JP2022509868A - ランダムオリゴヌクレオチドの生成方法およびその配列決定方法 - Google Patents

ランダムオリゴヌクレオチドの生成方法およびその配列決定方法 Download PDF

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Abstract

新たに生成された分子に存在する核酸塩基の配列についての不完全な情報を用いてランダムオリゴヌクレオチドが生成される。引き続いて、オリゴヌクレオチドの配列が決定され、次いで、こうしたオリゴヌクレオチドは、種々の潜在的な使用向けに処理され得る。

Description

関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１８年１１月３０日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６２／７７３，６７１号の優先権を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み込む。
[0002]様々な核酸を組み合わせることにより、極めて多数の様々なオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドが生成され得る。現在、こうした分子の合成は精度を必要とし、その結果、分子内に存在するヌクレオチド塩基の配列は、オリゴヌクレオチドを生成するに先立ち、既知である。
[0003]場合によっては、多数のランダムオリゴヌクレオチドが所望される。例えば、オリゴヌクレオチドは固有の分子タグとして機能し、ＤＮＡの個々の分子を標識することができる。この固有のタグ付けは一部の分析にとって有用であり、例えば、増幅に先立ち分子をタグ付けして分析の正確度を向上する。Ｚｈｅｎｇら（２０１４）Ａｎｃｈｏｒｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０：１４７９～８４を参照されたい。最近の発明は、暗号化にあたって固有の分子タグを使用する（Ｓａｗａｙａ、ＰＣＴ／ＵＳ１７／０５８０７６出願、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１８／０８１１１３を参照されたい）。この暗号化技法は、多数の固有の分子タグが生成されること、および、これらのタグの配列が既知であることも必要とする。
[0004]したがって、既知である配列を有する多数の固有のオリゴヌクレオチドを可能な限り安価で効率的に生成する必要がある。
[0003]本明細書に記載の本発明は、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの合成に関する。本明細書に記載の方法は、核酸のランダム配列の生成に関するものであり、したがって、オリゴヌクレオチドを生成するが、オリゴヌクレオチドの配列は、生成の後、全体的または部分的に決定されるまで未知である。一態様では、本発明のある特定の実施形態は、オリゴヌクレオチドを生成する方法を含み、３つのステップ、ａ）ヌクレオチドを分子にランダムに付加することによってオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを生成するステップと；ｂ）生成された分子に存在するヌクレオチド配列を決定するステップと；ｃ）生成された分子を有用な形態に処理するステップと、を含む。
[0004]ランダムオリゴヌクレオチドを生成するために、ある特定の実施形態は、ホスホロアミダイト化学を使用してヌクレオチドを合成する。一部の実施形態では、ホスホロアミダイト反応の制御は自動化計装を通して行われ、例えば、反応で使用される化学試薬を調節するマイクロ流体カラム、ならびに／または反応を局在化するのに使用されるマイクロアレイおよび／もしくはマイクロウェルなどの自動化計装あるが、これらに限定されない。
[0005]一部の実施形態では、空間制御が使用されて、ランダムオリゴヌクレオチドを生成する際の反応において使用される試薬および／または材料を最小限とする。空間制御方法は、当業者によって選択される場合も有り、これには、光ベースの反応を制御するのに使用されるマイクロミラーデバイス、および／または反応で使用される試薬を調節するのに使用されるインクジェット技術が含まれ得るが、これらに限定されない。
[0006]一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ランダムオリゴヌクレオチドを生成する際に末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用するなどの、酵素的方法を使用して合成される。かかる実施形態では、反応を最適化するように、かつオリゴヌクレオチドがランダム性を持って生成されることを確保するように、酵素は設計され得る。
[0007]一部の実施形態では、比較的短いランダムオリゴヌクレオチドが生成され、次いでランダムに組み合わされて、より長いランダムオリゴヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドのこうしたランダムな組合せは多段階法であり、この場合、複数の短いランダムオリゴヌクレオチドが組み合わされてより長いランダムオリゴヌクレオチドを形成し、次いでこれらが次々に組み合わされてより長いオリゴヌクレオチドを形成する等、所望サイズの分子が生成されるまで、この方法で組み合わされる。
[0008]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、所望よりも長い長さまで生成される。かかる実施形態では、生成された分子は切断、消化および／または溶解されて、より短い分子を形成する。
[0009]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、生成された後にサイズで分離される。こうした実施形態の一部では、望ましくないサイズのランダムに生成された分子は、廃棄されるか、より多くの分子のランダムな生成などに向けて、プロセスの前の段階で再利用される。
[0010]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドに付着している。こうした実施形態では、他のオリゴヌクレオチドは、ランダムに生成された分子の適用において活用される機能的エレメントとして働くことができる。一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチド上で直接生成される。例えば、既知であるオリゴヌクレオチドのセットを含むマイクロアレイを、その上でオリゴヌクレオチドがランダムに生成され得る基質として使用することができ、部分的に既知である配列および部分的に未知である配列を有する分子をもたらす。
[0011]一部の実施形態では、生成されるランダムオリゴヌクレオチドは部分的にのみランダムであり、その結果、分子の生成過程で分子の一部が完全にはランダムではない。こうした実施形態では、生成される分子の完全にはランダムではない態様は、完全に既知であっても、部分的に既知であっても、および／または部分的に推定されていてもよい。
[0012]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドはろ過処理されて、特定の望ましくない分子が排除される。これらの望ましくない分子は、望ましくないサイズおよび／もしくは望ましくない配列組成の分子、ならびに／またはそれらの分子の意図された使用にとって望ましくない任意の他の特性を含む場合がある。
[0013]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、これらの配列の決定に先立ち処理および／または改変される必要があり、例えば、ランダムオリゴヌクレオチドを他のオリゴヌクレオチドにライゲートさせて、所与の配列技術で使用されるプロトコルに適合させる。
