KR20220009445A

KR20220009445A - 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 어레이 및 방법

Info

Publication number: KR20220009445A
Application number: KR1020217041221A
Authority: KR
Inventors: 아오 첸; 순 수; 진 양; 롱키 리우; 오우 왕; 유시앙 리; 사 랴오; 궈신 탕; 유안 지앙; 총준 수; 밍 니; 웬웨이 장; 라도제 드르마낙; 스네자나 드르마낙
Original assignee: 비지아이 션전; 엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디.
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2022-01-24
Also published as: EP3971282A4; EP3971282A1; BR112021022865A2; JP2022540744A; CN114207105A; AU2020274774A1; MX2021013907A; SG11202112703QA; AU2020274774B2; US20230175047A1; CA3140512A1; WO2020228788A1

Abstract

샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하는 방법이 제공될 뿐만 아니라, 상기 방법에 사용된 핵산 어레이 및 핵산 어레이의 제조 방법이 제공된다.

Description

핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 어레이 및 방법

본 발명은 생체분자 공간 검출 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하는 방법, 이 방법에 사용되는 핵산 어레이, 및 핵산 어레이의 제조 방법을 제공한다.

조직에서 세포의 공간적 위치는 기능에 상당한 영향을 미친다. 이러한 공간적 이질성(spatial heterogeneity)을 탐구하기 위해서, 공간 좌표에 대한 지식을 가지고 세포의 지놈 또는 전사체를 정량화하고 분석하는 것이 필요하다. 그러나, 지놈 또는 전사체 분석을 위해 작은 조직 영역 또는 단일 세포를 수집하는 것은 매우 힘들고, 비용이 많이 들고, 정밀도가 낮다. 따라서, 단세포 또는 세포 내 수준으로 및 생체 분자(예를 들어, 핵산)의 공간 정보(예를 들어, 핵산 위치, 분포 및/또는 발현)의 고처리량 검출(high-throughput detection)에 도달 할 수 있는 방법의 개발이 매우 필요하다.

핵산의 공간적 검출을 실현하기 위해, 종래 기술은 어레이 기술과 고처리량 DNA 시퀀싱 기술을 결합하여 조직 샘플에서 위치 태그로 핵산을 포획 및 표지하고, 이를 시퀀싱 및 분석한다. 상기와 같은 목적을 달성할 수 있는 칩을 얻기 위하여 종래 기술에서는 스포팅(spotting) 및 비드-기반의 방법으로 칩 상에 핵산을 포획할 수 있는 프로브(probe)를 고정하였다. 그러나, 평면에 액적(droplet)을 스포팅하는 방법을 위해 미세-볼륨 스포팅 시스템(micro-volume spotting system)을 사용하여 얻은 칩의 활성 영역 크기는 200 미크론으로 높으며, 세포 관찰 정밀도는 단지 20 셀에 불과하다; 위치 태그로 표지된 비드의 확산-도금(spread-plating)과 함께 비드-기반 방법을 사용하여 얻어진 칩의 활성 영역 크기는 최대 10 미크론이며, 세포 관찰 정밀도는 단일 세포 수준에 불과하고, 세포 내 수준은 달성할 수 없다. 본 발명은 신규한 핵산 공간 검출용 핵산 어레이, 이의 제조 방법, 어레이에 기반한 핵산 공간 검출방법을 제공하며, 이는 고정밀 세포 내 국소화 및 고처리량 조직 국소화를 동시에 실현할 수 있고 중요한 응용 가치를 갖는다.

핵산 어레이의 제조

첫 번째 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 핵산 어레이를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(1) 여러 종류의 캐리어 서열(carrier sequence)을 제공하는 단계로서, 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하며, 및 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 위치 결정 서열 및 제1의 고정화 서열을 포함하며,

상기 위치 결정 서열은 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 갖고;

상기 제1 고정화 서열은 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하는, 단계.

(2) 여러 종류의 캐리어 서열을 고체 지지체(예를 들어, 칩(chip))의 표면에 결찰시키는 단계;

(3) 제1 프라이머를 제공하고, 및 캐리어 서열을 주형으로 하여 프라이머 신장 반응을 수행하여, 제1 고정화 서열의 영역 및 캐리어 서열의 위치 결정 서열이 이중 가닥을 형성하도록 하는 단계로서, 여기에서 상기 캐리어 서열과 혼성화하는 가닥은 제1 핵산 분자이고, 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열의 상보적인 서열을 포함하며; 여기에서, 3' 말단의 제 1 프라이머는 제1 고정화 서열 상보성 영역을 포함하고, 상기 제1 고정화 서열 상보성 영역은 제1 고정화 서열의 상보적 서열 또는 그의 단편을 포함하며, 자유 3' 말단을 갖는, 단계.

특정 구현예에서, 캐리어 서열 및 제1 핵산 분자는 단일 가닥 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 캐리어 서열 및 제1 핵산 분자는 단일 가닥 DNA 서열이다.

일부 구현예에서, 상기 단계 (3)에서, 신장 반응을 수행하는 동안, 캐리어 서열을 시퀀싱하여 캐리어 서열에 포함된 위치 결정 서열의 서열 정보를 획득한다.

일부 구현예에서, 상기 단계 (1)에서, 다양한 종류의 캐리어 서열은 다음 단계를 통해 제공된다:

(i) 캐리어 서열의 상보적인 서열을 포함하는 다양한 종류의 캐리어 서열 주형을 제공하는 단계;

(ii) 각 종류의 캐리어 서열 주형을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 수행하여 상기 각 종류의 캐리어 서열 주형의 증폭 산물을 얻는 단계; 상기 증폭 산물은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고.

특정 구현에에서, 증폭은 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification, RCA), 브릿지 PCR 증폭(bridge PCR amplification), 다중 가닥 치환 증폭(multiple strand displacement amplification, MDA) 또는 에멀젼 PCR 증폭(emulsion PCR amplification)으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 롤링 서클 증폭은 캐리어 서열의 연쇄체(concatmer)에 의해 형성된 DNB를 얻기 위해 수행된다. 이러한 구현예에서, 원형 주형 서열은 상기 단계 (i)에서 제공된다. 원형 핵산 분자의 제조 방법은 당업계에서 통상적인 방법이며, 당업자의 필요에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 선형 핵산 주형을 먼저 얻은 다음, 선형 핵산 주형의 원형화를 리가아제(ligase)(예를 들어, DNA 리가아제)에 의해 실현할 수 있다.

일부 구현예에서, 브릿지 PCR 증폭, 에멀전 PCR 증폭, 또는 다중 가닥 치환 증폭은 캐리어 서열의 클론 집단에 의해 형성된 DNA 클러스터를 얻기 위해 수행된다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다:

(4) 포획 서열을 포함하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계로서;

상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있고, 다음을 포함하며: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및, 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3'말단을 갖는, 단계,

(5) 제2 핵산 분자를 제1 핵산 분자에 결찰시키는 (예를 들어, 리가아제를 사용하여 제2 핵산 분자를 제1 핵산 분자에 결찰시키는) 단계.

특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 단일 가닥 핵산 서열이다. 특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 단일 가닥 DNA 서열이다. 특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 단일 가닥 RNA 서열이다.

특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 고정화 영역 및 포획 서열을 포함하고, 및 상기 고정화 영역은 이중 가닥 DNA 서열과 같은 이중 가닥 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 핵산 분자에 포함된 포획 서열은 단일 가닥 DNA 서열 또는 단일 가닥 RNA 서열과 같은 단일 가닥 핵산 서열이다. 이러한 구현예에서, 제2 핵산 분자는 부분적으로 이중 가닥 구조를 가지며, 즉 그의 고정화 영역은 이중 가닥 구조를 갖고, 그의 포획 서열은 단일 가닥 구조를 갖는다는 것을 이해하기 쉽다.

특정 구현예에서, 이중 가닥 핵산 서열은 1bp 내지 50 bp, 예를 들어 10 bp 내지 50 bp, 10 bp 내지 40 bp, 또는 10 bp 내지 30 bp의 길이를 갖는다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다:

(4) 제2 핵산 분자가 5'에서 3'방향으로 제2 고정화 서열의 상보체 및 포획 서열을 포함하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계로서;

상기 제2 고정화 서열의 상보체는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 혼성화를 허용하고;

(5) 어닐링을 허용하는 조건에서, 상기 제2 고정화 서열의 상보체를 제2 고정화 서열과 혼성화함으로써 제2 핵산 분자를 캐리어 서열에 결찰시키는 단계;

(6) 선택적으로, 제1 핵산 분자를 각각 캐리어 서열에 혼성화된 제2 핵산 분자에 결찰시키는 (예를 들어, 리가아제를 사용하여 제2 핵산 분자를 제1 핵산 분자에 결찰시키는) 단계.

이러한 구현예에서, 각각의 캐리어 서열은 그의 5' 말단에 제2 고정화 서열을 추가로 포함하고, 제2 고정화 서열은 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링을 허용한다. 일부 구현예에서, 제2 고정화 서열은 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용한다(예를 들어, 이는 브릿지 PCR 프라이머의 결합 부위로 사용될 수 있다).

특정 구현예에서, 제2 고정화 서열은 위치 결정 서열에 인접한다.

일부 구현예에서, 제2 고정화 서열은 1bp 내지 50 bp, 예를 들어 10 bp 내지 50 bp, 10 bp 내지 40 bp, 10 bp 내지 30 bp, 또는 10 bp 내지 20 bp의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 단계 (3)에서, 제1 프라이머는 그 안에 포함된 제1 고정화 서열 상보성 영역의 5' 말단에 고유 분자 식별자(unique molecular identifier, UMI) 서열을 추가로 포함하여, 제1 핵산 분자는 그 안에 포함된 제1 고정화 서열의 상보체의 5' 말단에 UMI 서열을 포함하고; 또는, 상기 단계 (4)에서, 제2 핵산 분자는 UMI 서열을 추가로 포함하며, 및 상기 UMI 서열은 포획 서열의 5' 말단에 위치하고

상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 20개, 예를 들어 10개)의 뉴클레오타이드 N을 포함하며, 각각의 N은 독립적으로 A, C, G 및 T 중 임의의 하나이다.

일부 구현예에서, 제1 프라이머가 그의 포함된 제1 고정화 서열 상보성 영역의 5' 말단에 고유 분자 식별자(UMI)를 포함하는 경우, 제1 프라이머는 UMI 서열의 5' 말단에 추가적인 서열을 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 mRNA의 poly-A 테일과 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열은 10개 이상(예를 들어, 20개 이상)의 데옥시티미딘 잔기(deoxythymidine residue)를 포함한다.

