JP2022511214A - コルヒチン誘導体の方法と使用 - Google Patents

コルヒチン誘導体の方法と使用 Download PDF

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Abstract

炎症の治療のためのコルヒチン誘導体、方法及びその使用。特定の実施形態において、コルヒチン誘導体は、式Ｉの化合物である。（Ｉ）JPEG2022511214000070.jpg8779

Description

本願は、一般に、コルヒチン誘導体、その方法及び使用に関する。
炎症状態は世界中の何百万もの人々に影響を及ぼしており、標的分子医学はこの分野でより安全でより効果的な薬物と治療法を開発することを目的としている。コルヒチンは、炎症に関与する分子経路を標的とすることができるため、炎症性疾患の治療に広く使用されている抗有糸分裂剤である。たとえば、乾癬性関節炎(P. Seidemann, B. Fjellner, A. Johannesson, J. Rheumatol. 14 (1987) 777-779)及び白血球-細胞破砕性血管炎(J.P. Callen, J. Am. Acad. Dermatol. 13 (1987) 193-200)の治療において有益な効果が報告された。さらに、最近の研究では、コルヒチンが白血球-内皮細胞接着(S.J. Rosenman, A.A. Ganji, W.M. Gallatin, F.A.S.E.B. J. 5 (1991)1603-1609)及びＴ細胞活性化(Y.A. Mekory, D. Baram, A. Goldberg, A. Klajman, Cell. Immunol. 120 (1989) 330-340)を細胞内チューブリンモノマーに結合することにより阻害し、それらの重合を防止することが示されている(G.O. Borisy, E.W. Taylor, J. Cell. Biol. 34 (1967) 533-548)。
コルヒチンの一般的な用途は、痛風と家族性地中海熱（ＦＭＦ）の治療である。実際、FMFの患者は通常、生涯にわたるコルヒチン療法を受けている。しかし、コルヒチンの使用は、有効性と治療を制限する副作用との間の治療指数が低いため、依然として困難である。
したがって、薬物の開発、並びに上記の不利な点の少なくとも１つを回避又は軽減する、又は有用な代替物を提供するその使用及び／又は使用方法の必要性が存在する。
一態様では、式Ｉの化合物、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせが提供される：
Figure 2022511214000002
ここで、ＺはＯ又はＳである；Ｘ１は、置換又は非置換の炭化水素基、又は置換又は非置換の不均一基から選択される。Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換炭化水素基、置換又は非置換不均一基、置換又は非置換炭素環式基、置換又は非置換複素環基、置換又は非置換芳香族基、又は置換又は非置換複素芳香族基から独立して選択される。
別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換芳香族基、置換又は非置換複素芳香族基、置換又は非置換炭素環式基、又は置換又は非置換の複素環式基から独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ハロアルキル、置換又は非置換ヒドロキシアルキル、置換又は非置換シアノアルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキルカルボニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換シクロアルケニル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルケニル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換アルキルアリール、置換又は非置換アルキルヘテロアリール、アルキレン‐Ｏ‐アルキル、アルキレン‐Ｏ‐シクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐ヘテロシクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐シクロアルキル、又はアルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐ヘテロシクロアルキルから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキル、置換又は非置換のＣ２‐Ｃ６アルケニル、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１‐Ｃ６アルキレン‐Ｏ‐アルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルアリール、又は置換又は非置換アルキルヘテロアリールから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、又は置換又は非置換アルキルアリールから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換アルキル、又は置換又は非置換アルキルアリールから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換のアルキルから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、メチル、エチル又はプロピルから独立して選択される。別の態様では、Ｒ２はメチルである。別の態様では、Ｒ３はエチル又はプロピルである。
別の態様では、Ｘ１は、置換又は非置換の炭化水素基である。別の態様では、Ｘ１は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、又は置換又は非置換アルキニルから選択される。別の態様では、Ｘ１は、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから選択される。別の態様では、Ｘ１は、非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから選択される。別の態様では、Ｘ１はメチル又はエチルから選択される。別の態様では、Ｘ１はメチルである。別の態様では、Ｘ１はＯＲ１０であり、Ｒ１０は、置換又は非置換の炭化水素基、又は置換又は非置換の不均一基から選択される。別の態様では、Ｒ１０は、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換芳香族基、置換又は非置換複素芳香族基、置換又は非置換炭素環式基、又は置換又は非置換の複素環式基から選択される。別の態様では、Ｒ１０は、置換又は非置換アルキル、ＣＨ２ＯＨ、置換又は非置換ハロアルキル、置換又は非置換ヒドロキシアルキル、置換又は非置換シアノアルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換シクロアルケニル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルケニル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換アルキルアリール、置換又は非置換アルキルヘテロアリール、アルキレン‐Ｏ‐アルキル、アルキレン‐Ｏ‐シクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐ヘテロシクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐シクロアルキル、又はアルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐ヘテロシクロアルキルから選択される。別の態様では、Ｒ１０は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、又は置換又は非置換アルキニルから選択される。別の態様では、Ｒ１０は、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキル、又は置換又は非置換のＣ２‐Ｃ６アルケニル、又はＣ２‐Ｃ６アルキニルから選択される。別の態様では、Ｒ１０は、置換又は非置換のアルキルから選択される。別の態様では、Ｒ１０は、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから選択される。別の態様では、Ｒ１０は、非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから選択される。別の態様では、Ｒ１０はメチル又はエチルから選択される。別の態様では、Ｒ１０はメチルである。
別の態様では、Ｘ１は、置換又は非置換の不均一基である。
別の態様では、Ｘ１は、‐ＣＲ４Ｒ５Ｒ６から選択され、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ、Ｈ、置換又は非置換炭化水素基、又は置換又は非置換不均一基から独立して選択される。別の態様では、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６はそれぞれ、置換又は非置換のアミド基から独立して選択される。別の態様では、Ｒ４及びＲ５はそれぞれＨ又は置換又は非置換アルキルから独立して選択され、Ｒ６は‐ＮＲ（ＣＯ）ＣＲ７Ｒ８Ｒ９であり、ＲはＨ及び置換又は非置換アルキルから選択され、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９はそれぞれ、Ｈ、ハロ基、置換又は非置換アルキルから選択される。別の態様では、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、フルオロ基から選択することができる。別の態様では、Ｘ１は‐ＣＨ２ＮＨ（ＣＯ）ＣＦ３である。
別の態様では、ＺはＯである。別の態様では、ＺはＳである。別の態様では、化合物は
Figure 2022511214000003
、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、化合物は
Figure 2022511214000004
、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、化合物は、
Figure 2022511214000005
、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、化合物は
Figure 2022511214000006
、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、化合物は
Figure 2022511214000007
、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、化合物は
Figure 2022511214000008
、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである。
別の態様では、化合物は、式Ｉ及び／又はその薬学的に許容される塩である。別の態様では、Ｃ７での配置はＳ配置である。別の態様では、化合物は、コルヒチン結合部位でβ‐チューブリンに結合する。別の態様では、β‐チューブリンは、β‐ＶＩ、β‐Ｖ、及び／又はβ‐Ｉである。別の態様では、β‐チューブリンはβ‐ＶＩである。別の態様では、化合物は、コルヒチンの結合エネルギーよりも小さい結合エネルギーを有する。別の態様では、化合物はコルヒチンよりも毒性が低い。別の態様では、化合物は、コルヒチンと比較して、より特異的に好中球を標的とする。別の態様では、化合物は、コルヒチンよりも低用量で細胞内カルシウム濃度の増加を抑制する。別の態様では、化合物は、コルヒチンよりも少なくとも約１０倍低い（約１０分の１の）用量で細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する。別の態様では、化合物は、コルヒチンの用量よりも約１０倍から約１００倍低い（約１０分の１から約１００分の１の）用量で細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する。別の態様では、化合物は、約０．１μＭの用量で細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する。別の態様では、化合物は、コルヒチンよりも低用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する。別の態様では、化合物は、コルヒチンよりも少なくとも約１０倍低い（約１０分の１の）用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する。別の態様では、化合物は、コルヒチンの用量よりも約１０倍から約１００倍低い（約１０分の１から約１００分の１の）用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する。別の態様では、化合物は、約０．１μＭの用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する。別の態様では、炎症性メディエーターは、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１、スーパーオキシド、又はそれらの組み合わせから選択される。別の態様では、化合物は、細胞内カルシウム濃度及び炎症性メディエーター産生の少なくとも１つの阻害に関して単調又は非単調の用量反応を示す。別の態様では、炎症性メディエーターは、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１、スーパーオキシド産生、又はそれらの組み合わせから選択される。別の態様では、化合物は白血球の動員を阻害する。
別の態様では、炎症の治療のために本明細書に記載の化合物が提供される。別の態様では、炎症は、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される。別の態様では、炎症は、好中球によって引き起こされる炎症を含む。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、心血管疾患に関連している。別の態様では、心血管疾患は冠状動脈アテローム性動脈硬化症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は痛風に関連している。
別の態様では、痛風の治療のために本明細書に記載の化合物が提供される。別の態様では、化合物は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）によって誘発される炎症に応答して免疫機能に対して阻害効果を有する。別の態様では、免疫機能に対する阻害効果は、細胞内カルシウム産生、ＩＬ‐１産生、ＩＬ‐８産生、スーパーオキシド産生、又はそれらの組み合わせから選択されるメディエーターを介してもたらされる。別の態様では、免疫機能は好中球に関するものである。別の態様では、阻害効果は、コルヒチンのそれよりも強力である。別の態様では、阻害効果は、コルヒチンのそれより少なくとも約１０倍大きい。別の態様では、阻害効果は約０．１μＭの濃度で生じる。別の態様では、心血管疾患の治療のために本明細書に記載の化合物が提供される。別の態様では、心血管疾患は冠状動脈アテローム性動脈硬化症である。
別の態様では、本明細書に記載の化合物を含む医薬組成物が提供される。別の態様では、組成物は、抗痛風剤をさらに含む。別の態様では、抗痛風剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、関節内糖質コルチコイド、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、組換え非ヒトウリカーゼ酵素、尿酸排泄促進剤、尿酸排泄剤、又はそれらの組み合わせから選択される。別の態様では、少なくとも１つの薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに含む。別の態様では、組成物は、本明細書に記載の２つ以上の化合物を含む。別の態様では、炎症の治療のために本明細書に記載の化合物を含む医薬組成物が提供される。別の態様では、炎症は、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される。別の態様では、炎症は、好中球によって引き起こされる炎症を含む。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、心血管疾患に関連している。別の態様では、心血管疾患は冠状動脈アテローム性動脈硬化症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は痛風に関連している。別の態様では、痛風の治療のために本明細書に記載の化合物を含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、哺乳動物の炎症を治療するための方法が提供され、これは、本明細書に記載の治療有効量の化合物を哺乳動物に投与することを含む。別の態様では、本明細書に記載の２つ以上の化合物が存在する。別の態様では、化合物が経口的及び／又は非経口的に投与される。別の態様では、化合物が静脈内及び／又は腹腔内に投与される。別の態様では、本明細書に記載の治療有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の炎症を治療するための方法が提供される。別の態様では、組成物は経口的及び／又は非経口的に投与される。別の態様では、組成物は、静脈内及び／又は腹腔内に投与される。別の態様では、炎症は、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される。別の態様では、炎症は、好中球によって引き起こされる炎症を含む。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、心血管疾患に関連している。別の態様では、心血管疾患は冠状動脈アテローム性動脈硬化症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は痛風に関連している。別の態様では、哺乳動物はヒトである。
別の態様では、哺乳動物の炎症の治療のために、治療有効量の本明細書に記載の化合物の使用が提供される。別の態様では、本明細書に記載の２つ以上の化合物が存在する。別の態様では、化合物は経口的及び／又は非経口的に投与可能である。別の態様では、化合物は、静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である。別の態様では、哺乳動物の炎症の治療のために、本明細書に記載の治療有効量の組成物の使用が提供される。別の態様では、組成物は経口的及び／又は非経口的に投与可能である。別の態様では、組成物は、静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である。別の態様では、炎症は、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される。別の態様では、炎症は、好中球によって引き起こされる炎症を含む。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は、心血管疾患に関連している。別の態様では、心血管疾患は冠状動脈アテローム性動脈硬化症である。別の態様では、好中球によって引き起こされる炎症は痛風に関連している。別の態様では、哺乳動物はヒトである。
別の態様では、哺乳動物において痛風を治療するための方法が提供され、これは、本明細書に記載の化合物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む。別の態様では、本明細書に記載の２つ以上の化合物が存在する。別の態様では、化合物が経口的及び／又は非経口的に投与される。別の態様では、化合物が静脈内及び／又は腹腔内に投与される。別の態様では、本明細書に記載の治療有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の痛風を治療するための方法が提供される。別の態様では、組成物は経口的及び／又は非経口的に投与される。別の態様では、組成物は、静脈内及び／又は腹腔内に投与される。別の態様では、哺乳動物はヒトである。別の態様では、痛風は、慢性痛風及び／又は急性痛風から選択される。別の態様では、痛風の治療は、少なくとも１つの痛風症状の治療を含む。別の態様では、前記少なくとも１つの痛風症状は、痛風発作、痛風結節形成、痛風関節炎、痛風関連炎症、及び／又は痛風に関連する関節破壊から選択される。別の態様では、前記少なくとも１つの痛風症状は、痛風炎症及び／又は炎症に関連する痛みから選択される。
別の態様では、哺乳動物の痛風の治療のために、治療有効量の本明細書に記載の化合物の使用が提供される。別の態様では、本明細書に記載の２つ以上の化合物が存在する。別の態様では、化合物は経口的及び／又は非経口的に投与可能である。別の態様では、化合物は、静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である。別の態様では、哺乳動物の痛風の治療のために、本明細書に記載の治療有効量の組成物の使用が提供される。別の態様では、組成物は経口的及び／又は非経口的に投与可能である。別の態様では、組成物は、静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である。別の態様では、哺乳動物はヒトである。別の態様では、痛風は、慢性痛風及び／又は急性痛風から選択される。別の態様では、痛風の治療は、少なくとも１つの痛風症状の治療を含む。別の態様では、前記少なくとも１つの痛風症状は、痛風発作、痛風結節形成、痛風関節炎、痛風関連炎症、及び／又は痛風に関連する関節破壊から選択される。別の態様では、前記少なくとも１つの痛風症状は、痛風炎症及び／又は炎症に関連する痛みから選択される。
別の態様では、炎症を治療する方法が提供され、この方法は、βＶＩ‐チューブリン阻害剤を投与することを含む。別の態様では、βＶＩ‐チューブリン阻害剤は、本明細書に記載の化合物又は組成物である。別の態様では、炎症は白血球浸潤に関連している。別の態様では、白血球浸潤は、好中球及び／又は単球の浸潤を含む。別の態様では、炎症は痛風に関連している。別の態様では、炎症はアテローム性動脈硬化症に関連している。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修正が詳細な説明から当業者に明らかになるので、本発明の実施形態を示す間の詳細な説明及び特定の例は、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
ここで、実施形態は、例としてのみ、図を参照して説明される。
図１は、化合物（２）及び（３）を作成するための合成スキームを示している。 図２は、化合物（４）及び（５）を作成するための合成スキームを示している。 図３は、化合物（６）から（３８）を作成するための合成スキームを示している。 図３Ａは、Ｒ位置でのコルヒチンへの修飾（５０）から（５４）を伴うコルヒチンの構造を示す。 図４は、Ｒ及びＲ１位置でのチオコルヒチンへの修飾（３９）、（３ａ～ｃ）、（４ａ～ｃ）及び（５ａ～ｃ）を伴うチオコルヒチンの構造を示す。 図４Ａから４Ｄは、コルヒチン及びチオコルヒチン誘導体の例を示している。 図５は、コルヒチン結合部位内に見られる残基の違いを示している。図５Ａは、標準的なβ１‐チューブリン配列に黒い文字として示されているコルヒチン［ｐｄｂコード１ＳＡ０］の結合表面に含まれる残基を示しており、３種類の結合部位の違いは中程度の灰色の文字で示され、残りの文字は灰色で、破線は配列間の同一の位置を表す。図５Ｂは、β‐チューブリン［ｐｄｂコード１ＳＡ０］に描かれた溶媒にアクセス可能な表面を示し、コルヒチン結合表面を構成する残基は図では黒で示され、３つの結合部位モデル間で違いを示す残基は黒い棒で示され、コルヒチンは分子構造として示され、Ａ環とＸ及びＹ位置がはっきりと見える。
図６は、タイプＩ（上）、タイプＩＩ（中央）、及びタイプＩＩＩ（下）のβ‐チューブリン結合部位に結合するコルヒチンとその誘導体の計算されたΔＧ［ｋｃａｌｍｏｌ－１］を示し、誘導体（（３）‐Ｄ‐２０）とコルヒチン（ＣＨ）のそれぞれのボックスプロットは、１０個の独立したドッキングポーズのエネルギー評価から生成された。ひげは５％と９５％の信頼値で示されている。 図７は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）で刺激されたヒト好中球によるカルシウム貯蔵の動員に対するコルヒチン及びコルヒチン誘導体の効果を示している。図７Ａ及び７Ｄは、コルヒチンの効果を示している。図７Ｂは、コルヒチン誘導体（９１）の効果を示している。図７Ｃは、コルヒチン誘導体ＴＰＯの効果を示している。図７Ｅ‐Ｊは、コルヒチンと比較したコルヒチン誘導体２８ａ、３９、４７ａ、８９、１４、及び４３の効果を示している（図７Ｄ）。図７Ｋ‐Ｌは、さまざまな用量でのコルヒチンの効果を示している。図７Ｍ‐Ｐは、さまざまな用量のコルヒチン（図７Ｋ‐Ｌ）と比較した、さまざまな用量のコルヒチン誘導体（４３）（図７Ｍ‐Ｎ）及び（４７ａ）（図７Ｏ‐Ｐ）の効果を示している。図７Ｑ及び７Ｒは、それぞれコルヒチン誘導体（４７ａ）及び（４３）の効果を示している。図７Ｓは、図７Ａ、７Ｂ、７Ｑ及び７Ｒで試験された化合物の阻害活性の比較を示している。図７Ｔ及び７Ｕは、細胞質カルシウム濃度のｆＭＬＰ誘発性増加に対するコルヒチン及び誘導体（９１）及び（４３）の効果を示している。図７Ｖ及び７Ｗのコルヒチン及び誘導体（９１）及び（４３）は、ＭＳＵによって誘発される細胞質カルシウム濃度の増加に関するものである。
図８は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）で刺激されたヒト好中球によるＩＬ‐８（図８Ａから８Ｇ及び８Ｌ）又はＩＬ‐１（図８Ｈから８Ｋ）の放出に対するコルヒチン及びコルヒチン誘導体の効果を示している。図８Ａは、コルヒチン誘導体（４３）の効果を示している。図８Ｂは、コルヒチン誘導体（４７ａ）の効果を示している。図８Ｃはコルヒチンの効果を示している。図８Ｄはコルヒチン誘導体（９１）を示している。図８Ｅはコルヒチン誘導体（４７ａ）を示している。図８Ｆは、コルヒチン誘導体（４３）の効果を示している。図８Ｇは、図８ＣからＦで試験された化合物の阻害活性の比較を示している。図８Ｈは、コルヒチンの効果を示している。図８Ｉはコルヒチン誘導体（９１）を示している。図８Ｊは、コルヒチン誘導体（４３）の効果を示している。図８Ｋは、図８ＨからＪでテストした化合物の阻害活性の比較を示している。図８Ｌは、ＭＳＵの非存在下でコルヒチン誘導体（４３）又は（４７ａ）とインキュベートしたヒト好中球におけるＩＬ‐８産生の基礎レベルを示している。
図９は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）で刺激されたヒト好中球によるスーパーオキシドの生成に対するコルヒチンとコルヒチン誘導体の効果を示している。図９Ａはコルヒチンの効果を示している。図９Ｂは、コルヒチン誘導体（９１）の効果を示している。図９Ｃは、コルヒチンの効果の効果を示している。図９Ｄはコルヒチン誘導体（９１）を示している。図９Ｅはコルヒチン誘導体（４７ａ）を示している。図９Ｆは、コルヒチン誘導体（４３）の効果を示している。図９Ｇは、図９ＣからＦの化合物の阻害活性の比較を示す。図９Ｈは、ＭＳＵの非存在下でコルヒチン誘導体（４３）又は（４７ａ）で刺激されたヒト好中球におけるスーパーオキシド生成の基礎レベルを示す。 図１０は、それぞれコルヒチン誘導体（９１）又はコルヒチン誘導体（４３）を皮下注射されたマウスにおける２時間にわたるコルヒチン誘導体（９１）（図１０Ａ）又はコルヒチン誘導体（４３）（図１０Ｂ）の血漿濃度を示す。
図１１は、それぞれコルヒチン誘導体（９１）又はコルヒチン誘導体（４３）の皮下注射後２時間にわたるマウスの循環白血球中のコルヒチン誘導体（９１）（図１１Ａ）又はコルヒチン誘導体（４３）（図１１Ｂ）の濃度を示している。 図１２は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）を注射したマウスの背側エアポーチへの白血球動員に対するコルヒチン及びコルヒチン誘導体（９１）の効果を示している。 図１３は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）を注射したマウスの背側エアポーチへの白血球動員に対するコルヒチン及びコルヒチン誘導体（９１）の治療効果を示している。 図１４は、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）を注射したマウスの背側エアポーチへの白血球動員に対するコルヒチン誘導体（４３）の治療効果を示している。
図１５は、ヒト好中球におけるβ‐チューブリン発現のウエスタンブロットを示している。 図１６は、コルヒチンがβＩＩＩチューブリンとどのように相互作用するかを示している。 図１７は、コルヒチン誘導体（９１）（ＣＣＩ）がβＩＩＩチューブリンとどのように相互作用するかを示している。 図１８は、コルヒチン誘導体（８９）がβＩＩＩチューブリンとどのように相互作用するかを示している。 図１９は、野生型及びＬＤＬＲＫＯマウスの体重に対する高脂肪食とＣＣＩの効果を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコントロール食（ＣＤ）又は高脂肪食（ＨＦ）を８週間与え、０．５μｍｏｌ／ｋｇのＣＣＩ又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を週に３回皮下注射した。マウスの体重を週に３回測定した。２週目から８週目までの各グループのマウスの体重増加をグラフに示す。
図２０は、高脂肪食を与えられた野生型及びＬＤＬＲＫＯマウスの血清中のトリグリセリドレベルに対するＣＣＩの効果を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはコントロール食（ＣＤ）又は高脂肪食（ＨＦ）を８週間与えられ、０．５μｍｏｌ／ｋｇ ＣＣＩ又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を週３回皮下注射された。８週間の食事の後に採血し、血清を調製して分析まで凍結した。 図２１は、高脂肪食を与えられた野生型及びＬＤＬＲＫＯマウスの血清中のコレステロールレベルに対するＣＣＩの効果を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはコントロール食（ＣＤ）又は高脂肪食（ＨＦ）を与えられました。）８週間、０．５μｍｏｌ／ｋｇ ＣＣＩ又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を週３回皮下注射する。８週間の食事の後に採血し、血清を調製して分析まで凍結した。
図２２は、高脂肪食を与えられたＬＤＬＲＫＯマウスの大動脈におけるアテローム性動脈硬化症の発症に対するＣＣＩの効果を示している。図２２Ａ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコントロール食（ＣＤ）又は高脂肪食（ＨＦ）を８週間与え、０．５μｍｏｌ／ｋｇのＣＣＩ又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を週に３回皮下注射した。大動脈を採取して解剖し、スーダンＩＶ染色による大動脈病変の正面アッセイを実施した。スーダンＩＶは、脂質、トリグリセリド、リポタンパク質を染色する脂溶性染料である。図２２Ｂは、「正面アッセイ」で染色されたプラークで覆われた大動脈弓の総面積のパーセントを示している。図２２Ｃは、「正面アッセイ」で染色されたプラークで覆われた下行大動脈の総面積のパーセントを示している。 図２３高脂肪食を与えられたＬＤＬＲＫＯマウスのサイトカインの血清レベルに対するＣＣＩの効果：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコントロール食（ＣＤ）又は高脂肪食（ＨＦ）を８週間与え、０．５μｍｏｌ／ｋｇＣＣＩ又はビヒクル（ＤＭＳＯ）週に３回皮下注射した。８週間の食事の後に採血し、血清を調製して、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによる分析まで凍結した。
特定の実施形態の詳細な説明
本明細書で引用される参照は、参照により組み込まれる。
定義
本発明の化合物、組成物、方法及び使用を説明する場合、以下の用語は、特に明記しない限り、以下の意味を有する。
本明細書で使用される「コルヒチン誘導体」という用語は、本明細書に記載の誘導体のいずれかを含み得、例えば、適切な場合、チオコルヒチン誘導体も含み得る。
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医によって求められている哺乳動物（例えば、ヒト）などの組織、系、動物において生物学的又は医学的応答を誘発する活性化合物又は薬剤の量を意味する。障害、状態、及び／又は疾患を治療するために与えられる場合、それは、哺乳動物を含む対象に投与されたときに、症状の治療などの所望の結果を達成し得る量である。
本発明の化合物は、非対称中心、キラル軸、及びキラル平面を有することができ（例えば、E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereo-chemistry of Carbon Compounds（炭素化合物の立体化学）, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190に記載されているように）、ラセミ体、ラセミ混合物、及び個々のジアステレオマーとして発生し、光学異性体を含むすべての可能な異性体及びそれらの混合物が本発明に含まれる。さらに、本明細書に開示される化合物は互変異性体として存在することができ、両方の互変異性体形態は、１つの互変異性構造のみが示され得るとしても、本発明の範囲に含まれることが意図される。
一般に、水素やＨなどの特定の元素への言及は、適切な場合、その元素のすべての同位体を含むことを意味する。
「アルキル基」という用語が、単独で、又は「ハロアルキル基」及び「アルキルアミノ基」などの他の用語内で使用される場合、それは、例えば、１から約２０個の炭素原子、又は具体的な実施態様では、１から約１２個の炭素原子を有する、直鎖又は分岐炭素ラジカルを包含する。他の実施形態では、アルキル基は、１から約６個の炭素原子を有する「低級アルキル」基である。そのような基の例には、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、イソブチル、ｓｅｃ‐ブチル、ｔｅｒｔ‐ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。より具体的な実施形態では、低級アルキル基は、１から４個の炭素原子を有する。