[0014]ランダムに生成された分子のヌクレオチド配列を決定するために、ある特定の実施形態は、ランダムオリゴヌクレオチドが生成されるたびに配列を直接決定する。すなわち、ランダムに生成された分子の配列は、１つまたは複数のヌクレオチドが分子に付加された直後またはすぐ後に決定、測定、または更新される。かかる実施形態では、ヌクレオチドを付加する反応は、例えば、反応の観測可能な副産物を生成するマイクロウェル局在化反応を使用して、直接観測される可能性がある。
[0015]一部の実施形態では、ランダムに生成された分子の配列は、分子がその全体として生成された後に決定される。配列の決定は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのリアルタイムシーケンサーおよび／またはナノポアシーケンサーなどの、個々の分子を正確に配列決定することができる特定の機器を必要とする。配列が決定された後、所望の配列を有する分子が回収され得る。
[0016]場合によっては、ランダムに生成された分子に存在する正確なヌクレオチド配列については不確実性が依然としてある。この不確実性は、ポリヌクレオチド配列決定のほとんどの適用にとって通常には望ましい低不確実性と比較して、比較的高く維持され得る。
[0017]一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列に対応するが、分子中に存在するヌクレオチドの正確な配列を表さない、ランダムオリゴヌクレオチドの署名が取得される。例えば、ランダムオリゴヌクレオチドは、署名を取得することができるナノポアを通過することができる。この署名は、ランダムオリゴヌクレオチドの正確な配列を取得するには不十分である可能性があるが、それでもなお、類似のナノポアまたは類似のデバイスを通して再び送られる場合は、ランダムオリゴヌクレオチドを識別するのに使用され得る。
[0018]一部の実施形態では、ランダムに生成された分子は、カラム分離などの、これに限定されないが、方法を使用して、サイズを選択することによって処理される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列についてスクリーニングされ、その結果、望ましくない配列を有するオリゴヌクレオチドを排除する。こうした実施形態では、望ましくないオリゴヌクレオチドに相補的な（complimentary）配列を有するオリゴヌクレオチドが、マイクロアレイなどの表面に、またはオリゴヌクレオチドに付着された磁気ビーズを使用により表面に付着させられることができ、このことが、望ましくないオリゴヌクレオチドを所望のオリゴヌクレオチドからろ過処理するのに、使用され得る。
[0019]一部の実施形態では、制限酵素が、特定の配列を有するオリゴヌクレオチドを消化するのに使用される。この消化は、オリゴヌクレオチドをより小さいオリゴヌクレオチドに分解して、オリゴヌクレオチドのサイズを低下させる。一部の実施形態では、これらのより小さいオリゴヌクレオチドは、サイズで選択され、より大きいオリゴヌクレオチドから分離され得る。
[0020]一部の実施形態では、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドは、例えば、ＴＡライゲーションまたは当業者によって使用される他の任意の方法を使用して、他のオリゴヌクレオチド上にライゲートされる。このライゲーションは、ランダムオリゴヌクレオチドを他の目的向けの技術に組み込むのに、使用され得る。
[0021]一部の実施形態では、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドは一本鎖であり、相補鎖は、最終分子がすべて完全に二本鎖であるように生成される。一部の実施形態では、相補鎖は、ポリメラーゼおよびランダムな縮重プライマーを使用して生成される。一部の実施形態では、生成された分子は部分的に二本鎖であり、ポリメラーゼが残りの相補鎖を生成するのにプライマーは必要とされない。
[0022]図１は、本明細書に記載の、基質上でのランダムオリゴヌクレオチドの生成に関するワークフローダイヤグラムを表す図である。 [0023]図２は、本明細書に記載の、より小さいオリゴヌクレオチドからのランダムオリゴヌクレオチドの生成に関するワークフローダイヤグラムを表す図である。 [0024]図３Ａは、ランダムオリゴヌクレオチドが生成され得る段階を表す図であり、その配列は本明細書に記載のように引き続いて決定される。図３Ｂは、ランダムオリゴヌクレオチドが生成され得る段階を表す図であり、その配列は本明細書に記載のように引き続いて決定される。図３Ｃは、ランダムオリゴヌクレオチドが生成され得る段階を表す図であり、その配列は本明細書に記載のように引き続いて決定される。 [0025]図４Ａは、ランダムオリゴヌクレオチドが生成され得る段階を表す図であり、その配列は本明細書に記載のように引き続いて決定される。図４Ｂは、ランダムオリゴヌクレオチドが生成され得る段階を表す図であり、その配列は本明細書に記載のように引き続いて決定される。図４Ｃは、ランダムオリゴヌクレオチドが生成され得る段階を表す図であり、その配列は本明細書に記載のように引き続いて決定される。
[0026]様々な実施形態が本明細書に記載されており、当業者であれば、本明細書に記載の実施形態が例としてのみ提供されていることを認識するであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、本発明のある特定の態様を変更し、置換し、および／または変えることができる。本明細書に記載の本発明は、特定の材料、試薬、または特定の方法に限定されるものではない。本明細書で使用される用語は、その実施にとって必要な本発明の態様を説明するのに使用されるものであり、限定することを意図するものではない。
[0027]本明細書に記載の技術は、しばしば単数形「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を使用して特定の事例に言及するが、単数形でのこれらの事例への言及によって、本発明が、これらの事例が単独でまたは単一で行われている用途に、限定されるものではない。当業者であれば、これらの事例を本発明の適用のためにどのくらい行う必要があるか、およびこれらの事例を並列でまたは直列で行うかどうかを判断することができる。
[0028]本明細書で使用される場合、分子に言及する場合「ランダム」または「ランダムに生成された」とは、ランダムなヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドなどの分子を指すが、これは、当該分子が、ヌクレオチドを当該分子にランダムに付加することによって生成されたからである。
[0029]本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ある形態の糖－リン酸主鎖によってともに連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基の配列を含む分子を指す。ともに連結されたヌクレオチドの数は、２個と小さくても１０００個以上と大きくても、任意の数とすることができる。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と置き換えることができる。「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語が指す核酸ポリマーの正確な長さは、当業者によって決定され得る。
[0030]本明細書で使用される場合、「署名」という用語は、分子から作製され得る任意の化学的、生物学的または物理的評価を指し、その後、これは完全な識別の有無にかかわらず、将来その分子を測定するのに使用され得る。