특정 구현예에서, 고체 지지체(solid support)는 칩(chip)이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 시퀀싱 칩(sequencing chip)과 같은 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 Illumina, MGI, 또는 Thermo Fisher 시퀀싱 플랫폼에서 사용되는 고처리량 시퀀싱 칩(high-thoughtput sequencing chip)과 같은 고처리량 시퀀싱 칩이다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 핵산 어레이를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(1) 여러 종류의 캐리어 서열을 제공하는 단계로서, 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고, 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 포획 서열 주형, 위치 결정 서열 및 제1 고정화 서열을 포함하며,

상기 포획 서열 주형은 포획 서열의 상보적인 서열을 포함하고 상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있으며, 다음을 포함하고: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열;

상기 위치 결정 서열은 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 가지며;

상기 제1 고정화 서열은 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하고; 및, 상기 제1 고정화 서열은 또한 절단 부위를 포함하며, 및 상기 절단은 닉킹 효소(nicking enzyme)를 사용한 효소적 절단, USER 효소를 사용한 효소적 절단, 광절단(photocleavage), 화학적 절단 또는 CRISPR-기반의 절단인, 단계;

(2) 여러 종류의 캐리어 서열을 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 결찰시키는 단계;

(3) 제1 프라이머(또는 프로브 프라이머(probe primer)로 지칭됨)를 제공하고, 상기 제1 프라이머는 5'에서 3'방향으로 결합 영역, 절단 영역 및 제1 고정화 서열 상보성 영역을 포함하며, 및 상기 제1 고정화 서열 상보성 영역은 제1 고정화 서열의 상보적인 서열 또는 그의 단편을 포함하고 및 자유 3' 말단을 가지며; 상기 결합 영역은 고체 지지체의 표면에 결찰될 수 있는 링커(linker)를 포함하고; 상기 절단 영역은 절단 부위를 포함하며;

상기 제1 프라이머를 프라이머로 사용하고 캐리어 서열을 주형으로 사용하여 프라이머 신장반응을 수행하여, 제1 고정화 서열의 영역, 위치 결정 서열 및 캐리어 서열의 포획 서열 주형이 이중 가닥을 형성하고, 상기 캐리어 서열과 혼성화된 가닥은 제1 핵산 분자이며, 및 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 제1 고정화 서열의 상보체, 위치 결정 서열의 상보체, 및 포획 서열을 포함하고; 제1 핵산 분자는 또한 포획 프로브로 지칭될 수 있는, 단계;

(4) 제1 프라이머를 고체 지지체의 표면에 결찰시키는 단계; 상기 단계 (3) 및 (4)는 임의의 순서로 수행되고;

(5) 선택적으로 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위에서 절단을 수행하여 캐리어 서열을 분해함으로써, 상기 단계 (3)의 신장 산물이 신장 산물을 형성하기 위한 주형(즉, 캐리어 서열)로부터 분리되어, 제1 핵산 분자(포획 프로브)가 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 결찰되는 단계.

상기 포획 프로브(즉, 제1 핵산 분자)는 캐리어 서열을 주형으로 사용하고 프라이머 신장 반응을 수행하여 얻어지기 때문에, 포획 프로브는 어레이 상의 포획 프로브의 종류(캐리어 서열의 종류)의 위치에 상응하는 고유한 위치 결정 서열의 상보체, 및 포획될 핵산 분자의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있는 포획 서열을 포함한다.

이러한 맥락에서, "각 종류의 캐리어 서열"이라는 표현은 동일한 위치 결정 서열을 포함하는 캐리어 서열을 의미한다.

일부 구현예에서, 단계 (1)에서, 여러 종류의 캐리어 서열은 다음 단계를 통해 제공된다:

(ii) 각 종류의 캐리어 서열 주형을 주형으로 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행하여 각 종류의 캐리어 서열 주형의 증폭 산물을 얻는 단계; 상기증폭 산물은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함한다.

특정 구현예에서, 증폭은 롤링 서클 증폭(RCA), 브릿지 PCR 증폭, 다중 가닥 치환 증폭(MDA), 또는 에멀젼 PCR 증폭으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 롤링 서클 증폭은 캐리어 서열의 연쇄체에 의해 형성된 DNB를 얻기 위해 수행된다. 이러한 구현예에서, 원형의 주형 서열은 상기 단계 (i)에서 제공된다. 원형의 핵산 분자의 제조 방법은 당업계에서 통상적인 방법이며, 당업자의 필요에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 선형 핵산 주형을 먼저 얻은 다음, 선형 핵산 주형의 원형화를 리가아제(예를 들어 DNA 리가아제)에 의해 실현될 수 있다.

특정 구현예에서, 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피의 연쇄체에 의해 형성된 DNB이다.

일부 구현예에서, 상기 단계 (1)은 다음 단계를 포함한다:

(1a) 원형의 핵산 주형을 제공하는 단계로서, 원형의 핵산 주형은 한 종류의 캐리어 서열 주형을 포함하고, 상기 캐리어 서열 주형은 캐리어 서열의 상보적인 서열을 포함하며, 즉, 상기 캐리어 서열 주형은 5'에서 3'방향으로 제1 고정화 서열의 상보체, 위치 결정 서열 및 포획 서열의 상보체를 포함하는, 단계;

(1b) 상기 원형의 핵산 주형을 주형으로 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA)을 수행하여 캐리어 서열의 연쇄체에 의해 형성된 DNA 나노볼(DNA nanoball, DNB)를 얻는 단계.

일부 구현예에서, 브릿지 PCR 증폭, 에멀젼 PCR 증폭, 또는 다중 가닥 치환 증폭을 수행하여 캐리어 서열의 클론 집단에 의해 형성된 DNA 클러스터를 얻는다.

일부 구현예에서, 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위는 닉킹 효소의 절단 부위이다. 일부 구현예에서, 닉킹 엔자임은 USER, BamHI, BmtI 등으로부터 선택된다. 특정 예시적인 구현예에서, 절단 부위는 서열번호: 14에 제시된다.

일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 시퀀성 프라이머를 위한 혼성화 영역 및/또는 증폭 프라이머를 위한 혼성화 영역을 추가로 포함하고; 여기에서 시퀀싱 프라이머를 위한 혼성화 영역은 시퀀싱 프라이머에 어닐링 및 시퀀싱 반응의 개시를 허용하며, 및 증폭 프라이머를 위한 혼성화 영역은 증폭 프라이머에 어닐링 및 신장 및 증폭 반응의 개시를 허용한다.

일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 1 bp 초과, 예컨대, 10 bp 초과의, 또는 20 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 20 내지 100 bp의 길이, 예컨대 20 내지 80 bp의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 위치 결정 서열은 1 bp 초과, 예컨대, 10 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 위치 결정 서열은 10 내지 100 bp, 예컨대 10 내지 50 bp, 예컨대, 10 내지 30 bp, 예컨대, 20 bp의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 포획 서열은 1 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 포획 서열은 1 내지 100 bp, 예컨대, 10 내지 50 bp, 예컨대 10 내지 30 bp의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열은 포획 서열 주형의 다운스트림 및 제1 고정화 서열의 업스트림에 위치한 UMI 서열(또는 프로브 태그 영역(probe tag region)으로 지칭됨)의 상보체를 포함하고, 상기 UMI 서열의 상보체는 UMI 서열의 상보적이며, 및 상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100, 5 내지 50, 5 내지 20, 예컨대 10개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 여기에서 각 N은 독립적으로 A, C, G 및 T중 임의의 하나이다. 일부 구현예에서, UMI 서열의 상보체는 위치 결정 서열 및 포획 서열 주형 사이에 위치한다. 다른 구현예에서, UMI 서열의 상보체는 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열 사이에 위치한다. 이러한 구현예에서, 상기 단계 (3)에서, 프라이머 신장 반응이 캐리어 서열을 주형으로 사용하여 수행되는 경우, 캐리어 서열에 혼성화하는 제1 핵산 분자/포획 프로브는 상응하게 UMI 서열(또한 프로브 태그로 지칭됨)을 포함할 것이다.

일부 구현예에서, 전술한 UMI 서열 또는 그의 상보적인 서열을 얻기 위해, 캐리어 서열의 주형 서열(즉, 캐리어 서열 주형)은 해당 위치에 UMI 서열 주형을 포함하고, 상기 UMI 서열 주형은 다양한 주요 염기(예를 들어, C, G, A, T, U)와 수소결합에 의해 상보적인 쌍을 이룰 수 있는 변형된 염기로 구성된 서열이다; 예를 들어, 변형된 염기는 이노신(inosine)일 수 있고, 이는 염기 A, C 및 U와 상보적인 쌍을 이룰 수 있다. 어떠한 이론에 얽매이지 않고, 캐리어 서열 주형은 UMI 서열 주형을 포함하는 경우, 롤링 서클 증폭 과정에서 증폭이 수행될 때마다 UMI 서열 주형과 상보적인 쌍을 이룰 수 있는 염기가 무작위로 결합되어, 각 시간의 증폭 산물은 무작위로 형성된 고유한 UMI 서열 주형을 가지므로, 각 시간의 증폭 산물을 구별한다. 따라서, 예를 들어, 카피수는 포획되는 상이한 핵산 분자에 대해 정l와될 수 있다. 일부 구현예에서, UMI 서열 주형은 복수(예를 들어, 10개 이상, 예컨대 10 내지 100개)의 이노신을 포함한다. 일부 구현예에서, UMI 서열 주형은 1 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, UMI 서열 주형은 5 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, UMI 서열 주형은 5 내지 100 bp, 예컨대, 5 내지 50 bp, 예컨대, 5 내지 20 bp, 예컨대 5 내지 15 bp, 예컨대 10 bp의 길이를 갖는다.

특정 구현예에서, 고체 지지체는 칩이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 BGISEQ-500 플랫폼의 시퀀싱 칩과 같은 시퀀싱 칩(MGI)이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 예를 들어, 특허 CN103180496B에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 고-밀도 어레이 칩(high-density array chip)이다.

캐리어 서열(예를 들어, DNB)는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 고체 지지체의 표면에 결찰될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법의 비-제한적인 예는 핵산 혼성화(nucleic acid hybridization), 비오틴-스트렙타비딘 결합(biotin-streptavidin binding), 설프히드릴 결합(sulfhydryl binding), 광-활성화 결합(photo-activated binding), 공유 결합(covalent binding), 항체-항원, 히드로겔 또는 기타 다공성 중합체(porous polymer) 물질에 의한 물리적 제한 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 고체 지지체는 다음 물질로부터 선택된다: 유리, 실리콘, 폴리리신 코팅 물질(polylysine coating material), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 폴리스티렌(polystyrene), 고리형 올레핀 공중합체(cyclic olefin copolymers, COCs), 고리형 올레핀 중합체(cyclic olefins polymers, COPs), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene) 또는 폴리카보네이트(polycarbonate) 등.

일부 구현예에서, 상기 단계 (3)에서, 프라이머 신장 반응을 수행하는 동안, 캐리어 서열(예를 들어, 그 안에 포함된 위치 결정 서열)을 시퀀싱하여, 캐리어 서열에 포함된 위치 결정 서열의 서열 정보를 얻는다.

일부 구현예에서, 상기 단계 (3) 이전에, 캐리어 서열(예를 들어, 그 안에 포함된 위치 결정 서열)을 시퀀싱하는 단계가 추가로 포함된다. 일부 구현예에서, 시퀀싱이 완료된 후, 시퀀싱으로 인해 합성 가닥에 첨가된 dNTP를 제거하기 위해 세척이 수행된다.

특정 구현예에서, 링커(linker)는 활성화기(activating group)(예를 들어, NH2)와 연결할 수 있는 연결기(linking group)이다. 이러한 구현예에서, 고체 지지체의 표면은 활성화기(예를 들어, NH2)로 변형된다. 일부 구현예에서, 링커는 -SH, -DBCO, -NHS 등을 포함한다. 특정 예시적인 구현예에서, 링커는 DBCO이고, 및 Azido-dPEG®8-NHS 에스테르는 고체 지지체 표면에 부착된다.

DBCO Azido-dPEG®8-NHS ester

일부 구현예에서, 제1 프라이머의 절단 영역에 포함된 절단 부위는 제어된 절단이 화학적, 효소적, 또는 광화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 절단 부위는 효소의 절단 부위이다. 일부 구현예에서, 효소 부위는 USER 효소 (UUU)의 효소 부위이다.

일부 구현예에서, 제1 프라이머의 절단 영역은 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위와 상이하다.

특정 구현예에서, 증폭은 PCR을 포함한다.

핵산 어레이 및 키트

세 번째 측면에서, 본 발명은 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 갖는 고체 지지체(예를 들어, 칩)를 포함하는 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 핵산 어레이를 제공하며, 여기서 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 어레이에서 상이한 위치를 포함하고, 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하며, 및 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 위치 결정 서열 및 제1 고정화 서열을 포함한다,

상기 위치 결정 서열은 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 가지고;

상기 제1 고정화 서열은 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용한다.

특정 구현예에서, 상기 각 종류의 캐리어 서열(즉, 동일한 위치 결정 서열을 포함하는 캐리어 서열)은 고체 지지체의 표면 상에 1 마이크론(micron) 미만, 예를 들어 약 900 나노미터(nanometer), 약 800 나노미터, 약 700 나노미터, 약 600 나노미터, 또는 약 500 나노미터의 직경을 갖는 영역(즉, 활성 영역)을 차지한다.