「アルケニル基」という用語は、少なくとも１つの炭素‐炭素二重結合を有する直鎖又は分岐炭素ラジカルを包含する。「アルケニル基」という用語は、共役及び非共役炭素‐炭素二重結合又はそれらの組み合わせを包含することができる。アルケニル基は、例えば、それに限定されることなく、２から約２０個の炭素原子、又は特定の実施形態では、２から約１２個の炭素原子を包含することができる。実施形態では、アルケニル基は、２から約４個の炭素原子を有する「低級アルケニル」基である。アルケニル基の例には、これらに限定されないが、エテニル、プロペニル、アリル、プロペニル、ブテニル及び４‐メチルブテニルが含まれる。「アルケニル基」及び「低級アルケニル基」という用語は、「シス」及び「トランス」配向、あるいは「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基を包含する。
「アルキニル基」という用語は、少なくとも１つの炭素‐炭素三重結合を有する直鎖又は分岐炭素ラジカルを意味する。「アルキニル基」という用語は、共役及び非共役の炭素‐炭素三重結合又はそれらの組み合わせを包含することができる。アルキニル基は、例えば、それに限定されることなく、２から約２０個の炭素原子、又は特定の実施形態では、２から約１２個の炭素原子を包含することができる。実施形態では、アルキニル基は、２から約１０個の炭素原子を有する「低級アルキニル」基である。いくつかの例は、２～約４個の炭素原子を有する低級アルキニル基である。そのような基の例には、プロパルギル、ブチニルなどが含まれる。
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子などのハロゲンを意味する。「ハロアルキル基」という用語は、アルキル炭素原子のいずれか１つ又は複数が上記で定義されたようにハロで置換されている基を包含する。具体的には、モノハロアルキル、ジハロアルキル、及びペルハロアルキルを含むポリハロアルキル基が含まれる。一例として、モノハロアルキル基は、基内にヨード、ブロモ、クロロ、又はフルオロ原子のいずれかを有し得る。ジハロ及びポリハロアルキル基は、２つ以上の同じハロ原子又は異なるハロ基の組み合わせを有し得る。「低級ハロアルキル基」は、１～６個の炭素原子を有する基を包含する。いくつかの実施形態において、低級ハロアルキル基は、１から３個の炭素原子を有する。ハロアルキル基の例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル及びジクロロプロピルが含まれる。
「ヒドロキシアルキル基」という用語は、例えば、それに限定されないが、１から約１０個の炭素原子を有し、そのいずれか１つが１つ以上のヒドロキシル基で置換され得る直鎖又は分岐アルキル基を包含する。実施形態において、ヒドロキシアルキル基は、１から６個の炭素原子及び１つ以上のヒドロキシル基を有する「低級ヒドロキシアルキル」基である。このような基の例には、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル、及びヒドロキシヘキシルが含まれる。
「アルコキシ基」という用語は、それぞれが、例えば、それに限定されないが、１から約１０個の炭素原子のアルキル部分を有する線状又は分枝状のオキシ含有基を包含する。実施形態において、アルコキシ基は、１から６個の炭素原子を有する「低級アルコキシ」基である。そのような基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ及びｔｅｒｔ‐ブトキシが含まれる。特定の実施形態において、低級アルコキシ基は、１から３個の炭素原子を有する。「アルコキシ」基は、フルオロ、クロロ又はブロモなどの１つ又は複数のハロ原子でさらに置換されて、「ハロアルコキシ」基を提供し得る。他の実施形態では、低級ハロアルコキシ基は、１から３個の炭素原子を有する。このような基の例には、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、フルオロエトキシ、及びフルオロプロポキシが含まれる。
「芳香族基」又は「アリール基」という用語は、１つ又は複数の環を有する芳香族基を意味し、そのような環は、ペンダント様式で一緒に結合され得るか、又は縮合され得る。特定の実施形態では、芳香族基は、１つ、２つ、又は３つの環である。単環式芳香族基は、環中に４から１０個の炭素原子、典型的には４から７個の炭素原子、より典型的には４から６個の炭素原子を含み得る。典型的な多環芳香族基は、２つ又は３つの環を持っている。２つの環を有する多環芳香族基は、典型的には、環内に８から１２個の炭素原子、好ましくは８から１０個の炭素原子を有する。芳香族基の例には、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリル又はアセナフチルが含まれる。
「ヘテロ原子」という用語は、炭素以外の原子を意味する。通常、ヘテロ原子は、硫黄、リン、窒素、及び酸素原子からなる群から選択される。複数のヘテロ原子を含む基には、異なるヘテロ原子が含まれる場合がある。
「ヘテロ芳香族基」又は「ヘテロアリール基」という用語は、１つ以上の環を有する芳香族基を意味し、そのような環は、ペンダント様式で一緒に結合され得るか、又は縮合され得、芳香族基は、少なくとも１つのヘテロ原子を有する。単環式ヘテロ芳香族基は、環内に４から１０個のメンバー原子、典型的には４から７個のメンバー原子、より典型的には４から６個のメンバー原子を含み得る。典型的な多環式ヘテロ芳香族基は、２つ又は３つの環を持っている。２つの環を有する多環芳香族基は、典型的には８から１２個のメンバー原子を有し、より典型的には、環中に８から１０個のメンバー原子を有する。ヘテロ芳香族基の例には、ピロール、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、フラン、チオフェン、トリアゾール、ピラゾール、イソキサゾール、イソチアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、トリアジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンズイミダゾール、ベンズチアゾール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリンなどが含まれるが、これらに限定されない。
「炭素環式基」という用語は、飽和又は不飽和の炭素環式炭化水素環を意味する。炭素環式基は芳香族ではない。炭素環式基は単環式又は多環式である。多環式炭素環式基は、縮合、スピロ、又は架橋環系である可能性がある。単環式炭素環式基は、環内に、４から１０個の炭素原子、典型的には４から７個の炭素原子、より典型的には５から６個の炭素原子を含み得る。二環式炭素環式基は、環内に８～１２個の炭素原子、通常は９～１０個の炭素原子を含み得る。
「複素環式基」という用語は、環内に炭素原子及び１つ以上のヘテロ原子を含む飽和又は不飽和の環構造を意味する。複素環式基は芳香族ではない。複素環式基は単環式又は多環式である。多環式複素環式基は、縮合、スピロ、又は架橋環系である可能性がある。単環式複素環基は、環内に４から１０個のメンバー原子（すなわち、炭素原子と少なくとも１個のヘテロ原子の両方を含む）、典型的には４から７、より典型的には５から６を含み得る。二環式複素環式基は、環内に８～１８個のメンバー原子、典型的には９個又は１０個のメンバー原子を含み得る。代表的な複素環式基には、例として、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピペリジン、１，４‐ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、３‐ピロリンなどが含まれる。
「不均一基」という用語は、炭素原子及び少なくとも１つのヘテロ原子を含む非水素メンバー原子の飽和又は不飽和鎖を意味する。不均一基は典型的には、１～２５個のメンバー原子を持っている。より典型的には、鎖は、１から１２個のメンバー原子、１から１０、そして最も典型的には１から６を含む。鎖は、線状又は分枝状であり得る。典型的な分岐した不均一基には、１つ又は２つの分岐、より一般的には１つの分岐がある。典型的には、不均一基は飽和している。不飽和不均一基は、１つ又は複数の二重結合、１つ又は複数の三重結合、又はその両方を持っている場合がある。典型的な不飽和不均一基は、１つ又は２つの二重結合又は１つの三重結合を持っている。より典型的には、不飽和不均一基は１つの二重結合を有する。
「炭化水素基」又は「ヒドロカルビル基」という用語は、１から２５個の炭素原子、典型的には１から１２個の炭素原子、より典型的には１～１０個の炭素原子、そして最も典型的には１から８個の炭素原子の鎖を意味する。炭化水素基は、線状又は分枝鎖構造を有し得る。典型的な炭化水素基は、１つ又は２つの分岐、典型的には１つの分岐を有する。典型的には、炭化水素基は飽和している。不飽和炭化水素基は、１つ以上の二重結合、１つ以上の三重結合、又はそれらの組み合わせを有し得る。典型的な不飽和炭化水素基は、１つ又は２つの二重結合又は１つの三重結合を持っている。より典型的には、不飽和炭化水素基は１つの二重結合を持っている。
「不飽和」という用語が任意の基と組み合わせて使用される場合、その基は完全に不飽和又は部分的に不飽和であり得る。しかしながら、「不飽和」という用語が本明細書で定義された特定の基と組み合わせて使用される場合、その用語はその特定の基の制限を維持する。例えば、本明細書で定義される「炭素環式基」の制限に基づく不飽和の「炭素環式基」は、芳香族基を包含しない。
「カルボキシ基」又は「カルボキシル基」という用語は、単独で使用される場合でも、「カルボキシアルキル基」などの他の用語と一緒に使用される場合でも、‐（Ｃ＝Ｏ）‐Ｏ‐を示す。
「カルボニル基」という用語は、単独で使用される場合でも、「アミノカルボニル基」などの他の用語と一緒に使用される場合でも、‐（Ｃ＝Ｏ）‐を意味する。
「アルキルカルボニル基」という用語は、アルキル基で置換されたカルボニル基を意味する。特定の実施形態において、「低級アルキルカルボニル基」は、カルボニル基に結合した上記のような低級アルキル基を有する。
「アミノアルキル基」という用語は、１つから約１０個の炭素原子を有し、そのいずれか１つが１つ又は複数のアミノ基で置換され得る直鎖又は分岐アルキル基を包含する。いくつかの実施形態において、アミノアルキル基は、１から６個の炭素原子及び１つ以上のアミノ基を有する「低級アミノアルキル」基である。このような基の例には、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチル、及びアミノヘキシルが含まれる。
「アルキルアミノアルキル基」という用語は、独立してアルキル基で置換された窒素原子を有するアミノアルキル基を包含する。特定の実施形態において、アルキルアミノアルキル基は、１から６個の炭素原子のアルキル基を有する「低級アルキルアミノアルキル」基である。他の実施形態では、低級アルキルアミノアルキル基は、１から３個の炭素原子のアルキル基を有する。適切なアルキルアミノアルキル基は、Ｎ‐メチルアミノメチル、Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐アミノエチル、Ｎ，Ｎ‐ジエチルアミノメチルなどのように、モノ又はジアルキル置換され得る。
「アラルキル基」という用語は、アリール置換アルキル基を包含する。実施形態では、アラルキル基は、１から６個の炭素原子を有するアルキル基に結合したアリール基を有する「低級アラルキル」基である。他の実施形態では、低級アラルキル基フェニルは、１から３個の炭素原子を有するアルキル部分に結合している。そのような基の例には、ベンジル、ジフェニルメチル及びフェニルエチルが含まれる。前記アラルキル中のアリールは、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル及びハロアルコキシでさらに置換され得る。
「アリールアルケニル基」という用語は、アリール置換アルケニル基を包含する。実施形態において、アリールアルケニル基は、２から６個の炭素原子を有するアルケニル基に結合したアリール基を有する「低級アリールアルケニル」基である。このような基の例には、フェニルエテニルが含まれる。前記アリールアルケニル中のアリールは、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル及びハロアルコキシでさらに置換され得る。
「アリールアルキニル基」という用語は、アリール置換アルキニル基を包含する。実施形態において、アリールアルキニル基は、２から６個の炭素原子を有するアルキニル基に結合したアリール基を有する「低級アリールアルキニル」基である。そのような基の例には、フェニルエチニルが含まれる。前記アラルキル中のアリールは、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル及びハロアルコキシでさらに置換され得る。ベンジルとフェニルメチルという用語は交換可能である。
「アルキルチオ基」という用語は、二価の硫黄原子に結合した、１から１０個の炭素原子の直鎖又は分岐アルキル基を含む基を包含する。特定の実施形態において、低級アルキルチオ基は、１から３個の炭素原子を有する。「アルキルチオ」の例はメチルチオ（ＣＨ３Ｓ‐）である。
「アルキルアミノ基」という用語は、「Ｎ‐アルキルアミノ」及び「Ｎ，Ｎ‐ジアルキルアミノ」という用語を含む、１つのアルキル基及び２つのアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。実施形態において、アルキルアミノ基は、窒素原子に結合した、１から６個の炭素原子の１つ又は２つのアルキル基を有する「低級アルキルアミノ」基である。他の実施形態では、低級アルキルアミノ基は、１から３個の炭素原子を有する。適切な「アルキルアミノ」基は、Ｎ‐メチルアミノ、Ｎ‐エチルアミノ、Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ‐ジエチルアミノなどのモノ又はジアルキルアミノであり得る。
「アリールアミノ基」という用語は、Ｎ‐フェニルアミノなどの１つ又は２つのアリール基で置換されたアミノ基を意味する。「アリールアミノ」基は、基のアリール環部分でさらに置換され得る。
「ヘテロアリールアミノ」という用語は、Ｎ‐チエニルアミノなどの１つ又は２つのヘテロアリール基で置換されたアミノ基を意味する。「ヘテロアリールアミノ」基は、基のヘテロアリール環部分でさらに置換され得る。
「アラルキルアミノ基」という用語は、１つ又は２つのアラルキル基で置換されたアミノ基を意味する。他の実施形態では、Ｎ‐ベンジルアミノなどのフェニル‐Ｃ１‐Ｃ３‐アルキルアミノ基が存在する。「アラルキルアミノ」基は、その基のアリール環部分でさらに置換され得る。
「アルキルアミノアルキルアミノ基」という用語は、１つ又は２つのアルキルアミノ基で置換されたアルキルアミノ基を意味する。実施形態では、Ｃ１‐Ｃ３‐アルキルアミノ‐Ｃ１‐Ｃ３‐アルキルアミノ基が存在する。
「アリールチオ基」という用語は、二価の硫黄原子に結合した、６から１０個の炭素原子のアリール基を包含する。「アリールチオ」の例はフェニルチオである。「アラルキルチオ基」という用語は、二価の硫黄原子に結合した上記のアラルキル基を包含する。特定の実施形態では、フェニル‐Ｃ１‐Ｃ３‐アルキルチオ基が存在する。「アラルキルチオ」の例は、ベンジルチオである。
「アリールオキシ基」という用語は、酸素原子に結合した、上で定義したように、任意選択で置換されたアリール基を包含する。このような基の例には、フェノキシが含まれる。
「アラルコキシ基」という用語は、酸素原子を介して他の基に結合したオキシ含有アラルキル基を包含する。特定の実施形態において、アラルコキシ基は、上記のように、低級アルコキシ基に結合した任意選択で置換されたフェニル基を有する「低級アラルコキシ」基である。
「シクロアルキル基」という用語は、飽和炭素環式基を含む。特定の実施形態において、シクロアルキル基は、Ｃ３‐Ｃ６環を含む。実施形態では、シクロペンチル、シクロプロピル、及びシクロヘキシルを含む化合物が存在する。
「シクロアルケニル基」という用語は、１つ又は複数の炭素‐炭素二重結合：共役若しくは非共役、又はそれらの組み合わせを有する炭素環式基を含む。「シクロアルケニル」及び「シクロアルキルジエニル」化合物は、「シクロアルケニル」という用語に含まれる。特定の実施形態において、シクロアルケニル基は、Ｃ３‐Ｃ６環を含む。例には、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル及びシクロヘプタジエニルが含まれる。「シクロアルケニル」基は、低級アルキル、ヒドロキシル、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、シアノ、アルコキシ、低級アルキルアミノなどの１から３の置換基を有し得る。
本明細書に記載の基と併せて使用される「適切な置換基」、「置換基」又は「置換された」という用語は、化学的及び薬学的に許容される基、すなわち本発明の化合物の治療活性を否定しない部分を指す。本発明の化合物の置換基及び置換パターンは、化学的に安定であり、当技術分野で知られている技術及び以下に記載されている方法によって容易に合成できる化合物を提供するために当業者によって選択され得ることが理解される。置換基自体が複数の基で置換されている場合、安定した構造が得られる限り、これらの複数の基は同じ炭素／メンバー原子上又は異なる炭素／メンバー原子上にあり得ることが理解される。いくつかの適切な置換基の例示的な例には、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヒドロキシアルキル、ベンジル、カルボニル、ハロ、ハロアルキル、パーフルオロアルキル、パーフルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、オキソ、メルカプト、アルキルチオ、アルコキシ、アリール又はヘテロアリール、アリールオキシ又はヘテロアリールオキシ、アラルキル又はヘテロアラルキル、アラルコキシ又はヘテロアラルコキシ、ＨＯ‐（Ｃ＝Ｏ）‐、アミド、アミノ、アルキル‐及びジアルキルアミノ、シアノ、ニトロ、カルバモイル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルスルホニル、及びアリールスルホニルが含まれる。典型的な置換基には、芳香族基、置換芳香族基、メチル基などのアルキル基を含む炭化水素基、ベンジルなどの置換炭化水素基、及びメトキシ基などのアルコキシ基を含む不均一基が含まれる。
「縮合」という用語は、２つ以上の炭素／メンバー原子が２つの隣接する環に共通である、例えば、環が「縮合環」であることを意味する。
本発明の化合物の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性の無機又は有機酸から形成された、本発明の化合物の従来の非毒性の塩が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来するもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２‐アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性又は酸性部分を含む本発明の化合物から合成することができる。一般に、塩基性化合物の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによって、又は遊離塩基を、化学量論量の、又は過剰の所望の塩形成無機又は有機酸と適切な溶媒又は溶媒の様々な組み合わせにおいて反応させることによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機又は有機塩基との反応によって形成される。
本発明は、本発明の化合物及びそれらの混合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物及びプロドラッグを含む。
「状態」という用語は、例えば、哺乳動物の健康状態に関連する標準的な身体的状態に適合しない、哺乳動物の身体的状態（全体として、又はその一部の１つ以上として）を示す。本明細書に記載の状態には、障害及び疾患が含まれるが、これらに限定されず、ここで「障害」という用語は、例えば、哺乳動物又はその部分のいずれかの機能異常に関連する哺乳動物の状態を示し、「疾患」という用語は、例えば、哺乳動物の体又はその部分のいずれかの正常な機能を損なう哺乳動物の状態を示し、通常、徴候及び症状を区別することによって現れる。典型的には、本明細書に記載の化合物及び組成物は、炎症状態を治療するために有用であり、典型的には、治療される炎症状態は、好中球によって引き起こされる炎症成分を有する。
「好中球によって引き起こされる」炎症という用語は、炎症が好中球に関連していることを意味する。炎症の多因子性を考えると、この用語を使用することにより、好中球は炎症のドライバー又はメディエーターであり、必ずしも唯一のドライバー又はメディエーターではなく、炎症／炎症の病因の少なくとも一部に寄与すると理解される。例えば、多くの場合、単球及び／又はマクロファージなどの他の免疫細胞も炎症のドライバーである可能性がある。好中球によって引き起こされる炎症は、好中球によって引き起こされる炎症性疾患、好中球によって引き起こされる炎症性障害、好中球によって引き起こされる炎症状態、又はそれらの組み合わせから選択することができる。例えば、好中球によって引き起こされる炎症は、好中球によって分泌されるサイトカインが、ＩＬ‐１及び／又はＩＬ‐８などの病理学的効果を有する状態を指す場合がある。
そのような状態の例には、乾癬、炎症性腸疾患、喘息、心臓及び腎再灌流障害、成人呼吸困難症候群、血栓症、糸球体腎炎、関節リウマチ、変形性関節症、髄膜炎、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中を含む脳卒中、神経外傷／閉鎖頭部損傷、内毒素血症及び／又は毒性ショック症候群、エンドトキシン又は炎症性腸疾患によって誘発される炎症反応、結核、アテローム性動脈硬化症、筋肉変性、多発性硬化症、カシェキシア、骨吸収、乾癬性関節炎、ライター症候群、痛風、外傷性関節炎、風疹関節炎、急性滑膜炎、糖尿病、膵臓β細胞疾患、アルツハイマー病、偽痛風、心血管疾患、及び血管炎などの他の急性又は慢性炎症性疾患状態が含まれる。典型的には、状態は痛風、偽痛風、心血管疾患、血管炎、又はアテローム性動脈硬化症である。本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」又は「療法」は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本明細書に記載の目的のために、有益な又は望ましい臨床結果には、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延又は鈍化、及び／又は検出可能か検出不可能かにかかわらず、病状の改善又は緩和が含まれ得るが、これらに限定されない。したがって、「治療」又は「療法」は、障害の病状を変えることを意図して行われる介入と見なすことができる。具体的には、治療又は療法は、疾患又は障害の病状を直接予防、減速、又はさもなければ減少させ得るか、又は対象を他の治療薬による治療又は療法に対してより感受性にする可能性がある。
「慢性痛風」という用語は、再発性又は長期の痛風発作（通称「痛風フレア」とも呼ばれる）、痛風結節形成、慢性炎症性関節炎、及び／又は痛風に関連する関節破壊を有する対象に存在する痛風を含む。
「急性痛風」という用語は、痛風発作などの少なくとも１つの痛風症状を患った、又は患っている対象に存在する痛風を含む。
「痛風関連炎症」又は「痛風性関節炎」という用語は、尿酸結晶に対する免疫応答による局所又は全身性炎症（無症状である可能性がある）を指す。
本発明の化合物に関する「投与」（例えば、化合物を「投与する」）という用語は、治療を必要とする動物の系に化合物又は化合物のプロドラッグを導入することを意味する。本発明の化合物又はそのプロドラッグが１つ又は複数の他の活性剤（例えば、抗痛風剤など）と組み合わせて提供される場合、「投与」及びその異綴語はそれぞれ、化合物又はそのプロドラッグ及び他の薬剤の同時及び連続的な導入を含むと理解される。
「痛風を治療する」又は「痛風の治療」という用語は、痛風状態に苦しむ哺乳動物への投与を指し、炎症を制限する及び／又は炎症に関連する痛みを軽減することによって痛風関節炎状態を軽減する効果を指す。
ピロリン酸カルシウム結晶沈着（ＣＰＰＤ）疾患としても知られる「偽痛風」という用語は、関節に自然発生的な痛みを伴う腫れを引き起こす関節炎の一種である。それは滑液中にＣＰＰ結晶が形成され、炎症や痛みを引き起こすときに発生する。
「含む」（comprising）、「有する」（having）、「含む」（including）という用語、及びそれらのさまざまな活用語尾は、示された構成要素を含み、他の要素を除外しない、制限のないもの（オープンエンド）を意味する。
「からなる」という用語は、クローズドエンド又は制限的な意味を持ち、「から本質的になる」とは、指定された成分を含み、不純物として存在する材料、成分を提供するために使用されるプロセスの結果として存在する不可避の材料以外の他の成分、及び本発明の技術的効果を達成すること以外の目的で追加された構成要素を除くことを意味する。例えば、「から本質的になる」という句を使用して定義される組成物は、任意の既知の薬学的に許容される添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包含する。典型的には、本質的に一組の成分からなる組成物は、５重量％未満、典型的には３重量％未満、より典型的には１重量％未満の不特定の成分を含むであろう。
本明細書に開示される要素を導入する場合、冠詞「ａ」（一つの）、「ａｎ」（一つの）、「ｔｈｅ」（その）、及び「ｓａｉｄ」（前記）は、１つ又は複数の要素が存在することを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、関連するリストされたアイテムの１つ又は複数の任意の及びすべての組み合わせを含む。
含まれるとして本明細書に定義された任意の成分は、但し書き又は否定的な制限により、クレームされた発明から明示的に除外され得ることが理解されよう。例えば、態様では、特定の官能基は、本明細書に記載の化合物から明示的に除外され得る。
最後に、本明細書で使用される「実質的に」、「約」及び「ほぼ」などの程度の用語は、最終結果が大幅に変更されないように、修正された用語の妥当な量の偏差を意味する。これらの程度の用語は、この逸脱が変更する単語の意味を否定しない場合、変更された用語の少なくとも±５％の逸脱を含むと解釈されるべきである。
さらに、ここに記載されているすべての範囲には、明示的に記載されているかどうかに関係なく、範囲の終端と中間範囲の任意の点が含まれる。したがって、本明細書で使用される場合、「ＸとＹの間」及び「約ＸとＹの間」などの句は、ＸとＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「約ＸとＹの間」などの句は、「約Ｘと約Ｙの間」を意味する。本明細書で使用される場合、「約ＸからＹまで」などの句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
コルヒチン誘導体
コルヒチン誘導体、誘導体を含む組成物、その投与方法、及びその使用は、炎症の治療のために提供される。
コルヒチン誘導体は、式Ｉの化合物：
Figure 2022511214000009
ここで、ＺはＯ又はＳである；Ｘ１は、置換又は非置換の炭化水素基、又は置換又は非置換の不均一基から選択される；Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換炭化水素基、置換又は非置換不均一基、置換又は非置換炭素環式基、置換又は非置換複素環基、置換又は非置換芳香族基、又は置換又は非置換ヘテロ芳香族基から独立して選択される；その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせによって表される。
他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３が両方ともメチルである場合、Ｘ１はメチルではない。
式Ｉの特定の実施形態において、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換芳香族基、置換又は非置換複素芳香族基、置換又は非置換炭素環式基、又は置換又は非置換複素環式基から独立して選択される。より特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ハロアルキル、置換又は非置換ヒドロキシアルキル、置換又は非置換シアノアルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキルカルボニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換シクロアルケニル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルケニル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換アルキルアリール、置換又は非置換アルキルヘテロアリール、アルキレン‐Ｏ‐アルキル、アルキレン‐Ｏ‐シクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐ヘテロシクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐シクロアルキル、又はアルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐ヘテロシクロアルキルから独立して選択される。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキル、置換又は非置換のＣ２‐Ｃ６アルケニル、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１‐Ｃ６アルキレン‐Ｏ‐アルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルアリール、又は置換又は非置換アルキルヘテロアリールから独立して選択される。より特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、又は置換又は非置換アルキルアリールから独立して選択される。さらなる実施形態において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、置換又は非置換アルキル、あるいは置換又は非置換アルキルアリールから独立して選択される。追加の実施形態では、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換のアルキルから独立して選択される。さらなる実施形態において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから独立して選択される。
一実施形態では、Ｘ１は、置換又は非置換の炭化水素基である。さらなる実施形態において、Ｘ１は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、又は置換又は非置換アルキニルから選択される。特定の実施形態では、Ｘ１は、置換又は非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキル、特に非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキルなどの置換又は非置換アルキルから選択される。より具体的な実施形態では、Ｘ１はメチル又はエチルから選択される。
別の実施形態では、Ｘ１は、置換又は非置換の不均一基である。さらなる実施形態において、Ｘ１は、‐ＣＲ４Ｒ５Ｒ６から選択され、ここで、Ｒ４Ｒ５Ｒ６は、それぞれ、Ｈ、置換又は非置換炭化水素基、置換又は非置換不均一基から独立して選択される。特に、Ｒ４Ｒ５Ｒ６はそれぞれ、置換又は非置換のアミド基から独立して選択することができる。特定の実施形態では、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ、Ｈ、置換又は非置換アルキルから独立して選択され、Ｒ６は‐ＮＲ（ＣＯ）ＣＲ７Ｒ８Ｒ９であり、ＲはＨ、及び置換又は非置換アルキルから選択され、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９はそれぞれ、Ｈ、ハロ基、及び置換又は非置換アルキルから選択される。Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９はハロから選択できる。より具体的には、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、フルオロ基から選択することができる。
さらなる実施形態では、Ｘ１はＯＲ１０である。Ｒ１０は、置換又は非置換の炭化水素基、又は置換又は非置換の不均一基から選択される。さらなる実施形態において、Ｒ１０は、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換芳香族基、置換又は非置換複素芳香族基、置換又は非置換炭素環式基、又は置換又は非置換の複素環式基から選択される。特に、Ｒ１０は、置換又は非置換アルキル、ＣＨ２ＯＨ、置換又は非置換ハロアルキル、置換又は非置換ヒドロキシアルキル、置換又は非置換シアノアルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換シクロアルケニル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルケニル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換アルキルアリール、置換又は非置換アルキルヘテロアリール、アルキレン‐Ｏ‐アルキル、アルキレン‐Ｏ‐シクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐ヘテロシクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐シクロアルキル、又はアルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐ヘテロシクロアルキルから選択される。
他の実施形態では、Ｒ１０は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、又は置換又は非置換アルキニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１０は、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキル、又は置換又は非置換のＣ２‐Ｃ６アルケニル、又はＣ２‐Ｃ６アルキニルから選択される。
さらなる実施形態において、Ｒ１０は、置換又は非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキル、特に非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキルなどの置換又は非置換アルキルから選択される。より具体的な実施形態では、Ｒ１０はメチル又はエチルから選択される。
特定の実施形態において、コルヒチン誘導体は、式ＩＡの化合物を含む：