[0031]ヌクレオチド合成の現在の方法は、少なくとも２つの特質を有する。第１に、所望のオリゴヌクレオチドを生成するのに核酸の既知の配列が使用される。新しく生成されたオリゴヌクレオチドは、極めて高い正確度、例えば９９％超の正確度で創製されるのが通常には所望される。第２に、オリゴヌクレオチドの生成は、一斉に行われることが一般には望まれる、すなわち、多くの同一のオリゴヌクレオチドが同時に生成される。
[0032]本明細書に記載の本発明によれば、ランダムオリゴヌクレオチドの配列は、ランダムオリゴヌクレオチドを生成するに先立ち既知である必要は必ずしもないが、ただし、その配列はその使用に先立ち決定され得る。さらに、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月２４日出願のＳａｗａｙａ、ＰＣＴ／ＵＳ１７／０５８０７６、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１８／０８１１１３号に記載の分子暗号化などへの、これに限定されないが、一部の適用の場合、オリゴヌクレオチドの正確な配列は完全に、またはその全体においても既知である必要はない。一部の適用の場合、配列に関する十分な知識のみが、上記オリゴヌクレオチドを他のランダムオリゴヌクレオチドから区別するのに必要とされる。実際、オリゴヌクレオチドの「署名」が上記オリゴヌクレオチドの使用に先立ち決定され、そして署名が上記オリゴヌクレオチドを他のランダムオリゴヌクレオチドから区別するに足りるほど重文に異なる限り、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は既知である必要はない。
[0033]ランダムオリゴヌクレオチドの固有性も、一部の適用にとって必要とされる。分子暗号化（ＰＣＴ／ＵＳ１７／０５８０７６、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１８／０８１１１３号）などのこれらの適用では、まったく同じ配列を持つ複数のオリゴヌクレオチドを有することは理想的とは言えない。これらの適用の一部は、非固有のオリゴヌクレオチドの存在を許容することができるが、まったく同じ配列を持つ多数の（例えば、数千、数万、もしくは数百を超える）オリゴヌクレオチドを有していることにほとんど使い道がない。したがって、本発明は、当今のヌクレオチド合成方法と比較して、固有のアプローチを取り、固有の課題を解決する。
[0034]本発明は：ａ）少なくとも１個のヌクレオチドを分子にランダムに付加することによって、核酸を含む少なくとも１つの分子を生成するステップであって、生成された分子はランダムオリゴヌクレオチドである、ステップと；ｂ）ランダムオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと；ｃ）ランダムオリゴヌクレオチドのある特定の特徴を使用してランダムオリゴヌクレオチドを選択するステップと、によって固有のランダムオリゴヌクレオチドを生成する。ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドを選択するステップは、オリゴヌクレオチドを処理してこれを種々の使用向けに調製することの一部である。ある特定の実施形態では、上記分子は測定される。ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを測定するのに使用される類似または同一の測定技法を使用して識別され得る。
[0035]本明細書に記載の分子を生成するための分子およびオリゴヌクレオチドの合成は、当業者に既知である一連の方法によって行われ得る。これらの方法には、ホスホロアミダイト化学および／または酵素ベースの合成が含まれ得るが、これらに限定されない。
[0036]それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＨｕｇｈｅｓおよびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ（２０１７）「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ：ｐｕｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ．」Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．；９：ａ０２３８１２およびＫｏｓｕｒｉおよびＣｈｕｒｃｈ（２０１４）「Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ；１１：４９９～５０７に記載のように、多様な方法がオリゴヌクレオチド合成に利用可能である。これらの方法は、単独で、または組み合わせて活用されて、ランダムオリゴヌクレオチドを生成することができる。本明細書に記載のランダムオリゴヌクレオチドを生成する方法は、本発明で活用され得る例であるが、本発明は、特定のオリゴヌクレオチド合成方法に限定されない。オリゴヌクレオチド合成の技術水準が発展するにつれて、オリゴヌクレオチド合成の代替方法が、本発明におけるランダムオリゴヌクレオチドの生成において活用され得る。
[0037]現在、大規模、低コストのヌクレオチド合成は、マイクロアレイシンセサイザー上でのホスホロアミダイト化学を使用して行われる。この方法による合成は、複数のオリゴヌクレオチドが高い配列正確度を持って並列で生成されることを可能にする。これらの方法に関する詳細は、Ｈｅｌｌｅｒ（２００２）ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｄｅｖｉｃｅｓ，ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．、４：１２９～５３；およびＬｅＰｒｏｕｓｔら、（２０１０）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｌｏｎｇ （１５０ｍｅｒ）ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３８（８）：２５２２～４０、に記載されており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
[0038]ある特定の実施形態では、特定の配列を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト合成を使用して、マイクロアレイ上でまたはマイクロウェル内で並列で合成され（現在の技法、以下に限定されないが、例えば、上記のＬｅＰｒｏｕｓｔ；および各米国特許、Ｂｒｕｈｎら、第６，４５８，５８３号；Ｇａｏら、第７，５４４，７９３号；Ｂａｎｙａｉら、第９，５５５，３８８号を用いる。これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）、そして、ランダムオリゴヌクレオチドが基質上で次いで生成されるが、これらの同一のオリゴヌクレオチドはその基質として役に立つ。
[0039]図１を参照すると、ステップ１０１は、リンカー分子１０３上に基質オリゴヌクレオチド１０２を生成し、リンカー分子は、例えば、マイクロアレイまたは磁気ビーズ１０４に連結され得るが、これに限定されない。ステップ１０５では、ランダムオリゴヌクレオチド１０６が、基質オリゴヌクレオチド１０２上に生成される。ステップ１０７では、非ランダムまたは既知であるオリゴヌクレオチド１０８が、成長する分子上に生成される。ステップ１０９は、使用に向け生成された分子のプロセシング、または、所望の回数だけ繰り返され得る、任意の組合せでのステップ１０５またはステップ１０７の繰り返し、のいずれかとすることができる。