일부 구현예에서, 핵산 어레이는 5'에서 3'방향으로 다음을 포함하는 제1 핵산 분자를 추가로 포함하고: 제1 고정화 서열의 상보체 및 위치 결정 서열의 상보체, 및 캐리어 서열의 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열을 혼성화하여 이중 가닥 구조를 형성한다. 제1 핵산 분자에서 제1 고정화 서열의 상보체 및 위치 결정 서열의 상보체만이 캐리어 서열의 상응하는 서열에 상보적이어서 이중 가닥을 형성한다는 것을 이해하기 쉬우므로, 제 1 고정화 서열 및 캐리어 서열에 의해 형성된 이중 가닥이 불완전한 이중 가닥, 즉, 부분적 이중 가닥 구조가 되도록 한다.

특정 구현예에서, 각 종류의 캐리어 서열의 각각의 카피는 이와 혼성화된 제1 핵산 분자를 포함한다.

특정 구현예에서, 캐리어 서열 및 제1 핵산 분자는 단일-가닥 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 캐리어 서열 및 제1 핵산 분자는 단일-가닥 DNA 서열이다.

일부 구현예에서, 핵산 어레이는 제2 핵산 분자를 추가로 포함하고, 여기에서 상기 제2 핵산 분자는 제1 핵산 분자에 결찰되어 핵산 어레이에 고정되며, 및 제2 핵산 분자는 포획 서열을 포함하고;

상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있으며, 다음을 포함한다: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로 기능할 수 있도록 하는 자유 3'말단을 갖는다.

특정 구현예에서, 각각의 제1 핵산 분자는 제2 핵산 분자에 결찰된다.

일부 구현예에서, 제2 핵산 분자의 5'말단은 제1 핵산 분자의 3'말단에 결찰된다.

다른 구현예에서, 핵산 어레이는 제2 핵산 분자를 추가로 포함하고, 여기에서 제2 핵산 분자는 캐리어 서열과 혼성화하여 핵산 어레이에 고정화된다.

이러한 구현예에서, 각각의 캐리어 서열은 그의 5'말단에 제2 고정화 서열을 추가로 포함하고, 제2 고정화 서열은 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 대한 어닐링을 허용하며; 및,

제2 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 제2 고정화 서열의 상보체 및 포획 서열을 포함하고; 상기 제2 고정화 서열의 상보체는 캐리어 서열의 제2 고정화 서열과 혼성화하여 이중 가닥을 형성하며;

상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있고, 및 다음을 포함한다; (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및, 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3'말단을 갖는다.

특정 구현예에서, 각 종류의 캐리어 서열의 각각의 카피는 이와 혼성화된 제2 핵산 분자를 포함한다.

일부 구현예에서, 제2 고정화 서열은 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응(예를 들어, 브릿지 PCR 프라이머의 결합 부위로 사용될 수 있음)의 개시를 허용한다.

특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 5'말단의 변형을 갖는다. 특정 구현예에서, 변형은 인산화(phosphorylation) 또는 비오틴(biotin) 변형이다.

특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 단일-가닥 핵산 서열이다. 특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 단일-가닥 DNA 서열이다. 특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 단일-가닥 RNA 분자이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 주형으로 캐리어 서열의 상보적인 서열을 증폭하여 형성된 증폭 산물이고, 및 상기 증폭은 롤링 서클 증폭(RCA), 브릿지 PCR 증폭, 다중 가닥 치환 증폭(MDA) 또는 에멀젼 PCR 증폭으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 연쇄체에 의해 형성된 DNB이다. 특정 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 롤링 서클 증폭에 의해 형성된 DNB이다.

특정 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 클론 집단에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 브릿지 PCR 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 에멀전 PCR 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 다중 가닥 치환 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

일부 구현예에서, 제2 핵산 분자는 고유한 분자 식별자(UMI) 서열을 포함하고, 및 상기 UMI 서열은 제1 고정화 서열의 상보체의 5'말단에 위치하며; 또는, 상기 제2 핵산 분자는 UMI 서열을 추가로 포함하고, 상기 UMI 서열은 포획 서열의 5' 말단에 위치하며;

상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 20개, 예컨대 10개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 및 각각의 N은 독립적으로 A, C, G 및 T 중 임의의 하나이다.

특정 구현예에서, 고체 지지체는 칩이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 시퀀싱 칩과 같은 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 Illumina, MGI 또는 Thermo Fisher 시퀀싱 플랫폼에서 사용되는 고처리량 시퀀싱 칩(high-throughput sequencing chip)과 같은, 고처리량 시퀀싱 칩이다.

일부 구현예에서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 mRNA의 poly-A 테일에 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열은 10개 이상(예를 들어, 20개 이상)의 데옥시티미딘 잔기를 포함한다.

일부 구현예에서, 위치 결정 서열은 1 nt 초과의, 예컨대 5 nt 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 위치 결정 서열은 5 내지 50 nt, 예컨대, 10 내지 50 nt, 10 내지 30 nt, 또는 20 내지 30 nt의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 상이한 종류의 캐리어 서열에 포함된 위치 결정 서열의 길이는 동일하거나 상이할 수 있다.

일부 구현예에서, 포획 서열은 1 nt 초과의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 포획 서열은 1 내지 100 nt, 예컨대 1 내지 50 nt, 예컨대 10 내지 30 nt의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 1 nt 초과의, 예컨대 10 nt 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 10 내지 200 nt의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 20 내지 100 nt, 예컨대 20 내지 50 nt의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 제2 고정화 서열은 1 nt 초과의, 예컨대 10 nt 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 고정화 서열은 10 내지 200 nt, 예를 들어, 10 내지 100 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 30 nt, 또는 10 내지 20 nt의 길이를 갖는다.

네 번째 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 키트를 제공한다: (i) 세 번쩨 측면에 따른 핵산 어레이; 상기 핵산 어레이는 제2 핵산 분자를 포함하지 않고; 및 (ii) 제2 핵산 분자, 상기 제2 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 고정화 영역 및 포획 서열을 포함하고;

상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있으며, 다음을 포함하고: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및, 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3' 말단을 갖는다.

일부 구현예에서, 키트는 다음을 포함한다: (i) 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 갖는 고체 지지체(예를 들어, 칩)를 포함하는 핵산 어레이로서, 여기에서 각 종류의 캐리어 서열은 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고, 및 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 위치 결정 서열 및 제1 고정화 서열을 포함하며;

상기 제1 고정화 서열은 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하며;

상기 핵산 어레이는 또한 제1 핵산 분자를 포함하고, 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 다음을 포함하는, 핵산 어레이: 제1 고정화 서열의 상보체 및 위치 결정 서열의 상보체, 및 캐리어 서열의 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열을 혼성화하여 이중 가닥을 형성하고;

및, (ii) 제2 핵산 분자로서, 이의 고정화 영역은 이중-가닥 DNA 서열을 포함한다.

리가아제는 상기 (ii)에 기재된 제2 핵산 분자를 상기 (i)에 기재된 핵산 어레이에 포함된 제1 핵산 분자에 결찰시키기 위하여 사용될 수 있다는 것을 이해하기 쉽다. 그러므로, 특정 구현예에서, 상기 키트는 리가아제를 추가로 포함한다.

다른 구현예에서, 키트는 다음을 포함한다: (i) 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 갖는 고체 지지체(예를 들어, 칩)을 포함하는 핵산 어레이로서, 여기에서 각 종류의 캐리어 서열을 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고, 및 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 제2 고정화 서열, 위치 결정 서열 및 제1 고정화 서열을 포함하며;

상기 제2 고정화 서열은 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링을 허용하고;

상기 위치 결정 서열은 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 고유의 뉴클레오타이드 서열을 가지며;

상기 제1 고정화 서열은 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하고;

상기 핵산 어레이는 또한 제1 핵산 분자를 포함하며, 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 다음을 포함하고: 고정화 서열의 상보체 및 위치 결정 서열의 상보체, 및 캐리어 서열의 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열을 혼성화하여 이중 가닥을 형성하며;

및, (ii) 제2 핵산 분자로서, 이의 고정화 영역은 제2 고정화 서열의 상보체를 포함한다.

어닐링을 허용하는 조건에서, 상기 (ii)에 기재된 제2 핵산은 상기 (ii)에 기재된 핵산 어레이에 포함된 캐리어 서열의 상보적인 영역과 혼성화할 수 있으므로, 제2 핵산 분자는 리가아제를 사용하여 제1 핵산 분자에 결찰될 수 있다고 이해하기 쉽다. 따라서, 특정 구현예에서, 상기 키트는 리가아제를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한, 세 번째 측면에 따른 핵산 어레이의 용도 또는 네 번째 측면에 따른 키트의 용도에 관한 것이거나, 또는 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 검출 시약의 제조에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 핵산의 공간 정보는 핵산의 위치, 분포 및/또는 발현을 포함한다.

특정 구현예에서, 샘플은 세포를 포함하는 조직 샘플과 같은 조직 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 조직 절폄이다. 특정 구현예에서, 조직 절편은 고정된 조직, 예를 들어, 포르말린-고정 파라핀-포매된(Formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 조직 또는 냉동 조직(deep-frozen tissue)로부터 제조된다.

다섯 번째 측면에서, 본 발명은 또한 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 갖는 고체 지지체(예를 들어, 칩)를 포함하는, 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 핵산 어레이에 관한 것이고, 여기에서 각 종류의 캐리어 서열은 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고, 및 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 다음을 포함한다: 포획 서열 주형, 위치 결정 서열 및 제1 고정화 서열, 여기에서,

상기 포획 서열 주형은 포획 서열의 상보적인 서열을 포함하고 상기 포획 서열은 다음을 포함하여 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있으며: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열;

상기 제1 고정화 서열은 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하며, 및 제1 고정화 서열은 또한 절단 부위를 포함하고, 및 상기 절단은 닉킹 효소에 의한 효소적 절단, USER 효소에 의한 효소적 절단, 광절단, 화학적 절단 또는 CRISPR-기반의 절단으로부터 선택될 수 있으며;

상기 핵산 어레이는 또한 제1 핵산 분자(또한 포획 프로브로 지칭됨)을 포함하고, 및 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 결합 영역, 절단 영역, 및 캐리어 서열 상보성 영역을 포함하며,

상기 결합 영역은 고체 지지체의 표면에 결찰할 수 있는 링커를 포함하고;

상기 절단 영역은 절단 부위를 포함하며;

상기 캐리어 서열 상보성 영역은 캐리어 서열에 상보적일 수 있는 서열을 포함하고, 이는 5'에서 3'방향으로 다음을 포함하며: 제1 고정화 서열의 보상체, 위치 결정 서열의 보상체, 및 포획 서열; 및, 상기 포획 서열은 제1 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할수 있도록 자유 3'말단을 가지고;

및, 제1 핵산 분자의 캐리어 서열 상보성 영역은 캐리어 서열과 혼성화하여 이중 가닥을 형성한다.

특정 구현예에서, 캐리어 서열 및 제1 핵산 분자는 단일-가닥 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 캐리어 서열 및 제1 핵산 분자는 단일-가닥 DNA 분자이다.

특정 구현예에서, 각 종류의 캐리어 서열의 각각의 카피는 이와 혼성화된 전술된 제1 핵산 분자를 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 핵산 분자의 링커는 활성화기(예를 들어, NH₂)와 연결될 수 있는 연결기이고, 고체 지지체의 표면은 활성화기(예를 들어, NH₂)로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 -SH, -DBCO, 또는 -NHS를 포함한다. 일부 구현예에서 링커는

(DBCO)이고, 및

(Azido-dPEG®8-NHS 에스테르)는 고체 지지체의 표면에 부착된다.

일부 구현예에서, 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위는 닉킹 효소 절단 부위이다. 일부 구현예에서, 닉킹 효소는 USER, BamHI, BmtI등으로부터 선택된다. 특정 예시적인 구현예에서, 절단 부위는 서열번호: 14에 제시된다.

