのサイズはわずか２２３個のアミノ酸残基（ａａ）である。ＴＡＮＧＯでは、融合したタンパク質のサイズは、それぞれ２４０ａａ、及び３４１ａａである。ＣｈａＣｈａについては、ｇＲＮＡの発現要件に加えて、それらは、それぞれ２４０ａａ、及び１９００ａａである。このより小さいサイズのために、該システムは構築が容易であり、これにより細胞への負担を少なくする。
本発明のシステムは、２つのシグナル増幅工程を含有する。本発明に特有の第１の工程では、複数のＲＲのコピーをリン酸化するＨＫの再構築を生じる。ＴＡＮＧＯ及びＣｈａＣｈａシステムにも存在する増幅の第２のレベルは、ＲＲによる遺伝子誘導の触媒的性質のレベルである。本発明の２段のレベルの増幅により、結果としてＴＡＮＧＯシステムと比較してダイナミックレンジが１０倍に向上する。
本発明のシステムは、時間の経過と共に脱感作されず、何度かのリガンドの存在／非存在におけるサイクルの後に、同じタンパク質が再活性化されることが可能である。反対に、ＴＡＮＧＯ及びＣｈａＣｈａのシステムの要素は、一度しか使用できないため、それらのシステム活性はタンパク質の分解及びｄｅ ｎｏｖｏタンパク質合成に依存しており、これは本質的に遅いプロセスである。この特性により、本発明のシステムは、オン状態からオフ状態へ（及びその逆も）より迅速に切り替わることができる。
本発明が他のアプローチと比較して１つの余分な増幅レベルを含有することにより、本発明は、少量のタンパク質及び弱いタンパク質－タンパク質相互作用を検出することができる。この特徴の利点は、本発明のアッセイに必要な成分の発現が、細胞内で低から高に調節できることである。このようにして、該システムの成分の発現レベルを、適切なリガンド誘導性ダイナミックレンジを可能にするレベルに設定することができる。したがって、本アプローチは、以前のアプローチでのタンパク質の過剰発現によって発生することがあるリガンド非依存性シグナル伝達を低減する。
特に、本発明のアッセイは、ＴＡＮＧＯアッセイよりも高いダイナミックレンジを示す。このパラメータは、ＴＡＮＧＯと比較して、本発明によって生成される結果の自動分析を容易にするであろう。
別の本発明のシステムの利点は、異なるＨＫ－ＲＲペアを同時に使用することによって多重化できることである。天然の２成分システムの数が非常に多いため、多重化の可能性は非常に大きい。各キメラペアは独立しており、異なる出力を誘導する。それ故、同じ実験で、複数のタンパク質－タンパク質相互作用及び複数のＧＰＣＲに対する化合物の作用を一度に試験することができるであろう。他のアプローチでは、十分に特徴づけられたＴＥＶプロテアーゼの数が限られているため、多重化はより困難である。
また、本発明のシステムでは、ＲＲが自発的に脱リン酸化することにより、可逆性を実現している。タンパク質ペアの間の相互作用がない場合、該キナーゼはもはや活性化されず、ＲＲをリン酸化することはない。リン酸化されていないＲＲは、ＧＯＩの発現を誘導することができない。ＴＡＮＧＯ及びＣｈａＣｈａの場合、ＧＰＣＲとβ－アレスチンの間の相互作用の後に放出される転写活性化因子を、時間をかけて分解する必要があるため、システムの可逆性は困難である。
最後に、本発明のアッセイは高度にモジュール化されている。ＧＰＣＲ誘導アッセイの場合のように、相補するＨＫ断片の同じペアを利用して、細胞質内のタンパク質－タンパク質相互作用及び膜局在性タンパク質－タンパク質相互作用を検出できる。他のアッセイでは、様々な種類のタンパク質－タンパク質相互作用を探査するために大幅な調整が必要であり、ＴＡＮＧＯなどのアッセイではＧＰＣＲ経路に特異的であり、かつ一般的なタンパク質－タンパク質相互作用の探査には使用されていない。
本発明は、複数の用途を有することができる。
１）ＧＰＣＲと相互作用する化合物を同定するための新しいスクリーニングアッセイの開発に使用できる。得られたアッセイは、既存のアッセイよりも優れた特異性及び高いダイナミックレンジを持つと期待される。また、多重化も容易になる。アッセイの商業化は、現在、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ及びＴＡＮＧＯ）によって行われているのと同様に、ＨＫに融合されたＧＰＣＲを含有する安定した細胞株を販売することによって行うことができる。
１）ＧＰＣＲと相互作用する化合物を同定するための新しいスクリーニングアッセイの開発に使用できる。得られたアッセイは、既存のアッセイよりも優れた特異性及び高いダイナミックレンジを持つと期待される。また、多重化も容易になる。アッセイの商業化は、現在、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ及びＴＡＮＧＯ）によって行われているのと同様に、ＨＫに融合されたＧＰＣＲを含有する安定した細胞株を販売することによって行うことができる。
２）タンパク質－タンパク質相互作用を調節する化合物をスクリーニングするために使用することができ、それ故、創薬に使用できる。酵母２ハイブリッドとは対照的に、該スクリーニングアッセイは哺乳類細胞で行うことができ、これはより重要なシステムである。さらに、本発明では、同じアッセイを、異なる細胞区画（核、細胞質、又は膜）に局在するタンパク質に使用することができる。
３）既存の治療用細胞ベースの薬剤は、膜の細胞質側でのタンパク質－タンパク質相互作用に関与するシグナル伝達経路を使用することが多い。これは、細胞外抗体断片への抗原の結合がタンパク質相互作用パートナーを動員するＣＡＲ－Ｔ細胞を含み；これらの相互作用は、次いで再配線されて、発明者のアプローチを使用して治療効果をもたらすことができる。
ＨＫの細胞質ドメインは二量体化及び自己リン酸化が可能であることが知られている。
本発明は、部分的な細胞質ドメインが、固有のシグナルを送る能力の低下を有するかどうかという課題に基づいている。この目的のために、本発明者らは、ＨＫの段階的短縮の変異誘発を実施して、それ自体で二量体化できないドメインを同定した（図１ｂ）。短縮型変異体の第１のセットは、ＥｎｖＺ及びＮａｒＸの細胞質ドメイン全体（それぞれＥｎｖＺ１８０～４５０及びＮａｒＸ１７６～５９８）を含み、第２のセットはヒスチジンの上流に約２０個のアミノ酸（ａａ）のＮ末端を有するより深い切断を特徴とした（それぞれ、ＥｎｖＺ２２３～４５０及びＮａｒＸ３７９～５９８）。本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞において同族の応答制御因子ＯｍｐＲと共発現するＥｎｖＺの短縮型変異体が、構成的にシグナルを送ることができ、かつ野生型ＥｎｖＺに匹敵するレベルでＯｍｐＲ制御性レポーターであるｍセルリアンの発現を誘導できることを発見した（図１ｃ）。この結果は、ヒスチジンを含有する小さなＥｎｖＺドメイン（「ドメインＡ」、ａａ ２２３～２８９）がホモ二量体化の原因であるということと一致している。一方、ＮａｒＸの短縮型変異体は、同族のＲＲ ＮａｒＬ及びＮａｒＬ誘導性レポーターの存在下で、基底シグナル伝達のサイズ依存性の低下を示し、最短の変異体であるＮａｒＸ３７９～５９８でバックグラウンドレベルに達した（図１ｄ）。この結果について、いくつかの説明が可能であり、以下を含む：（１）タンパク質の安定性の低下、（２）短縮型変異体のキナーゼ活性の低下及び／又はホスファターゼ活性の増加、及び（３）変異体がそれ自体で二量体化できないこと。これらの説明の中で、最後の説明だけが、合成シグナル伝達の最終的な確立をサポートする。強制的な二量体化がシグナル伝達を回復するかどうかを確認するために、本発明者らは、短縮型ＮａｒＸドメインを哺乳動物細胞において強力なヘテロ二量体を形成するタンパク質のペアに融合することを試みた。この理由は、二量体化のみが損なわれた場合に、互いに強い親和性を持つタンパク質に結合されるこれらの同じ変異体が二量体化し、シグナルを下流にトランスダクションするというものであった。
ＳｙｎＺｉｐ１／ＳｙｎＺｉｐ２
本発明者らは、既知の相互作用のペアであるＳｙｎＺｉｐ１とＳｙｎＺｉｐ２とを使用し、それらを短いＮａｒＸドメインであるＮａｒＸ３７９～５９８のＮ末端及びＣ末端に融合させた。短いＮａｒＸドメインのＮ末端へのＳｙｎＺｉｐ１及びＳｙｎＺｉｐ２の融合の共発現は、完全長のＮａｒＸのシグナル伝達よりもはるかに低いものの、レポーター発現の増加をもたらすことが観察された（図６）。一方、ＮａｒＸのＣ末端へのＳｙｎＺｉｐ融合の共発現は、二量体化によって誘発されるレポーター発現の増加をもたらさなかった。全体として、結果は、完全長ＨＫの細胞質ドメインに対するセンサードメインの位置と一致する、短い細胞質ＮａｒＸドメインのＮ末端への融合を介したシグナル伝達メカニズムとしての二量体化の強制の可能性を示唆した。しかし、定量的な挙動は貧弱であった。この研究と並行して、本発明者らは、コンストラクトを作動するプロモーターを、外部刺激に応答しないこと、及び発現レベルのバランスが取れていることを確実にするために最適化した（図７）。
本発明者らは、既知の相互作用のペアであるＳｙｎＺｉｐ１とＳｙｎＺｉｐ２とを使用し、それらを短いＮａｒＸドメインであるＮａｒＸ３７９～５９８のＮ末端及びＣ末端に融合させた。短いＮａｒＸドメインのＮ末端へのＳｙｎＺｉｐ１及びＳｙｎＺｉｐ２の融合の共発現は、完全長のＮａｒＸのシグナル伝達よりもはるかに低いものの、レポーター発現の増加をもたらすことが観察された（図６）。一方、ＮａｒＸのＣ末端へのＳｙｎＺｉｐ融合の共発現は、二量体化によって誘発されるレポーター発現の増加をもたらさなかった。全体として、結果は、完全長ＨＫの細胞質ドメインに対するセンサードメインの位置と一致する、短い細胞質ＮａｒＸドメインのＮ末端への融合を介したシグナル伝達メカニズムとしての二量体化の強制の可能性を示唆した。しかし、定量的な挙動は貧弱であった。この研究と並行して、本発明者らは、コンストラクトを作動するプロモーターを、外部刺激に応答しないこと、及び発現レベルのバランスが取れていることを確実にするために最適化した（図７）。
合成のシグナル伝達システムについて、シグナル伝達の読み取りに非特異的な変更を加えないようにすることが重要である。本発明のシステムにおいて、成分は、構成的プロモーターにより発現される。ただし、これらのプロモーターは実際にはＳｐ１などの高度発現性の転写因子によって制御されており、これらの因子が無関係の内因性経路を介する外部刺激によって直接影響を受ける危険性が常に存在する。これは、構成的発現の変化、及び研究された作用とは無関係であり、かつ人工的であるシグナル伝達の読み取りの明らかな変化をもたらすであろう。これらの交絡因子を排除するために、本発明者らは、様々な刺激条件下でのそれらの頑健性についていくつかの構成的プロモーターを調べ、細胞のシグナル伝達を誘導するために使用されることが多い異なる化合物（エピネフリン及びプロカテロール）の存在下でのＣＭＶプロモーター及びＥＦ１αプロモーターによるｉＲＦＰの発現を比較した。いずれの化合物を含まない培地では、両方のプロモーターの活性は類似している。しかしながら、エピネフリン及びプロカテロールの存在下では、ＣＭＶプロモーターの活性は２倍に誘導されるが、一方、ＥＦ１αプロモーターの活性は影響を受けない（図７ａ）。
短縮型ＨＫ細胞質ドメインの高すぎる発現がバックグラウンドレベルを増加させ、かつ非特異的な相互作用に応答するかどうかを決定するために、ＣＭＶ、ＥＦ１α、及びＥＦ１α－Ｖ１のプロモーターから発現されたＮａｒＸ／ＮａｒＬのシステムの活性を定量化した。ＥＦ１α－Ｖ１プロモーターはＥＦ１αより約５分の１弱い。結果は、レポーター遺伝子の同等の発現が、いずれの試験されたプロモーターから発現されたＮａｒＸで得られることを示している（図７ｂ、レーン２と３、及びレーン５と６を比較）。しかし、ＮａｒＬがより弱いプロモーターから発現される場合、レポーター遺伝子の発現の低下が観察された（補足図２ｂ）。これらの結果に照らして、本発明者らは、ＥＦ１α－Ｖ１を使用してＮａｒＸ由来のコンストラクトを作動し、ＥＦ１αを使用してＮａｒＬ発現を作動した。
本発明者らは、作用を最適化する可能性をさらに調査した。ＨＫは自己リン酸化メカニズムに関して２つのファミリーに分けられることが知られている。「シス」ファミリーでは、ホスホリル基は、同じモノマーのＣＡドメインに結合したＡＴＰ分子からヒスチジンに転移する。「トランス」ファミリーでは、ホスホリル基は、一方のモノマーに結合したＡＴＰから、もう一方のモノマーのリン酸化可能なヒスチジンに転移する（図２ａ）。すべてのＨＫについて、ＡＴＰ結合部位又はヒスチジンのいずれかを変異させることにより、ホスホリル基の転移を停止することができる。ＡＴＰ結合部位変異体とヒスチジン変異体の間に形成されたヘテロダイマーは、「シス」ファミリーＨＫの場合はシグナル伝達することができないが、「トランス」ファミリーＨＫの場合は、実際には、ヒスチジン変異体モノマーからＡＴＰ結合部位変異体モノマーへの一方向のリン酸転移を介してシグナルを送ることがなお可能である（図２ｂ）。それ故、これらの変異体は「トランス」ファミリーＨＫに対して互いに相補し合う。
本発明者らは、相補し合う変異体間の二量体化は、その同族の応答調節因子に対する変異体ＨＫのホスファターゼ活性の低下により、より効率的なトランスダクションをもたらすことができると仮定した。タンパク質アライメントを使用して、本発明者らは、ＮａｒＸのＣＡドメインにおけるＡＴＰ結合に重要な推定残基を同定した。