[0040]基質オリゴヌクレオチド１０２は、一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドの将来の使用を容易にする特性を有することができる。例えば、基質オリゴヌクレオチド１０２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコルにおけるヌクレオチド増幅のためのプライマーとして機能することができる適切な配列を含むことができる。これらの基質オリゴヌクレオチド１０２はまた、一部の実施形態では、生成されるオリゴヌクレオチドを識別する助けとなる指標として働くこともできる。さらに、これらの基質オリゴヌクレオチド１０２はまた、一部の実施形態では、アダプターとして機能することもでき、または本明細書で検討される機能に限定されない他の機能を果たすこともできる。既知である配列のオリゴヌクレオチドに連結される生成されたランダムオリゴヌクレオチド１０６は、一部の実施形態では、次いで、特定の既知である配列を有するオリゴヌクレオチド１０８の生成のための基質として機能することができる。これに続いて、一部の実施形態では、より多くのランダムオリゴヌクレオチド１０６がこの分子上で生成されてもよく、一部の実施形態では、次いで、既知である配列のより多くのオリゴヌクレオチドが生成されてもよい、等、この方法で、所望の分子が生成されるまで、既知である部分と未知であるランダム配列部分の生成を交互に繰り返す。
[0041]一群の同一のオリゴヌクレオチドがマイクロアレイ上に直列で合成されて、ランダムオリゴヌクレオチドの合成のための基質として働いた後、一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチド合成が、ホスホロアミダイト合成を使用してこうした基質オリゴヌクレオチド１０２上で行われる。マイクロアレイ上での従来の合成とは対照的に、ランダムオリゴヌクレオチド１０６を生成するのに使用されるランダム合成は、生成される正確な配列が完全に未知であるように、または部分的に指向性である場合は部分的に未知であるように、非指向性であるか、または、一部の実施形態では、部分的に指向性である。本明細書で使用される場合、「部分的に指向性」とは、完全にはランダムではないやり方で、選択されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをあるオリゴヌクレオチドに付加するステップを指す。
[0042]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などの、ＤＮＡを酵素的に合成するタンパク質を使用して合成される。一部の実施形態では、これらのタンパク質酵素は、ランダムオリゴヌクレオチドを合成するように特異的に設計されており、その結果、酵素によって前もって生成されたランダムオリゴヌクレオチドの任意の配列部分に依存する特定のオリゴヌクレオチドを合成しない。
[0043]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、限定されないが、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、米国特許第９，８４５，５０１号；およびＴｕｒｎｅｒら、米国特許第７，３０２，１４６号と類似のシステムにおいてマイクロウェル内で合成されるが、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。かかる実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドの合成は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＷｉｌｌｉａｍｓ、米国特許第９，８４５，５０１号；およびＫｏｒｌａｃｈ、米国特許第８，５８０，５３９号内で検討される標識技法などの分子の標識の使用を含む。分子の標識は、ヌクレオチドがランダムオリゴヌクレオチドに付加された直後またはすぐ後に合成されるランダムオリゴヌクレオチドの配列を決定するのに役に立つ。こうした実施形態では、このプロセスによって生成されるランダムオリゴヌクレオチドは、短時間未知の配列であるに過ぎない。新たに付加されたヌクレオチドは既知となり、したがってオリゴヌクレオチドの配列が決定される。こうした実施形態では、別のランダムオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドが基質オリゴヌクレオチド上で化学的に結合されるが、新たに生成されたオリゴヌクレオチドはこの基質オリゴヌクレオチドになる。ランダムオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドが付加された後、配列が次いで決定される。このことが、略既知の長さおよび略既知のまたは完全に既知の配列のランダムオリゴヌクレオチドが生成されるまで、このやり方で継続される。かかる実施形態では、本発明の方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドをランダムに生成するステップと、（ｂ）そのオリゴヌクレオチドの配列を決定するステップとを交互に繰り返す。かかる実施形態でのオリゴヌクレオチドの配列を決定するための方法は、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドの配列組成を決定するための方法を検討しつつ、以下でさらに詳述される。
[0044]オリゴヌクレオチドの完全に非指向性の合成は、こうしたオリゴヌクレオチドの将来の使用にあたって問題となる場合がある、生成される一部のランダムオリゴヌクレオチドにつながり得る。例えば、ヌクレオチドの「ＣＣＣＣ」配列を有するオリゴヌクレオチドなどのホモポリマー・ランは、非特異的なアニーリングおよび／または一部の配列決定プラットフォームでの配列決定に伴う問題につながり得る（Ｘｕら、（２００９）Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ２４０，０００ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ２５ｍｅｒ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ ｐｒｏｂｅｓ、ＰＮＡＳ、Ｖｏｌ．１０７ Ｎｏ．７ ２２８９～２２９４ページを参照されたい）。ランダムオリゴヌクレオチドの合成に先立ち、これらおよび他の理想的とは言えないランダムオリゴヌクレオチドを回避するために、反応に使用される試薬は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる各米国特許、Ｃａｒｅｎら、第６，２２１，６５３号；Ｏｋａｍｏｔｏら、第６，４７６，２１５号；およびＳｃｈｌｅｉｆｅｒら、第６，０７７，６７４号；およびＤｅｌｌｉｎｇｅｒら、第７，５７２，９０７号に記載のインクジェット技術を使用して、ある特定の実施形態では部分的に指向性とすることができる。
[0045]ある特定の実施形態では、反応はまた、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＳａｎｄｓｔｒｏｍ、米国特許第６，５４５，７５８号およびＣｅｒｒｉｎａら、米国特許第７，１５７，２２９号に記載のものなどの、光制御反応を調節するマイクロミラーを使用して、部分的に指向性とすることができる。オリゴヌクレオチドのランダム合成の部分的な制御の例は、所与のヌクレオチド塩基の量を制限することと思われる。例えば、仮にシトシンのホモポリマー・ランが所与の適用にとって理想的とは言えないならば、シトシン以外のヌクレオチド塩基が、ランダムオリゴヌクレオチドの合成において、例えば、インクジェット技術を使用して、有利に指向性とし得るかもしれない。さらに、光制御反応はマイクロミラーで改変され得る。光制御反応を使用する場合、特定の核酸塩基は、反応に近接して溶液中に存在すると推定されるかまたは知られているヌクレオチド塩基に応じて、有利または不利とすることができる。
