JP2022512471A - ポリメラーゼ阻害剤ならびに関連する組成物及び方法 - Google Patents

ポリメラーゼ阻害剤ならびに関連する組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022512471A
JP2022512471A JP2021532981A JP2021532981A JP2022512471A JP 2022512471 A JP2022512471 A JP 2022512471A JP 2021532981 A JP2021532981 A JP 2021532981A JP 2021532981 A JP2021532981 A JP 2021532981A JP 2022512471 A JP2022512471 A JP 2022512471A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
substituted
alkyl
salt
dna polymerase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2021532981A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020123792A5 (ja
JP7474257B2 (ja
Inventor
ウェンフイ チョウ
キンバリー ケー クノッヘ
ダグラス アール ストーツ
ミン チョウ
ポンチョ マイセンハイマー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Promega Corp
Original Assignee
Promega Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Promega Corp filed Critical Promega Corp
Publication of JP2022512471A publication Critical patent/JP2022512471A/ja
Publication of JPWO2020123792A5 publication Critical patent/JPWO2020123792A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7474257B2 publication Critical patent/JP7474257B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/40—Radicals substituted by oxygen atoms
    • C07D307/42—Singly bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/02—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C309/03—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C309/13—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton
    • C07C309/14—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton containing amino groups bound to the carbon skeleton
    • C07C309/15—Sulfonic acids having sulfo groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton containing amino groups bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of at least one of the amino groups being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/26—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/28—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton with sulfone or sulfoxide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/78—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans
    • C07D307/79—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D307/80—Radicals substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/74—Benzo[b]pyrans, hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本開示は、ＤＮＡ増幅反応の改善のための組成物及び方法を含む。詳細には、本開示は、低温でＤＮＡポリメラーゼを不活性化することによって非特異的なＤＮＡの増幅を最小化するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いたホットスタートＰＣＲ適用のための組成物及び方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１２日に出願された米国仮出願第６２／７７８，５９０号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に完全に援用される。
分野
本明細書では、ＤＮＡ増幅反応の改善のための組成物及び方法が提供される。詳細には、本開示は、低温でＤＮＡポリメラーゼを不活性化することによって非特異的なＤＮＡの増幅を最小化するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いたホットスタートＰＣＲ適用のための組成物及び方法を提供する。
生物学的ＰＣＲは、指数関数的に標的ＤＮＡ配列を特異的に増幅するための迅速かつ簡便な方法である（例えば、Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７－４３９１（１９８８）、その全体が参照により本明細書に援用される）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は分子生物学の技術であり、１コピーあるいは数コピーのＤＮＡを数桁の大きさにわたって増幅して、数千～数百万コピーの特定のＤＮＡ配列を生成するのに使用される。ホットスタートＰＣＲはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の改変形態であり、低温でＤＮＡポリメラーゼを不活性化することによってＤＮＡの非特異的増幅を回避する。当初、ホットスタートＰＣＲは、サイクリング開始の間の最初の変性の直前まで、Ｍｇ2+、ｄＮＴＰ、または酵素を抑制することによって実施された。代替的に、ホットスタートＰＣＲは、ＰＣＲの最初の変性ステップの間に混合物が加熱されるにつれて融解するワックスビーズバリアで反応構成要素を分離することによって達成され得る。
他のホットスタートＰＣＲの手法には、より低い温度でＤＮＡポリメラーゼの活性をブロックするための、特異的抗体またはポリメラーゼの可逆的化学修飾（例えば、有機酸無水物によるリジンの修飾）の使用が含まれる。そのため、ポリメラーゼの活性化は、９５℃での最初の活性化ステップを要する。このステップでは、酵素の活性中心に結合した抗体を変性し、さらに、化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼから酸無水物で作製された任意のリジン修飾を除去する。例えば、抗Ｔａｑ抗体は、Ｔａｑポリメラーゼ活性を７２℃未満（酵素がプライマーを伸長させる最適温度）で低減する。特異的抗体がＴａｑポリメラーゼから離れると、増幅はより高い特異性で進行する。
ただし、抗体ベースのホットスタートＰＣＲまたはＤＮＡポリメラーゼの化学修飾に基づくホットスタートＰＣＲを使用することには重大な欠点が存在する。例えば、抗体ベースのホットスタートＰＣＲは、ＰＣＲ反応で使用される各酵素に対し異なる抗体を使用する必要があり、ＤＮＡポリメラーゼに対する化学修飾は、酵素を活性化するために９５℃でのより長い時間を要する場合があり、また一部の酵素活性が回復しない場合がある。
本明細書では、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2022512471000001
（Ｉ）
またはその塩
（式中、
Ａは、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルから選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２である）
が提供される。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、Ａは、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ8－Ｃ14アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ12アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ2は－ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、ｎは２である。
いくつかの実施形態において、化合物はアルカリ金属塩の形態をとる。
いくつかの実施形態において、化合物は、
Figure 2022512471000002

Figure 2022512471000003

Figure 2022512471000004

Figure 2022512471000005

Figure 2022512471000006

Figure 2022512471000007
及び
Figure 2022512471000008

Figure 2022512471000009
から選択される。
本明細書では、本明細書で記載される式（Ｉ）の化合物と、ＤＮＡポリメラーゼとを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｃａ、Ｔｆｕ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｌｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４、またはこれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、化合物はＤＮＡポリメラーゼに結合している。いくつかの実施形態において、化合物はＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する。
いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上の核酸増幅試薬を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の増幅試薬は、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、オリゴヌクレオチドプライマー、及び核酸鋳型からなる群より選択される。
本明細書では、本明細書で記載される式（Ｉ）の化合物と、１つ以上の核酸増幅試薬とを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の増幅試薬は、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、オリゴヌクレオチドプライマー、及び核酸鋳型からなる群より選択される。
本明細書では、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2022512471000010
（ＩＩ）
またはその塩
（式中、
Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２であり、
Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）と、
１つ以上の核酸増幅試薬とを含む、組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、Ａは、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ8－Ｃ14アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ12アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ2は－ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、ｎは２である。
いくつかの実施形態において、Ｒ3は－ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ3は－ＳＯ3Ｘであり、Ｘはナトリウムカチオンである。
いくつかの実施形態において、化合物はアルカリ金属塩の形態をとる。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は、
Figure 2022512471000011

Figure 2022512471000012

Figure 2022512471000013

Figure 2022512471000014

Figure 2022512471000015

Figure 2022512471000016

Figure 2022512471000017

Figure 2022512471000018

Figure 2022512471000019

Figure 2022512471000020

Figure 2022512471000021

Figure 2022512471000022

Figure 2022512471000023

Figure 2022512471000024

Figure 2022512471000025

Figure 2022512471000026

Figure 2022512471000027

Figure 2022512471000028

Figure 2022512471000029

Figure 2022512471000030
及び
Figure 2022512471000031
から選択される。
いくつかの実施形態において、１つ以上の増幅試薬は、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、オリゴヌクレオチドプライマー、及び核酸鋳型からなる群より選択される。
本明細書では、ポリメラーゼ活性を温度依存的に阻害する方法であって、ＤＮＡポリメラーゼを式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2022512471000032
（ＩＩ）
またはその塩
（式中、
Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２であり、
Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）
に接触させることを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、Ａは、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ8－Ｃ14アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ12アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ2は－ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、ｎは２である。
いくつかの実施形態において、Ｒ3は－ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ3は－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘはナトリウムカチオンである）である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は、
Figure 2022512471000033

