JP2022540744A - 核酸の空間情報を検出するためのアレイ及び方法 - Google Patents
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Abstract
試料における核酸の空間情報を検出するための方法のほか、方法において使用される核酸アレイ、及び核酸アレイを作製するための方法が提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、生体分子の空間的検出の分野に関する。詳細には、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するための方法、方法において使用される核酸アレイ、及び核酸アレイを作製するための方法を提供する。
組織における、細胞の空間的位置は、細胞の機能に、著明に影響を及ぼす。この空間的不均質性について調べるために、細胞のゲノム又はトランスクリプトームを、空間座標についての知見と共に、定量及び解析することが必要である。しかし、ゲノム解析又はトランスクリプトーム解析のために、小組織領域、又はさらに単一細胞を回収することは、極めて煩瑣であり、費用がかさみ、精度が低い。したがって、生体分子（例えば、核酸）についての空間情報（例えば、核酸の位置、分布、及び／又は発現）の単一細胞レベル、又はさらに細胞内レベルのハイスループット検出を達成しうる方法を開発することが、大いに必要とされている。
核酸の空間的検出を実現するために、先行技術は、アレイ技術を、ハイスループットＤＮＡシーケンシング技術と組み合わせて、組織試料における核酸を捕捉し、位置についてのタグで標識し、核酸をシーケンシングし、解析する。上記で言及された目的を達成しうるチップを得るために、先行技術は、スポッティング又はビーズベースの方法により、核酸を捕捉することが可能なプローブを、チップに固定する。しかし、平面における液滴スポッティング法のために、マイクロ容量のスポッティングシステムを使用することにより得られる、チップの活性領域のサイズは、最大で、２００ミクロンであり、細胞観察の精度は、細胞２０個に過ぎず；ビーズベースの方法を、位置についてのタグで標識されたビーズの拡散播種と共に使用することにより得られる、チップの活性領域サイズは、最大で、１０ミクロンであり、細胞観察精度は、単一細胞レベルに到達しうるに過ぎず、細胞内レベルは、達成されえない。本発明は、核酸の空間的検出のための新規の核酸アレイ、核酸アレイの調製法、及び高精度の細胞内位置特定、及びハイスループットの組織内位置特定を同時に実現する、アレイに基づく、核酸の空間的検出法を提供し、重要な適用価値を有する。
本発明は、核酸の空間情報を検出するための、新規のアレイ、及びアレイの調製法を提供する。核酸アレイが、核酸の空間情報を検出へと適用される場合、高精度の細胞内位置決め、及びハイスループットの組織内位置決めが同時に実現されうる。本発明のアレイ、及びアレイに基づく検出法は、細胞の位置決め、細胞内位置決め、細胞内小器官の位置決め、細胞間相互作用、細胞内小器官間相互作用、分子経路の調査研究、疾患の診断などにおいて、大きな適用価値を有する。
核酸アレイの調製
第１の態様では、本発明は、生物学的試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイを作出するための方法であって、以下のステップ：
（１）複数種類のキャリア配列を用意するステップであり、各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、位置決め（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）配列、及び第１の固定化配列を含み、
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とするステップ；
（２）複数種類のキャリア配列を、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップ；
（３）第１のプライマーを用意し、キャリア配列の第１の固定化配列及び位置決め配列の領域が、二本鎖を形成するように、キャリア配列を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施するステップであり、キャリア配列とハイブリダイズする鎖が、第１の核酸分子であり、第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補性配列、及び位置決め配列を含み；第１のプライマーが、その３’末端に、第１の固定化配列の相補性領域を含み、第１の固定化配列の相補性領域が、第１の固定化配列の相補性配列又はその断片を含み、遊離３’末端を有するステップ
を含む方法を提供する。
第１の態様では、本発明は、生物学的試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイを作出するための方法であって、以下のステップ：
（１）複数種類のキャリア配列を用意するステップであり、各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、位置決め（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）配列、及び第１の固定化配列を含み、
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とするステップ；
（２）複数種類のキャリア配列を、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップ；
（３）第１のプライマーを用意し、キャリア配列の第１の固定化配列及び位置決め配列の領域が、二本鎖を形成するように、キャリア配列を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施するステップであり、キャリア配列とハイブリダイズする鎖が、第１の核酸分子であり、第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補性配列、及び位置決め配列を含み；第１のプライマーが、その３’末端に、第１の固定化配列の相補性領域を含み、第１の固定化配列の相補性領域が、第１の固定化配列の相補性配列又はその断片を含み、遊離３’末端を有するステップ
を含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、キャリア配列及び第１の核酸分子は、一本鎖核酸配列である。一部の実施形態では、キャリア配列及び第１の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ配列である。
一部の実施形態では、ステップ（３）において、伸長反応を実施する間に、キャリア配列に含有される位置決め配列の配列情報を得るように、キャリア配列がシーケンシングされる。
一部の実施形態では、ステップ（１）において、複数種類のキャリア配列は、以下のステップ：
（ｉ）複数種類のキャリア配列の鋳型を用意するステップであり、キャリア配列の鋳型が、キャリア配列の相補性配列を含むステップ；
（ｉｉ）各種類のキャリア配列の鋳型を、鋳型として使用して、核酸増幅反応を実施して、各種類のキャリア配列の鋳型の増幅産物を得るステップであり、増幅産物が、キャリア配列の複数のコピーを含むステップ
を介して用意される。
（ｉ）複数種類のキャリア配列の鋳型を用意するステップであり、キャリア配列の鋳型が、キャリア配列の相補性配列を含むステップ；
（ｉｉ）各種類のキャリア配列の鋳型を、鋳型として使用して、核酸増幅反応を実施して、各種類のキャリア配列の鋳型の増幅産物を得るステップであり、増幅産物が、キャリア配列の複数のコピーを含むステップ
を介して用意される。
ある特定の実施形態では、増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ増幅、多重鎖置換増幅（ＭＤＡ）、又はエマルジョンＰＣＲ増幅から選択される。
ある特定の実施形態では、キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢを得るように、ローリングサークル増幅が実施される。このような実施形態では、ステップ（ｉ）において、環状鋳型配列が用意される。当技術分野では、環状核酸分子を調製するための方法が、常套的な方法であり、必要に従い、当業者により選択されうる。例えば、まず、直鎖状核酸鋳型が得られ、次いで、リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ）により、直鎖状核酸鋳型の環状化が実現されうる。
一部の実施形態では、キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡクラスターを得るように、ブリッジＰＣＲ増幅、エマルジョンＰＣＲ増幅、又は多重鎖置換増幅が実施される。
一部の実施形態では、方法は、以下のステップ：
（４）第２の核酸分子を用意するステップであり、第２の核酸分子が、捕捉配列を含み；
捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列が、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するステップ；
（５）第２の核酸分子を、第１の核酸分子へとライゲーションするステップ（例えば、リガーゼを使用することにより、第２の核酸分子を、第１の核酸分子へとライゲーションするステップ）
をさらに含む。
（４）第２の核酸分子を用意するステップであり、第２の核酸分子が、捕捉配列を含み；
捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列が、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するステップ；
（５）第２の核酸分子を、第１の核酸分子へとライゲーションするステップ（例えば、リガーゼを使用することにより、第２の核酸分子を、第１の核酸分子へとライゲーションするステップ）
をさらに含む。
ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖核酸配列である。ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ配列である。ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖ＲＮＡ配列である。
ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、５’から３’の方向に、固定化領域及び捕捉配列を含み、固定化領域は、二本鎖ＤＮＡ配列などの二本鎖核酸配列を含む。一部の実施形態では、第２の核酸分子に含有される捕捉配列は、一本鎖ＤＮＡ配列又は一本鎖ＲＮＡ配列などの一本鎖核酸配列である。このような実施形態では、第２の核酸分子が、部分的に、二本鎖構造を有する、すなわち、第２の核酸分子の固定化領域が、二本鎖構造を有し、第２の核酸分子の捕捉配列が、一本鎖構造を有することを理解することは容易である。
ある特定の実施形態では、二本鎖核酸配列は、１ｂｐ～５０ｂｐ、例えば、１０ｂｐ～５０ｂｐ、１０ｂｐ～４０ｂｐ、又は１０ｂｐ～３０ｂｐの長さを有する。
他の実施形態では、方法は、以下のステップ：
（４）第２の核酸分子を用意するステップであり、第２の核酸分子が、５’から３’の方向に、第２の固定化配列の相補体及び捕捉配列を含み；
第２の固定化配列の相補体が、その相補性ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることを可能とし；
捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列が、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するステップ；
（５）アニーリングを可能とする条件下で、第２の固定化配列の相補体を、第２の固定化配列とハイブリダイズさせ、これにより、第２の核酸分子を、キャリア配列へとライゲーションするステップ；
（６）任意選択で、それぞれ、キャリア配列へとハイブリダイズされている、第１の核酸分子と、第２の核酸分子とをライゲーションするステップ（例えば、リガーゼを使用することにより、第２の核酸分子を、第１の核酸分子へとライゲーションするステップ）
をさらに含む。
（４）第２の核酸分子を用意するステップであり、第２の核酸分子が、５’から３’の方向に、第２の固定化配列の相補体及び捕捉配列を含み；
第２の固定化配列の相補体が、その相補性ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることを可能とし；
捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列が、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するステップ；
（５）アニーリングを可能とする条件下で、第２の固定化配列の相補体を、第２の固定化配列とハイブリダイズさせ、これにより、第２の核酸分子を、キャリア配列へとライゲーションするステップ；
（６）任意選択で、それぞれ、キャリア配列へとハイブリダイズされている、第１の核酸分子と、第２の核酸分子とをライゲーションするステップ（例えば、リガーゼを使用することにより、第２の核酸分子を、第１の核酸分子へとライゲーションするステップ）
をさらに含む。
このような実施形態では、各キャリア配列は、その５’末端において、第２の固定化配列をさらに含み、第２の固定化配列は、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリングを可能とする。一部の実施形態では、第２の固定化配列は、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とする（例えば、第２の固定化配列は、ブリッジＰＣＲプライマーの結合性部位として使用されうる）。
ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖核酸配列である。ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ配列である。ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖ＲＮＡ配列である。
ある特定の実施形態では、第２の固定化配列は、位置決め配列に隣接する。
一部の実施形態では、第２の固定化配列は、１ｂｐ～５０ｂｐ、例えば、１０ｂｐ～５０ｂｐ、１０ｂｐ～４０ｂｐ、１０ｂｐ～３０ｂｐ、又は１０ｂｐ～２０ｂｐの長さを有する。
一部の実施形態では、ステップ（３）において、第１の核酸分子が、含有される第１の固定化配列の相補体の５’末端に、ＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）配列を含むように、第１のプライマーは、含有される第１の固定化配列の相補性領域の５’末端に、ＵＭＩ配列をさらに含むか；又はステップ（４）において、第２の核酸分子は、ＵＭＩ配列をさらに含み、ＵＭＩ配列が、捕捉配列の５’末端に配置され；
ＵＭＩ配列は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００、５つ～５０、１０など、５つ～２０）のヌクレオチドＮから構成されるヌクレオチド配列であり、各Ｎは、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つである。
ＵＭＩ配列は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００、５つ～５０、１０など、５つ～２０）のヌクレオチドＮから構成されるヌクレオチド配列であり、各Ｎは、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つである。
一部の実施形態では、第１のプライマーが、含有される第１の固定化配列の相補性領域の５’末端に、ＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）配列を含む場合、第１のプライマーは、ＵＭＩ配列の５’末端に、さらなる配列をさらに含みうる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることが可能な配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリＴオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、チップである。一部の実施形態では、固体支持体は、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用されうる。一部の実施形態では、固体支持体は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製、ＭＧＩ製、又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のシーケンシングプラットフォームにおいて使用されるハイスループットシーケンシングチップなどのハイスループットシーケンシングチップである。
第２の態様では、本発明は、生物学的試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイを作出するための方法であって、以下のステップ：
（１）複数種類のキャリア配列を用意するステップであり、各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、捕捉配列鋳型、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
捕捉配列鋳型が、捕捉配列の相補性配列を含み、捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし；第１の固定化配列がまた、切断部位も含み、切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択されうるステップ；
（２）複数種類のキャリア配列を、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップ；
（３）第１のプライマー（又はプローブプライマーと称される）を用意するステップであり、第１のプライマーが、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及び第１の固定化配列の相補性領域を含み、第１の固定化配列の相補性領域が、第１の固定化配列の相補性配列又はその断片を含み、遊離３’末端を有し；結合性領域が、固体支持体の表面へとライゲーションされうるリンカーを含み；切断領域が、切断部位を含み；
キャリア配列の第１の固定化配列、位置決め配列、及び捕捉配列鋳型の領域が、二本鎖を形成するように、第１のプライマーを、プライマーとして使用し、キャリア配列を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施し、キャリア配列とハイブリダイズされた鎖が、第１の核酸分子であり、第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体、位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含み；第１の核酸分子がまた、捕捉プローブとも称されうるステップ；
（４）第１のプライマーを、固体支持体の表面へとライゲーションするステップであり、ステップ（３）及び（４）が、任意の順序で実施されるステップ；
（５）第１の核酸分子（捕捉プローブ）が、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションされるよう、ステップ（３）の伸長産物が、伸長産物を形成するための鋳型（すなわち、キャリア配列）から分離されるように、任意選択で、キャリア配列の第１の固定化配列に含有される切断部位において、切断を実施して、キャリア配列を消化するステップ
を含む方法を提供する。
（１）複数種類のキャリア配列を用意するステップであり、各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、捕捉配列鋳型、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
捕捉配列鋳型が、捕捉配列の相補性配列を含み、捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし；第１の固定化配列がまた、切断部位も含み、切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択されうるステップ；
（２）複数種類のキャリア配列を、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップ；
（３）第１のプライマー（又はプローブプライマーと称される）を用意するステップであり、第１のプライマーが、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及び第１の固定化配列の相補性領域を含み、第１の固定化配列の相補性領域が、第１の固定化配列の相補性配列又はその断片を含み、遊離３’末端を有し；結合性領域が、固体支持体の表面へとライゲーションされうるリンカーを含み；切断領域が、切断部位を含み；
キャリア配列の第１の固定化配列、位置決め配列、及び捕捉配列鋳型の領域が、二本鎖を形成するように、第１のプライマーを、プライマーとして使用し、キャリア配列を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施し、キャリア配列とハイブリダイズされた鎖が、第１の核酸分子であり、第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体、位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含み；第１の核酸分子がまた、捕捉プローブとも称されうるステップ；
（４）第１のプライマーを、固体支持体の表面へとライゲーションするステップであり、ステップ（３）及び（４）が、任意の順序で実施されるステップ；
（５）第１の核酸分子（捕捉プローブ）が、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションされるよう、ステップ（３）の伸長産物が、伸長産物を形成するための鋳型（すなわち、キャリア配列）から分離されるように、任意選択で、キャリア配列の第１の固定化配列に含有される切断部位において、切断を実施して、キャリア配列を消化するステップ
を含む方法を提供する。
捕捉プローブ（すなわち、第１の核酸分子）は、キャリア配列を、鋳型として使用し、プライマー伸長を実施することにより得られるので、捕捉プローブは、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブ（当該種類のキャリア配列）の位置に対応する、固有の位置決め配列の相補体、及び捕捉される核酸分子の全部又は一部とハイブリダイズしうる捕捉配列を含む。アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置は、位置決め配列の相補体を解析することにより決定されうる。
この文脈では、「各種類のキャリア配列」という表現は、同じ位置決め配列を含むキャリア配列を指す。
一部の実施形態では、ステップ（１）において、複数種類のキャリア配列は、以下のステップ：
（ｉ）複数種類のキャリア配列の鋳型を用意するステップであり、キャリア配列の鋳型が、キャリア配列の相補性配列を含むステップ；
（ｉｉ）各種類のキャリア配列の鋳型を、鋳型として使用して、核酸増幅反応を実施して、各種類のキャリア配列の鋳型の増幅産物を得るステップであり、増幅産物が、キャリア配列の複数のコピーを含むステップ
を介して用意される。
（ｉ）複数種類のキャリア配列の鋳型を用意するステップであり、キャリア配列の鋳型が、キャリア配列の相補性配列を含むステップ；
（ｉｉ）各種類のキャリア配列の鋳型を、鋳型として使用して、核酸増幅反応を実施して、各種類のキャリア配列の鋳型の増幅産物を得るステップであり、増幅産物が、キャリア配列の複数のコピーを含むステップ
を介して用意される。
ある特定の実施形態では、増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ増幅、多重鎖置換増幅（ＭＤＡ）、又はエマルジョンＰＣＲ増幅から選択される。
ある特定の実施形態では、キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢを得るように、ローリングサークル増幅が実施される。このような実施形態では、ステップ（ｉ）において、環状鋳型配列が用意される。当技術分野では、環状核酸分子を調製するための方法が、常套的な方法であり、必要に従い、当業者により選択されうる。例えば、まず、直鎖状核酸鋳型が得られ、次いで、リガーゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ）により、直鎖状核酸鋳型の環状化が実現されうる。
ある特定の実施形態では、各種類のキャリア配列は、キャリア配列の複数のコピーのコンカテマーにより形成されるＤＮＢである。
一部の実施形態では、ステップ（１）は、以下のステップ：