ＥｎｖＺのＣＡドメインに存在するアミノ酸（ａａ）の変異分析により、３４７位のアスパラギンがＥｎｖＺのキナーゼ活性に始原であると同定することを可能にした。ヒスチジンキナーゼのＣＡドメインは、ＨＳＰ９０シャペロン／ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ／ヒスチジンキナーゼタンパク質のＡＴＰａｓｅドメインの大きなファミリーに属している（スーパーファミリー５５８７４、ｈｔｔｐ：／／ｓｕｐｆａｍ．ｏｒｇ／ＳＵＰＥＲＦＡＭＩＬＹ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｃｏｐ．ｃｇｉ？ｓｕｎｉｄ＝５５８７４）。ＥｎｖＺのＮ３４７がＮａｒＸで保存されるかどうかを同定するために、本発明者らはＥｎｖＺ及びＮａｒＸをＡＴＰａｓｅドメインを含有するタンパク質でアライメントを行った。アライメントにより、ＮａｒＸのＡｓｎ５０９を、ＡＴＰ結合に潜在的に重要な保存残基と同定した。
全長ＨＫは哺乳動物細胞で構成的にシグナルを送ることが示されたため、本発明者らは、ＮａｒＸのコドン最適化変異体と同族下流のＲＲ ＮａｒＬ及びＮａｒＬ応答性プロモーターにより作動されるレポーター遺伝子の異なる組み合わせを同時トランスフェクトすることにより、ＨＥＫ２９３細胞で相補性アッセイを設定した。このアッセイ（図２ｃ）では、（ｉ）完全長の野生型ＮａｒＸが前に示したとおりシグナルを送ることができること、（ｉｉ）ＡＴＰ結合に重要なＣＡドメインのアスパラギン酸、又はＤＨｐドメインのヒスチジンのいずれかの変異体は、予想どおり、それ自体でシグナルを送ることができない、（ｉｉｉ）ＮａｒＸの相補変異体の共発現は、野生型で得られたレベルにシグナル伝達を部分的に回復させることを示す。
次に、ＮａｒＸの短い細胞質ドメインに同じ変異体を導入し（図２ｄ）、得られた変異体を、先の野生型ドメインで実施したとおり、Ｎ末端でＳｙｎＺｉｐ１及びＳｙｎＺｉｐ２のペプチドに融合し、それぞれコンストラクトＳｙｎＺｉｐ１：：ＮａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑ（以降、簡略化のためにＳｙｎＺｉｐ１：：Ｈｍｕｔと表記）、及びＳｙｎＺｉｐ２：：ＮａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａ（ＳｙｎＺｉｐ２：：Ｎｍｕｔと表記）を作成した。本発明者らはまた、融合ペアを反転させて、ＳｙｎＺｉｐ２：：ＮａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑ（ＳｙｎＺｉｐ２：：Ｈｍｕｔ）及びＳｙｎＺｉｐ１：：ＮａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａ（ＳｙｎＺｉｐ１：：Ｎｍｕｔ）を生成した。これらのコンストラクトのペアがＮａｒＬ応答レポーターの存在下でＮａｒＬ ＲＲと共にＨＥＫ２９３細胞で共発現した場合、ＮａｒＬを介したシグナル伝達は、完全長の野生型ＮａｒＸで得られたレベルに完全に回復し、かつ野生型の短いＮａｒＸ融合と比較してはるかに強いシグナルを生成することが見出された（図８）。回復は両方のペアで同じであった（図２ｆ、棒グラフ１１及び１２）。融合したＳｙｎＺｉｐドメインの一方又は両方が欠失している場合、シグナル伝達は停止し（図２ｆ、棒グラフ４～８、図９）、これは、融合ドメインの二量体化は必要であり、かつシグナル伝達を回復するのに十分であることを示している。興味深いことに、両方ともＳｙｎＺｉｐ１に融合した相補するＮａｒＸ変異体のペア（ＳｙｎＺｉｐ１：：Ｈｍｕｔ及びＳｙｎＺｉｐ１：：Ｎｍｕｔ）もまた、野生型ドメインの条件（図６、棒グラフ４）と同様の条件下で観察された（弱い）作用と一致して、シグナル伝達活性の上昇をもたらした（図２ｆ、棒グラフ９）。これは、ＳｙｎＺｉｐ１－ＳｙｎＺｉｐ２相互作用と比較して親和性が低下しているにもかかわらず、ＳｙｎＺｉｐ１ドメインがホモ二量体化できるという仮説につながる。実際、元の文献を調べると、ＳｙｎＺｉｐ１はサイズ排除クロマトグラフィー実験において単量体と二量体の両方として存在し、ＳｙｎＺｉｐ２単独よりもはるかに広い範囲でそのように存在することが示唆されている。シグナル伝達強度の用量応答挙動を評価するために、本発明者らは、ＮａｒＸ由来コンストラクトのプラスミド用量を変化させるための出力レベルを特徴づけた（図２ｇ）。
活性はプラスミドの投与量に比例して増加し、完全長の野生型ＮａｒＸが最も高い投与量感度を示し、おそらく最も強い二量体化定数を示し、ＳｙｎＺｉｐ１－ＳｙｎＺｉｐ２ペアはわずかに減少するが同等の二量体化挙動を示し、ＳｙｎＺｉｐ１は明らかに二量体化が劣っていることを示す。例えば、プラスミドの量を最初に使用した条件と比較して約１６分の１（１００ｎｇではなく６．２５ｎｇ）に減らすと、ＳｙｎＺｉｐ１－ＳｙｎＺｉｐ１シグナル伝達がバックグラウンドレベルに減少するが、一方で、予想どおり、強力なＳｙｎＺｉｐ１－ＳｙｎＺｉｐ２二量体化が生じる。
要約すると、これらの実験は、ＮａｒＸの可能なシグナル伝達が、相補する短縮型変異ドメインの二量体化の強制によって回復できること、及びこの回復が用量及び相互作用の強度に依存することを示唆している。Ｅ．ｃｏｌｉにおける約１：３０のＨＫ：ＲＲの比を用いる２成分シグナル伝達化学量論の現在の知識と一致して、ＮａｒＬと比較して約１０％のＮａｒＸ発現はレポーター出力を完全に活性化する。これは、ＮａｒＬを作動するプロモーターＥＦ１α－Ｖ１（「方法」を参照）が、ＮａｒＬを作動する野生型ＥＦ１αプロモーターよりも約５分の１と弱く、さらにプラスミドの投与量比が１：２（つまり、５０ｎｇのＮａｒＸ由来プラスミドに対し、１００ｎｇのＲＲをコードするプラスミド）はすでに応答を飽和している。
ＦＫ５０６／ＦＫＢＰ
本物のシグナル伝達を可能にするには、好ましくは、ＮａｒＸドメインの二量体化を外部刺激によって制御する必要がある。誘導性タンパク質－タンパク質相互作用は、細胞質内及び膜全体の両方で共通のシグナル伝達メカニズムである。十分に特徴づけられたリガンド誘導ヘテロ二量体化が、小分子Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）（ラパマイシン類似体 Ｃ１６－（Ｓ）－７－メチルインドールラパマイシン、ＡＰ２１９６７としても知られている）の存在下で、タンパク質ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）変異体ＦＲＢＴ２０９８Ｌの間で起こる。
本物のシグナル伝達を可能にするには、好ましくは、ＮａｒＸドメインの二量体化を外部刺激によって制御する必要がある。誘導性タンパク質－タンパク質相互作用は、細胞質内及び膜全体の両方で共通のシグナル伝達メカニズムである。十分に特徴づけられたリガンド誘導ヘテロ二量体化が、小分子Ａ／Ｃヘテロ二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）（ラパマイシン類似体 Ｃ１６－（Ｓ）－７－メチルインドールラパマイシン、ＡＰ２１９６７としても知られている）の存在下で、タンパク質ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）変異体ＦＲＢＴ２０９８Ｌの間で起こる。
ＮａｒＸドメインがこの相互作用をトランスダクションできるかどうかを調べるために（図３ａ）、上記のヒスチジン及びアスパラギンを相補するＮａｒＸ変異体を、それらのＮ末端で、それぞれＦＫＢＰ（ＦＫ）タンパク質とＦＲＢＴ２０９８Ｌ（ＦＲ）タンパク質とに融合し、ＦＫ：：ＮａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑ（ＦＫ：：Ｈｍｕｔ）及びＦＲ：：ＮａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａ（ＦＲ：：Ｎｍｕｔ）の融合体、及びその逆のＦＲ：：Ｈｍｕｔ及びＦＫ：：Ｎｍｕｔのペアを得た。第１に、１００ｎＭのＡ／Ｃの非存在下又は存在下でＮａｒＸ又はＮａｒＸ３７９～５９８をＨＥＫ細胞にトランスフェクトして、Ａ／Ｃが野生型のＮａｒＸ／ＮａｒＬシステムに影響を与えないことを確認した（図３ｂ、棒グラフ２及び３）。次に、本発明者らは、ＳｙｎＺｉｐ１－ＳｙｎＺｉｐ２の実験に使用した方法と同様の方法において、応答調節因子ＮａｒＬ及びＮａｒＬ活性化レポーターコンストラクトの存在下で、今回はリガンドを使用した場合と使用しない場合とで、異なる融合変異型と対照コンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にて発現させて、リガンド誘導性シグナル伝達を精査した（図３ｂ、図８）。予想のとおり、全長野生型ＮａｒＸは構成的に活性であった。野生型ＮａｒＸを除くすべてのケースで、リガンドの非存在下ではシグナル伝達は発生しなかった。高レベルのリガンドは、（ｉ）ＮａｒＸ由来ドメインが相補的なヒスチジン及びアスパラギン変異を含有する、かつ（ｉｉ）それらがそれぞれＦＫＢＰ及びＦＲＢ相互作用パートナーに融合される場合にのみ、強いシグナル伝達を誘導することができる（図３ｂ、棒グラフ１１及び１２）。次いで、発明者らは、ＦＲ：：ＨｍｕｔとＦＫ：：Ｎｍｕｔとのペアを使用して、この改変したシグナルトランスダクション経路の用量応答挙動を特徴づけることを進めた（図３ｃ）。用量応答は、期待されるヒル関数依存性を示しており、これから、アッセイにおけるＥＣ５０は、公表されている１０ｎＭ及び３６ｎＭの値と比較して１．３ｎＭであると決定された。
上記の結果は、細胞質におけるシグナルトランスダクションを媒介するＴＣＳに基づく成分の能力を示している。しかしながら、シグナル伝達の大部分は膜をわたって行われる。多くの膜貫通シグナル伝達経路は、脂質二重層の細胞質表面でのタンパク質－タンパク質相互作用に関与し、これには、数百のタンパク質のファミリーであるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）によって開始される重要なクラスのシグナル伝達経路を含む。ＧＰＣＲシグナルトランスダクションの重要な工程は、ＧＰＣＲ自体とタンパク質β－アレスチンとの間の複合体の形成であり、その後にＧＰＣＲの内部移行、リサイクル、シグナル伝達などの様々なプロセスが続く。この相互作用は、融合した転写活性化因子の特異的なタンパク質分解切断によるＧＰＣＲシグナル伝達の再配線に十分であることが以前に示されていた。本発明者らは、この相互作用がまた、二成分経路を介した触媒的膜貫通シグナル伝達を可能にし得ると仮定した。この目的のために、本発明者らは、ＮａｒＸの短縮型ヒスチジン変異体であるＮａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑを、ＧＰＣＲ ＡＤＲＢ２－ＡＶＰＲ２：アドレナリン受容体ベータ２（ＡＤＲＢ２）のプロカテロール活性化キメラ及びアルギニンバソプレシン受容体２（ＡＶＰＲ２）の細胞質断片に融合した。本発明者らはまた、ＮａｒＸの短縮型アスパラギン変異体であるＮａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａを、β－アレスチン２に融合した（図４ａ）。最後に、本発明者らは、作用が対称的であるかどうかを調べるために、これらの融合を逆にして実施した。
第１に、プロカテロールがＮａｒＸ／ＮａｒＬシステムを介したシグナル伝達に影響を与えないことを確認した。１００ｎＭのプロカテロールの非存在下又は存在下で、ＮａｒＬ及びＮａｒＬ活性化レポーターを、ＮａｒＸ又はＮａｒＸ３７９～５９８のいずれかで同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、プロカテロールとは無関係に、それぞれ、完全に誘導されたレポーター発現、及びバックグラウンドのレポーター発現を示した（図４ｂ、棒グラフ２及び３）。ＧＰＣＲ受容体、β－アレスチン、又はその両方にそれぞれ融合した相補的ＮａｒＸ変異体を組み合わせた実験（図４ｂ、図１１ａ）では、β－アレスチンとＧＰＣＲ受容体のみ（図４ｂ、棒グラフ９及び１０）で一定量のプロカテロール非依存性シグナル伝達が発生することが見出された。この作用はＧＰＣＲでより顕著であり、受容体がリガンド非依存的様式に二量体化することを示唆している。重要なことに、相補的なＮａｒＸ変異体がＧＰＣＲ受容体とβ－アレスチンとにそれぞれ融合した場合に、非常に強力なプロカテロール誘発性シグナル伝達が起こり、誘導ダイナミックレンジは３桁を超えた（図４ｂ、棒グラフ１１及び１２）。２成分に基づくシステムで得られたダイナミックレンジは、ＧＰＣＲ活性化のタンパク質分解に基づくアッセイであるＴＡＮＧＯアッセイで得られたものよりも高かった（図１１ｂ）。