일부 구현예에서, 제1 핵산 분자의 절단 영역에 포함된 절단 부위는 제어된 절단이 화학적, 효소적, 또는 광화학적 방법에 의해 수행될 수 있는 부위이다. 특정 구현예에서, 절단 부위는 효소 절단 부위이다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 USER 효소 절단 부위(UUU)이다.

일부 구현예에서, 제1 핵산 부위의 절단 영역은 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위와 상이하다.

특정 구현예에서, 핵산 어레이는 두 번째 측면에 기재된 방법에 의해 제조된다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 주형으로 캐리어 서열의 상보적인 서열을 증폭하여 형성된 증폭 산물이고, 상기 증폭은 롤링 서클 증폭(RCA), 브릿지 PCR 증폭, 다중 가닥 치환 증폭(MDA) 또는 에멀젼 PCR 증폭으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 연쇄체에 의해 형성된 DNB이다. 특정 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 주형으로 캐리어 서열의 상보적인 서열을 사용하여 롤링 서클 증폭에 의해 형성된 DNB이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 주형으로 캐리어 서열의 상보적인 서열을 사용하여 브릿지 PCR 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 주형으로 캐리어 서열의 상보적인 서열을 사용하여 에멀젼 PCR 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 주형으로 캐리어 서열의 상보적인 서열을 사용하여 다중 가닥 치환 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열은 포획 서열 주형의 다운스트림 및 제1 고정화 서열의 업스트림에 위치한 UMI 서열의 상보체를 추가로 포함하고, 상기 UMI 서열의 상보체는 UMI 서열에 상보적이며, 상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 20개, 예컨대 10개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 각각의 N은 A, C, 및 T 중 임의의 하나이다.

및, 제1 핵산 분자의 캐리어 서열 상보성 영역은 포획 서열의 다운스트림 및 제1 고정화 서열의 상보체의 다운스트림에 위치한 UMI 서열을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, UMI 서열의 상보체는 위치 결정 서열 및 포획 서열 주형 사이에 위치하거나, 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열 사이에 위치한다.

일부 구현예에서, 각 종류의 캐리어 서열(즉, 동일한 위치 결정 서열을 포함하는 캐리어 서열)의 각각의 카피는 상이한 UMI 서열의 상보체를 갖는다. 상응하게, 각각의 카피의 캐리어 서열과 혼성화된 제1 핵산 분자(포획 프로브) 또한 상이한 UMI 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 캐리어 서열은 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위를 통해 핵산 어레이로부터 제거된다. 이러한 구현예에서, 핵산 어레이는 표면에 부착된 여러 종류의 포획 프로브(제1 핵산 분자)를 갖는 고체 지지체(예를 들어, 칩)를 포함하고, 각 종류의 포획 프로브(제1 핵산 분자)는 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 및 포획 프로브(제1 핵산 분자)가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3'말단을 갖도록 배향되고, 여기에서 각 종류의 포획 프로브(제1 핵산 분자)는 5'에서 3'방향으로 결합 영역, 절단 영역, 위치 결정 서열의 상보체 및 포획 서열을 포함하며, 여기에서,

상기 결합 영역은 고체 지지체의 표면에 결찰시킬 수 있는 링커를 포함하고;

상기 절단 영역은 절단 부위를 포함하며;

상기 위치 결정 영역은 어레이 상의 포획 프로브 종류의 위치에 해당하고;

상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있으며 다음을 포함한다: (1a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열, 및/또는, (1b) 무작위 또는 축중된 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열.

일부 구현예에서, 상기 각 종류의 캡쳐 프로브의 각각의 캡쳐 프로브(즉, 동일한 위치 결정 서열/위치 결정 서열의 상보체를 포함하는 포획 프로브)는 상이한 UMI 서열을 포함하고, 상기 UMI 서열은 포획 서열의 업스트림 및 절단 영역의 다운스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, UMI 서열은 포획 서열의 5'말단, 예를 들어, 포획 서열 및 위치 결정 서열의 상보체 사이 위치에 위치한다. 다른 구현예에서, UMI 서열은 위치 결정 서열의 상보체의 5'말단, 예를 들어 절단 영역 및 위치 결정 서열의 상보체 사이에 위치한다.

일부 구현예에서, 상기 각 종류의 캐리어 서열(즉, 동일한 위치 결정 서열을 포함하는 캐리어 서열) 또는 각 종류의 포획 프로브(즉, 동일한 위치 결정 서열/위치 결정 서열의 상보체를 포함하는 포획 프로브)는 고체 지지체 표면 상에1 마이크로미터 미만, 예를 들어 약 900 나노미터, 약 800 나노미터, 약 700 나노미터, 약 600 나노미터, 또는 약 500 나노미터의 직경을 갖는 영역(즉, 활성 영역)을 차지한다. 특정 구현예에서, 상기 각 종류의 캐리어 서열 또는 각 종류의 포획 프로브는 약 500 나노미터의 직경을 갖는 활성 영역을 가진다.

특정 구현예에서, 고체 지지체는 칩이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 BGISEQ-500 플랫폼과 같은 시퀀싱 칩(MGI)이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 예를 들어, 특허 CN103180496B에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 고-밀도 어레이 칩이다.

일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 1bp 초과, 예컨대 10bp 초과, 또는 20 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 고정화 서열은 20 내지 100 bp, 예컨대 20 내지 80 bp의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, 위치 결정 서열은 1 bp 초과, 예컨대 10 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 위치 결정 서열은 10 내지 100 bp, 예컨대 20 내지 50 bp, 예컨대 10 내지 30 bp, 예컨대 20 bp의 길이를 갖는다.

일부 구현예에서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 mRNA의 poly-A 테일에 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, poly-T 울리고뉴클레오타이드 서열은 10개 이상(예를 들어, 20개 이상)의 데옥시티미딘 잔기를 포함한다

일부 구현예에서, 포획 서열은 1 bp 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 포획 서열은 1 내지 100 bp, 예컨대 10 내지 50 bp, 예컨대 10 내지 30 bp의 길이이다.

검출 방법

여섯 번째 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 방법을 제공한다:

(1) 세 번째 측면에 따른 핵산 어레이를 제공하거나, 또는 첫 번째 측면에 따른 방법에 의해 핵산 어레이를 얻는 단계; 여기에서,

상기 핵산 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 포함하고, 각 종류의 캐리어 서열은 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고:

상기 캐리어 서열의 각각의 카피는 제1 핵산 분자 및 그와 혼성화된 제2 핵산 분자를 포함하며, 및 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 서로 결찰되지 않았고;

상기 제1 핵산 분자는 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 위치 결정 서열의 상보체를 포함하며,

상기 제2 핵산 분자는 샘플에서 핵산을 포획할 수 있는 포획 서열을 포함하고;

(2) 어닐링을 허용하는 조건에서 상기 핵산 어레이는 테스트할 샘플과 접촉시켜, 상기 테스트될 샘플 내의 핵산이 제2 핵산 분자의 포획 서열에 어닐링되도록 하고, 핵산의 위치는 핵산 어레이 상의 캐리어 서열의 위치와 연관될 수 있게 하는 단계;

(3) (i) 캐리어 서열의 각각의 카피에 혼성화된(예를 들어, 리가아제를 사용함) 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 결찰시키는 단계;

상기 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 하여, 상기 포획된 핵산 분자에 혼성화하는 가닥이 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 갖는 신장 산물을 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하고, 및/또는,

상기 포획된 핵산 분자를 프라이머로 사용하며, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 상기 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 주형으로 하여, 상기 신장된 포획된 핵산 분자가 공간 정보 태그로서 위치 결정 서열을 갖는, 신장된 포획된 핵산 분자를 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하며;

대안적으로, (ii) 제2 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 하여, 신장된 제2 핵산 분자가 포획된 핵산의 상보적인 서열을 포함하는, 신장된 제2 핵산 분자를 생성하기 위해 신장 반응을 수행하고; 캐리어 서열의 각각의 카피에 혼성화되는 제1 핵산 분자 및 신장된 제2 핵산 분자를 (예를 들어, 리가아제 사용하여)결찰시키는 단계, 이로써 제1 핵산 분자에 결찰된 신장된 제2 핵산 분자는 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 가지며;

(4) 어레이의 표면으로부터 공간 정보 태그를 가진 핵산 분자의 적어도 일부를 방출하는 단계; 상기 일부는 위치 결정 서열 또는 그의 상보적인 가닥 및 포획된 핵산 분자 또는 그의 상보적인 가닥을 포함하고, 및

(5) 상기 단계 (4)에서 방출된 핵산 분자의 서열 정보를 직접적으로 또는 간접적으로 분석하는 단계.

이러한 구현예에서, 표적 핵산이 상기 단계 (2)에서 포획되기 전에, 제1 핵산 분자는 핵산 어레이 상의 제2 핵산 분자에 결찰되지 않는다.

일곱번째 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 방법을 제공한다:

(1) 첫 번째 측면에 따른 핵산 어레이를 제공하거나, 세 번째 측면에 따른 방법에 의해 핵산 어레이를 얻는 단계; 여기에서,

상기 핵산 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 포함하고, 캐리어 서열의 각 종류는 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 상기 캐리어 서열의 각 종류는 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하며;

상기 캐리어 서열의 각각의 카피는 이와 혼성화된 제1 핵산 분자를 포함하고, 상기 제1 핵산 분자는 제2 핵산 분자에 결찰되며;

상기 제1 핵산 분자는 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치와 상응하는 위치 결정 서열의 상보체를 포함하며,

(2) 어닐링을 허용하는 조건에서 상기 핵산 어레이는 테스트할 샘플과 접촉시켜, 테스트될 샘플 내의 핵산이 제2 핵산 분자의 포획 서열에 어닐링되도록 하고, 핵산의 위치는 핵산 어레이 상의 캐리어 서열의 위치와 연관될 수 있게 하는 단계;

(3) (iii) 상기 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 상기 포획된 핵산 분자를 주형으로 하여, 포획된 핵산 분자와 혼성화된 가닥이 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 갖는, 신장 산물을 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계; 및/또는

포획된 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 상기 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 주형으로 하여, 신장된 포획된 핵산 서열이 공간 정보 태그로서 위치 결정 서열을 갖는, 신장된 포획된 핵산 분자를 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계;

(4) 어레이의 표면으로부터 공간 정보 태그를 가진 핵산 분자의 적어도 일부를 방출시키는 단계; 상기 일부는 위치 결정 서열의 상보체 또는 그의 상보적인 가닥 및 포획된 핵산 분자 또는 그의 상보적인 가닥을 포함하고, 및

이러한 구현예에서, 표적 핵산이 상기 단계 (2)에서 포획되기 전에, 제1 핵산 분자는 핵산 어레이 상에서 제2 핵산 분자에 결찰된다.

여섯 번째 또는 일곱 번째 측면의 방법의 특정 구현예에서, 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 연쇄체에 의해 형성된 DNB이고, 또는 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 클론 집단에 의해 형성된 DNA 클러스터이다.

여섯 번째 또는 일곱 번째 측면의 방법의 특정 구현예에서, 캐리어 서열 및 제1 핵산 분자는 단일-가닥 DNA이다. 특정 구현예에서, 제2 핵산 분자는 단일-가닥 DNA 또는 단일-가닥 RNA이다.