Figure 2022512471000034

Figure 2022512471000035

Figure 2022512471000036

Figure 2022512471000037

Figure 2022512471000038

Figure 2022512471000039

Figure 2022512471000040

Figure 2022512471000041

Figure 2022512471000042

Figure 2022512471000043

Figure 2022512471000044

Figure 2022512471000045

Figure 2022512471000046

Figure 2022512471000047

Figure 2022512471000048

Figure 2022512471000049

Figure 2022512471000050

Figure 2022512471000051

Figure 2022512471000052
及び
Figure 2022512471000053
から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｃａ、Ｔｆｕ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｌｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４、またはこれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体からなる群より選択される。
本明細書では、阻害されたポリメラーゼを活性化する方法であって、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2022512471000054
（ＩＩ）
またはその塩
（式中、
Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２であり、
Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）
によって阻害されたＤＮＡポリメラーゼを曝露することと、
温度を８０℃超に加熱して当該ＤＮＡポリメラーゼを活性化することとを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、化合物は、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2022512471000055
（Ｉ）
またはその塩
（式中、
Ａは、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルから選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２である）
である。
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｃａ、Ｔｆｕ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｌｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４、またはこれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、温度は９０℃超である。
本明細書では、核酸を増幅する方法であって、
（ａ）増幅試薬及び核酸鋳型を、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2022512471000056
（ＩＩ）
またはその塩
（式中、
Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２であり、
Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）によって阻害されたＤＮＡポリメラーゼに添加することと、
（ｂ）温度を少なくとも８０℃に加熱して当該ＤＮＡポリメラーゼを活性化することと、
（ｃ）当該増幅試薬及び核酸鋳型にとって適切な時間及び温度の熱サイクルプロトコルによって実行することとを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、増幅試薬は、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む。いくつかの実施形態において、増幅試薬は、核酸鋳型上の標的に対する順方向及び逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、８０℃超の温度に加熱することによって活性化される。いくつかの実施形態において、熱サイクルプロトコルは、（ｉ）高温変性ステップ、（ｉｉ）低温アニーリングステップ、及び（ｉｉｉ）中温伸長ステップの３つの温度サイクルを含み、５回以上連続して繰り返される。いくつかの実施形態において、変性、アニーリング、及び伸長のステップは、２０回以上連続して繰り返される。いくつかの実施形態において、熱サイクルプロトコルは、高温変性ステップ、中温／低温アニーリング／伸長ステップの２つの温度サイクルを含み、５回以上連続して繰り返される。いくつかの実施形態において、変性及びアニーリング／伸長のステップは２０回以上連続して繰り返される。
２つの異なるポリメラーゼ阻害剤（図１Ａは化合物＃７１２４）のありまたはなしで実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の増幅産物を評価するために使用したアガロースゲルの代表的な画像を含む。 ２つの異なるポリメラーゼ阻害剤（図１Ｂは化合物＃７２６１）のありまたはなしで実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の増幅産物を評価するために使用したアガロースゲルの代表的な画像を含む。 異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４３７、化合物＃７４３８、及び化合物＃７４３９（化合物＃７２６１の変形形態））を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。 異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４８９及び化合物＃７４９０（化合物＃７１２４の変形形態））を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。 異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４８７及び化合物＃７４８８（化合物＃７１２４の変形形態））を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。 異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４９１及び化合物＃７４９３（化合物＃７１２４の変形形態））を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。 異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４８６及び化合物＃７４９５（化合物＃７１２４の変形形態））を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。 ポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７１２４）の滴定のための２２℃に対するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ活性の結果の代表的なグラフを含み、これはＩＣ50の推定に使用することができる。 異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７１２４、化合物＃７１２６、化合物＃７１２７、化合物＃７１２３、化合物＃７１２５、化合物＃６９６６、及びＳＤＳ）に対するＩＣ50値の結果の代表的な表を含む。 示された様々な濃度でのポリメラーゼ阻害剤化合物＃７１２４及びポリメラーゼ酵素を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。 示された様々な濃度でのポリメラーゼ阻害剤化合物＃７２６１及びポリメラーゼ酵素を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。 ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて２つの異なるポリメラーゼ阻害剤（化合物＃７１２４及び化合物＃７２６１）のありまたはなしで実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応のＣＣＲ５遺伝子増幅産物を評価するために使用したアガロースゲルの代表的な画像を含む。 ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて２つの異なるポリメラーゼ阻害剤（化合物＃７１２４及び化合物＃７２６１）のありまたはなしで実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応のヒトジストロフィンＡｌｕ７－２遺伝子増幅産物を評価するために使用したアガロースゲルの代表的な画像を含む。
本明細書では、ＤＮＡ増幅反応の改善のための組成物及び方法が提供される。詳細には、本開示は、低温でＤＮＡポリメラーゼを不活性化することによって非特異的なＤＮＡの増幅を最小化するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いたホットスタートＰＣＲ適用のための組成物及び方法を提供する。
本開示の実施形態は、ＰＣＲ適用（例えば、ホットスタートＰＣＲ）のための新規の熱不安定性小分子ポリメラーゼ阻害剤を提供する。熱不安定性分子を増幅反応物に添加すると、ＤＮＡポリメラーゼ活性をより低い温度で阻害することによってホットスタートＰＣＲ適用が改善される。抗体ベースのホットスタートＰＣＲとは異なり、熱不安定性小分子ポリメラーゼ阻害剤の使用は、ホットスタートＰＣＲ適用で使用され得る異なるＤＮＡポリメラーゼに広く適用可能な簡便かつ普遍的なアプローチである。さらに、本明細書で提供される実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼに関連する望ましくないヌクレアーゼ活性を排除し、低温での非特異的産物の増幅を回避するため、より高い特異性及び収率で増幅産物を産生する。
本開示に基づいて当業者が認識するであろうように、多くの困難なＰＣＲ反応及び分析はホットスタートから恩恵を受け、場合によっては、ホットスタートは所望のＤＮＡ標的の増幅に要するものである。これには、標的のコピー数が非常に低い反応（例えば、１０，０００細胞当たり１個のＨＩＶゲノム）、変性ＤＮＡ（例えば、多くのＤＮＡ抽出手順は、反応セットアップ中に鋳型が１本鎖であるように煮沸ステップを含む）、または汚染ＤＮＡ（例えば、土壌もしくは糞便由来のＤＮＡ及び／または大量のＲＮＡを含むＤＮＡ）が含まれる。加えて、ホットスタートＰＣＲで対処され得る他の課題としては、プライマーの設計不良、単一反応への増幅の多重化、及びＤＮＡ鋳型内に類似の（ただし同一ではない）標的部位の存在が挙げられる。本開示の新規の熱不安定性小分子ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、これらの課題に対処する。
本明細書の当該セクション及び開示全体で使用されるセクション見出しは、単に編成のためであり、限定することは意図されていない。
１．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じる場合は、定義を含め、本文書が優先される。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載されている方法及び材料と同様または同等であるものも、本開示の実施及び試験で使用することができる。本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参照により援用される。本明細書で開示される材料、方法、及び実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することは意図されていない。
特定の官能基及び化学用語の定義は、下記でさらに詳細に説明される。本開示の目的のために、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５th Ｅｄ．（表紙裏）に従って同定され、特定の官能基は、概して、当該文献に記載されている通りに定義されている。さらに、有機化学の一般的原理や、特定の機能部分及び反応性は、Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２nd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，２００６、Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７th Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１３、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，３rd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１８、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３rd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７で説明されており、これらの各々の内容全体が、参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用する場合、「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加されている、本明細書で定義されるアルキル基を指す。アルコキシの代表例としては、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２－プロポキシ、ブトキシ、及びｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、１～３０個の炭素原子、例えば、１～１６個の炭素原子（Ｃ1－Ｃ16アルキル）、１～ １４個の炭素原子（Ｃ1－Ｃ14アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ1－Ｃ12アルキル）、１～１０個の炭素原子（Ｃ1－Ｃ10アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ1－Ｃ8アルキル）、１～６個の炭素原子（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、１～４個の炭素原子（Ｃ1－Ｃ4アルキル）、６～２０個の炭素原子（Ｃ6－Ｃ20アルキル）、または８～１４個の炭素原子（Ｃ8－Ｃ14アルキル）を含む直鎖状または分枝状の飽和炭化水素鎖を意味する。アルキルの代表例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、及びｎ－ドデシルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、２～３０個の炭素原子を含み、少なくとも１つの炭素間二重結合を含む、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を指す。アルケニルの代表的な例としては、限定されるものではないが、エテニル、２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、３－ブテニル、４－ペンテニル、５－ヘキセニル、２－ヘプテニル、２－メチル－１－ヘプテニル、及び３－デセニルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「アルキニル」という用語は、２～３０個の炭素原子を含み、少なくとも１つの炭素間三重結合を含む、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を指す。アルキニルの代表例としては、限定されるものではないが、エチニル、プロピニル、及びブチニルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、フェニル基、または２環式もしくは３環式の芳香族縮合環系を指す。２環式縮合環系の適例は、親分子部分に付加され、フェニル基に縮合しているフェニル基である。３環式縮合環系の適例は、親分子部分に付加され、他の２個のフェニル基に縮合しているフェニル基である。２環式アリールの代表例としては、限定されるものではないが、ナフチルが挙げられる。３環式アリールの代表例としては、限定されるものではないが、アントラセニルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「シクロアルキル」という用語は、３～１０個の炭素原子と０個のヘテロ原子とを含む飽和炭素環式環系を指す。シクロアルキルは、単環式、２環式、架橋、縮合、またはスピロ環式であり得る。シクロアルキルの代表例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、及びビシクロ［５．２．０］ノナニルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素間二重結合を含み、好ましくは環当たり５～１０個の炭素原子を有する、非芳香族の単環式環系または多環式環系を指す。例示的な単環式シクロアルケニル環としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、またはシクロへプテニルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。
本明細書で使用する場合、「ハロアルキル」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、または８個の水素原子がハロゲンにより置き換えられている、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。
本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」という用語は、芳香族の単環式環、または芳香族の２環式環系、または芳香族の３環式環系を指す。芳香族の単環式環は、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群より独立的に選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立的に選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子）を含む、５員または６員の環である。５員の芳香族の単環式環は、２つの二重結合を有し、６員の芳香族の単環式環は、３つの二重結合を有する。２環式ヘテロアリール基の適例は、本明細書で定義されているような単環式アリール基に縮合して付加された単環式ヘテロアリール環、または本明細書で定義されているような単環式ヘテロアリール基である。３環式ヘテロアリール基の適例は、本明細書で定義されているような単環式アリール基または本明細書で定義されているような単環式ヘテロアリール基から独立的に選択される２つの環に縮合した単環式ヘテロアリール環である。単環式ヘテロアリールの代表例としては、限定されるものではないが、ピリジニル（ピリジン－２－イル、ピリジン－３－イル、ピリジン－４－イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ベンゾピラゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チエニル、フラニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、１，２，４－トリアジニル、及び１，３，５－トリアジニルが挙げられる。２環式ヘテロアリールの代表的な例としては、限定されるものではないが、ベンゾイミダゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、クロメニル、イミダゾピリジン、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、プリニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、キノキサリニル、チアゾロピリジニル、チアゾロピリミジニル、チエノピロリル、及びチエノチエニルが挙げられる。３環式ヘテロアリールの代表例としては、限定されるものではないが、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられる。単環式、２環式、及び３環式のヘテロアリールは、環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分に接続している。
本明細書で使用する場合、「複素環」または「複素環式」という用語は、単環式複素環、２環式複素環、または３環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より独立的に選択された少なくとも１個のヘテロ原子を含む３、４、５、６、７、または８員環である。３員または４員環は、０または１つの二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される１個のヘテロ原子とを含む。５員環は、０または１つの二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される１、２、または３個のヘテロ原子とを含む。６員環は、０、１、または２つの二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される１、２、または３個のヘテロ原子とを含む。７員及び８員環は、０、１、２、または３つの二重結合と、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群より選択される１、２、または３個のヘテロ原子とを含む。単環式複素環の代表例としては、限定されるものではないが、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２－チアジナニル、１，３－チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられる。２環式複素環は、フェニル基に縮合した単環式複素環、または単環式シクロアルキルに縮合した単環式複素環、または単環式シクロアルケニルに縮合した単環式複素環、または単環式複素環に縮合した単環式複素環、またはスピロ複素環基、あるいは、環における隣接していない２個の原子が、１、２、３、もしくは４個の炭素原子のアルキレン架橋により、または２、３、もしくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋により連結している、架橋した単環式複素環環系である。２環式複素環の代表例としては、限定されるものではないが、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾチエニル、２，３－ジヒドロイソキノリン、２－アザスピロ［３．３］ヘプタン－２－イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－イルを含む）、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。３環式複素環の適例は、フェニル基と縮合した２環式複素環、または単環式シクロアルキルと縮合した２環式複素環、または単環式シクロアルケニルと縮合した２環式複素環、または単環式複素環と縮合した２環式複素環、あるいは、２環式環における隣接していない２個の原子が、１、２、３、もしくは４個の炭素原子のアルキレン架橋により、または２、３、もしくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋により連結している、２環式複素環である。３環式複素環の例としては、以下に限定されないが、オクタヒドロ－２，５－エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ－２Ｈ－２，５－メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ－アダマンタン（１－アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、及びオキサ－アダマンタン（２－オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）が挙げられる。単環式、２環式、及び３環式の複素環は、環内に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子を介して親分子部分に接続している。
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ」という用語は－ＯＨ基を意味する。
いくつかの場合において、基（例えば、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキル）内の炭素原子数は、接頭辞「Ｃx－Ｃy－」によって示され、式中、ｘは基内の炭素原子の最小数であり、ｙは基内の炭素原子の最大数である。したがって、例えば、「Ｃ1－Ｃ3－アルキル」は、１～３個の炭素原子を含むアルキル基を指す。
「置換基」という用語は、示された基の原子上で置換された基を指す。
基または部分が置換され得る場合、「置換されている」という用語は、「置換されている」を用いた表現で示される基上の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個であり、いくつかの実施形態においては１、２、または３個、他の実施形態においては１または２個）の水素が、列挙され示された基の選択または当業者に知られている好適な基（例えば、以下に列挙される基のうちの１つ以上）で置き換えられ得ることを示す。置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、－ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、及びアシルが挙げられる。
本明細書に記載されている化合物について、基及びその置換基は、許容される原子価及び置換基に従って選択することができ、この選択及び置換により、安定した化合物、例えば、転位、環化、脱離などによるような変換を自発的に起こさない化合物がもたらされるようにする。
本明細書で使用される「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｓ）」、「～することができる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、及びこれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドな移行句、用語、または単語であるように意図されている。文脈による別段の明確な定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。本明細書における多くの実施形態は、排他的ではない「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（～を含む）」という語を用いて記載される。このような実施形態は、実施形態の複数の排他的な「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（～からなる）」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に～からなる）」を含み、それらの実施形態は、そのような表現を用いて代替的に特許請求または説明され得る。また、本開示は、明示的に示されているか否かにかかわらず、本明細書で提示されている実施形態または要素「～を含む」または「～から本質的になる」他の実施形態も企図している。
本明細書内での数値範囲の列挙については、同じ精度を伴った、その範囲の間に介在する各々の数が明示的に企図されている。例えば、６～９という範囲については、６と９に加えて７と８という数が企図されており、６．０～７．０という範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０という数が明示的に企図されている。
本明細書で使用する場合、「単離ポリヌクレオチド」とは、その起源に基づき、単離ポリヌクレオチドが、この「単離ポリヌクレオチド」と共に自然界で見いだされるポリヌクレオチドの全てまたは一部分と会合していない、自然界では結合しないポリヌクレオチドと作用可能に結合している、または自然界ではより大きな配列の一部として発生しない、（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源またはこれらの組合せの）ポリヌクレオチドを意味し得る。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、別段の指定がない限り、ペプチドアミド結合（－－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－－）によって主鎖を介して連結した２つ以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ペプチド」という用語は、典型的には、短いアミノ酸ポリマー（例えば、２５アミノ酸未満の鎖）を指し、「ポリペプチド」という用語は、典型的には、より長いアミノ酸ポリマー（例えば、２５アミノ酸超の鎖）を指す。
本明細書で使用する場合、「試料」、「試験試料」、「試験片」、「対象由来の試料」、及び「患者試料」は、交換可能に使用され得、これらは、全血などの血液の試料、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球、または単球であり得る。試料は、患者から得たままの状態で直接使用する場合もあれば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害構成要素の不活性化、試薬の添加などによって前処理して、本明細書で記載されるように、または当技術分野で知られているように、何らかの方法で試料の特性を改変する場合もある。
「配列同一性」は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が同じモノマーサブユニットの配列構成を有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸など）が類似のポリマー配列を有する程度を指す。例えば、類似のアミノ酸は、同じ生物物理学的特性を共有するアミノ酸であり、例えば、酸性（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び極性無電荷（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）のファミリーに分類され得る。「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）の計算は、（１）２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウインドウ（例えば、長い方の配列の長さ、短い方の配列の長さ、指定ウインドウ）にわたって比較する、（２）同一の（または類似の）モノマー（例えば、同じアミノ酸が両方の配列で生じる、類似のアミノ酸が両方の配列で生じる）を含有する位置数を決定して一致した位置の数を得る、（３）一致した位置の数を比較ウインドウ（例えば、長い方の配列の長さ、短い方の配列の長さ、指定ウインドウ）内の位置の総数で割る、及び（４）結果に１００を掛けて配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを得る、といった方法により行われる。例えば、ペプチドＡ及びＢが共に２０アミノ酸長であり、かつ１つ以外の全ての位置で同一のアミノ酸を有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは、９５％配列同一性を有する。同一でない位置のアミノ酸が同じ生物物理学的特性（例えば、いずれも酸性）を共有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは１００％配列類似性を有することとなる。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、ペプチドＤの１５アミノ酸のうち１４アミノ酸がペプチドＣの一部のアミノ酸に対し同一である場合、ペプチドＣ及びＤは７０％配列同一性を有するが、ペプチドＤはペプチドＣの最適比較ウインドウに対しては９３．３％配列同一性を有する。本明細書における「配列同一性パーセント」（または「配列類似性パーセント」）を算出する目的では、アラインメント配列内の任意のギャップはその位置におけるミスマッチとして処理される。
「部分配列」は、別のより大きなペプチドまたはポリペプチドと１００％の配列同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。部分配列は、より大きなアミノ酸鎖の部分と完全に一致する。
本明細書で使用する場合、「実質的に」とは、記載された特性、パラメーター、及び／または値が正確に達成される必要はないが、例えば、許容度、測定誤差、測定精度限界、及び当業者に知られている他の要因を含む偏差または変動が、当該特性がもたらすように意図された効果を排除しない量で生じ得ることを意味する。実質的に存在しない特性または特徴は、ノイズ内にあるもの、バックグラウンド以下にあるもの、使用されるアッセイの検出能力未満にあるもの、または重要な特性のわずかな部分（例えば、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、０．００００１％未満、０．０００００１％未満、０．００００００１％未満）である。
「バリアント」は、本明細書では、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを記載するために使用される。「ＳＮＰ」は、一塩基多型であるバリアントを指す。「生物学的活性」の代表例としては、特異的抗体によって結合される能力、または免疫応答を促進する能力が挙げられる。また、バリアントは、本明細書では、あるアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物学的活性を保持するタンパク質を記載するためにも使用される。アミノ酸の保存的置換（例えば、アミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、程度、及び荷電領域の分布）を有する異なるアミノ酸で置き換えること）は、当技術分野では、典型的には軽微な変化を含むものとして認識されている。これらの軽微な変化は、部分的には、当技術分野で理解されているようにアミノ酸の疎水性指標を検討することによって特定することができる。アミノ酸の疎水性指標は、その疎水性及び電荷の検討に基づく。当技術分野では、類似の疎水性指標のアミノ酸が置換されてもタンパク質機能を保持し得ることが知られている。１つの態様において、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。また、アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするためにも使用され得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の検討は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の計算を可能にする。これは、抗原性及び免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な尺度である。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当技術分野で理解されているように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実施することができる。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値は共に、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この知見と整合して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及びその他の特性によって明らかにされるような、アミノ酸の相対的類似性、特に、アミノ酸の側鎖に依存することが理解される。
本明細書で別途定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書で記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用されるいかなる命名法及びこれらの技術も、当技術分野で周知され一般的に使用されているものである。用語の意味及び範囲は明確にすべきであるが、潜在的な曖昧さがある場合には、本明細書で提供される定義は、いかなる辞書または外的な定義にも優先する。さらに、文脈による別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形も含むものとし、複数形の用語は単数形も含むものとする。
２．ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤
本開示は、新規の熱不安定性小分子ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いたホットスタートＰＣＲに関する材料及び方法を含む。これらの実施形態によれば、本開示は、炭素鎖尾部（Ｒ1）と、分子の分解を可能にするコア基（Ａ）と、頭部基とを含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2022512471000057
（Ｉ）
またはその塩
（式中、
Ａは、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルから選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２である）
を提供する。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル、メトキシ、及びイソプロポキシから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メトキシ及びイソプロポキシから選択される１個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル及びメトキシから独立的に選択される２個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル及びメトキシから独立的に選択される３個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル及びメトキシから独立的に選択される４個の置換基で置換されたフェニルである。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立的に選択される１、２、または３個のヘテロ原子を有する、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１個のヘテロ原子を有する、置換されていない、またはＣ－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１もしくは２個の置換基で置換された、５員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、ハロ（例えば、クロロまたはブロモ）から選択される１個の置換基で置換されたフラニルである。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、２環式ヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、Ａは、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ8－Ｃ14アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ12アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ2は－ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、ｎは２である。
いくつかの実施形態において、化合物は、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩の形態をとる。
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2022512471000058