Figure 2022511214000010
式ＩＡの場合、Ｒ２、Ｒ３及びＸ１は、式Ｉに関して上記のようであり得る。
特定の実施形態において、コルヒチン誘導体は、式ＩＢの化合物を含む：
Figure 2022511214000011
式ＩＢの場合、Ｒ２、Ｒ３及びＸ１は、式Ｉに関して上記のようであり得る。
他の実施形態では、コルヒチン誘導体は、式ＩＣの化合物を含む：
Figure 2022511214000012
式ＩＣの場合、Ｒ３及びＸ１は、式Ｉに関して上記のようであり得る。
他の実施形態では、コルヒチン誘導体は、式ＩＤの化合物を含む：
Figure 2022511214000013
式ＩＤの場合、Ｒ３とＸ１は、式Ｉに関して上記のようであり得る。
式Ｉ及びＩＡからＩＤの特定の実施形態では、Ｘ１はメチル又はメトキシである。別の実施形態では、Ｒ３は、置換又は非置換のアルキルから選択される。さらなる実施形態において、Ｒ３は、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから選択され、より具体的には、Ｒ３はエチルである。
本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせの形態であり得る。より具体的な実施形態では、式Ｉ及びＩＡからＩＤまでの化合物は、Ｃ７でＳ配置を有する。式Ｉ及びＩＡからＩＤの化合物の特定の例を図１から４及び４Ａから４Ｄに示す。
本明細書に記載の特定の化合物は、例えば、以下のように調製することができる。
ａ）式ＩＶの化合物
Figure 2022511214000014
をＲＯＣｌと反応させて
Figure 2022511214000015
を形成する。ここで、Ｒは、置換又は非置換のアルキルから選択することができ、Ｘ１は、上記で定義した通りであり得る。
本明細書に記載の特定の化合物はまた、以下のように調製することができる：
ａ）式ＩＶの化合物
Figure 2022511214000016
をＲ２Ｂｒと反応させて
Figure 2022511214000017
を形成する。ここで、Ｘ１及びＲ２は上記で定義されたとおりであり得る。
本明細書に記載の特定の化合物はまた、以下のように調製することができる：
ａ）式ＶＩＩの化合物
Figure 2022511214000018
をＲ２Ｂｒと反応させ
Figure 2022511214000019
を形成する。ここで、Ｘ１及びＲ３は上記で定義されたとおりであり得る。
より具体的なＸ１基は、例えば、式ＶＩ又はＶＩＩＩをＨＯ（ＣＯ）ＣＲ４Ｒ５Ｒ６と反応させることによって加えることができ、ここで、‐（ＣＯ）Ｘ１は、‐（ＣＯ）ＯＲであり、Ｒ４Ｒ５Ｒ６は、それぞれ、Ｈ、置換又は非置換の炭化水素基、置換又は非置換の不均一基から独立して選択される。特に、Ｒ４Ｒ５Ｒ６はそれぞれ、置換又は非置換のアミド基から独立して選択することができる。特定の実施形態において、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ、Ｈ、置換又は非置換アルキル基から独立して選択され、Ｒ６は、‐ＮＲ（ＣＯ）ＣＲ７Ｒ８Ｒ９であり、ここで、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、それぞれ、Ｈ、ハロ基、置換又は非置換アルキル基から選択される。Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、ハロ基から選択できる。より具体的には、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、フルオロ基から選択することができる。
本明細書に記載の特定の化合物は、例えば、以下のように調製することもできる。
ａ）式ＶＩＡの化合物
Figure 2022511214000020
を１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びＣＦ３ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ（Ｆ３ＣｇｌｙＯＨ）と反応させ
Figure 2022511214000021
を形成する。ここで、Ｒ２は上記で定義された通りであり得る。
本明細書に記載の特定の化合物はまた、以下のように調製することができる：
ａ）式ＶＩＩＡの化合物
Figure 2022511214000022
のヒドロキシル基を保護して
Figure 2022511214000023
を形成する（ＰＧ＝保護基）：
ｂ）式ＶＩＩＢの化合物を１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及びＣＦ３ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ（Ｆ３ＣｇｌｙＯＨ）と反応させ、続いて脱保護して：
Figure 2022511214000024
を形成する。
本明細書に記載の特定の化合物は、例えば、以下のように調製することができる。
ａ）式ＸＸの化合物をＲＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｃｌと反応させ：
Figure 2022511214000025
Figure 2022511214000026
を形成する。ここで、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１０は、上で定義された通りであり得る。
本明細書に記載の特定の化合物はまた、以下のように調製することができる：
ａ）式ＸＸＩＩの化合物のヒドロキシル基を保護して
Figure 2022511214000027
Figure 2022511214000028
を形成する（ＰＧ＝保護基）：
ｂ）式ＸＸＩＩＢの化合物をＲ１０Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｃｌと反応させ、続いて脱保護して：
Figure 2022511214000029
を形成する。
一般に、本明細書に記載の化合物は、文献に知られているか、又は本明細書に例示されている反応及び標準的な操作を使用することによって調製することができる。
本明細書に記載の化合物は、痛風などの、炎症状態、疾患、及び／又は障害の治療に有用である。治療される痛風は、例えば、慢性痛風及び／又は急性痛風であり得る。特に、本明細書に記載の化合物は、痛風発作、痛風に関連する関節破壊などの少なくとも１つの痛風症状を治療することができる。例えば、本明細書に記載の化合物は、痛風性炎症を制限し、及び／又は炎症に関連する痛みを軽減することができる。
痛風は、炎症性関節炎の最も痛みを伴う一般的な形態の１つとして知られている。その有病率（西欧諸国では３～６％）は、痛風、肥満や腎不全などの高尿酸血症の主要な危険因子を促進する状態の上昇により、世界中で増加している。尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）結晶は痛風性関節炎の病因であり、循環中の尿酸の濃度がその溶解度（＞６ｍｇ／ｍＬ）を超えると関節や軟部組織に形成され、耐え難いほどの痛みを引き起こす強力な自然免疫反応を引き起こす。
痛風発作の最初のイベントには、ＭＳＵが誘発する組織内のマクロファージの活性化と関節内の細胞死が含まれる。これらの細胞イベントは、炎症反応を促進及び増幅する炎症誘発性サイトカインの放出につながる。ＩＬ‐１及びＩＬ‐８は、痛風の病因におけるサイトカインとして同定されている。ＩＬ‐１は、内皮細胞の表面での接着分子（Ｅ‐セレクチンなど）の発現の増加やケモカインの放出などを含む、痛風発作の初期の分子イベントを調整する。ＩＬ‐８は、好中球にとって最も強力な走化性物質の１つであり、影響を受けた関節の激しい痛みや腫れなどを含む、痛風の典型的な症状を引き起こす好中球の大量流入を促進する。動員された好中球は、ＭＳＵによって活性化され、炎症性サイトカイン、活性酸素種（ＲＯＳ）、プロテアーゼ、及び炎症反応を増幅する好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を放出する。好中球の濃度が高い場合、ＮＥＴはＭＳＵと相互作用して、痛風発作の解決に寄与する凝集ＮＥＴという名前の複合体を形成する。
痛風の治療は、その病因の２つの重要な側面、すなわちＭＳＵ結晶の発達と炎症を対象としている。前者に使用される薬にはキサンチンオキシダーゼ阻害剤（ＸＯＩ）が含まれ、後者にはコルヒチン、非ステロイド性抗炎症薬又はコルチコステロイドが含まれる。コルヒチンはまた、尿酸低下療法の開始による痛風発作の予防、ＸＯＩに不耐性の一部の患者、及びさまざまな期間の予防にも使用される。痛風発作の頻度と発生は予測できないが、尿酸低下療法を開始してから約４年間、患者が痛風発作に苦しむことは珍しくない。患者の平均６０％は、最初の発作から１～２年以内に痛風発作に苦しんでいる。
多くの患者が利用可能な抗炎症薬に対する相対的な禁忌に関連する複数の併存疾患に苦しんでいるため、痛風の治療は困難である。また、ほとんどの抗炎症薬は、ＭＳＵ誘発性炎症の根底にある分子メカニズムに対する特異性を欠いている。対照的に、コルヒチンは、ＭＳＵが誘導する好中球の活性化を阻害するが、細菌ペプチドｆＭＬＰが誘導する好中球の特定の応答は阻害しないため、痛風に関与する分子経路に対してある程度の特異性を示す。それにもかかわらず、コルヒチンの治療上安全な用量の範囲は非常に狭く、この薬のコンプライアンスが不十分である主な理由である胃腸系での大きな毒性を示す。
本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、毒性が低く、好中球などの造血細胞；痛風発作に豊富な炎症細胞に対してより特異的である。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１０２２８０５（Tuszynski et al.）で、抗有糸分裂薬の類似体であるコルヒチンが癌の治療に対して毒性が低いことが実証された。
有利なことに、本明細書に記載のコルヒチン誘導体の抗炎症活性は、コルヒチンの抗炎症活性に匹敵するだけでなく、コルヒチンが抗炎症特性を欠く用量で保存することができる（例えば、本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、コルヒチンよりもより低い用量（例えば、少なくとも約１０倍低い）で抗炎症効果を提供し得るものであり、したがって、ある面では、コルヒチンよりも強力である）。以下の例に示すように、化合物（９１）、４３、及び４７ａは、０．１μＭという低い用量で細胞内カルシウム濃度の増加を抑制することができる。対照的に、コルヒチンは１０μＭの濃度でカルシウムの動員に同様の阻害を誘発した（図７Ａ、Ｅ、Ｋ及びＬ）。
したがって、予期せぬことに、コルヒチン誘導体（９１）、（４７ａ）、及び（４３）は、コルヒチンと比較して約１０～約１００倍低い（約１０分の１～約１００分の１の）濃度；コルヒチンが効果がないことが示された用量で細胞内カルシウム貯蔵の動員を有意に減少させることができる（図７）。
他の炎症性疾患に対するコルヒチンの効果は、再発性心膜炎及び家族性地中海熱（ＦＭＦ）の治療で示されている（Slobodnock et al. The American Journal of Medicine (2015)））。地中海地域を起源とする集団の２００～１，０００人の一人に主に影響を与える遺伝性疾患であるＦＭＦの患者は、コルヒチンによる生涯にわたる治療の恩恵を受けている。コルヒチンはＦＭＦのゴールドスタンダード治療法である（https://www.fmffoundation.org/fmf）。心膜炎に関しては、現在のヨーロッパのガイドラインでは、コルヒチンを１日２ｍｇで１～２日間投与し、その後に維持量を投与することを推奨している（Slobodnock et al. The American Journal of Medicine (2015)）。コルヒチン誘導体の他の二次市場には、偽痛風、冠状動脈アテローム性動脈硬化症、血管炎、又はそれらの組み合わせなどの好中球媒介性炎症を伴う疾患が含まれるが、これらに限定されない。特に、偽痛風に関しては、コルヒチンがＣＰＰ関節炎の予防と急性治療に提案されている（Slobodnock et al. The American Journal of Medicine (2015)）。さらに、好中球が関与する複雑な免疫炎症経路がアテローム硬化性プラークの発生、成長、及び不安定性に関与している冠状動脈アテローム性動脈硬化症では、コルヒチンは炎症性メディエーターの血中レベルを抑制し、アテローム性動脈硬化症の進行と不安定性に関与しているコレステロール結晶誘発性好中球媒介性炎症を予防することが報告されている（Nidorf et al. 2014)）。本明細書に提示される結果に関して、ＣＣＩ及び他のコルヒチン誘導体は、痛風並びに他の炎症性疾患、状態、及び／又は障害、例えば、再発性心膜炎、ＦＭＦ、乾癬、炎症性腸疾患、喘息、心臓及び腎再灌流障害、成人呼吸困難症候群、血栓症、糸球体腎炎、関節リウマチ、骨関節炎、髄膜炎、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中を含む脳卒中、神経外傷／閉鎖頭部損傷、内毒素血症及び／又は毒性ショック症候群、エンドトキシン又は炎症性腸疾患によって誘発される炎症反応、結核、アテローム性動脈硬化症、筋肉変性、多発性硬化症、カシェキシア、骨吸収、乾癬性関節炎、ライター症候群、痛風、外傷性関節炎、風疹関節炎、急性滑膜炎、糖尿病、膵臓β細胞疾患、アルツハイマー病、偽痛風、心血管疾患、及び血管炎などの他の急性又は慢性炎症性疾患状態などの治療に使用されることが期待される。
通常、状態は痛風、偽痛風、心血管疾患、血管炎、又はアテローム性動脈硬化症である。
痛風の治療に関して、コルヒチンは、痛風発作に関与する主要な白血球である好中球の炎症作用のほとんどを弱めるので、この炎症性疾患の病因に関して最も特異性を示す。それにもかかわらず、このアルカロイドの投与は、有効性と治療を制限する副作用との間の治療指数が低いため、依然として困難である。実際、そして予想外に、本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、好中球に対して、コルヒチンと比較して増加した特異性を提供することができ、また、低用量でのコルヒチンと同様の抗炎症活性を有する。言い換えれば、本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、コルヒチンと同じ抗炎症効果をもたらすことが見出されたが、驚くべきことに、それらはコルヒチンよりも有意に強力であった。これらの予想外の結果は、本明細書に記載のコルヒチン誘導体をより低い用量で投与することを可能にする一方で、それらの増加した特異性が毒性及び望ましくない二次効果の可能性を減少させるという利点を提供する。慢性腎臓病に苦しむ痛風患者はコルヒチンを含む痛風発作の治療に使用される抗炎症薬の大部分に禁忌があるため、これはこれらの患者にとって特に重要である。
同じことが進行した肝機能障害のある患者にも当てはまる。本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、より低い用量で投与することができ、より高い特異性を有し、それによって毒性の可能性を減少させるので、それらは、胃腸合併症などのコルヒチン投与によって引き起こされる厄介な副作用の少なさと関連付けることができる。
本発明の化合物は、標準的な製薬慣行に従って、哺乳動物、典型的にはヒトなどの動物に、単独で、又は医薬組成物中の薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせて、任意選択でミョウバンなどの既知のアジュバントと組み合わせて、投与することができる。化合物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、及び皮下の投与経路を含めて、経口又は非経口的に投与することができる。
前述のように、本発明の化合物は経口投与することができる。本発明による化合物又は組成物の経口使用のために、選択された化合物は、例えば、錠剤又はカプセルの形態で、又は水溶液又は懸濁液として投与され得る。経口用錠剤の場合、一般的に使用される担体には乳糖及びコーンスターチが含まれ、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤が一般的に添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥コーンスターチが含まれる。経口使用に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化剤及び懸濁剤と組み合わされる。必要に応じて、特定の甘味料及び／又は香味料を加えることができる。筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内で使用する場合、通常、有効成分の無菌溶液を調製し、溶液のｐＨを適切に調整して緩衝する必要がある。静脈内使用の場合、製剤を等張にするために溶質の総濃度を制御する必要がある。
本発明の化合物はまた、治療されている痛風に対するそれらの特定の有用性のために選択される他の治療薬と組み合わせて及び／又は同時に投与することができる。例えば、本発明の化合物は、同時に又は連続して、抗痛風剤と組み合わせて、及び／又は同時に投与することができる。
抗痛風剤の例には、これらに限定されないが、以下が含まれる：非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、関節内糖質コルチコイド、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、組換え非ヒトウリカーゼ酵素、尿酸排泄促進剤、尿酸排泄剤、及びそれらの組み合わせ。本化合物はまた、他の関連する適応症を治療するための成分と同時投与される場合など、他の療法とともに有用であり得る。
キサンチンオキシダーゼ阻害剤には、酵素キサンチンオキシダーゼを阻害することによって血清尿酸レベルを低下させる化合物が含まれる。キサンチンオキシダーゼ阻害剤の例には、フェブキソスタット、プロポリス、オキシプリノール、チソプリン、又はイノシトール及びアロプリノールが含まれるが、これらに限定されない。
組換え非ヒトウリカーゼ酵素には、ラスブリカーゼ又はペグロティカーゼが含まれる。
尿酸排泄促進剤又は尿酸排泄剤は、腎臓の血流への尿酸の再取り込みを防ぎ、排泄の正味の増加をもたらすことにより、体内に蓄積された尿酸の急速な排泄を加速する化合物を指す。このような尿酸排泄促進剤又は尿酸排泄剤の例には、プロベネシド、ベンズブロマロン、スルフィンピラゾン、グアイフェネシン、ロサルタン、アトルバスタチン、アムロジピン、副腎皮質刺激ホルモン又はフェノフィブラートが含まれる。
ＮＳＡＩＤＳには、ジクロフェナク、インドメタシン、ナプロキセン、スリンダク、ルミラコキシブ、又はＣｏｘ‐２選択的阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。Ｃｏｘ‐２選択的阻害剤には、エトリコキシブ、セレコキシブ（ＳＣ‐５８６３５）、５‐ブロモ‐２‐（４‐フルオロフェニル）‐３‐（４‐（メチルスルホニル）フェニル）‐チオフェン（ＤＵＰ）‐６９７）、フロスリド（ＣＧＰ‐２８２３８）、メロキシカム、６‐メトキシ‐２ナフチル酢酸（６‐ＭＮＡ）、ＭＫ‐９６６（Ｖｉｏｘｘ）、ナブメトン（６‐ＭＮＡプロドラッグ）、ニメスリド、Ｎ‐［２‐（シクロヘキシルオキシ）‐４‐ニトロフェニル］‐メタンスルホンアミド（ＮＳ‐３９８）、ＳＣ‐５７６６、ＳＣ‐５８２１５、又は３‐ホルミルアミノ‐７‐メチルスルホニルアミノ‐６‐フェノキシ‐４Ｈ‐１‐ベンゾピラン‐１‐オン（Ｔ‐６１４）が含まれるが、これらに限定されない。
抗炎症剤はコルチコステロイドであり得る。コルチコステロイドには、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α‐ジフルオロ‐１７‐［（２‐フラニルカルボニル）オキシ］‐１１β‐ヒドロキシ‐１６α‐メチル‐３‐オキソ‐アンドロスタ‐１，４‐ジエン‐１７β‐カルボチオ酸Ｓ‐フルオロメチルエステル、６α，９α‐ジフルオロ‐１１β‐ヒドロキシ‐１６α‐メチル‐３‐オキソ‐１７α‐プロピオニルオキシ‐アンドロスタ‐１，４‐ジエン‐１７β‐カルボチオ酸Ｓ‐（２‐オキソ‐テトラヒドロ‐フラン‐３Ｓ‐イル）エステル、ベクロメタゾンエステル、１７‐プロピオン酸エステル又は１７，２１‐ジプロピオン酸エステル、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾンエステル、フロ酸エステル、トリアムシノロンアセトニド、ロフレポニド、シクレソニド、プロピオン酸ブチクソコート、ＲＰＲ‐１０６５４１、ＳＴ‐１２６、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α‐ジフルオロ‐１１β‐ヒドロキシ‐１６α‐メチル‐１７α‐［（‐４‐メチル‐１，３‐チアゾール‐５‐カルボニル）オキシ］‐３‐オキソ‐アンドロスタ‐１，４‐ジエン‐１７β‐カルボチオ酸Ｓ‐フルオロメチルエステル及び６α，９α‐ジフルオロ‐１７α‐［（２‐フラニルカルボニル）オキシ］‐１１β‐ヒドロキシ‐１６α‐メチル‐３‐オキソ‐アンドロスタ‐１，４‐ジエン‐１７β‐カルボチオ酸Ｓ‐フルオロメチルエステル、又は６α，９α‐ジフルオロ‐１７α‐［（２‐フラニルカルボニル）オキシ］‐１１β‐ヒドロキシ‐１６α‐メチル‐３‐オキソ‐アンドロスタ‐１，４‐ジエン‐１７β‐カルボチオ酸Ｓ‐フルオロメチルエステルが含まれるが、これらに限定されない。
固定用量として処方される場合、そのような組み合わせ製品は、以下に記載される用量範囲内の本発明の化合物及びその承認された用量範囲内の他の薬学的に活性な薬剤を使用する。あるいは、本明細書に記載の化合物は、組み合わせ製剤が不適切である場合、既知の薬学的に許容される薬剤と共に連続して使用され得る。
本発明による化合物がヒト対象に投与される場合、日用量は通常、処方する医師によって決定され、用量は、一般に、個々の患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重症度に応じて変化する。
１つの例示的な用途では、痛風の治療を受けている哺乳動物に適切な量の化合物が投与される。投与は、１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重を超える；１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重まで；１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約２５０ｍｇ／ｋｇ体重まで；又は１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの量で行われる。これらの投与量は、より具体的には経口で使用することができる。
用量の任意の組み合わせを使用することができる。この組み合わせは、順次又は同時に使用することができる。
β‐チューブリンコルヒチン結合部位
５つの最も一般的なヒトβ‐チューブリンアイソタイプのモデルが決定されており、コルヒチン結合部位は、アイソタイプの特異性に基づいたドラッグデザインに最も有望であると本明細書で特定されている。この結合部位をテンプレートとして使用して、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１０２２８０５に記載されているコルヒチン誘導体は、アイソタイプ間の固有の変動、及び各β‐チューブリンアイソタイプ上のコルヒチン結合部位が幾何学的特性と生化学的特性の両方において異なるという事実に基づいて、目的のβ‐チューブリンアイソタイプに優先的に結合するように設計された。そこに記載されているように、癌細胞で過剰発現されるチューブリンのアイソタイプであるβ‐ＩＩＩチューブリンに優先的に結合するコルヒチン類似体が生成され、これらの誘導体は低用量で腫瘍増殖を阻害する点でタキソールよりも強力であることがわかった。
上記のアプローチを使用して、コルヒチンの構造を変更し、β‐ＶＩチューブリンアイソタイプに結合する能力を高めた。β‐ＶＩチューブリンは、好中球などの免疫細胞で発現する主要なβ‐チューブリンアイソタイプの１つであるため、ターゲットとして重要である（図１５を参照）。さらに、β‐ＶＩチューブリンへの結合は、このアイソタイプが造血細胞に特異的であるため、非造血細胞によるオフターゲット効果を最小限に抑える。β‐ＶＩチューブリンアイソタイプは、特にコルヒチン結合領域で他とは非常に異なり、人体での分布が狭く、結合する薬物に対して高レベルの特異性と選択性を提供する。
本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、βＶＩ、βＶに優先的に結合し、βＩチューブリンへの親和性は低い。本明細書に記載の計算方法は、痛風炎症などの炎症状態に関与する細胞に対する特異性が増加した、コルヒチンよりもはるかに低い濃度で予想外に活性であり得、コルヒチンの望ましくない副作用を回避できるコルヒチン誘導体を提供する。
コルヒチン結合を調べた。コルヒチン結合部位を構成する残基の配列は、すべてのヒトチューブリンアイソタイプの中で最大の変動（７７．８％の同一性）を示している（Huzil J.T. et al., Nanotechnology. 2006:17:S90-S100）。この結合部位は、コルヒチノイド、ベンズイミダゾール（Laclette J.P. et al., Biochem Biophys Res Commun. 1980; 92:417-23; Tahir S.K., Biotechniques. 2000; 29:156-60; Russell G.J. et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 1995; 35:1153-9; 及びHoebeke J. et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 1976; 69:319-24）及びポドフィロトキシン（Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202）を含むいくつかの天然化合物と相互作用することが以前に示されており、いくつかの結合コンフォメーションに対応できるようにしている（Garland D.L., Biochemistry. 1978; 17:4266-72; Sackett D.L. et al., Biochemistry, 1993; 32:13560-5; Andreu J.M. et al., Biochemistry. 1982; 21:6465-76; Chaudhuri A.R. et al., J. Mol. Biol., 2000; 303:679-92）。コルヒチンは非常に強力な抗有糸分裂活性を有し、これは毒性又は毒性に近いレベルでのみ観察され、痛風の治療としての使用を制限する一方で、造血幹細胞で発現されるチューブリンアイソタイプに対する選択性が高い類似化合物を比較するための標準として本明細書で使用される。
計算スクリーニングを使用して、β‐チューブリンアイソタイプ親和性（特にβ‐ＶＩへの親和性）に基づいて、より優れた抗炎症特性を有する可能性のあるコルヒチン誘導体を決定した。次に、これらの誘導体（例えば、誘導体９１、４７ａ、及び４３）の抗炎症特性を、本明細書に記載のインビトロ及びインビボ試験を使用して検証した。例えば、本明細書に記載の化合物９１（例えば、図７を参照）などの特定のβ‐チューブリンアイソタイプに対してより高い親和性を有するコルヒチン誘導体は、炎症細胞に対するそれらの効果においてコルヒチンよりも優れていることが見出された（例えば、コルヒチン毒性の不利な点なしに、約１０から約１００倍低い（約１０分の１から約１００分の１の）濃度でのカルシウム動員の阻害）。本明細書に記載の誘導体の抗炎症特性は、以下の実施例に概説されている。
チューブリンといくつかのリガンドとの相互作用に関する構造情報は多数あるが、チューブリンのコンフォメーションは時間の経過とともに減衰し、薬物の結合自体がタンパク質自体の中で有意なコンフォメーション変化を引き起こす可能性がある（Luduena R.F. et al., Biochem. 1995; 34:15751-9; Chaudhuri A.R. et al., J. Mol. Biol., 2000; 303:679-92; 及び Schwarz P.M. et al., Biochem. 1998; 37:4687-92）。したがって、結合部位の特定の固定されたコンフォメーションを使用したモデリング予測は、信頼できない可能性がある。これは特にコルヒチン結合に当てはまり、非結合型のβ‐チューブリンはコルヒチン結合空洞が完全に欠如していることを示している（Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7）。この制限を克服するために、最初に、ヒトβ‐チューブリンアイソタイプ全体に見られるコルヒチン結合部位の３つの代表的なモデルが作成された。第二に、体系的なドッキング手順が実行された。これは、シミュレートされたアニーリング法によってコルヒチン結合部位のコンフォメーション空間をサンプリングしようとするものである。
計算モデリング手法を使用して、造血細胞で発現するβ‐チューブリンアイソタイプの特異性を高めることができるモデルシステムを設計するために、コルヒチンにいくつかの変更を加えた。アイソタイプ間の違いを調べるために、結晶構造中で結合したコルヒチンの下にある空洞を調べた。特に、いくつかのＣ３‐デメチルチオコルヒチン誘導体及びＣ１‐デメチルコルヒチン誘導体が合成された。
最終的に、チューブリンアイソタイプ特異的薬剤は、現在処方されている対応物よりも副作用が少ないはずである。これは、それらが炎症に関連する特定のβ‐チューブリンアイソタイプを発現している細胞でのみ微小管に結合して破壊するためである。これらの結果はまた、モデリングがより良い薬物を生成する可能性が高く、チューブリンを使用して合理的な薬物設計が可能であることを示唆している。
上記の開示は、一般に、本発明を説明している。以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、例示のみを目的として説明されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況が好都合であると示唆又は提供する可能性があるため、形式の変更及び同等物の代替が考慮される。本明細書では特定の用語が使用されているが、そのような用語は説明的な意味で意図されており、限定を目的とするものではない。
例１‐コルヒチン誘導体の合成と分析
材料と方法
研究で使用された、すべての化合物及びコルヒチン、Ｎ‐［（７Ｓ）‐１，２，３，１０‐テトラメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１）は、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ（オークビル、オンタリオ州、カナダ）から購入した。
コルヒチン化合物の合成
合成スキームについては、図１～３を参照のこと。
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐１‐（（メチル）カルボニルオキシ）‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（２）及びＮ‐［（７Ｓ）‐１‐ヒドロキシ‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（３）。（２）と（３）の合成は、Ｂｌａｄｅ‐Ｆｏｎｔ（A. Blade-Font, Afinidad, 36 (1979) 329-331）から採用され、図１に示されている。
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１‐（（エチル）カルボニルオキシ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（４）及びＮ‐［（７Ｓ）‐１‐（（（メチル）エチル）カルボニルオキシ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（５）。
１ミリモルの（２）を２．５ｍＬの水酸化ナトリウム溶液に溶解した。溶液を０℃に冷却した。１ミリモルのＣＨ３ＣＨ２ＣＯＣｌ又は（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＣｌを３．５ｍＬのアセトンに溶解し、化合物（４）又は（５）に添加した。溶液を１５時間静置した後、２５ｍＬのアルカリ水を加えた。得られた生成物をクロロホルムを使用して抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。（４）と（５）の合成を図２に示す。
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１‐（エトキシ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（６）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１‐（エトキシ‐１‐メチル）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（７）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐１‐（２‐メチルプロポキシ）‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（７ａ）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１‐（ブトキシ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（７ｂ）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１‐（（ブタ（３‐エン）オキシ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（７ｃ）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（プロパノキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（８）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（（プロパ（２‐エン）オキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（９）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（（フェニル）メトキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１０）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（（（３‐メトキシ）プロパン）オキシ）（３‐メトキシ））‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１１）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（（フェニル（３‐クロロ））メトキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１２）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（（ピリジン（３））イル）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１３）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（（フェニル（２‐クロロ））メトキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１４）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐９‐オキソ‐１‐（（（フェニル（４‐クロロ））メトキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１５）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐２，３，１０‐トリメトキシ‐１‐（（メチル）シクロヘキサン）‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（１６）。