여덟 번째 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 방법을 제공한다:

(1) 다섯 번째 측면에 따른 핵산 어레이를 제공하거나, 또는 두 번째 측면에 따른 방법에 의해 핵산 어레이를 얻는 단계; 상기 핵산 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 포함하고, 각 종류의 캐리어 서열은 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 및 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고;

상기 캐리어 서열의 각각의 카피는 이와 혼성화된 제1 핵산 분자를 포함하고, 상기 제1 핵산 분자는 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 위치 결정 서열의 상보체 및 샘플에서 핵산을 포획할 수 있는 포획 서열을 포함하며;

(2) 어닐링을 허용하는 조건에서 상기 핵산 어레이는 테스트할 샘플과 접촉시켜 테스트될 샘플 내의 핵산이 제1 핵산 분자의 포획 서열에 어닐링되도록 하고, 및 핵산의 위치가 핵산 어레이 상의 제1 핵산 분자의 위치와 연관될 수 있게 하는 단계;

(3) 상기 제1 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 하여, 포획된 핵산 분자와 혼성화된 가닥이 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 갖는, 신장 산물을 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계;

(4) 어레이의 표면으로부터 공간 정보 태그를 가진 핵산 분자의 적어도 일부를 방출시키는 단계; 상기 일부는 위치 결정 서열 또는 그의 상보적인 가닥 및 포획된 핵산 분자 또는 그의 상보적인 가닥을 포함하고; 및

일부 구현예에서, 상기 단계 (2) 전에, 방법은 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위에서 절단을 수행하여 캐리어 서열을 절단하고, 동시에 제1 핵산 분자(포획 프로브)를 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 결찰시키는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, 핵산 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 부착된 여러 종류의 포획 프로브를 포함하고, 각 종류의 포획 프로브는 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 상기 포획 프로브는 어레이 상의 포획 프로브의 종류의 위치에 상응하는 위치 결정 서열의 상보체 및 샘플에서 핵산을 포획할 수 있는 포획 서열을 포함하고;

(2) 어닐링을 허용하는 조건에서 핵산 어레이는 테스트할 샘플과 접촉시켜, 테스트할 샘플에서 핵산이 포획 프로브의 포획 서열에 어닐링되도록 하고, 및 핵산의 위치는 어레이 상에서 포획 프로브의 위치에 연관될 수 있게 하는 단계;

(3) 상기 포획 프로브를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 하여, 신장 산물이 공간 정보 태그로서의 위치 결정 서열의 상보체 및 포획된 핵산 분자의 상보적인 서열을 포함하는 결과가 되도록 프라이머 신장 반응을 수행함으로써, 공간 정보 태그를 가진 DNA 분자를 생성하는 단계; 선택적으로, 공간 정보 태그를 가진 DNA 분자의 상보적인 가닥을 생성하고/생성하거나, 선택적으로 공간 정보 태그를 가진 DNA 분자를 증폭시키며;

(4) 상기 공간 정보 태그를 가진 DNA 분자 및/또는 이들의 상보체 또는 앰플리콘의 적어도 일부를 어레이의 표면으로부터 방출시키는 단계; 상기 일부는 공간 정보 태그 또는 이의 상보적인 가닥을 포함하고, 및

여덟 번째 측면의 방법의 일부 구현예에서, 제1 핵산 분자 및 포획 프로브는 단일-가닥 DNA와 같은 DNA 분자이다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나의 방법의 특정 구현예에서, 핵산의 공간 정보는 핵산의 위치, 분포 및/또는 발현을 포함한다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나의 방법의 특정 구현예에서, 샘플은 조직 절편과 같은 조직 샘플이다. 일부 특정 구현예에서, 조직 절편은 고정된 조직, 예를 들어, 포르말린-고정 파라핀-포매된(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 조직 또는 냉동(deep-frozen) 조직으로부터 제조된다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나의 방법의 특정 구현예에서, 방법은 비-진단 목적으로 사용된다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 임의의 핵산 분석 방법은 단계 (5)에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이 단계는 시퀀싱을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열-특이적 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 특이적 증폭 반응은, 예를 들어 위치 결정 도메인 및/ 또는 특정 표적 서열(예를 들어, 검출될 특정 표적 DNA)에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 분석 방법은 서열-특이적 PCR 반응이다. 따라서, 특정 구현예에서, 이 단계는 서열-특이적 PCR 반응을 포함할 수 있다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 단계 (5)에서 얻어진 서열 분석 정보는 샘플에서 핵산의 공간 정보(즉, 위치 정보)를 얻고자 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이 공간 정보는 결정된 서열 분석 정보의 특성으로부터 유도될 수 있으며, 예를 들어 사용된 조직 샘플의 맥락에서 그 자체가 공간적으로 유용한 정보를 줄 수 있는 특정 핵산의 존재를 나타낼 수 있고/있거나 공간 정보(예를 들어, 공간적 위치)는 시퀀싱 정보와 결합된, 어레이 상의 조직 샘플의 위치에서 파생될 수 있다. 따라서, 상기 방법은, 예를 들어 위치 결정 태그 및 조직 샘플에서 이의 위치에 대한 상관 관계로 인해, 서열 분석 정보를 조직 샘플의 위치와 단순히 연관시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 공간 정보는 서열 분석 데이터를 조직 샘플의 이미지와 연관시킴으로써 편리하게 얻을 수 있다. 따라서, 이러한 구현예에서, 여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나의 방법은 단계 (6): 단계 (5)에서 얻어진 서열 분석 정보를 샘플의 이미지와 연관시키는 단계로서, 여기에서 샘플은 단계 (3) 이전 또는 이후에 이미지화 되는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플의 이미지화는 광, 명시야, 암시야, 위상차, 형광, 반사, 간섭, 공초점 현미경 또는 이들의 조합을 사용한다.

여섯 번째 측면의 방법의 특정 구현예에서, 방법은 샘플에서 전사체를 검출하기 위해 사용된다. 이러한 구현예에서, 단계 (3)(i)에서, cDNA 분자는 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 역전사 프라이머로 사용하여 포획된 RNA분자로부터 생성되고, 상기 cDNA 분자는 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 가지며, 선택적으로 cDNA 분자는 증폭되고; 또는, 단계 (3)(ii)에서, cDNA 분자는 제2 핵산 분자를 역전사 프라이머로 사용하여 포획된 RNA 분자로부터 생성되고, 각각의 캐리어 서열에 혼성화된 제1 핵산 분자 및 cDNA 분자는 결찰되어(예를 들어, 리가아제를 사용함) 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 가진 cDNA 분자를 생성하며, 선택적으로, cDNA 분자는 증폭되고; 및 단계 (4)에서, cDNA 분자 및/또는 이들의 앰플리콘의 적어도 일부는 어레이의 표면으로부터 방출되며, 여기에서 방출된 핵산 분자는 cDNA 분자의 제1 및/또는 제2 가닥 또는 이의 앰플리콘일 수 있고, 및 여기에서 일부는 공간 정보 서열 또는 이의 상보적인 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)에서, 포획 서열은 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일곱 번째 측면의 방법의 특정 구현예에서, 방법은 샘플에서 전사체를 검출하기 위해 사용된다. 이러한 구현예에서, 단계 (3)(iii)에서, cDNA 분자는 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 역전사 프라이머로 사용하여 포획된 RNA 분자로부터 생성되고, 상기 cDNA 분자는 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 가지며, 선택적으로 cDNA 분자는 증폭되며; 및, 단계 (4)에서, cDNA 분자 및/또는 이들의 앰플리콘의 적어도 일부는 어레이의 표면으로부터 방출되고, 여기에서 방출된 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 이의 앰플리콘의 제1 및/또는 제2 가닥일 수 있으며, 및 여기에서 일부는 공간 정보 서열 또는 이의 상보적인 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)에서, 포획 서열은 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

여덟 번째 측면의 방법의 특정 구현예에서, 방법은 샘플에서 전사체를 검출하기 위해 사용된다. 이러한 구현예에서, 단계 (3)에서, cDNA 분자는 포획 프로브를 RT 프라이머로 사용하여 포획된 RNA 분자로부터 생성되고, 상기 cDNA 분자는 공간 정보 태그를 가지며, 선택적으로 cDNA 분자는 증폭되며; 단계 (4)에서, cDNA 분자 및/또는 이들의 앰플리콘의 적어도 일부는 어레이의 표면으로부터 방출되고, 여기에서 방출된 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 이의 앰플리콘의 제1 및/또는 제2 가닥일 수 있으며, 및 여기에서 일부는 공간 정보 태그 서열 또는 이의 상보적인 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)에서, 포획 서열은 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나의 방법의 일부 구현예에서, 공간 정보 태그를 가진 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자) 또는 공간 정보 태그를 가진 cDNA 분자가 어레이의 표면에서 방출되기 전 또는 후에, 상보적인 가닥 또는 제2 가닥 cDNA가 생성된다.

제2 가닥 DNA(예를 들어, cDNA)를 생성하는 단계는 제2 가닥 합성의 별도 단계 또는 증폭 반응의 초기 단계에서 어레이에서 제자리에서(in situ) 수행될 수 있다. 대안적으로, 제1 가닥 DNA, 예를 들어 cDNA(즉, 포획된 핵산 분자를 주형으로 하여 생성된 가닥)은 어레이로부터 방출될 수 있고, 그 다음 제2 가닥 합성은, 예를 들어 별도의 단계로서 또는 증폭 반응에서 용액에서 수행되는 반응에서 수행될 수 있다.

제2 가닥 합성이 어레이(즉, 제자리에서(in situ)) 상에서 수행되는 경우, 방법은 제2 가닥 합성 전에, RNA 분해 효소(Rnase) 예를 들어 Rnase H를 사용하여 포획된 핵산 분자를 제거하는 선택적 단계를 포함할 수 있다. 이에 대한 절차는 당업계에 잘 알려져 있고 설명되어 있다. 그러나, 상기 단계는 일반적으로 불필요하며, 대부분의 경우, RNA는 자연적으로 분해된다. 어레이로부터 샘플을 제거하는 단계는 어레이로부터 RNA도 제거한다.

일부 구현예에서, DNA(예를 들어, cDNA)의 제2 가닥은 단일 반응으로 생성되고, 제2 가닥 합성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 어레이 기질로부터 방출된 제1 가닥 cDNA는 무작위 프라이머, 예를 들어 헥사머 프라이머, 및 DNA 중합효소, 예를 들어 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)와 함께 인큐베이션하여 제1 가닥을 주형으로 사용하여 DNA 합성 반응을 수행할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 상보적인 가닥 또는 제2 가닥의 합성은 랜덤 프라이머 및 가닥 치환 중합효소를 사용한다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나에 따른 방법의 일부 구현예에서, 서열 분석 전에, 공간 정보 태그를 가진 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자) 또는 cDNA 분자를 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 증폭 단계는 공간 정보 태그를 가진 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자) 또는 cDNA 분자가 어레이로부터 방출된 후에 수행되거나, 또는 증폭 단계가 어레이 상의 제자리(in situ) (즉, 제1 핵산 분자 및/또는 캐리어 서열 및/또는 포획 프로브가 여전히 고체 지지체의 표면에 결찰되어 있는 경우)에서 수행된다. 특정 구현예에서, 증폭 단계는 PCR을 포함한다.

여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 상기 단계 (4)에서, 분자는 다음 방법에 의해 어레이의 표면으로부터 방출된다: (i) 핵산 절단; (ii) 변성(denaturation); 및/또는 (iii) 물리적 방법. 특정 구현예에서, 분자는 가열된 물 또는 버퍼를 고체 지지체에 처리하여 방출된다.

일부 구현예에서, 방출된 분자를 정제하는 단계는 시퀀싱 전에 추가로 포함된다.

일부 구현예에서, 샘플이 어레이와 접촉된 후 및 상기 단계 (3) 전에, 샘플에 물을 보충하는 단계가 추가로 포함된다.

일부 구현예에서, 상기 단계 (4) 전에, 방법은 어레이를 세척하여 잔류 샘플(예를 들어, 조직)을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 어레이는 어레이 상의 샘플을 배향시키기 위한 적어도 하나의 배향 마커(orientation marker)를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 단계 (5)에서, 서열 분석 단계는 시퀀싱 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 시퀀싱 단계는 가역적 염료-종결제(reversible dye-terminator)dp 기초한 시퀀싱 반응을 포함한다.