（１ａ）環状核酸鋳型を用意するステップであり、環状核酸鋳型が、１種類のキャリア配列の鋳型を含み、キャリア配列の鋳型が、キャリア配列の相補性配列を含む、すなわち、キャリア配列の鋳型が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体、位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含むステップ；
（１ｂ）環状核酸鋳型を、鋳型として使用することにより、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実施して、キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）を得るステップ
を含む。
（１ａ）環状核酸鋳型を用意するステップであり、環状核酸鋳型が、１種類のキャリア配列の鋳型を含み、キャリア配列の鋳型が、キャリア配列の相補性配列を含む、すなわち、キャリア配列の鋳型が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体、位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含むステップ；
（１ｂ）環状核酸鋳型を、鋳型として使用することにより、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実施して、キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）を得るステップ
を含む。
一部の実施形態では、キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡクラスターを得るように、ブリッジＰＣＲ増幅、エマルジョンＰＣＲ増幅、又は多重鎖置換増幅が実施される。
一部の実施形態では、第１の固定化配列に含有される切断部位は、ニッキング酵素の切断部位である。一部の実施形態では、ニッキング酵素は、ＵＳＥＲ、ＢａｍＨＩ、ＢｍｔＩなどから選択される。ある特定の例示的な実施形態では、切断部位は、配列番号１４に示される。
一部の実施形態では、第１の固定化配列は、シーケンシングプライマーのためのハイブリダイゼーション領域、及び／又は増幅プライマーのためのハイブリダイゼーション領域をさらに含み；シーケンシングプライマーのためのハイブリダイゼーション領域は、シーケンシングプライマーへのアニーリング、及びシーケンシング反応の誘発を可能とし、増幅プライマーのためのハイブリダイゼーション領域は、増幅プライマーへのアニーリング、並びに伸長反応及び増幅反応の誘発を可能とする。
一部の実施形態では、第１の固定化配列は、１０ｂｐを超えるか、又は２０ｂｐを超えるなど、１ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、第１の固定化配列は、２０～８０ｂｐなど、２０～１００ｂｐの長さを有する。
一部の実施形態では、位置決め配列は、１０ｂｐを超えるなど、１ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、位置決め配列は、１０～５０ｂｐなど、１０～３０ｂｐなど、２０ｂｐなど、１０～１００ｂｐの長さを有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることが可能な配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリＴオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む。
一部の実施形態では、捕捉配列は、１ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、捕捉配列は、１０～５０ｂｐなど、１０～３０ｂｐなど、１～１００ｂｐの長さを有する。
一部の実施形態では、キャリア配列は、捕捉配列鋳型の下流、及び第１の固定化配列の上流に配置されたＵＭＩ配列（また、プローブタグ領域とも称される）の相補体をさらに含み、ＵＭＩ配列の相補体は、ＵＭＩ配列に対して、相補性であり、ＵＭＩ配列は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００、５つ～５０、１０など、５つ～２０）のヌクレオチドＮから構成されるヌクレオチド配列であり、各Ｎは、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つである。一部の実施形態では、ＵＭＩ配列の相補体は、位置決め配列と、捕捉配列鋳型との間に配置される。他の実施形態では、ＵＭＩ配列の相補体は、第１の固定化配列と、位置決め配列との間に配置される。このような実施形態では、ステップ（３）において、プライマー伸長反応が、キャリア配列を鋳型として使用して実施される場合、キャリア配列とハイブリダイズする、第１の核酸分子／捕捉プローブは、これに対応して、ＵＭＩ配列（また、プローブタグとも称される）を含むであろう。
一部の実施形態では、前述のＵＭＩ配列又はその相補性配列を得るために、キャリア配列の鋳型配列（すなわち、キャリア配列の鋳型）は、対応する位置に、ＵＭＩ配列鋳型を含み、ＵＭＩ配列鋳型は、修飾塩基から構成された配列であり、修飾塩基は、様々な主要塩基（例えば、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｕ）との水素結合により、相補性対合が可能であり；例えば、修飾塩基は、塩基であるＡ、Ｃ、及びＵとの相補性対合が可能なイノシンでありうる。いかなる理論にも束縛されずに述べると、キャリア配列の鋳型が、ＵＭＩ配列鋳型を含む場合、各回の増幅産物が、ランダムに形成された、固有のＵＭＩ配列を有し、これにより、各回の増幅産物を識別するように、ローリングサークル増幅工程で、増幅が実施されるたびに、ＵＭＩ配列鋳型との相補性対合が可能な塩基は、ランダムに結合させられることが考えられる。したがって、例えば、コピー数は、捕捉されている異なる核酸分子について定量されうる。一部の実施形態では、ＵＭＩ配列鋳型は、複数の（例えば、１０～１００など、少なくとも１０の）イノシンを含む。一部の実施形態では、ＵＭＩ配列鋳型は、１ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、ＵＭＩ配列鋳型は、５ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、ＵＭＩ配列鋳型は、５～５０ｂｐなど、５～２０ｂｐなど、５～１５ｂｐなど、１０ｂｐなど、５～１００ｂｐの長さを有する。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、チップである。一部の実施形態では、固体支持体は、シーケンシングプラットフォームとして使用されうる。一部の実施形態では、固体支持体は、ＢＧＩＳＥＱ－５００プラットフォームのシーケンシングチップなどのシーケンシングチップ（ＭＧＩ）である。一部の実施形態では、固体支持体は、例えば、中国特許第１０３１８０４９６号において記載されている方法により得られうる、高密度アレイチップである。
キャリア配列（例えば、ＤＮＢ）は、当技術分野で公知である、任意の適切な方法により、固体支持体の表面へとライゲーションされうる。ある特定の実施形態では、方法の非限定例は、核酸ハイブリダイゼーション、ビオチン－ストレプトアビジン結合、スルフヒドリル結合、光活性化結合、共有結合、抗体－抗原結合、ハイドロゲルによる物理的限定、若しくは他の多孔性ポリマー材料など、又はこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、固体支持体は、以下の材料：ガラス、ケイ素、ポリリシンコーティング材料、ニトロセルロース、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、又はポリカーボネートなどから選択される。
一部の実施形態では、ステップ（３）において、プライマー伸長反応を実施する間に、キャリア配列に含有される位置決め配列の配列情報を得るように、キャリア配列（例えば、含有される位置決め配列）がシーケンシングされる。
一部の実施形態では、ステップ（３）の前に、キャリア配列（例えば、含有される位置決め配列）をシーケンシングするステップは、さらに含まれる。一部の実施形態では、シーケンシングが完了した後で、シーケンシングのために合成鎖へと付加されたｄＮＴＰを除去するように、洗浄が実施される。
ある特定の実施形態では、リンカーは、活性化基（例えば、ＮＨ２）とカップリングすることが可能な連結基である。このような実施形態では、固体支持体の表面は、活性化基（例えば、ＮＨ２）により修飾される。一部の実施形態では、リンカーは、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ、－ＮＨＳなどを含む。ある特定の例示的な実施形態では、リンカーは、ＤＢＣＯであり、アジド－ｄＰＥＧ（Ａｚｉｄｏ－ｄＰＥＧ）（登録商標）８－ＮＨＳエステルが、固体支持体の表面へと接合されている。
一部の実施形態では、第１のプライマーの切断領域に含有される切断部位は、化学法、酵素法、又は光化学法により、制御切断が実施されうる部位である。ある特定の実施形態では、切断部位は、酵素の切断部位である。一部の実施形態では、酵素部位は、ＵＳＥＲ酵素の酵素部位（ＵＵＵ）である。
一部の実施形態では、第１のプライマーの切断領域に含有される切断部位は、化学法、酵素法、又は光化学法により、制御切断が実施されうる部位である。ある特定の実施形態では、切断部位は、酵素の切断部位である。一部の実施形態では、酵素部位は、ＵＳＥＲ酵素の酵素部位（ＵＵＵ）である。
一部の実施形態では、第１のプライマーの切断領域は、キャリア配列の第１の固定化配列に含有される切断部位と異なる。
ある特定の実施形態では、増幅は、ＰＣＲを含む。
核酸アレイ及びキット
第３の態様では、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイであって、複数種類のキャリア配列が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とする
核酸アレイを提供する。
第３の態様では、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイであって、複数種類のキャリア配列が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とする
核酸アレイを提供する。
ある特定の実施形態では、前記各種類のキャリア配列（すなわち、同じ位置決め配列を含むキャリア配列）は、固体支持体の表面における直径を、１ミクロン未満、例えば、約９００ナノメートル、約８００ナノメートル、約７００ナノメートル、約６００ナノメートル、又は約５００ナノメートルとする領域（すなわち、活性領域）を占める。
一部の実施形態では、核酸アレイは、第１の核酸分子をさらに含み、第１の核酸分子は、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体及び位置決め配列の相補体を含み、キャリア配列の第１の固定化配列及び位置決め配列とハイブリダイズすることにより、二本鎖構造を形成する。第１の固定化配列と、キャリア配列とにより形成される二本鎖が、不完全な二本鎖、すなわち、部分的な二本鎖構造であるように、第１の核酸分子において、第１の固定化配列の相補体及び位置決め配列の相補体だけが、キャリア配列の対応する配列と相補性であり、これにより、二本鎖を形成することを理解することは容易である。
ある特定の実施形態では、各種類のキャリア配列の各コピーは、そのコピーとハイブリダイズされた、第１の核酸分子を含む。
ある特定の実施形態では、キャリア配列及び第１の核酸分子は、一本鎖核酸配列である。一部の実施形態では、キャリア配列及び第１の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ配列である。
一部の実施形態では、核酸アレイは、第２の核酸分子をさらに含み、第２の核酸分子は、第１の核酸分子へとライゲーションされ、これにより、核酸アレイへと固定化されており、第２の核酸分子は、捕捉配列を含み；
捕捉配列は、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列は、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有する。
捕捉配列は、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列は、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有する。
ある特定の実施形態では、各第１の核酸分子は、第２の核酸分子へとライゲーションされている。
一部の実施形態では、第２の核酸分子の５’末端は、第１の核酸分子の３’末端へとライゲーションされている。
他の実施形態では、核酸アレイは、第２の核酸分子をさらに含み、第２の核酸は、キャリア配列とハイブリダイズし、これにより、核酸アレイへと固定化されている。
このような実施形態では、各キャリア配列は、その５’末端において、第２の固定化配列をさらに含み、第２の固定化配列は、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリングを可能とし；
第２の核酸分子は、５’から３’の方向に、第２の固定化配列の相補体及び捕捉配列を含み；第２の固定化配列の相補体は、キャリア配列の第２の固定化配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成し；
捕捉配列は、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列は、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有する。
第２の核酸分子は、５’から３’の方向に、第２の固定化配列の相補体及び捕捉配列を含み；第２の固定化配列の相補体は、キャリア配列の第２の固定化配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成し；
捕捉配列は、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列は、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有する。
ある特定の実施形態では、各種類のキャリア配列の各コピーは、そのコピーとハイブリダイズされた第２の核酸分子を含む。
一部の実施形態では、第２の固定化配列は、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とする（例えば、第２の固定化配列は、ブリッジＰＣＲプライマーの結合性部位として使用されうる）。
ある特定の実施形態では、第２の固定化配列は、位置決め配列に隣接する。
ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、５’末端の修飾を有する。ある特定の実施形態では、修飾は、リン酸化又はビオチン修飾である。
ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖核酸配列である。ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ配列である。ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖ＲＮＡ配列である。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、鋳型としてのキャリア配列の相補性配列の増幅により形成される増幅産物であり、増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ増幅、多重鎖置換増幅（ＭＤＡ）、又はエマルジョンＰＣＲ増幅から選択される。
ある特定の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢである。ある特定の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用するローリングサークル増幅により形成されるＤＮＢである。
ある特定の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用するブリッジＰＣＲ増幅により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、鋳型としてのキャリア配列の相補性配列のエマルジョンＰＣＲ増幅により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用することによる多重鎖置換増幅により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、第１の核酸分子は、ＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）配列をさらに含み、ＵＭＩ配列は、第１の固定化配列の相補体の５’末端に配置されるか；又は第２の核酸分子は、ＵＭＩ配列をさらに含み、ＵＭＩ配列は、捕捉配列の５’末端に配置され；
ＵＭＩ配列は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００、５つ～５０、１０など、５つ～２０）のヌクレオチドＮから構成されるヌクレオチド配列であり、各Ｎは、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つである。
ＵＭＩ配列は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００、５つ～５０、１０など、５つ～２０）のヌクレオチドＮから構成されるヌクレオチド配列であり、各Ｎは、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つである。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、チップである。一部の実施形態では、固体支持体は、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用されうる。一部の実施形態では、固体支持体は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製、ＭＧＩ製、又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のシーケンシングプラットフォームにおいて使用されるハイスループットシーケンシングチップなどのハイスループットシーケンシングチップである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることが可能な配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリＴオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む。
一部の実施形態では、位置決め配列は、５ｎｔを超えるなど、１ｎｔを超える長さを有する。一部の実施形態では、位置決め配列は、１０～５０ｎｔ、１０～３０ｎｔ、又は２０～３０ｎｔなど、５～５０ｎｔの長さを有する。一部の実施形態では、異なる種類のキャリア配列に含有される位置決め配列の長さは、同じ場合もあり、異なる場合もある。
一部の実施形態では、捕捉配列は、１ｎｔを超える長さを有する。ある特定の実施形態では、捕捉配列は、１～５０ｎｔなど、１０～３０ｎｔなど、１～１００ｎｔの長さを有する。
一部の実施形態では、第１の固定化配列は、１０ｎｔを超えるなど、１ｎｔを超える長さを有する。一部の実施形態では、第１の固定化配列は、１０～２００ｎｔの長さを有する。一部の実施形態では、第１の固定化配列は、２０～５０ｎｔなど、２０～１００ｎｔの長さを有する。
一部の実施形態では、第２の固定化配列は、１０ｎｔを超えるなど、１ｎｔを超える長さを有する。一部の実施形態では、第２の固定化配列は、１０～２００ｎｔ、例えば、１０～１００ｎｔ、１０～５０ｎｔ、１０～３０ｎｔ、又は１０～２０ｎｔの長さを有する。
第４の態様では、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するためのキットであって、（ｉ）第２の核酸分子を含まない、第３の態様に従う核酸アレイ；及び（ｉｉ）５’から３’の方向に、固定化領域及び捕捉配列を含む、第２の核酸分子を含み；
捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列が、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有する
キットを提供する。
捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；捕捉配列が、第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有する
キットを提供する。
一部の実施形態では、キットは、（ｉ）複数種類のキャリア配列が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし；
核酸アレイが、また、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体及び位置決め配列の相補体を含み、キャリア配列の第１の固定化配列及び位置決め配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成する、第１の核酸分子も含む
核酸アレイ；並びに
（ｉｉ）固定化領域が、二本鎖ＤＮＡ配列を含む、第２の核酸分子を含む。
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし；
核酸アレイが、また、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体及び位置決め配列の相補体を含み、キャリア配列の第１の固定化配列及び位置決め配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成する、第１の核酸分子も含む
核酸アレイ；並びに
（ｉｉ）固定化領域が、二本鎖ＤＮＡ配列を含む、第２の核酸分子を含む。
リガーゼが、（ｉｉ）で記載された、第２の核酸分子を、（ｉ）で記載された、核酸アレイに含有される、第１の核酸分子へとライゲーションするのに使用されうることを理解することは容易である。したがって、ある特定の実施形態では、キットは、リガーゼをさらに含む。
他の実施形態では、キットは、（ｉ）複数種類のキャリア配列が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、第２の固定化配列、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
第２の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリングを可能とし；
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし；
核酸アレイが、また、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体及び位置決め配列の相補体を含み、キャリア配列の第１の固定化配列及び位置決め配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成する、第１の核酸分子も含む
核酸アレイ；並びに
（ｉｉ）固定化領域が、第２の固定化配列の相補体を含む、第２の核酸分子
を含む。
第２の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリングを可能とし；
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし；
核酸アレイが、また、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体及び位置決め配列の相補体を含み、キャリア配列の第１の固定化配列及び位置決め配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成する、第１の核酸分子も含む
核酸アレイ；並びに
（ｉｉ）固定化領域が、第２の固定化配列の相補体を含む、第２の核酸分子
を含む。
ある特定の実施形態では、第２の固定化配列は、位置決め配列に隣接する。
アニーリングを可能とする条件下で、（ｉｉ）で記載された、第２の核酸分子が、（ｉ）で記載された、核酸アレイに含有されるキャリア配列の相補性領域とハイブリダイズすることが可能であり、このため、リガーゼを使用することにより、第２の核酸分子が、第１の核酸分子へとライゲーションされうることを理解することは容易である。したがって、ある特定の実施形態では、キットは、リガーゼをさらに含む。
別の態様では、本発明はまた、試料における核酸の空間情報の検出のための、第３の態様に従う核酸アレイ、若しくは第４の態様に従うキットの使用、又は試料における核酸の空間情報の検出のための、検出試薬の製造におけるこれらの使用にも関する。
一部の実施形態では、核酸の空間情報は、核酸の位置、分布、及び／又は発現を含む。
ある特定の実施形態では、試料は、細胞を含む組織試料などの組織試料である。一部の実施形態では、試料は、組織切片である。ある特定の実施形態では、組織切片は、固定組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、又は急速冷凍組織から調製される。