１ｍｍｏｌの（２）化合物を２．５ｍＬの水酸化ナトリウム溶液に溶解し、溶液を０℃に冷却した。１ミリモルの臭化物誘導体（例：（６）の場合は１‐ブロモエタン、（７）の場合は２‐ブロモプロパン、（７ａ）の場合は１‐ブロモ‐２‐メチルプロパン、（７ｂ）の場合は１‐ブロモ‐ブタン、（７ｃ）の場合は４‐ブロモブタ‐１‐エン、（８）の場合は１‐ブロモプロパン、（９）の場合は３‐ブロモプロパ‐１‐エン、（１０）の場合は（ブロモメチル）ベンゼン、（１１）の場合は１‐メトキシ‐２‐ブロモエタン、（１２）の場合は１‐ブロモメチル‐３‐クロロベンゼン、（１３）の場合は３‐（ブロモメチル）ピリジン、（１４）の場合は１‐ブロモメチル‐２‐クロロベンゼン、（１５）の場合は１‐ブロモメチル‐４‐クロロベンゼン、及び（１６）の場合は（ブロモメチル）シクロヘキサンを３．５ｍＬのアセトンに溶解した。各溶液を１５時間放置した。次に、２５ｍＬのアルカリ水を加えた。クロロホルムを使用して化合物を抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。（６‐１６）の合成を図３に示す。
Ｎ‐デアセチル‐Ｎ‐（Ｎ‐トリフルオロアセチルアミノアシル）コルヒチンの一般的な調製手順：
メタノール（５０ｍＬ）及び２Ｎ ＨＣｌ（２５ｍＬ）中の３ｍｍｏｌの誘導体（６‐１６）を、１日間撹拌しながら９０℃で加熱した。反応混合物を冷却し、ＮａＨＣＯ３で中和した。生成物を塩化メチレンで抽出し、ブラインで洗浄した。抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。脱アセチル化された化合物（１７‐２７）はＣＨ２Ｃｌ２から結晶化された。
１ミリモルの脱アセチル化化合物（１７～２７）及び［（トリフルオロアセチル）アミノ］酢酸（１ミリモル）を、室温でジクロロメタン（６ｍＬ）に溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１ミリモル）を加えた。２時間後、懸濁液を０℃に冷却し、濾過した。生成物（２８～３８）を、ジクロロメタン／メタノール（１：０から０：１）で溶出するシリカゲルカラムでクロマトグラフィーにかけた。（２８‐３８）の結晶化は、ジクロロメタン：エチルエーテル（１：１）を用いて実施された。
分析的解析

(2)C(23)H(25)O(7)N(1); 計算値 M, 427, 実測値 EIMS m/e 427.1 (M+); (3) C(21)H(23)O(6)N(1); 計算値 M, 385, 実測値 EIMS m/e 385.1 (M+); (4) C(24)H(27)O(7)N(1); 計算値 M, 441, 実測値 EIMS m/e 441.1 (M+); (5) C(25)H(29)O(7)N(1); 計算値 M, 455 実測値 EIMS m/e 455.0 (M+); (6) C(23)H(27)O(6)N(1); 計算値 M, 413, 実測値 EIMS m/e 413.1 (M+); 元素分析計算値 C% 66.83, H% 6.55, N% 23.22 実測値: C% 66.82, H% 6.54, N% 23.22; (7) C(24)H(29)O(6)N(1); 計算値 M, 427, 実測値 EIMS m/e 427.1 (M+); 元素分析計算値 C% 67.44, H% 6.77, N% 3.22, 実測値: C% 67.41, H% 6.73, N% 3.21; (8) C(24)H(29)O(6)N(1); 計算値 M, 427, 実測値 EIMS m/e 427.1 (M+); 元素分析計算値 C% 67.44, H% 6.79, N% 32.78, 実測値: C% 67.44, H% 6.80, N% 32.77; (9) C(24)H(27)O(6)N(1); 計算値 M, 425, 実測値 EIMS m/e 425.1 (M+); 元素分析計算値 C% 67.76, H% 6.35, N% 3.29 実測値: C% 67.77, H% 6.33, N% 3.28; (10) C(28)H(28)O(6)N(1); 計算値 M, 475, 実測値 EIMS m/e 475.2 (M+); 元素分析計算値 C% 70.88, H% 5.91, N% 2.95 実測値: C% 70.87, H% 5.92, N% 2.93; (11) C(24)H(29)O(7)N(1); 計算値 M, 443, 実測値 EIMS m/e 443.1 (M+); 元素分析計算値 C% 65.01, H% 6.54, N% 3.16 実測値: C% 65.02, H% 6.53, N% 3.11; (12) C(28)H(27)O(6)N(1)Cl(1); 計算値 M, 509, 実測値 EIMS m/e 509.1 (M+); 元素分析計算値 C% 71.04, H% 6.13, N% 2.93 実測値: C% 71.05, H% 6.12, N% 2.95; (13) C(27)H(28)O(6)N(2); 計算値 M, 476, 実測値 EIMS m/e 476.1 (M+); 元素分析計算値 C% 68.06, H% 5.88, N% 5.88, 実測値: C% 68.09, H% 5.86, N 5.89%; (14) C(28)H(28)O(6)N(1)Cl(1); 計算値 M, 509, 実測値 EIMS m/e 509.1 (M+); 元素分析計算値 C% 66.01, H% 5.50, N% 2.94, Cl% 6.87 実測値: C% 66. 03, H% 5.51, N% 2.95, Cl% 6.88; (15) C(24)H(29)O(7)N(1); 計算値 M, 509, 実測値 EIMS m/e 509.1 (M+); 元素分析計算値 C% 65.01, H% 6.09, N% 3.16, Cl% 7.90, 実測値: C% 65.02, H% 6.07, N% 3.10, Cl% 7.92; (16) C(28)H(34)O(6)N(1); 計算値 M, 495, 実測値 EIMS m/e 495.2 (M+); 元素分析計算値 C% 70.02, H% 7.09, N% 2.91 実測値: C% 70.04, H% 7.08, N% 2.93; (17) C(21)H(25)O(5)N(1); 元素分析計算値 C% 67.92, H% 7.27, N% 3.77 実測値: C% 67.93, H% 7.28, N% 3.78; (18) C(22)H(27)O(5)N(1) 元素分析計算値 C% 68.57, H% 7.01, N% 3.77 実測値: C% 68.59, H% 7.03, N% 3.79; (19) C(22)H(27)O(5)N(1); 元素分析計算値 C% 68.63, H% 7.04, N% 3.78 実測値: C% 68.62, H% 7.05, N% 3.79; (20) C(22)H(25)O(5)N(1); 元素分析計算値 C% 68.92, H% 6.52, N% 3.65 実測値: C% 68.94, H% 6.53, N% 3.67; (21) C(26)H(26)O(5)N(1); 元素分析計算値 C% 72.22, H% 6.01, N% 3.24 実測値: C% 72.21, H% 6.04, N% 3.23; (22)C(22)H(27)O(6)N(1); 元素分析計算値C% 65.83, H% 6.73, N% 3.49 実測値: C% 65.82, H% 6.73, N% 3.48; (23) C(26)H(25)O(5)N(1)Cl(1); 元素分析計算値 C% 66.95, H% 5.36, N% 3.02, Cl 7.51 実測値: C% 66.93, H% 5.34, N% 3.01, Cl 7.53; (24) C(22)H(26)O(5)N(1); 元素分析計算値 C% 81.25, H% 6.77, N% 3.64 実測値: C% 81.26, H% 6.78, N% 3.66; (25)C(26)H(26)O(5)N(1)Cl(1); 元素分析計算値 C% 66.80, H% 5.56, N% 2.99, Cl% 7.49, 実測値: C% 66.81, H% 5.55, N% 2.98, Cl% 7.48; (26)C(22)H(27)O(5)N(1); 元素分析計算値C% 77.92, H% 7.01, N% 3.63, 実測値: C% 77.93, H% 7.03, N% 3.65; (27)C(26)H(32)O(5)N(1); 元素分析計算値 C% 71.23, H% 7.30, N% 3.19 実測値: C% 71.22, H% 7.32, N% 3.20; (28)C(25)H(27)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 57.25, H% 5.15, N% 5.18, F% 10.85, 実測値: C% 57.25, H% 4.99, N% 5.34, F% 10.86; (29) C(26)H(29)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.59 実測値: C% 56.38, H% 5.3, N% 5.3, F% 10.87; (30) C(26)H(29)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.59, 実測値: C% 57.58, H% 5.32, N% 5.28, F% 10.59; (31) C(26)H(27)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.56, 実測値: C% 57.99, H% 5.88, N% 5.28, F% 10.55; (32)C(30)H(28)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 59.92, H% 4.66, N% 4.65, F% 9.46, 実測値: C% 59.71, H% 4.65, N% 4.37, F% 9.49; (33) C(26)H(29)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.59 実測値: C% 56.38, H% 5.21, N% 4.68, F% 9.55; (34)C(30)H(27)O(7)N(2)Cl(1)F(3); 元素分析計算値 C% 56.77, H% 4.28, N% 4.13, F% 8.41, 実測値: C% 56.74, H% 4.29, N% 4.12, F% 8.43; (35) C(26)H(27)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 58.20, H% 4.86, N% 4.69, F% 9.56, 実測値: C% 58.12, H% 4.87, N% 4.69, F% 9.57; (36)C(30)H(28)O(7)N(2)Cl(1)F(3); 元素分析計算値 C% 58.06, H% 4.15, N% 4.12, F% 8.41 実測値: C% 58.06, H% 4.14, N% 4.13, F% 8.40; (37)C(26)H(28)O(7)N(2)Cl(1)F(3); 元素分析計算値 C% 54.54, H% 4.87, N% 4.73, F% 9.25, 実測値: C% 54.53, H% 4.88, N% 4.72, F% 9.26; (38) C(30)H(34)O(7)N(2)F(3); 元素分析計算値 C% 60.91, H% 5.75, N% 4.73, F% 9.64, 実測値: C% 60.79, H% 5.67, N% 4.63, F%9.67.
チオコルヒチン化合物の合成（図４）
チオコルヒチン、Ｎ‐［（７Ｓ）‐１，２，３‐トリメトキシ‐１０‐メチルスルファニロ‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（３９）：コルヒチン（１）（１ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのメタノール／ジメチルホルムアミド（１：１）に７０‐８０℃で溶解した。溶液を室温に冷却し、ナトリウムメタンチオラート（２ミリモル）を加えた。混合溶液を一晩撹拌した。水（２０ｍＬ）を加え、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濃縮した。エチルエーテル／アセトン（１：１）からの残留物の結晶化により、７１％の収率で生成物（３９）が得られた。
Ｎ‐［（７Ｓ）‐３‐ヒドロキシ‐１，２‐ジメトキシ‐３‐ヒドロキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（４０）：１０ｍＬのメタノールを使用して１ｍｍｏｌのチオコルヒチン（３９）を溶解し、３０ｍＬの０．２Ｎ塩酸を添加した。メタノールを蒸発させ、冷却し、水酸化ナトリウム溶液をｐＨ値が１１になるまで加え、得られたアルカリ性溶液をクロロホルムで抽出して、非フェノール性物質を除去した。水酸化ナトリウム溶液（赤色）を塩酸で酸性化し、クロロホルムで抽出した。乾燥及び濃縮後、（４０）の収率は５８％であった。
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐３‐（プロパ（２‐エン）オキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（４１）、Ｎ‐［（７Ｓ）‐３‐エトキシ‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（４２）、及びＮ‐［（７Ｓ）‐３‐プロポキシ‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アセトアミド（４３）：１ミリモルの（４０）化合物を２．５ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に溶解した。得られた溶液を０℃に冷却して、３‐ブロモプロパ‐１‐エン（１ミリモル）で化合物（４１）を得るか、１‐ブロモエタン（１ミリモル）で化合物（４２）を得るか、又は１‐ブロモプロパン（１ｍｍｏｌ）で化合物（４３）を得て、３．５ｍＬアセトンに溶解し、冷却した溶液に加えた。溶液を１５時間静置した後、２５ｍＬのアルカリ水を加えた。得られた生成物をクロロホルムを使用して抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。（４１）の収率は６８％、（４２）の収率は７１％であった。
Ｎ‐デアセチル‐Ｎ‐（Ｎ‐トリフルオロアセチルアミノアシル）チオコルヒチンの調製：
Ｎ‐［（７Ｓ）‐３‐ヒドロキシ‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アミン（４４）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐３‐（プロパ（２‐エン）オキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アミン（４５）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐３‐エトキシ‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］アミン（４６）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐３‐ヒドロキシ‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］‐Ｎ‐［（トリフルオロアセチル）グリシル］アセトアミド（４７）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐３‐（プロパ‐２‐エノキシ）‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］‐Ｎ‐［（トリフルオロアセチル）グリシル］アセトアミド（４８）；
Ｎ‐［（７Ｓ）‐３‐エトキシ‐１，２‐ジメトキシ‐１０‐メチルスルファニル‐９‐オキソ‐５，６，７，９‐テトラヒドロベンゾ［α］ヘプタレン‐７‐イル］‐Ｎ‐［（トリフルオロアセチル）グリシル］アセトアミド（４９）。
各派生物（４４‐４６）、及び（４７‐４９）は同様の方法で調製された。１ミリモルの適切な誘導体（４０）又は（４１）又は（４２）を２Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）を含むメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、９０℃で加熱して２４時間撹拌した。反応混合物を冷却し、ＮａＨＣＯ３で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。結晶化は（１：１）ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨからであった。脱アセチル化化合物（４４）、（４５）、（４６）の収率は、それぞれ５８％、６３％及び７１％であった。
（４４）又は（４５）又は（４６）の脱アセチル化化合物１ミリモル及びＮ‐トリフルオロアセチロアミノ酸（１ミリモル）を室温で溶解し、ジクロロメタン（６ｍＬ）を撹拌しながら加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１ミリモル）を懸濁液に加え、２時間後に０℃に冷却して濾過した。各化合物（４７）又は（４８）又は（４９）をジクロロメタン：エチルエーテル（１：１）溶液から結晶化させた。（４７）、（４８）、及び（４９）の収率はそれぞれ６４％、６７％、７５％であった。
（３９）、（４０‐４２）、（４４‐４６）及び（４７‐４９）化合物の分析

コルヒチン（１）: M.p. 275 °C; (39): M.p. 250°C -252°C; 元素分析計算値C(22)H(25)N(1)O(5)S(1): C% 63.60, H% 6.06, N% 3.37, S%7.72; 実測値: C% 63.71, H% 6.15, N% 3.42, S% 7.79; (40): M.p. 306°C; 元素分析計算値C(21)H(23)O(5)N(1)S(1): C% 62.8, H% 5.8, N% 3.5, S% 8.0, 実測値: C% 62.9, H% 5.8, N% 3.3, S% 7.5; 計算値 M, 401.1, 実測値 EIMS m/e 401.1 (M+); (41): M.p. 306°C; 元素分析計算値 C(24)H(27)O(5)N(1)S(1), C% 65.3, H% 6.12, N% 3.17, S% 7.24, 実測値: C% 65.07, H% 6.59, N% 3.21, S% 7.28; 計算値M, 454.5, 実測値 EIMS 454.5 (M+Na+); 442.5; (42): M.p. 273°C; 元素分析計算値 C(23)H(27)O(5)N(1)S(1), C% 64.33, H% 18.64, N% 3.26, S% 7.45, 実測値: C% 64.4, H%18.9, N% 3.27, S% 7.61; 計算値 M, 452.6, 実測値 EIMS 452.6 (M+Na+); (44):M.p. 281°C; 元素分析計算値 C(19)H(21)O(4)N(1)S(1), C% 63.51, H% 5.91, N% 3.88, S% 8.92, 実測値: C% 63.55, H% 5.83, N% 3.75, S% 8.93; (45): M.p. 254°C; 元素分析計算値 C(22)H(25)O(4)N(1)S(1), C% 65.8, H% 6.77, N% 3.52, S% 7.99, 実測値: C% 65.83, H% 6.49, N% 3.63, S% 8.31; (46): M.p. 276°C; 元素分析計算値 C(21)H(25)O(4)N(1)S(1), C% 65.81, H% 6.50, N% 3.6, S% 8.24, 実測値: C% 65.12, H% 6.54, N% 3.57, S% 8.27; (47): M.p. 284°C; 元素分析計算値 C(23)H(23)O(6)N(2)S(1)F(3), C% 55.42 , H% 4.61, N% 2.92, S% 6.42, F% 11.44 実測値: C% 55.43, H% 4.62, N% 2.91, S% 6.42, F% 11.44; (48): M.p.324°C; 元素分析計算値C(26)H(27)O(6)N(2)S(1)F(3), C% 56.52, H% 4.89, N% 5.07, S% 5.79, F% 10.32 実測値: C% 56.52, H% 4.87, N% 7.01, S% 5.79, F% 10.32; (49): M.p. 256°C; 元素分析計算値 C(25)H(27)O(6)N(2)S(1)F(3), C% 57.03, H% 5.13, N% 5.32, S% 6.08, F% 10.87 実測値: C% 53.67, H% 4.5, N% 5.32, S% 6.05; F% 10.85.
コルヒチン誘導体の特定の合成
化合物（２）
Figure 2022511214000030
水（２０００ｍＬ）中の１（３０．０ｇ）及びナトリウムチオメトキシド（３０．０ｍＬ）の溶液を室温で一晩撹拌した。反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２０．０ｇ、６５％）を得た。
化合物（６）、（１７）及び（２８）
Figure 2022511214000031
１（１．０ｇ、２．５１ｍｍｏｌ）及び塩化アセチル（３ｍＬ）の溶液に、テトラクロリド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１ｍＬ）を加え、混合物を室温で４０時間撹拌した。粗生成物を直接次のステップに使用した。
メタノール／水中の２（粗製）及び水酸化リチウム（４当量）の溶液を室温で１時間撹拌した。水相を抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。再結晶（０．２ｇ、２１％、２ステップ）により生成物を得た。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３（８００ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、ブロモエタン（４５０ｍｇ、４．１６ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１．２ｇ、８．３１ｍｍｏｌ）の混合物を、９０℃で２時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．５ｇ、６０％）を得た。
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の４（７００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．７ｇ、１６．９５モル）及びＤＭＡＰ（８３ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１５ｍＬ）中の５（粗製）及びナトリウムメトキシド（３６５．０ｍｇ、６．７６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。次に、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。抽出物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．６ｇ）を得た。
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の６（６００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）の溶液を室温で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮して、生成物（０．４５ｇ、９６％）を得た。
７（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（３９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２７ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、Ｆ３ＣＧｌｙＯＨ（２８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５４ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）中の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２２ｍｇ、３１％）を得た。
化合物（１１）、（２２）及び（３３）
Figure 2022511214000032
１（１．０ｇ、２．５１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アセチル（３ｍＬ）をテトラクロリド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１ｍＬ）に加え、混合物を室温で４０時間撹拌した。粗生成物を直接次のステップに使用した。
メタノール／水中の２（粗製）及び水酸化リチウム（４当量）の溶液を室温で１時間撹拌した。水相を抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。再結晶により生成物を得た（０．２ｇ、２１％、２ステップ）。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３（８００ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、１‐ブロモ‐２‐メトキシエタン（５８０ｍｇ、４．１６ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１．１５ｇ、８．３１ｍｍｏｌ）の混合物を、７５℃で３時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．５ｇ、５４％）を得た。
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の４（５００ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．５ｇ、１１．２９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（５５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１５ｍＬ）中の５（粗製）及びナトリウムメトキシド（２４４．０ｍｇ、４．５２ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。次に、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。抽出物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．４５ｇ）を得た。
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の６（０．６ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）の溶液を室温で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮して、生成物（０．４５ｇ、９４％）を得た。
７（６５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、Ｆ３ＣＧｌｙＯＨ（４２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）中の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２５ｍｇ、２８％）を得た。
化合物（１３）、（２４）及び（３５）
Figure 2022511214000033
１（１．０ｇ、２．５１ミリモル）の溶液に、塩化アセチル（３ｍＬ）をテトラクロリド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１ｍＬ）に加え、混合物を室温で４０時間撹拌した。粗生成物を直接次のステップに使用した。
メタノール／水中の２（粗製）及び水酸化リチウム（４当量）の溶液を室温で１時間撹拌した。水相を抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。再結晶により生成物を得た（０．２ｇ、２１％、２ステップ）。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３（１．０ｇ、２．６ミリモル）、３‐（クロロメチル）ピリジン（０．６４ｇ、３．９ミリモル）及び炭酸カリウム（１．０８ｇ、７．８ミリモル）の混合物を９０℃で８時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．７ｇ、５８％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の４（７００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．２ｇ、１４．７１モル）及びＤＭＡＰ（７２ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物（０．７ｇ、８７％）を得た。
メタノール（１０ｍＬ）中の５（０．７ｇ、１．２２ミリモル）及びナトリウムメトキシド（１３１．０ｍｇ、２．４３ミリモル）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の６（粗製）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０．３ｇ）を得た。
７（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３１ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、Ｆ３ＣＧｌｙＯＨ（３９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）中の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２２ｍｇ、３２％）を得た。
化合物（４０）、（４４）及び（４７）
Figure 2022511214000034
リン酸（１２０ｍＬ）中の１（４．０ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、１５％水酸化ナトリウム水溶液を加えることによりｐＨ５に調整し、続いてジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をアセトンでの結晶化により精製して、表題化合物（１．８ｇ、６７％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の２（６００ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．３ｇ、１４．９６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１０ｍＬ）中の３（粗製）及びナトリウムメトキシド（１２０．０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の４（粗製）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０．４ｇ）を得た。
０℃に冷却したジクロロメタン（３ｍＬ）中の５（５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化ｔｅｒｔ‐ブチルジメチルシリル（２１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を、クロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物（３０ｍｇ、４５％）。
６（３０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（２４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、Ｆ３ＣＧｌｙＯＨ（２２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）中の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得て、これをさらに精製することなく次のステップに直接使用した。
ＴＨＦ（３ｍＬ）中の７（粗製）の溶液に、ＴＢＡＦ（２８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、クロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２０ｍｇ）を得た。
化合物４７ａ
Figure 2022511214000035
水（２０００ｍＬ）中の１（３０．０ｇ）及びナトリウムチオメトキシド（３０．０ｍＬ）の溶液を室温で一晩撹拌した。反応液をジクロロメタンで抽出し、有機層を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２０．０ｇ、６５％）を得た。