Figure 2022512471000059

Figure 2022512471000060

Figure 2022512471000061

Figure 2022512471000062

Figure 2022512471000063

Figure 2022512471000064
及び
Figure 2022512471000065
から選択される。
別の態様において、本開示は、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2022512471000066
（ＩＩ）
またはその塩
（式中、
Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
ｎは、１または２であり、
Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ
（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオンまたはアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）
を使用する、本明細書でさらに説明されるような組成物及び方法を提供する。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル、メトキシ、及びイソプロポキシから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メトキシ及びイソプロポキシから選択される１個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル及びメトキシから独立的に選択される２個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル及びメトキシから独立的に選択される３個の置換基で置換されたフェニルである。いくつかの実施形態において、Ａは、メチル及びメトキシから独立的に選択される３個の置換基で置換されたフェニルである。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立的に選択される１、２、または３個のヘテロ原子を有する、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１個のヘテロ原子を有する、置換されていない、またはＣ－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１もしくは２個の置換基で置換された、５員単環式ヘテロアリールである。いくつかの実施形態において、Ａは、ハロ（例えば、クロロまたはブロモ）から選択される１個の置換基で置換されたフラニルである。
いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、２環式ヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、Ａは、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、Ａは、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ8－Ｃ14アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ12アルキルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ2は－ＣＯＯＨである。
いくつかの実施形態において、ｎは１である。いくつかの実施形態において、ｎは２である。
いくつかの実施形態において、Ｒ3は－ＣＯＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ3は－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘはナトリウムカチオンである）である。
いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ3は－ＳＯ3Ｘ（式中、ＸはＮａである）である。
いくつかの実施形態において、Ｒ1はＣ12アルキルであり、Ｒ2は水素であり、ｎは２であり、Ｒ3は－ＳＯ3Ｘ（式中、ＸはＮａである）である。
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は、
Figure 2022512471000067