第５の態様では、本発明はまた、試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイであって、複数種類のキャリア配列が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み、キャリア配列が、５’から３’の方向に、捕捉配列鋳型、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
捕捉配列鋳型が、捕捉配列の相補性配列を含み、捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし、第１の固定化配列がまた、切断部位も含み、切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択される場合があり
核酸アレイが、また、第１の核酸分子（また、捕捉プローブとも称される）も含み、第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及びキャリア配列の相補性領域を含み、
結合性領域が、固体支持体の表面へのライゲーションが可能なリンカーを含み；
切断領域が、切断部位を含み；
キャリア配列の相補性領域が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体、位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含むキャリア配列と相補性でありうる配列を含み；捕捉配列が、第１の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有し；
第１の核酸分子の、キャリア配列の相補性領域が、キャリア配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成する
核酸アレイにも関する。
捕捉配列鋳型が、捕捉配列の相補性配列を含み、捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；
位置決め配列が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とし、第１の固定化配列がまた、切断部位も含み、切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択される場合があり
核酸アレイが、また、第１の核酸分子（また、捕捉プローブとも称される）も含み、第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及びキャリア配列の相補性領域を含み、
結合性領域が、固体支持体の表面へのライゲーションが可能なリンカーを含み；
切断領域が、切断部位を含み；
キャリア配列の相補性領域が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体、位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含むキャリア配列と相補性でありうる配列を含み；捕捉配列が、第１の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有し；
第１の核酸分子の、キャリア配列の相補性領域が、キャリア配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成する
核酸アレイにも関する。
ある特定の実施形態では、キャリア配列及び第１の核酸分子は、一本鎖核酸配列である。一部の実施形態では、キャリア配列及び第１の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ配列である。
ある特定の実施形態では、各種類のキャリア配列の各コピーは、そのコピーとハイブリダイズされた、前述の、第１の核酸分子を含む。
一部の実施形態では、第１の核酸分子のリンカーは、活性化基（例えば、ＮＨ２）とカップリングすることが可能な連結基であり、固体支持体の表面は、活性化基（例えば、ＮＨ２）により修飾される。ある特定の実施形態では、リンカーは、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ、又は－ＮＨＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、
であり、
が、固体支持体の表面へと接合されている。
であり、
が、固体支持体の表面へと接合されている。
一部の実施形態では、第１の固定化配列に含有される切断部位は、ニッキング酵素の切断部位である。一部の実施形態では、ニッキング酵素は、ＵＳＥＲ、ＢａｍＨＩ、ＢｍｔＩなどから選択される。ある特定の例示的な実施形態では、切断部位は、配列番号１４に示される。
一部の実施形態では、第１の核酸分子の切断領域に含有される切断部位は、化学法、酵素法、又は光化学法により、制御切断が実施されうる部位である。ある特定の実施形態では、切断部位は、酵素的切断部位である。一部の実施形態では、切断部位は、ＵＳＥＲ酵素の切断部位（ＵＵＵ）である。
一部の実施形態では、第１の核酸分子の切断領域は、キャリア配列の第１の固定化配列に含有される切断部位と異なる。
ある特定の実施形態では、核酸アレイは、第２の態様において記載された方法により調製される。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、鋳型としてのキャリア配列の相補性配列の増幅により形成される増幅産物であり、増幅は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ増幅、多重鎖置換増幅（ＭＤＡ）、又はエマルジョンＰＣＲ増幅から選択される。
ある特定の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢである。ある特定の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用するローリングサークル増幅により形成されるＤＮＢである。
ある特定の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用するブリッジＰＣＲ増幅により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、鋳型としてのキャリア配列の相補性配列のエマルジョンＰＣＲ増幅により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用することによる多重鎖置換増幅により形成されるＤＮＡクラスターである。
一部の実施形態では、キャリア配列は、捕捉配列鋳型の下流、及び第１の固定化配列の上流に配置された、ＵＭＩ配列の相補体をさらに含み、ＵＭＩ配列の相補体は、ＵＭＩ配列に対して、相補性であり、ＵＭＩ配列は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００、５つ～５０、１０など、５つ～２０）のヌクレオチドＮから構成されるヌクレオチド配列であり、各Ｎは、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つであり；
第１の核酸分子の、キャリア配列の相補性領域は、捕捉配列の上流、及び第１の固定化配列の相補体の下流に配置されたＵＭＩ配列をさらに含む。
第１の核酸分子の、キャリア配列の相補性領域は、捕捉配列の上流、及び第１の固定化配列の相補体の下流に配置されたＵＭＩ配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ＵＭＩ配列の相補体は、位置決め配列と、捕捉配列鋳型との間に、又は第１の固定化配列と、位置決め配列との間に配置される。
一部の実施形態では、各種類のキャリア配列の各コピー（すなわち、同じ位置決め配列を含むキャリア配列）は、異なるＵＭＩ配列の相補体を有する。これに対応して、各コピーのキャリア配列とハイブリダイズされた、第１の核酸分子（捕捉プローブ）もまた、異なるＵＭＩ配列を有する。
一部の実施形態では、キャリア配列は、キャリア配列の第１の固定化配列に含有される切断部位を介して、核酸アレイから除去される。このような実施形態では、核酸アレイは、複数種類の捕捉プローブ（第１の核酸分子）が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類の捕捉プローブ（第１の核酸分子）は、アレイにおける異なる位置を占め、捕捉プローブ（第１の核酸分子）は、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するように配向されており、各種類の捕捉プローブ（第１の核酸分子）は、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、位置決め配列の相補体及び捕捉配列を含み、
結合性領域は、固体支持体の表面へのライゲーションが可能なリンカーを含み；
切断領域は、切断部位を含み；
位置決め配列は、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応し；
捕捉配列は、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（１ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（１ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含む。
結合性領域は、固体支持体の表面へのライゲーションが可能なリンカーを含み；
切断領域は、切断部位を含み；
位置決め配列は、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応し；
捕捉配列は、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（１ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（１ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含む。
一部の実施形態では、前記各種類の捕捉プローブの各捕捉プローブ（すなわち、同じ位置決め配列／位置決め配列の相補体を含む捕捉プローブ）は、異なるＵＭＩ配列を有し、ＵＭＩ配列は、捕捉配列の上流、及び切断領域の下流に配置される。一部の実施形態では、ＵＭＩ配列は、捕捉配列の５’末端に、例えば、捕捉配列と、位置決め配列の相補体との間に配置される。他の実施形態では、ＵＭＩ配列は、位置決め配列の相補体の５’末端に、例えば、切断領域と、位置決め配列の相補体との間に配置される。
一部の実施形態では、前記各種類のキャリア配列（すなわち、同じ位置決め配列を含むキャリア配列）、又は各種類の捕捉プローブ（すなわち、同じ位置決め配列／位置決め配列の相補体を含む捕捉プローブ）は、固体支持体の表面における直径を１マイクロメートル未満、例えば、約９００ナノメートル、約８００ナノメートル、約７００ナノメートル、約６００ナノメートル、又は約５００ナノメートルとする領域（すなわち、活性領域）を占める。ある特定の実施形態では、前記各種類のキャリア配列、又は各種類の捕捉プローブは、直径を約５００ナノメートルとする活性領域を有する。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、チップである。一部の実施形態では、固体支持体は、シーケンシングプラットフォームとして使用されうる。一部の実施形態では、固体支持体は、ＢＧＩＳＥＱ－５００プラットフォームなどのシーケンシングチップ（ＭＧＩ）である。一部の実施形態では、固体支持体は、例えば、中国特許第１０３１８０４９６号において記載されている方法により得られうる、高密度アレイチップである。
一部の実施形態では、第１の固定化配列は、１０ｂｐを超えるか、又は２０ｂｐを超えるなど、１ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、第１の固定化配列は、２０～８０ｂｐなど、２０～１００ｂｐの長さを有する。
一部の実施形態では、位置決め配列は、１０ｂｐを超えるなど、１ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、位置決め配列は、１０～５０ｂｐなど、１０～３０ｂｐなど、２０ｂｐなど、１０～１００ｂｐの長さを有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズすることが可能な配列を含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列は、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリＴオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む。
一部の実施形態では、捕捉配列は、１ｂｐを超える長さを有する。一部の実施形態では、捕捉配列は、１０～５０ｂｐなど、１０～３０ｂｐなど、１～１００ｂｐの長さである。
検出法
第６の態様では、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）第３の態様に従う核酸アレイを用意するか、又は第１の態様に従う方法により、核酸アレイを得るステップであり、
核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類のキャリア配列を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み；
キャリア配列の各コピーが、そのコピーハイブリダイズされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を含み、第１の核酸分子と、第２の核酸分子とが、互いとライゲーションされず；
第１の核酸分子が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体を含み、
第２の核酸分子が、試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、第２の核酸分子の捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、核酸アレイにおける、キャリア配列の位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）（ｉ）ハイブリダイズされている、第１の核酸分子及び第２の核酸分子を、キャリア配列の各コピーへとライゲーションする（例えば、リガーゼを使用して）ステップであり、
プライマー伸長を可能とする条件下で、ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びに捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらし、捕捉された核酸分子とハイブリダイズする鎖が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するステップ；並びに／又は、
プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉された核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びにライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、捕捉され、伸長された核酸分子をもたらし、捕捉され、伸長された核酸分子が、空間情報タグとしての、位置決め配列を有するステップ；
代替的に、（ｉｉ）プライマー伸長を可能とする条件下で、第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長された第２の核酸分子をもたらすステップであり、伸長された第２の核酸分子が、捕捉された核酸の相補性配列を含み；第１の核酸分子へとライゲーションされている、伸長された第２の核酸分子が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するように、キャリア配列の各コピーへとハイブリダイズされている、第１の核酸分子と、伸長された第２の核酸分子とをライゲーションする（例えば、リガーゼを使用して）ステップ；
（４）空間情報タグを伴う核酸分子の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、位置決め配列又はその相補鎖、及び捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法を提供する。
第６の態様では、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）第３の態様に従う核酸アレイを用意するか、又は第１の態様に従う方法により、核酸アレイを得るステップであり、
核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類のキャリア配列を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み；
キャリア配列の各コピーが、そのコピーハイブリダイズされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を含み、第１の核酸分子と、第２の核酸分子とが、互いとライゲーションされず；
第１の核酸分子が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体を含み、
第２の核酸分子が、試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、第２の核酸分子の捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、核酸アレイにおける、キャリア配列の位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）（ｉ）ハイブリダイズされている、第１の核酸分子及び第２の核酸分子を、キャリア配列の各コピーへとライゲーションする（例えば、リガーゼを使用して）ステップであり、
プライマー伸長を可能とする条件下で、ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びに捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらし、捕捉された核酸分子とハイブリダイズする鎖が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するステップ；並びに／又は、
プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉された核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びにライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、捕捉され、伸長された核酸分子をもたらし、捕捉され、伸長された核酸分子が、空間情報タグとしての、位置決め配列を有するステップ；
代替的に、（ｉｉ）プライマー伸長を可能とする条件下で、第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長された第２の核酸分子をもたらすステップであり、伸長された第２の核酸分子が、捕捉された核酸の相補性配列を含み；第１の核酸分子へとライゲーションされている、伸長された第２の核酸分子が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するように、キャリア配列の各コピーへとハイブリダイズされている、第１の核酸分子と、伸長された第２の核酸分子とをライゲーションする（例えば、リガーゼを使用して）ステップ；
（４）空間情報タグを伴う核酸分子の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、位置決め配列又はその相補鎖、及び捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法を提供する。
このような実施形態では、ステップ（２）において、標的核酸が捕捉される前に、第１の核酸分子が、核酸アレイにおける、第２の核酸分子とライゲーションされていない。
第７の態様では、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）第１の態様に従う核酸アレイを用意するか、又は第３の態様に従う方法により、核酸アレイを得るステップであり、
核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類のキャリア配列を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み；
キャリア配列の各コピーが、そのコピーとハイブリダイズされた、第１の核酸分子を含み、第１の核酸分子が、第２の核酸分子へとライゲーションされており；
第１の核酸分子が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体を含み、
第２の核酸分子が、試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、第２の核酸分子の捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、核酸アレイにおける、キャリア配列の位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）（ｉｉｉ）プライマー伸長を可能とする条件下で、ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びに捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、捕捉された核酸分子とハイブリダイズされた鎖が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するステップ；並びに／又は
捕捉され、伸長された核酸分子をもたらすように、プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉された核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びにライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施するステップであり、捕捉され、伸長された核酸配列が、空間情報タグとしての、位置決め配列を有するステップ；
（４）空間情報タグを伴う核酸分子の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、位置決め配列又はその相補鎖、及び捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法を提供する。
（１）第１の態様に従う核酸アレイを用意するか、又は第３の態様に従う方法により、核酸アレイを得るステップであり、
核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類のキャリア配列を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み；
キャリア配列の各コピーが、そのコピーとハイブリダイズされた、第１の核酸分子を含み、第１の核酸分子が、第２の核酸分子へとライゲーションされており；
第１の核酸分子が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体を含み、
第２の核酸分子が、試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、第２の核酸分子の捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、核酸アレイにおける、キャリア配列の位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）（ｉｉｉ）プライマー伸長を可能とする条件下で、ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びに捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、捕捉された核酸分子とハイブリダイズされた鎖が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するステップ；並びに／又は
捕捉され、伸長された核酸分子をもたらすように、プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉された核酸分子を、プライマーとして使用すること、並びにライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施するステップであり、捕捉され、伸長された核酸配列が、空間情報タグとしての、位置決め配列を有するステップ；
（４）空間情報タグを伴う核酸分子の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、位置決め配列又はその相補鎖、及び捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法を提供する。
このような実施形態では、ステップ（２）において、標的核酸が捕捉される前に、第１の核酸分子は、核酸アレイにおける、第２の核酸分子へとライゲーションされている。