본 발명의 여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나에 따른 핵산 공간 정보를 검출하는 방법은 RNA 검출, 전차세 분석, DNA 검출, 지놈 분석 등에 사용될 수 있다. 공간 정보는 전사체학 및 유전체학 관련 연구에 매우 중요하며, 특히 정상 및 병든 세포 또는 조직의 비교 연구와 같은 상이한 세포 또는 조직 영역에서 전사체 또는 지놈 변이 연구, 또는 질병 진행 중 전사체 또는 지놈 변화 연구 등에 유용하다.

예를 들어, 알츠하이머병의 병태생리학적 분석(pathophysiological analysis)은 그 병리학적 과정이 뉴런과 신경교세포(glial cell)의 상호작용을 포함함을 보여주고, 관련 전사체 및 후성유전체(epigenome) 연구에서도 알츠하이머병 환자의 뇌가 신경 기능을 심각하게 손상시키고 선천 면역 반응의 이상 가지는 것을 발견한 것으로 나타났다. 그러나, 인구-수준 연구는 특히 희귀 세포 유형의 경우, 세포 간 및 세포 집단 내 변화의 복잡성을 밝힐 수 없다. 단일 세포 수준의 일반적인 연구에서는 동일한 기간에 다른 조직 영역에서 특정 세포 유형의 특성과 신경퇴행(neurodegeneration) 중 세포 구성의 변화를 구별할 수 없다. 따라서, 질병의 발병기전 및 발달 모드를 더 밝히기 위해, 공간 차원의 단일-세포 전사체 정보를 얻는 것이 시급하다.

본 발명의 여섯 번째 내지 여덟 번째 측면 중 어느 하나에 따른 핵산 공간 정보를 검출하는 방법은 뇌 조직 샘플의 서로 다른 영역에서 핵산 분자를 칩에 결찰된 위치 결정 태그를 갖는 포획 서열을 통헤 칩에 고정시키고, 시퀀싱을 수행하여, 정확한 위치 정보를 포함하는 전사체 결과를 얻음으로써 알츠하이머병이 진행되는 동안 서로 다른 영역에서 특정 세포 유형의 변화를 감지할 수 있다. 특히, 본 발명의 칩 상의 DNB 또는 DNA 클러스터의 활성 영역은 나노미터 정도로 낮은 등급이지만, 세포 직경은 약 12 um이므로, 본 발명의 칩은 세포 내 해상도로 공간적 위치 결정 정보를 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 다음의 예시적인 구현예를 포함한다:

항목1. 다음 단계를 포함하는 샘플에서 생체분자(예를 들어, 핵산)의 공간 정보를 검출하는데 사용되는 핵산 어레이를 생성하는 방법:

(1) 원형의 핵산 주형을 제공하는 단계로서, 상기 원형의 핵산 주형은 일종의 포획 프로브의 주형 서열을 포함하고, 상기 주형 서열은 5'에서 3'방향으로 링커 영역, 공간 태그 영역, 및 포획 영역을 포함하며; 여기에서,

상기 링커 영역은 절단 부위를 포함하고, 및 절단은 닉킹 효소에 의한 효소적 절단, USER 효소에 의한 효소적 절단, 광절단. 화학적 절단 또는 CRISPR-기반의 절단으로부터 선택될 수 있고;

상기 공간 태그 영역은 공간 태그 서열을 포함하고, 상기 공간 태그 서열은 어레이 상의 일종의 포획 프로브의 위치에 해당하며;

상기 포획 영역은 샘플에서 생체분자(예를 들어, 핵산)을 포획할 수 있는 포획 서열을 포함하고; 여기에서 상기 포획 서열은 다음을 포함한다: (1a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (1b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 분자(예를 들어, 특정 핵산)에 대한 특정 서열인, 단계;

(2) 원형의 핵산 주형을 주형으로 사용하여 주형 서열의 상보적 서열(즉, 주형 상보적 서열)의 연쇄체에 의해 형성되는 DNA 나노볼(DNB)를 얻기 위해 롤링 서클 증폭(RCA)를 수행하는, 단계;

(3) DNB를 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 결찰시키는, 단계;

(4) 프로브 프라이머를 제공하고, DNB에 포함된 주형 상보적 서열을 주형으로 사용하여, 주형 상보적 서열에 혼성화된 가닥이 포획 프로브인 신장 산물을 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계; 선택적으로, 상기 프로브 프라이머가 5'에서 3'방향으로 결합 영역, 절단 영역 및 프라이머 링커 영역을 포함하는 신장 산물을 증폭시키는, 단계; 여기에서,

상기 절단 영역은 절단 부위를 포함하며;

상기 프라이머 링커 영역은 DNB에 포함된 주형 상보적 서열의 링커 영역의 서열(즉, 주형 서열의 링커 영역의 상보적 서열)의 전체 또는 일부에 상보적이고, 및 프로브 프라이머가 프라이머로 기능하고 신장 반응을 개시할 수 있도록 하는 자유 3'말단을 가지며; 바람직하게, 프라이머 링커 영역은 주형 서열 또는 이의 단편의 링커 영역의 서열을 포함하고.

(5) 상기 고체 지지체의 표면에 상기 프로브 프라이머를 결찰시키는 단계; 상기 단계 (4) 및 (5)는 임의의 순서로 수행되고;

(6) 상기 링커 영역에 포함된 절단 부위에서 절단을 수행하여 DNB를 절단하고, 상기 단계 (4)에서 신장 산물을 신장 산물을 형성하는 주형 DNB로부터 분리하여 포획 프로브를 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 결찰시키는, 단계;

바람직하게, 상기 원형의 핵산 주형, DNB 및 포획 프로브는 DNA이고;

바람직하게, 여러 종류의 원형의 핵산 주형은 상기 단계 (1)에서 제공되고, 각 종류의 원형의 핵산 주형은 표면에 여러 종류의 포획 프로브가 부착된 고체 지지체(예를 들어, 칩)를 얻기 위해, 포획 프로브의 상이한 주형 서열을 포함한다.

항목 2. 항목 1에 있어서, 상기 링커 영역에 포함된 절단 부위는 닉킹 효소에 대한 절단 부위이고;

바람직하게, 상기 닉킹 효소는 USER, BamHI, 및 BmtI으로부터 선택되는, 방법.

항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 링커 영역은 시퀀싱 프라이머 혼성화 영역 및/또는 증폭 프라이머 혼성화 영역을 추가로 포함하고; 상기 시퀀싱 프라이머 혼성화 영역은 시퀀싱 프라이머에 어닐링 및 시퀀싱 반응의 개시를 허용하며, 및 증폭 프라이머 혼성화 영역은 증폭 프라이머에 어닐링 및 신장 및 증폭 반응의 개시를 허용하는 것인, 방법.

항목 4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 mRNA의 poly-A 테일과 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고;

바람직하게, 상기 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며;

바람직하게, 상기 poly-T 올리오뉴클레오타이드 서열은 10개 이상(예를 들어, 20개 이상)의 데옥시티미딘 잔기를 포함하는, 방법.

항목 5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 주형 서열은 포획 영역의 업스트림 및 링커 영역의 다운스트림에 위치한 프로브 태그 영역을 추가로 포함하고, 상기 프로브 태그 영역은 변형된 염기로 이루어진 프로브 태그 상보적인 서열을 포함하며, 상기 변형된 염기는 여러 종류의 주요 염기(예를 들어, C, G, A, T, U)와 수소 결합에 의해 상보적인 쌍을 이룰 수 있고;

바람직하게, 상기 프로브 태그 영역은 공간 태그 영역과 포획 영역 사이에, 또는 링커 영역과 공간 태그 영역 사이에 위치하며;

바람직하게, 상기 프로브 태그 상보적인 서열은 복수(예를 들어, 10개 이상)의 이노신(Inosine)을 포함하는, 방법.

항목6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 다음의 하나 이상의 특성을 갖는, 방법:

(i) 상기 링커 영역은 1 bp 초과의, 예를 들어 10 bp 초과의, 또는 20 bp 초과의 길이를 가지고; 바람직하게, 상기 링커 영역은 20 내지 100 bp의 길이를 가지며;

(ii) 상기 공간 태그 영역은 1 bp 초과의, 예를 들어 10 bp 초과의 길이를 가지고; 바람직하게, 상기 공간 태그 영역은 10 내지 100 bp의 길이를 가지며;

(iii) 상기 포획 영역은 1 bp 초과의 길이를 가지고; 바람직하게, 상기 포획 영역은 1 내지 100 bp의 길이를 가지며;

(iv) 상기 프로브 태그 영역은 1 bp 초과의, 예를 들어 5 bp 초과의 길이를 가지고; 바람직하게, 상기 프로브 태그 영역은 5 내지 100 bp의 길이를 가진다.

항목 7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 고체 지지체는 칩이고;

바람직하게, 상기 고체 지지체는 시퀀싱 칩과 같은 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있는, 방법.

항목 8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (4)에서, 프라이머 신장 반응이 수행되는 동안 공간 태그 서열의 상보적인 서열은 상응하는 포획 프로브에 포함되는 공간 태그 서열의 서열 정보를 얻기 위해, 시퀀싱 되는, 방법.

항목 9. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (4) 전에, DNB에 포함된 공간 태그 서열의 상보적인 서열을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하고;

바람직하게, 시퀀싱이 완료된 후, 시퀀싱에 의해 합성 가닥에 첨가된 dNTP를 세척하여 제거하는, 방법.

항목 10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 링커는 활성화기(예를 들어, NH2)와 연결할 수 있는 연결기이고, 및 고체 지지체는 그 표면에 활성화기(예를 들어, NH2)에 의해 변형되며;

바람직하게, 상기 링커는 -SH, -DBCO 또는 -NHS를 포함하고;

바람직하게, 상기 링커는

(DBCO)이며, 및

(Azido-dPEG®8-NHS 에스테르)는 고체 지지체의 표면에 부착되는, 방법.

항목 11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 절단 영역에 포함된 절단 부위는 제어된 절단이 화학적, 효소적, 또는 광화학적 방법에 의해 수행될 수 있는 부위이고;

바람직하게, 상기 절단 부위는 효소 절단 부위이며;

바람직하게, 상기 절단 영역 및 링커 영역에 포함된 절단 부위는 상이한, 방법.

항목 12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 증폭은 PCR을 포함하는, 방법.

항목 13. 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 핵산 어레이.

항목 14. 샘플에서 생체분자(예를 들어, 핵산)의 공간 정보를 검출하기 위하여 표면에 여러 종류의 포획 프로브가 부착된 고체 지지체(예를 들어, 칩)을 포함하는, 핵산 어레이; 상기 각 종류의 포획 프로브는 어레이에서 상이한 위치를 차지하고 포획 프로브가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3'말단을 갖도록 배향되며, 상기 각 종류의 포획 프로브는 5'에서 3'방향으로 결합 영역, 절단 영역, 공간 태그 서열 및 포획 서열을 포함하고;

상기 결합 영역은 고체 지지체의 표면에 결찰될 수 있는 링커를 포함하며;

상기 절단 영역은 절단 부위를 포함하고;

상기 공간 태그 서열은 어레이 상에 포획 프로브 종류의 위치에 상응하며

상기 포획 서열은 포획될 생체분자(예를 들어, 핵산)의 전체 또는 일부와 혼성화될 수 있고, 다음을 포함하는, 핵산 어레이: (1a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (1b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 분자(예를 들어, 특정 핵산)에 대한 특정 서열.

항목 15. 항목 14에 있어서, 각 종류의 포획 프로브의 각각의 포획 프로브(즉, 동일한 공간 정보 서열을 포함하는 포획 프로브)는 서로 다른 프로브 태그 서열을 가지며, 상기 프로브 태그 서열은 포획 서열의 업스트림 및 절단 영역의 다운스트림에 위치하고;

바람직하게, 각 종류의 포획 프로브는 약 500 나노미터의 직경의 활성 영역을 차지하는, 핵산 어레이.

항목 16. 항목 14 또는 15에 있어서, 각 종류의 포획 프로브(즉, 동일한 공간 태그 서열을 포함하는 포획 프로브)는 고체 지지체의 표면 상에 1 micron 미만의 직경을 갖는 영역(즉, 확설 영역)을 차지하고;

바람직하게, 각 종류의 포획 프로브는 약 500 나노미터의 직경을 갖는 활성 영역을 차지하는, 핵산 어레이.