[0046]ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドが生成された後、ランダムオリゴヌクレオチド上で直接生成することによって、および／またはライゲーションにより非ランダムオリゴヌクレオチドをランダムオリゴヌクレオチドに付着することによって、いずれかで、非ランダムオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドがランダムオリゴヌクレオチドに付着される。
[0047]ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、多段階法で生成される。かかる方法は、少なくとも１つのより短いランダムオリゴヌクレオチドを生成するステップを含む。次いで、上記より短いランダムオリゴヌクレオチドが組み合わされて、より長いランダムオリゴヌクレオチドを生成する。次いで、上記より長いランダムオリゴヌクレオチドが組み合わされて、さらにより長いオリゴヌクレオチドを生成することができる。ランダムヌクレオチドは、例えば、酵素を使用したライゲーションまたはホスホロアミダイト化学によって指向された分子結合を通して組み合わされて、より長いオリゴヌクレオチドを生成する。ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチド生成の１つまたは複数の段階で望ましくないランダムオリゴヌクレオチドを排除するのに、ろ過ステップが使用される。ある特定の実施形態では、多段階法は：１個のヌクレオチドを別のヌクレオチドにランダムに付加することによってランダムオリゴヌクレオチドを生成するステップと；第１のランダムオリゴヌクレオチドを別のランダムオリゴヌクレオチドにランダムに組み合わせるステップと；ある特定の特徴についてランダムオリゴヌクレオチドをスクリーニングするステップと；ある特定の特徴を有するランダムオリゴヌクレオチドを排除するステップと；残りのランダムオリゴヌクレオチドをランダムに組み合わせるステップと、を含む。スクリーニング、排除、および組み合わせの各ステップが繰り返えされて、所望の特徴を有するランダムオリゴヌクレオチドを創製することができる。
[0048]図２を参照すると、ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、ダイマー（dimer）または二量体（two-mer）を含む。ダイマー２０２は、２個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。異なる４種の核酸塩基、Ａ＝アデノシン、Ｔ＝チミジン、Ｃ＝シトシン、およびＧ＝グアニンがあることを考慮すると、２個のヌクレオチドからなる異なる１６の組合せがある。したがって、ダイマーとは、異なる１６の配列：ＡＴ、ＴＡ、ＣＧ、ＧＣ、ＣＡ、ＡＣ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＡ、ＡＧ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＡ、ＴＴ、ＣＣ、ＧＧのうちの１つとすることができる。
[0049]四量体２０３は、４個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。四量体オリゴヌクレオチドは、１６２の組合せの核酸塩基を有する。ダイマーオリゴヌクレオチドを組み合わせることによって四量体オリゴヌクレオチドが生成される場合、四量体オリゴヌクレオチドは、例えば、ある特定の実施形態では、ホモポリマー・オリゴヌクレオチドについてスクリーニングされ得る。ホモポリマー・オリゴヌクレオチドは、単一種のヌクレオチド塩基、例えば、ＡＡＡＡ、ＴＴＴＴ、ＣＣＣＣ、およびＧＧＧＧを含む。このスクリーニングは、それ自体がホモポリマー・オリゴヌクレオチドであり、したがって理想的とは言えない、ランダムに生成されたホモポリマー・オリゴヌクレオチドと相補的である末端配列を有するオリゴヌクレオチドのマイクロアレイの上面に四量体オリゴヌクレオチドを流すなどの、これに限定されないが、方法によって、行うことができる。ある特定の実施形態では、ダイマーはランダムダイマーであり、四量体はランダム四量体である。
[0050]ある特定の実施形態では、望ましくないオリゴヌクレオチドのスクリーニングは、ランダムオリゴヌクレオチドの生成過程で行われる。望ましくないオリゴヌクレオチドに結合してランダムオリゴヌクレオチドの溶液からそれらを排除するフィルターとして、望ましくないオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することによって、スクリーニングは行われる。
[0051]図２に見られるように、例示的な実施形態では、ダイマー２０１がランダムに組み合わされて（２０２）、四量体オリゴヌクレオチド２０３を生成する。生成する可能性のある１６２の四量体オリゴヌクレオチドが存在する。次いで、四量体オリゴヌクレオチドが、望ましくないオリゴヌクレオチドについてスクリーニングされる（２０４）。残りの四量体の数は１６２－ｘである（式中、ｘ＝ふるい落とされた望ましくないオリゴヌクレオチドの数）。次いで、残りの四量体２０５が組み合わされて（２０６）、８個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである八量体２０７を生成する。八量体の数は（１６２－ｘ）２である（式中、ｘ＝ふるい落とされた望ましくないオリゴヌクレオチドの数）。ステップ２０８は、スクリーニングステップを繰り返すこと、組み合わせステップを繰り返すこと、または繰り返しステップまたはスクリーニングステップの任意の組み合わせを繰り返すことである。ステップ２０８は、所望の回数だけ繰り返され得る。
[0052]ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、既知の配列のオリゴヌクレオチドと化学的に結合している。これらの既知のオリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドの３’および／または５’末端に連結され得る。一部の実施形態では、このプロセスは複数回行われ、結果として、ランダムオリゴヌクレオチドと既知の配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せを含有するオリゴヌクレオチドをもたらす。
[0053]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、生成された後、望ましくないオリゴヌクレオチドについてろ過処理され得る。望ましくないオリゴヌクレオチドについてのろ過処理は、ランダムヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチドと物理的に連結される前に行われてもよく、その後に行われてもよい。他のオリゴヌクレオチドは、既知の配列を有しても、部分的にランダムな配列を有しても、完全に未知の配列を有してもよい。このろ過は、望ましくないオリゴヌクレオチドを排除することによって行われ得る。望ましくないオリゴヌクレオチドは、例えば、カラムベースのサイズ分離技法を使用して、サイズに基づいて、生成されたオリゴヌクレオチドをろ過処理することによって排除され得る。
[0054]ある特定の実施形態では、望ましくないオリゴヌクレオチドの排除ステップは、望ましくない配列についてろ過処理するなどの他のろ過方法と組み合わせて行われ得る。望ましくない配列についてのろ過処理は、以下の方法またはそれらの組合せのいずれかによって行われ得る：表面またはビーズに結合した相補的オリゴヌクレオチドへの望ましくないオリゴヌクレオチドの結合、およびその後の、望ましくないオリゴヌクレオチドから所望のオリゴヌクレオチドを洗い流すこと；望ましくないオリゴヌクレオチドの分解を容易にし得るタンパク質に結合している相補的なオリゴヌクレオチドへ望ましくないオリゴヌクレオチドが結合すること；制限エンドヌクレアーゼを使用することによって望ましくないオリゴヌクレオチドを切断し、したがって、これのサイズを縮小して、続いて行うサイズによるろ過を可能とし、その結果、望ましくないオリゴヌクレオチドを排除すること；および／または当業者にとって知られている他の任意の方法を使用して、望ましくない配列を有するオリゴヌクレオチドをろ過して取り除くこと。