Figure 2022512471000068

Figure 2022512471000069

Figure 2022512471000070

Figure 2022512471000071

Figure 2022512471000072

Figure 2022512471000073

Figure 2022512471000074

Figure 2022512471000075

Figure 2022512471000076

Figure 2022512471000077

Figure 2022512471000078

Figure 2022512471000079

Figure 2022512471000080

Figure 2022512471000081

Figure 2022512471000082

Figure 2022512471000083

Figure 2022512471000084

Figure 2022512471000085

Figure 2022512471000086
及び
Figure 2022512471000087
から選択される。
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物は、塩の形態をとってもよい。化合物の中性形態を、塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することにより再生することができる。化合物の親形態は、様々な塩形態とは、ある特定の物理的特性（例えば、極性溶媒における溶解性）が相違するが、それ以外では、これらの塩は、本開示の目的において、化合物の親形態と同等である。
詳細には、式（Ｉ）の化合物は少なくとも１つの－ＣＯＯＨ部分を含み、これはアニオン性（すなわち、－ＣＯＯ-）であってもよく、好適なカチオンと塩を形成することができる。式（ＩＩ）の化合物は、少なくとも１つの－ＣＯＯＨ部分または少なくとも１つの－ＳＯ3Ｈ部分を含み、これはアニオン性（すなわち、それぞれ－ＣＯＯ-または－ＳＯ3 -）であってもよく、好適なカチオンと塩を形成することができる。好適な無機カチオンの例としては、限定されるものではないが、Ｌｉ+、Ｎａ+、及びＫ+などのアルカリ金属イオン、Ｃａ2+及びＭｇ2+などのアルカリ土類カチオン、ならびにその他のカチオンが挙げられる。ナトリウム塩が特に好適であり得る。好適な有機カチオンの例としては、限定されるものではないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ4 +）及び置換されたアンモニウムイオン（例えば、ＮＨ3Ｒ1 +、ＮＨ2Ｒ2 +、ＮＨＲ3 +、ＮＲ4 +）が挙げられる。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は、以下に由来するものである：エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、ならびにリジン及びアルギニンなどのアミノ酸。
化合物がカチオン性であるまたはカチオン性になり得る官能基を有する場合（例えば、－ＮＨ2は－ＮＨ3 +になり得る）、塩は好適なアニオンを用いて形成することができる。好適な無機アニオンの例としては、限定されるものではないが、次の無機酸に由来するものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸。好適な有機アニオンの例としては、限定されるものではないが、次の有機酸に由来するものが挙げられる：２－アセチルオキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸。
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物は、様々な方法によって調製することができる。例えば、化合物は、スキーム１に例示されるように調製することができる。
スキーム１
Figure 2022512471000088
スキーム１に例示されるように、アルデヒド化合物Ａを好適なグリニャール試薬（例えば、化合物Ｒ1－ＭｇＸ（式中、Ｘはブロモなどのハロゲンである））と反応させて化合物Ｂを生成することができる。化合物Ｂをクロロギ酸ｐ－ニトロフェニルと反応させて、対応するカーボネート化合物を生成させ、これを適切なアミンと反応させて式（ＩＩ）の化合物を形成することができる。当業者は、Ｒ3が－ＣＯＯＨである化合物を用いて式（Ｉ）の化合物を同様に調製できることを認識するであろう。
本明細書中の化合物及び中間体は、有機合成分野の当業者に周知されている方法によって単離及び精製することができる。化合物を単離及び精製するための従来的な方法の例としては、限定されるものではないが、活性炭での任意選択の前処理を伴った高温または低温での再結晶化による固体支持体（例えば、シリカゲル、アルミナ、またはアルキルシラン基で誘導体化されたシリカ）上でのクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、様々な圧力での蒸留、真空下での昇華、及び粉砕（例えば、“Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），ｂｙ Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ， ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ，ｐｕｂ． Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載されるようなもの）を挙げることができる。
各個々のステップにおける反応条件及び反応時間は、用いる特定の反応物質や反応物質中に存在する使用置換基に応じて変動し得る。具体的な手順を実施例の項で示す。反応は、従来の方法で後処理を行うことができ、例えば、当技術分野で一般に知られている手法（例えば、以下に限定されないが、結晶化、蒸留、抽出、粉砕、及びクロマトグラフィー）に従って、残渣から溶媒を除去し、さらに精製することにより行われる。別段の記載がない限り、出発材料及び試薬は、市販のものであるか、または当業者により、化学文献に記載されている方法を用いて市販の材料から調製することができる。出発材料が市販のものでない場合、出発材料は、標準的な有機化学的手法か、構造的に同様な公知の化合物の合成に類似する技法か、または上述されたスキームもしくは合成例の項に記載されている手順に類似する技法から選択される手順により、調製することができる。
通例的な実験作業は、反応条件、試薬、及び合成経路の順序の適切な操作、反応条件に適合性でない恐れのある任意の化学官能性の保護、ならびに本方法の反応順序における好適なポイントでの脱保護を含めて、本発明の範囲に含まれる。好適な保護基、ならびにこのような好適な保護基を用いて種々の置換基を保護及び脱保護する方法は、当業者に周知されており、このような方法の例は、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（５ｔｈ ｅｄ．）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０１４））という表題のＰＧＭ Ｗｕｔｓによる論文に見いだすことができ、当該文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明の化合物の合成は、上述された合成スキームまたは具体的な実施例に記載の方法に類似する方法により、遂行することができる。
開示化合物の光学的活性形態が必要とされる場合、当該形態は、光学的に活性の出発材料（例えば、好適な反応ステップの不斉誘導により調製）を用いて、本明細書で説明されている手順のうちの１つを行うことにより、または標準的な手順（例えば、クロマトグラフィー分離、再結晶、もしくは酵素的分割）を用いて、化合物もしくは中間体の立体異性体混合物を分割することにより、取得することができる。
同様に、化合物の純粋な幾何異性体が必要とされる場合、当該異性体は、純粋な幾何異性体を出発材料として用いて、上記手順のうちの１つを行うことにより、またはクロマトグラフィー分離のような標準的な手順を用いて、化合物もしくは中間体の幾何異性体混合物を分割することにより、取得することができる。
記載されている合成スキーム及び具体的な実施例は、例示的なものであり、特許請求の範囲で定義されている本発明の範囲を限定するように解釈しないものとする。合成方法及び具体的な実施例における全ての代替方法、変更、及び等価物は、特許請求の範囲内に含まれる。
３．ＰＣＲ試薬、組成物、及びキット
本開示の実施形態には、限定されるものではないが、ホットスタートＰＣＲ反応を含めたＰＣＲ反応を行うのに使用される様々な試薬が含まれる。このようなＰＣＲ反応は、本明細書で説明されるような任意の好適な試薬（本開示の新規の熱不安定性小分子ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を含む）を用いて実施することができる。これらの実施形態に従って使用され得るＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、ＤＮＡ分子を複製可能な任意のポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼであり、これはＰＣＲ適用で特に有用である。熱安定性ポリメラーゼは、多種多様な好熱性細菌、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（Ｔｂｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属のその他の種、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）、及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属のその他の種、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ 属のその他の種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓｏ）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ（Ｐｏｃ）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ａｂｙｓｓｉ（Ｐａｂ）、及びＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）、ならびにこれらの変異体、バリアント、または誘導体から単離される。
いくつかの実施形態において、これらの実施形態に従って使用され得るＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、市販のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｍａｓｓ．、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．の各社製のもの）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（登録商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標）、ならびにこれらの活性変異体、バリアント、及び誘導体である。他のＤＮＡポリメラーゼ（上記で具体的に開示されていないが、本開示に基づいて当業者に知られているであろうＤＮＡポリメラーゼを含む）を、本明細書で提供される新規の熱不安定性小分子ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤と共に使用してもよい。
本明細書で提供される実施形態によれば、様々な他のＰＣＲ試薬は増幅試薬を含むことができ、増幅試薬は、核酸標的の増幅のための少なくとも１つのプライマーまたは少なくとも１対のプライマー、増幅の検出を可能にする少なくとも１つのプローブ及び／または色素、リガーゼ、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ及び／またはＮＴＰ）、２価マグネシウムイオン、あるいはこれらの任意の組合せ（とりわけ、本開示に基づいて当業者が認識すると考えられるもの）を含み得る。いくつかの実施形態において、増幅試薬及び／または核酸標的はそれぞれ、有効量で、例えば、他の必要な試薬（限定されるものではないが、熱安定性逆転写酵素及びマンガンを含む）の存在下で所望の核酸標的の増幅を可能にするのに十分な量で、存在し得る。
本明細書で提供される実施形態によれば、ＰＣＲ試薬は、１つ以上のプライマー、あるいは核酸鋳型の複製をプライミング可能な、及び／またはそのために使用される任意の核酸を含み得る。概して、プライマーは、より長い鋳型に対し相補的なより短い核酸である。複製中、プライマーは、鋳型配列に基づいて伸長して、鋳型の相補的コピーであるより長い核酸を産生することができる。伸長は、とりわけ、（例えば、ポリメラーゼの作用による）個々のヌクレオチドの連続的な付加により、または（例えば、プライマー対を連結するリガーゼの作用による）ヌクレオチドのブロックの結合により、生じ得る。プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらのアナログ（例えば、人工核酸）、またはこれらの任意の組合せであり得る。プライマーは、任意の好適な長さ、例えば、少なくとも約１０、１５、２０、または３０ヌクレオチドを有し得る。例示的なプライマーは化学的に合成される。プライマーは、少なくとも１つの核酸標的を増幅するための少なくとも１つのプライマー対として供給され得る。プライマー対は、得られるアンプリコンの対向する末端（したがって長さ）を集合的に定義するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーであり得る。
本明細書で提供される実施形態によれば、ＰＣＲ試薬は、１つ以上のプローブ、または少なくとも１つの標識（例えば、少なくとも１つの色素）に接続した任意の核酸も含み得る。プローブは、核酸標的及び／またはアンプリコンに対する配列特異的結合パートナーであり得る。プローブは、互いに近接したときに集合的に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を示す色素対に接続している１つ以上の核酸を含めた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく標的増幅の検出を可能にするように設計することができる。色素対は、第１及び第２の放出体、またはとりわけ放出体及び消光体をもたらすことができる。色素対からの蛍光発光は、色素が互いに分離するとき（例えば、プライマー伸長中のプローブの切断（例えば、５’ヌクレアーゼアッセイ、例えば、ＴＡＱＭＡＮプローブを用いたアッセイ）によって）、またはプローブがアンプリコン（例えば、分子ビーコンプローブ）とハイブリダイズするときに変化する。プローブの核酸部分は、任意の好適な構造または起源を有し得、例えば、核酸部分は、ロックド核酸、ユニバーサルプローブライブラリーのメンバーなどであり得る。他の場合には、プローブ及びプライマー対のプライマーの１つは、同じ分子内で結合し得る。例えば、プライマー－プローブ分子は、その３’末端にプライマー配列と、その５’末端に分子ビーコン型プローブとを含み得る。この配置を用いて、異なる色素で標識された関連するプライマー－プローブ分子を同じ逆方向プライマーと共に多重化アッセイで使用して、単一ヌクレオチド（一塩基多型（ＳＮＰ））によって異なる標的配列を決定することができる。