合成シグナル伝達カスケードが異なる既知のＧＰＣＲリガンドの作用を再現できるかどうかを判断するために、本発明者らは、２種のアゴニスト（プロカテロール、イソプロテレノール）及び一部分のアゴニスト（クレンブテロール）の存在下でＡＤＲＢ２－ＡＶＰＲ２：：Ｈｍｕｔとβ－アレスチン：：Ｎｍｕｔ．とのペアを含むシステムの用量応答を特徴づけた。２つの完全アゴニストであるプロカテロール（図４ｃ、青い線）及びイソプロテレノール（図４ｃ、赤い線）は、用量依存的な様式に強力な下流遺伝子発現を誘導し、飽和用量で同じ最大応答に達することが観察された。部分アゴニストのクレンブテロールの存在下では、レポーター遺伝子の発現は完全アゴニストの存在下よりも３．５倍低くなる（図４ｃ、緑の線を青及び赤の線と比較）。さらに、単一細胞フローサイトメトリーのデータは、二峰性ではなく単峰性の誘導を示唆している（図４ｄ、ＴＣＳデータ）。プロカテロール、イソプロテレノール、及びクレンブテロールのＥＣ５０値は、用量応答曲線からそれぞれ５ｎＭ、３０ｎＭ、及び１４ｎＭであると決定した。これらの値は、文献に記載されている値、及びＴＡＮＧＯアッセイを使用して決定された値と類似している（図４ｃ、破線、二次軸）。ＴＡＮＧＯアッセイは高い絶対レポーター発現をもたらすが、漏出はＴＣＳに基づくメカニズムと比較してはるかに高く、単一細胞データは二峰性であることに注意されたい（図４ｄ、ＴＡＮＧＯデータ）。本発明者らはまた、プロカテロールの存在下でのアンタゴニストのプロプラノロールの作用を特徴づけ、本発明のシグナル伝達カスケードにおいて、該アンタゴニストが用量依存的な様式でプロカテロールの作用を阻害することを見出した（図４ｅ、青い線）。本発明者らは、このアッセイにおけるアンタゴニストのＩＣ５０を２ｎＭであると決定し、これは、ＴＡＮＧＯアッセイを使用することによって得られた値と同様であった（図４ｅ、破線）。これらの結果は、本発明のシステムが、ＧＰＣＲ活性に対するアゴニスト及びアンタゴニストの様々な既知の作用を忠実にトランスダクションすることができ、相互作用パラメータの定量的データを抽出するために使用できることを実証している。
概要
細胞、特に哺乳類細胞において天然でないシグナル伝達手法を実装することは、細胞の挙動を合理的に制御し、最終的には基礎研究、バイオテクノロジー、及び医学のための新規の細胞機能を操作するために非常に望ましい。二成分シグナル伝達は、脊椎動物のシグナル伝達とは非常に異なって進化的であり、本発明者の知る限りでは、ヒスチジンからアスパラギン酸へのホスホリル転移の一例が脊椎動物の細胞では開示されていない。原核生物におけるＴＣＳシグナルトランスダクションの天然のメカニズムは、膜内のＨＫ二量体のリガンド誘導性コンフォメーション変化に依存しているが、哺乳類細胞におけるこのメカニズムの直接的な実施は捕まえにくい。代わりに、本明細書において本発明者らは、ＨＫ細胞質ドメインの解離状態と結合状態との間でのスイッチングを介するシグナル伝達を制御することにより、本質的に同じ最終結果を達成するための異なる戦略を追求した。本発明者らが本明細書に示すケースでは、ＨＫ ＮａｒＸの短縮型細胞質ドメインのヒスチジン及びアスパラギン変異体にそれぞれ融合されるタンパク質のリガンド誘導性二量体化によってスイッチングを達成した。変異体の代わりに野生型の短縮型ドメインを使用した場合にも、同様の定性的作用が観察される。しかしながら、定量的挙動は劣り、さらに重要なことに、結果として生じる作用は、ＳｙｎＺｉｐ１及びＧＰＣＲの場合のように、２つの相互作用パートナーのリガンド誘導性二量体化とパートナーのうちの１つのホモ二量体化の間を区別しない。ダイナミックレンジが低下する理由の１つは、ヒスチジン変異体と比較して、野生型ドメインのホスファターゼ活性がより強いことである可能性がある。
細胞、特に哺乳類細胞において天然でないシグナル伝達手法を実装することは、細胞の挙動を合理的に制御し、最終的には基礎研究、バイオテクノロジー、及び医学のための新規の細胞機能を操作するために非常に望ましい。二成分シグナル伝達は、脊椎動物のシグナル伝達とは非常に異なって進化的であり、本発明者の知る限りでは、ヒスチジンからアスパラギン酸へのホスホリル転移の一例が脊椎動物の細胞では開示されていない。原核生物におけるＴＣＳシグナルトランスダクションの天然のメカニズムは、膜内のＨＫ二量体のリガンド誘導性コンフォメーション変化に依存しているが、哺乳類細胞におけるこのメカニズムの直接的な実施は捕まえにくい。代わりに、本明細書において本発明者らは、ＨＫ細胞質ドメインの解離状態と結合状態との間でのスイッチングを介するシグナル伝達を制御することにより、本質的に同じ最終結果を達成するための異なる戦略を追求した。本発明者らが本明細書に示すケースでは、ＨＫ ＮａｒＸの短縮型細胞質ドメインのヒスチジン及びアスパラギン変異体にそれぞれ融合されるタンパク質のリガンド誘導性二量体化によってスイッチングを達成した。変異体の代わりに野生型の短縮型ドメインを使用した場合にも、同様の定性的作用が観察される。しかしながら、定量的挙動は劣り、さらに重要なことに、結果として生じる作用は、ＳｙｎＺｉｐ１及びＧＰＣＲの場合のように、２つの相互作用パートナーのリガンド誘導性二量体化とパートナーのうちの１つのホモ二量体化の間を区別しない。ダイナミックレンジが低下する理由の１つは、ヒスチジン変異体と比較して、野生型ドメインのホスファターゼ活性がより強いことである可能性がある。
このアプローチは、元の原核生物のシグナル伝達の特徴の多くを保持している。これは、応答制御因子ＮａｒＬの複数のコピーをリン酸化できる単一のＮａｒＸ二量体による増幅性の多重のターンオーバープロセスであり、よって複数の転写開始イベントを誘導することができる。本発明者らは、２段階の増幅により、タンパク質分解－切断に基づくアプローチと比較して、ダイナミックレンジが大幅に改善される結果となると推測している。さらに、刺激が撤回される場合、ＲＲの自発的な脱リン酸化によりシグナル伝達が停止し、これは、迅速なシグナル伝達の静止が必要な場合に、完全なホスファターゼ活性を保持する野生型ＨＫドメインの賢明な使用によって促進できる。ＴＣＳ経路の多様性を考えると、合成シグナル伝達経路の多重化は、上記の方法を使用することによって実現可能である。それと共に、結果は、細胞質内と膜全体の両方で、哺乳類細胞におけるセンシング及びシグナル伝達のための新規の手法を示している。
方法
当業者が利用可能な標準的な分子クローニング技術を用いた。
当業者が利用可能な標準的な分子クローニング技術を用いた。
プラスミドの構築
プラスミドは、標準的なクローニング技術を用いて構築した。今回使用した制限酵素はすべてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社から購入した。断片の増幅には、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用した。一本鎖のオリゴヌクレオチドはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社で合成した。消化産物又はＰＣＲ断片は、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ抽出キット又はＧｅｎ Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて精製した。ライゲーションは、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ社）を用いて、１０℃で３０秒～３０℃で３０秒の間で１４０サイクルの温度サイクルライゲーションによって行った。ギブソンアセンブリは以下の記載の方法で行った。ライゲーション産物又はギブソンアセンブリ産物５μｌを、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ添加したＬＢ寒天培地上に播種した化学的にコンピテントなＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α又はＥ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換した。得られたクローンは、コロニーＰＣＲ（Ｄｒｅａｍ Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で直接スクリーニングした。本発明者らは、アンピシリンを補充したＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｍｉｌｌｅｒ Ｄｉｆｃｏ（ＢＤ）で単一クローンを拡大し、ＧｅｎＥｌｕｔｅプラスミドミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用してそれらのプラスミドＤＮＡを精製した。得られたすべてのプラスミドは、サンガーシーケンシング法を使用してＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈによって配列検証した。哺乳類のトランスフェクション用のＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）プラスミドミディプレップシステム（Ａ２４９５）を使用して１００ｍｌの液体培養物から得た。回収したＤＮＡは、Ｎｏｒｇｅｎ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（カタログ番号２７７００）又はＭｉｄｉ（カタログ番号５２２００）を使用してさらに精製した。この作業で使用した各コンストラクトの簡単なクローニング手順を以下に説明する。
プラスミドは、標準的なクローニング技術を用いて構築した。今回使用した制限酵素はすべてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社から購入した。断片の増幅には、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用した。一本鎖のオリゴヌクレオチドはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社で合成した。消化産物又はＰＣＲ断片は、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ抽出キット又はＧｅｎ Ｅｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて精製した。ライゲーションは、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ社）を用いて、１０℃で３０秒～３０℃で３０秒の間で１４０サイクルの温度サイクルライゲーションによって行った。ギブソンアセンブリは以下の記載の方法で行った。ライゲーション産物又はギブソンアセンブリ産物５μｌを、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ添加したＬＢ寒天培地上に播種した化学的にコンピテントなＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α又はＥ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換した。得られたクローンは、コロニーＰＣＲ（Ｄｒｅａｍ Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で直接スクリーニングした。本発明者らは、アンピシリンを補充したＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｍｉｌｌｅｒ Ｄｉｆｃｏ（ＢＤ）で単一クローンを拡大し、ＧｅｎＥｌｕｔｅプラスミドミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用してそれらのプラスミドＤＮＡを精製した。得られたすべてのプラスミドは、サンガーシーケンシング法を使用してＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈによって配列検証した。哺乳類のトランスフェクション用のＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）プラスミドミディプレップシステム（Ａ２４９５）を使用して１００ｍｌの液体培養物から得た。回収したＤＮＡは、Ｎｏｒｇｅｎ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ Ｍｉｎｉ（カタログ番号２７７００）又はＭｉｄｉ（カタログ番号５２２００）を使用してさらに精製した。この作業で使用した各コンストラクトの簡単なクローニング手順を以下に説明する。
ギブソンアセンブリプロトコル
ギブソンアセンブリは、ベクター（０．０１８ｐｍｏｌ）及びインサート（０．０９ｐｍｏｌ）を、１×ギブソンアセンブリ緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０１Ｍ ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－８０００、１ｍＭ ＮＡＤ）、０．０４ユニットのＴ５エキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ社）、０．２５ユニットのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）、及び４０ユニットのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）において混合することによって、最終容積１０μｌにおいて実行した。ギブソンアセンブリの陰性対照には、ベクターのみを含んだ。ギブソンアセンブリは５０℃で１時間で達成した。
ギブソンアセンブリは、ベクター（０．０１８ｐｍｏｌ）及びインサート（０．０９ｐｍｏｌ）を、１×ギブソンアセンブリ緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０１Ｍ ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－８０００、１ｍＭ ＮＡＤ）、０．０４ユニットのＴ５エキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ社）、０．２５ユニットのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）、及び４０ユニットのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）において混合することによって、最終容積１０μｌにおいて実行した。ギブソンアセンブリの陰性対照には、ベクターのみを含んだ。ギブソンアセンブリは５０℃で１時間で達成した。