[0055]生成されたランダムオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために、様々な配列決定技法が、個別にまたは組み合わせて使用され得る。当業者であれば、最良の好ましい配列決定技法を決定することができ、配列決定技術が進歩するにつれて、こうした技法は、本発明による配列を決定するために活用され得る。重要なことに、ランダムオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するのに使用される配列決定技法は、ランダムオリゴヌクレオチドが、配列決定された後に使用向けに収集されるのを可能にすること、または代替的に、ランダムオリゴヌクレオチドが配列決定された後に収集され得るコピーまたは相補的オリゴヌクレオチドを生成することのどちらかを要件とする。こうした要件は、ランダムオリゴヌクレオチドの配列が決定された後、生成されたランダムオリゴヌクレオチドが使用されることを可能にする。
[0056]ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、これの配列の決定に先立ち処理される必要がある。この処理には、当業者であれば理解するように、ランダムオリゴヌクレオチドへのヌクレオチドの付加、それらのサイズまたは配列に基づいた特定のオリゴヌクレオチドの排除、および／またはランダムオリゴヌクレオチドが存在する溶液を変更することが含まれ得るが、これらに限定されない。ランダムオリゴヌクレオチドを処理して配列決定用にこれを調製するための特定の方法は、使用される配列決定方法に依存する。核酸の鎖を配列決定するための方法は変化するので、ランダムオリゴヌクレオチドを処理して配列決定用にこれを調製することも変化することができ、当業者であれば、ランダムオリゴヌクレオチドを処理して配列決定用にこれを調製するための適切な方法を決定することができる。
[0057]ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、配列決定後に収集される必要がある。配列決定後にヌクレオチドの収集を可能にするシーケンサーの可能な選択肢は、例えば、Ｅｉｄら（２００９）「Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３（５９１０）：１３３～３８で検討の、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの１分子リアルタイムシーケンサーである。そこに記載のシーケンサーは、複製されているところのポリヌクレオチドにヌクレオチドが組み込まれるときに、ヌクレオチドを固有に識別できるインジケーター分子を使用して、ポリヌクレオチドをリアルタイムで複製するポリメラーゼを観測する。
[0058]配列決定された後のこれらのポリヌクレオチドの抽出は、当初配列決定されたポリヌクレオチドの複数のコピーをもたらすことになるので、結果は、本発明が使用され得る一部の状況にとって理想的とは言えない。例えば、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドが、出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／０５８０７６ ＷＯ公開ＷＯ２０１８／０８１１１３に記載されているなどの、分子暗号化で使用予定の場合、デュプリケイトオリゴヌクレオチドは理想的とは言えない。合成されたポリヌクレオチドは、一部の実施形態では、配列決定されているポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへのビーズの付着を使用して当初のポリヌクレオチドから分離され得るが、他のアプローチがより良好な収率を提供する可能性がある。
[0059]一部の実施形態では、合成されたポリヌクレオチドを当初のポリヌクレオチドから分離するアプローチとは、一本鎖ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または部分的一本鎖ポリヌクレオチドをランダムに生成しておいたことと思われる。かかる実施形態では、配列決定過程で生成された分子のコピーは、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドへの補体（compliment）であると思われる。配列決定される分子がヘアピンループ（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの配列調製で現在使用されているもの、Ｔｒａｖｅｒｓら、米国特許第９，４０４，１４６号、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）を含有しないと仮定すると、新たに合成されたポリヌクレオチドおよび当初の相補的な分子は、シーケンサーから抽出され得る既知である配列を有するランダムに生成された二本鎖オリゴヌクレオチドであると思われる。
[0060]ある特定の実施形態では、配列決定技術が活用されて、ランダムオリゴヌクレオチドを直接生成し、次にその配列を即座に決定することができる。配列決定技術は、インジケーター分子を観測することにより、ポリメラーゼとポリヌクレオチドの間の反応を観測するが、このインジケーター分子は、所与のヌクレオチド塩基が配列決定されるポリヌクレオチドへと組み込まれたことを示す。ある特定の実施形態では、反応は、ランダムに生成されているところのオリゴヌクレオチドを伸長する、ＴｄＴなどの酵素によって理想的には指向される。
[0061]図３Ａ～Ｃを参照すると、一部の実施形態では、反応は、酵素「ａ」３０２を含有するマイクロウェル３０１内で行われる。ある特定の実施形態では、酵素３０２はＴｄＴである。
[0062]図３Ｂを参照すると、ある特定の実施形態では、酵素３０２（「ａ」）が、そしてヌクレオチド「ｂ」３０３がオリゴヌクレオチド３０４にランダムに付加された直後またはすぐ後に、インジケーター分子「ｃ」３０５は観測され得る３０６。
[0063]図３Ｃを参照すると、ある特定の実施形態では、試薬が３０７に付加され、そしてマイクロ流体力学を使用してマイクロウェル３０１から排除される。
[0064]一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドへの新たなヌクレオチドの付加は、酵素近傍の溶液がほぼ等量の種々のヌクレオチド塩基を含有することから、ランダムに付加される。他の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドを合成している酵素を取り巻く溶液は、等しい割合のヌクレオチド塩基を含有せず、したがって、オリゴヌクレオチドの組成は、なおもランダムであるが、等しい割合の各ヌクレオチド塩基を有するとは予想されない。一部の実施形態では、酵素を取り巻く溶液は、ランダムオリゴヌクレオチドの生成を指向する目的で、特定の比率のヌクレオチド塩基を含有するように指向される。こうした指向性は、例えば、ランダムオリゴヌクレオチドの組成を制御するのに、他のものよりもある特定のヌクレオチド塩基の取り込みに有利であることができる。
[0065]オリゴヌクレオチドの配列が決定された後にオリゴヌクレオチドを回収する能力を有する別の配列決定技術は、参照により本明細書に組み込まれる、ＬｏｍａｎおよびＷａｔｓｏｎ（２０１５）「Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｅｓｔ ｌａｕｎｃｈ ｆｏｒ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２巻、３０３～３０４ページに記載のものなどの、ナノポアシーケンサーである。ある特定の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドはこの全体が生成され、次いで、ランダムオリゴヌクレオチドの配列を直接決定するナノポアシーケンサーを使用して、この配列が決定され、その後、オリゴヌクレオチドが回収される。