第６の態様又は第７の態様の方法についての、ある特定の実施形態では、キャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢであるか、又はキャリア配列の複数のコピーは、キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡクラスターである。
第６の態様又は第７の態様の方法についての、ある特定の実施形態では、キャリア配列及び第１の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡである。ある特定の実施形態では、第２の核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡである。
第８の態様では、本発明は、試料における核酸の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）第５の態様に従う核酸アレイを用意するか、又は第２の態様に従う方法により、核酸アレイを得るステップであり、核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類のキャリア配列を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み；
キャリア配列の各コピーが、そのコピーとハイブリダイズされた、第１の核酸分子を含み、第１の核酸分子が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体、及び試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、第１の核酸分子の捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、核酸アレイにおける、第１の核酸分子の位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）プライマー伸長を可能とする条件下で、第１の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、捕捉された核酸分子とハイブリダイズさせた鎖が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するステップ；
（４）空間情報タグを伴う核酸分子の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、位置決め配列又はその相補鎖、及び捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法を提供する。
（１）第５の態様に従う核酸アレイを用意するか、又は第２の態様に従う方法により、核酸アレイを得るステップであり、核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類のキャリア配列を含み、各種類のキャリア配列が、アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、キャリア配列の複数のコピーを含み；
キャリア配列の各コピーが、そのコピーとハイブリダイズされた、第１の核酸分子を含み、第１の核酸分子が、アレイにおける、当該種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体、及び試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、第１の核酸分子の捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、核酸アレイにおける、第１の核酸分子の位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）プライマー伸長を可能とする条件下で、第１の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、捕捉された核酸分子とハイブリダイズさせた鎖が、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するステップ；
（４）空間情報タグを伴う核酸分子の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、位置決め配列又はその相補鎖、及び捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法を提供する。
一部の実施形態では、ステップ（２）の前に、方法は、キャリア配列の第１の固定化配列に含有される切断部位において、切断を実施して、キャリア配列を消化し、同時に、第１の核酸分子（捕捉プローブ）を、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップをさらに含む。このような実施形態では、核酸アレイは、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類の捕捉プローブを含み、各種類の捕捉プローブは、アレイにおける異なる位置を占め、捕捉プローブは、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応する、位置決め配列の相補体、及び試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含む。
一部の実施形態では、方法は、
（２）被験試料における核酸が、捕捉プローブの捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、アレイにおける、捕捉プローブの位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉プローブを、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施するステップであり、結果として得られる伸長産物が、空間情報タグとしての位置決め配列の相補体、及び捕捉された核酸分子の相補性配列を含み、これにより、空間情報タグを伴うＤＮＡ分子を作出し；任意選択で、空間情報タグを伴うＤＮＡ分子の相補鎖を作出するステップ、及び／又は、任意選択で、空間情報タグを伴うＤＮＡ分子を増幅するステップ；
（４）空間情報タグを伴うＤＮＡ分子、及び／又はそれらの相補体若しくは単位複製配列の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、空間情報タグ又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
をさらに含む。
（２）被験試料における核酸が、捕捉プローブの捕捉配列にアニーリングし、核酸の位置が、アレイにおける、捕捉プローブの位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉プローブを、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施するステップであり、結果として得られる伸長産物が、空間情報タグとしての位置決め配列の相補体、及び捕捉された核酸分子の相補性配列を含み、これにより、空間情報タグを伴うＤＮＡ分子を作出し；任意選択で、空間情報タグを伴うＤＮＡ分子の相補鎖を作出するステップ、及び／又は、任意選択で、空間情報タグを伴うＤＮＡ分子を増幅するステップ；
（４）空間情報タグを伴うＤＮＡ分子、及び／又はそれらの相補体若しくは単位複製配列の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、空間情報タグ又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列情報を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
をさらに含む。
第８の態様の方法についての、一部の実施形態では、第１の核酸分子、及び捕捉プローブは、一本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡ分子である。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つの方法についての、ある特定の実施形態では、核酸の空間情報は、核酸の位置、分布、及び／又は発現を含む。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つの方法についての、ある特定の実施形態では、試料は、組織切片などの組織試料である。ある特定の実施形態では、組織切片は、固定組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、又は急速冷凍組織から調製される。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つの方法についての、ある特定の実施形態では、方法は、非診断的目的のために使用される。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つにおいて記載される方法についての、一部の実施形態では、任意の核酸解析法は、ステップ（５）において使用されうる。ある特定の実施形態では、このステップは、シーケンシングを含みうる。一部の実施形態では、配列特異的解析法が使用されうる。例えば、例えば、位置決めドメイン、及び／又は特定の標的配列（例えば、検出される、特定の標的ＤＮＡ）に特異的なプライマーを使用して、配列特異的増幅反応が実施されうる。例示的な解析法は、配列特異的ＰＣＲ反応である。したがって、ある特定の実施形態では、このステップは、配列特異的ＰＣＲ反応を含みうる。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つにおいて記載される方法についての、一部の実施形態では、ステップ（５）において得られた配列解析情報は、試料における核酸の空間情報（すなわち、位置情報）を得るのに使用されうる。一部の実施形態では、この空間情報は、決定される配列解析情報の性質に由来しうる、例えば、この空間情報は、使用される組織試料の文脈で、それ自体、空間情報を提供しうる、特定の核酸の存在を明らかにしうる、及び／又は空間情報（例えば、空間的局在）は、シーケンシング情報とカップリングされた、アレイにおける組織試料の位置に由来しうる。したがって、方法は、例えば、位置決めタグ、及び位置決めタグの、組織試料における位置との相関により、単に、配列解析情報を、組織試料における位置と相関させるステップを伴いうる。一部の実施形態では、空間情報は、配列解析データを、組織試料についての画像と相関させることにより、簡便に得られうる。したがって、このような実施形態では、第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つの方法は、ステップ（６）：ステップ（５）において得られた配列解析情報を、試料についての画像と相関させるステップであり、試料が、ステップ（３）の前に、又はこの後でイメージングされるステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料のイメージングは、光学顕微鏡法、明視野顕微鏡法、暗視野顕微鏡法、位相差顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、反射顕微鏡法、干渉顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、又はこれらの組合せを使用する。
第６の態様の方法についての、ある特定の実施形態では、方法は、試料におけるトランスクリプトームを検出するのに使用される。このような実施形態では、ステップ（３）（ｉ）において、ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、逆転写プライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、前記ｃＤＮＡ分子は、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有し、任意選択で、ｃＤＮＡ分子は、増幅されるか；又はステップ（３）（ｉｉ）において、第２の核酸分子を、逆転写プライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有するｃＤＮＡ分子を作出するように、第１の核酸分子と、各キャリア配列とハイブリダイズされたｃＤＮＡ分子とがライゲーションされ（例えば、リガーゼを使用して）、任意選択で、ｃＤＮＡ分子が増幅され；ステップ（４）において、ｃＤＮＡ分子及び／又はそれらの単位複製配列の少なくとも一部が、アレイの表面から放出され、放出される核酸分子が、ｃＤＮＡ分子又はその単位複製配列の第１の鎖及び／又は第２の鎖であることが可能であり、一部が、空間情報配列又はその相補鎖を含む。一部の実施形態では、ステップ（１）において、捕捉配列は、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
第７の態様の方法についての、ある特定の実施形態では、方法は、試料におけるトランスクリプトームを検出するのに使用される。このような実施形態では、ステップ（３）（ｉｉｉ）において、ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、逆転写プライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、ｃＤＮＡ分子は、空間情報タグとして、第１の核酸分子に含有された、位置決め配列の相補体を有し、任意選択で、ｃＤＮＡ分子が増幅され；ステップ（４）において、ｃＤＮＡ分子及び／又はそれらの単位複製配列の少なくとも一部が、アレイの表面から放出され、放出される核酸分子が、ｃＤＮＡ分子又はその単位複製配列の第１の鎖及び／又は第２の鎖であることが可能であり、一部が、空間情報配列又はその相補鎖を含む。一部の実施形態では、ステップ（１）において、捕捉配列は、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
第８の態様の方法についての、ある特定の実施形態では、方法は、試料におけるトランスクリプトームを検出するのに使用される。このような実施形態では、ステップ（３）において、捕捉プローブを、ＲＴプライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、ｃＤＮＡ分子は、空間情報タグを有し、任意選択で、ｃＤＮＡ分子が増幅され；ステップ（４）において、ｃＤＮＡ分子及び／又はそれらの単位複製配列の少なくとも一部が、アレイの表面から放出され、放出される核酸分子が、ｃＤＮＡ分子又はその単位複製配列の第１の鎖及び／又は第２の鎖であることが可能であり、一部が、空間情報タグ配列又はその相補鎖を含む。一部の実施形態では、ステップ（１）において、捕捉配列は、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列を含む。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つの方法についての、一部の実施形態では、空間情報タグを伴う核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）、又は空間情報タグを伴うｃＤＮＡ分子が、アレイの表面から放出される前に、又はこの後で、ｃＤＮＡの相補鎖又は第２の鎖が作出される。
第２の鎖であるＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を作出するためのステップは、アレイにおいてｉｎ ｓｉｔｕで、第２の鎖の合成の別個のステップとして、又は増幅反応の最初のステップにおいて実施される場合もある。代替的に、第１の鎖であるＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡ（すなわち、捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより作出される鎖）が、アレイから放出される場合があり、次いで、第２の鎖の合成が、例えば、別個のステップとしてであれ、増幅反応においてであれ、溶液において実行される反応において実施される場合がある。
第２の鎖の合成が、アレイにおいて（すなわち、ｉｎ ｓｉｔｕで）実施される場合、方法は、第２の鎖の合成の前に、例えば、ＲＮＡ消化酵素（ＲＮアーゼ）例えば、ＲＮアーゼＨを使用することにより、捕捉された核酸分子（例えば、ＲＮＡ）を除去する、任意選択のステップを含みうる。当技術分野では、捕捉された核酸分子を除去するための手順が周知であり、記載されている。しかし、除去ステップは、一般に不要であり、大半の場合に、ＲＮＡは、自然に分解される。アレイから試料を除去するステップは、一般に、アレイから、ＲＮＡもまた除去する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）の第２の鎖は、単一の反応で作製され、第２の鎖の合成は、当技術分野で公知である、任意の適切な方法により実施されうる。例えば、第１の鎖を、鋳型として使用する、ＤＮＡ合成反応を実施するように、アレイ基質から放出される、第１の鎖であるｃＤＮＡは、ランダムプライマー、例えば、ヘキサマープライマー、及びＤＮＡポリメラーゼ、例えば、鎖置換ポリメラーゼと共にインキュベートされうる。したがって、ある特定の実施形態では、相補鎖又は第２の鎖の合成は、ランダムプライマー、及び鎖置換ポリメラーゼを使用する。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つに従う方法についての、一部の実施形態では、配列解析の前に、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）、又は空間情報タグを伴うｃＤＮＡ分子を増幅するステップが、さらに含まれる。一部の実施形態では、増幅ステップは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）、若しくは空間情報タグを伴うｃＤＮＡ分子が、アレイから放出された後で実施されるか、又は増幅ステップは、アレイにおいてｉｎ ｓｉｔｕで（すなわち、第１の核酸分子及び／若しくはキャリア配列及び／若しくは捕捉プローブが、固体支持体の表面へと、なおもライゲーションされている時点において）実施される。ある特定の実施形態では、増幅ステップは、ＰＣＲを含む。
第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つにおいて記載される方法についての、一部の実施形態では、ステップ（４）において、分子は、以下の方法：（ｉ）核酸切断法；（ｉｉ）核酸変性法；及び／又は（ｉｉｉ）物理的方法により、アレイの表面から放出される。ある特定の実施形態では、分子は、熱水又は緩衝液を、固体支持体へと適用することにより放出される。
一部の実施形態では、シーケンシングの前に、放出された分子を精製するステップがさらに含まれる。
一部の実施形態では、試料が、アレイと接触させられた後、及びステップ（３）の前に、試料に水を補充するステップが、さらに含まれる。
一部の実施形態では、ステップ（４）の前に、方法は、アレイを洗浄して、試料（例えば、組織）の残留物を除去するステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、アレイは、アレイにおける試料を方向付ける、少なくとも１つの配向マーカーを含む。
一部の実施形態では、ステップ（５）において、配列解析ステップは、シーケンシングステップを含む。一部の実施形態では、シーケンシングステップは、可逆性のダイターミネーターに基づくシーケンシング反応を含む。
本発明の第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つに従い、核酸の空間情報を検出するための方法は、ＲＮＡ検出、トランスクリプトーム解析、ＤＮＡ検出、ゲノム解析などのために使用されうる。空間情報は、トランスクリプトミクス及びゲノミクスに関連する調査研究に対して、大きな重要性を有し、とりわけ、正常細胞若しくは正常組織と、罹患細胞若しくは罹患組織とについての比較研究、又は疾患過程における、トランスクリプトーム若しくはゲノムの変化についての研究など、異なる細胞又は組織領域における、トランスクリプトーム又はゲノムの変動の研究において有用である。
例えば、アルツハイマー病についての病態生理学的解析は、アルツハイマー病の病理過程が、ニューロンとグリア細胞との相互作用を伴うことを示し、関連するトランスクリプトーム研究及びエピゲノム研究もまた、アルツハイマー病を伴う患者の脳が、ニューロン機能の重度の損傷、及び自然免疫応答における異常を有することを見出している。しかし、集団レベルの調査研究は、とりわけ、希少な細胞型について、細胞間及び細胞集団内の変化の複雑性を明らかにできない。単一細胞レベルにおける、通常の調査研究は、同じ期間の、異なる組織領域における、特異的細胞型の特徴、及び神経変性時における、細胞組成の変化を識別できない。したがって、疾患の発症機序及び発生様態を、さらに明らかにするために、空間的次元を伴う、単一細胞トランスクリプトーム情報を得ることが火急的に必要である。
本発明の第６の態様～第８の態様のうちのいずれか１つに従い、核酸の空間情報を検出するための方法は、アルツハイマー病の進行時に、異なる領域において、特異的細胞型の変化の検出を実現するよう、正確な位置情報を含むトランスクリプトーム結果が得られるように、脳組織試料の異なる領域における核酸分子を、チップへとライゲーションされた位置タグを伴う捕捉配列を介して、チップへと固定化し、シーケンシングを実施することができる。特に、本発明のチップにおける、ＤＮＢ又はＤＮＡクラスターの活性領域が、ナノメートル単位の精細なグレードであるのに対し、細胞の直径は、約１２ｕｍであるので、本発明のチップは、細胞内分解能を伴う、空間的位置決め情報を得ることができる。
本発明はまた、以下の例示的な実施形態も含む：
項目１．試料における生体分子（例えば、核酸）の空間情報を検出するのに使用される核酸アレイを作出するための方法であって、以下のステップ：
（１）環状核酸鋳型を用意するステップであり、環状核酸鋳型が、１種類の捕捉プローブの鋳型配列を含み、鋳型配列が、５’から３’の方向に、リンカー領域、空間タグ領域、及び捕捉領域を含み；
リンカー領域が、切断部位を含み、切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択される場合があり；
空間タグ領域が、空間タグ配列を含み、空間タグ配列が、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応し；
捕捉領域が、試料における生体分子（例えば、核酸）を捕捉することが可能な捕捉配列を含み；捕捉配列が、（１ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（１ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的分子（例えば、標的核酸）に特異的な配列を含む
ステップ；
（２）環状核酸鋳型を、鋳型として使用することにより、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実施して、鋳型配列の相補性配列（すなわち、鋳型と相補的な配列）のコンカテマーにより形成されるＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）を得るステップ；
（３）ＤＮＢを、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップ；
（４）プローブプライマーを用意し、ＤＮＢに含有される、鋳型と相補的な配列を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、鋳型と相補的な配列へとハイブリダイズされた鎖が、捕捉プローブであり；任意選択で、伸長産物を増幅し；プローブプライマーが、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及びプライマーリンカー領域を含み；
結合性領域が、固体支持体の表面へとへとライゲーションされうるリンカーを含み；
切断領域が、切断部位を含み；
プライマーリンカー領域が、ＤＮＢに含有される、鋳型と相補的な配列（すなわち、鋳型配列のリンカー領域の相補性配列）のリンカー領域の配列の全部又は一部と相補性であり、プローブプライマーが、プライマーとして機能し、伸長反応を誘発することを可能とするように、遊離３’末端を有し；好ましくは、プライマーリンカー領域が、鋳型配列のリンカー領域の配列又はその断片を含む
ステップ；
（５）プローブプライマーを、固体支持体の表面へとライゲーションするステップであり、ステップ（４）及び（５）が、任意の順序で実施されるステップ；
（６）ステップ（４）における伸長産物が、鋳型ＤＮＢから分離され、これにより、伸長産物を形成し、これにより、捕捉プローブを、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップであり、
好ましくは、環状核酸鋳型、ＤＮＢ、及び捕捉プローブが、ＤＮＡであり；
好ましくは、複数種類の環状核酸鋳型が、ステップ（１）において用意され、各種の環状核酸鋳型が、複数種類の捕捉プローブが表面へと接合された、固体支持体（例えば、チップ）を得るように、捕捉プローブの異なる鋳型配列を含む
ステップ
を含む方法。
項目１．試料における生体分子（例えば、核酸）の空間情報を検出するのに使用される核酸アレイを作出するための方法であって、以下のステップ：
（１）環状核酸鋳型を用意するステップであり、環状核酸鋳型が、１種類の捕捉プローブの鋳型配列を含み、鋳型配列が、５’から３’の方向に、リンカー領域、空間タグ領域、及び捕捉領域を含み；