組換えＤＮＡクローニングプロトコル
ＯｍｐＲ＿ＲＥ－セルリアン（ｐＭＺ１）：ＥＦ１α－セルリアン（ｐＫＨ２４）からのｍセルリアンコーディング配列をＮｏｔＩ及びＳｍａＩで消化し、ＡｆｅＩ及びＰｓｐＯＭＩで消化したプラスミドＯｍｐＲ＿ＲＥ－ａｍＣｙａｎ（ｐＪＨ００８）にクローニングした。
ＯｍｐＲ＿ＲＥ－セルリアン（ｐＭＺ１）：ＥＦ１α－セルリアン（ｐＫＨ２４）からのｍセルリアンコーディング配列をＮｏｔＩ及びＳｍａＩで消化し、ＡｆｅＩ及びＰｓｐＯＭＩで消化したプラスミドＯｍｐＲ＿ＲＥ－ａｍＣｙａｎ（ｐＪＨ００８）にクローニングした。
ＣＭＶ－ｅｎｖＺ Ｎ３４７Ａ（ｐＭＺ３７）：ｅｎｖＺの５’及び３’断片を、プラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）からＰＲ３６８７／ＰＲ３７０８及びＰＲ３７０７／ＰＲ３７０９を用いてＰＣＲ増幅した。このプライマーは、３４７位のアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンをアラニン（Ａ）をコードするコドンに交換する変異を導入するように設計されている。ＸｈｏＩ及びＰｖｕＩＩで消化したプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）とＰＣＲ産物との両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ｅｎｖＺ２２３～４５０（ｐＭＺ１２３）：ｅｎｖＺの３’断片は、プラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ１）からＰＲ４３４５／ＰＲ４３４６を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、２４３位のリン酸化可能なヒスチジンをコードするコドンの上流の２０番目のコドンから遺伝子の終わりまでの配列を増幅し、この増幅された配列の前にＡＴＧ配列を挿入するように設計された。ＸｈｏＩとＡｇｅＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）とＰＣＲ産物とをギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）：ｎａｒＸの５’及び３’断片は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ（ｐＪＨ００２）からＰＲ４１２２／ＰＲ４５４１及びＰＲ４３４６／ＰＲ４５４２を用いてＰＣＲ増幅した。このプライマーは、５０９位のアスパラギン（Ｎ）をコードするコドンをアラニン（Ａ）をコードするコドンに交換する変異を導入するように設計されていた。ＸｈｏＩとＡｇｅＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）とＰＣＲ産物との両方は、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ１６３）：ｎａｒＸの３’断片は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ（ｐＪＨ００２）からＰＲ４３４５／ＰＲ４５４６を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、３９９位のリン酸化可能なヒスチジンをコードするコドンの上流の２０番目のコドンから遺伝子の終わりまでの配列を増幅し、この増幅された配列の前にＡＴＧ配列を挿入するように設計された。ＸｈｏＩとＡｇｅＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）とＰＣＲ産物とを、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）：ＥＦ１αの短縮バージョンとしてのＥＦ１α－Ｖ１は、プラスミドｐＲＡ１１４からＰＲ４７３３／ＰＲ４７３４でＰＣＲ増幅した（Ａｌｔａｍｕｒａら、原稿準備中）。ＰｓｐＯＭＩとＡｇｅＩとで消化されたとプラスミドＥｎｖＺ－ＧＧＧＧＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＥＭ０１７）及びプロモーターは、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ１：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２００）：本発明者らは、ＩＤＴを介してＳｙｎＺｉｐ１及びＧ４ＳリンカーをコードするｇＢｌｏｃｋ配列のデノボ合成を行った（ｇＢｌｏｃｋ２６４）。ＮａｒＸ３７９～５９８のコーディング配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ１７６～５９８（ＪＨ０１０）からＰＲ４３４６／ＰＲ４７４７を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）、ｇＢｌｏｃｋ、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ｎａｒＸ３７９～５９８：：ＳｙｎＺｉｐ１（ｐＭＺ２０２）：本発明者らは、ＩＤＴを介してＧ４Ｓリンカー及びＳｙｎＺｉｐ１をコードするｇＢｌｏｃｋ配列のデノボ合成を行った（ｇＢｌｏｃｋ２６５）。ＮａｒＸ３７９～５９８のコーディング配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ１６３）からＰＲ４１２２／ＰＲ４７４７を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）、ｇＢｌｏｃｋ、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２０６）：本発明者らは、ＩＤＴを介してＳｙｎＺｉｐ２及びＧ４ＳリンカーをコードするｇＢｌｏｃｋ配列のデノボ合成を行った（ｇＢｌｏｃｋ２６９）。ＮａｒＸ３７９～５９８のコーディング配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ１７６～５９８（ＪＨ０１０）からＰＲ４３４６／ＰＲ４７４７を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）、ｇＢｌｏｃｋ、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ｎａｒＸ３７９～５９８：：ＳｙｎＺｉｐ１（ｐＭＺ２０８）：本発明者らは、ＩＤＴを介してＧ４Ｓリンカー及びＳｙｎＺｉｐ１をコードするｇＢｌｏｃｋ配列のデノボ合成を行った（ｇＢｌｏｃｋ２７０）。ＮａｒＸ３７９～５９８のコーディング配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ１６３）からＰＲ４１２２／ＰＲ４７４８を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）、ｇＢｌｏｃｋ、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ：：ＣＢＲＣ（ｐＭＺ２１１）：ＣＢＲＣを有するＦＲＢの３’断片及びＦＲＢの５’断片を、プラスミドＦＲＢ：：ＣＢＲＣからＰＲ４１２２／ＰＲ４５４１及びＰＲ４３４６／ＰＲ４５４２を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、（完全なタンパク質セリン／スレオニン－タンパク質キナーゼＴＯＲ１と比較して）両方の９８位のスレオニン（Ｔ）をコードするコドンをロイシン（Ｌ）をコードするコドンに交換する変異を導入するように設計された。ＢａｍＨＩ及びＡｇｅＩで消化されたプラスミドＦＲＢ：：ＣＢＲＣ、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ＦＫＢＰ：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２１４）：ＦＫＢＰをコードする配列を、プラスミドＣＢＲＮ：：ＦＫＢＰからＰＲ４７６６／ＰＲ４７６７を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８のコーディング配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ１７６～５９８（ｐＪＨ０１０）からＰＲ４３４６／ＰＲ４７７１を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、増幅された断片の間に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを挿入するように設計された。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）、及びＰＣＲ産物の両方は、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２１５）：ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＦＲＢ：：ＣＢＲＣ（ｐＭＺ２１１）からＰＲ４７６９／ＰＲ４７７０を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８のコーディング配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ１７６～５９８（ｐＪＨ０１０）からＰＲ４３４６／ＰＲ４７７１を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、増幅された断片の間に（Ｇ４Ｓ）２リンカーを挿入するように設計された。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＮａｒＬ＿ＲＥ－セルリアン（ｐＭＺ２１９）：最小応答要素ＮａｒＬ＿ＲＥは、プライマーＰＲ４８９２及びＰＲ４８９３をアニーリングすることによって形成した。ＡｓｃＩとＮｄｅＩとで消化されたプラスミドＯｍｐＲ＿ＲＥ－セルリアン（ｐＭＺ１）、及びアニーリングされた産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＳｙｎＺｉｐ１：：ｎａｒＸ３７９ｔ～５９８（ｐＭＺ２２１）：ＳｙｎＺｉｐ１、Ｇ４Ｓリンカー及びＮａｒＸ３７９～３８３をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ１：：ＮａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２００）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７１を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＳｙｎＺｉｐ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２２２）：ＳｙｎＺｉｐ２、Ｇ４Ｓリンカー及びＮａｒＸ３７９～３８３をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２０６）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７１を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＳｙｎＺｉｐ１：：ｎａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２２３）：ＳｙｎＺｉｐ１及びＧ４Ｓリンカーをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ１：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２００）からＰＲ４９７１／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＳｙｎＺｉｐ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２２４）：ＳｙｎＺｉｐ２及びＧ４Ｓリンカーをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２０６）からＰＲ４９７１／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＳｙｎＺｉｐ１：：ｎａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２２５）：ＳｙｎＺｉｐ１をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ１：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