ＴＨＦ（２２０ｍｌ）中の２（１５．０ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（７９．０ｇ、３６１．０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１．８ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（４００ｍＬ）中の３（粗製）及びナトリウムメトキシド（４．０ｇ、７４．０ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。次に、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。抽出物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（１５．０ｇ）を得た。
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の４（１５．０ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（２０ｍｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応溶液を濃縮して、生成物（１１．０ｇ、８５％）を得た。
５（１１．０ｇ、２９．０ミリモル）、ＥＤＣＩ（１１．３ｇ、５９．０ミリモル）、ＨＯＢＴ（２．０ｇ、５９．０ミリモル）、Ｆ３ＣＯＧｌｙＯＨ（７．６ｇ、４４．０ミリモル）及びトリエチルアミン（１１．９ｇ、１１８．０ミリモル）のジクロロメタン（２００ｍＬ）中の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（１２．０ｇ、７７％）を得た。
化合物（４０）、（４１）、（４５）及び（４８）
Figure 2022511214000036
リン酸（１２０ｍＬ）中の１（４．０ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、１５％水酸化ナトリウム水溶液を加えることによりｐＨ５に調整し、続いてジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をアセトンでの結晶化により精製して、表題化合物（１．８ｇ、６７％）を得た。
アセトン（３ｍＬ）中の２（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、３‐ブロモプロパ‐１‐エン（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（５２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の混合物を２時間還流した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（３０ｍｇ、５５％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３（５００ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．５ｇ、１１．３１モル）及びＤＭＡＰ（５５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次に直接使用した。
メタノール（１０ｍＬ）中の４（粗製）及びナトリウムメトキシド（１２０．０ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得て、これを次に直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の５（粗製）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０．４ｇ）を得た。
６（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、Ｆ３ＣＧｌｙＯＨ（４３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６３ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）中の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２５ｍｇ、３６％）を得た。
化合物（４０）、（４２）、（４６）及び（４９）
Figure 2022511214000037
リン酸（１２０ｍＬ）中の１（４．０ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、１５％水酸化ナトリウム水溶液を加えることによりｐＨ５に調整し、続いてジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をアセトンで結晶化することにより精製して、表題化合物（１．８ｇ、６７％）を得た。
アセトン（３ｍＬ）中の２（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ブロモエタン（２１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（５２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の混合物を２時間還流した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（３５ｍｇ、６５％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．５ｇ、１１．６３モル）及びＤＭＡＰ（５７ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１０ｍＬ）中の４（粗製）及びナトリウムメトキシド（１２２．０ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の５（粗製）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０．４ｇ）を得た。
６（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（４９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、Ｆ３ＣＧｌｙＯＨ（４４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）中の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２５ｍｇ、３６％）を得た。
化合物（６ａ）、（１７ａ）及び（２８ａ）
Figure 2022511214000038
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の１（２０．０ｇ、０．０５ミリモル）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（１０９．３ｇ、０．５０モル）及びＤＭＡＰ（２．４ｇ、０．０２モル）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（４００ｍＬ）中の２（粗製）及びナトリウムメトキシド（５．４ｇ、０．１ｍｏｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。次に、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。抽出物を濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した（２０．０ｇ、８７％）。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の３（２．９５ｇ、６．４６ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）の溶液を室温で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮して、生成物（２．１ｇ、９１％）を得た。
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の４（２００ｍｇ、０．５６ミリモル）、ＤＣＣ（１３８ｍｇ、０．６７ミリモル）、ＤＭＡＰ（８２ｍｇ、０．６７ミリモル）、及びトリエチルアミン（１１５ｍｇ、１．１２ミリモル）の溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（１１０ｍｇ、３９％）を得た。
化合物（８３）
Figure 2022511214000039
１（１．０ｇ、２．５１ミリモル）の溶液に、塩化アセチル（３ｍＬ）をテトラクロリド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１ｍＬ）に加え、混合物を室温で４０時間撹拌した。粗生成物を直接次のステップに使用した。
メタノール／水中の２（粗製）及び水酸化リチウム（４当量）の溶液を室温で１時間撹拌した。水相を抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。再結晶により生成物を得た（０．２ｇ、２１％、２ステップ）。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３（８００ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、ブロモエタン（４５０ｍｇ、４．１６ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１１５０ｍｇ、８．３１ｍｍｏｌ）の混合物を、９０℃で２時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．５ｇ、６０％）を得た。
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の４（７００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．７ｇ、１６．９５モル）及びＤＭＡＰ（８３ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１５ｍＬ）中の５（粗製）及びナトリウムメトキシド（３６５．０ｍｇ、６．７６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間攪拌した。次に、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。抽出物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．６ｇ）を得た。
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の６（６００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）の溶液を室温で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮して生成物をnineした（０．４５ｇ、９６％）。
ジクロロメタン（３ｍＬ）中の７（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でメチルカーボノクロリダート（ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ）（１９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（１５ｍｇ、２６％）を得た。
化合物（８４）
Figure 2022511214000040
１（１．０ｇ、２．５１ミリモル）の溶液に、塩化アセチル（３ｍＬ）をテトラクロリド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１ｍＬ）に加え、混合物を室温で４０時間撹拌した。粗生成物を直接次のステップに使用した。
メタノール／水中の２（粗製）及び水酸化リチウム（４当量）の溶液を室温で１時間撹拌した。水相を抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。再結晶により生成物を得た（０．２ｇ、２１％、２ステップ）。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３（８００ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、１‐ブロモ‐２‐メトキシエタン（５８０ｍｇ、４．１６ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（１．１５ｇ、８．３１ｍｍｏｌ）の混合物を、７５℃で３時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．５ｇ、５４％）を得た。
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の４（５００ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．５ｇ、１１．２９ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（５５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１５ｍＬ）中の５（粗製）及びナトリウムメトキシド（２４４．０ｍｇ、４．５２ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。次に、水を加え、ジクロロメタンで抽出した。抽出物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．４ｇ）を得た。
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の６（０．６ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５ｍｌ）の溶液を室温で３時間撹拌した。反応溶液を濃縮して、生成物（０．４５ｇ、９４％）を得た。
ジクロロメタン（３ｍＬ）中の７（５０ｍｇ、０．１２ミリモル）及びトリエチルアミン（２５ｍｇ、０．２５ミリモル）の溶液に、０℃でメチルカーボノクロリダート（ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ）（１８ｍｇ、０．１９ミリモル）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（１６ｍｇ、２８％）を得た。
化合物（８５）
Figure 2022511214000041
１（１．０ｇ、２．５１ミリモル）の溶液に、塩化アセチル（３ｍＬ）をテトラクロリド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１ｍＬ）に加え、混合物を室温で４０時間撹拌した。粗生成物を直接次のステップに使用した。
メタノール／水中の２（粗製）及び水酸化リチウム（４当量）の溶液を室温で１時間保存した。水相を抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。再結晶により生成物を得た（０．２ｇ、２１％、２ステップ）。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３（１．０ｇ、２．６ミリモル）、３‐（クロロメチル）ピリジン（０．６４ｇ、３．９ミリモル）及び炭酸カリウム（１．０８ｇ、７．８ミリモル）の混合物を９０℃で８時間攪拌した。反応混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（０．７ｇ、５８％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の４（７００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．２ｇ、１４．７１モル）及びＤＮＰ（７２ｎｅｇ．０．５９ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して粗生成物を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して生成物（０．７ｇ、８７％）を得た。
メタノール（１０ｍＬ）中の５（０．７ｇ、１．２２ミリモル）及びナトリウムメトキシド（１３１．０ｍｇ、２．４３ミリモル）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の６（粗製）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０．３ｇ）を得た。
ジクロロメタン（３ｍＬ）中の７（５０ｍｇ、０．１２ミリモル）及びトリエチルアミン（３５ｍｇ、０．３５ミリモル）の溶液に、０℃でメチルカーボノクロリダート（ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ）（１６ｍｇ、０．１７ミリモル）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（１２ｍｇ、２１％）を得た。
化合物（８９）
Figure 2022511214000042
リン酸（１２０ｍＬ）中の１（４．０ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、１５％水酸化ナトリウム水溶液を加えることによりｐＨ５に調整し、続いてジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をアセトンで結晶化することにより精製して、表題化合物（１．８ｇ、６７％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の２（６００ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．３ｇ、１４．９６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（７３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次に直接使用した。
メタノール（１０ｍＬ）中の３（粗製）及びナトリウムメトキシド（１２０．０ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得て、これを次に直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の４（粗製）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０．４ｇ）を得た。
０℃に冷却したジクロロメタン（３ｍＬ）中の５（５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及びｌｍ（９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ‐ブチルジメチルクロロシラン（２１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（３０ｍｇ、４５％）を得た。
ジクロロメタン（３ｍＬ）中の６（１００ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６４ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でメチルカーボノクロリダート（ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ）（４０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（５０ｍｇ、４５％）を得た。
テトラヒドロフラン（３ｍＬ）中の７（５０ｍｇ、０．０９ミリモル）の溶液に、ＴＢＡＦ（２９ｍｇ、０．１１ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮し、クロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、５１％）を得た。
化合物（９０）
Figure 2022511214000043
リン酸（１２０ｍＬ）中の１（４．０ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、１５％水酸化ナトリウム水溶液を加えることによりｐＨ５に調整し、続いてジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をアセトンで結晶化することにより精製して、表題化合物（１．８ｇ、６７％）を得た。
アセトン（３ｍＬ）中の２（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、３‐ブロモプロパ‐１‐エン（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（５２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の混合物を２時間還流した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（３０ｍｇ、５５％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３（５００ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．５ｇ、１１．３１モル）及びＤＭＡＰ（５５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１０ｍＬ）中の４（粗製）及びナトリウムメトキシド（１２０．０ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の５（粗製）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０４ｇ）を得た。
ジクロロメタン（３ｍＬ）中の６（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でメチルカーボノクロリダート（ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ）（２４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、３５％）を得た。
化合物（９１）
合成ルートＡ
Figure 2022511214000044
リン酸（１２０ｍＬ）中の１（４．０ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を氷上に注ぎ、１５％水酸化ナトリウム水溶液を加えることによりｐＨ５に調整し、続いてジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をアセトンで結晶化することにより精製して、表題化合物（１．８ｇ、６７％）を得た。
アセトン（３ｍＬ）中の２（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ブロモエタン（２１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（５２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の混合物を２時間還流した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（３５ｍｇ、６５％）を得た。
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、（Ｂｏｃ）２Ｏ（２．５ｇ、１１．６３モル）及びＤＭＡＰ（５７ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流した。反応混合物を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
メタノール（１０ｍＬ）中の４（粗製）及びナトリウムメトキシド（１２２．０ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得、次のステップに直接使用した。
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の５（粗製）及びトリエチルアミン（１０ｍＬ）の溶液を室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮して生成物（０．４ｇ）を得た。
ジクロロメタン（３ｍＬ）中の６（５０ｍｇ、０．１３ミリモル）及びトリエチルアミン（２５ｍｇ、０．２５ミリモル）の溶液に、０℃でメチルカーボノクロリダート（ｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄａｔｅ）（２４ｍｇ、０．２５ミリモル）を加えた。得られた溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、３５％）を得た。
合成ルートＢ
Figure 2022511214000045
ステップ１‐酸分解
Figure 2022511214000046
ＴＨＣ（１ｇ）を温かい濃亜リン酸（８５％）（４０ｍｌ）に溶解し、約１２時間撹拌した。溶液をクロロホルムで約５回抽出した。得られたクロロホルム画分を水で洗浄し、次にロータリーエバポレーターを使用して濃縮して、加水分解からの生成物を得た。
加水分解の生成物をアセトンに溶解し、Ｋ２ＣＯ３の水溶液を加えた。得られた溶液を濃縮し、次にさらにアセトンを加え、続いて濃縮してカリウム塩（３‐デメチルチオコルヒチン）を得た。
ステップ２-エーテル（３‐エトキシチオコルヒチン）の合成
Figure 2022511214000047
ステップ１からのカリウム塩（３‐デメチルチオコルヒチン）をアセトン（７５ｍｌ）に溶解し、２倍モル過剰のヨウ化エチルを加えた。得られた溶液を撹拌し、還流下で約５時間還流（沸騰）させた。溶液を濃縮し、アセトニトリルを加え、溶液を再び濃縮して、残っているヨウ化エチルを除去して、沈殿３‐エトキシチオコルヒチンを得た。
ステップ３-アミド結合の加水分解
Figure 2022511214000048
３‐エトキシチオコルヒチンを５Ｍ ＨＣｌ（１００ｍｌ）に溶解し、還流（沸騰）させ、沸騰させながら攪拌し、ＴＬＣでモニターした。約５時間後、反応混合物をクロロホルムで７回抽出した。得られたクロロホルム画分を水で洗浄し、蒸発乾固させた。生成物をメタノールに溶解し、３回濃縮して微量の水を除去した。生成物をアセトニトリルに溶解し、蒸発乾固してアミン（３‐エトキシデアセチルチオコルヒチン）を得た。
ステップ４
Figure 2022511214000049
乾燥アミン（３‐エトキシデアセチルチオコルヒチン）をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、ＴＥＡ（トリエチルアミン）（１．５ｍｌ）を加えた。この溶液に、クロロギ酸メチル（０．５ｇ）を加え、ＲＴ（室温）で約５時間撹拌し、ＴＬＣでモニターした。得られた溶液を蒸発乾固し、クロロホルムに溶解し、０．２Ｍ ＨＣｌで２回、次に水で１回抽出した。得られたクロロホルム画分を蒸発乾固し、アセトニトリルに溶解し、再度蒸発乾固させた。得られた生成物（ＣＲ‐４２‐０２４＝（９１））をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶離液は、０～５％のヘキサンを含むヘキサン／酢酸エチルの混合物であった。
ＴＰＯ
以下に説明するいくつかの実験では、コルヒチン誘導体ＴＰＯ（Kerekes P, Sharma PN, Brossi A, Chignell CF, Quinn FR (1985) Synthesis and biological effects of novel thiocolchicines. 3. Evaluation of N-acyldeacetylthiocolchicines, N-(alkoxycarbonyl) deacetylthiocolchicines, and O-ethyldemethylthiocolchicines. New synthesis of thiodemecolcine and antileukemic effects of 2-demethyl- and 3-demethylthiocolchicine.（新規チオコルヒチンの合成と生物学的効果。３．Ｎ‐アシルデアセチルチオコルヒチン、Ｎ‐（アルコキシカルボニル）デアセチルチオコルヒチン、及びＯ‐エチルデメチルチオコルヒチンの評価。チオデメコルシンの新規合成及び２‐デメチル‐及び３‐デメチルチオコルヒチンの抗白血病効果。）J Med Chem 28:1204-1208に記載、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して、（９１）と比較して痛風に関連する炎症に対してその有効性を決定した。
Figure 2022511214000050
ＴＰＯ
例２-痛風の炎症のインビトロ研究
一連のインビトロ実験は、ＭＳＵ誘発好中球活性化において、コルヒチン誘導体である（９１）（一部の図では「ＣＣＩ」と呼ばれる）を使用して実施された。ＣＨ‐３５（４３）やＣＲ４２‐００３（４７ａ）など、（９１）と同様の構造を持つコルヒチン誘導体の効果を示すための実験も行われた。化合物を生成するために使用される足場であるコルヒチンの構造は、ＣＣＩ（９１）、ＣＨ‐３５（４３）、及びＣＲ‐４２‐００３（４７ａ）を生成するために、以下の表１に示す位置で変更された。要約すると、以下でさらに詳細に説明するように、ヒト好中球は健康なドナーから分離され、（９１）、（４３）、及び（４７ａ）の存在下又は非存在下で痛風の原因物質であるＭＳＵで刺激された。評価された主要な好中球応答は、細胞質カルシウムレベル（図７）、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ‐８又はＩＬ‐１など）の産生（図８）及びスーパーオキシド産生（図９）であった。
Figure 2022511214000051
Figure 2022511214000052
化合物は、標的アイソフォーム（この場合はβＶＩ）に対する化合物の高親和性相互作用の必要性と、敏感な器官又は組織におけるオフターゲットチューブリンアイソフォームに対する可能な限り低い親和性との間のバランスをとるために、アルゴリズムアプローチで選択された。したがって、所望の標的に対して改善された特異性／選択性を有する化合物を選択した。目的の細胞内のβ‐チューブリンアイソタイプに対するコルヒチンの親和性を高める可能性が高い化学修飾を特定するためにこのアプローチで使用される重要なパラメーターには、次のものがある。（ｉ）β‐チューブリンアイソタイプに対するコルヒチンの異なる親和性、及び（ｉｉ）異なる細胞タイプ間のこれらのβ‐チューブリンアイソタイプの発現の量的及び質的な違い。
薬物ドッキング及びリガンドとチューブリンの個々の残基との相互作用のモードに関する詳細な知識により、標的細胞型での発現により、選択したチューブリンアイソタイプの特異性及び選択性を改善するための修飾を決定することが可能になった。計算作業は、平衡化されたヒト構造が生成される足場としてウシチューブリンを使用した、ヒトチューブリンアイソタイプのホモロジーモデリングに基づいていることに注意する必要がある。ヒトとウシのチューブリンの配列類似性が非常に高いため、得られた結果の信頼性は非常に高くなっている。表１に示される３つの化合物の構造及び予測される結合エネルギー、並びにここで研究された３つの化合物の化学合成の詳細、並びにそれらの密接に構造的に関連するコルヒチン誘導体は、本明細書に記載されており、米国特許番号９，４５８，１０１にも見出すことができ、その内容は参照により組み込まれる。
材料及び方法
材料
ヒトβ‐チューブリンアイソタイプβ‐Ｉ（ＭＡＢ８５２７）及びベータ‐ＩＩＩ（ＭＡＢ１１９５）に対する抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入し、ベータ‐ＩＩ（ａｂ１５５３１１）及びベータ‐Ｖ（ａｂ８２３６６）はＡｂｃａｍから入手し、ベータ‐ＩＶｂ（ＷＨ００１０３８３Ｍ２）、抗ＰＩ３キナーゼｐ８５（ＡＢＳ１８５６）抗体は、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ベータＶＩ（ＬＳ‐Ｃ３３８１９６）抗体は、ＬＳ Ｂｉｏから、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）（７１５‐０３５‐１５０）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（ＩｇＧ）（７１１‐０３５‐１５２）は、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。ラット抗マウスＣＤ４５Ｆｉｔｃ（１１‐０４５１‐８２）及びＦｕｒａ‐２‐アセトキシメチルエステル（Ｆｕｒａ‐２ＡＭ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。コルヒチン、デキストランＴ５００、アプロチニン、ロイペプチン、及びシトクロムＣはＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｌｕｓ ＥＣＬキットは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから、Ｆｉｃｏｌｌ‐ＰａｑｕｅはＷｉｓｅｎｔ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手した。三斜晶系ＭＳＵ結晶は社内で合成された。エンドトキシン汚染は、リムルスアメーバ細胞溶解物（Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）アッセイによって除外された。
ヒト好中球の単離
好中球は健康な成人ボランティアの静脈血から単離された。簡単に説明すると、静脈血をイソクエン酸塩を含むチューブで採取し、赤血球を２％デキストランに沈殿させ、Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅクッションでの遠心分離によって好中球を無菌的に精製した。汚染赤血球は低張溶解によって除去され、好中球は１．６ｍＭのＣａＣｌ２を含むＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳに再懸濁された。
細胞内カルシウム動員を決定するためのＭＳＵ及びコルヒチン又はコルヒチン誘導体によるヒト好中球の刺激
ヒト好中球（１×１０７細胞／ｍｌ）を、１ｍｇ／ｍｌＭＳＵの添加前に、１μＭのＦｕｒａ‐２ＡＭ及び示された濃度のコルヒチン（図７Ａ）。（９１）（ＣＣＩ）（図７Ｂ）、ＴＰＯ（図７Ｃ）又は希釈剤（ＤＭＳＯ）とプレインキュベートした。さらに、さらなるコルヒチン誘導体に関して同様の実験が行われた。特に、ヒト好中球は、ＭＳＵ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加する前に、１０μＭのコルヒチン（図７Ｄ）、Ｄ１＝（２８ａ）（図７Ｅ及び７Ｊ）、Ｄ２＝（３９）（図７Ｆ）、Ｄ３＝（４７ａ）（図７Ｇ及び７Ｊ）、Ｄ４＝（８９）（図７Ｈ）で刺激された。さらなる実験では、ヒト好中球を１０μＭのコルヒチン、１μＭのＣＨ‐２２＝（１４）、３μＭのＣＨ‐３５＝（４３）、又は希釈剤ＤＭＳＯ（図７Ｉ及び７Ｊ）で刺激した。さらなる実験では、ヒト好中球を０．１μＭ又は１０μＭのコルヒチン（図７Ｋ及び７Ｌ）、０．０１μＭ、０．１μＭ又は１μＭ又は１０μＭの誘導体（４３）（図７Ｍ及び７Ｎ）、又は０．０１μＭ、０．１μＭ又は１μＭ又は１０μＭの誘導体（４７ａ）（図７０及び７Ｐ）で刺激した。さらなる実験では、ヒト好中球を０．１μＭ又は１μＭ又は１０μＭの誘導体（４３）（図７Ｑ）、又は０．１μＭ又は１μＭ又は１０μＭの誘導体（４７ａ）（図７Ｒ）で刺激した後、１ｍｇ／ｍｌＭＳＵを添加した。図７Ｓは、図７Ａ、７Ｂ、７Ｑ及び７Ｒで試験された化合物について、示された濃度での化合物の効力のプロットを示している。