リンカー領域が、切断部位を含み、切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択される場合があり；
空間タグ領域が、空間タグ配列を含み、空間タグ配列が、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応し；
捕捉領域が、試料における生体分子（例えば、核酸）を捕捉することが可能な捕捉配列を含み；捕捉配列が、（１ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（１ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的分子（例えば、標的核酸）に特異的な配列を含む
ステップ；
（２）環状核酸鋳型を、鋳型として使用することにより、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実施して、鋳型配列の相補性配列（すなわち、鋳型と相補的な配列）のコンカテマーにより形成されるＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）を得るステップ；
（３）ＤＮＢを、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップ；
（４）プローブプライマーを用意し、ＤＮＢに含有される、鋳型と相補的な配列を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、鋳型と相補的な配列へとハイブリダイズされた鎖が、捕捉プローブであり；任意選択で、伸長産物を増幅し；プローブプライマーが、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及びプライマーリンカー領域を含み；
結合性領域が、固体支持体の表面へとへとライゲーションされうるリンカーを含み；
切断領域が、切断部位を含み；
プライマーリンカー領域が、ＤＮＢに含有される、鋳型と相補的な配列（すなわち、鋳型配列のリンカー領域の相補性配列）のリンカー領域の配列の全部又は一部と相補性であり、プローブプライマーが、プライマーとして機能し、伸長反応を誘発することを可能とするように、遊離３’末端を有し；好ましくは、プライマーリンカー領域が、鋳型配列のリンカー領域の配列又はその断片を含む
ステップ；
（５）プローブプライマーを、固体支持体の表面へとライゲーションするステップであり、ステップ（４）及び（５）が、任意の順序で実施されるステップ；
（６）ステップ（４）における伸長産物が、鋳型ＤＮＢから分離され、これにより、伸長産物を形成し、これにより、捕捉プローブを、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップであり、
好ましくは、環状核酸鋳型、ＤＮＢ、及び捕捉プローブが、ＤＮＡであり；
好ましくは、複数種類の環状核酸鋳型が、ステップ（１）において用意され、各種の環状核酸鋳型が、複数種類の捕捉プローブが表面へと接合された、固体支持体（例えば、チップ）を得るように、捕捉プローブの異なる鋳型配列を含む
ステップ
を含む方法。
項目２．リンカー領域に含有される切断部位が、ニッキング酵素のための切断部位であり；
好ましくは、ニッキング酵素が、ＵＳＥＲ、ＢａｍＨＩ、及びＢｍｔＩから選択される、
項目１に記載の方法。
好ましくは、ニッキング酵素が、ＵＳＥＲ、ＢａｍＨＩ、及びＢｍｔＩから選択される、
項目１に記載の方法。
項目３．リンカー領域が、シーケンシングプライマーのハイブリダイゼーション領域、及び／又は増幅プライマーのハイブリダイゼーション領域をさらに含み；シーケンシングプライマーのハイブリダイゼーション領域が、シーケンシングプライマーへのアニーリング、及びシーケンシング反応の誘発を可能とし、増幅プライマーのハイブリダイゼーション領域が、増幅プライマーへのアニーリング、並びに伸長反応及び増幅反応の誘発を可能とする、
項目１又は２に記載の方法。
項目１又は２に記載の方法。
項目４．ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることが可能な配列を含み；
好ましくは、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列が、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含み；
好ましくは、ポリＴオリゴヌクレオチド配列が、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む、
項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列が、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含み；
好ましくは、ポリＴオリゴヌクレオチド配列が、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む、
項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目５．鋳型配列が、捕捉領域の上流、及びリンカー領域の下流に配置された、プローブタグ領域をさらに含み、プローブタグ領域が、修飾塩基から構成された、プローブタグと相補的な配列を含み、修飾塩基が、複数種類の主要塩基（例えば、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｕ）との水素結合により、相補性対合が可能であり；
好ましくは、プローブタグ領域が、空間タグ領域と、捕捉領域との間に、又はリンカー領域と、空間タグ領域との間に配置され；
好ましくは、プローブタグと相補的な配列が、複数の（例えば、少なくとも１０の）イノシンを含む、
項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、プローブタグ領域が、空間タグ領域と、捕捉領域との間に、又はリンカー領域と、空間タグ領域との間に配置され；
好ましくは、プローブタグと相補的な配列が、複数の（例えば、少なくとも１０の）イノシンを含む、
項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
項目６．以下の特徴：
（ｉ）リンカー領域が、１ｂｐを超える、例えば、１０ｂｐを超えるか、又は２０ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、リンカー領域が、２０～１００ｂｐの長さを有すること；
（ｉｉ）空間タグ領域が、１ｂｐを超える、例えば、１０ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、空間タグ領域が、１０～１００ｂｐの長さを有すること；
（ｉｉｉ）捕捉領域が、１ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、捕捉領域が、１～１００ｂｐの長さを有すること；
（ｉｖ）プローブタグ領域が、１ｂｐを超える、例えば、５ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、プローブタグ領域が、５～１００ｂｐの長さを有すること
のうちの１つ又は複数を有する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）リンカー領域が、１ｂｐを超える、例えば、１０ｂｐを超えるか、又は２０ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、リンカー領域が、２０～１００ｂｐの長さを有すること；
（ｉｉ）空間タグ領域が、１ｂｐを超える、例えば、１０ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、空間タグ領域が、１０～１００ｂｐの長さを有すること；
（ｉｉｉ）捕捉領域が、１ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、捕捉領域が、１～１００ｂｐの長さを有すること；
（ｉｖ）プローブタグ領域が、１ｂｐを超える、例えば、５ｂｐを超える長さを有し；好ましくは、プローブタグ領域が、５～１００ｂｐの長さを有すること
のうちの１つ又は複数を有する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
項目７．固体支持体が、チップであり；
好ましくは、固体支持体が、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用されうる、
項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、固体支持体が、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用されうる、
項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
項目８．ステップ（４）において、対応する捕捉プローブに含有された空間タグ配列の配列情報を得るように、プライマー伸長反応が実施される間に、空間タグ配列の相補性配列がシーケンシングされる、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
項目９．ステップ（４）の前に、ＤＮＢに含有された、空間タグ配列の相補性配列をシーケンシングするステップがさらに含まれ；
好ましくは、シーケンシングが完了した後で、洗浄により、シーケンシングのために合成鎖へと付加されたｄＮＴＰが除去される、
項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、シーケンシングが完了した後で、洗浄により、シーケンシングのために合成鎖へと付加されたｄＮＴＰが除去される、
項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
項目１０．リンカーが、活性化基（例えば、ＮＨ２）とカップリングすることが可能な連結基であり、固体支持体が、表面において、活性化基（例えば、ＮＨ２）により修飾され；
好ましくは、リンカーが、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ、又は－ＮＨＳを含み；
好ましくは、リンカーが、
であり、
が、固体支持体の表面へと接合されている、
項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、リンカーが、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ、又は－ＮＨＳを含み；
好ましくは、リンカーが、
であり、
が、固体支持体の表面へと接合されている、
項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１．切断領域に含有される切断部位が、制御切断が、化学法、酵素法、又は光化学法により実施されうる部位であり；
好ましくは、切断部位が、酵素的切断部位であり；
好ましくは、切断領域に含有される切断部位と、リンカー領域とが異なる、
項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、切断部位が、酵素的切断部位であり；
好ましくは、切断領域に含有される切断部位と、リンカー領域とが異なる、
項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２．増幅が、ＰＣＲを含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項目１３．項目１～１２のいずれか一項に記載の方法により調製される核酸アレイ。
項目１４．試料における生体分子（例えば、核酸）の空間情報を検出するための核酸アレイであって、複数種類の捕捉プローブが表面へと接合された、固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類の捕捉プローブが、アレイにおける異なる位置を占め、捕捉プローブが、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するように配向されており、各種類の捕捉プローブが、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、空間タグ配列、及び捕捉配列を含み、
結合性領域が、固体支持体の表面へとへとライゲーションされうるリンカーを含み；
切断領域が、切断部位を含み；
空間タグ配列が、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応し；
捕捉配列が、捕捉される生体分子（例えば、核酸）の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（１ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（１ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的分子（例えば、標的核酸）に特異的な配列を含む
核酸アレイ。
結合性領域が、固体支持体の表面へとへとライゲーションされうるリンカーを含み；
切断領域が、切断部位を含み；
空間タグ配列が、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応し；
捕捉配列が、捕捉される生体分子（例えば、核酸）の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（１ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（１ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的分子（例えば、標的核酸）に特異的な配列を含む
核酸アレイ。
項目１５．各種類の捕捉プローブ（すなわち、同じ空間タグ配列を含む捕捉プローブ）のうちの各捕捉プローブが、異なるプローブタグ配列を有し、プローブタグ配列が、捕捉配列の上流、及び切断領域の下流に配置され；
好ましくは、プローブタグ配列が、捕捉配列と、空間タグ配列との間に、又は切断領域と、空間タグ配列との間に配置される、
項目１４に記載の核酸アレイ。
好ましくは、プローブタグ配列が、捕捉配列と、空間タグ配列との間に、又は切断領域と、空間タグ配列との間に配置される、
項目１４に記載の核酸アレイ。
項目１６．各種類の捕捉プローブ（すなわち、同じ空間タグ配列を含む捕捉プローブ）が、固体支持体の表面における直径を１ミクロン未満とする領域（すなわち、活性領域）を占め；
好ましくは、各種類の捕捉プローブが、直径を約５００ナノメートルとする活性領域を占める、
項目１４又は１５に記載の核酸アレイ。
好ましくは、各種類の捕捉プローブが、直径を約５００ナノメートルとする活性領域を占める、
項目１４又は１５に記載の核酸アレイ。
項目１７．固体支持体が、チップであり；
好ましくは、固体支持体が、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用されうる、
項目１４～１６のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
好ましくは、固体支持体が、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用されうる、
項目１４～１６のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
項目１８．項目１～１２のいずれか一項に記載の方法により調製される、項目１４～１７のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
項目１９．試料における生体分子の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）項目１３～１８のいずれか一項に記載の核酸アレイを用意するか、又は項目１～１２のいずれか一項に記載の方法により、核酸アレイを得るステップであり；核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類の捕捉プローブを含み、各種類の捕捉プローブが、アレイにおける異なる位置を占め、捕捉プローブが、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応する空間タグ配列、及び試料における生体分子を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）捕捉プローブの捕捉配列が、被験試料における生体分子に結合し、これにより、生体分子の位置が、核酸アレイにおける捕捉プローブの位置と相関されえ、空間タグにより標識された生体分子がもたらされるように、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）空間タグにより標識された生体分子を、アレイの表面から放出するステップ；並びに
（４）ステップ（３）において放出された生体分子の配列を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法。
（１）項目１３～１８のいずれか一項に記載の核酸アレイを用意するか、又は項目１～１２のいずれか一項に記載の方法により、核酸アレイを得るステップであり；核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類の捕捉プローブを含み、各種類の捕捉プローブが、アレイにおける異なる位置を占め、捕捉プローブが、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応する空間タグ配列、及び試料における生体分子を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）捕捉プローブの捕捉配列が、被験試料における生体分子に結合し、これにより、生体分子の位置が、核酸アレイにおける捕捉プローブの位置と相関されえ、空間タグにより標識された生体分子がもたらされるように、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）空間タグにより標識された生体分子を、アレイの表面から放出するステップ；並びに
（４）ステップ（３）において放出された生体分子の配列を、直接的に、又は間接的に解析するステップ
を含む方法。
項目２０．試料における核酸の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）項目１３～１８のいずれか一項に記載の核酸アレイを用意するか、又は項目１～１２のいずれか一項に記載の方法により、核酸アレイを得るステップであり、核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類の捕捉プローブを含み、各種類の捕捉プローブが、アレイにおける異なる位置を占め、捕捉プローブが、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応する空間タグ配列、及び試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、捕捉プローブの捕捉配列にアニーリングし、これにより、核酸の位置が、アレイにおける、捕捉プローブの位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉プローブを、プライマーとして使用し、捕捉された核酸分子を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施するステップであり、結果として得られる伸長産物が、空間タグ配列、及び捕捉された核酸分子の相補性配列を含み、これにより、空間タグで標識されたＤＮＡ分子をもたらし；任意選択で、空間タグで標識されたＤＮＡ分子の相補鎖をもたらすステップ、及び／又は任意選択で、空間タグで標識されたＤＮＡ分子を増幅するステップ；
（４）空間タグで標識されたＤＮＡ分子、及び／又はそれらの相補鎖若しくは単位複製配列の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、空間タグ配列又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列を、直接的に、又は間接的に解析するステップであり、
好ましくは、核酸の空間情報が、核酸の位置、分布、及び／又は発現を含み；
好ましくは、捕捉プローブが、ＤＮＡ分子であり；
好ましくは、試料が、組織切片などの組織試料であり；
好ましくは、組織切片が、固定組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、又は急速冷凍組織から調製される
ステップ
を含む方法。
（１）項目１３～１８のいずれか一項に記載の核酸アレイを用意するか、又は項目１～１２のいずれか一項に記載の方法により、核酸アレイを得るステップであり、核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類の捕捉プローブを含み、各種類の捕捉プローブが、アレイにおける異なる位置を占め、捕捉プローブが、アレイにおける、当該種類の捕捉プローブの位置に対応する空間タグ配列、及び試料における核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）被験試料における核酸が、捕捉プローブの捕捉配列にアニーリングし、これにより、核酸の位置が、アレイにおける、捕捉プローブの位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、核酸アレイを、被験試料と接触させるステップ；
（３）プライマー伸長を可能とする条件下で、捕捉プローブを、プライマーとして使用し、捕捉された核酸分子を、鋳型として使用して、プライマー伸長反応を実施するステップであり、結果として得られる伸長産物が、空間タグ配列、及び捕捉された核酸分子の相補性配列を含み、これにより、空間タグで標識されたＤＮＡ分子をもたらし；任意選択で、空間タグで標識されたＤＮＡ分子の相補鎖をもたらすステップ、及び／又は任意選択で、空間タグで標識されたＤＮＡ分子を増幅するステップ；
（４）空間タグで標識されたＤＮＡ分子、及び／又はそれらの相補鎖若しくは単位複製配列の少なくとも一部を、アレイの表面から放出するステップであり、一部が、空間タグ配列又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された核酸分子の配列を、直接的に、又は間接的に解析するステップであり、
好ましくは、核酸の空間情報が、核酸の位置、分布、及び／又は発現を含み；
好ましくは、捕捉プローブが、ＤＮＡ分子であり；
好ましくは、試料が、組織切片などの組織試料であり；
好ましくは、組織切片が、固定組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、又は急速冷凍組織から調製される
ステップ
を含む方法。
項目２１．ステップ（５）において、配列解析が、シーケンシング、又は配列特異的ＰＣＲ反応を含む、項目２０に記載の方法。
項目２２．ステップ（６）：ステップ（５）において得られた配列解析情報を、試料についての画像と相関させるステップをさらに含み、試料が、ステップ（３）の前に、又はこの後でイメージングされる、項目２０又は２１に記載の方法。
項目２３．試料におけるトランスクリプトームを検出するために使用され、
ステップ（３）において、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子を合成するように、捕捉プローブが、ＲＴプライマーとして使用され、ｃＤＮＡ分子が、空間タグで標識され、任意選択で、ｃＤＮＡ分子が増幅され；
ステップ（４）において、ｃＤＮＡ分子及び／又はそれらの単位複製配列の少なくとも一部が、アレイの表面から放出され、放出される核酸分子が、ｃＤＮＡ分子又はその単位複製配列の第１の鎖及び／又は第２の鎖であることが可能であり、一部が、空間タグ配列又はその相補鎖を含み；
好ましくは、ステップ（１）において、捕捉配列が、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、
項目２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（３）において、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子を合成するように、捕捉プローブが、ＲＴプライマーとして使用され、ｃＤＮＡ分子が、空間タグで標識され、任意選択で、ｃＤＮＡ分子が増幅され；
ステップ（４）において、ｃＤＮＡ分子及び／又はそれらの単位複製配列の少なくとも一部が、アレイの表面から放出され、放出される核酸分子が、ｃＤＮＡ分子又はその単位複製配列の第１の鎖及び／又は第２の鎖であることが可能であり、一部が、空間タグ配列又はその相補鎖を含み；
好ましくは、ステップ（１）において、捕捉配列が、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、
項目２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
項目２４．空間タグで標識されたＤＮＡ分子又は空間タグで標識されたｃＤＮＡ分子が、アレイの表面から放出される前に、又はこの後で、相補鎖又はｃＤＮＡの第２の鎖がもたらされ；
好ましくは、相補鎖又は第２の鎖の合成が、ランダムプライマー、及び鎖置換ポリメラーゼを使用する、