いくつかの実施形態において、ＰＣＲ試薬は、１つ以上の標識またはレポーター分子も含み得る。標識は、任意の実体（例えば、化合物、生物学的粒子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、細菌、胞子、ウイルス、もしくは細胞小器官）、または液滴）に接続した、あるいはそれに組み込まれた任意の同定及び／または識別するマーカーまたは識別子を含む。標識は、例えば、実体を光学的に検出可能及び／または光学的に識別可能にする色素であり得る。標識に使用される例示的な色素としては、蛍光色素（フルオロフォア）及び蛍光消光剤がある。レポーターは、反応の程度などの条件を報告する任意の化合物または化合物のセットを含む。例示的なレポーターは、少なくとも１つの色素（例えば、蛍光色素もしくはエネルギー移動対）、及び／または少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。核酸増幅アッセイのための例示的なレポーターは、プローブ及び／またはインターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、臭化エチジウムなど）を含み得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＣＲ試薬を組み合わせて組成物またはキットが形成され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の新規の熱不安定性小分子ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を含め、増幅反応を行うのに要する任意の好適なＰＣＲ試薬を含み得る。例えば、組成物は、本開示のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤及び１つ以上のＰＣＲ試薬、例えば、核酸標的の増幅のためのプライマーまたはプライマー対、増幅の検出を可能にするプローブ及び／または色素、リガーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ及び／またはＮＴＰ）、２価マグネシウムイオン、あるいはこれらの任意の組合せ、本開示に基づいて当業者が認識するであろう、他の試薬のうちの１つ以上を含み得る。これらの様々なＰＣＲ試薬の組合せ（新規の熱不安定性小分子ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を含む）は、ホットスタートＰＣＲ反応を含むＰＣＲ反応を行うのに使用されるキットにも含めることができる。
本明細書で提供される実施形態によれば、上記のＰＣＲ試薬の濃度は、使用される特定の反応条件及び試薬、ならびに増幅されるべき所望のＤＮＡ標的に応じて変動し得る。当業者であれば、任意のＰＣＲ試薬に対し本明細書で提供される任意の特定の濃度または濃度範囲（本開示のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤に関する濃度範囲を含む）が、使用される特定の反応条件及び試薬に応じて変化し、限定することは意図されていないことを容易に認識するであろう。
４．材料及び方法
本開示の実施形態には、限定されるものではないが、ホットスタートＰＣＲ反応を含めたＰＣＲ反応を行うのに使用される様々な組成物及び方法が含まれる。概して、ＰＣＲ反応は、核酸またはそのセグメントのプロセス複製またはコピー（例えば、直接コピー及び／または相補的コピー）の形成を伴う。複製反応は概して、酵素、とりわけポリメラーゼ及び／またはリガーゼを伴う。複製された核酸及び／またはセグメントは、複製のための鋳型（及び／または標的）である。ＰＣＲ反応は概して、増幅のプロセス、すなわち、複製が経時的に繰り返し生じ、鋳型分子の少なくとも１つのセグメントの複数のコピーを形成する反応も含む。増幅は、増幅が進行するにつれて、コピー数の指数関数的または線形的な増加を生じ得る。典型的な増幅は、コピー数及び／またはシグナルの１，０００倍を超える増加をもたらす。本明細書で開示されるアッセイにおける例示的な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含み得、これらの各々は、熱サイクルによって駆動される。熱サイクルは概して、変性（融解）、アニーリング、及び伸長の連続ラウンドを実施するために反応混合物を加熱及び冷却するサイクルを伴う。追加的または代替的に、本明細書で提供されるアッセイは、等温的に実施され得る他の増幅反応、例えば、分岐プローブＤＮＡアッセイ、カスケードＲＣＡ、ヘリカーゼ依存的増幅、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ＰＡＮ－ＡＣ、Ｑ－ベータレプリカーゼ増幅、ローリングサークル複製（ＲＣＡ）、自己持続性配列複製、鎖置換増幅などを使用してもよい。増幅は、線状または環状の鋳型を利用することができる。
増幅は、上記で説明されるような任意の好適な試薬（本開示の新規の熱不安定性小分子ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を含む）を用いて実施することができる。増幅は、増幅混合物中で実施されるか、またはその存在について試験され得る。増幅混合物は、組成物中で、存在する場合、核酸標的分子の複数のコピーを生成可能である任意の組成物である。増幅混合物は、とりわけ、少なくとも１つのプライマーまたはプライマー対、少なくとも１つのプローブ、少なくとも１つの複製酵素（例えば、少なくとも１つのポリメラーゼ、例えば、少なくとも１つのＤＮＡ及び／またはＲＮＡポリメラーゼ、及び／または少なくとも１つのリガーゼ）、及び／またはデオキシヌクレオチド（及び／またはヌクレオチド）、三リン酸（ｄＮＴＰ及び／またはＮＴＰ）の任意の組合せを含み得る。
本明細書でさらに説明されるように、ホットスタートＰＣＲ増幅は、概して、高温に達するまで、特異的標的を増幅せず、またさらに、例えば非特異的標的を増幅しない増幅反応（例えば、重合及び／またはライゲーション）を含む。高温は、少なくとも、非特異的増幅を低減するために、プライマーに対するアニーリング温度前後であり得る。場合によっては、ホットスタートＰＣＲは、所与の標的の増幅、または所与の標的の増加した収率の増幅を可能にするものであり、必ずしも非特異的標的の増幅を低減することは要求されない。他の場合には、ポリメラーゼ酵素のヌクレアーゼ活性は、プライマー及び鋳型の分解を引き起こし得（例えば、蛍光色素の除去またはプライマーもしくはプローブの長さの減少をもたらす）、場合によっては、ホットスタートＰＣＲは、望ましくないヌクレアーゼ活性を低減または防止することができる。
概して、ＰＣＲは、連続的な複製ラウンドを達成するための加熱及び冷却の交互サイクル（すなわち、熱サイクル）に依存する任意の核酸増幅反応を含む。ＰＣＲは、２つ以上の温度設定点間（例えば、より高い融解（変性）温度及びより低いアニーリング／伸長温度）の熱サイクル、または３つ以上の温度設定点間（例えば、より高い融解温度、より低いアニーリング温度、及び中間伸長温度）の熱サイクルによって実施することができる。ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼ、例えば、とりわけ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、野生型酵素、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＦａｓｔＳｔａｒｔポリメラーゼなど）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓ－Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、またはこれらの組合せを用いて実施することができる。ＰＣＲは概して、産物アンプリコンの量を連続サイクルにわたって指数関数的に増加させる。
任意の好適なＰＣＲ手法または手法の組合せ、例えば、アレル特異的ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ、配列間特異的ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、指数後線形ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、多重ライゲーション依存的プローブ増幅、多重ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップ－エクステンションＰＣＲ、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ、定性的ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、シングルセルＰＣＲ、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ユニバーサルファストウォーキングＰＣＲ、またはこれらの任意の組合せが、本明細書で開示される実施形態で利用され得る。
上記の実施形態に従って、本開示の熱不安定性小分子ポリメラーゼ阻害剤を検討するために使用する様々な材料及び方法について以下に説明する。
Ｔａｑ及び熱分解性界面活性剤滴定。図９は、示された様々な濃度でポリメラーゼ阻害剤化合物＃７１２４及びポリメラーゼ酵素を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応（Ｃｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子標的）の結果の代表的な表を含む。範囲には、約０．３７５～１．２５Ｕ Ｔａｑ／２５μｌの反応及び１００～２５０μＭの化合物＃７１２４が含まれる。図１０は、示された様々な濃度でポリメラーゼ阻害剤化合物＃７２６１及びポリメラーゼ酵素を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の結果の代表的な表を含む。範囲には、約０．３７５～１．２５Ｕ Ｔａｑ／２５μｌの反応及び５０～１７５μＭの化合物＃７２１６が含まれる。（以下の表１を参照。）
表１．
Figure 2022512471000089
ヒトゲノム鋳型の試験。図１１は、２つの異なるポリメラーゼ阻害剤（化合物＃７１２４及び化合物＃７２６１）のありまたはなしで、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応のＣＣＲ５遺伝子増幅産物を評価するために使用したアガロースゲルの代表的な画像を含む。標的アンプリコンは５００ｂｐであり、ホットスタートを使用しなければ、かなりの量のプライマーダイマーが存在する。化合物＃７１２４及び化合物＃７２６１を用いた場合、５００ｂｐ収率は増加したが、プライマーダイマーの量はとどまった（ホットスタートなしのＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ処理及び抗体媒介ホットスタートありのＧｏＴａｑ（登録商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼと比較して）。反応構成要素を以下の表２に示す。以下のサイクル法が使用された：［（２２℃で９０分間、９４℃で２分間）１サイクル、（９２℃で３０秒間、６８℃で２分間）４５サイクル、（７２℃で５分間）１サイクル、４℃の浸漬］。
図１２は、２つの異なるポリメラーゼ阻害剤（化合物＃７１２４及び化合物＃７２６１）のありまたはなしで、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応のヒトジストロフィンＡｌｕ－７２遺伝子増幅産物を評価するために使用したアガロースゲルの代表的な画像を含む。標的アンプリコンは３２０ｂｐであり、ホットスタートなしの場合収率は少ない。化合物＃７１２４及び化合物＃７２６１を用いた場合、３２０ｂｐ収率が増加し、ある特定の濃度では二次産物（スミアとして認められる）が劇的に減少した。反応構成要素を以下の表２に示す。以下のサイクル法が使用された：［（２２℃で９０分間、９４℃で２分間）１サイクル、（９４℃で５０秒間、５９℃で５０秒間、６８℃で２分間）４２サイクル、４℃の浸漬］。
表２．
Figure 2022512471000090
５．実施例
当業者には、本明細書で説明される本開示の方法の他の好適な改変及び適合が、容易に適用可能かつ認識可能であり、また、本開示の範囲または本明細書に開示される態様及び実施形態から逸脱することなく、適切な等価物を用いてなされ得ることが容易に明らかであろう。本開示を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することによって、同じことがより明確に理解されるであろう。以下の実施例は、本開示のいくつかの態様及び実施形態を単に例示することを意図したものであり、本開示の範囲を限定するように解釈すべきものではない。本明細書で言及される全ての学術誌参考文献、米国特許、及び刊行物の開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例示される複数の態様を有する。
実施例１
化合物の合成
ポリメラーゼ阻害剤は、以下の一般手順によって作製することができる。
アルデヒド（１当量）を０℃の脱水ＴＨＦ中で所望のグリニャール試薬（１．２当量）と反応させた。混合物を室温で終夜撹拌した。２０ｍＬの水を添加し、次いで１００ｍＬのエーテルを添加することにより、反応をクエンチした。得られた混合物を、沈殿が消失するまで２ＮのＨＣｌで酸性化した。水層をエーテルで３回抽出し、合わせた有機層を水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。得られたアルコールを、ヘプタン／酢酸エチルを溶離剤として用いたシリカカラムによって精製した。
上記アルコール（１当量）及びクロロギ酸ｐ－ニトロフェニル（２当量）の２０ｍＬ脱水ＴＨＦ中溶液に、ピリジン（３当量）を０℃でゆっくりと添加した。反応混合物を１時間にわたって撹拌した。溶媒を除去した後、残渣をヘプタンに溶解した。不溶性の沈殿物を濾去した。濾液の溶媒を除去した後、粗製炭酸ｐ－ニトロフェニルを直接使用した。
炭酸ｐ－ニトロフェニル（１当量）の溶液に、所望のアミンＴＢＡ塩（３当量）を添加した。混合物を１時間にわたって撹拌した。固体を濾過によって除去した。溶媒を除去した後、化合物をＤＣＭに溶解し、ヘプタン／酢酸エチル－ＤＣＭ／ＭｅＯＨを溶媒として用いたシリカカラムによって精製した。粘性の固体が得られた。二ナトリウム樹脂を脱イオン水で３～４回洗浄した。化合物をイオン交換用のために樹脂カラムに装填した。化合物を迅速にすすぎ、所望の画分を回収し、凍結乾燥した。
化合物構造を以下に示す。
Figure 2022512471000091