好中球（１×１０７細胞／ｍｌ）を１μＭＦｕｒａ‐２ＡＭ、及び指定濃度の（９１）（ＣＣＩ）、ＴＰＯ、２８ａ、３９、４７ａ、８９、１４、４３又はコルヒチンとともに３７℃で３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで１回洗浄し、５×１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し、分光蛍光光度計（Ｊｏｂｉｎ ＹｖｏｎのＦｌｕｏｒｏｌｏｇ‐ＳＰＥＸ）の温度制御（３７℃）キュベットコンパートメントに移した。
ヒト好中球のカルシウムレベルの測定
細胞内カルシウム濃度は分光蛍光光度計で測定され、曲線下面積（ＭＳＵ注入から１００秒まで）として表される。
次に、細胞質カルシウムの変化を、ＭＳＵ又はＨＢＳＳ（ネガティブコントロール）の添加後に、３４０及び３８０ｎｍの２つの励起波長と５１０ｎｍの発光波長を使用して測定した。遊離内部カルシウム濃度は、３４０ｎｍと３８０ｎｍで得られた蛍光値の比率から推定された。結果は、時間の関数としての細胞内カルシウム濃度の曲線下面積として計算される（刺激の追加に対して０‐１００秒）。
ＭＳＵに対する応答の特異性の決定：ヒト好中球における細胞質カルシウムのｆＭＬＰ誘発性増加
ヒト好中球（１×１０７細胞／ｍｌ）を上記のように単離し、１μＭ Ｆｕｒａ‐２ＡＭ及び示された濃度のコルヒチン、ＣＣＩ（９１）又はＣＨ‐３５（４３）とプレインキュベートした後、１０‐７Ｍ ｆＭＬＰ（図７Ｔ及び７Ｕ）又は１ｍｇ／ｍｌ ＭＳＵ（図７Ｖ及び７Ｗ）を添加した。細胞内カルシウム濃度は分光蛍光光度計で測定され、曲線下面積として表される。
ＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８又はＩＬ‐１放出を決定するためのＭＳＵ及びコルヒチン又はコルヒチン誘導体によるヒト好中球の刺激
ヒト好中球を上記のように単離し、示された濃度のコルヒチン（４３）（図８Ａ）、（４７ａ）（図８Ｂ）又はＤＭＳＯとともに３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ＭＳＵ（１ｍｇ／ｍｌ）又はバッファー（ＲＰＭＩ）を細胞に添加し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。細胞を遠心分離し（４００ｘｇで２分間）、上清を回収し、１６，０００ｘｇで５分間再度遠心分離した。さらなる実験では、ヒト好中球を、示された濃度のコルヒチン（図８Ｃ）、ＣＣＩ（９１）（図８Ｄ）、ＣＲ４２‐００３（４７ａ）（図８Ｅ）又は（４３）（図８Ｆ）とともにインキュベートした後、１ｍｇ／ｍｌ ＭＳＵと３時間インキュベーションした。図８Ｇは、図８Ｃ～Ｆで試験された示された濃度での化合物の効力のプロットを示す。ＣＲ４２‐００３（４７ａ）及びＣＨ‐３５（４３）の存在下でのＩＬ‐８産生の基礎レベルも、ＭＳＵ刺激の前に決定された（図８Ｌ）。ＩＬ‐１βの場合、白色ＲＰＭＩ中のヒト好中球（２ｘ１０７細胞／ｍｌ）を２５０Ｕ／ｍｌ ＴＮＦαでプライミングし、示された濃度のコルヒチン（図８Ｈ）、ＣＣＩ（９１）（図８Ｉ）、ＣＨ‐３５（４３）（図８Ｊ）とインキュベートした後、１ｍｇ／ｍｌ ＭＳＵを添加し、３７℃で３時間インキュベートした。図８Ｋは、図８Ｈ‐Ｊでテストした化合物について、示された濃度での化合物の効力の比較を示している。次に、細胞を遠心分離して、上記のように上清を回収した。細胞外ＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８又はＩＬ‐１βはＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量化された。すべてのサンプルを２回測定した。
ヒト好中球におけるＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８又はＩＬ‐１レベルの測定
刺激された好中球によって放出されるＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８又はＩＬ‐１の量は、市販のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ヒトＩＬ‐８サイトセット、番号ＣＨＣ１３０３及びＩＬ‐１β（番号８８‐７２６１‐８８））を用いることにより決定した。
スーパーオキシド産生を決定するためのＭＳＵ及びコルヒチン又はコルヒチン誘導体によるヒト好中球の刺激
ヒト好中球を上記のように単離し、示された濃度のコルヒチン（図９Ａ）、（９１）（ＣＣＩ）（図９Ｂ）、又は希釈剤（ＤＭＳＯ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした後、１２５μＭシトクロムＣ又はバッファー（ＨＢＳＳ）の存在下、３７℃で１０分間、１ｍｇ／ｍｌ ＭＳＵで刺激した。さらなる実験では、ヒト好中球を、示された濃度のコルヒチン（図９Ｃ）、ＣＣＩ（９１）（図９Ｄ）、（４７ａ）（図９Ｅ）又は（４３）（図９Ｆ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍｇ／ｍｌ ＭＳＵで刺激した。図９Ｇは、図９Ｃ～９Ｆで試験された化合物について示された濃度での化合物の効力のプロットを示している。（４７ａ）及び（４３）の存在下でのＲＯＳ生成の基礎レベルも、ＭＳＵ刺激の前に決定された（図９Ｈ）。結果は、ＭＳＵコントロールによって生成されたスーパーオキシドの比率として表される。
ヒト好中球のスーパーオキシドレベルの測定
スーパーオキシド生成は、シトクロムＣアッセイの還元を使用して測定された。最初の１０分以内に読み取られた５５０ｎｍと５４０ｎｍでの光学密度の読み取り値の差に、シトクロムＣの吸光係数を掛けて、１ｘ１０６個の細胞によって生成されたｎｍｏｌＯ２の数を求めた。結果は、ｎｍｏｌＯ２／１ｘ１０６細胞／ｍｌとして表される。
ウエスタンブロット分析
好中球懸濁液（２×１０７細胞／ｍｌ）を同量の２×沸騰修飾Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（１×バッファー：６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）、４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ドデシル硫酸ナトリウム）（ＳＤＳ）、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）β‐メルカプトエタノール、８．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、グリセロール、２．５ｍＭオルトバナジン酸塩、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．０２５％ブロモフェノールブルー）に直接移し、７分間煮沸分した。タンパク質は、還元条件下で１０％アクリルアミドゲル上でＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分離され、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写された。ブロッキング剤と抗体は、トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ ７．８、１９０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ｖｏｌ ｖｏｌ Ｔｗｅｅｎ‐２０）で希釈した。一次及び二次抗体は、メーカーが推奨する濃度で使用された。抗β‐チューブリンアイソタイプ特異的抗体でイムノブロッティングする前に、ＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（ＴＢＳＴ中の５％ｗｔ／ｖｏｌ粉乳）でインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ及びロバ抗ウサギＩｇＧをＴＢＳＴ溶液で希釈した。化学発光試薬を使用して、最大曝露時間５分の抗体を検出した。提示されたすべてのイムノブロットは、抗ＰＩ３キナーゼｐ８５抗体を用いてタンパク質の負荷が等しくなるように制御された。
結果
（９１）（ＣＣＩ）は、コルヒチンよりも低い濃度でＭＳＵ誘発性カルシウム動員を阻害する
ＭＳＵによって開始される好中球の最も初期の分子イベントの１つは細胞内カルシウム貯蔵の動員であるため、（９１）（ＣＣＩ）、（４３）、及び（４７ａ）の効果がこの初期のシグナル伝達イベントで評価された。簡単に説明すると、上記でさらに詳しく説明したように、ヒト好中球を蛍光カルシウムインジケーターＦｕｒａ‐２とインキュベートした後、（９１）（ＣＣＩ）、（４３）、又は（４７ａ）の濃度範囲でインキュベートし、ＭＳＵで刺激した。Ｆｕｒａ‐２は、細胞内貯蔵からの放出によって引き起こされる細胞質カルシウムの増加を監視する。テストされた（９１）（ＣＣＩ）、（４３）、又は（４７ａ）の濃度は、０．１～１０μＭの範囲であった。比較のために、同じ濃度のコルヒチンを使用して同じ実験を行った。
図７Ａ‐Ｃに示すように、（９１）（ＣＣＩ）は、０．１μＭの低用量で細胞内カルシウム濃度の増加を有意に抑制するが、ＴＰＯはより高い濃度で抑制を示す。対照的に、コルヒチンは、１０μＭの濃度でのみカルシウムの動員の有意な阻害を誘発することができる。したがって、（９１）は、細胞内カルシウム貯蔵の動員をコルヒチンよりも約１００分の1の濃度で有意に減少させることができ、したがって、カルシウムの動員を阻害する点でコルヒチンよりも約１００倍強力である。他のコルヒチン誘導体２８ａ、３９、４７ａ、１４、及び４３は、コルヒチン（図７Ｅ）と比較した場合、（８９）（図７Ｈ）を除いて、ヒト好中球のカルシウムレベルの低下に関して好中球阻害効果を示した（図７Ｅ‐Ｊ）。これは、（最初のスパイク後の）グラフ化された線の傾きの増加によって示され、細胞質の遊離カルシウムの濃度の増加を示す（図７Ｄ‐Ｉ）。
注目すべきことに、コルヒチン（図７Ｋ及び７Ｌ）と比較した場合、コルヒチン誘導体（９１）と同様の所見が、０．１μＭという低い濃度のコルヒチン誘導体（４３）（図７Ｍ及び７Ｎ）及び（４７ａ）（図７Ｏ及び７Ｐ）で見られた。したがって、９１、４７ａ、４３などのコルヒチン誘導体は、コルヒチンに必要な濃度よりもはるかに低い（たとえば、約１００分の１の）濃度で、ＭＳＵによって誘発されるヒト好中球のカルシウム動員の増加を阻害する能力を示す（図７）。
さらなる実験では、図７Ｂ及び７Ｑ‐Ｓに示すように、誘導体は０．０１～１０μＭの濃度範囲でテストされた。比較のために、同じ濃度のコルヒチンを使用して同じ実験を行った。ＣＣＩ（９１）（図７Ｂ）及びＣＨ‐３５（４３）（図７Ｒ）は、０．１μＭの濃度で細胞質カルシウムの増加を大幅に減少させることがわかった。図７Ｒに示すように、ＣＨ‐３５（４３）は、０．１μＭ、１μＭ、及び１０μＭで細胞内カルシウム濃度の増加を有意に抑制することができた。ＣＨ‐３５（４３）は古典的な単調な用量反応を示し、その効果は濃度に依存する。対照的に、ＣＣＩ（９１）は非単調な用量反応を示し、ＭＳＵが誘発する、１０μＭ濃度の細胞質カルシウムの増加に有意な影響を与えない。図７Ｓに示すように、０．１μＭでの誘導体とコルヒチンの阻害活性の比較により、ＣＣＩ（９１）とＣＨ‐３５（４３）は、ＭＳＵによる細胞質カルシウムの増加を大幅に減少させる点でコルヒチンよりも強力であることが確認された。したがって、ＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）は、コルヒチンと比較して低濃度で阻害剤活性を維持する。
ＭＳＵによる好中球活性化に対するＣＣＩ（９１）の特異性を評価するために、ＣＣＩ（９１）が無関係の刺激に対する好中球応答を阻害できるかどうかを決定した。この刺激に応答した好中球の活性化が宿主の生存に影響を与えるため、細菌刺激が選択された。簡単に説明すると、ヒト好中球を１０μＭ ＣＣＩ（９１）とインキュベートした後、細菌ペプチドｆＭＬＦで活性化した。図７Ｔ及び７Ｕに示すように、ｆＭＬＦによる好中球の活性化は、細胞質内のカルシウム濃度の有意な上昇を誘発した。しかし、ＣＣＩ（９１）の存在下では、細胞質カルシウム応答は影響を受けなかった。これらの結果は、ＣＣＩ（９１）による好中球活性化の阻害がＭＳＵに対してある程度の選択性を示したことを明らかにした。
（９１）（ＣＣＩ）は、コルヒチンよりも低濃度でＭＳＵ誘発性のＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８又はＩＬ‐１の放出を阻害する
ＭＳＵに応答してカルシウムの動員を弱める（９１）（ＣＣＩ）、（４３）又は（４７ａ）の能力は、このシグナル伝達イベントの下流の好中球応答への影響の決定を促した。カルシウム動員などの初期のシグナル伝達イベントはＭＳＵによるＳｒｃキナーゼの活性化に依存するため、ＭＳＵによって誘導されるＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８のＳｒｃ依存性産生も（９１）（ＣＣＩ）によって阻害されるかどうかが決定された。さらに、ＩＬ‐１は内皮細胞上の接着分子の発現と炎症誘発性サイトカインの合成を誘導し、これらが一緒になって好中球の大量の動員を促進するため、ＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）のＩＬ‐１の産生を抑制する能力も評価された。簡単に説明すると、上記でさらに詳細に説明したように、ＭＳＵで刺激する前に、又はフェノールを含まないＲＰＭＩ（ネガティブコントロール）で３時間インキュベートする前に、好中球を指定濃度の（９１）（ＣＣＩ）、（４３）、（４７ａ）及びコルヒチン又はＤＭＳＯとともにインキュベートした。次に、無細胞上清を回収し、活性化された好中球によって放出されたＣＸＣＬ８／ＩＬ‐８又はＩＬ‐１の量をＥＬＩＳＡによって決定した。
図８Ａ‐Ｂに示すように、コルヒチン誘導体（４３）（図８Ａ）又はコルヒチン誘導体（４７ａ）（図８Ｂ）とプレインキュベートした好中球によるＩＬ‐８の放出の有意な減少が、０．１μＭの低濃度から観察された。
さらなる実験では、図８Ｄ‐Ｆに示すように、ＣＣＩ（９１）、ＣＲ４２‐００３（４７ａ）、及びＣＨ‐３５（４３）とプレインキュベートした好中球によるＩＬ‐８の放出に有意な減少が０．１μＭから１０μＭの低濃度から観察された（図８Ｄ‐Ｆ）。対照的に、コルヒチンは１及び１０μＭでＩＬ‐８の放出を有意に阻害するだけであった（図８Ｃ）。０．１μＭでの誘導体の阻害活性の比較（図８Ｇ）は、ＭＳＵによるＩＬ‐８生産の増加を低減する上で、コルヒチンがこの好中球エフェクター機能をもはや弱めることができない濃度で、ＣＣＩ（９１）がＣＨ‐３５（４３）及びＣＲ４２‐００３（４７ａ）よりも強力であることを明らかにした。
インビトロアッセイは、ＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）がＭＳＵに応答した細胞質カルシウムの増加及びＲＯＳ（下記参照）の産生を弱めることを明らかにしたので、このアッセイはＩＬ‐１産生に関してＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）を用いて実施された。ＩＬ‐１のＭＳＵ誘導合成に対するＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）の効果は、わずかな変更を加えたＩＬ‐８について記載されたのと同じ実験的アプローチを使用して決定された。成熟したＩＬ‐１の産生と分泌には２つの刺激が必要である。したがって、ヒト好中球は、ＭＳＵで刺激する前にＴＮＦ‐αでプライミングされた。１０μＭのＣＣＩ（９１）、ＣＨ‐３５（４３）、又はコルヒチンで処理した細胞によるＩＬ‐１の産生の減少が観察された（図８Ｈ‐Ｊ）。注目すべきことに、ＣＣＩ（９１）は０．１μＭの閾値濃度で最も強力な化合物であったが、ＣＨ‐３５（４３）は１μＭで有効であった（図８Ｉ及び８Ｊ）。コルヒチンと比較すると、両方の誘導体がより強力である（図８Ｋ）。一緒に、化合物は、好中球におけるＭＳＵ誘発性ＩＬ‐１産生の阻害に関して高い効力を有する。
さらに、図８Ｌに示すように、ＣＲ４２‐００３（４７ａ）又はＣＨ‐３５（４３）のみとインキュベートした好中球の上清で測定されたＩＬ‐８の量は、ネガティブコントロール（ＨＢＳＳに含まれる好中球）の量と同様である。これは、ＣＲ４２‐００３（４７ａ）もＣＨ‐３５（４３）も、ＩＬ‐８の放出によって決定される好中球に対して非特異的な効果を示さないことを示唆している。
コルヒチン又はコルヒチン誘導体で刺激されたヒト好中球のスーパーオキシドレベル
カルシウム依存性であり、ＭＳＵによって活性化されることが知られており、炎症を起こした関節に損傷を与える可能性がある追加の好中球エフェクター機能は、ＲＯＳの産生である。（９１）（ＣＣＩ）、（４３）、及び（４７ａ）はカルシウムの動員を阻害するため、（９１）（ＣＣＩ）、（４３）、及び（４７ａ）も好中球におけるＭＳＵ誘発性ＲＯＳ産生を調節する可能性がある。簡単に説明すると、上記で詳細に説明したように、ＭＳＵで刺激する前に、比較目的でヒト好中球を（９１）（ＣＣＩ）、（４３）、（４７ａ）、又はコルヒチンとインキュベートした。
図９Ａ‐Ｂに示すように、（９１）（ＣＣＩ）は、ＭＳＵによって引き起こされるスーパーオキシドの生成の大幅な減少を引き起こした。（９１）（ＣＣＩ）は０．１μＭの濃度でスーパーオキシド産生を阻害するが、コルヒチンがＭＳＵ誘発性のスーパーオキシド産生を阻害できる最低用量は１μＭである。（９１）（ＣＣＩ）は、したがって、コルヒチンよりも約１０倍低い（約１０分の１の）濃度で、ヒト好中球におけるＭＳＵ誘発性スーパーオキシド産生を阻害し、したがって、ヒト好中球におけるＭＳＵ誘発性スーパーオキシド産生を阻害するためにコルヒチンよりも約１０倍強力である。
さらなる実験では、図９Ｄ‐９Ｆに示すように、ＣＣＩ（９１）、ＣＲ４２‐００３（４７ａ）、及びＣＨ‐３５（４３）は、０．１μＭの濃度でＭＳＵによって引き起こされるスーパーオキシドの生成を大幅に減少させた。対照的に、コルヒチン阻害能力は１μＭという高い閾値を持っている（図９Ｃ）。０．１μＭでの誘導体とコルヒチンの阻害活性の比較（図９Ｇ）は、ＭＳＵ誘発性のＲＯＳ生産の増加の低下において、ＣＣＩ（９１）とＣＨ‐３５（４３）がコルヒチンとＣＲ４２‐００３（４７ａ）よりも有意に強力であることを明らかにした。さらに、図９Ｈに示すように、好中球をＣＲ４２‐００３（４７ａ）又はＣＨ‐３５（４３）のみとインキュベートしたときに測定されたスーパーオキシドの量は、ネガティブコントロール（ＨＢＳＳに含まれる好中球）の量と同様である。これは、ＣＲ４２‐００３（４７ａ）もＣＨ‐３５（４３）も、スーパーオキシドの生成によって決定されるように、好中球に対して非特異的な効果を示さないことを示唆している。
例３-ＡＤＭＥＴ予測
上記のインビトロ所見に基づいて、及び誘導体（９１）と（８９）の間で観察されたヒト好中球の炎症反応に対する発散効果に基づいてインビボで誘導体（９１）の機能を評価する前に、痛風の治療のための潜在的な薬物としての（９１）の使用を評価するために、ＡＤＭＥＴ予測をこれらの誘導体間で決定した。
ＡＤＭＥＴ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ７．２（Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｐｌｕｓ、ＣＡ）は、薬物動態の業界標準予測ソフトウェアである。ＡＤＭＥＴの特性を予測するために、複合構造で実行された。以下の表２は、ＡＤＭＥＴリスク指標を示している。各リスク指標は、値が高いほど、薬物動態又は毒性の問題のために化合物が薬剤として失敗するリスクが高いことを示すスコアである。ＣＹＰ＿リスクは、代謝責任モデルの集合体である。ＴＯＸ＿ＭＵＴ＿リスクは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの変異原性モデルの集合体である。ＴＯＸ＿リスクは、毒性責任のモデルの集合体である。ＡＤＭＥＴ＿リスクは、複数の要因を組み合わせた全体的なリスクスコアである。スコアに寄与する特定の要因は、メモに記載されている。この分析は、インビボでの動作の信頼できるｉｎ‐ｓｉｌｉｃｏプロキシである。各リスク指標において、（８９）のリスクスコアは（９１）のスコアよりも高いことがわかった。したがって、（８９）は、ＡＤＭＥＴの要因により、薬剤として失敗する可能性が高いと予測される。
Figure 2022511214000053
したがって、ＡＤＭＥＴ予測は、（９１）と比較して（８９）の毒性リスクが明らかに高いことを示しており、動物試験で失敗する可能性が高い候補となっている。
例４-インビボ研究
コルヒチン誘導体のインビトロでの効果を示したので（上記を参照）、ＭＳＵによって誘発されたインビボでの炎症においてＣＣＩ（化合物９１）を用いて一連の実験を行った。要約すると、以下でさらに詳細に説明するように、痛風のような炎症を誘発するためにマウスにＭＳＵを注射した。マウスにさらにＣＣＩ（化合物９１）又はＣＨ‐３５（化合物４３）を単独で、又はＭＳＵ注射の前又は後に注射して、ＣＣＩ（化合物９１；図１０Ａ）の血漿半減期を決定し、ＣＨ‐３５（化合物４３；図１０Ｂ）の血漿半減期を決定し、ＣＣＩ（化合物９１）又はＣＨ‐３５（化合物４３）が循環白血球によって取り込まれるかどうかを決定し（それぞれ図１１Ａ及びＢ）、ＣＣＩ（化合物９１）又はＣＨ‐３５（化合物４３）対コルヒチン（図１２、１３及び１４）のＭＳＵ誘発性炎症反応に関連する効果を比較した。
Ａ．マウスにおけるコルヒチン誘導体の血漿半減期の決定
使用した実験モデルと血漿中のＣＣＩ又はＣＨ‐３５の濃度の測定
マウスに５μｍｏｌ／ｋｇの（９１）（ＣＣＩ）又はＣＨ‐３５（４３）を皮下注射し、注射後１５、３０、４５、６０、又は１２０分で屠殺した。３５％タイロードバッファーｐＨ ６．５及び２０％クエン酸‐デキストロース溶液（ＡＣＤ）を用いた心臓穿刺により血液を採取し、２５００×ｇをＲＴで１５分間遠心分離して血漿を得た。血漿中の化合物の濃度（図１０Ａ及びＢ）は、質量分析によって決定された。（９１）（ＣＣＩ）又はＣＨ‐３５（４３）の濃度は、同じ時点で収穫された５匹のマウスの血漿（ｎｇ／ｍｌ）で測定された（９１）（ＣＣＩ）又はＣＨ‐３５（４３）の量の平均として表される。
Ｂ．循環白血球中のコルヒチン誘導体の濃度の決定
使用した実験モデルと循環白血球中のＣＣＩ又はＣＨ‐３５の濃度の測定
マウスに５μｍｏｌ／ｋｇの（９１）（ＣＣＩ）又はＣＨ‐３５（４３）を皮下注射し、注射後１５、３０、４５、６０、又は１２０分で屠殺した。心臓穿刺により血液を採取し、遠心分離して循環白血球を得た。白血球中の化合物の濃度（図１１Ａ及びＢ）は、質量分析によって決定された。（９１）（ＣＣＩ）又はＣＨ‐３５（４３）の濃度は、５匹のマウスの同じ時点で収穫される循環白血球で測定された（９１）（ＣＣＩ）又はＣＨ‐３５（４３）の量（ｎｇ／ｍｌ）の平均として表される。
Ｃ．（９１）（ＣＣＩ）は、ＭＳＵ注射の５分前に投与すると、エアポーチモデルでＭＳＵによって誘発される白血球動員を阻害する
使用した実験モデルとエアポーチ内の白血球の測定
野生型マウス（ＣＤ‐１マウス）におけるコルヒチン及びコルヒチン誘導体の抗炎症活性のインビボ評価を行った。皮下に空気を注入することにより、７日間にわたってマウスの背側にエアポーチを生成した。空気の最初の注射の７日後、エアポーチ内へのＭＳＵ（１．５ｍｇ／ｍｌ）又は希釈剤（ＰＢＳ）の注射の５分前に、示された量の（９１）（ＣＣＩ）、コルヒチン又はＤＭＳＯ（ビヒクル）を含む１０μｌ／ｇのＨＢＳＳを皮下注射した。ＭＳＵの投与から７時間後、エアポーチ内の滲出液を２ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍ ＥＤＴＡで２回フラッシュし、１ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍ ＥＤＴＡで１回フラッシュして採取し、動員された白血球の数をフローサイトメトリーで測定した。白血球は抗ＣＤ４５及び抗Ｌｙ６Ｇ抗体で染色された。
Ｄ．（９１）又は（４３）は、ＭＳＵ注射の１．５時間後に投与すると、エアポーチモデルでＭＳＵによって誘発される白血球動員を阻害する
使用した実験モデルとエアポーチ内の白血球の測定
野生型マウスにおけるコルヒチン及びコルヒチン誘導体の抗炎症活性のインビボ評価を行った。皮下に空気を注入することにより、７日間にわたってマウスの背側にエアポーチを生成した。最初の空気注射の７日後、エアポーチ内のＭＳＵ（１．５ｍｇ／ｍｌ）又は希釈剤（ＰＢＳ）の注射の１．５時間後に、示された量の（９１）、（４３）、コルヒチン又はＤＭＳＯ（ビヒクル）を含む１０μｌ／ｇのＨＢＳＳを皮下注射した。ＭＳＵの投与から７時間後、エアポーチ内の滲出液を２ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍ ＥＤＴＡで２回フラッシュし、１ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍ ＥＤＴＡで１回フラッシュして採取し、動員された白血球の数をフローサイトメトリーで測定した。白血球は抗ＣＤ４５及び抗Ｌｙ６Ｇ抗体で染色された。
結果
循環中の（９１）（ＣＣＩ）又は（４３）（ＣＨ‐３５）の半減期と白血球中のその濃度
インビボでのＣＣＩ又はＣＨ‐３５（４３）の抗炎症活性を試験する前に、マウス血漿中のそれらの半減期及び２時間にわたる循環白血球中の濃度を決定した。
図１０Ａに示すように、血漿サンプルの質量分析により、（９１）（ＣＣＩ）の濃度は１５分（８０ｎｇ／ｍｌ）でピークに達し、その後６０分までにこの濃度の１／４未満に減少したことが明らかになった（ｔ1/2＝１３．３分）。（９１）（ＣＣＩ）の濃度の低下が観察されたが、それは少なくとも２時間血漿中で持続した。同様に、循環ＣＨ‐３５（４３）の最高濃度は、注入後１５分でピークに達した（図１０Ｂ）。しかし、ＣＣＩ（９１）とは対照的に、血漿中のＣＨ‐３５（４３）の量は、薬物の注射後約５０分で検出できないレベルに低下した。したがって、ＣＨ‐３５（４３）の濃度は、投与後１時間以内に血漿中で有意に減少した。総合すると、これらの結果は、ＣＣＩ（９１）とＣＨ‐３５（４３）の半減期が非常に短いことを示しており、別の区画への取り込みが速いことを示唆している。
図１１Ａに示すように、循環白血球では、（９１）（ＣＣＩ）の濃度は１５分でピークに達し、分析された最後の時点（２時間）までこれらの細胞で持続した。同様に、図１１Ｂに示すように、循環白血球では、ＣＨ‐３５（４３）の濃度は１５分でピークに達し、分析された最後の時点（２時間）までこれらの細胞で持続した。したがって、ＣＨ‐３５（４３）は、皮下注射後少なくとも２時間は循環白血球に存続する可能性がある。
（９１）（ＣＣＩ）又は（４３）ＣＨ‐３５はインビボでＭＳＵ誘発性炎症を軽減する
（９１）（ＣＣＩ）又はＣＨ‐３５（４３）のインビボ抗炎症活性は、ＭＳＵ誘発性炎症のエアポーチモデルで評価された。このモデルが選択されたのは、背側の気腔が、関節の滑膜の内層（例：線維芽細胞及びマクロファージ）及び白血球動員の同じプロファイルと本質的な細胞の特徴を共有しているためである。
図１２に示すように、ＭＳＵは７時間で白血球のエアポーチへの動員を誘発したが、これは５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のコルヒチンによって阻害された。約１０分の１の低濃度でも、（９１）（ＣＣＩ）は、ＭＳＵの投与前に注射した場合でも白血球の動員を阻害することができた。示されているように、コルヒチンの５μｍｏｌ／ｋｇと比較して０．５μｍｏｌ／ｋｇの有意に低い用量で白血球動員を阻害するＣＣＩ（９１）の能力が実証されたが、この用量のコルヒチンはこのシリーズでは有意ではなかった。０．５μｍｏｌ／ｋｇの用量で、コルヒチンはインビボでＭＳＵによって誘発される白血球動員を有意に阻害する効力を失った。逆に、ＣＣＩ（９１）は、その非単調な用量反応曲線のために、５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のコルヒチンよりも効果的ではない可能性がある。
（９１）（ＣＣＩ）の治療可能性を判断するために、エアポーチ実験を変更し、ＭＳＵをエアポーチに追加した後に０．５μｍｏｌ／ｋｇ（９１）（ＣＣＩ）を注入した。図１３に示すように、これらの実験条件下でも白血球動員の有意な減少が観察され、ＭＳＵがすでに炎症過程を引き起こした後、（９１）（ＣＣＩ）を投与した場合でも、ＭＳＵ誘発性の炎症を抑制できることを示している。対照的に、０．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のコルヒチンは、インビボでのＭＳＵ誘発性の白血球動員を有意に阻害することができなくなった（図１３）。むしろ、意外なことに、（９１）（ＣＣＩ）は、したがって、コルヒチンの有効量の約１０分の１の濃度でＭＳＵ誘発性の白血球動員を阻害する。さらなる実験では、図１４に示すように、ＣＨ‐３５（４３）を同様にテストして、図１３に示すＣＣＩ（９１）で得られた結果を比較した。図１４の結果は、ＣＨ‐３５（４３）が、エアポーチへの白血球の流入を阻害する点でＣＣＩ（９１）よりも弱いことを示している。白血球動員を有意に抑制したＣＨ‐３５（４３）の最低濃度は、２．５μｍｏｌ／ｋｇであった。したがって、ＣＨ‐３５（４３）は、ＭＳＵによって誘発される炎症中に白血球の動員を阻害する可能性がある。まとめると、これらの結果は、ＣＨ‐３５（４３）とＣＣＩ（９１）の両方が、コルヒチンよりも低濃度でインビボでの白血球動員を阻害できる一方で、ＣＣＩ（９１）は、インビボでのＭＳＵ誘発性の白血球動員を阻害するための最も強力な化合物であることを示している。
実施例５‐好中球におけるベータチューブリンアイソタイプの発現プロファイル
方法
好中球懸濁液（２×１０７細胞／ｍｌ）を同量の２×沸騰修飾Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（１×バッファー：６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）β‐メルカプトエタノール、８．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、グリセロール、２．５ｍＭオルトバナジン酸、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．０２５％ブロモフェノールブルー）に直接移し、及び７分間煮沸した。タンパク質は、還元条件下で１０％アクリルアミドゲル上でＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分離され、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写された。ブロッキング剤と抗体は、トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１９０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５％ｖｏｌ ｖｏｌ Ｔｗｅｅｎ‐２０）で希釈した。一次及び二次抗体は、メーカーが推奨する濃度で使用された。抗β‐チューブリンアイソタイプ特異的抗体でイムノブロッティングする前に、ＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（ＴＢＳＴ中の５％ｗｔ／ｖｏｌ粉乳）でインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗マウスＩｇＧ及びロバ抗ウサギＩｇＧをＴＢＳＴ溶液で希釈した。化学発光試薬を使用して、最大曝露時間５分の抗体を検出した。提示されたすべてのイムノブロットは、抗ＰＩ３キナーゼｐ８５抗体を用いてタンパク質の負荷が等しくなるように制御された。
結果
白血球におけるβ‐チューブリンアイソタイプの発現プロファイルは、ｍＲＮＡレベルで調査されている。βＶＩのｍＲＮＡの発現は主に造血細胞に限定されているが、β‐チューブリンＩ、ＩＶ、及びＶのｍＲＮＡは遍在的に発現しており、β‐ＩＩと‐ＩＩＩのｍＲＮＡは脳に限定されている。合理的な設計アプローチを使用して、さまざまなβ‐チューブリンアイソタイプに対するコルヒチンの異なる結合親和性に基づいてコルヒチン誘導体を開発し、好中球におけるこれらのアイソタイプのｍＲＮＡ発現プロファイルがタンパク質レベルでの発現と相関するかどうかを決定した。手短に言えば、新たに単離されたヒト好中球を溶解し、ベータ‐Ｉ、アルファ／ベータ‐ＩＩ、ベータ‐ＩＩＩ、ベータ‐ＩＶ、ベータ‐Ｖ及びベータ‐ＶＩチューブリンに対する市販の抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。βＩＩとβＩＶにはそれぞれβＩＩａ、βＩＩｂとβＩＶａ、βＩＶｂと呼ばれる２つの変種があるが、それらの配列は非常に類似しており、構造も類似していることに注意されたい。図１５に示すように、ヒト好中球はベータＩ、アルファ／ベータＩＩ、ベータＩＶ、ベータＶＩを発現するが、ベータＩＩＩとベータＶは発現しない。βＶで観察されたバンドは非特異的である（ポジティブコントロールで確認（データは示さず））。β‐ＶＩの発現は主に造血細胞に限定されているため、このβ‐チューブリンアイソタイプに対してより高い親和性を持つコルヒチン誘導体を本明細書に記載の分析のために選択した。
ＣＨ‐３５（４３）に低濃度でＭＳＵ誘導応答を阻害する能力を与える可能性が最も高いβ‐チューブリンアイソタイプを特定するために、コルヒチン、ＣＣＩ（９１）、ＣＲ４２‐００３（４７ａ）及びＣＨ‐３５（４３）の結合自由エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を以下の表３で比較した。
Figure 2022511214000054
上記の表３に示すように、ＣＨ‐３５（４３）は、コルヒチン及びＣＲ４２‐００３（４７ａ）と比較して、βＩＶｂ及びβＶＩの結合自由エネルギーが大幅に低くなっている。これらのデータは、βＩＶｂ及びβＶＩに対するＣＨ‐３５（４３）の親和性が高いと、テストしたアッセイでコルヒチン及びＣＲ４２‐００３（４７ａ）と比較して低濃度でＣＨ‐３５（４３）が活性化する可能性が非常に高いことを示唆している。さらに、ＣＣＩ（９１）に関しては、コルヒチン及びＣＲ４２‐００３（４７ａ）と比較してβＩＶｂ及びβＶＩに対しても高い親和性を示す。ＣＣＩ（９１）とＣＨ‐３５（４３）の違いは、ＣＨ‐３５（４３）は単調な用量関係にあり、ＣＣＩ（９１）には当てはまらないことである。結合自由エネルギーデータは、これが、結合自由エネルギーがＣＣＩ（９１）と比較してＣＨ‐３５（４３）に対して有意に高い好中球で発現される唯一の２つのβ‐チューブリンアイソタイプであるため、βＩＶｂ又はβＶＩ、あるいはその両方に対するＣＨ‐３５（４３）のより高い親和性に起因する可能性があることを示唆している。
ディスカッション