２００）からＰＲ４９７１／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＳｙｎＺｉｐ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２２６）：ＳｙｎＺｉｐ２をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＳｙｎＺｉｐ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２０６）からＰＲ４９７１／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８Ｎ５０９Ａをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＦＫＢＰ：：ｎａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑ （ｐＭＺ２２９）：ＦＫＢＰ及び（Ｇ４Ｓ）２リンカーをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＦＫＢＰ：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２１４）からＰＲ４９７４／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ：：ｎａｒＸ３７９～５９８Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２３０）：ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ及び（Ｇ４Ｓ）２リンカーをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２１５）からＰＲ４９７５／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＦＫＢＰ：：ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２３１）：ＦＫＢＰ及び（Ｇ４Ｓ）２リンカーをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＦＫＢＰ：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２１４）からＰＲ４９７４／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ：：ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２３２）：ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ及び（Ｇ４Ｓ）２リンカーをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌ：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２１５）からＰＲ４９７５／ＰＲ４９７３を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７２を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｎａｒＸ（ｐＭＺ２３９）：ＮａｒＸをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ（ｐＪＨ００２）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７９を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｎａｒＸ３７９～５９８ （ｐＭＺ２４１）： ｎａｒＸの３ ’断片は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ（ｐＪＨ００２）のＰＲ４９７７／ＰＲ３６８７でＰＣＲ増幅した。プライマーは、３９９位のリン酸化可能なヒスチジンをコードするコドンの上流の２０番目のコドンから遺伝子の終わりまでの配列を増幅し、この増幅された配列の前にＡＴＧ配列を挿入するように設計された。ＰＣＲ産物、及びＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）は、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２４２）：ＮａｒＸをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７９を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２４４）：ｎａｒＸの３’断片は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ４９７７／ＰＲ３６８７を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、３９９位のリン酸化可能なヒスチジンをコードするコドンの上流の２０番目のコドンから遺伝子の終わりまでの配列を増幅し、この増幅された配列の前にＡＴＧ配列を挿入するように設計された。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２４５）：ＮａｒＸをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９７９を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化したプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２４７）：ｎａｒＸの３’断片は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ４９７７／ＰＲ３６８７を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、３９９位のリン酸化可能なヒスチジンをコードするコドンの上流の２０番目のコドンから遺伝子の終わりまでの配列を増幅し、この増幅された配列の前にＡＴＧ配列を挿入するように設計された。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化したプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－ｎａｒＬ（ｐＭＺ２４８）：ＥＦ１αプロモーターはプラスミドｐＲＡ５８からＰＲ４７３２／ＰＲ４９７８を用いてＰＣＲ増幅した（Ａｌｔａｍｕｒａらｌ、原稿準備中）。ＰｓｐＯＭＩとＡｇｅＩで消化したプラスミドＣＭＶ－ｎａｒＬ（ｐＪＨ００４）及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ｎａｒＬ（ｐＭＺ２４９）：ＥＦ１αプロモーターはプラスミドｐＲＡ１１４からのＰＲ４７３４／ＰＲ４９７８でＰＣＲ増幅した（Ａｌｔａｍｕｒａらｌ、原稿準備中）。ＰｓｐＯＭＩとＡｇｅＩで消化したプラスミドＣＭＶ－ｎａｒＬ（ｐＪＨ００４）及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＡＲＲＢ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２５０）：ＡＲＲＢ２をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＡＲＲＢ２：：ＴＥＶプロテアーゼ（ｐＢＨ３０２）からＰＲ４９８０／ＰＲ４９８１を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ（ｐＪＨ２）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９８２を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、増幅された断片の間にＧ４Ｓリンカーを挿入するように設計した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたＥＦ１－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（ｐＭＺ１９４）及びＰＣＲ産物の両方、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＡＲＲＢ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２５１）：ＡＲＲＢ２をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＡＲＲＢ２：：ＴＥＶプロテアーゼ（ｐＢＨ３０２）からＰＲ４９８０／ＰＲ４９８１を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９８２を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、増幅された断片の間にＧ４Ｓリンカーを挿入するように設計した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＡＲＲＢ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２５２）：ＡＲＲＢ２をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＡＲＲＢ２：：ＴＥＶプロテアーゼ（ｐＢＨ３０２）からＰＲ４９８０／ＰＲ４９８１を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９８２を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、増幅された断片の間にＧ４Ｓリンカーを挿入するように設計した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２５７）：ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｔＴＡ（ｐＢＨ３１２）からＰＲ４９８３／ＰＲ４９８５を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９８２を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、増幅された断片の間にＧ４Ｓリンカーを挿入するように設計した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ２５８）：ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１をコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｔＴＡ（ｐＢＨ３１２）からＰＲ４９８３／ＰＲ４９８５を用いてＰＣＲ増幅した。ＮａｒＸ３７９～５９８ Ｎ５０９Ａをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｎ５０９Ａ（ｐＭＺ１６０）からＰＲ３６８７／ＰＲ４９８２を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、増幅された断片の間にＧ４Ｓリンカーを挿入するように設計した。ＡｇｅＩとＸｈｏＩとで消化されたプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ｅｎｖＺ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＭＺ１９４）及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ｔＴＡ＿ＲＥ－セルリアン（ｐＭＺ２９０）：ｔＴＡによって制御されるプロモーターは、プラスミドｔＴＡ＿ＲＥ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＩＭ００３）からＰＲ５２２６／ＰＲ５２２７を用いてＰＣＲ増幅した。ＡｓｃＩ及びＡｇｅＩで消化されたプラスミドＤｃｕＲ＿ＲＥ－セルリアン（ｐＭＺ２５９）及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＡＲＲＢ２：：ＴＥＶプロテアーゼ（ｐＭＺ２９１）：ＡＲＲＢ２２８３～４０９及びＴＥＶプロテアーゼをコードする配列は、プラスミドＣＭＶ－ＡＲＲＢ２：：ＴＥＶプロテアーゼ（ｐＢＨ３０２）からＰＲ５２２８／ＰＲ５２２９を用いてＰＣＲ増幅した。ｂＧＨ ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルの配列は、プラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ＡＲＲＢ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２５０）からＰＲ５２３０／ＰＲ５２３１を用いてＰＣＲ増幅した。ＢｓａＩとＡｖｒＩＩとで消化されたプラスミドＥＦ１－Ｖ１－ＡＲＲＢ２：：ｎａｒＸ３７９～５９８（ｐＭＺ２５０）及びＰＣＲ産物の両方を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α：：ｉＲＦＰ（ｐＣＳ１８４）：ＣＭＶ－ｉＲＦＰ（ｐＣＳ１２）のｉＲＦＰコーディング配列をＰＲ２２５８／ＰＲ２２５９を用いてＰＣＲ増幅した。ＢｍｔＩとＸｂａＩとで消化したプラスミドＥＦ１α：：ｃｉｔｒｉｎｅ（ｐＲＡ００１、Ａｌｔａｍｕｒａら、原稿準備中）及びＰＣＲ産物を、ライゲーションミックスを使用してアセンブルした。