Figure 2022512471000092

Figure 2022512471000093

Figure 2022512471000094

Figure 2022512471000095

Figure 2022512471000096
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７１２４）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２５ （ｄ， ２Ｈ）， ７．１５ （ｔ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４８（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．７３ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９３ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３８ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．７５ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ24Ｈ40ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４７０．２６， 実測値４７０．３．
ナトリウム３－（（（（１－（５－クロロフラン－２－イル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７２６１）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．５０ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．５２ （ｄ， １Ｈ）， ６．４１ （ｄ， １Ｈ）， ５．５５（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．０１ （ｑ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３２ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．８１ （ｑ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．６２ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ21Ｈ35ＣｌＮＯ6Ｓ）： 計算値４６４．１９， 実測値４６４．３．
ナトリウム３－（（（（１－（２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４８９）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２０ （ｓ， １Ｈ）， ７．１２ （ｔ， １Ｈ）， ６．９５ （ｄ， １Ｈ）， ６．６５ （ｄ， １Ｈ）， ５．４８（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ４．５ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．２０ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３６ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３８ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８０ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］（Ｃ24Ｈ40ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４８２．２６， 実測値４８２．５．
ナトリウム３－（（（（１－（クロマン－６－イル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４９０）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．１５ （ｔ， １Ｈ）， ６．９８ （ｍ， 重複， ２Ｈ）， ６．６５ （ｄ， １Ｈ）， ５．４８（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ４．１７ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．９１ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．７５ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３７ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８０ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］（Ｃ26Ｈ42ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４９６．２７， 実測値４９６．６．
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシ－２－メチルフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４８７）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２１ （ｄ， １Ｈ）， ７．１０ （ｔ， １Ｈ）， ６．７３ （ｄ， １Ｈ）， ６．６２ （ｓ， ｂｒ，１Ｈ）， ５．６１（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．６８ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９４ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３７ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３０ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］（Ｃ25Ｈ42ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４８４．２７， 実測値４８４．５．
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシ－３－メチルフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４８８）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．０－７．２ （ｍ， ３Ｈ）， ６．８３ （ｄ， １Ｈ）， ５．６３（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．６３ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９４ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３７ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．１２ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］（Ｃ25Ｈ42ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４８４．２７， 実測値４８４．５．
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシ－２，３－ジメチルフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４９１）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．３１ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ７．１１ （ｄ， １Ｈ）， ６．７３ （ｄ， １Ｈ）， ５．６７（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．７７ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９１ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３７ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．１９ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， ２．１２ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ26Ｈ44ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４９８．２９， 実測値４９８．５．
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシ－２，５－ジメチルフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４９３）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．１３ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ７．０ （ｓ， １Ｈ）， ６．６７ （ｓ， １Ｈ）， ５．６７（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．７３ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９５ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３５ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．２９ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， ２．１４ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．７９ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ26Ｈ44ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４９８．２９， 実測値４９８．５．
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシ－２，６－ジメチルフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４９４）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．１３ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．５１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．６７（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．６８ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９５ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３８ （ｍ， 重複， ８Ｈ， ２ＣＨ３＋ＣＨ２）， １．５－２．０ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ26Ｈ44ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４９８．２９， 実測値４９８．５．
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシ－２，３，６－トリメチルフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７６４０）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．１３ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．６１ （ｓ， １Ｈ）， ５．７２ （ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．７２ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９４ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３８ （ｍ， 重複， ５Ｈ， ＣＨ３＋ＣＨ２）， ２．２７ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， ２．０９ （ｓ， ３Ｈ， ＣＨ３）， １．５－２．０ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ27Ｈ46ＮＯ6Ｓ-）： 計算値５１２．３１， 実測値５１２．５．
ナトリウム３－（（（（１－（５－ブロモフラン－２－イル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４８４）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２５ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．５１ （ｄ， １Ｈ）， ６．４８ （ｄ， １Ｈ）， ５．５３ （ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ２．９７ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３２ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．８２ （ｑ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．６３ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ21Ｈ35ＢｒＮＯ6Ｓ）： 計算値５０８．１４， 実測値５０８．８．
ナトリウム３－（（（（１－（３，４－ジメトキシフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４８６）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２１ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．７－７．０ （ｍ， ３Ｈ）， ５．４８（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．７３ （ｍ， ６Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９３ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３８ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．７５ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ25Ｈ42ＮＯ7Ｓ-）： 計算値５００．６７， 実測値５００．３．
ナトリウム３－（（（（１－（４－メトキシフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７１２４）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２５ （ｄ， ２Ｈ）， ７．１５ （ｔ， １Ｈ）， ６．８２ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４８（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．７３ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．９３ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３８ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．７５ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ24Ｈ40ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４７０．２６， 実測値４７０．３．
ナトリウム３－（（（（１－（４－イソプロポキシフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン－１－スルホネート（７４９５）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２５ （ｄ， ２Ｈ）， ７．１８ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．８１ （ｄ， ２Ｈ）， ５．４８（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ４．６１ （ｍ， １Ｈ， ＣＨ）， ２．９３ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３９ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．７５ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ26Ｈ44ＮＯ6Ｓ-）： 計算値４９８．７０， 実測値４９８．５．
４－（（（（１－（４－メトキシフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（７３６５）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２５ （ｄ， ２Ｈ）， ６．８２ （ｄ， ２Ｈ）， ５．６７ （ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ４．８５ （ｓ， ｂｒ， １Ｈ）， ３．６９ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ３．２ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３８ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．７８ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ－Ｈ］ （Ｃ25Ｈ41ＮＯ５）： 計算値４３５．３， 実測値４３４．５．
（（（１－（４－メトキシフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）グルタミン酸（７３６６）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２１ （ｄ， ２Ｈ）， ６．８７ （ｄ， ２Ｈ）， ５．５－５．７ （ｍ， １Ｈ）， ４．１－４．３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６９ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， １．５－１．８ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８３ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ－］ （Ｃ26Ｈ41ＮＯ７）： 計算値４７９．３， 実測値４７８．５．
（（（１－（４－メトキシフェニル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アスパラギン酸（７３６７）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２５ （ｄ， ２Ｈ）， ６．８７ （ｄ， ２Ｈ）， ５．５－５．７ （ｍ， １Ｈ）， ４．６２ （ｍ， １Ｈ）， ３．８１ （ｓ， ３Ｈ， ＯＣＨ３）， ２．７－３．２ （ｍ， ２Ｈ）， １．５－２．０ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８３ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ－Ｈ］ （Ｃ25Ｈ39ＮＯ７）： 計算値４６５．２７， 実測値４６４．３．
４－（（（（１－（５－クロロフラン－２－イル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）ブタン酸（７４３７）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．２６ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．５２ （ｄ， １Ｈ）， ６．４３ （ｄ， １Ｈ）， ５．５５（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ２．９５ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．３７ （ｔ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．８１ （ｑ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．６３ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ22Ｈ36ＣｌＮＯ5）： 計算値４２９．２３， 実測値４２８．４．
４－（（（（１－（５－クロロフラン－２－イル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）グルタミン酸（７４３９）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．５３ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．５３ （ｄ， １Ｈ）， ６．４４ （ｄ， １Ｈ）， ５．５５（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ３．９１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２８ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．６－２．２ （ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ23Ｈ36ＣｌＮＯ7）： 計算値４７３．２２， 実測値４７２．４．