痛風の治療に使用される薬剤の中で、コルヒチンは、痛風発作に関与する主要な白血球である好中球の炎症作用のほとんどを弱めるため、この炎症性疾患の病因に関して最も特異性を示す。それにもかかわらず、その投与は、有効性と治療を制限する副作用との間の治療指数が低いため、依然として困難である。合理的なドラッグデザインアプローチを使用して、コルヒチンの類似体（９１）（ＣＣＩ）が開発され、ＭＳＵ誘発性の炎症をインビボで、ＭＳＵ誘発性の好中球反応をインビトロでコルヒチンよりも約１０分の１～約１００分の１の濃度で阻害する。注目すべきことに、他のコルヒチン誘導体４３及び４７ａは、本明細書に記載されるように、９１と同じ用量で好中球応答を低減するのに同様に効果的であった。
ＣＣＩ（９１）及び（４３）は、インビトロ及びインビボでコルヒチンよりも約１０分の１～約１００分の１の用量で抗炎症活性を保持していた。さらに、これらの化合物は、ＭＳＵによって誘発された炎症反応の開始後に投与された場合に抗炎症特性を示し、それらの治療の可能性を示している。
（９１）（ＣＣＩ）コルヒチンよりも低い濃度でインビトロ及びインビボでＭＳＵ誘発性の好中球活性化を弱める能力は、そのチューブリンアイソタイプ特異性によって部分的に説明できる。（９１）（ＣＣＩ）のインシリコ分析により、好中球で発現するβ‐チューブリンアイソタイプの１つであるβ‐ＶＩチューブリンに優先的に結合することが明らかになった。さらに、β‐ＶＩチューブリンアイソタイプは、特にコルヒチン結合領域で他とは非常に異なり、結合する薬物に対して高レベルの特異性と選択性を提供する。（９１）（ＣＣＩ）とは対照的に、コルヒチンは、遍在的に発現するβ‐チューブリンアイソタイプであるβ‐ＩＶチューブリンに対して最も高い親和性を示す。コルヒチンは、ＭＳＵによって誘発される活性化と白血球の動員を阻害することができるが、多くの異なる細胞タイプによって発現されるβ‐チューブリンアイソタイプに結合する能力が原因である可能性が最も高い、望ましくない副作用に関連している。したがって、（９１）（ＣＣＩ）のβ‐ＶＩチューブリンへの特異的結合は、このアイソタイプがこれらの細胞では発現されないため、非造血細胞でのオフターゲット効果を最小限に抑え、好中球での活性を最大化する可能性が高い。
インビトロ分析は、（９１）（ＣＣＩ）がＭＳＵによって活性化される最も上流のシグナル伝達イベントの１つである細胞質カルシウムの増加を阻害することを明らかにした。コルヒチンがもはや効果的でない濃度（約１００分の１の低用量）でこの分子イベントを阻害する（９１）（ＣＣＩ）の能力は、（９１）（ＣＣＩ）によって優先的に結合されたβ‐チューブリンアイソタイプがＭＳＵによって誘発される細胞内カルシウム貯蔵動員においてより重要な役割を果たす可能性が最も高いことを強く示唆する。（９１）（ＣＣＩ）は、βＶＩ、βＶに優先的に結合し、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析で予測されるように、βＩ‐チューブリンへの親和性は低くなる。同じような推論は、ＭＳＵによって誘発されるスーパーオキシドの生成など、細胞内カルシウムの動員の下流のエフェクター機能に拡張することができる。（９１）（ＣＣＩ）は、コルヒチンよりも約１０倍低い（約１０分の１の）用量で、ＭＳＵに応答してヒト好中球によるスーパーオキシドの生成を阻害するという直接的な証拠が本明細書に提供されている。同様に、ＭＳＵによって誘発されるＩＬ‐８の放出も、（９１）（ＣＣＩ）によって抑制される。（９１）（ＣＣＩ）は、コルヒチンよりも最大約１０倍低い（約１０分の１の）濃度でＩＬ‐８の放出を阻害するのに特に効果的である。（９１）（ＣＣＩ）は、ＭＳＵ誘発性炎症を治療するために低用量で投与することができ、これにより薬物関連の副作用のリスクが減少する。ＩＬ‐８は好中球にとって最も強力な走化性物質の１つであるため、低濃度での（９１）（ＣＣＩ）によるＩＬ‐８産生の阻害は痛風に非常に関連している。同様に、スーパーオキシドは関節に付随的な損傷を引き起こすため、スーパーオキシド産生の抑制も痛風の病因に関連している。
インビトロ観察は、（９１）（ＣＣＩ）がＭＳＵ誘発性好中球応答を阻害することを明らかにし、次いで、インビボでＭＳＵ誘発性炎症を弱めるＣＣＩの能力が決定された。本明細書に示されているのは、（９１）（ＣＣＩ）が、ＭＳＵの前又は後に投与された場合に、ＭＳＵによって誘発される白血球動員を阻害することである。後者は、（９１）（ＣＣＩ）が、ＭＳＵがインビトロ実験で投与されてから約１時間３０分後に注射されたときに、その抗炎症活性が維持されたため、（９１）（ＣＣＩ）が治療に使用できることを示している。本明細書の実験において、（９１）（ＣＣＩ）がインビボでその抗炎症活性を保持する最低用量は、０．５μｍｏｌ／ｋｇであった。
マウスで使用される薬物のヒト等価用量の推定値を取得するために、態様では、マウスで使用される濃度を約１２．３で割ることができる（Nair, A.B. and Jacob, S. 2016. A simple practice guide for dose conversion between animals and human（動物及びヒト間の用量変換のための簡単な実践ガイド）, J Basic Clin Pharma: 7: 27-31）。マウスにおけるＭＳＵ誘発性の白血球動員を効果的に弱めるコルヒチンの用量は５μｍｏｌ／ｋｇである（Chia, E.W., Grainger, R. and Harper, J.L. 2008. British Journal of Pharmacology: 153: 1288-95）。この用量は痛風患者に与えられるヒトの用量よりも１０倍高いため、ヒトの等価用量と見なされる。外挿により、そして本明細書の実験に基づいて、（９１）（ＣＣＩ）は、痛風発作を治療するために現在使用されているコルヒチンの用量よりも約１０倍低い（約１０分の１の）用量で、ヒトのＭＳＵ誘発性炎症を弱めることができると予想される。
痛風発作中の関節へのこれらの細胞の大量の流入のためにヒト好中球が標的化され、この白血球におけるベータチューブリンアイソタイプの発現が決定された。好中球はβ‐Ｉ、β‐ＩＩ、β‐ＩＶ及びβ‐ＶＩチューブリンを発現するが、β‐ＩＩＩ及びβ‐Ｖチューブリンは発現しない。このタンパク質発現パターンは、他の人によって報告されたβ‐チューブリンアイソタイプのｍＲＮＡ発現プロファイルとよく相関している。β‐ＶＩチューブリンのｍＲＮＡは、骨髄、胸腺、胎児肝臓などの多数の白血球を含む造血細胞及び臓器に限定されている。ただし、β‐ＩＩＩ及びβ‐ＶチューブリンのｍＲＮＡは白血球では検出できない。β‐Ｉ、β‐ＩＩ、及びβ‐ＩＶチューブリンアイソタイプのｍＲＮＡのレベルは、白血球のβ‐ＶＩよりも大幅に低くなっている。好中球と他のほとんどの細胞タイプの両方における異なるβ‐チューブリンアイソタイプの機能的重要性は不明なままであるが、機能的冗長性と特異性の両方の証拠がある。前者に関しては、ほとんどのβ‐チューブリンアイソタイプが重合して不均一な微小管になる能力は、機能的な冗長性をサポートする。後者に関して、チューブリン障害として知られている疾患群の異なる表現型は、チューブリンアイソタイプが異なる機能的役割を果たしていることを示唆している。チューブリン障害は、さまざまなβ‐チューブリンアイソタイプの変異によって引き起こされる可能性がある。さらに、β‐チューブリンアイソタイプの組織特異的及び発生段階特異的発現も、これらのタンパク質の非冗長で機能的な役割を示唆している。
白血球におけるβ‐ＶＩチューブリンの機能は不明なままであるが、その白血球発現プロファイルが白血球に対するある程度の機能的特異性を反映し、β‐ＶＩチューブリン特異的薬剤がより少ない非造血細胞に対する、より少ないオフターゲット効果（off-target effects）を示す可能性があると考えられたため、このアイソタイプが標的にされた。コルヒチンよりもβＶＩチューブリンに対して有意に高い相対親和性を有すると予測される３つの誘導体の効力を試験して、インビトロ及びインビボでＭＳＵによるヒト好中球の活性化を阻害した。インビトロで調査されたエフェクター機能は、痛風の病因、すなわち、ＩＬ‐１及びＩＬ‐８の放出並びにスーパーオキシドの産生において役割を果たすものである。非常に効果的な好中球走化性物質であるＩＬ‐８に関して、このサイトカインに対する中和抗体は、ウサギモデルにおいてＭＳＵによって誘発される好中球流入を有意に減少させる。一方、ＩＬ‐１は、内皮細胞や関節内の他の細胞型（滑膜細胞など）による接着分子やサイトカインの発現を誘導することにより、痛風において役割を果たす。スーパーオキシドに関しては、この活性酸素種は関節の側副組織損傷に関連している。本明細書で提供されるデータは、ＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）が、コルヒチンよりも有意に低い濃度、インビトロで約１０分の１から約１００分の１の濃度で、ＭＳＵによって誘発されるＲＯＳの産生及びＩＬ‐８の放出を弱めることを示唆している。これらの好中球応答を減少させるこれらの誘導体の能力は、痛風発作を引き起こす重要な分子イベントを標的とする可能性があることを示している。
インビトロでの観察は、ＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）がコルヒチンよりも有意に高い効力でインビボでＭＳＵ誘発性炎症を弱めることができるかどうかの決定を促した。炎症のエアポーチモデルを使用して、本明細書で提供されるデータは、インビトロでのＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）の阻害活性が、インビボでＭＳＵ誘発性炎症を弱めるそれらの能力を反映することを示唆する。ＣＣＩ（９１）に関しては、ＭＳＵの投与前に注入された場合、コルヒチンよりも約１０倍低い（約１０分の１の）閾値用量でＭＳＵが注入されたエアポーチへの白血球の動員を阻害する。ただし、高濃度では、ＣＣＩ（９１）は白血球の流入を阻害する効果が低いことに注意すべきである。同様の非単調な傾向が、カルシウム及びＲＯＳのインビトロアッセイで観察された。この非単調な用量反応は、内分泌かく乱薬物などのオフターゲット作用に起因する非単調な用量反応を伴う他の薬剤で報告されているように、β‐チューブリンアイソタイプ以外のリガンドへのＣＣＩ（９１）の結合を反映している可能性が最も高い。
ＣＣＩがＭＳＵに応答して白血球の動員を大幅に減少させる点でコルヒチンよりも強力であることを示したので、その治療の可能性を評価した。ＭＳＵ注射の１．５時間後のＣＣＩ（９１）の皮下投与は、エアポーチへの白血球の動員を有意に減少させた。したがって、ＣＣＩ（９１）は、開始後にＭＳＵによって誘発される炎症を抑えることもできる。驚いたことに、コルヒチンはこの特性をＣＣＩ（９１）と共有していたが、コルヒチンはＣＣＩ（９１）が活性を維持する濃度である０．５μｍｏｌ／ｋｇで抗炎症活性を失う。ＣＨ‐３５（４３）についても、ＣＣＩ（９１）よりも高濃度の２．５μｍｏｌ／ｋｇであるにもかかわらず、同様の観察が行われた。ＣＣＩ（９１）とは対照的に、ＣＨ‐３５（４３）はインビトロ及びインビボの両方で単調な用量反応を示す。総合すると、これらの観察結果は、ＣＣＩ（９１）がＣＨ‐３５（４３）よりもインビボでのＭＳＵ誘発性炎症の抑制においてより強力であることを示している。
ＣＣＩ（９１）とＣＨ‐３５（４３）の半減期は短いが、これらの誘導体は両方とも、白血球動員のピークの７時間前に投与すると、ＭＳＵ誘発性の白血球動員を弱めることができる。これは、白血球、特に好中球によるこれらの化合物の取り込みと保持によって部分的に説明できる。コルヒチンは、単核細胞と比較して好中球に優先的に蓄積する。ＣＣＩ（９１）の保持は、注射後２時間まで循環白血球で観察された（予備データ）。ＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）の薬物動態の完全な特性評価は、これらの化合物の作用機序へのさらなる洞察を提供する可能性がある。
好中球は宿主を感染から保護する上で重要な役割を果たしているため、炎症を抑えるために好中球を標的にすることは困難であった。ＣＣＩ（９１）は、細胞質カルシウムの増加や活性酸素種の生成などの特定の好中球抗菌反応を抑えながら、ＭＳＵ誘発性炎症を選択的に阻害することが決定された（データは示さず）。細菌ペプチドｆＭＬＦを使用して、ＣＣＩ（９１）の存在下で好中球がこの細菌ペプチドに応答する能力の証拠が提供された。この観察は、ＣＣＩ（９１）がＭＳＵに対する好中球刺激を弱めながら細菌感染のリスクを増加させてはならず、おそらくホルミルペプチド受容体によって媒介される自然免疫がβＶＩチューブリンに完全には依存していないことを示唆している。ベータＶＩチューブリンは、他のベータチューブリンアイソタイプと共有する細菌防御において冗長な役割を果たしているか、あるいはベータＶＩチューブリンはこれらの防御にまったく必要とされていないかである。ＣＣＩ（９１）及びＣＨ‐３５（４３）はまた、他のベータチューブリンアイソタイプに対する親和性が増加していると推定されていることに注意されたい。
要約すると、ＭＳＵ誘発性炎症を抑制し、痛風発作中の痛風患者の症状を緩和する可能性のある、毒性の少ない新しい抗炎症薬が開発された。このような薬剤の開発は、痛風患者の主要な満たされていない臨床的ニーズに対応している。コルヒチンは治療指数が非常に狭く、薬物間相互作用による有害な副作用に関連している。
さらに、痛風は、併存疾患（例：慢性腎臓病（ＣＫＤ））の患者でより頻繁に現れる。痛風患者の約５４％がＣＫＤに苦しんでいる。ＣＫＤ患者は、腎機能障害のためにこれらの患者においてコルヒチンが毒性レベルまでより容易に蓄積するため、コルヒチンの注意深い投与を必要とするため、これはコルヒチンの使用を困難にする。併存疾患はまた、急性痛風発作に関連する炎症と痛みを軽減するために使用できるコルヒチン以外の薬剤の選択を大幅に制限する。不寛容と併存疾患のために現在の治療法をとることができない患者は、新しくて毒性の少ない治療アプローチの原動力である。ＮＳＡＩＤやコルチコステロイドなどの代替抗炎症薬があるが、これらの化合物自体も十分に立証された副作用と関連している。したがって、ここに提示された発見は、ＣＣＩのより低い有効量がその治療域を広げ、コルヒチン及び他の抗炎症薬に関連する有害な副作用を減少させることを示している。痛風患者の推定１２％は、利用可能なすべての治療法に抵抗性である（未発表の観察）。（９１）（ＣＣＩ）は非常に低用量で活性があるため、（９１）（ＣＣＩ）が他の薬剤との相互作用により毒性を引き起こす可能性はほとんどない。この仮説は、（９１）（ＣＣＩ）がコルヒチン及び上記の（８９）などの他のコルヒチン誘導体よりも毒性が低いことを示したラットの急性炎症毒性研究によって裏付けられている。（９１）（ＣＣＩ）の最大耐量は、コルヒチンの最大耐量の３倍である。このような薬は、痛風患者、特に腎機能の低下のために薬を排除できないためにＣＫＤを患っている患者にとって特に興味深いものである。（９１）（ＣＣＩ）は、コルヒチンよりも安全な抗炎症薬であり、痛風患者のためのより安全な代替薬である。
例６-チューブリン結合研究
材料及び方法
チューブリンモデルの準備
ヒトβ‐チューブリンアイソタイプのコンセンサス配列は以前に記載されている（Huzil J.T. et al., Nanotechnology. 2006:17:S90-S100）。コルヒチン結合部位を構成する残基は、１ＳＡ０ ｐｄｂ座標内のＢ鎖を調べることによって決定された（Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202.）。ＰｙＭｏｌ ｖ１．０（Delano WL. The PyMOL Molecular Graphics System. 2002）を使用して、コルヒチンから６Å以内に原子が見つかった残基を選択した。この残基のサブセットから、コルヒチン結合部位内に見られる接触残基の最小セットが定義された（図５Ａ及び５Ｂ）。この減少した接触セットに基づくβＩ、βＩＩａ、βＩＩｂ、βＩＩＩ、βＩＶａ、βＩＶｂ、及びβＶの一次配列の検査は、チューブリンアイソタイプを３つのコルヒチン結合部位の１つに配置した；タイプＩ（βＩ及びβＩＶ）、タイプＩＩ（βＩＩ）及びタイプＩＩＩ（βＩＩＩ及びβＶ）（図５Ａ）。次に、１ＳＡ０ Ｂ鎖座標（Ravelli et al., 2004, Nature, 428, 198-202）から得られたテンプレートβ‐チューブリン構造を使用して、ＰｙＭｏｌ ｖ１．０（Delano WL. The PyMOL Molecular Graphics System. 2002）にある変異関数を使用して標準の配座異性体ライブラリーから適切な残基を置き換えることによりモデルを作成した。
各結合部位モデルの最小化は、ＣＨＡＲＭｍ（Chemistry at HARvard Molecular Mechanics）分子力場（(Brooks B.R., Brooks CLr, Mackerell AD.J. et al., CHARMM: The biomolecular simulation program.（ＣＨＡＲＭＭ：生体分子シミュレーションプログラム。） J. Comput. Chem. 2009）を用いて、ＧＲＯＭＡＣＳ分子動力学（ＭＤ）パッケージ（バージョン３．２．１）で実行された（Lindahl F. et al., GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis.（ＧＲＯＭＡＣＳ ３．０：分子シミュレーション及び軌道解析用パッケージ。） J Mol. Mod. 2001; 7:306-17)。最急降下及び共役勾配最小化の収束基準は、０．０５ｋｃａｌｍｏｌ‐１Å‐１の勾配で設定された。最小化に続いて、十分に溶媒和された周期的ボックス（１００ｘ１００ｘ１００Å）で短いシミュレーテッドアニーリングラン（１００ｐｓ）が実行された。拘束されていない電荷はナトリウムイオンと釣り合いが取れており、長距離静電気は粒子メッシュＥｗａｌｄ（ＰＭＥ）を使用して計算された。
コルヒチン誘導体
チューブリンに結合したコルヒチンの構造は、ｐｄｂ構造ファイル１ＳＡ０（Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202）から抽出され、ＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈ（ＣｈｅｍＡｘｏｎ、ハンガリー）にインポートされた。Ｃ１及びＣ３メトキシ基の誘導体化（図２‐４）は、３Ｄ描画ツールを使用して変更を構築することによって達成された。次に、各派生物は３Ｄ座標でＭＤＬ Ｍｏｌｆｉｌｅｓ（Ｓｙｍｙｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）としてエクスポートされた。
コルヒチンのパラメーター化と最小化
コルヒチンとその誘導体構造は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ２．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で実装されているＣＨＡＲＭｍ力場（Brooks B.R., Brooks CLr, Mackerell AD.J. et al., CHARMM: The biomolecular simulation program. J. Comput. Chem. 2009）を使用して準備及びパラメーター化された。タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの結合部位モデルに各誘導体を再導入する前に、真空中の最小化ステップを実行した。初期のコルヒチン座標は結晶構造から得られたため、３つの環のそれぞれに含まれる炭素原子に調和拘束（１０ｋｃａｌｍｏｌ－１）が設定された。二乗平均偏差（ＲＭＳ）勾配が０．０５ｋｃａｌｍｏｌ－１Å－１未満になるまで、水素が追加され、結合次数が固定され、原子位置がＣＨＡＲＭｍ力場と採用基底関数系ニュートンラフソン（ＡＢＮＲ）プロトコルを使用して最適化された。特定のコルヒチン誘導体はわずかに異なって調製された。個々のシステムは、ＧＲＯＭＡＣＳを使用してＴＩＰ３ウォーターボックスに配置され、最小化された。短い平衡化の後、３つの別々の条件のシステムエネルギーが得られた。溶媒和されたチューブリンコルヒチン複合体Ｅ（Ｐ＋Ｌ）のエネルギーは、コルヒチンがコルヒチン結合部位Ｅ（Ｐ－Ｌ）に結合されていないチューブリンコルヒチンシステムから得られたエネルギーから差し引かれた。Ｅ（Ｐ－Ｌ）の場合、コルヒチンとチューブリンの間に非結合相互作用が導入されないように、大きなウォーターボックスが使用された。
計算コルヒチンスクリーニング
タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの結合部位への２０のコルヒチン誘導体のドッキングは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ２．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｉｎｃ．、米国）に実装されているように、ＣＤＯＣＫＥＲ（Wu G. et al., J. Comput Chem. 2003; 24:1549-62）を使用して実行された。。簡単に説明すると、ＣＨＡＲＭｍ力場を使用したシミュレーテッドアニーリングＭＤアプローチを使用して、誘導体のコンフォメーション検索を実行した（Brooks B.R., Brooks CLr, Mackerell AD.J. et al., CHARMM: The biomolecular simulation program.（ＣＨＡＲＭＭ：生体分子シミュレーションプログラム。） J. Comput. Chem. 2009）。入力部位球の選択は、コルヒチン結合部位全体にわたって定義された。次に、各誘導体を温度Ｔ＝７００Ｋに加熱し、Ｔ＝３００Ｋにアニーリングした。２０のコルヒチン誘導体のそれぞれに対して１０のそのようなサイクルが実行され、６００のポーズが生成された。次に、各コンフォメーションは、上記のＡＢＮＲ法を使用して、局所エネルギー最小化にかけた。
結合エネルギー評価
ＭＭ‐ＧＢＳＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ‐Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａ、分子力学一般化表面積）を使用して、真空静電学を使用して各システムの結合エネルギーを評価し、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎモデルを使用して溶媒和を概算した。結合エネルギーは、システムの全ポテンシャルエネルギーを取得し、誘導体と空の二量体のエネルギーを差し引くことによって計算された。
Figure 2022511214000055
特定のコルヒチン誘導体では、エネルギーはわずかに異って決定された。
Figure 2022511214000056
精製チューブリンアイソタイプへの薬物結合
チューブリンは、ホスホセルロースクロマトグラフィー（Fellous A., et al., Eur. J. Biochem. 1977; 78:167-74）によってバルク微小管タンパク質から精製された。続いて、αβＩＩ及びαβＩＩＩチューブリンダイマーを、以前に記載されたようにモノクローナル抗体を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製した（Banerjee A. et al., J. Biol. Chem. 1992; 267:13335-9;及び Baneljee A. et al., J. Biol. Chem. 1988; 263:3029-34)。動的蛍光測定では、チューブリンの５００μＬアリコート（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、一連の薬物濃度の存在下で石英蛍光キュベット（光路長０．５ｃｍ）内で３７℃でインキュベートした。速度論は、チューブリンよりも大過剰の薬物を使用して、疑似一次条件下で実施された。使用した励起波長と発光波長は、それぞれ３８０ｎｍと４３７ｎｍであった。
補正された蛍光値は、時間（ｔ）の関数としてプロットされ、曲線：
Figure 2022511214000057
に適合した。これらの条件下では、ｋｏｎ，ａｐｐは、薬物とチューブリンアイソタイプ間の相互作用の程度の優れた指標である。Ｌｎ（Ｆｍａｘ－Ｆｔ）対ｔの予想される線形プロットには、傾きｋｏｎ，ａｐｐがある。ｋｏｎ，ａｐｐ値は、αβＩＩ、及びαβＩＩＩ、それぞれ１３２及び３０Ｍ－１ｓ－１について以前に報告された値の関数としてプロットされた（Banerjee A. et al., J. Biol. Chem. 1992; 267:13335-9）。
結果
アイソタイプシーケンス分析
チューブリンの三次構造は、ドメインＩ（残基１～１９８）、ドメインＩＩ（残基１９９～３７３）及びドメインＩＩＩ（残基３７４～４２８）の３つの異なるドメインに分けることができる（Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7）。βＩ、βＩＩａ、βＩＩｂ、βＩＩＩ、βＩＶａ、βＩＶｂ、及びβＶアイソタイプは、これらのドメイン内でそれぞれ８７．４％、８８．１％、及び９６．３％の同一性を共有する。パクリタキセル結合に関与する残基（Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7）については、β‐チューブリンアイソタイプ間の全体的な同一性と比較した場合、予想よりも大きい９１．７％という配列同一性があった。この平均よりも高い傾向は、Ｖｉｎｃａ結合部位（Gigant B. et al., Nature. 2005:435:519-22）（９２．３％の同一性）及びＧＤＰ結合部位（Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7）（１００％同一性）でも続いている。コルヒチン結合表面（Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202）は、１８残基：Ｖ２３６、Ｃ２３９、Ｌ２４６、Ａ２４８、Ｋ２５２、Ｌ２５３、Ｎ２５６、Ｍ２５７、Ｔ３１２、Ｖ３１３、Ａ３１４、Ａ３１５、Ｖ３１６、Ｎ３４８、Ｋ３５０、Ｔ３５１、Ａ３５２、及びＩ３６８（図５Ａ）からなることがわかり、パクリタキセル及びＶｉｎｃａ結合部位とは対照的に、調べた７つのβ‐チューブリンアイソタイプ間で７７．９％の同一性しか共有していない。
一般に、結合部位は主に非極性であり、残基Ｋ２５２及びＫ３５０によって表面の外唇にわずかな正電荷が導入される。コルヒチン結合表面内の特異的置換は、Ｃ２３６Ｓ（βＩＩＩ及びβＶ）、Ａ３１５Ｔ（βＩＩＩ及びβＶ）、Ｖ３１６Ｉ（βＩＩ）、及びＴ３５１Ｖ（βＩＩＩ及びβＶ）であることがわかった（図５Ａ）。この部位内の置換のアイソタイプ分布に基づいて、β‐チューブリンアイソタイプは３つのクラスに分類された。タイプＩ結合部位は、標準的なβＩ配列によって特徴付けられ、ほとんどの場合、βＩＩ及びβＩＶアイソタイプを含む。タイプＩＩ結合部位は、βＩＩアイソタイプ内にのみ見られるＶ３１６Ｉ置換を除いて、タイプＩ部位と同一である。タイプＩＩＩ結合部位は、最大の変動（Ｃ２３６Ｓ、Ａ３１５Ｔ、及びＴ３５１Ｖ）を有し、βＩＩＩ及びβＶアイソタイプを含む。タイプＩＩ及びタイプＩＩＩの結合部位内で見つかった置換がβＩ‐チューブリン構造にマッピングされた場合（Lowe J. et al., J. Mol. Biol. 2001; 313:1045-57）、すべてがコルヒチンＡリングを囲む領域内に配置されることが観察された（図５Ｂ）。これらの置換はいずれも表面の電荷を変化させないが、Ｃ２３９Ｓ及びＡ３１５Ｔは、Ａ環と相互作用する表面の極性、特に３つの非極性フェノールメトキシ基を変化させる。
コルヒチン誘導体
図２‐４に概説されているように、基本的なコルヒチンとチオコルヒチンの足場にいくつかの変更が加えられた。これらの修飾は、アルカン／アルケン、エステル／エーテル、Ｃ１‐デメチルコルヒチン及びＣ３‐デメチルコルヒチンへの芳香族修飾（図３及び３Ａ）、又はＣ３‐デメチルチオコルヒチンへのアルカン／アルケン修飾（図４）で構成された。アイソタイプ結合部位のクラス間の空間的及び化学的差異を調べるために、特定の修飾が選択された。Ｃ１で行われた修飾は、残基３１５、３１６、及び３５１の間に見られる差異をプローブするように設計されたが、Ｃ３で行われた変更は、主に、共結晶で観察され、コルヒチンの下にある非極性空洞を調べるように設計された（Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202）。
コルヒチン誘導体のドッキング
コルヒチン誘導体を計算で調べるために採用された基本的な戦略は、いくつかのリガンド配向の生成、続いてＭＤベースのシミュレーテッドアニーリング、及び最急降下と共役勾配最小化を組み込んだ最終精製ステップを含んでいた。ＣＤＯＣＫＥＲ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｉｎｃ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して、コルヒチン誘導体ごとに合計１０個のレプリカを生成し、結合部位モデルの中心の周りにランダムに分散させた。誘導体の最初の配置に続いて、それらはそれぞれＭＤベースのシミュレーテッドアニーリングと最小化による最終精製にかけられ、３つの結合部位モデルのそれぞれで各誘導体とコルヒチンに対して１０個のドッキングポーズが得られた。ドッキング手順の最後のステップは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＳｔｕｄｉｏのＳｃｏｒｅ Ｌｉｇａｎｄ Ｐｏｓｅｓプロトコルを使用して、洗練されたドッキングポーズをスコアリングすることであった。結合エネルギースコアを作成するために、各実験の１０のポーズの平均エネルギー値が使用されたことに注意されたい。この手順により、６３０個のリガンド配座異性体が得られ、そのエネルギー評価が実行された。
結合エネルギーの決定
結合エネルギーは、ドッキングステップで決定された各完全システムの全ポテンシャルエネルギーを計算し、次に結合リガンドとアポダイマーのエネルギーを差し引くことによって決定された（表４から６）。各コルヒチン誘導体の平均結合エネルギーをプロットすると、傾向はすべてのモデルで一貫しており、タイプＩ、タイプＩＩ、又はタイプＩＩＩの結合部位の間に明らかな違いはなかった（図６；ＣＨはコルヒチンを表す）。ただし、すべてのモデルで、位置Ｃ１のエステル／エーテル及び芳香族誘導体はコルヒチンと比較して高い結合エネルギーを示したが、位置Ｃ１及びＣ３のアルカン／アルケン及びチオコルヒチン誘導体は優れた結合親和性を示した（表４及び図６）。これらのプロットは、各誘導体の結合エネルギーの範囲も示しており、ドッキングフィットの全体的な適切性を示唆している（図６）。具体的には、コルヒチンよりも高い結合エネルギーを示す誘導体は、結合エネルギーの分布が大きくなる傾向があり、全体的な結合エネルギーが低い誘導体は、分布が狭くなった。この傾向は、Ｃ１位置の各官能基の極性と相関しているように見えた。これらの修飾がインビトロで果たした役割を調べるために、すべてのコルヒチン誘導体を合成し、チューブリン結合アッセイでテストした。
これらの計算から、コルヒチンアミド基の修飾がチューブリンとの結合を増加させることは明らかである（表５及び６）。これらの結果はまた、平均して、特定の誘導体（（４０）、（４２）、（４３））に加えられた修飾が最低のエネルギーを持っていたことを示唆している。
Figure 2022511214000058
Figure 2022511214000059
Figure 2022511214000060
例７-結合速度論
（９１）（ＣＣＩ）のどの側面が上記の予期しない結果に寄与している可能性があるかを判断するために、ドッキング実験（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１０２２８０５に以前記載されており、参照により本明細書に組み込まれる）を実施して、コルヒチン誘導体とチューブリンアイソタイプβ‐ＩＩＩの間の結合エネルギーがＸ１位置での修飾に関して、インビトロ及びインビボで観察される効果に寄与する可能性があるかどうかを確認した。
以下の表７に示すコルヒチン誘導体の３Ｄ構造は、柔軟なリガンドと剛直な受容体の条件下でＡｕｔｏｄｏｃｋ４プログラムを使用して、βＩＩＩチューブリンのコルヒチン結合部位（コルヒチン結合部位のベータＶＩと構造的に同一）にドッキングされた。ＡｕｔｏＤｏｃｋ４は、薬物候補が既知の３Ｄ構造の受容体にどのように結合するかを予測するように設計されており、２つの主要なプログラムで構成されている：ａｕｔｏｄｏｃｋは、ターゲットタンパク質を記述するグリッドのセットへのリガンドのドッキングを実行し、ａｕｔｏｇｒｉｄはこれらのグリッドを事前に計算する。リガンドの初期構造は、最初にＡｍｂｅｒ１２：ＥＨＴ力場（ＭＯＥ２０１３．０８０２）を使用して最小化され、ＧＡＭＥＳＳ‐ＵＳバージョン２０１０‐１０‐０１のＲＨＦ／ｃｃ‐ｐＶＤＺレベルの理論に基づいて完全に最適化された。ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ（Ｑ１３５０９）から取得したβＩＩＩチューブリン配列データ（ＴＢＢ３＿ＨＵＭＡＮ）とホモロジーモデルは、ＭＯＥ２０１３．０８０２によってＲＣＳＢタンパク質データバンク（１ＳＡ０．ｐｄｂ）のチューブリン構造に基づいてβＩＩＩチューブリンに対して構築された。
Figure 2022511214000061
結果
上記のドッキング実験の結果を以下の表８に示す。
Figure 2022511214000062
上記の表８に示すように、コルヒチン及び（９１）（ＣＣＩ）と（８９）の比較は、ＯＨ基がチューブリンへの結合エネルギーを－５．９７及び－６．２から－５．４２Ｋｃａｌ／ｍｏｌに増加させたことを示した。したがって、ＯＨを有することは、結合エネルギーを増加させ、チューブリンへの親和性を低下させる原因となる可能性がある。したがって、ＯＨを欠く（９１）（ＣＣＩ）は、結合エネルギーを減少させ、チューブリンに対する親和性を増加させ、したがって、本明細書に提示されるインビトロ及びインビボの結果における機能的応答を増加させた。
例８‐アテローム性動脈硬化症のマウスモデル
イントロダクション
アテローム性動脈硬化症は慢性炎症性疾患であり、その間に新内膜病変のために動脈の狭窄が起こる（１）。好中球などの免疫細胞は、アテローム性動脈硬化症病変の発症、進行、不安定性に重要な役割を果たす（２）。これらの病変が破裂すると、心筋梗塞や脳卒中などの複数の心血管合併症を引き起こす。炎症はアテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たしているため、炎症を抑えることは、この分野で多くの注目を集めている治療アプローチである。たとえば、ＩＬ‐１βを阻害する薬剤は、アテローム性動脈硬化症の転帰を改善する。
この研究では、好中球が関与する炎症が両方の疾患の病因に関与しているため、痛風モデルでテストされたコルヒチン誘導体を使用してアテローム性動脈硬化症を治療できると判断された。アテローム性動脈硬化症の治療にこれらの誘導体を使用することの利点は、それらがコルヒチンよりも有意に低い用量で活性であり、その結果、毒性がより低い可能性が高いことである。
このデータを考慮すると、本明細書に記載のコルヒチン誘導体は、好中球媒介性炎症を伴う疾患など、他の炎症媒介性疾患において役割を果たす可能性があると予測される。