項目２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、相補鎖又は第２の鎖の合成が、ランダムプライマー、及び鎖置換ポリメラーゼを使用する、
項目２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
項目２５．配列解析の前に、空間タグで標識された、ＤＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子を増幅するステップをさらに含み；
好ましくは、増幅ステップが、空間タグで標識された、ＤＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子が、アレイから放出された後で実施されるか、又は増幅ステップが、アレイにおいてｉｎ ｓｉｔｕで実施され；
好ましくは、増幅ステップが、ＰＣＲを含む、
項目２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、増幅ステップが、空間タグで標識された、ＤＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子が、アレイから放出された後で実施されるか、又は増幅ステップが、アレイにおいてｉｎ ｓｉｔｕで実施され；
好ましくは、増幅ステップが、ＰＣＲを含む、
項目２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
項目２６．配列解析が、放出された分子を精製するステップをさらに含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
項目２７．ステップ（４）の前に、アレイを洗浄して、試料（例えば、組織）の残留物を除去するステップをさらに含む、項目２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
項目２８．ステップ（４）において、分子が、以下の方法：（ｉ）核酸切断法；（ｉｉ）核酸変性法；及び／又は（ｉｉｉ）物理的方法により、アレイの表面から放出され；
好ましくは、分子が、酵素的切断により、捕捉プローブの切断領域から放出される、
項目２０～２７のいずれか一項に記載の方法。
好ましくは、分子が、酵素的切断により、捕捉プローブの切断領域から放出される、
項目２０～２７のいずれか一項に記載の方法。
項目２９．ステップ（６）において、試料が、光学顕微鏡法、明視野顕微鏡法、暗視野顕微鏡法、位相差顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、反射顕微鏡法、干渉顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、又はこれらの組合せを使用することによりイメージングされる、項目２０～２８のいずれか一項に記載の方法。
ここで、本発明は、本発明を限定するのではなく、本発明を例示することが意図される、以下の実施例を参照しながら記載される。
そうでないことが指定されない限りにおいて、実施例で記載される実験及び方法は、基本的に、当技術分野で周知であり、多様な参考文献において記載されている、常套的な方法に従い実施された。加えて、実施例において、具体的条件を伴わない実験及び方法について、これらの実験及び方法は、常套的な条件又は製造元により推奨される条件に従い実行された。製造元の指示を伴わずに使用された試薬又は測定器は、全て、市販の常套的な製品であった。当業者は、実施例が、本発明について、例を目的として記載するものであり、本発明により主張される保護の範囲を限定することを意図するものではないことについて承知している。本明細書で言及される、全ての刊行物及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
実施例１．捕捉チップの調製（１）
１．以下のＤＮＡライブラリーの配列をデザインし、合成した。配列の合成は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより実施された。
１．以下のＤＮＡライブラリーの配列をデザインし、合成した。配列の合成は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより実施された。
５’－リン酸化－ＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡ（リンカーＡ、配列番号１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（位置決め配列の相補体、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴなど、任意の塩基を表した）ＣＴＧＡＴＡＡＧＧＴＣＧＣＣＡ（第２の固定化配列の相補体、配列番号２）ＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴ（リンカーＢ、配列番号３）－３’［配列中、リンカーＡは、第１の固定化配列の相補体の一部及び環状化部位を含み、リンカーＢは、第１の固定化配列の相補体の別の一部、切断部位、及び環状化部位を含んだ］。
２．ｉｎ ｓｉｔｕでのライブラリーの増幅
ＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）の調製：以下の反応系４０ｕｌを調製し、上記のＤＮＡライブラリー８０フェムトモルを添加したが、この場合、ＤＮＢプライマーは、ＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴＴＡＡＧＴＣＧＧＡＴＣＧＴ（配列番号４）の配列を有し、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。
ＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）の調製：以下の反応系４０ｕｌを調製し、上記のＤＮＡライブラリー８０フェムトモルを添加したが、この場合、ＤＮＢプライマーは、ＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴＴＡＡＧＴＣＧＧＡＴＣＧＴ（配列番号４）の配列を有し、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。
上記の反応系を、反応のためのＰＣＲ装置に入れた。反応条件は、以下の通り：９５℃で３分間、４０℃で３分間であり；反応の後、反応系を、氷上に置き、ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキットにおいてＤＮＢを調製するのに要求される、４０ｕｌの混合酵素Ｉ、及び２ｕｌの混合酵素ＩＩのほか、１ｕｌのＡＴＰ（１００ｍＭ母液、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、及び０．１ｕｌのＴ４リガーゼ（ＢＧＩ製）を添加した。十分に混合した後で、上記の反応系を、３０℃のＰＣＲ装置へと移し、２０分間にわたり反応させて、ＤＮＢを形成した。ＢＧＩＳＥＱ５００ ＳＥ５０キットにおいて記載された方法に従い、ＤＮＢを、ＢＧＩＳＥＱ５００シーケンシングチップにロードした。
３．位置決め配列のシーケンシング及び解読：ＢＧＩＳＥＱ５００ ＳＥ５０シーケンシングキットの指示書に従い、位置決め配列を解読し、シーケンシング長を、２５ｂｐとしてシーケンシングする。シーケンシングにより形成されるｆｑファイルは、後の使用のために保存した。
４．固定化捕捉配列：Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより、以下のＤＮＡ配列：５’－リン酸化－ＣＴＧＡＴＡＡＧＧＴＣＧＣＣＡ（第２の固定化配列の相補体、配列番号５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（ＵＭＩ）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ（捕捉配列、配列番号６）－３’［配列中、Ｎは、任意の塩基（例えば、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ）を表した］が合成された。シーケンシングチップを、シーケンサーから取り出し、ＢＧＩＳＥＱ５００ ＳＥ５０キットのＨｏｌｅ ７の切断試薬を、チップへとポンプ注入した（試薬がチップの全体を覆い、気泡が発生していないことを確認した）。チップを、６０℃で静置し、１０分間にわたり、反応を実施した。反応の後、５倍濃度のＳＳＣ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｈｅｎｇｇｏｎｇから購入された）適量を、シーケンシングチップへとポンプ注入して、チップにおける、既存の試薬を置きかえた。捕捉配列を、５倍濃度のＳＳＣで、１ｕＭへと希釈し、チップが、捕捉配列で満たされるように、適量の、希釈された捕捉配列を、チップへと添加した。捕捉配列が、ＤＮＢと、完全にハイブリダイズされるように、室温で、約３０分間にわたり、チップを静置した。
５．チップの分割：調製されたチップを、いくつかの小片へと切り分け、この場合、小片のサイズを、実験の必要に従い調整し、チップを、ｐＨを８．０とする、５０ｍＭのトリス緩衝液に浸漬し、後の使用のために、４℃で保存した。
実施例２．組織ｍＲＮＡの捕捉及びｃＤＮＡの合成
１．凍結組織切片。凍結切片についての標準手順に従い、マウスの小脳組織切片を作製した。
１．凍結組織切片。凍結切片についての標準手順に従い、マウスの小脳組織切片を作製した。
２．ｍＲＮＡの捕捉。組織切片のサイズに従い、実施例１で調製された、適切なサイズのチップを、取り出し、室温で静置した。チップにおける液体を蒸発させた後、組織切片と、組織チョッパーにおけるチップとの温度差により、組織切片を、捕捉チップへと付着させた。付着させられた組織切片を、室温で静置し、５倍濃度のＳＳＣ反応溶液を、チップへと添加し（そして、組織が付着した領域を、完全に覆った）、３０℃で、３０分間にわたり、反応を実施して、組織におけるｍＲＮＡを、チップにおける捕捉領域と、完全にハイブリダイズさせた。
３．ｃＤＮＡの合成。５倍濃度のＳＳＣを使用して、室温で、２回にわたり、チップを洗浄し、以下の逆転写酵素反応系２００ｕｌを調製し、反応溶液を、チップへと添加して、チップを完全に覆い、４２℃で、９０分間～１８０分間にわたり、反応を実施した。ｍＲＮＡは、ポリＴを、プライマーとして使用して、ｃＤＮＡの合成を実施し、ｍＲＮＡの３’末端は、ｃＤＮＡ相補鎖の合成のための、ＴＳＯタグ（ＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣ／ｒＧ／／ｒＧ／／ｉＸＮＡ＿Ｇ／）（配列番号７）を保有した。上記工程の構造概略図を、図１に示した。
４．空間位置決め領域の、捕捉領域へのライゲーション。ｃＤＮＡ合成の後、チップを、５倍濃度のＳＳＣで、２回にわたり洗浄した。以下の反応系１ｍｌを調製し、適切な容量の反応系を、チップへとポンプ注入して、チップが、以下のライゲーション反応液で満たされたことを確認し、図１に示されたニックをライゲーションした。反応は、室温で、３０分間にわたり実施した。反応の後、チップを、５倍濃度のＳＳＣにより、５５℃の温度で、各回５分間ずつ、３回にわたり洗浄した。
５．ｃＤＮＡの放出。ｃＤＮＡの第１の鎖を、チップにおいて合成した後で、適量のホルムアミド溶液を、チップへと添加し、５５℃で、１０分間にわたり反応させて、ｃＤＮＡを、チップから放出した。放出された分子は、図２に示される構造を有した。チップから放出された反応溶液を回収し、２倍濃度のＸＰ磁気ビーズを使用して、ｃＤＮＡ鎖を精製し、最後に、４５ｕｌのＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、産物を回収した。Ｑｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡ検出キットを使用して、一本鎖ｃＤＮＡを、定量的に検出した。
６．ｃＤＮＡの増幅。以下の反応系１００ｕｌを調製した：
上記の反応系を、ＰＣＲ装置に入れ、以下の反応プログラム：９５℃で３分間にわたり、１１サイクル（９８℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、７２℃で３分間）、７２℃で５分間、４℃で無限時間を設定した。反応が完了した後で、ＸＰビーズを使用して、精製し、回収した。Ｑｕｂｉｔキットを使用して、ｄｓＤＮＡの濃度を定量し、２１００を使用して、ｃＤＮＡ断片の分布を検出した。２１００例の検出結果を、図３に示した。ｃＤＮＡの長さは、正常であった。
実施例３．ｃＤＮＡライブラリーの構築及びシーケンシング
１．Ｔｎ５による中断。ｃＤＮＡの濃度に従い、２０ｎｇのｃＤＮＡを、０．５ｕＭのＴｎ５酵素、及び対応する緩衝液（Ｔｎ５酵素のためのコーティング法は、ｓｔＬＦＲライブラリー構築キットに従い実施した）と共に添加し、十分に混合して、２０ｕｌの反応系を形成した。５５℃で１０分間にわたり、反応を実施し、０．１％のＳＤＳ ５ｕｌを添加し、室温で、５分間にわたり、十分に混合して、Ｔｎ５による中断ステップを終了させた。
１．Ｔｎ５による中断。ｃＤＮＡの濃度に従い、２０ｎｇのｃＤＮＡを、０．５ｕＭのＴｎ５酵素、及び対応する緩衝液（Ｔｎ５酵素のためのコーティング法は、ｓｔＬＦＲライブラリー構築キットに従い実施した）と共に添加し、十分に混合して、２０ｕｌの反応系を形成した。５５℃で１０分間にわたり、反応を実施し、０．１％のＳＤＳ ５ｕｌを添加し、室温で、５分間にわたり、十分に混合して、Ｔｎ５による中断ステップを終了させた。
２．ＰＣＲ増幅。以下の反応系１００ｕｌを調製した：
混合した後、反応系を、ＰＣＲ装置に入れ、以下のプログラム：９５℃で３分間、１１サイクル（９８℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、７２℃で３分間）、７２℃で５分間、４℃で無限時間を設定した。反応が完了した後で、ＸＰビーズを使用して、精製し、回収した。Ｑｕｂｉｔキットを使用して、ｄｓＤＮＡ濃度を定量した。
３．シーケンシング。ＤＮＢを調製するために、上記の中断の後で、８０フェムトモルの増幅産物を採取した。以下の反応系４０ｕｌを調製した：
上記の反応系を、反応のためのＰＣＲ装置に入れ、反応条件は、以下の通り：９５℃で３分間、４０℃で３分間であった。反応が完了した後で、反応系を、氷上に置き、ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキットにおいてＤＮＢを調製するのに要求される、４０ｕｌの混合酵素Ｉ、及び２ｕｌの混合酵素ＩＩのほか、１ｕｌのＡＴＰ（１００ｍＭ母液、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．１ｕｌのＴ４リガーゼ（ＢＧＩ製）を添加した。十分に混合した後で、上記の反応系を、３０℃のＰＣＲ装置へと移し、２０分間にわたり反応させて、ＤＮＢを形成した。ＭＧＩＳＥＱ２０００のＰＥ５０キットに記載されている方法に従い、ＤＮＢを、ＭＧＩＳＥＱ２０００のシーケンシングチップにロードし、シーケンシングを、ＰＥ５０シーケンシングモデルに関連する指示書に従い実施し、この場合、第１の鎖のシーケンシングを、２段階に分けた、すなわち、２５ｂｐをシーケンシングし、次いで、１５サイクルにわたる暗所反応を実施し、次いで、１０ｂｐのＵＭＩ配列をシーケンシングし、第２の鎖について、５０ｂｐをシーケンシングした。
データ解析
１．ｃＤＮＡシーケンシングにより得られた、第１の鎖の２５ｂｐの配列を、アライメントにより、捕捉チップにおける位置決め配列のｆｑ（実施例１のステップ３において得られたシーケンシング結果）とマッチさせた。マッチング結果を、図４に示したが、ここで、明領域は、ｃＤＮＡシーケンシングの２５ｂｐが、捕捉チップと正確にマッチした領域を表し、この領域は、捕捉チップにおける、組織捕捉のための領域を表した。この結果は、捕捉チップが、空間位置決め領域を使用して、組織捕捉領域を、正確に位置特定しうることを示した。
１．ｃＤＮＡシーケンシングにより得られた、第１の鎖の２５ｂｐの配列を、アライメントにより、捕捉チップにおける位置決め配列のｆｑ（実施例１のステップ３において得られたシーケンシング結果）とマッチさせた。マッチング結果を、図４に示したが、ここで、明領域は、ｃＤＮＡシーケンシングの２５ｂｐが、捕捉チップと正確にマッチした領域を表し、この領域は、捕捉チップにおける、組織捕捉のための領域を表した。この結果は、捕捉チップが、空間位置決め領域を使用して、組織捕捉領域を、正確に位置特定しうることを示した。
２．ｃＤＮＡシーケンシングにより、捕捉チップとマッチされたＤＮＢについて、さらに解析し、これらのＤＮＢリードのｃＤＮＡの第２の鎖についてのシーケンシング結果（反応組織におけるｍＲＮＡの発現）と、マウスゲノムとの間のアライメント解析を実施した。マウスゲノムにアライメントされたＤＮＢについて、２５ｂｐのシーケンシング結果を介して、マウスｍＲＮＡの情報を、捕捉チップにアライメントした。図５に示される通り、左側図は、解析された組織切片における、ｍＲＮＡ発現についての、完全な全体像を示し、全体像は、この捕捉チップが、組織における、ｍＲＮＡ発現の差違について解析しうることを示し；図５の右側図は、マウス小脳において発現された、ランダムに選択された遺伝子の、組織発現レベルを示し、これは、このチップが、全組織における、ある特定の遺伝子の発現の差違について解析しうることを指し示した。
実施例４．捕捉チップの調製（２）
１．以下のＤＮＡライブラリーの配列をデザインし、合成した。配列の合成は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより実施された。
１．以下のＤＮＡライブラリーの配列をデザインし、合成した。配列の合成は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより実施された。
５’－リン酸化－ＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＧ（固定化配列１、配列番号１２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（位置決め配列鋳型、Ｎは、任意の塩基、例えば、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴを表した）ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ（ＵＭＩ鋳型、Ｉはイノシンを表した）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（捕捉配列、配列番号１３）ＣＣＴＣＡＧＣ（切断部位、配列番号１４）ＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡ（固定化配列２、配列番号１５）［配列中、固定化配列１は、第１の固定化配列の相補体の部分的配列及び環状化部位を含み、固定化配列２は、第１の固定化配列の相補体の部分的配列及び環状化部位を含んだ］。
２．ｉｎ ｓｉｔｕでのライブラリーの増幅
ＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）の調製：以下の反応系４０ｕｌを調製し、上記で言及されたＤＮＡライブラリー８０フェムトモルを添加したが、ＤＮＢプライマーは、ＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧ（配列番号１６）の配列を有し、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。
ＤＮＢ（ＤＮＡ ｎａｎｏｂａｌｌ）の調製：以下の反応系４０ｕｌを調製し、上記で言及されたＤＮＡライブラリー８０フェムトモルを添加したが、ＤＮＢプライマーは、ＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧ（配列番号１６）の配列を有し、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。
上記の反応系を、反応のためのＰＣＲ装置に入れ、反応条件は、以下の通り：９５℃で３分間、４０℃で３分間であり；反応の後、反応系を、氷上に置き、ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキットにおいてＤＮＢを調製するのに要求される、４０ｕｌの混合酵素Ｉ、及び２ｕｌの混合酵素ＩＩ、並びに１ｕｌのＡＴＰ（１００ｍＭ母液、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．１ｕｌのＴ４リガーゼ（ＢＧＩ製）を添加した。十分に混合した後で、上記の反応系を、３０℃のＰＣＲ装置へと移し、２０分間にわたり反応させて、ＤＮＢを形成した。ＢＧＩＳＥＱ５００ ＳＥ５０キットにおいて記載された方法に従い、ＤＮＢを、ＢＧＩＳＥＱ５００シーケンシングチップにロードした。
３．空間情報の解読
（１）チップの表面修飾：
上記のＢＧＩＳＥＱ－５００プラットフォームチップの表面を、以下の構造を有する、Ａｚｉｄｏ－ｄＰＥＧ（登録商標）８－ＮＨＳエステルと接触させた：
（１）チップの表面修飾：
上記のＢＧＩＳＥＱ－５００プラットフォームチップの表面を、以下の構造を有する、Ａｚｉｄｏ－ｄＰＥＧ（登録商標）８－ＮＨＳエステルと接触させた：
以下の方法に従い、チップの表面修飾を実行した：ＮＨＳ－ＰＥＧ８－アジド（１モル当たり５６４．５８ｇ）の濃度は、４５μＭであり、以下の方法により、１００ｍｌを調製した：
－２０℃で保存し、凍結及び乾燥の反復を回避した。
ＤＢＣＯプライマーは、１ｕＭの濃度を有したが、ＰＢＳで希釈した。
（２）プライマープローブのカップリング：
以下のプライマープローブ配列は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。
以下のプライマープローブ配列は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。
ＤＢＣＯ（連結基）－ＵＵＵ（ＵＳＥＲ切断部位）ＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＧ（配列番号１７、この配列は、第１の固定化配列の相補体、ＰＣＲ増幅部位配列、中間配列を含んだ）。上記のプライマープローブ１ｕＭを、ＰＢＳで希釈し、アジドで修飾されたチップへと導入し、室温で、１時間又は一晩にわたり反応させた。
（３）空間情報の解読。ＢＧＩＳＥＱ５００ ＳＥ５０シーケンシングキットの指示書に従い、空間情報の配列を解読し、シーケンシング長を、３０ｂｐとしてシーケンシングした（最初の２０ｂｐは、空間情報配列であり、最後の１０ｂｐは、プローブタグ配列であった）。シーケンシングにより形成されるｆｑファイルは、後の使用のために保存した。
（４）捕捉領域の合成：
ｄＴＴＰと、Ｈｉｆｉポリメラーゼとの混合溶液を調製し、ＤＮＢを、鋳型として使用し、空間位置決め領域を含むプローブ配列を、プライマーとして使用し、ｄＴＴＰを、基質として使用して、オリゴｄＴ配列を伸長させた。
ｄＴＴＰと、Ｈｉｆｉポリメラーゼとの混合溶液を調製し、ＤＮＢを、鋳型として使用し、空間位置決め領域を含むプローブ配列を、プライマーとして使用し、ｄＴＴＰを、基質として使用して、オリゴｄＴ配列を伸長させた。
４．空間情報を含むプローブの放出
１ｕＭのＳｐａｔｉａｌ＿ＲＮＡ＿ＢｂｖＣＩプライマー（５倍濃度のＳＳＣで希釈された）を調製し、プライマー配列ＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴ（配列番号１８）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。ハイブリダイゼーションは、室温で、３０分間にわたり実施した。ＢｂｖＣＩ切出し系（１．５ｍｌ）：１５ｕｌのＲＥ＋１５０ｕｌの１０倍濃度のＣＳ緩衝液＋１３３５ｕｌのｄｄＨ２Ｏを調製し、空間位置決め領域を解読した後で、チップへと導入し、３７℃で、１時間又は一晩にわたり、反応を実施した。シーケンシングキット（ＭＧＩ）のＷＢ２を添加することにより、２回にわたり、洗浄を実施し、次いで、５５℃で１５分間にわたり、ホルムアミドを使用して、反応を実施するのに続き、ＷＢ２で、２回にわたり洗浄した。得られたプローブの概略図を、図７に示したが、プローブ配列は、以下の通りであった：
ＵＵＵ（切断領域）ＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＧ（第１の固定化配列の相補体、配列番号１９）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（位置決め配列の相補体であり、ステップ１のＤＮＡライブラリーの配列における位置決め配列鋳型と同じであった）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（ＵＭＩ配列であり、ステップ１において鋳型として使用されるＵＭＩ鋳型から得られる、ランダム塩基配列の相補性配列であった）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（捕捉配列、配列番号２０）
１ｕＭのＳｐａｔｉａｌ＿ＲＮＡ＿ＢｂｖＣＩプライマー（５倍濃度のＳＳＣで希釈された）を調製し、プライマー配列ＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴ（配列番号１８）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕｈｅ ＢＧＩにより合成された。ハイブリダイゼーションは、室温で、３０分間にわたり実施した。ＢｂｖＣＩ切出し系（１．５ｍｌ）：１５ｕｌのＲＥ＋１５０ｕｌの１０倍濃度のＣＳ緩衝液＋１３３５ｕｌのｄｄＨ２Ｏを調製し、空間位置決め領域を解読した後で、チップへと導入し、３７℃で、１時間又は一晩にわたり、反応を実施した。シーケンシングキット（ＭＧＩ）のＷＢ２を添加することにより、２回にわたり、洗浄を実施し、次いで、５５℃で１５分間にわたり、ホルムアミドを使用して、反応を実施するのに続き、ＷＢ２で、２回にわたり洗浄した。得られたプローブの概略図を、図７に示したが、プローブ配列は、以下の通りであった：