４－（（（（１－（５－クロロフラン－２－イル）トリデシル）オキシ）カルボニル）アミノ）アスパラギン酸（７４３８）。1Ｈ ＮＭＲ （ｄ6－ＤＭＳＯ， δ ｐｐｍ）： ７．５９ （ｔ， １Ｈ， ＮＨ）， ６．５３ （ｍ， １Ｈ）， ６．４４ （ｍ， １Ｈ）， ５．５５（ｔ， １Ｈ， ＣＨ）， ４．２１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５－２．８ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．７２ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．１－１．４ （ｍ， ＣＨ２， ２０Ｈ）， ０．８１ （ｔ， ＣＨ３， ３Ｈ）． ＭＳ （ｍ／ｅ） ［Ｍ-］ （Ｃ23Ｈ36ＣｌＮＯ7）： 計算値４５９．２２， 実測値４５８．４．
実施例２
ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤＃７１２４及び誘導体
本開示の熱不安定性小分子ポリメラーゼ阻害剤がホットスタート増幅を提供し得ることを実証するために、プラスミドＤＮＡからのＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子の１．５ｋｂ断片を増幅した。ホットスタート条件を用いて行った場合、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）は、より低い温度で阻害されたが、ＤＮＡを変性させるために温度を上昇させると（例えば、９５℃）、増幅の開始時に活性化され、増幅によっておよそ１．５ｋｂのサイズの単一の産物が得られた。非ホットスタート条件を用いて行った場合、ＤＮＡポリメラーゼはより低い温度で阻害されることはなく、増幅によって（他の二次生成物の中で）およそ４００ｂｐのサイズの産物が得られ、１．５ｋｂ断片は一時的に存在した。熱不安定性小分子ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）活性を阻害する能力を試験するため、増幅反応物を２２℃で１．５～６時間またはそれ以上インキュベートしてからＰＣＲ増幅を実施した。
増幅を室温で設定した。熱不安定性小分子ポリメラーゼ阻害剤（複数可）を滴定して反応させた（濃度は正確な化合物、阻害される酵素、界面活性剤の濃度、及びその他の緩衝液条件に依存する）。これらの実験のために、以下の組成物を使用した：１Ｘ ＧｏＴａｑ（登録商標）無色Ｆｌｅｘｉ緩衝液、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー、０．０２５Ｕ／μＬ ＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、５００ｐｇのプラスミドＤＮＡ、及びそれを２５μｌの反応物にするためのヌクレアーゼ非含有水。「小分子阻害剤なし」、「鋳型なし対照」（ＮＴＣ）、及び「能動ホットスタート」（抗体媒介ホットスタートでＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用）の対照反応を組み立てた。反応物を室温のサーマルサイクラーに挿入し、以下のサイクリングプロトコルを使用した：１サイクル（２２℃で１．５～６時間、９５℃で２分間）、３０サイクル（９３℃で１５秒、５４℃で３０秒、７２℃で１分間）、１サイクル（７２℃で５分間）、及び４℃の浸漬。サイクリングが完了したら、ＰＣＲ産物を分離し、１％アガロースゲル上で、臭化エチジウム染色及びＵＶ光照射によって可視化した。カメラを使用してゲルの画像を記録した。
予想されたように、ホットスタート対照反応（抗体媒介ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用）及びホットスタート能力を示す小分子阻害剤（複数可）との反応は、単一の１．５ｋｂ産物を増幅した。「小分子阻害剤なし対照」反応及びホットスタート能力を示さない小分子阻害剤（複数可）との反応では、４００ｂｐ産物が増幅された（他の二次産物及び１．５ｋｂ産物は存在する場合も存在しない場合もある）。「鋳型なし」対照では、増幅は生じなかった。
図１Ａ～図１Ｂは、本開示の２つの異なるポリメラーゼ阻害剤の一方（図１Ａは化合物＃７１２４、図１Ｂは化合物＃７２６１）のありまたはなしで実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応の増幅産物を評価するために使用したアガロースゲルの代表的な画像を含む。図１Ａは、示された様々な濃度の化合物＃７１２４を用いたホットスタートＰＣＲ増幅結果を含む。示されるように、化合物＃７１２４の使用により、非特異的ＤＮＡ増幅（約４００ｋｂ産物）が防止された一方で、所望のＤＮＡ標的（約１．５ｋｂ）の増幅が促進された。正確な濃度は、特定の反応条件及び試薬に応じて変化するが、促進された約１００μＭ～約１５０μＭの範囲の濃度での化合物＃７１２４の使用が有効であり、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が達成された。
図３は、化合物＃７１２４の誘導体である異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４８９及び化合物＃７４９０）を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応（プラスミドＤＮＡからのＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子標的の１．５ｋｂ断片を増幅）の結果の代表的な表を含む。示されるように、化合物＃７４８９の使用により、約７５μＭ～約１７５μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡ増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。化合物＃７４９０の使用により、約１００μＭ～約１２５μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡ増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。
図４は、化合物＃７１２４の誘導体である異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４８７及び化合物＃７４８８）を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応（プラスミドＤＮＡからのＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子標的の１．５ｋｂ断片を増幅）の結果の代表的な表を含む。示されるように、化合物＃７４８７の使用により、約７５μＭ～約１５０μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡの増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。化合物＃７４８８の使用により、約７５μＭ～約１００μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡ増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。
図５は、化合物＃７１２４の誘導体である異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４９１及び化合物＃７４９３）を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応（プラスミドＤＮＡからのＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子標的の１．５ｋｂ断片を増幅）の結果の代表的な表を含む。示されるように、化合物＃７４９１の使用により、約７５μＭ～約１２５μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡの増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。化合物＃７４９３の使用により、約１００μＭ～約１２５μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡ増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。
図６は、化合物＃７１２４の誘導体である異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４８６及び化合物＃７４９５）を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応（プラスミドＤＮＡからのＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子標的の１．５ｋｂ断片を増幅）の結果の代表的な表を含む。示されるように、化合物＃７４８６の使用により、約１２５μＭ～約１７５μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡの増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。化合物＃７４９５の使用により、約５０μＭ～約７５μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡ増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。
図２～６において、「ＨＳなし」は、非特異的産物の増幅を防止しなかった反応を示しており、「ＨＳ」は、非特異的産物の増幅を防止し特異的産物の増幅を促進した反応を示しており、「増幅なし」は、特異的産物の増幅も非特異的産物の増幅もないことを示している。増幅収率評価は、「＋＋」（ホットスタート対照に類似する良好な収率）、「＋」（中程度の収率）、及び「低」（低収率）として括弧内に示されている。
実施例３
ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤＃７２６１及び誘導体
ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤＃７２６１及びその誘導体の活性を試験するために、上記の実施例２で説明したのと同じ方法を使用した。図１Ｂは、示された様々な濃度の化合物＃７２６１を用いたホットスタートＰＣＲ増幅結果（プラスミドＤＮＡからのＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子標的の１．５ｋｂ断片を増幅）を含む。示されるように、化合物＃７２６１の使用により、非特異的ＤＮＡ増幅（約４００ｋｂ産物）が防止された一方で、所望のＤＮＡ標的（約１．５ｋｂ）の増幅が促進された。正確な濃度は、特定の反応条件及び試薬に応じて変化するが、促進された約７５μＭ～約１００μＭの範囲の濃度での化合物＃７２６１の使用が有効であり、所望のＤＮＡ標的を特異的に増幅する。
図２は、化合物＃７２６１の誘導体である異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７４３７、化合物＃７４３８、及び化合物＃７４３９）を用いて実施した様々なホットスタートＰＣＲ反応（プラスミドＤＮＡからのＣｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ ｏｍｅｇａ遺伝子標的の１．５ｋｂ断片を増幅）の結果の代表的な表を含む。示されるように、化合物＃７４３７の使用により、約１００μＭ～約１５０μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡの増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。化合物＃７４３８の使用により、約２５μＭ～約２００μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡ増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。化合物＃７４３９の使用により、約５０μＭ～約２２５μＭの範囲の濃度で、非特異的ＤＮＡ増幅が防止され、所望のＤＮＡ標的の特異的増幅が促進された。詳細には、ＤＮＡポリメラーゼ＃７２６１阻害剤の効力は、＃７４３８及び＃７４３９に対し約７５μＭから約２５μＭ～約１５０μＭまたはそれ以上に増強された。
実施例４
異なる温度におけるポリメラーゼ不活性化の評価
活性アッセイを使用して、特異的反応条件における小分子ポリメラーゼ阻害剤の濃度を試験して阻害有効性を決定した。対応するＩＣ50値も化合物に対し決定した。また、活性アッセイは、化合物によって反応が阻害される温度または温度範囲を試験するためにも使用した。
例示的な活性アッセイは、様々な方法に従って行うことができる。例えば、放射能取込みをモニタリングするＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイでは、「活性化された」仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡがＤＮＡ基質として使用される。ＤＮＡ基質と共に、反応物は、最小限として緩衝液（例えば、ＧｏＴａｑ（登録商標）緩衝液）、マグネシウム、ｄＮＴＰ、及びポリメラーゼを含む。反応を停止し、ＤＮＡを氷冷したＴＣＡ（トリクロロ酢酸）によって沈殿させ、氷上で少なくとも１０分間インキュベートし、ＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、沈殿可能なＤＮＡ（フィルター上）への放射能取込みをシンチレーションカウンティングによって測定した。（例えば、Ａｐｏｓｐｉａｎ ＆ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ．（１９６２）ＪＢＣ ２３７：５１９－５２５．、Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ｂａｃｔ．１２７：１５５０－１５５７を参照。）
放射能取込みをモニタリングするプライマー伸長ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイでは、１本鎖ＤＮＡ（例えば、Ｍ１３）及びプライマー基質をＤＮＡ基質として使用した。プライマー及び鋳型をアニーリングした。反応物は、最小限として緩衝液（例えば、ＧｏＴａｑ（登録商標）緩衝液）、マグネシウム、ｄＮＴＰ、及びポリメラーゼを含む。反応を停止し、ＤＮＡを氷冷したＴＣＡによって沈殿させ、氷上で少なくとも１０分間インキュベートし、ＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、フィルター上の沈殿可能なＤＮＡへの放射能取込みをシンチレーションカウンティングによって測定した。（例えば、Ｌｏｎｇｌｅｙ ＆ Ｍｏｓｂａｕｇｈ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：２６５５－２６６４を参照。）
図７は、２２℃で行われ、阻害剤（すなわち、化合物＃７１２４）を滴定するポリメラーゼ活性アッセイを表したものを含む。図７は、ＩＣ50が決定され得る活性アッセイの例である。化合物７１２４は、低濃度ではＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを阻害しなかったが、濃度が増加するにつれて阻害が開始し、最終的には１００％阻害に達する。このグラフから、ＩＣ50を１５０μＭと計算した。これらの実験では、活性化仔ウシ胸腺ＤＮＡ活性アッセイを使用した。これに類似したアッセイを使用して、酵素阻害が生じる他の条件（例えば、温度、緩衝液条件、及び様々なＤＮＡポリメラーゼ）を決定することができる。
図８は、２２℃でインキュベートしたときの異なるポリメラーゼ阻害剤（すなわち、化合物＃７１２４、化合物＃７１２６、化合物＃７１２７、化合物＃７１２３、化合物＃７１２５、化合物＃６９６６、及びＳＤＳ）に対するＩＣ50値の結果の代表的な表を含む。図８は、様々な化合物に対するＩＣ50情報の例である。ＩＣ50値を決定するために、図７で実施したものと同様の実験を行った。これらの実験では、活性化仔ウシＤＮＡ法を使用した。
実施例５
温度による酵素の活性化の評価
活性化温度及び活性が回復したときの時間を試験するため、活性アッセイ反応を、小分子ポリメラーゼ阻害剤のありまたはなしで組み立てることができる（さらに上記で説明の通り）。反応は、一定時間にわたり低温（例えば、２２℃または３７℃）で開始する。反応の温度を高温（例えば、９０℃超）まで上昇させ、所与の時間にわたりインキュベートして、酵素活性化を可能にすることができる。反応温度を６８～７９℃まで低下させ、１５分にわたりインキュベートすることができる。反応を停止し、試料を処理し、活性を計算して、回復され得る酵素活性の量を決定することができる。
これらの方法に従い、ＰＣＲを使用して、ポリメラーゼ酵素の活性化を試験し、例えば、最初の変性ステップ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｍｅｇａ遺伝子、またはヒトゲノムＤＮＡからの標的）の温度及び時間を調整することにより、各小分子阻害剤における最も有効な条件を決定することができる。
実施例６
リアルタイム阻害及び活性化条件
本開示の方法によれば、リアルタイム伸長速度活性アッセイ法を用いて実験を行い、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド取込みを測定することもできる。例えば、プライマー伸長アッセイは、非共有結合ＤＮＡ色素（例えば、ＢＲＹＴ（商標）ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）及びオリゴヌクレオチドＤＮＡ基質を用いたリアルタイムＰＣＲ装置上で伸長がモニタリングされるプロセスを含むことができる。（例えば、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＆ Ｗｉｔｔｗｅｒ（２０１４），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０（２）：３３４－３４０を参照）。活性アッセイ反応を、小分子ポリメラーゼ阻害剤のありまたはなしで組み立てることができる。反応は、最小限として緩衝液（例えば、ＧｏＴａｑ（登録商標）緩衝液）、マグネシウム、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ基質、及びポリメラーゼを含む。
アッセイの１つの実施形態において、反応をモニタリングして酵素の活性化が開始する温度を決定することができる。反応を低温（例えば、２２℃、３７℃、５５℃など）から高温（６８℃、７２℃、７９℃など）で所与の時間にわたりインキュベートしながら伸長速度を測定してポリメラーゼの阻害を評価することができる。
アッセイの別の実施形態において、活性化に必要な温度及び時間を調べることができる。反応を一定時間にわたり低温（例えば、２２℃または３７℃）でインキュベートしながら活性をモニタリングすることができる。反応の温度を高温（例えば、９０℃超）まで上昇させ、所与の時間にわたりインキュベートして、酵素の活性化を試みることができる。次いで、反応温度を６８～７９℃まで低下させ、標準活性アッセイと同様にインキュベートして、回復した酵素活性を測定することができる。
実施例７
ＤＮＡポリメラーゼに関連するヌクレアーゼ活性の阻害に関する化合物の評価
多くのＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレアーゼ活性を有する関連ドメインを有する（例えば、Ｔａｑは５’ヌクレアーゼを有し、Ｐｆｕは３’→５’校正ヌクレアーゼを有する）。５’ヌクレアーゼ活性及び３’→５’ヌクレアーゼ活性の両方が、ＰＣＲにとって問題となり得る。例えば、適切な構造が設定中の反応でＤＮＡと共に形成される場合、５’ヌクレアーゼ活性がプライマーの５’末端上の色素を除去することがある。また、例えば、３’→５’ヌクレアーゼ活性が、設定中の反応でプライマー及び鋳型を分解することもある。これらの厄介な副反応も、本開示の小分子ポリメラーゼ阻害剤によって阻害され得る。
本開示の小分子ポリメラーゼ阻害剤がヌクレアーゼ活性を阻害する能力について試験するために、５’蛍光色素標識分岐二重鎖ＤＮＡ基質を用いて（Ｔａｑなどの酵素についての）５’ヌクレアーゼ活性アッセイを実施することができる。（例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７７８－７８３．、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ（１９９９）ＰＮＡＳ ９６：６１４３－６１４８．、Ｃｅｓｋａ ＆ Ｓａｙｅｒｓ（１９９８）ＴＩＢＳ：３３１－３３６を参照。） ＤＮＡ基質をアニールし、緩衝液（例えば、ＧｏＴａｑ（登録商標）緩衝液）、マグネシウム、及びヌクレアーゼまたはヌクレアーゼドメインを有するポリメラーゼを含む反応構成要素と組み合わせることができる。反応はＥＤＴＡで停止し、キャピラリー電気泳動装置で行って、切断されたＤＮＡ基質及び切断されていないＤＮＡ基質の量を決定することができる。
加えて、３’－放射性標識二重鎖ＤＮＡを基質として用いて、（Ｐｆｕなどの校正ポリメラーゼに対して）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性アッセイを実施することができる。ＤＮＡ基質は、緩衝液（例えば、ＧｏＴａｑ（登録商標）緩衝液）、マグネシウム、及びヌクレアーゼまたはヌクレアーゼドメインを有するポリメラーゼを含む反応構成要素と組み合わせることができる。反応はＥＤＴＡによって停止することができ、ＤＮＡは氷冷ＴＣＡによって沈殿させ、氷上で少なくとも１０分にわたりインキュベートすることができる。沈殿可能なＤＮＡは遠心分離によってペレット化することができ、放射性標識された３’末端から放出された沈殿不可能なＤＮＡはシンチレーションカウンティングによって測定することができる。（例えば、Ｃｈａｓｅ ＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．（１９７４）ＪＢＣ ２４９：４５４５－４５５２．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｐｐ．１０．５１－５２を参照。）
実施例８
方法の変形形態
本開示に基づいて当業者に理解されるであろうように、本開示の小分子ポリメラーゼ阻害剤は、限定されるものではないが、リガーゼ、逆転写酵素、及びＲＮアーゼＨなどの他の酵素の活性、または関連ドメインの活性を阻害するために使用することができる。これらの酵素の活性は、ＰＣＲ法、ｒｔＰＣＲ法、またはその他のＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法の文脈で調べることができる。
以上の発明を実施するための形態及び付随する実施例は、単に例示的なものであり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるものではないことが理解される。本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義される。
本開示の実施形態に対する様々な変更及び改変が当業者には明白であろう。そのような変更及び改変（限定されるものではないが、本発明における化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関する変更及び改変を含む）は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。