方法
動物と食事
ＬＤＬＲ ＫＯマウスはランダムに４つのグループに分けられ、コントロール（ＣＤ）食餌（グループ１及び２）又は高脂肪食餌（グループ３及び４）のいずれかが与えられた。高脂肪（ＨＦ）食は、総コレステロール０．２％、総脂肪２１％（脂肪から４２％ｋｃａｌ）、総脂肪酸の６０％超を含み、ショ糖を多く含んでいた（３４重量％）。動物とその飼料は毎週計量された。
ＣＣＩによる治療
グループ２及び４のマウスには、０．５μｍｏｌ／ｋｇのＣＣＩを皮下（ｓ．ｃ）に、週に３回、８週間投与した。この用量のＣＣＩは、痛風のエアポーチモデルで白血球の動員を大幅に減少させる最低用量であるために選択された。
血漿脂質測定
８週間の食餌を与えた後、マウスから採血した。採取した血液から血清を調製し、分析まで凍結した。血清トリグリセリドとコレステロールは、我々のＭｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（学際的及び微生物学研究所サービス）によってマウスの血清で測定された。
肉眼的病変領域の定量化
大動脈病変の「正面」アッセイとスーダンＩＶ染色は、すべてのマウスから採取した大動脈で実施した。ＩｍａｇｅＪの「対象領域」ツールを使用して、大動脈枝と下行大動脈の脂質染色面積の割合をマウス間で比較した。
サイトカイン測定
８週間の食餌を与えた後、マウスから採血した。採取した血液から血清を調製し、分析まで凍結した。血清中のサイトカインのレベルは、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定された。アッセイされたサイトカインは、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ２１、Ｇ‐ＣＳＦ（ＣＳＦ‐３）、ＲＡＮＫＬ、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＩＬ‐１ベータ、ＩＬ‐６及びＭＣＰ‐１（ＣＣＬ２）であった。これらのサイトカインは、ＡｐｏＥＫＯマウスにおけるアテローム性動脈硬化症の発症を反映すると報告されたサイトカインシグネチャーに基づいて選択された。アテローム性動脈硬化症の炎症性の側面がこのモデルでよりよく表されるため、ＬＤＬＲ ＫＯモデルが使用された。
結果
図１９は、ＣＣＩで治療し、ＣＤ又はＨＦ食餌を与えたマウスは、薬物で治療せず、８週間にわたって同じ食餌を与えたマウスと同じ量の体重が増加したことを示している。これは、ＣＣＩがインビボでＭＳＵ誘発性の白血球動員を弱める用量を使用してマウスが８週間薬剤に耐えたことを示している。マウスは正常に行動し、苦痛の兆候は見られなかった。
ＣＤ食餌を与えられたマウスと比較して、ＨＦ食餌を８週間与えられたＬＤＬＲ ＫＯマウスの血清中のトリグリセリドの量の有意な増加が観察された（図２０）。トリグリセリドのレベルは、ＨＦ食のみを与えられたマウスよりもＨＦ食を８週間与えられたＣＣＩ処置マウスの方が低かった。
ＣＤ食餌を与えられたマウスと比較して、ＨＦ食餌を８週間与えられたＬＤＬＲ ＫＯマウスの血清中のコレステロールの量の有意な増加が観察された（図２１）。コレステロールのレベルは、ＨＦ食のみを与えられたマウスよりもＨＦ食を与えられたＣＣＩ処置マウスの方が低かった。
図２２Ａは、ＨＦ食を８週間与えたマウスが、アテローム性動脈硬化症の病変を発症したことを示している（赤で染色）。ＨＦ食餌を与えられたＣＣＩ処置マウスの大動脈弓又は下行大動脈の染色された病変領域の割合は、ＨＦ食餌のみを与えられたマウスよりも低かった。「正面アッセイ」で染色されたプラークで覆われた大動脈弓の総面積のパーセントを、各マウスについて決定した（図２２Ｂ）。病変は、ＨＦ食（ＨＦ）を与えられたマウスよりも、高脂肪食と我々の化合物（ＨＦ＋ＣＣＩ）を与えられたＬＤＬＲ ＫＯマウスで大動脈弓の総面積のより小さな割合をカバーした。「正面アッセイ」で染色されたプラークで覆われた下行大動脈の総面積のパーセントを、各マウスについて決定した（図２２Ｃ）。病変は、ＨＦ食（ＨＦ）を与えられたマウスよりも、高脂肪食と我々の化合物（ＨＦ＋ＣＣＩ）を与えられたＬＤＬＲ ＫＯマウスで下行大動脈の総面積のより小さな割合をカバーした。ＨＦ＋ＣＣＩグループのマウスの大多数は、下行大動脈の総面積の１％未満をカバーしている。対照的に、ＨＦ食グループでは、病変は１．２～８％の面積をカバーしている。
ＲＡＮＫＬを除いて、ＣＤを与えられたマウスと比較して、ＨＦ食を８週間与えられたマウスの血清ですべてのサイトカインのレベルの増加が観察された（図２３）。ＲＡＮＫＬのレベルは８週間のＨＦ食後に減少した。ＣＣＩは、ＨＦ食を８週間与えたＬＤＬＲ ＫＯマウスの血清中のこれらのサイトカインのレベルに有意な影響を及ぼさなかった。
ディスカッション
アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の慢性炎症性疾患である（１）。いくつかの炎症細胞とメディエーターがこの病気の発症と進行に寄与している（２～４）。したがって、この疾患の炎症性要素は潜在的な治療標的である。コルヒチン誘導体であるＣＣＩが、ＬＤＬＲ ＫＯマウスモデルでアテローム性動脈硬化症の進行及び／又は発症を遅らせる能力をテストした。まとめると、我々の発見は、ＣＣＩがコレステロールとトリグリセリドの血清レベル、及びアテローム性動脈硬化症のプラークについて染色した大動脈の面積の割合を含むこの慢性炎症疾患に関連するいくつかの変数を減少させるという点で、ＣＣＩがアテローム性動脈硬化症の発症及び／又は進行に影響を与える可能性があることを示している。さらに、この研究は、ＣＣＩが少なくとも２ヶ月間マウスによって十分に許容されるというさらなる証拠を提供する。コルヒチンと比較してＣＣＩの毒性が低く、アテローム性動脈硬化症のいくつかの信頼できる指標を減少させる傾向があるため、ＣＣＩはヒトにおけるこの疾患の治療の有望な代替治療法となっている。
参考文献
1. Shapiro, MD and Fazio, S. From Lipids to Inflammation.（脂質から炎症まで。） 2016. Circulation Research 118:732-749.
2. Hartwig, H; Silvestre R; Daemen M; Lutgens, E and Soehnlein, O. Neutrophils in atherosclerosis.（アテローム性動脈硬化症における好中球） Hamostaseologie 2015; 35: 121-127.
3. Stefan Mark Nidorf and Peter Lindsay Thompson. Why Colchicine Should Be Considered for Secondary Prevention of Atherosclerosis: An Overview.（アテローム性動脈硬化症の二次予防のためにコルヒチンを考慮すべき理由：概説。） 2019. Clinical Therapeutics 41: 41-48.
4. Lin B, Pillinger M, Shah B, et al. Use of colchicine in atherosclerotic heart disease.（アテローム性動脈硬化症心疾患におけるコルヒチンの使用。） 2018. Curr Res Integr Med 3(S1):2-4.

Claims (151)

  1. 炎症の治療のための式Ｉの化合物：
    Figure 2022511214000063
    ここで：
    ＺはＯ又はＳである；
    Ｘ１は、置換又は非置換の炭化水素基、又は置換又は非置換の不均一基から選択される；
    Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、置換又は非置換炭化水素基、置換又は非置換不均一基、置換又は非置換炭素環式基、置換又は非置換複素環基、置換又は非置換芳香族基、又は置換又は非置換ヘテロ芳香族基から独立して選択される；
    その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせ。
  2. Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換芳香族基、置換又は非置換複素芳香族基、置換又は非置換の炭素環式基、又は置換又は非置換の複素環式基から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ハロアルキル、置換又は非置換ヒドロキシアルキル、置換又は非置換シアノアルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキルカルボニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換シクロアルケニル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルケニル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換アルキルアリール、置換又は非置換アルキルヘテロアリール、アルキレン‐Ｏ‐アルキル、アルキレン‐Ｏ‐シクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐ヘテロシクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐シクロアルキル、又はアルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐ヘテロシクロアルキルから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  4. 前記Ｒ２及びＲ３が、それぞれ、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキル、置換又は非置換のＣ２‐Ｃ６アルケニル、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１‐Ｃ６アルキレン‐Ｏ‐アルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルアリール、又は置換又は非置換アルキルヘテロアリールから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アリール、又は置換又は非置換アルキルアリールから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  6. Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、置換又は非置換アルキル、又は置換又は非置換アルキルアリールから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  7. Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、置換又は非置換のアルキルから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  8. 前記Ｒ２及びＲ３が、それぞれ、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  9. Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  10. Ｒ２及びＲ３がそれぞれ、メチル、エチル又はプロピルから独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
  11. Ｒ２がメチルである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
  12. Ｒ３がエチル又はプロピルである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
  13. Ｘ１が置換又は非置換の炭化水素基である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物
  14. Ｘ１が、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、又は置換又は非置換アルキニルから選択される、請求項１３に記載の化合物。
  15. Ｘ１が、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから選択される、請求項１４に記載の化合物。
  16. Ｘ１が非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキルから選択される、請求項１４に記載の化合物
  17. Ｘ１がメチル又はエチルから選択される、請求項１６に記載の化合物。
  18. Ｘ１がメチルである、請求項１７に記載の化合物。
  19. Ｘ１がＯＲ１０であり、Ｒ１０が置換又は非置換炭化水素基、又は置換又は非置換不均一基から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
  20. Ｒ１０が、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換芳香族基、置換又は非置換ヘテロ芳香族基、置換又は非置換炭素環式基、又は置換又は非置換複素環式基から選択される、請求項１９に記載の化合物。。
  21. Ｒ１０が、置換又は非置換アルキル、ＣＨ２ＯＨ、置換又は非置換ハロアルキル、置換又は非置換ヒドロキシアルキル、置換又は非置換シアノアルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換シクロアルケニル、置換又は非置換アルキルシクロアルキル、置換又は非置換アルキルシクロアルケニル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アルキルヘテロシクロアルケニル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換アルキルアリール、置換又は非置換アルキルヘテロアリール、アルキレン‐Ｏ‐アルキル、アルキレン‐Ｏ‐シクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐ヘテロシクロアルキル、アルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐シクロアルキル、又はアルキレン‐Ｏ‐アルキレン‐ヘテロシクロアルキルから選択される、請求項１９に記載の化合物。
  22. Ｒ１０が、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、又は置換又は非置換アルキニルから選択される、請求項１９に記載の化合物。
  23. Ｒ１０が、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキル、又は置換又は非置換のＣ２‐Ｃ６アルケニル、又はＣ２‐Ｃ６アルキニルから選択される、請求項１９に記載の化合物。
  24. Ｒ１０が、置換又は非置換のアルキルから選択される、請求項１９に記載の化合物。
  25. Ｒ１０が、置換又は非置換のＣ１‐Ｃ６アルキルから選択される、請求項１９に記載の化合物。
  26. Ｒ１０が非置換Ｃ１‐Ｃ６アルキルから選択される、請求項１９に記載の化合物。
  27. Ｒ１０がメチル又はエチルから選択される、請求項１９に記載の化合物。
  28. Ｒ１０がメチルである、請求項２７に記載の化合物。
  29. Ｘ１が置換又は非置換の不均一基である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
  30. Ｘ１が－ＣＲ４Ｒ５Ｒ６から選択され、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６がそれぞれ、Ｈ、置換又は非置換炭化水素基、又は置換又は非置換不均一基から独立して選択される、請求項２９に記載の化合物。
  31. Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６がそれぞれ、置換又は非置換のアミド基から独立して選択される、請求項３０に記載の化合物。
  32. Ｒ４及びＲ５がそれぞれ、Ｈ又は置換又は非置換アルキルから独立して選択され、Ｒ６が‐ＮＲ（ＣＯ）ＣＲ７Ｒ８Ｒ９であり、ＲがＨ及び置換又は非置換アルキルから選択され、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９はそれぞれ、Ｈ、ハロ基、及び置換又は非置換アルキルから選択される、請求項３０に記載の化合物。
  33. Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９がフルオロ基から選択される、請求項３２に記載の化合物。
  34. Ｘ１が‐ＣＨ２ＮＨ（ＣＯ）ＣＦ３である、請求項３３に記載の化合物。
  35. ＺがＯである、請求項１から３４のいずれか一項に記載の化合物。
  36. ＺがＳである、請求項１から３４のいずれか一項に記載の化合物。
  37. 化合物が
    Figure 2022511214000064
    その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の化合物。
  38. 化合物が
    Figure 2022511214000065
    その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の化合物。
  39. 化合物が
    Figure 2022511214000066
    その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである請求項１に記載の化合物。
  40. 化合物が
    Figure 2022511214000067
    その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の化合物。
  41. 化合物が
    Figure 2022511214000068
    その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の化合物。
  42. 化合物が
    Figure 2022511214000069
    その薬学的に許容される塩、その水和物、その溶媒和物、その互変異性体、その光学異性体、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の化合物。
  43. 化合物が式Ｉ及び／又はその薬学的に許容される塩である、請求項１から４２のいずれか一項に記載の化合物。
  44. Ｃ７での配置がＳ配置である、請求項１から４３のいずれか一項に記載の化合物。
  45. 化合物がコルヒチン結合部位でβ‐チューブリンに結合する、請求項１から４４のいずれか一項に記載の化合物。
  46. β‐チューブリンがβ‐ＶＩ、β‐Ｖ、及び／又はβ‐Ｉである、請求項４５に記載の化合物。
  47. β‐チューブリンがβ‐ＶＩである、請求項４６に記載の化合物。
  48. 化合物がコルヒチンの結合エネルギーよりも低い結合エネルギーを有する、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の化合物。
  49. 化合物がコルヒチンよりも毒性が低い、請求項１から４８のいずれか一項に記載の化合物。
  50. 化合物がコルヒチンと比較して、より特異的に好中球を標的とする、請求項１から４９のいずれか一項に記載の化合物。
  51. 化合物が、コルヒチンよりも低い用量で細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する、請求項１から５０のいずれか一項に記載の化合物。
  52. 化合物がコルヒチンより少なくとも約１０分の１の用量で細胞内カルシウム濃度の増加を抑制する、請求項５１に記載の化合物。
  53. 化合物がコルヒチンの用量よりも約１０分の１から約１００分の１の用量で細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する、請求項５２に記載の化合物。
  54. 化合物が約０．１μＭの用量で細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する、請求項１から５３のいずれか一項に記載の化合物。
  55. 化合物がコルヒチンよりも低用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する、請求項１から５４のいずれか一項に記載の化合物。
  56. 化合物がコルヒチンより少なくとも約１０分の１の用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する、請求項５５に記載の化合物。
  57. 化合物がコルヒチンの用量よりも約１０分の１から約１００分の１の用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する、請求項５５に記載の化合物。
    。
  58. 化合物が約０．１μＭの用量で炎症性メディエーターの産生を阻害する、請求項１から５７のいずれか一項に記載の化合物。
  59. 炎症性メディエーターが、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１、スーパーオキシド、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の化合物。
  60. 化合物が、細胞内カルシウム濃度及び炎症性メディエーター産生のうちの少なくとも１つの阻害に関して単調又は非単調な用量反応を示す、請求項１から５０のいずれか一項に記載の化合物。
  61. 炎症性メディエーターが、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１、スーパーオキシド産生、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項６０に記載の化合物。
  62. 化合物が白血球の動員を阻害する、請求項１から６１のいずれか一項に記載の化合物。
  63. 炎症が、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物。
  64. 炎症が好中球によって引き起こされる炎症を含む、請求項６２又は６３に記載の化合物。
  65. 好中球によって引き起こされる炎症が、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である、請求項６４に記載の化合物。
  66. 好中球によって引き起こされる炎症が心血管疾患に関連している、請求項６４に記載の化合物。
  67. 心血管疾患が冠状動脈アテローム性動脈硬化症である、請求項６６に記載の化合物。
  68. 好中球によって引き起こされる炎症が痛風に関連している、請求項６４に記載の化合物。
  69. 痛風の治療のための、請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物。
  70. 化合物が、尿酸一ナトリウム（ＭＳＵ）誘発性炎症に応答して免疫機能に対して阻害効果を有する、請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物。
  71. 免疫機能に対する阻害効果が、細胞内カルシウム産生、ＩＬ‐１産生、ＩＬ‐８産生、スーパーオキシド産生、又はそれらの組み合わせから選択されるメディエーターを介してもたらされる、請求項７０に記載の化合物。
  72. 免疫機能が好中球に関するものである、請求項７１に記載の化合物。
  73. 阻害効果がコルヒチンの阻害効果よりも強力である、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の化合物。
  74. 阻害効果がコルヒチンのそれより少なくとも約１０倍大きい、請求項７３に記載の化合物。
  75. 阻害効果が約０．１μＭの濃度で生じる、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の化合物。
  76. 心血管疾患の治療のための、請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物。
  77. 心血管疾患が冠状動脈アテローム性動脈硬化症である、請求項７６に記載の化合物。
  78. 請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
  79. 抗痛風剤をさらに含む、請求項７８に記載の組成物。
  80. 抗痛風剤が、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、関節内糖質コルチコイド、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、組換え非ヒトウリカーゼ酵素、尿酸排泄促進剤、尿酸排泄剤、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項７９に記載の組成物。
  81. 少なくとも１つの薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤をさらに含む、請求項７８から８０のいずれか一項に記載の組成物。
  82. 組成物が、請求項１から６２のいずれか一項に記載の２つ以上の化合物を含む、請求項７８から８１のいずれか一項に記載の組成物。
  83. 炎症の治療のための、請求項７８から８２のいずれか一項に記載の組成物。
  84. 炎症が、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項８３に記載の組成物。
  85. 炎症が好中球によって引き起こされる炎症を含む、請求項８３又は８４に記載の組成物。
  86. 好中球によって引き起こされる炎症が、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である、請求項８５に記載の組成物。
    。
  87. 好中球によって引き起こされる炎症が心血管疾患に関連している、請求項８５に記載の組成物。
  88. 心血管疾患が冠状動脈アテローム性動脈硬化症である、請求項８７に記載の組成物。
  89. 好中球によって引き起こされる炎症が痛風に関連している、請求項８５に記載の組成物。
  90. 痛風の治療のための請求項７８から８１のいずれか一項に記載の組成物
  91. 請求項１から６２のいずれか一項に記載の治療有効量の化合物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の炎症を治療するための方法。
  92. 請求項１から６２のいずれか一項に記載の２つ以上の化合物が存在する、請求項９１に記載の方法。
  93. 化合物が経口的及び／又は非経口的に投与される、請求項９１又は９２に記載の方法。
  94. 化合物が静脈内及び／又は腹腔内に投与される、請求項９１又は９２に記載の方法。
  95. 請求項７８から８２のいずれか一項に記載の治療有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の炎症を治療するための方法。
  96. 組成物が経口的及び／又は非経口的に投与される、請求項９５に記載の方法。
  97. 組成物が静脈内及び／又は腹腔内に投与される、請求項９５に記載の方法。
  98. 炎症が、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項９１から９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 炎症が好中球によって引き起こされる炎症を含む、請求項９１から９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 好中球によって引き起こされる炎症が、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である、請求項９９に記載の方法。
  101. 好中球によって引き起こされる炎症が心血管疾患に関連している、請求項９９に記載の方法。
  102. 心血管疾患が冠状動脈アテローム性動脈硬化症である、請求項１０１に記載の方法。
  103. 好中球によって引き起こされる炎症が痛風に関連している、請求項９９に記載の方法。
  104. 哺乳動物がヒトである、請求項９１から１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 哺乳動物の炎症の治療のための、請求項１から６２のいずれか一項に記載の治療有効量の化合物の使用。
  106. 請求項１～６２のいずれか一項に記載の２つ以上の化合物が存在する、請求項１０５に記載の使用。
  107. 化合物が経口的及び／又は非経口的に投与可能である、請求項１０５又は１０６に記載の使用。
  108. 化合物が静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である、請求項１０５又は１０６に記載の使用。
  109. 哺乳動物の炎症の治療のための、請求項７８から８２のいずれか一項に記載の治療有効量の組成物の使用。
  110. 組成物が経口的及び／又は非経口的に投与可能である、請求項１０９に記載の使用。
  111. 組成物が静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である、請求項１０９に記載の使用。
  112. 炎症が、炎症性疾患、炎症状態、炎症性障害、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１０５から１１１のいずれか一項に記載の使用。
  113. 炎症が好中球によって引き起こされる炎症を含む、請求項１０５から１１２のいずれか一項に記載の使用。
  114. 好中球によって引き起こされる炎症が、偽痛風、痛風、心血管疾患、血管炎、又はそれらの組み合わせに関連する炎症である、請求項１１３に記載の使用。
  115. 好中球によって引き起こされる炎症が心血管疾患に関連している、請求項１１３に記載の使用。
  116. 心血管疾患が冠状動脈アテローム性動脈硬化症である、請求項１１５に記載の使用。
  117. 好中球によって引き起こされる炎症が痛風に関連している、請求項１１３に記載の使用。
  118. 哺乳動物がヒトである、請求項１０５から１１７のいずれか一項に記載の使用。
  119. 請求項１から６２のいずれか一項に記載の治療有効量の化合物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の痛風を治療するための方法。
  120. 請求項１から６２のいずれか一項に記載の２つ以上の化合物が存在する、請求項１１９に記載の方法。
  121. 化合物が経口的及び／又は非経口的に投与される、請求項１１９又は１２０に記載の方法。
  122. 化合物が静脈内及び／又は腹腔内に投与される、請求項１１９又は１２０に記載の方法。
  123. 請求項７８から８２のいずれか一項に記載の治療有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の痛風を治療するための方法。
  124. 組成物が経口的及び／又は非経口的に投与される、請求項１２３に記載の方法。
  125. 組成物が静脈内及び／又は腹腔内に投与される、請求項１２３記載の方法。
  126. 哺乳動物がヒトである、請求項１１９から１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 痛風が慢性痛風及び／又は急性痛風から選択される、請求項１１９から１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 痛風の治療が、少なくとも１つの痛風症状の治療を含む、請求項１１９から１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記少なくとも１つの痛風症状が、痛風発作、痛風結節形成、痛風関節炎、痛風関連炎症、及び／又は痛風に関連する関節破壊から選択される、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記少なくとも１つの痛風症状が、痛風炎症及び／又は炎症に関連する疼痛から選択される、請求項１２８に記載の方法。
  131. 哺乳動物の痛風の治療のための、請求項１から６２のいずれか一項に記載の治療有効量の化合物の使用。
  132. 請求項１から６２のいずれか一項に記載の２つ以上の化合物が存在する、請求項１３１に記載の使用。
  133. 化合物が経口的及び／又は非経口的に投与可能である、請求項１３１又は１３２に記載の使用。
  134. 化合物が静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である、請求項１３１又は１３２に記載の使用。
  135. 哺乳動物の痛風の治療のための、請求項７８から８２のいずれか一項に記載の治療有効量の組成物の使用。
  136. 組成物が経口的及び／又は非経口的に投与可能である、請求項１３５に記載の使用。
  137. 組成物が静脈内及び／又は腹腔内に投与可能である、請求項１３５に記載の使用。
  138. 哺乳動物がヒトである、請求項１３１から１３７のいずれか一項に記載の使用。
  139. 痛風が慢性痛風及び／又は急性痛風から選択される、請求項１３１から１３８のいずれか一項に記載の使用。
  140. 痛風の治療が、少なくとも１つの痛風症状の治療を含む、請求項１３１から１３９のいずれか一項に記載の使用。
  141. 前記少なくとも１つの痛風症状が、痛風発作、痛風結節形成、痛風関節炎、痛風関連炎症、及び／又は痛風に関連する関節破壊から選択される、請求項１４０に記載の使用。
  142. 前記少なくとも１つの痛風症状が、痛風性炎症及び／又は炎症に関連する疼痛から選択される、請求項１４０に記載の使用。
  143. βＶＩ－チューブリン阻害剤を投与することを含む、造血細胞の運動性及び／又は動員を減少させる方法。
  144. βＶＩ‐チューブリン阻害剤が、請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物である、請求項１４３に記載の方法。
  145. 造血細胞が、好中球及び／又は単球などの白血球である、請求項１４３又は１４４に記載の方法。
  146. βＶＩ－チューブリン阻害剤を投与することを含む、炎症を治療する方法。
  147. βＶＩ－チューブリン阻害剤が、請求項１から６２のいずれか一項に記載の化合物である、請求項１４６に記載の方法。
  148. 炎症が白血球浸潤に関連している、請求項１４６又は１４７に記載の方法。
  149. 白血球浸潤が、好中球及び／又は単球の浸潤を含む、請求項１４８に記載の方法。
    の方法。
  150. 炎症が痛風に関連している、請求項１４６から１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. 炎症がアテローム性動脈硬化症に関連している、請求項１４６から１４９のいずれか一項に記載の方法。
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