ＵＵＵ（切断領域）ＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＧ（第１の固定化配列の相補体、配列番号１９）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（位置決め配列の相補体であり、ステップ１のＤＮＡライブラリーの配列における位置決め配列鋳型と同じであった）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（ＵＭＩ配列であり、ステップ１において鋳型として使用されるＵＭＩ鋳型から得られる、ランダム塩基配列の相補性配列であった）ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（捕捉配列、配列番号２０）
５．チップの分割
調製された捕捉チップを、いくつかの小片へと切り分け、小片のサイズを、実験の必要に従い調整し、チップを、ｐＨを８．０とする、５０ｍＭのトリス緩衝液に浸漬し、後の使用のために、４℃で保存した。
調製された捕捉チップを、いくつかの小片へと切り分け、小片のサイズを、実験の必要に従い調整し、チップを、ｐＨを８．０とする、５０ｍＭのトリス緩衝液に浸漬し、後の使用のために、４℃で保存した。
実施例５．組織ｍＲＮＡの捕捉及びｃＤＮＡの合成
１．凍結組織切片。凍結切片についての標準手順に従い、マウスの小脳組織切片を作製した。
１．凍結組織切片。凍結切片についての標準手順に従い、マウスの小脳組織切片を作製した。
２．ｍＲＮＡの捕捉。組織切片のサイズに従い、実施例４で調製された、適切なサイズのチップを、取り出し、室温で静置した。チップにおける液体を蒸発させた後、組織切片と、組織チョッパーにおけるチップとの温度差により、組織切片を、捕捉チップへと付着させた。付着させた組織切片を、室温で静置し、５倍濃度のＳＳＣ反応溶液を、チップへと添加し（そして、組織を付着させた領域を、完全に覆った）、３０℃で、３０分間にわたり、反応を実施して、組織におけるｍＲＮＡを、チップにおける捕捉領域と、完全にハイブリダイズさせた。
３．ｃＤＮＡの合成。５倍濃度のＳＳＣを使用して、室温で、２回にわたり、チップを洗浄し、以下の逆転写酵素反応系２００ｕｌを調製し、反応溶液を、チップへと添加して、チップを完全に覆い、４２℃で、９０分間～１８０分間にわたり、反応を実施した。ｍＲＮＡは、ポリＴを、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして使用し、ｍＲＮＡの３’末端は、ｃＤＮＡ相補鎖の合成のための、ＴＳＯタグ（ＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧ／ｒＧ／／ｒＧ／／ｉＸＮＡ＿Ｇ／）（配列番号２１）を保有した。上記工程の構造概略図を、図８に示した。
４．ｃＤＮＡの放出。ｃＤＮＡの第１鎖を、チップにおいて合成した後で、ＵＳＥＲ酵素反応系を調製し、ＵＳＥＲ酵素の指示マニュアルに従い、反応を実行した。放出された分子は、図９に示される構造を有した。チップから放出された反応溶液を回収し、２倍濃度のＸＰ磁気ビーズを使用して、ｃＤＮＡの第１鎖を精製し、最後に、４５ｕｌのＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、産物を回収した。
５．ｃＤＮＡの増幅。以下の反応系１００ｕｌを調製した：
上記の反応系を、ＰＣＲ装置に移し、以下の反応プログラム：９５℃で３分間にわたり、１１サイクル（９８℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、７２℃で３分間）、７２℃で５分間、４℃で無限時間を設定した。反応が完了した後で、ＸＰビーズを使用して、精製し、回収した。Ｑｕｂｉｔキットを使用して、ｄｓＤＮＡの濃度を定量し、２１００を使用して、ｃＤＮＡ断片の分布を検出した。２１００例の試験結果を、図１０に示したが、ここで、ｃＤＮＡの長さは、正常であった。
実施例６．ｃＤＮＡライブラリーの構築及びシーケンシング
１．Ｔｎ５による中断。ｃＤＮＡの濃度に従い、２０ｎｇのｃＤＮＡを、０．５ｕＭのＴｎ５酵素、及び対応する緩衝液（Ｔｎ５酵素のためのコーティング法は、ｓｔＬＦＲライブラリー構築キットに従い実施した）と共に添加し、十分に混合して、２０ｕｌの反応系を形成した。５５℃で１０分間にわたり、反応を実施し、０．１％のＳＤＳ ５ｕｌを添加し、室温で、５分間にわたり混合して、Ｔｎ５による中断ステップを終了させた。
１．Ｔｎ５による中断。ｃＤＮＡの濃度に従い、２０ｎｇのｃＤＮＡを、０．５ｕＭのＴｎ５酵素、及び対応する緩衝液（Ｔｎ５酵素のためのコーティング法は、ｓｔＬＦＲライブラリー構築キットに従い実施した）と共に添加し、十分に混合して、２０ｕｌの反応系を形成した。５５℃で１０分間にわたり、反応を実施し、０．１％のＳＤＳ ５ｕｌを添加し、室温で、５分間にわたり混合して、Ｔｎ５による中断ステップを終了させた。
２．ＰＣＲ増幅。以下の反応系１００ｕｌを調製した：
混合した後、反応系を、ＰＣＲ装置に入れ、以下のプログラム：９５℃で３分間にわたり、１１サイクル（９８℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、７２℃で３分間）、７２℃で５分間、４℃で無限時間を設定した。反応が完了した後で、ＸＰビーズを使用して、精製し、回収した。Ｑｕｂｉｔキットを使用して、ｄｓＤＮＡ濃度を定量した。
３．シーケンシング。ＤＮＢを調製するために、上記の中断後の８０フェムトモルの増幅産物を採取した。以下の反応系４０ｕｌを調製した：
上記の反応系を、反応のためのＰＣＲ装置に入れ、反応条件は、以下の通り：９５℃で３分間、４０℃で３分間であった。反応の後、反応系を、氷上に置き、ＤＮＢＳＥＱシーケンシングキットにおいてＤＮＢを調製するのに要求される、４０ｕｌの混合酵素Ｉ、及び２ｕｌの混合酵素ＩＩのほか、１ｕｌのＡＴＰ（１００ｍＭ母液、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び０．１ｕｌのＴ４リガーゼ（ＢＧＩ製）を添加した。十分に混合した後で、上記の反応系を、３０℃のＰＣＲ装置へと移し、２０分間にわたり反応させて、ＤＮＢを形成した。ＭＧＩＳＥＱ２０００のＰＥ５０キットに記載されている方法に従い、ＤＮＢを、ＭＧＩＳＥＱ２０００のシーケンシングチップへとロードし、シーケンシングは、関連する指示書に従い、カスタマーシーケンシングモードで実施し、第１の鎖のシーケンシングを、２段階に分けた、すなわち、２０ｂｐをシーケンシングし、次いで、１０ｂｐのプローブタグ配列をシーケンシングし、第２の鎖について、５０ｂｐをシーケンシングした。
データ解析
１．ｃＤＮＡシーケンシングにより得られた、第１の鎖の２０ｂｐの配列を、アライメントにより、チップにおける空間情報配列のｆｑ（実施例４のステップ３において得られたシーケンシング結果）とマッチさせた。マッチング結果を、図１１に示したが、ここで、明領域は、ｃＤＮＡシーケンシングの２０ｂｐが、捕捉チップと正確にマッチした領域を表し、この領域は、捕捉チップにおける、組織捕捉のための領域を表した。この結果は、捕捉チップが、空間位置決め領域を使用して、組織捕捉領域を、正確に位置特定しうることを示した。
１．ｃＤＮＡシーケンシングにより得られた、第１の鎖の２０ｂｐの配列を、アライメントにより、チップにおける空間情報配列のｆｑ（実施例４のステップ３において得られたシーケンシング結果）とマッチさせた。マッチング結果を、図１１に示したが、ここで、明領域は、ｃＤＮＡシーケンシングの２０ｂｐが、捕捉チップと正確にマッチした領域を表し、この領域は、捕捉チップにおける、組織捕捉のための領域を表した。この結果は、捕捉チップが、空間位置決め領域を使用して、組織捕捉領域を、正確に位置特定しうることを示した。
２．ｃＤＮＡシーケンシングにより、捕捉チップとマッチされたＤＮＢについて、さらに解析し、これらのＤＮＢリードのｃＤＮＡの第２の鎖についてのシーケンシング結果（反応組織におけるｍＲＮＡの発現）と、マウスゲノムとの間のアライメント解析を実施した。マウスゲノムにアライメントされたＤＮＢについて、２０ｂｐのシーケンシング結果を介して、マウスｍＲＮＡの情報を、捕捉チップにアライメントした。図１２に示される通り、左側図は、解析された組織切片における、ｍＲＮＡ発現についての全体像を示し、全体像は、この捕捉チップが、組織における、ｍＲＮＡ発現の差違について解析しうることを示し；図１２の右側図は、マウス小脳において発現された、ランダムに選択された遺伝子の、組織発現レベルを示し、これは、このチップが、全組織における、ある特定の遺伝子の発現の差違について解析しうることを指し示した。
本発明の具体的実施形態について、詳細に記載されたが、当業者は、公開された全ての教示に従い、詳細に対して、多様な改変及び変更がなされる場合があり、これらの変更は、本発明の保護の範囲内にあることを理解するであろう。本発明の全ては、付属の特許請求の範囲、及びその任意の均等物により与えられる。
Claims (49)
- 試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイであって、複数種類のキャリア配列が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類のキャリア配列が、前記アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、前記キャリア配列の複数のコピーを含み、前記キャリア配列が、５’から３’の方向に、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
前記位置決め配列が、前記アレイにおける、前記種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
前記第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とする、
核酸アレイ。 - 第１の核酸分子をさらに含み、前記第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、前記第１の固定化配列の相補体及び前記位置決め配列の相補体を含み、前記第１の核酸分子が、前記キャリア配列の前記第１の固定化配列及び前記位置決め配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成し；
好ましくは、各種類のキャリア配列の各コピーが、前記コピーとハイブリダイズされた、第１の核酸分子を含む、
請求項１に記載の核酸アレイ。 - 第２の核酸分子をさらに含み、前記第２の核酸分子が、前記第１の核酸分子へとライゲーションされ、前記第２の核酸分子が、捕捉配列を含み；
前記捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；前記捕捉配列が、前記第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有し；
好ましくは、各第１の核酸分子が、前記第２の核酸分子へとライゲーションされている、
請求項１又は２に記載の核酸アレイ。 - 各キャリア配列が、その５’末端において、第２の固定化配列をさらに含み、前記第２の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリングを可能とし；
前記第２の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とする
請求項１又は２に記載の核酸アレイ。 - 第２の核酸分子をさらに含み、前記第２の核酸分子が、５’から３’の方向に、前記第２の固定化配列の相補体及び捕捉配列を含み；
前記第２の固定化配列の相補体が、前記キャリア配列の前記第２の固定化配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成し；
前記捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；前記捕捉配列が、前記第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有し；
好ましくは、各種類のキャリア配列の各コピーが、前記コピーとハイブリダイズされた、第２の核酸分子を含む、
請求項４に記載の核酸アレイ。 - キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用する増幅により形成される増幅産物であり、前記増幅が、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ増幅、多重鎖置換増幅（ＭＤＡ）、又はエマルジョンＰＣＲ増幅から選択され；
好ましくは、キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢであり；好ましくは、キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用するローリングサークル増幅により形成されるＤＮＢであり；
好ましくは、キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡクラスターであり；
例えば、キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用するブリッジＰＣＲ増幅により形成されるＤＮＡクラスターであり；
例えば、キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用するエマルジョンＰＣＲ増幅により形成されるＤＮＡクラスターであり；
例えば、キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列の相補性配列を、鋳型として使用する多重鎖置換増幅により形成されるＤＮＡクラスターである、
請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - 前記第１の核酸分子が、ＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）配列をさらに含み、前記ＵＭＩ配列が、前記第１の固定化配列の相補体の５’末端に配置され；
前記ＵＭＩ配列が、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００）のヌクレオチドＮからなるヌクレオチド配列であり、各Ｎが、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つであり；
好ましくは、各第１の核酸分子に含有される前記ＵＭＩ配列が、互いと異なる、
請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - 前記第２の核酸分子が、ＵＭＩ配列をさらに含み、前記ＵＭＩ配列が、前記捕捉配列の５’末端に配置され；
前記ＵＭＩ配列が、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００）のヌクレオチドＮからなるヌクレオチド配列であり、各Ｎが、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つであり；
好ましくは、各第２の核酸分子に含有される前記ＵＭＩ配列が、互いと異なる、
請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - 前記固体支持体が、チップであり；
好ましくは、前記固体支持体が、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用される場合があり；
好ましくは、前記固体支持体が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製、ＭＧＩ製、又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のシーケンシングプラットフォームにおいて使用されるハイスループットシーケンシングチップなどのハイスループットシーケンシングチップである、
請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - ｍＲＮＡを捕捉することが可能な前記オリゴヌクレオチド配列が、前記ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることが可能な配列を含み；
好ましくは、ｍＲＮＡを捕捉することが可能な前記オリゴヌクレオチド配列が、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含み；
好ましくは、前記ポリＴオリゴヌクレオチド配列が、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む、
請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - 前記キャリア配列が、前記位置決め配列の上流に配置された捕捉配列鋳型をさらに含み、前記捕捉配列鋳型が、前記捕捉配列の相補性配列を含み、前記捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；
前記キャリア配列の前記第１の固定化配列がまた、切断部位も含み、前記切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択される場合があり；
前記核酸アレイが、第１の核酸分子をさらに含み、前記第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及びキャリア配列の相補性領域を含み、
前記結合性領域が、前記固体支持体の表面へのライゲーションが可能なリンカーを含み；
前記切断領域が、切断部位を含み；
前記キャリア配列の相補性領域が、前記キャリア配列と相補性でありうる配列を含み、５’から３’の方向に、前記第１の固定化配列の相補体、前記位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含み；前記捕捉配列が、前記第１の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有し；
前記第１の核酸分子の前記キャリア配列の相補性領域が、前記キャリア配列とハイブリダイズして、二本鎖を形成し；
好ましくは、各種類のキャリア配列の各コピーが、前記コピーとハイブリダイズされた、第１の核酸分子を含む、
請求項１に記載の核酸アレイ。 - 前記キャリア配列が、前記捕捉配列鋳型の下流、及び前記第１の固定化配列の上流に配置された、ＵＭＩ配列の相補体をさらに含み、前記ＵＭＩ配列の相補体が、前記ＵＭＩ配列に対して、相補性であり、前記ＵＭＩ配列が、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００）のヌクレオチドＮからなるヌクレオチド配列であり、各Ｎが、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つであり；
前記第１の核酸分子の前記キャリア配列の相補性領域が、前記補足配列の上流、及び前記第１の固定化配列の相補体の下流に配置されたＵＭＩ配列をさらに含み；
好ましくは、前記ＵＭＩ配列の相補体が、前記位置決め配列と、前記捕捉配列鋳型との間に、又は前記第１の固定化配列と、前記位置決め配列との間に配置され；
好ましくは、各種類のキャリア配列の各コピー（すなわち、同じ位置決め配列を含むキャリア配列）が、互いと異なる、ＵＭＩ配列の相補体を含む、
請求項１１に記載の核酸アレイ。 - 前記第１の核酸分子の前記リンカーが、活性化基（例えば、ＮＨ２）とカップリングすることが可能な連結基であり、前記固体支持体の前記表面が、前記活性化基（例えば、ＮＨ２）により修飾され；
好ましくは、前記リンカーが、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ、又は－ＮＨＳを含み；
好ましくは、前記リンカーが、
であり、
が、前記固体支持体の前記表面へと接合されている、
請求項１１又は１２に記載の核酸アレイ。 - 前記第１の核酸分子の前記切断領域に含有される前記切断部位が、化学法、酵素法、又は光化学法により、制御切断が実施されうる部位であり；
好ましくは、前記第１の核酸分子の前記切断領域に含有される前記切断部位が、酵素的切断部位であり；
好ましくは、前記第１の核酸分子の前記切断領域が、前記キャリア配列の前記第１の固定化配列に含有される前記切断部位と異なる、
請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - 前記固体支持体が、チップであり；
好ましくは、前記固体支持体が、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用される場合があり；
好ましくは、前記固体支持体が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製、ＭＧＩ製、又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のシーケンシングプラットフォームにおいて使用されるハイスループットシーケンシングチップなどのハイスループットシーケンシングチップである、
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - ｍＲＮＡを捕捉することが可能な前記オリゴヌクレオチド配列が、前記ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることが可能な配列を含み；
好ましくは、ｍＲＮＡを捕捉することが可能な前記オリゴヌクレオチド配列が、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含み；
好ましくは、前記ポリＴオリゴヌクレオチド配列が、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む、
請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸アレイ。 - （ｉ）第２の核酸分子を含まない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸アレイ；及び（ｉｉ）５’から３’の方向に、固定化領域及び捕捉配列を含む、第２の核酸分子を含み；
前記捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；前記捕捉配列が、前記第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有する、
キット。 - 請求項２に記載の核酸アレイを含み、前記第２の核酸分子の前記固定化領域が、二本鎖核酸配列（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列）を含む、請求項１５に記載のキット。
- 請求項４に記載の核酸アレイを含み、前記第２の核酸分子の、前記固定化領域が、第２の固定化配列の相補体を含む、請求項１５に記載のキット。
- 前記核酸アレイに含有される、前記第１の核酸分子が、ＵＭＩ配列を含まない場合に、前記第２の核酸分子が、ＵＭＩ配列をさらに含み、前記ＵＭＩ配列が、前記捕捉配列の５’末端に配置され；
前記ＵＭＩ配列が、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００）のヌクレオチドＮからなるヌクレオチド配列であり、各Ｎが、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つである、
請求項１５～１７のいずれか一項に記載のキット。 - 生物学的試料における核酸の空間情報を検出するための核酸アレイを作出するための方法であって、以下のステップ：
（１）複数種類のキャリア配列を用意するステップであり、各種類のキャリア配列が、前記キャリア配列の複数のコピーを含み、前記キャリア配列が、５’から３’の方向に、位置決め配列、及び第１の固定化配列を含み、
前記位置決め配列が、前記アレイにおける、前記種類のキャリア配列の位置に対応する、固有のヌクレオチド配列を有し；
前記第１の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリング、及び伸長反応の誘発を可能とするステップ；
（２）前記複数種類のキャリア配列を、固体支持体（例えば、チップ）の表面へとライゲーションするステップ；
（３）第１のプライマーを用意し、前記キャリア配列の前記第１の固定化配列及び前記位置決め配列の領域が、二本鎖を形成するように、前記キャリア配列を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施するステップであり、前記キャリア配列とハイブリダイズする鎖が、第１の核酸分子であり、前記第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、前記第１の固定化配列、及び前記位置決め配列の相補性配列を含み；前記第１のプライマーが、その３’末端に、第１の固定化配列の相補性領域を含み、前記第１の固定化配列の相補性領域が、前記第１の固定化配列の相補性配列又はその断片を含み、遊離３’末端を有するステップ