항목 17. 항목 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 고체 지지체는 칩이고;

바람직하게, 상기 고체 지지체는 시퀀싱 칩과 같은 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있는, 핵산 어레이.

항목 18. 항목 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 핵산 어레이는 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는, 핵산 어레이.

항목 19. 다음 단계를 포함하는 샘플에서 생체분자의 공간 정보를 검출하는 방법:

(1) 항목 13 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산 어레이를 제공하거나, 또는 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 핵산 어레이를 얻는 단계; 상기 핵산 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 부착된 여러 종류의 포획 프로브를 포함하고, 각 종류의 포획 프로브는 어레이에서 상이한 위치를 차지하며, 및 포획 프로브는 어레이 상에 포획 프로브 종류의 위치에 상응하는 공간 태그 서열 및 샘플에서 생체분자를 포획할 수 있는 포획 서열을 포함하며;

(2) 핵산 어레이를 테스트할 샘플과 접촉시켜, 상기 포획 프로브의 포획 서열이 테스트될 샘플 내의 생체분자에 결합하여, 생체분자의 위치는 핵산 어레이 상의 포획 프로브의 위치와 연관될 수 있고, 및 공간 정보에 의해 표지된 생체분자가 생성되는 단계;

(3) 어레이의 표면으로부터 공간 태그로 표지된 생체분자를 방출시키는 단계; 및

(4) 상기 (3)에서 방출된 생체분자의 서열을 직접적으로 또는 간접적으로 분석하는 단계.

항목 20. 다음 단계를 포함하는 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하는 방법:

(1) 항목 13 내지 18 중 어느 하나에 따른 핵산 어레이를 제공하거나, 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 핵산 어레이를 얻는 단계; 상기 핵산 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 부착된 여러 종류의 포획 프로브를 포함하고, 각 종류의 포획 프로브는 어레이 내의 상이한 위치를 차지하며, 상기 포획 프로브는 어레이 상의 포획 프로브 종류의 위치에 상응하는 공간 태그 서열 및 샘플에서 핵산을 포획할 수 있는 포획 서열을 포함하고;

(2) 어닐링을 허용하는 조건에서 상기 핵산 어레이를 테스트할 샘플과 접촉시켜, 테스트될 샘플 내의 핵산이 상기 포획 프로브의 포획 서열에 어닐링되도록 하여, 핵산의 위치가 어레이 상의 포획 프로브의 위치와 연관될 수 있게 하는, 단계;

(3) 상기 포획 프로브를 프라이머로 사용하고 포획된 핵산 분자를 주형으로 하여 프라이머 신장이 가능한 조건에서 프라이머 신장 반응을 수행하여, 생성된 신장 산물이 공간 태그 서열 및 포획된 핵산 분자의 상보적인 서열을 포함함으로써, 공간 태그로 표지된 DNA 분자를 생성하는 단계로서; 선택적으로, 공간 태그로 표지된 DNA 분자의 상보적인 가닥을 생성하고/생성하거나, 선택적으로, 공간 태그로 표지된 DNA 분자를 증폭시키며;

(4) 공간 태그로 표지된 DNA 분자 및/또는 이들의 상보적인 가닥 도는 앰플리콘의 적어도 일부가 어레이의 표면으로부터 방출되는 단계; 상기 일부는 공간 태그 서열 및 이의 상보적인 가닥을 포함하고; 및

(5) 상기 단계 (4)에서 방출된 핵산 분자의 서열을 직접적으로 또는 간접적으로 분석하는 단계;

바람직하게, 핵산의 공간 정보는 핵산의 위치, 분포 및/또는 발현을 포함하고;

바람직하게, 상기 포획 프로브는 DNA 분자이며;

바람직하게, 샘플은 조직 절편과 같은 조직 샘플이고;

바람직하게, 조직 절편은 고정된 조직, 예를 들어, 포르말린-고정 파라핀-포매된(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 조직 또는 냉동(deep-frozen) 조직으로부터 제조된다.

항목 21. 항목 20에 있어서, 상기 방법은 단계 (5)에서, 서열 분석이 시퀀싱 또는 서열-특이적 PCR 반응을 포함하는 방법.

항목 22. 항목 20 또는 21에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계 (6)을 추가로 포함하는 방법: 단계 (5)에서 얻어진 서열 분석 정보를 샘플의 이미지와 연관시키는 단계로서, 여기서 샘플은 단계 (3) 전 또는 후에 이미지화된다.

항목 23. 항목 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 샘플 내의 전사체를 검출하기 위해 사용되고, 여기에서:

단계 (3)에서, 포획 프로브를 RT 프라이머로 사용하여 포획된 RNA 분자로부터 cDNA 분자를 합성하며, 상기 cDNA 분자는 공간 태그로 표지되며, 선택적으로 cDNA는 증폭되고;

단계 (4)에서, 상기 cDNA 분자 및/또는 이들의 앰플리콘의 적어도 일부는 어레이의 표면으로부터 방출되며, 여기에서 방출된 핵산 분자는DNA분자 또는 이의 앰플리콘의 제1 및/또는 제2 가닥일 수 있고, 여기에서 일부는 공간 태그 서열 또는 이의 상보적인 가닥을 포함하며;

바람직하게, 단계 (1)에서, 포획된 서열은 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.

항목 24. 항목 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 공간 태그로 표지된 DNA 분자 또는 공간 태그로 표지된 cDNA 분자가 어레이의 표면으로부터 방출되기 전 또는 후에, 상보적인 가닥 또는 cDNA 제2 가닥이 생성되고;

바람직하게, 상보적인 가닥 또는 제2 가닥의 합성은 무작위 프라이머 및 가닥 치환 중합효소를 사용하는, 방법.

항목 25. 항목 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 서열 분석 전에, 공간 태그로 표지된 DNA 분자 또는 cDNA 분자를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하고;

바람직하게, 상기 증폭 단계는 공간 태그로 표지된 DNA 또는 cDNA 분자가 어레이로부터 방출된 후에 수행되거나, 어레이 상의 제자리에서(in situ) 수행되며;

바람직하게, 상기 증폭 단계는 PCR을 포함하는, 방법.

항목 26. 항목 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 서열 분석이 방출된 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

항목 27. 항목 20 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 단계 (4) 전에, 어레이를 세척하여 샘플(예를 들어, 조직)의 잔여물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

항목 28. 항목 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 단계 (4) 전에, 분자는 다음 방법에 의해 어레이의 표면으로부터 방출되고: (i) 핵산 절단; (ii) 변성; 및/또는 (iii) 물리적 방법;

바람직하게, 상기 분자는 효소 절단에 의해 포획 프로브의 절단 영역으로부터 방출되는, 방법.

항목 29. 항목 20 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 단계 (6) 전에, 샘플은 광, 명시야, 암시야, 위상차, 형광, 반사, 간섭, 공초점 현미경 또는 이들의 조합을 사용하여 이미지화 되는, 방법.

본 발명은 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 신규 어레이 및 이의 제조 방법을 제공한다. 핵산 어레이를 핵산의 공간 정보 검출에 적용하면, 고정밀 세포 내 위치 결정(high-precision subcellular positioning) 및 고처리량 조직 위치 결정(high-throughput tissue positioning)을 동시에 구현할 수 있다. 본 발명의 어레이 및 어레이에 기반한 검출 방법은 세포 위치, 세포 내 위치, 세포 소기관 위치, 세포 상호작용, 세포소기관 상호작용, 분자경로 연구, 질병 진단 등에서 응용 가치가 크다.

도. 1은 실시예 2에서 mRNA를 포획한 후의 cDNA 합성의 개략도를 나타낸다.
도. 2는 실시예 2에서 칩으로부터 방출된 분자의 개략도를 나타낸다.
도. 3은 실시예 2에서 cDNA 단편 분포의 2100 검출 결과를 나타낸다.
도. 4는 실시에 3에서 cDNA 시퀀싱에 의해 얻어진 제1 가닥의 25 bp 서열과 포획 칩 상의 위치 결정 서열의 fq를 매칭한 결과를 나타낸다.
도. 5는 실시예 3의 조직 절편에서 mRNA의 발현을 그래프로 나타낸 것이다.
도. 6은 실시예 4의 예시적인 구현예의 DNB에 포함된 프로브 프라이머 및 캐리어 서열의 개략도를 나타낸다.
도. 7은 실시예 3에서 칩에 결찰된 프로브의 개략도를 나타낸다.
도. 8은 실시예 5에서 포획된 핵산 분자의 cDNA 합성의 개략도를 나타낸다.
도. 9는 실시예 5에서 칩으로부터 방출된 분자의 개략도를 나타낸다.
도. 10은 실시예 5에서 cDNA 단편 분포의 2100 검출 결과를 나타낸다.
도. 11은 실시예 6에서 cDNA 시퀀싱에 의해 얻어진 제1 가닥의 20 bp 서열과 포획 칩 상의 위치 결정 서열의 fq를 매칭한 결과를 나타낸다.
도. 12는 실시예 6의 조직 절편에서 mRNA의 발현을 그래프로 나타낸 것이다.

실시예

이제 본 발명을 제한하기보다는 본 발명을 예시하기 위한 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 설명한다.

달리 명시되지 않는 한, 실시예에 기재된 실험 및 방법은 기본적으로 당업계에 공지되어 있고 각종 참고문헌에 기재된 통상적인 방법에 따라 수행하였다. 또한, 실시예에서 특별한 조건이 없는 경우에는 통상적인 조건 또는 제조사에서 권장하는 조건에 따라 수행하였다. 제조사의 지침 없이 사용된 시약이나 기구는 모두 상업적으로 구매한 기존 제품이었다. 당업자는 실시예가 예로서 본 발명을 설명하고, 본 발명에 의해 청구된 보호 범위를 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 알고 있다. 여기에서 언급된 모든 간행물 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.

실시예 1. 포획 칩(capture chip)의 제조(1)

1. 다음과 같은 DNA 라이브러리 서열을 디자인하여 합성하였다. 서열 합성은 Beijing Liuhe BGI에 의해 수행되었다.

5'-phosphorylated-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(링커 A, 서열번호: 1)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(위치 결정 서열의 상보체, N은 C, G, A 또는 T와 같은 임의의 염기를 나타냄)CTGATAAGGTCGCCA(제2 고정화 서열의 상보체, 서열번호: 2)CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(링커 B, 서열번호: 3)-3'. 여기에서, 링커 A는 제1 고정화 서열의 상보체의 일부 및 원형화 부위를 포함하고, 링커 B는 제1 고정화 서열의 상보체의 다른 부분, 절단 부위, 및 원형화 부위를 포함한다.

2. 라이브러리의 in situ 증폭

DNA 나노볼(DNA nanoball, DNB)의 제조: 40 ul의 다음 반응 시스템을 준비하고, 상기 80 fmol의 상기 DNA 라이브러리를 추가하였다. 여기에서, DNB 프라이머는 GGCCTCCGACTTAAGTCGGATCGT (서열번호: 4)의 서열을 가지고 Beijing Liuhe BGI에 의해 합성되었다.

상기 반응 시스템을 반응을 위해 PCR 기계에 넣어주었다. 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분, 40℃에서 3분; 반응 후, 얼음 위에 놓고 DNBSEQ 시퀀싱 키트(DNBSEQ sequencing kit)에서 DNB를 제조하는데 필요한 40 ul의 혼합효소 I 과 2 ul의 혼합효소 II와 1 ul의 ATP(100 mM 모액, Thermo Fisher), 및 0.1 ul의 T4 리가아제(BGI에서 생산)를 첨가하였다. 잘 섞은 후, 상기 반응 시스템을 30℃의 PCR 기계로 옮기고 20분간 반응시켜 DNB를 형성하였다. DNB는 BGISEQ500 SE50 키트에 기술된 방법에 따라 BGISEQ500 시퀀싱 칩에 로딩되었다.