ＥＦ１α－Ｖ１－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｔＴＡ（ｐＢＨ２９２）：ＡＤＲＢ２２５４～３４１ ＡＶＰＲ２３４３～３７１及びｔＴＡをコードする配列を、プラスミドＣＭＶ－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｔＴＡ（ｐＢＨ３１２）からＰＲ５２３２／ＰＲ５２３３を用いてＰＣＲ増幅した。ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩとで消化したプラスミドＥＦ１α－Ｖ１－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｎａｒＸ３７９～５９８ Ｈ３９９Ｑ（ｐＭＺ２５７）及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを用いてアセンブルした。
ＣＭＶ－ＡＲＲＢ２：：ＴＥＶプロテアーゼ（ｐＢＨ３０２）：本発明者らは、２つのｇＢｌｏｃｋ（ｇＢｌｏｃｋ１１２及びｇＢｌｏｃｋ１１３）を有するＴＥＶプロテアーゼと融合したβ－アレスチン－２をコードするｇＢｌｏｃｋ配列のＩＤＴを介するデノボ合成を行った。ＮｏｔＩとＥｃｏＲＩとで消化したプラスミドｐＺｓＹｅｌｌｏｗ１－Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６３２４４５）及び該ｇＢｌｏｃｋを、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ＯＰＲＫ１１～３４５：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｔＴＡ（ｐＢＨ３０９）：本発明者らは、ＩＤＴを介して、ＫＯＲ－１をコードするｇＢｌｏｃｋ（ｇＢｌｏｃｋ１１４）配列と、ｔＴＡに融合したＶ２ＲをコードするｇＢｌｏｃｋ（ｇＢｌｏｃｋ１１５）配列とをデノボ合成した。ＫＯＲ－１１～３４５をコードする配列を、ｇＢｌｏｃｋ１１４からＰＲ２４４２／ＰＲ２４４３を用いてＰＣＲ増幅した。ＸｈｏＩとＭｆｅＩとで消化したプラスミドｐＺｓＹｅｌｌｏｗ１－Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ６３２４４５）、ＰＣＲ産物及びｇＢｌｏｃｋ１１５を、ギブソンミックスを使用してアセンブルした。
ＣＭＶ－ＡＤＲＢ２１～３４１：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｔＴＡ（ｐＢＨ３１２）：ＩＤＴを介して、本発明者らは、ベータ－２アドレナリン受容体をコードするｇＢｌｏｃｋ（ｇＢｌｏｃｋ１１８）配列のデノボ合成を行った。ＡＤＲＢ２１～３４１をコードする配列を、ｇＢｌｏｃｋ１１８からＰＲ２４４２／ＰＲ２４４４を用いてＰＣＲ増幅した。ＸｈｏＩとＢｓｓＨＩＩとで消化したプラスミドＣＭＶ－ＯＰＲＫ１１～３４５：：ＡＶＰＲ２３４３～３７１：：ｔＴＡ（ｐＢＨ３０９）、及びＰＣＲ産物を、ギブソンミックスを用いてアセンブルした。
ＣＭＶ－ｎａｒＸ１７６～５９８（ｐＪＨ０１０）：ｎａｒＸの３’断片は、ＣＭＶ－ｎａｒＸ（ｐＪＨ００２）からＰＲ１０２１／ＰＲ１０２３を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーは、１７６位のアラニンをコードするコドンから該遺伝子の末端までのＮａｒＸの配列を増幅し、この増幅された配列の前にＡＴＧ配列を挿入するように設計した。ＰＣＲ産物及びＣＭＶ－ｎａｒＸ（ｐＪＨ００２）をＸｈｏＩとＡｇｅＩとで消化した。次いで、この２つの消化産物は一緒にライゲーションした。
以下のプラスミドは以前から報告されていた：ＣＭＶ－ｅｎｖＺ（ｐＪＨ００１）、ＣＭＶ－ｎａｒＸ （ｐＪＨ００２）、ＣＭＶ－ｏｍｐＲ（ｐＪＨ００３）、ＣＭＶ－ｎａｒＬ（ｐＪＨ００４）、ＯｍｐＲ＿ＲＥ－ＡｍＣｙａｎ（ｐＪＨ００８）、ＣＭＶ－ｅｎｖＺ＿ｃｙｔ（ｐＪＨ００９）、ＣＭＶ－ｅｎｖＺ Ｈ２４３Ｖ（ｐＥＭ０１３）、ＣＭＶ－ｎａｒＸ Ｈ３９９Ｑ（ｐＥＭ０１４）及びＥｎｖＺ－ＧＧＧＧＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＥＭ０１７）（Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１１，１５７０５－１５７１０（２０１４））。ＣＢＲＮ：：ＦＫＢＰ、及びＦＲＢ：：ＣＢＲＣ（Ｓｃｈｒａｍｍ，Ａ．ら，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １９（２０１８））。Ｅｆ１α－ｍセルリアン（ｐＫＨ０２４）、Ｅｆ１α－シトリン（ｐＫＨ０２５）Ｅｆ１α－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＫＨ０２６）、及びＪｕｎｋ－ＤＮＡ（ｐＢＨ２６５）（Ｐｒｏｃｈａｚｋａ，ら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，４７２９（２０１４））。ｐＴＲＥ双方向性ｍＣｈｅｒｒｙ－ｐＡ（ｐＩＭ００３）（Ａｎｇｅｌｉｃｉ，Ｂ．，ら，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １６，２５２５－２５３７（２０１６））。プラスミドＣＭＶ－ｉＲＦＰ（ｐＣＳ１２）は、Ａｄｄｇｅｎｅ社から入手した（プラスミド３１８５７（Ｆｉｌｏｎｏｖ，Ｇ．Ｓ．ら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ５１，１４４８－１４５１（２０１２）））。
細胞培養
本研究の実験は、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入したＨＥＫ２９３において実行した（カタログ番号１１６３１～０１７）。細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｆ９６６５）及び１％ペニシリン／ストレプトガミン溶液（Ｓｉｇｍａ－ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ４３３３）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号４１９６６～０５２）中で５％のＣＯ２にて３７℃で培養した。分割は、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２５２００～０７２）を使用して３～４日ごとに実行した。培養物は最大２ヶ月間増殖させた後、新たな細胞ストックに交換した。
本研究の実験は、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入したＨＥＫ２９３において実行した（カタログ番号１１６３１～０１７）。細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｆ９６６５）及び１％ペニシリン／ストレプトガミン溶液（Ｓｉｇｍａ－ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ４３３３）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号４１９６６～０５２）中で５％のＣＯ２にて３７℃で培養した。分割は、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２５２００～０７２）を使用して３～４日ごとに実行した。培養物は最大２ヶ月間増殖させた後、新たな細胞ストックに交換した。
トランスフェクション
すべてのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１１６６８０２７）を使用して実施した。すべてのトランスフェクションは２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｕｎｃ；ＮＣ－１４２４７５）で行い、４００ｎｇのＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に、５００μｌのＤＭＥＭにウェルあたり５００００個の密度で細胞を播種した。各試料のプラスミドは、補足表３～１８に示すとおり混合し、最終容量を５０μｌにするために、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ還元血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号３１９８５～９６２）の容量を用いて完成させた。１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を試料あたり５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉで希釈し、最終容量を３．７５：１のμｌ 試薬／μｇ ＤＮＡの比にした。少なくとも５分間のインキュベーション後、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを混合したＤＮＡ試料に添加した。得られた混合物を穏やかにボルテックスすることにより簡単に混合し、細胞に添加する前に室温で２０分間インキュベートした。ＤＮＡを細胞に添加した４時間後、培地を取り除き、５００μｌの新しい培地と交換した。必要に応じて、試験される化学物質５μｌを培地に添加した。以下に示すとおり、所望の最終濃度の１００倍の異なるストック溶液を調製した。
すべてのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１１６６８０２７）を使用して実施した。すべてのトランスフェクションは２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｕｎｃ；ＮＣ－１４２４７５）で行い、４００ｎｇのＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に、５００μｌのＤＭＥＭにウェルあたり５００００個の密度で細胞を播種した。各試料のプラスミドは、補足表３～１８に示すとおり混合し、最終容量を５０μｌにするために、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ還元血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号３１９８５～９６２）の容量を用いて完成させた。１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を試料あたり５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉで希釈し、最終容量を３．７５：１のμｌ 試薬／μｇ ＤＮＡの比にした。少なくとも５分間のインキュベーション後、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを混合したＤＮＡ試料に添加した。得られた混合物を穏やかにボルテックスすることにより簡単に混合し、細胞に添加する前に室温で２０分間インキュベートした。ＤＮＡを細胞に添加した４時間後、培地を取り除き、５００μｌの新しい培地と交換した。必要に応じて、試験される化学物質５μｌを培地に添加した。以下に示すとおり、所望の最終濃度の１００倍の異なるストック溶液を調製した。
Ａ／Ｃヘテロ二量体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ番号６３５０５７）ストック溶液をエタノール（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ；カタログ番号０２８６０）で調製した：２５０μＭ、５０μＭ、２０μＭ、８μＭ、３．２μＭ、１．２８μＭ、５１２ｎＭ、２０５ｎＭ、８１．９ｎＭ、３２．８ｎＭ、１３．１ｎＭ、５．２４ｎＭ、１．０４ｎＭ。
プロカテロール（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｐ９１８０～１０ＭＧ）ストック溶液をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｄ４５４０、ＢＣＢＴ０８０３）で調製した：１ｍＭ、２８６μＭ、８１．６μＭ、２３．３μＭ、１０μＭ、６．６μＭ、１．９μＭ、５４４ｎＭ、１５５ｎＭ、４４．４ｎＭ、及び１２．７ｎＭ。
イソプロテレノール（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｉ６５０４）ストック溶液をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｄ４５４０）で調製した：１ｍＭ、２８６μＭ、８１．６μＭ、２３．３μＭ、６．６μＭ、１．９μＭ、５４４ｎＭ、１５５ｎＭ、４４．４ｎＭ、及び１２．７ｎＭ。