[0066]他の実施形態では、ナノポア技術が使用されて、参照により組み込まれる、Ｆｕｌｌｅｒら（２０１６）、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ－ｔａｇｇｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｒｒａｙ」、ＰＮＡＳ，２０１６年５月１０日、Ｖｏｌ．１１３ Ｎｏ．１９、５２３３～５２３８ページ（ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６０１７８２１１３にて入手可能）と類似するが同一ではない、インジケーター分子を使用することにより、あるランダムヌクレオチドのあるオリゴヌクレオチドへの組込みを観測する。
[0067]図４Ａ～Ｃは、ナノポアアレイ上のポリマータグ付きヌクレオチドを使用した合成によるリアルタイムの単一分子電子ＤＮＡ配列決定を例示する。これは、ランダムオリゴヌクレオチドの生成の観測を可能にし、この配列は、その生成のすぐ後にまたは直後に決定される。
[0068]図４Ａを参照すると、分子４０１は、ナノポア４０３に極近接して膜４０２に付着している。ランダムオリゴヌクレオチド４０６は、分子４０１に付着している。ある特定の実施形態では、分子４０１は酵素ＴｄＴである。
[0069]図４Ｂ～Ｃを参照すると、分子「ａ」４０１がヌクレオチド４０４「ｂ」をランダムにランダムオリゴヌクレオチド４０６に付加した後、インジケーター分子「ｃ」４０５は自由にナノポア４０３を通過し、シグナルを生成する。
[0070]一部の実施形態では、反応溶液中のヌクレオチド塩基は、生成されるオリゴヌクレオチドの配列が完全にランダムであることを確保するように調節される必要がある。完全にランダムな配列の場合、ランダムオリゴヌクレオチド中の所与の任意の位置での一ヌクレオチド塩基の存在を使用して、当該ランダムオリゴヌクレオチド中の別の位置でのあるヌクレオチド塩基の存在または非存在を予測することはできない。
[0071]オリゴヌクレオチドの配列が、オリゴヌクレオチドが生成された直後またはすぐ後に決定される実施形態では、またはオリゴヌクレオチドが今生成されているところであるときに決定される実施形態では、この生成の周囲の溶液は、一部の実施形態では、制御され得る。一部の実施形態では、マイクロ流体制御メカニズムが使用され、この場合、マイクロチャンネルが反応性溶液を調節するが、その結果、溶液が反応性領域またはマイクロウェルを横断して流れることを可能にする。一部の実施形態では、インクジェット技術が活用されて、反応性溶液をリアルタイムで調節する。一部の実施形態では、特定の濃度のヌクレオチド塩基を含有する溶液の流れは、反応性表面またはマイクロウェルを横断して流される。一部の実施形態では、熱または光ベースの反応などの指向性エネルギーは、マイクロミラーおよび／または反応に影響を及ぼすエネルギーの指向性の制御に関する他の形態を使用して制御される。
[0072]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドの正確な配列は、確実性を持って決定されない。ランダムオリゴヌクレオチドの正確な配列に関する知識は、ランダムオリゴヌクレオチドの一部の使用にとって必要ではない場合もある。ランダムオリゴヌクレオチドの一部の使用の場合は、所与のランダムオリゴヌクレオチドの配列についての不完全情報は、そのオリゴヌクレオチドを他のランダムに生成されたオリゴヌクレオチドから区別するのに十分である。したがって、一部の実施形態では、部分的な配列情報、または部分的に不正確な配列情報が、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドから取得される。一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドの「署名」は、シーケンサーから取得され、次いで、これが使用されて、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドを識別し、かつ／またはこれを他のランダムオリゴヌクレオチドから区別することができる。この署名は、例えば、膜に包埋された細孔をランダムオリゴヌクレオチドが通過することから取得される電気シグナル、または、別の分子または酵素とのランダムオリゴヌクレオチドの相互作用から取得される分子のキネティック署名（kinetic signature）、とすることができるが、これらに限定されない。次いで、所与の配列決定方法から取得された署名が、ランダムオリゴヌクレオチドを識別するのに使用され得る。例えば、組み合わせられたオリゴヌクレオチドを同じまたは類似の配列決定プラットフォーム上で配列決定する際に、ランダムオリゴヌクレオチドが、ランダムオリゴヌクレオチドにライゲートされた別のオリゴヌクレオチドに対する識別子として使用されるプロトコルにおいて、ランダムオリゴヌクレオチドは識別され得る。
[0073]ランダムに生成された分子を処理する方法。
[0074]本発明の方法によって生成されたランダムオリゴヌクレオチドは、分子暗号化（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／０５８０７６号）などの種々の技術において、または、米国特許公開第２０１５／０２１１０５０号；および第２０１５／０２１１０６１号、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれるが、に記載の方法などの分子レベルの識別を必要とする他の方法において、使用され得る。ランダムに生成された分子を処理する方法は、ランダムに生成された分子を使用した技術に依存する。
[0075]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、これらの配列の決定に先立ち、ある特定の特徴を有するある特定のオリゴヌクレオチドを選択するステップによって、処理される。処理は、効率的な配列決定を可能にし、シーケンサーによって作成されたヌクレオチド配列は正確であり、そして有用であるオリゴヌクレオチドについてのみ作成される。しかし、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列が決定された後にオリゴヌクレオチドを処理することもまた所望される場合もある。このようなことは、例えば、生成されてくるオリゴヌクレオチドの配列が、その生成の直後またはすぐ後に決定される場合に、必要とされると思われる。そのようなことはまた、大きいランダムオリゴヌクレオチドを生成するときにも必要とされる可能性があり、その配列が続いて決定されるが、この大きいランダムオリゴヌクレオチドは、使用に先立ちより小さいオリゴヌクレオチドに処理される必要がある。
[0076]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、カラム分離などの、これに限定されないが、選別技法を使用して、サイズを選択することによって処理される。望ましくないサイズの分子が望ましいサイズの分子から分離され、その結果、所望であれば、特定数のヌクレオチド塩基を含有する分子を選択することができる。