を含む方法。 - ステップ（１）において、前記複数種類のキャリア配列が、以下のステップ：
（ｉ）複数種類のキャリア配列の鋳型を用意するステップであり、前記キャリア配列の鋳型が、前記キャリア配列の相補性配列を含むステップ；
（ｉｉ）各種類のキャリア配列の鋳型を、鋳型として使用することにより、核酸増幅反応を実施して、各種類のキャリア配列の鋳型の増幅産物を得るステップであり、前記増幅産物が、前記キャリア配列の複数のコピーを含み；
好ましくは、前記増幅が、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ増幅、多重鎖置換増幅（ＭＤＡ）、又はエマルジョンＰＣＲ増幅から選択され；
好ましくは、前記キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢを得るように、ローリングサークル増幅が実施され；
好ましくは、前記キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡを得るように、ブリッジＰＣＲ増幅、エマルジョンＰＣＲ増幅、又は多重鎖置換増幅が実施されるステップ
により用意される、請求項２１に記載の方法。 - 以下のステップ：
（４）第２の核酸分子を用意するステップであり、前記第２の核酸分子が、捕捉配列を含み；
前記捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；前記捕捉配列が、前記第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するステップ；
（５）前記第２の核酸分子を、前記第１の核酸分子へとライゲーションするステップ（例えば、リガーゼを使用して、前記第２の核酸分子を、前記第１の核酸分子へとライゲーションするステップ）
をさらに含む、請求項２１又は２２に記載の方法。 - 前記第２の核酸分子が、５’から３’の方向に、固定化領域及び捕捉配列を含み、前記固定化領域が、二本鎖ＤＮＡ配列を含む、請求項２３に記載の方法。
- 各キャリア配列が、その５’末端において、第２の固定化配列をさらに含み、前記第２の固定化配列が、その相補性ヌクレオチド配列へのアニーリングを可能とし；以下のステップ：
（４）第２の核酸分子を用意するステップであり、前記第２の核酸分子が、５’から３’の方向に、第２の固定化配列の相補体及び捕捉配列を含み；
前記第２の固定化配列の相補体が、その相補性ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを可能とし；
前記捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；前記捕捉配列が、前記第２の核酸分子が、伸長プライマーとして機能することを可能とするように、遊離３’末端を有するステップ；
（５）アニーリングを可能とする条件下で、前記第２の固定化配列の相補体を、前記第２の固定化配列とハイブリダイズさせ、これにより、前記第２の核酸分子を、前記キャリア配列へとライゲーションするステップ；
（６）任意選択で、それぞれ、前記キャリア配列へとハイブリダイズされている、前記第１の核酸分子と、前記第２の核酸分子とをライゲーションするステップ（例えば、リガーゼを使用して、前記第２の核酸分子を、前記第１の核酸分子へとライゲーションするステップ）
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。 - ステップ（３）において、前記第１の核酸分子が、その第１の固定化配列の相補体の５’末端に、前記ＵＭＩ配列を含むように、前記第１のプライマーが、その第１の固定化配列の相補性領域の５’末端に、ＵＭＩ（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）をさらに含むか；又はステップ（４）において、前記第２の核酸分子が、ＵＭＩ配列をさらに含み、前記ＵＭＩ配列が、前記捕捉配列の５’末端に配置され；
前記ＵＭＩ配列が、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００）のヌクレオチドＮからなるヌクレオチド配列であり、各Ｎが、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つである、
請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ（１）において、前記キャリア配列が、前記位置決め配列の上流に配置された捕捉配列鋳型をさらに含み、前記捕捉配列鋳型が、前記捕捉配列の相補性配列を含み、前記捕捉配列が、捕捉される核酸の全部又は一部とハイブリダイズすることが可能であり、（ａ）ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列；及び／又は（ｂ）ランダムオリゴヌクレオチド配列若しくは縮重オリゴヌクレオチド配列；又は（ｃ）特定の標的核酸に特異的な配列を含み；前記キャリア配列の前記第１の固定化配列がまた、切断部位も含み、前記切断が、ニッキング酵素による酵素的切断、ＵＳＥＲ酵素による酵素的切断、光切断、化学的切断、又はＣＲＩＳＰＲベースの切断から選択される場合があり；
ステップ（３）において、前記第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、第１の固定化配列の相補体、位置決め配列の相補体、及び捕捉配列を含むように、前記キャリア配列の前記第１の固定化配列、前記位置決め配列、及び前記捕捉配列鋳型の領域が、二本鎖を形成し；
前記第１のプライマーが、５’から３’の方向に、結合性領域、切断領域、及び第１の固定化配列の相補性領域を含み、前記結合性領域が、前記固体支持体の表面へのライゲーションが可能なリンカーを含み、前記切断領域が、切断部位を含み；
前記方法が以下のステップ：
（４）前記第１のプライマーを、前記固体支持体の前記表面へとライゲーションするステップであり、ステップ（３）及び（４）が、任意の順序で実施されるステップ；
（５）任意選択で、ステップ（３）における伸長産物が、このような伸長産物が形成される前記鋳型（すなわち、キャリア配列）から分離され、これにより、前記第１の核酸分子が、前記固体支持体（例えば、チップ）の前記表面へとライゲーションされるように、前記キャリア配列の前記第１の固定化配列に含有される前記切断部位において、切断を実施して、前記キャリア配列を消化するステップ
をさらに含み；
好ましくは、各種類のキャリア配列が、キャリア配列の前記複数のコピーのコンカテマーにより形成されるＤＮＢである、
請求項２２に記載の方法。 - ステップ（１）において、前記第１の固定化配列に含有される前記切断部位が、ニッキング酵素の切断部位であり；
好ましくは、前記ニッキング酵素が、ＵＳＥＲ、ＢａｍＨＩ、及びＢｍｔＩから選択される、
請求項２７に記載の方法。 - ステップ（１）において、前記キャリア配列が、前記捕捉配列鋳型の下流、及び前記第１の固定化配列の上流に配置された、ＵＭＩ配列の相補体をさらに含み、前記ＵＭＩ配列の相補体が、ＵＭＩ配列に対して、相補性であり、前記ＵＭＩ配列が、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つ；例えば、５つ～１００）のヌクレオチドＮからなるヌクレオチド配列であり、各Ｎが、独立に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴのうちのいずれか１つであり；
ステップ（３）において、前記第１の核酸分子が、５’から３’の方向に、前記第１の固定化配列の相補体、前記位置決め配列の相補体、及び前記捕捉配列、並びに前記補足配列の上流、及び前記第１の固定化配列の相補体の下流に配置されたＵＭＩ配列を含むように、前記キャリア配列の前記第１の固定化配列、前記位置決め配列、前記補足配列鋳型、及び前記ＵＭＩ配列の相補体の領域が、二本鎖を形成し；
好ましくは、前記ＵＭＩ配列の相補体が、前記位置決め配列と、前記捕捉配列鋳型との間に、又は前記第１の固定化配列と、前記位置決め配列との間に配置される、
請求項２７又は２８に記載の方法。 - 前記第１のプライマーの前記リンカーが、活性化基（例えば、ＮＨ２）とカップリングすることが可能な連結基であり、前記固体支持体の前記表面が、前記活性化基（例えば、ＮＨ２）により修飾され；
好ましくは、前記リンカーが、－ＳＨ、－ＤＢＣＯ、又は－ＮＨＳを含み；
好ましくは、前記リンカーが、
であり、
が、前記固体支持体の前記表面へと接合されている、
請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第１のプライマーの前記切断領域に含有される前記切断部位が、化学法、酵素法、又は光化学法により、制御切断が実施されうる部位であり；
好ましくは、前記第１のプライマーの前記切断領域に含有される前記切断部位が、酵素的切断部位であり；
好ましくは、前記第１のプライマーの前記切断領域が、前記キャリア配列の前記第１の固定化配列に含有される前記切断部位と異なる、
請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。 - ｍＲＮＡを捕捉することが可能な前記オリゴヌクレオチド配列が、前記ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることが可能な配列を含み；
好ましくは、ｍＲＮＡを捕捉することが可能な前記オリゴヌクレオチド配列が、ポリＴオリゴヌクレオチド配列を含み；
好ましくは、前記ポリＴオリゴヌクレオチド配列が、少なくとも１０（例えば、少なくとも２０）のデオキシチミジン残基を含む、
請求項２１～３１のいずれか一項に記載の方法。 - 前記固体支持体が、チップであり；
好ましくは、前記固体支持体が、シーケンシングチップなどのシーケンシングプラットフォームとして使用される場合があり；
好ましくは、前記固体支持体が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製、ＭＧＩ製、又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のシーケンシングプラットフォームにおいて使用されるハイスループットシーケンシングチップなどのハイスループットシーケンシングチップである、
請求項２１～３２のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ（３）において、伸長反応を実施する間に、前記キャリア配列に含有される前記位置決め配列の配列情報を得るように、前記キャリア配列がシーケンシングされる、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（３）の前に、前記キャリア配列をシーケンシングするステップが含まれ；
好ましくは、前記シーケンシングが完了した後で、前記シーケンシングのために合成鎖へと付加されたｄＮＴＰを除去するように、洗浄が実施される、
請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。 - 好ましくは、核酸アレイが、請求項３及び５～１０のいずれか一項で規定された通りである、
請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法により調製される核酸アレイ。 - 好ましくは、核酸アレイが、請求項１１～１６のいずれか一項で規定された通りである、
請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法により調製される核酸アレイ。 - 試料における核酸の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）請求項３若しくは５に記載の核酸アレイを用意するか、若しくは請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法により、核酸アレイを得るステップであり、
前記核酸アレイが、固体支持体（例えば、チップ）の表面へと接合された、複数種類のキャリア配列を含み、各種類のキャリア配列が、前記アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、前記キャリア配列の複数のコピーを含み；
各キャリア配列が、前記各キャリア配列とハイブリダイズされた第１の核酸分子を含み、前記第１の核酸分子が、第２の核酸分子へとライゲーションされているか、又は各キャリア配列が、前記各キャリア配列とハイブリダイズされた、第１の核酸分子及び第２の核酸分子を含み；
前記第１の核酸分子が、前記アレイにおける、前記種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体を含み、
前記第２の核酸分子が、前記試料における前記核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含むステップ；
（２）前記被験試料における前記核酸が、前記第２の核酸分子の前記捕捉配列にアニーリングし、これにより、前記核酸の前記位置が、前記核酸アレイにおける、前記キャリア配列の前記位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、前記核酸アレイを、前記被験試料と接触させるステップ；
（３）（ｉ）前記第１の核酸分子と、前記第２の核酸分子とが、互いとライゲーションされていない場合に、各キャリア配列へとハイブリダイズされている、前記第１の核酸分子と、前記第２の核酸分子とをライゲーションする（例えば、リガーゼを使用して）ステップ；
前記プライマー伸長を可能とする条件下で、前記ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び前記捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、前記捕捉された核酸分子とハイブリダイズする鎖が、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有するステップ；並びに／又は、
前記プライマー伸長を可能とする条件下で、前記捕捉された核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び前記ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、捕捉され、伸長された核酸分子をもたらすステップであり、前記捕捉され、伸長された核酸が、空間情報タグとしての、前記位置決め配列を有するステップ；
代替的に、（ｉｉ）前記第１の核酸分子と、前記第２の核酸分子とが、互いとライゲーションされていない場合に、前記プライマー伸長を可能とする条件下で、前記第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長された第２の核酸分子をもたらすステップであり、前記伸長された第２の核酸分子が、前記捕捉された核酸の相補性配列を含むステップ；各キャリア配列へとハイブリダイズされている、前記第１の核酸分子と、前記伸長された第２の核酸分子とをライゲーションする（例えば、リガーゼを使用して）ステップであり、前記第１の核酸分子へとライゲーションされている、前記伸長された第２の核酸分子が、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有するステップ；
代替的に、（ｉｉｉ）前記第１の核酸分子と、前記第２の核酸分子とが、互いへとライゲーションされている場合に、前記プライマー伸長を可能とする条件下で、前記ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、前記捕捉された核酸分子とハイブリダイズする鎖が、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有するステップ；並びに／又は、
前記プライマー伸長を可能とする条件下で、前記捕捉された核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び前記ライゲーションされ、接続された、第１の核酸分子及び第２の核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、捕捉され、伸長された核酸分子をもたらすステップであり、前記捕捉され、伸長された核酸分子が、空間情報タグとしての、前記位置決め配列を有するステップ；
（４）空間情報タグで標識された前記核酸分子の少なくとも一部を、前記アレイの前記表面から放出するステップであり、前記一部が、前記位置決め配列又はその相補鎖、及び前記捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された前記核酸分子の配列を、直接的に、又は間接的に解析するステップであり、
好ましくは、前記核酸の空間情報が、前記核酸の位置、分布、及び／又は発現を含み；
好ましくは、前記試料が、組織切片などの組織試料であり；
好ましくは、前記組織切片が、固定組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、又は急速冷凍組織から調製される
ステップ
を含む方法。 - 試料におけるトランスクリプトームを検出するのに使用され、
（ａ）ステップ（３）（ｉ）において、前記ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、逆転写プライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、前記ｃＤＮＡ分子が、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有し、任意選択で、前記ｃＤＮＡ分子が増幅されるか；又はステップ（３）（ｉｉ）において、前記第２の核酸分子を、逆転写プライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有するｃＤＮＡ分子を作出するように、前記第１の核酸分子と、各キャリア配列とハイブリダイズする前記ｃＤＮＡ分子とがライゲーションされ（例えば、リガーゼを使用することにより）、任意選択で、前記ｃＤＮＡ分子が増幅されるか；又はステップ（３）（ｉｉｉ）において、前記ライゲーションされた、第１の核酸分子、及び第２の核酸分子を、逆転写プライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、前記ｃＤＮＡ分子が、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有し、任意選択で、前記ｃＤＮＡ分子が増幅され；
（ｂ）ステップ（４）において、前記ｃＤＮＡ分子及び／又はそれらの単位複製配列の少なくとも一部が、前記アレイの前記表面から放出され、放出される核酸分子が、前記ｃＤＮＡ分子又はその単位複製配列の第１の鎖及び／又は第２の鎖であることが可能であり、前記一部が、前記位置決め配列又はその相補鎖を含み；
好ましくは、ステップ（１）において、前記捕捉配列が、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、
請求項３８に記載の方法。 - 試料における核酸の空間情報を検出するための方法であって、以下のステップ：
（１）請求項１１～１６のいずれか一項に記載の核酸アレイを用意するか、又は請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法により、核酸アレイを得るステップであり、前記核酸アレイが、複数種類のキャリア配列が、表面へと接合された固体支持体（例えば、チップ）を含み、各種類のキャリア配列が、前記アレイにおける異なる位置を占め、前記各種類のキャリア配列が、前記キャリア配列の複数のコピーを含み；
各キャリア配列が、前記各キャリア配列とハイブリダイズされた第１の核酸分子を含み、前記第１の核酸分子が、前記アレイにおける、前記種類のキャリア配列の位置に対応する、位置決め配列の相補体、及び前記試料における前記核酸を捕捉することが可能な捕捉配列を含む
ステップ；
（２）前記被験試料における前記核酸が、前記第１の核酸分子の前記捕捉配列にアニーリングし、これにより、前記核酸の前記位置が、前記核酸アレイにおける、前記第１の核酸分子の前記位置と相関されうるように、アニーリングを可能とする条件下で、前記核酸アレイを、前記被験試料と接触させるステップ；
（３）前記プライマー伸長を可能とする条件下で、前記第１の核酸分子を、プライマーとして使用すること、及び捕捉された核酸分子を、鋳型として使用することにより、プライマー伸長反応を実施して、伸長産物をもたらすステップであり、前記捕捉された核酸分子とハイブリダイズする鎖が、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有するステップ；
（４）前記空間情報タグで標識された前記核酸分子の少なくとも一部を、前記アレイの前記表面から放出するステップであり、前記一部が、前記位置決め配列又はその相補鎖、及び前記捕捉された核酸分子又はその相補鎖を含むステップ；並びに
（５）ステップ（４）において放出された前記核酸分子の配列を、直接的に、又は間接的に解析するステップであり、
好ましくは、前記核酸の空間情報が、前記核酸の位置、分布、及び／又は発現を含み；
好ましくは、前記試料が、組織切片などの組織試料であり；
好ましくは、前記組織切片が、固定組織、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、又は急速冷凍組織から調製される
ステップ
を含む方法。 - 試料におけるトランスクリプトームを検出するのに使用され、
ステップ（３）において、前記第１の核酸分子を、ＲＴプライマーとして使用することにより、捕捉されたＲＮＡ分子から、ｃＤＮＡ分子が作出され、前記ｃＤＮＡ分子が、空間情報タグとして、前記第１の核酸分子に含有された、前記位置決め配列の相補体を有し、任意選択で、前記ｃＤＮＡ分子が増幅され；
ステップ（４）において、前記ｃＤＮＡ分子及び／又はそれらの単位複製配列の少なくとも一部が、前記アレイの前記表面から放出され、放出される核酸分子が、前記ｃＤＮＡ分子又はその単位複製配列の第１の鎖及び／又は第２の鎖であることが可能であり、前記一部が、前記位置決め配列又はその相補鎖を含み；
好ましくは、ステップ（１）において、前記捕捉配列が、ｍＲＮＡを捕捉することが可能なオリゴヌクレオチド配列を含む、
請求項４０に記載の方法。 - 前記キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列のコンカテマーにより形成されるＤＮＢであるか、又は前記キャリア配列の前記複数のコピーが、前記キャリア配列のクローン集団により形成されるＤＮＡクラスターである、
請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ（５）において、配列解析が、シーケンシング、又は配列特異的ＰＣＲ反応を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（６）：ステップ（５）において得られた配列解析情報を、前記試料についての画像と相関させるステップをさらに含み、前記試料が、ステップ（３）の前に、又はこの後でイメージングされ；
好ましくは、前記試料のイメージングが、光学顕微鏡法、明視野顕微鏡法、暗視野顕微鏡法、位相差顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、反射顕微鏡法、干渉顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、又はこれらの組合せを使用する、
請求項３８～４３のいずれか一項に記載の方法。 - 空間情報タグで標識された前記核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）、又は空間情報タグで標識された前記ｃＤＮＡ分子が、前記アレイの前記表面から放出される前に、又はこの後で、ｃＤＮＡの相補鎖又は第２の鎖がもたらされ；
好ましくは、前記相補鎖又は前記第２の鎖の合成が、ランダムプライマー、及び鎖置換ポリメラーゼを使用する、
請求項３８～４４のいずれか一項に記載の方法。 - 配列解析の前に、前記空間情報タグで標識された前記核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）又はｃＤＮＡ分子を増幅するステップをさらに含み；
好ましくは、前記増幅ステップが、前記空間情報タグで標識された前記核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）又はｃＤＮＡ分子が、前記アレイから放出された後で実施されるか、又は前記増幅ステップが、前記アレイにおいてｉｎ ｓｉｔｕで実施され；
好ましくは、前記増幅ステップが、ＰＣＲを含む、
請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。 - 配列解析の前に、放出された核酸分子を精製するステップをさらに含む、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（４）の前に、前記アレイを洗浄して、前記試料（例えば、組織）の残留物を除去するステップをさらに含む、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ（４）において、前記核酸分子が、以下の方法：（ｉ）核酸切断法；（ｉｉ）核酸変性法；及び／又は（ｉｉｉ）物理的方法により、前記アレイの前記表面から放出される、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の方法。
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