クレンブテロール（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ５４２３）ストック溶液をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｄ４５４０）で調製した：１ｍＭ、２８６μＭ、８１．６μＭ、２３．３μＭ、６．６μＭ、１．９μＭ、５４４ｎＭ、１５５ｎＭ、４４．４ｎＭ、及び１２．７ｎＭ。
プロプラノロール（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｐ０８８４）ストック溶液を水で調製した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１０９７７－０３５）：１ｍＭ、２８６μＭ、８１．６μＭ、２３．３μＭ、６．６μＭ、１．９μＭ、５４４ｎＭ、１５５ｎＭ、４４．４ｎＭ、及び１２．７ｎＭ。
顕微鏡検査
顕微鏡画像はトランスフェクションの４８時間後に撮影した。本発明者らは、画像取得時に３７℃に保持される機械化されたステージ及び温度制御チャンバーを備えた株式会社ニコンのエクリプスＴｉ顕微鏡を使用した。励起光は、株式会社ニコンのＩｎｔｅｎｓｉＬｉｇｈｔ Ｃ－ＨＧＦＩ水銀ランプによって生成され、最適化されたＳｅｍｒｏｃｋフィルターキューブのセットでフィルター処理した。得られた画像は、１０倍の対物レンズを使用して浜松ホトニクス株式会社のＯＲＣＡ Ｒ２カメラによって収集した。各Ｓｅｍｒｏｃｋキューブは、励起フィルター、ダイクロイックミラー、及び発光フィルターから組み立てられている。異なる蛍光タンパク質間のクロストークを最小限に抑えるために、本発明者らは以下の設定を使用した：セルリアン；ＣＦＰ ＨＣ（ＨＣ４３８／２４、ＢＳ４５８、ＨＣ４８３／３２）、ｍＣｈｅｒｒｙ；ＴｘＲｅｄ ＨＣ（ＨＣ６２４／４０、ＢＳ５９３、ＨＣ５６２／４０）。画像は、セルリアンとｍＣｈｅｒｒｙとの４０ミリ秒の露光で取得した。取得した画像は、可視化を向上させるために均一なコントラスト強調を実行するＩｍａｇｅＪソフトウェアによって処理した。
顕微鏡画像はトランスフェクションの４８時間後に撮影した。本発明者らは、画像取得時に３７℃に保持される機械化されたステージ及び温度制御チャンバーを備えた株式会社ニコンのエクリプスＴｉ顕微鏡を使用した。励起光は、株式会社ニコンのＩｎｔｅｎｓｉＬｉｇｈｔ Ｃ－ＨＧＦＩ水銀ランプによって生成され、最適化されたＳｅｍｒｏｃｋフィルターキューブのセットでフィルター処理した。得られた画像は、１０倍の対物レンズを使用して浜松ホトニクス株式会社のＯＲＣＡ Ｒ２カメラによって収集した。各Ｓｅｍｒｏｃｋキューブは、励起フィルター、ダイクロイックミラー、及び発光フィルターから組み立てられている。異なる蛍光タンパク質間のクロストークを最小限に抑えるために、本発明者らは以下の設定を使用した：セルリアン；ＣＦＰ ＨＣ（ＨＣ４３８／２４、ＢＳ４５８、ＨＣ４８３／３２）、ｍＣｈｅｒｒｙ；ＴｘＲｅｄ ＨＣ（ＨＣ６２４／４０、ＢＳ５９３、ＨＣ５６２／４０）。画像は、セルリアンとｍＣｈｅｒｒｙとの４０ミリ秒の露光で取得した。取得した画像は、可視化を向上させるために均一なコントラスト強調を実行するＩｍａｇｅＪソフトウェアによって処理した。
フローサイトメトリー
トランスフェクションの４８時間後、培地を除去し、細胞を２００μｌのＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１０５～０１）を用いて３７°Ｃで５分間インキュベートすることにより、ＦＡＣＳ分析用に細胞を調製した。インキュベーションの後、プレートを氷上に移した。可能な細胞損傷を回避するために、試料を連続したバッチで調製し、単一試料が１時間を超えて氷上に保持されないようにした。異なる蛍光レポーター間のクロストークを最小限に抑える励起と発光との組み合わせでＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＩＩセルアナライザーを使用して調製した試料を測定した。セルリアンは４４５ｎｍレーザー及び４７３／１０ｎｍ発光フィルターで測定し、ｍＣｈｅｒｒｙは６００ｎｍロングパスフィルターと６１０／２０発光フィルターを合わせた５６１ｎｍ励起レーザーで測定した。セルリアン及びｍＣｈｅｒｒｙは、それぞれ、すべての実験でＰＭＴ電圧３３０及び３１０で測定した。ＳＰＨＥＲＯ ＲａｉｎＢｏｗキャリブレーション粒子（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＲＣＰ－３０－５Ａ、ＢＤ）を使用して、一定のデバイス性能を確認した。
トランスフェクションの４８時間後、培地を除去し、細胞を２００μｌのＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１０５～０１）を用いて３７°Ｃで５分間インキュベートすることにより、ＦＡＣＳ分析用に細胞を調製した。インキュベーションの後、プレートを氷上に移した。可能な細胞損傷を回避するために、試料を連続したバッチで調製し、単一試料が１時間を超えて氷上に保持されないようにした。異なる蛍光レポーター間のクロストークを最小限に抑える励起と発光との組み合わせでＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＩＩセルアナライザーを使用して調製した試料を測定した。セルリアンは４４５ｎｍレーザー及び４７３／１０ｎｍ発光フィルターで測定し、ｍＣｈｅｒｒｙは６００ｎｍロングパスフィルターと６１０／２０発光フィルターを合わせた５６１ｎｍ励起レーザーで測定した。セルリアン及びｍＣｈｅｒｒｙは、それぞれ、すべての実験でＰＭＴ電圧３３０及び３１０で測定した。ＳＰＨＥＲＯ ＲａｉｎＢｏｗキャリブレーション粒子（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＲＣＰ－３０－５Ａ、ＢＤ）を使用して、一定のデバイス性能を確認した。
データ分析
一般的な棒グラフのフローサイトメトリーデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実行した。この研究では、正規化された発現単位（セルリアン、基準単位）として示されるとおり、棒グラフの蛍光値は以下のように計算される。生細胞は、前方及び側方散乱の読み取り値に基づいてゲートされる。この集団から、単一細胞が、前方散乱領域及び前方散乱高さに基づいてゲートされる。このゲート内で、セルリアン陽性の細胞は、この対照試料の細胞の９９．９％が選択されたゲートの外に落ちるように、陰性対照に基づいてゲートされる。各セルリアン陽性細胞について、蛍光強度の平均値を計算し、陽性細胞の頻度を乗じる。この値は、試料内の総レポーターシグナルの測定値として使用され、総強度（ＴＩ）と定義できる。セルリアンのＴＩは、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のＴＩによって正規化される（構成的トランスフェクション対照）。したがって、相対式は次のとおりである：基準単位のレポーター強度＝［平均（レポーター＋細胞中のレポーター）×頻度（レポーター＋細胞）］／［平均（トランスフェクションマーカー＋細胞中のトランスフェクションマーカー）×頻度（トランスフェクションマーカー＋細胞）］。
一般的な棒グラフのフローサイトメトリーデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して実行した。この研究では、正規化された発現単位（セルリアン、基準単位）として示されるとおり、棒グラフの蛍光値は以下のように計算される。生細胞は、前方及び側方散乱の読み取り値に基づいてゲートされる。この集団から、単一細胞が、前方散乱領域及び前方散乱高さに基づいてゲートされる。このゲート内で、セルリアン陽性の細胞は、この対照試料の細胞の９９．９％が選択されたゲートの外に落ちるように、陰性対照に基づいてゲートされる。各セルリアン陽性細胞について、蛍光強度の平均値を計算し、陽性細胞の頻度を乗じる。この値は、試料内の総レポーターシグナルの測定値として使用され、総強度（ＴＩ）と定義できる。セルリアンのＴＩは、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のＴＩによって正規化される（構成的トランスフェクション対照）。したがって、相対式は次のとおりである：基準単位のレポーター強度＝［平均（レポーター＋細胞中のレポーター）×頻度（レポーター＋細胞）］／［平均（トランスフェクションマーカー＋細胞中のトランスフェクションマーカー）×頻度（トランスフェクションマーカー＋細胞）］。
配列
以下の配列が、テキスト形式で本明細書と共に提出された配列プロトコルと異なる場合は、以下の配列が優先される。
以下の配列が、テキスト形式で本明細書と共に提出された配列プロトコルと異なる場合は、以下の配列が優先される。
合成プロモーターの配列を以下の表に示す（下線はＲＲ ＤＮＡ結合部位を示し、斜体文字はＴＡＴＡボックスを示す。開始コドンは太字で示す）。
プロモーター ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＥＦ１α－Ｖ１の配列
＞ＣＭＶプロモーター（配列番号３）
ｇｃｇｔｔｇａｃａｔｔｇａｔｔａｔｔｇａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔｃｔｃｔｇｇｃｔａａｃｔ
＞ＣＭＶプロモーター（配列番号３）
ｇｃｇｔｔｇａｃａｔｔｇａｔｔａｔｔｇａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔｃｔｃｔｇｇｃｔａａｃｔ
＞ＥＦ１α（配列番号４）
ＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡ
ＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡ
＞ＥＦ１α－Ｖ１（配列番号５）
ｔｔａａｇｃｔｃｇｇｇｃｃｃＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＣＧＴＣＴＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＴＣＴＡＧＣＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＴＴＡＡＣＴＡＧＣＡＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＧＴＴＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＡＴＴＡＡＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＧＧＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＡＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧＧＣＧＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡａ
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ｎａｒＬの配列：
＞ＮａｒＬ（配列番号６）
ＭＳＮＱＥＰＡＴＩＬＬＩＤＤＨＰＭＬＲＴＧＶＫＱＬＩＳＭＡＰＤＩＴＶＶＧＥＡＳＮＧＥＱＧＩＥＬＡＥＳＬＤＰＤＬＩＬＬＤＬＮＭＰＧＭＮＧＬＥＴＬＤＫＬＲＥＫＳＬＳＧＲＩＶＶＦＳＶＳＮＨＥＥＤＶＶＴＡＬＫＲＧＡＤＧＹＬＬＫＤＭＥＰＥＤＬＬＫＡＬＨＱＡＡＡＧＥＭＶＬＳＥＡＬＴＰＶＬＡＡＳＬＲＡＮＲＡＴＴＥＲＤＶＮＱＬＴＰＲＥＲＤＩＬＫＬＩＡＱＧＬＰＮＫＭＩＡＲＲＬＤＩＴＥＳＴＶＫＶＨＶＫＨＭＬＫＫＭＫＬＫＳＲＶＥＡＡＶＷＶＨＱＥＲＩＦ
＞ＮａｒＬ（配列番号６）
ＭＳＮＱＥＰＡＴＩＬＬＩＤＤＨＰＭＬＲＴＧＶＫＱＬＩＳＭＡＰＤＩＴＶＶＧＥＡＳＮＧＥＱＧＩＥＬＡＥＳＬＤＰＤＬＩＬＬＤＬＮＭＰＧＭＮＧＬＥＴＬＤＫＬＲＥＫＳＬＳＧＲＩＶＶＦＳＶＳＮＨＥＥＤＶＶＴＡＬＫＲＧＡＤＧＹＬＬＫＤＭＥＰＥＤＬＬＫＡＬＨＱＡＡＡＧＥＭＶＬＳＥＡＬＴＰＶＬＡＡＳＬＲＡＮＲＡＴＴＥＲＤＶＮＱＬＴＰＲＥＲＤＩＬＫＬＩＡＱＧＬＰＮＫＭＩＡＲＲＬＤＩＴＥＳＴＶＫＶＨＶＫＨＭＬＫＫＭＫＬＫＳＲＶＥＡＡＶＷＶＨＱＥＲＩＦ
ＶＰ４８の配列
＞ＶＰ４８（配列番号７）
ＧＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＰＧ
＞ＶＰ４８（配列番号７）
ＧＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＰＡＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＰＧ
ＥｎｖＺ１８０～４５０、ＥｎｖＺ２２３～４５０、ＮａｒＸ１７６～５９８、及びＮａｒＸ３７９～５９８のａａ配列は以下に示す。リン酸化可能なヒスチジンは下線斜体で示し、ＡＴＰ結合ドメインに重要なアスパラギンは太字下線で示す。
ＮａｒＸ３７９～５９８の変異型バージョンのａａでは、変異型のａａを太字下線で示す。
Claims (28)
- 細胞、特に哺乳類細胞、より特にヒト細胞であって、
－ ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
－ ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
－ 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、
を含む、
前記細胞。 - 前記第１の変異型及び／又は前記第２の変異型は、前記ヒスチジンキナーゼの膜貫通ドメインを含まない、請求項１に記載の細胞。
- － 前記第１の変異型は、前記ヒスチジンキナーゼの機能的伝達ドメイン及び／又は機能的センサードメインを含まない、及び／又は
－ 前記第２の変異型は、前記ヒスチジンキナーゼの機能的伝達ドメイン及び／又は機能的センサードメインを含まない、
請求項１又は２に記載の細胞。 - 前記応答制御タンパク質は、エフェクタードメインに融合したレシーバードメインを含み、前記レシーバードメインは、前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによってリン酸化可能であり、かつ前記エフェクタードメインは、リン酸化されたレシーバードメインによって活性化可能であるか、又は阻害可能である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞。
- － 前記エフェクタードメインは、転写活性化ドメインであり、
－ 前記細胞は、前記転写活性化ドメインによって認識可能である誘導性プロモーターの制御下の目的の遺伝子を含む第４の核酸を含み、
前記転写活性化ドメインの活性化により、前記目的の遺伝子の発現が誘導される、
請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記目的の遺伝子は、目的のタンパク質又は目的のＲＮＡをコードし、特に前記目的のタンパク質は、発光タンパク質である、請求項５に記載の細胞。
- － 前記第１及び前記第２の変異型は、ＥｎｖＺキナーゼの変異型であり、前記応答制御タンパク質は、ＯｍｐＲ応答制御タンパク質を含むか、又はそれである、又は
－ 前記第１及び前記第２の変異型は、ＮａｒＸキナーゼの変異型であり、前記レシーバードメインは、ＮａｒＬ応答制御タンパク質（配列番号６）を含むか、又はそれであり、かつ前記エフェクタードメインは、ＶＰ１６転写活性化ドメイン（Ｖｐ４８、配列番号７）であるか、又はそれを含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記第１又は前記第２の変異型は、ＥｎｖＺ１８０～４５０（配列番号８）、ＥｎｖＺ２２３～４５０（配列番号９）、ＮａｒＸ１７６～５９８（配列番号１０）及びＮａｒＸ３７９～５９８（配列番号１１）から選択される変異型であるか、又はそれを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記誘導性プロモーターは、ＯｍｐＲプロモーター（配列番号１）、及びＮａｒＬ－ＲＥ（配列番号２）から選択される、請求項５～８のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記第１の核酸配列及び／又は前記第２の核酸配列及び／又は前記第３の核酸配列は、前記細胞のコドンの使用に向けて最適化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記第１の核酸配列及び／又は前記第２の核酸配列及び／又は前記第３の核酸配列は、構成的プロモーターの転写制御下にある、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記構成的プロモーターは、ＣＭＶ（配列番号３）、ＥＦ１α（配列番号４）、及びＥＦ１α－Ｖ１（配列番号５）から選択される、請求項１１に記載の細胞。
- 前記第１の変異型及び前記第２の変異型は、同一である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ヒスチジンキナーゼは、トランスリン酸化ファミリーに属する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
- － 前記第１の変異型は、前記ヒスチジンキナーゼの前記第１又は前記第２の変異型の前記ＣＡドメインによってアクセス可能なヒスチジン残基を含まないＤＨｐドメインを含み、及び／又は
－ 前記第２の変異型は、ＡＴＰを結合できないＣＡドメインを含む、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の細胞。 - － 前記第１の変異型は、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｈ３９９Ｑ）（配列番号１２）又はＮａｒＸ１７６～５９８（Ｈ３９９Ｑ）であるか、又はそれを含み、及び／又は
－ 前記第２の変異型は、変異型ＮａｒＸ３７９～５９８（Ｎ５０９Ａ）（配列番号１３）又はＮａｒＸ１７６～５９８（Ｎ５０９Ａ）であるか、又はそれを含む、
請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの特異的な結合は、前記第１及び／又は前記第２のポリペプチドによって特異的に認識可能なリガンドによって誘発可能である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記第１のポリペプチドは、受容体であるか、又はそれを含み、かつ前記第２のポリペプチドは、前記受容体の結合パートナーであるか、又はそれを含み、前記受容体と前記結合パートナーとの結合は、前記受容体によって認識可能な前記リガンドによって誘発可能である、請求項１７に記載の細胞。
- 前記受容体は、膜貫通受容体であり、かつ前記結合パートナーは、細胞質タンパク質である、請求項１８に記載の細胞。
- － 前記第１のポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体からなるか、又はそれを含み、かつ第２のポリペプチドは、前記Ｇタンパク質共役型受容体の細胞質リガンド、特にβ－アレスチンからなるか、又はそれを含み、又は
－ 前記第１のポリペプチドは、Ｔ細胞受容体からなるか、又はそれを含み、かつ前記第２のポリペプチドは、ＺＡＰ－７０であるか、又はそれを含む、
請求項１～１９のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記目的の遺伝子は、細胞の機能又は内部状態に影響を与える免疫タンパク質、特にサイトカイン若しくは抗体、又はマイクロＲＮＡをコードする、請求項５～２０のいずれか１項に記載の細胞。
- 前記細胞は、哺乳類細胞、特にヒト細胞である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の細胞。
- タンパク質－タンパク質相互作用を評価するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
－ 請求項１～２２のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程であり、前記細胞は、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
● 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、
を含む、前記工程、及び
－ 前記応答制御タンパク質の活性を決定する工程、
を含み、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの特異的な結合により、前記第１又は第２の変異型の前記ＣＡドメインが前記第１又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインをリン酸化し、そして前記第１の変異型及び／又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによるリン酸化によって、前記応答制御タンパク質の活性が調節されるように、特に活性化若しくは阻害されるように、前記第１の変異型と前記第２の変異型とが二量体化する、
前記方法。 - タンパク質－タンパク質相互作用に対する化合物の作用を評価するための方法であって、前記方法は以下の工程：
－ 請求項１～２２のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程であって、前記細胞は、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、及び
● 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、
を含む、前記工程、及び
－ 前記細胞を化合物と接触させる工程、及び
－ 前記応答制御タンパク質の活性を決定する工程、
を含み、
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの特異的な結合により、前記第１又は第２の変異型の前記ＣＡドメインが前記第１又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインをリン酸化し、そして前記第１の変異型及び／又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによるリン酸化によって、前記応答制御タンパク質の活性が調節されるように、特に活性化若しくは阻害されるように、前記第１の変異型と前記第２の変異型とが二量体化し、かつ
前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの前記特異的な結合に対する前記化合物の作用は、前記応答制御タンパク質の前記活性によって決定される、
前記方法。 - 刺激に応答して所望の応答を引き出すための方法であって、前記方法は、以下の工程：
－ 請求項１～２２のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程であって、前記細胞は、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含むヒスチジンキナーゼの第１の変異型のＮ末端に融合した第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列、
● ＤＨｐドメイン及びＣＡドメインを含む前記ヒスチジンキナーゼの第２の変異型のＮ末端に融合した第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
ここで、前記第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの特異的な結合は、前記刺激によって誘発され、及び
● 前記第１又は前記第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによって特異的にリン酸化可能な応答制御タンパク質をコードする第３の核酸配列、
を含み、
ここで、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとの特異的な結合により、前記第１又は第２の変異型の前記ＣＡドメインが前記第１又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインをリン酸化し、そして前記第１の変異型及び／又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによるリン酸化によって前記応答制御タンパク質の活性が調節されるように、前記第１の変異型と前記第２の変異型とが二量体化する、
前記工程、
－ 前記細胞を前記刺激に暴露する工程であり、前記所望の応答は、前記応答制御タンパク質の活性によって媒介される、又は前記応答制御タンパク質の活性である、前記工程、
を含む、前記方法。 - － 前記応答制御タンパク質は、エフェクタードメインに融合したレシーバードメインを含み、前記レシーバードメインは、前記第１又は第２の変異型の前記ＤＨｐドメインによってリン酸化可能であり、かつ前記エフェクタードメインは、リン酸化されたレシーバードメインによって活性化可能であり、
－ 前記エフェクタードメインは、転写活性化ドメインであり、
－ 前記細胞は、前記転写活性化ドメインによって認識可能である誘導性プロモーターの制御下の目的の遺伝子をコードする第４の核酸配列をさらに含み、
前記転写活性化ドメインの活性化により、前記目的の遺伝子の発現が誘導される、
請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。 - － 前記目的の遺伝子の発現産物の存在は、前記応答制御タンパク質の活性として決定され、又は
－ 前記目的の遺伝子の発現産物は、前記所望の応答であるか、又は前記所望の応答を媒介する、
請求項２６に記載の方法。 - 哺乳類細胞、特にヒト細胞をトランスフェクション又はトランスダクションするために特に適したベクターであって：
－ 請求項１～２２のいずれか一項に記載のとおりの第１の核酸配列、
－ 請求項１～２２のいずれか一項に記載のとおりの第２の核酸配列、
－ 請求項１～２２のいずれか一項に記載のとおりの第３の核酸配列、及び
－ 任意に、請求項５～２２のいずれか一項に記載のとおりの第４の核酸配列
を含む、前記ベクター。
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