Claims (68)

  1. 式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2022512471000097
    （Ｉ）
    またはその塩
    （式中、
    Ａは、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルから選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
    Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
    Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
    ｎは、１または２である）。
  2. Ａが、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである、請求項１に記載の化合物、またはその塩。
  3. Ａが、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである、請求項１に記載の化合物、またはその塩。
  4. Ａが、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である、請求項１に記載の化合物、またはその塩。
  5. Ａが、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される、請求項４に記載の化合物、またはその塩。
  6. Ｒ1がＣ8－Ｃ14アルキルである、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。
  7. Ｒ1がＣ12アルキルである、請求項６に記載の化合物、またはその塩。
  8. Ｒ2が水素である、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  9. Ｒ2が－ＣＯＯＨである、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  10. ｎが１である、請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  11. ｎが２である、請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩。
  12. 前記化合物がアルカリ金属塩の形態をとる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物。
  13. 前記化合物が、
    Figure 2022512471000098

    Figure 2022512471000099

    Figure 2022512471000100

    Figure 2022512471000101

    Figure 2022512471000102

    Figure 2022512471000103
    及び
    Figure 2022512471000104

    Figure 2022512471000105
    から選択される、請求項１に記載の化合物。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物と、ＤＮＡポリメラーゼとを含む、組成物。
  15. 前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｃａ、Ｔｆｕ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｌｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４、またはこれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記化合物が前記ＤＮＡポリメラーゼに結合している、請求項１４に記載の組成物。
  18. 前記化合物が前記ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する、請求項１７に記載の組成物。
  19. １つ以上の核酸増幅試薬をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  20. 前記１つ以上の増幅試薬が、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、オリゴヌクレオチドプライマー、及び核酸鋳型からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物と、１つ以上の核酸増幅試薬とを含む、組成物。
  22. 前記１つ以上の増幅試薬が、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、オリゴヌクレオチドプライマー、及び核酸鋳型からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2022512471000106
    （ＩＩ）
    またはその塩
    （式中、
    Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
    Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
    Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
    ｎは、１または２であり、
    Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）と、
    １つ以上の核酸増幅試薬と
    を含む、組成物。
  24. Ａが、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである、請求項２３に記載の組成物。
  25. Ａが、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである、請求項２３に記載の組成物。
  26. Ａが、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である、請求項２３に記載の組成物。
  27. Ａが、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される、請求項２６に記載の組成物。
  28. Ｒ1がＣ8－Ｃ14アルキルである、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  29. Ｒ1がＣ12アルキルである、請求項２８に記載の組成物。
  30. Ｒ2が水素である、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の組成物。
  31. Ｒ2が－ＣＯＯＨである、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の組成物。
  32. ｎが１である、請求項２３～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. ｎが２である、請求項２３～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  34. Ｒ3が－ＣＯＯＨである、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の組成物、またはその塩。
  35. Ｒ3が－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘはナトリウムカチオンである）である、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の組成物、またはその塩。
  36. 前記化合物がアルカリ金属塩の形態をとる、請求項２３～３５のいずれか１項に記載の組成物。
  37. 式（ＩＩ）の前記化合物が、
    Figure 2022512471000107

    Figure 2022512471000108

    Figure 2022512471000109

    Figure 2022512471000110

    Figure 2022512471000111

    Figure 2022512471000112

    Figure 2022512471000113

    Figure 2022512471000114

    Figure 2022512471000115

    Figure 2022512471000116

    Figure 2022512471000117

    Figure 2022512471000118

    Figure 2022512471000119

    Figure 2022512471000120

    Figure 2022512471000121

    Figure 2022512471000122

    Figure 2022512471000123

    Figure 2022512471000124

    Figure 2022512471000125

    Figure 2022512471000126
    及び
    Figure 2022512471000127
    から選択される、請求項２３に記載の組成物。
  38. 前記１つ以上の増幅試薬が、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、オリゴヌクレオチドプライマー、及び核酸鋳型からなる群より選択される、請求項２３～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  39. ポリメラーゼ活性を温度依存的に阻害する方法であって、ＤＮＡポリメラーゼを式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2022512471000128
    （ＩＩ）
    またはその塩
    （式中、
    Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
    Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
    Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
    ｎは、１または２であり、
    Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）
    に接触させることを含む、前記方法。
  40. Ａが、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、３、もしくは４個の置換基で置換された、フェニルである、請求項３９に記載の方法。
  41. Ａが、置換されていない、またはＣ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4アルコキシ、及びハロから独立的に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換された、５員または６員単環式ヘテロアリールである、請求項３９に記載の方法。
  42. Ａが、置換されていない２環式ヘテロシクリル基である、請求項３９に記載の方法。
  43. Ａが、２，３－ジヒドロベンゾフラニル及びクロマニルから選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. Ｒ1がＣ8－Ｃ14アルキルである、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. Ｒ1がＣ12アルキルである、請求項４４に記載の方法。
  46. Ｒ2が水素である、請求項３９～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. Ｒ2が－ＣＯＯＨである、請求項３９～４５のいずれか１項に記載の方法。
  48. ｎが１である、請求項３９～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. ｎが２である、請求項３９～４７のいずれか１項に記載の方法。
  50. Ｒ3が－ＣＯＯＨである、請求項３９～４９のいずれか１項に記載の方法、またはその塩。
  51. Ｒ3が－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘはナトリウムカチオンである）である、請求項３９～４９のいずれか１項に記載の方法、またはその塩。
  52. 前記化合物がアルカリ金属塩の形態をとる、請求項３９～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 式（ＩＩ）の前記化合物が、
    Figure 2022512471000129

    Figure 2022512471000130

    Figure 2022512471000131

    Figure 2022512471000132

    Figure 2022512471000133

    Figure 2022512471000134

    Figure 2022512471000135

    Figure 2022512471000136

    Figure 2022512471000137

    Figure 2022512471000138

    Figure 2022512471000139

    Figure 2022512471000140

    Figure 2022512471000141

    Figure 2022512471000142

    Figure 2022512471000143

    Figure 2022512471000144

    Figure 2022512471000145

    Figure 2022512471000146

    Figure 2022512471000147

    Figure 2022512471000148
    及び
    Figure 2022512471000149
    から選択される、請求項３９に記載の方法。
  54. 前記ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３９～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｃａ、Ｔｆｕ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｌｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４、またはこれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体からなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. 阻害されたポリメラーゼを活性化する方法であって、式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2022512471000150
    （ＩＩ）
    またはその塩
    （式中、
    Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
    Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
    Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
    ｎは、１または２であり、
    Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）
    によって阻害されたＤＮＡポリメラーゼを曝露することと、
    温度を８０℃超に加熱して前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化することとを含む、前記方法。
  57. 前記化合物が、式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2022512471000151
    （Ｉ）
    またはその塩
    （式中、
    Ａは、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルから選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
    Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
    Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
    ｎは、１または２である）
    である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５６または５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｃａ、Ｔｆｕ、Ｔｂｒ、Ｔｔｈ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｔｌｉ、Ｔｆｌ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｂｓｔ、Ｐｈｏ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、ＥＳ４、またはこれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体からなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記温度が９０℃超である、請求項５６～５９のか１項に記載の方法。
  61. 核酸を増幅する方法であって、
    （ａ）増幅試薬及び核酸鋳型を、式（ＩＩ）の化合物：
    Figure 2022512471000152
    （ＩＩ）
    またはその塩
    （式中、
    Ａは、単環式もしくは２環式アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基から選択され、これらの各々は、任意選択で、１、２、または３個の置換基で置換されていてもよく、
    Ｒ1は、Ｃ6－Ｃ20アルキルであり、
    Ｒ2は、水素及び－ＣＯＯＨから選択され、
    ｎは、１または２であり、
    Ｒ3は、－ＣＯＯＨ及び－ＳＯ3Ｘ（式中、Ｘは、水素、アルカリ金属カチオン、及びアンモニウムカチオンから選択される）から選択される）
    によって阻害されたＤＮＡポリメラーゼに添加することと、
    （ｂ）温度を少なくとも８０℃に加熱して前記ＤＮＡポリメラーゼを活性化することと、
    （ｃ）前記増幅試薬及び核酸鋳型にとって適切な時間及び温度の熱サイクルプロトコルによって実行すること
    とを含む、前記方法。
  62. 前記増幅試薬が、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2またはＭｇＳＯ4）、及びオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記増幅試薬が、前記核酸鋳型上の標的に対する順方向及び逆方向プライマーを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、９０℃超の温度に加熱することによって活性化される、請求項６１に記載の方法。
  65. 前記熱サイクルプロトコルが、（ｉ）高温変性ステップ、（ｉｉ）低温アニーリングステップ、及び（ｉｉｉ）中温伸長ステップの３つの温度サイクルを含み、５回以上連続して繰り返される、請求項６１に記載の方法。
  66. 前記変性、アニーリング、及び伸長のステップが２０回以上連続して繰り返される、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記熱サイクルプロトコルが、高温変性ステップ、中温／低温アニーリング／伸長ステップの２つの温度サイクルを含み、５回以上連続して繰り返される、請求項６１に記載の方法。
  68. 前記変性及びアニーリング／伸長のステップが２０回以上連続して繰り返される、請求項６７に記載の方法。
JP2021532981A 2018-12-12 2019-12-12 ポリメラーゼ阻害剤ならびに関連する組成物及び方法 Active JP7474257B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862778590P 2018-12-12 2018-12-12
US62/778,590 2018-12-12
PCT/US2019/065955 WO2020123792A1 (en) 2018-12-12 2019-12-12 Polymerase inhibitors and related compositions and methods

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2022512471A true JP2022512471A (ja) 2022-02-04
JPWO2020123792A5 JPWO2020123792A5 (ja) 2022-12-20
JP7474257B2 JP7474257B2 (ja) 2024-04-24

Family

ID=69174582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021532981A Active JP7474257B2 (ja) 2018-12-12 2019-12-12 ポリメラーゼ阻害剤ならびに関連する組成物及び方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US11524946B2 (ja)
EP (1) EP3894597B1 (ja)
JP (1) JP7474257B2 (ja)
WO (1) WO2020123792A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7474257B2 (ja) * 2018-12-12 2024-04-24 プロメガ コーポレイション ポリメラーゼ阻害剤ならびに関連する組成物及び方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2584027B1 (en) 2007-10-11 2015-12-30 Promega Corporation Cleavable surfactants
JP2013194050A (ja) 2012-03-23 2013-09-30 Kobe Gakuin Ｄｎａポリメラーゼ阻害活性を有する新規化合物
JP7474257B2 (ja) * 2018-12-12 2024-04-24 プロメガ コーポレイション ポリメラーゼ阻害剤ならびに関連する組成物及び方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20200199088A1 (en) 2020-06-25
US20230097403A1 (en) 2023-03-30
EP3894597A1 (en) 2021-10-20
US11524946B2 (en) 2022-12-13
WO2020123792A1 (en) 2020-06-18
JP7474257B2 (ja) 2024-04-24
US11939310B2 (en) 2024-03-26
EP3894597B1 (en) 2022-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2365135C (en) Method for amplifying nucleic acid sequence
JP5985503B2 (ja) 定量的増幅のためのユニバーサルリファレンス色素
CN103172700B (zh) 经由镁螯合的pcr热启动
JPH02500804A (ja) 望ましくない交差反応を排除するためにオリゴヌクレオチドを使用するポリヌクレオチドの検定法
WO2005111209A1 (ja) 高速dnaポリメラーゼを用いた高速pcr
US11939310B2 (en) Polymerase inhibitors and related compositions and methods
KR20130022437A (ko) 광분해성 화합물을 사용한, 비특이적 증폭의 감소를 위한 신규한 ｐｃｒ 방법
CN109477111B (zh) 热稳定聚合酶抑制剂组合物和方法
EP1806400B1 (en) Inactivation method
US20220064710A1 (en) Nucleic acid modifying reagents and uses thereof
CN109831913B (zh) 用于可逆地保护生物分子的试剂
US9222127B2 (en) Compositions and methods for the protection of nucleophilic groups
JPH1175847A (ja) 超好熱始原菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１ 株由来ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル 抗体を利用した核酸増幅法
WO2023177976A2 (en) Nucleic acid crosslinking reagents and uses thereof
US20230143626A1 (en) Fast and robust bi-functional mutants of taq dna polymerase
JP2003259882A (ja) 改良されたｐｃｒ用の試薬
JP2023113514A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド
JP2023113515A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド
Sood et al. Polymerase Chain Reaction-The DNA Copying Machine
US20130065776A1 (en) Selective enrichment of non-methylated nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221212

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221212

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20231129

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231204

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240304

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240314

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240412

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7474257

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150