[0077]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、理想的とは言えないおよび／または望ましくない配列を有するオリゴヌクレオチドを排除することによって、特定の配列についてスクリーニングされる。こうした実施形態では、望ましくないオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を有するランダムオリゴヌクレオチドが、マイクロアレイなどの表面に、またはランダムオリゴヌクレオチドに付着された磁気ビーズを使用して付着され得る。次いで、ランダムオリゴヌクレオチドは、マイクロアレイの上面にこれらで流すことによってこの表面に導入されてもよく、磁気ビーズを含有する溶液に導入されてもよい。所望のランダムオリゴヌクレオチドは、溶液がマイクロアレイ上面に流された後、溶液中にとどまるか、または磁気ビーズが除去されると溶液中にとどまる。当業者であれば、特定のオリゴヌクレオチドの配列についてスクリーニングして、最終混合物中のこうした望ましくない分子の存在を回避する、最良の技法を決定することができる。
[0078]一部の実施形態では、制限酵素が、特定の配列を有するランダムオリゴヌクレオチドを消化するのに使用される。この消化はオリゴヌクレオチドのサイズを縮小し、その結果、これらをより小さいオリゴヌクレオチドに分解する。これらのより小さい分子は、サイズで選択され、より大きいオリゴヌクレオチドから分離され得る。
[0079]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、例えば、ＴＡライゲーションまたは当業者によって使用される他の任意の方法を使用して、他のオリゴヌクレオチド上にライゲートおよび／またはそうでなければ付着される。このライゲーションは、ランダムオリゴヌクレオチドを他の目的、例えば米国特許公開第２０１５／０２１１０５０号；および第２０１５／０２１１０６１号に開示の目的向けの技術に組み込むために、使用され得る。
[0080]一部の実施形態では、生成されたランダムオリゴヌクレオチドは一本鎖である。一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドの配列が決定される方法は、一本鎖ランダムオリゴヌクレオチドをもたらす。配列決定されたランダムオリゴヌクレオチドが完全に一本鎖であり、それらの所望の使用が、それらが二重鎖であることを必要とする場合、次いで一部の実施形態では、相補性配列を有する鎖を生成するためにある技法が使用される。かかる技法の１つは、一致する鎖を生成するため、ランダムな縮重プライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを使用することとすることができる。ランダムプライマーは必ずしも必要ではない。一部の実施形態では、ランダムに生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは、それらの配列の決定に先立ちまたはこれの過程中に、二本鎖ＤＮＡ分子に付着される。ある特定の実施形態では、ランダムに生成された一本鎖オリゴヌクレオチドは、これらの配列が決定された後、二本鎖ＤＮＡ分子にライゲートされる。一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、既知である配列部分を有する分子に付着されるが、このことのために、特定のプライマーが、ポリメラーゼを使用して相補鎖を生成するように設計され得る。
[0081]一部の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、これらの所望の形態に処理された後、パッケージ化されてもよく、そして、このパッケージは、溶液中に存在する配列とともに標識され得る。一部の実施形態では、ランダムに生成された分子が分子暗号化で使用される場合（ＰＣＴ／ＵＳ１７／０５８０７６を参照されたい）、溶液中の分子の正確な配列および／または署名は安全に維持される必要があり、こうした実施形態では、存在する配列についての情報は、分子の溶液とともにパッケージ化されておらず、代わりに、別々のパッケージで送られ得るかおよび／または適切な当事者に安全に送達される配列情報を含有するデータファイルを有することができる。
[0082]本発明をある特定の好ましい実施形態を参照して詳細に説明してきたが、変更および改変は記載の本発明の１つまたは複数の独立した態様の範囲および趣旨の範囲内である。

Claims (19)

  1. オリゴヌクレオチドを生成する方法であって、
    ａ．少なくとも１個のヌクレオチドをランダムに分子に付加することによって、ヌクレオチドを含む少なくとも１つの分子を生成するステップであって、生成された分子はランダムオリゴヌクレオチドである、ステップと；
    ｂ．ランダムオリゴヌクレオチドの配列を決定するステップと；
    ｃ．ランダムオリゴヌクレオチドのある特定の特徴を使用してランダムオリゴヌクレオチドを選択するステップと、
    を含む方法。
  2. ランダムオリゴヌクレオチドがホスホロアミダイト化学を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
  3. ランダムオリゴヌクレオチドが酵素的方法を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
  4. ランダムオリゴヌクレオチドがマイクロウェル内で生成される、請求項１に記載の方法。
  5. ランダムオリゴヌクレオチドがマイクロアレイ上で生成される、請求項１に記載の方法。
  6. ランダムオリゴヌクレオチドを選択するのに使用される特徴が、ヌクレオチドの特定の配列である、請求項１に記載の方法。
  7. ランダムオリゴヌクレオチドを選択する特徴が、ランダムオリゴヌクレオチドのサイズである、請求項１に記載の方法。
  8. ランダムオリゴヌクレオチドが、少なくとも部分的に既知である配列を有するオリゴヌクレオチド上で生成される、請求項１に記載の方法。
  9. ヌクレオチドが分子に付加された後、インジケーター分子が反応性になる、請求項３に記載の方法。
  10. 核酸塩基を分子に付加するステップが部分的に指向性である、請求項１に記載の方法。
  11. マイクロ流体を使用して反応条件を制御する、請求項１に記載の方法。
  12. 指向性エネルギーを使用して反応条件を制御する、請求項１に記載の方法。
  13. ランダムオリゴヌクレオチドの特性がナノポアを使用して測定される、請求項１に記載の方法。
  14. 選択されたオリゴヌクレオチドが特定の使用向けに調製される、請求項１に記載の方法。
  15. ランダムオリゴヌクレオチドが測定され、したがって、ランダムオリゴヌクレオチドが、類似または同一の測定技法を使用して識別され得る、請求項１に記載の方法。
  16. オリゴヌクレオチドを生成する方法であって、
    ａ．一つのヌクレオチドを別のヌクレオチドにランダムに付加することによってランダムオリゴヌクレオチドを生成するステップと；
    ｂ．第１のランダムオリゴヌクレオチドを別のランダムオリゴヌクレオチドと組み合わせるステップであって、第１のランダムオリゴヌクレオチドは、他のランダムオリゴヌクレオチドにランダムに組み合わされる、ステップと；
    ｃ．ある特定の特徴についてランダムオリゴヌクレオチドをスクリーニングするステップと；
    ｄ．ある特定の特徴を有するランダムオリゴヌクレオチドを排除するステップと；
    ｅ．残りのランダムオリゴヌクレオチドをランダムに組み合わせるステップと、
    を含む方法。
  17. 所望の特徴を有するランダムオリゴヌクレオチドを創製するのに、ステップｃ～ｅのいずれかを繰り返すステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. ランダムオリゴヌクレオチドをスクリーニングするのに使用される特徴に、ランダムオリゴヌクレオチドのサイズが含まれる、請求項１６に記載の方法。
  19. ランダムオリゴヌクレオチドをスクリーニングするのに使用される特徴に、ランダムオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が含まれる、請求項１６に記載の方法。
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