3. 위치 결정 서열의 시퀀싱 및 디코딩: BGISEQ500 SE50 시퀀싱 키트의 지침에 따라, 위치 결정 서열은 25 bp의 시퀀싱 길이로 디코딩 되고 시퀀싱 된다. 시퀀싱에 의해 혀성된 fq 파일은 나중에 사용하기 위해 저장되었다.

4. 포획 서열 고정화: 다음 DNA 서열은 Beijing Liuhe BGI에 의해 합성되었다: 5'-phosphorylated-CTGATAAGGTCGCCA(제2 고정화 서열의 상보체, 서열번호: 5)NNNNNNNNNN(UMI)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN(포획 서열, 서열번호: 6)-3', 여기에서 , N은 임의의 염기(예를 들어, C, G, A, 또는 T)를 나타낸다. 시퀀싱 칩을 시퀀서에서 가져오고, BGISEQ500 SE50 키드의 Hole 7의 절단 시약을 칩으로 펌핑하였다(시약이 전체 칩을 덥고 기포가 생성되지 않도록 한다). 칩을 60℃에서 방치하고 10분간 반응시켰다. 반응 후, 5ХSSC(Shanghai Shenggong에서 구입) 적당량을 시퀀싱 칩에 펌핑하여 칩의 이전 시약을 교체했습니다. 포획 서열을 5xSSC로 1 uM로 희석하고, 희석된 포획 서열을 적당량 칩에 첨가하여, 칩이 포획 서열로 채워지도록 하였다. 칩을 실온에서 약 30분 동안 방치하여 포획 서열이 DNB와 완전히 혼성화되도록 하였다.

5. 칩 다이싱: 준비된 칩을 여러 개의 작은 조각으로 자르고, 실험의 필요에 따라 조각의 크기를 조정하고, 칩을 pH 8.0의 50 mM 트리스 완충액에 담그고, 나중에 사용하기 위해 4℃에서 저장되었다.

실시예 2. 조직 mRNA의 포획 및 cDNA 합성

1. 동결 조직 절편. 마우스의 소뇌 조직 절편(cerebellar tissue section)은 동결 절편의 표준 절차에 따라 만들었다.

2. mRNA 포획. 조직 절편의 크기에 따라, 실시예 1에서 제조한 적당한 크기의 칩을 채취하여 상온에 두었다. 칩 위의 액체가 증발된 후, 조직 절편과 조직 절단기의 칩 사이의 온도 차이로 인해 조직 절편이 포획 칩에 부착되었다. 부착된 조직 절편을 실온에 두고, 칩에 5ХSSC 반응 용액을 첨가하고(조직이 부착된 부위를 완전히 덮음), 30℃에서 30분간 반응하여 조직 내의 mRNA가 칩 상의 포획 영역과 완전히 혼성화되도록 하였다.

3. cDNA 합성. 5ХSSC를 이용하여 칩을 실온에서 2회 세척하고, 200 ul의 하기 역전사 반응 시스템을 준비하고, 반응 용액을 칩에 첨가하여 칩을 완전히 덮고, 42℃에서 90 내지 180분 동안 반응을 수행하였다. mRNA는 cDNA합성을 수행하기 위해 polyT를 프라이머로 사용할 것이며, mRNA의 3' 말단에는 cDNA 상보적인 가닥의 합성을 위해 TSO 태그 (AAGTCGGAGGCCAAGCGGTC/rG//rG//iXNA_G/) (서열번호: 7)가 있다. 상기 과정의 구조도를 도 1에 나타내었다.

4. 공간적 위치 결정 영역을 포획 영역에 결찰. cDNA 합성 후, 칩을 5ХSSC로 2회 세척하였다. 1 ml의 하기 반응 시스템을 준비하고, 하기 결찰 반응 용액으로 칩이 채워지도록 적당한 부피를 칩에 펌핑하고, 도 1에 도시된 닉(nick)을 결찰하였다. 반응은 상온에서 30분 동안 수행되었다. 반응 후, 칩을 55℃의 온도에서 5ХSSC로 5분씩, 3회 세척하였다.

5. cDNA 방출. cDNA의 제1 가닥을 칩 상에서 합성한 후, 적절한 양의 포름아미드 용액을 칩에 첨가하고 55℃에서 10분 동안 반응시켜 칩으로부터 cDNA 가닥을 방출시켰다. 방출된 분자는 도 2에 도시된 구조를 가졌다. 칩으로부터 방출된 반응 용액을 수집하고, 2ХXP 마그네틱 비드를 사용하여 cDNA 가닥을 정제하고, 최종적으로 45 ul의 TE 완충액(Thermo Fisher)을 사용하여 산물을 회수하였다. 큐빗 ssDNA 검출 키트(qubit ssDNA detection kit)를 사용하여 단일 가닥 cDNA를 정량적으로 검출하였다.

6. cDNA 증폭. 100 ul의 하기 반응 시스템을 준비하였다:

상기 반응 시스템을 PCR 기계에 넣고, 다음의 반응 프로그램을 설정하였다: 95℃에서 3분, 11주기(98℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 3분), 72℃에서 5분, 4℃에서 ∞ 반응이 완료된 후, XP 마그네틱 비드를 사용하여 정제 및 회수하였다. 큐빗 키트를 사용하여 dsDNA의 농도를 정량화하였고, 2100을 사용하여 cDNA 단편의 분포를 검출하였다. 2100 테스트 결과는 도 3에 나타내었고, 여기에서 cDNA 길이는 정상이었다.

실시예 3. cDNA 라이브러리의 구성 및 시퀀싱

1. Tn5 중단(interruption). cDNA 농도에 따라 20 ng의 cDNA에 0.5 uM의 Tn5 효소 및 해당 완충액(Tn5 효소의 코팅 방법은 stLFR 라이브러리 구성 키트(stLFR library construction kit)에 따라 수행)을 첨가하고, 잘 혼합하여 20 ul의 반응 시스템을 형성하였다. 반응은 55℃에서 10분 동안 수행되었고, 5 ul의 0.1% SDS를 추가하고 실온에서 5분 동안 잘 혼합하여 Tn5 중단 단계를 종료하였다.

2. PCR 증폭. 100 ul의 하기 반응 시스템을 준비하였다:

혼합 후, PCR 기계에 넣고, 다음 프로그램을 설정하였다: 95℃에서 3분, 11주기(98℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 3분), 72℃에서 5분, 4℃에서 ∞ 반응이 완료된 후, XP 비드를 사용하여 정제 및 회수하였다. 큐빗 키트를 사용하여 dsDNA의 농도를 정량화하였다.

3. 시퀀싱. 상기 중단 후 증폭된 산물의 80 fmol을 취하여 DNB를 제조하였다. 40 ul의 하기 반응 시스템을 준비하였다:

상기 반응 시스템을 반응을 위해 PCR 기계에 넣고, 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분, 40℃에서 3분. 반응이 완료된 후, 얼음 위에 놓고 DNBSEQ 시퀀싱 키트에서 DNB를 제조하는데 필요한 40 ul의 혼합효소 I 과 2 ul의 혼합효소 II와 1 ul의 ATP(100 mM 모액, Thermo Fisher), 및 0.1 ul의 T4 리가아제(BGI에서 생산)를 첨가하였다. 잘 섞은 후, 상기 반응 시스템을 30℃의 PCR 기계로 옮기고 20분 동안 반응시켜 DNB를 형성하였다. MGISEQ2000의 PE50 키트에 기재된 방법에 따라 MGISEQ2000의 시퀀싱 칩에 DNB를 로딩하고, PE50 시퀀싱 모델을 이용하여 해당 지침에 따라 시퀀싱을 수행하였으며, 여기에서 제1 가닥의 시퀀싱은 2단계로 나누어, 즉, 25 bp 시퀀싱 후 암반응 15주기를 수행한 다음, 10 bp UMI 시퀀싱을 수행하고, 제2 가닥에 대해 50 bp 시퀀싱을 수행하였다.

데이터 분석

1. cDNA 시퀀싱에 의해 얻어진 제1 가닥의 25 bp 서열을 포획 칩 상의 위치 결정 서열의 fq(실시예 1의 단계 3에서 얻어진 시퀀싱 결과)와 얼라인먼트하여(by alignment) 매치시켰다. 매칭 결과를 도 4에 나타내었고, 여기에서 밝은 영역이 25 bp의 cDNA 시퀀싱이 포획 칩과 정확히 일치하는 영역을 나타내고, 이 영역은 조직 포획을 위한 포획 칩 상의 영역을 나타낸다. 포획 칩은 공간적 위치 결정 영역을 사용하여 조직 포획 영역을 정확하게 찾을 수 있음을 보여주었다.

2. cDNA 시퀀싱에 의해 포획 칩에 매칭된 DNB를 추가로 분석하였고, 이들 DNB 리드(read)의 cDNA(반응 조직 내 mRNA 발현)의 제2 가닥 시퀀싱 결과와 마우스 지놈 사이의 얼라인먼트 분석(alignment analysis)을 수행하였다. 마우스 지놈에 얼라인된(aligned) DNB의 경우, 25 bp 시퀀싱 결과를 통해 마우스 mRNA 정보를 포획 칩에 얼라인되었다(was aligned). 도 5에서 나타낸 바와 같이, 왼쪽 면은 분석된 조직 절편에서 mRNA 발현의 전체 그림을 보여주었으며, 전체 그림은 이 포획 칩이 조직에서 mRNA 발현 차이를 분석할 수 있음을 보여주었다; 도의 오른쪽 면은 마우스 소뇌(cerebellum)에서 발현되는 무작위로 선택된 유전자의 조직 발현 수준을 보여주며, 이는 이 칩이 전체 조직에서 특정 유전자의 발현 차이를 분석할 수 있음을 나타내었다.

실시예 4. 포획 칩의 제조(2)

5'-phosphorylated-GAACGACATGGCTTTTTCCCGTAGCCATGTCGTTCTGCGCCTTCCCGATG(고정화 서열 1, 서열번호: 12) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(위치 결정 서열 주형, N은 임의의 염기, 예를 들어, C, G, A 또는 T를 나타냄) IIIIIIIIII(UMI 서열, I는 이노신(Inosine)을 나타냄) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(포획 서열, 서열번호: 13) CCTCAGC(절단 부위, 서열번호: 14) CCTTGGCTCACA(고정화 서열 2, 서열번호: 15). 여기에서, 고정화 서열 1은 제1 고정화 서열의 상보체 및 원형화 부위의 일부 서열을 포함하였고, 고정화 서열 2는 제1 고정화 서열의 상보체 및 원형화 부위의 일부 서열을 포함하였다.

2. 라이브러리의 in situ 증폭

DNA 나노볼(DNA nanoball, DNB)의 제조: 40 ul의 다음 반응 시스템을 준비하고, 상기 80 fmol의 상기 DNA 라이브러리를 추가하였다. 여기에서, DNB 프라이머는 GACATGGCTACGTGTGAGCCAAGG(서열번호: 16)의 서열을 가지고 Beijing Liuhe BGI에 의해 합성되었다.

3. 공간 정보의 디코딩

(1) 칩의 표면 변형:

상기 BGISEQ-500 플랫폼 칩의 표면은 다음의 구조를 가진 Azido-dPEG®8-NHS 에스테르와 첩촉되도록 하였다:

칩 표면 변형은 다음 방법에 따라 수행되었다: NHS-PEG8-Azido (564.58 g/mol) 농도는 45 μM이었고, 다음과 같은 방법으로 100 ml를 제조하였다.

-20℃에서 보관하였고, 반복적인 동결 및 해동을 피하였다.

DBCO-프라이머의 농도는 1 μM이었고, PBS 로 희석하였다.

(2) 프라이머 프로브와 연결:

다음 프라이머 프로브 서열은 Beijing Liuhe BGI에 의해 합성되었다:

DBCO(연결기)-UUU(USER 절단 부위)TTTTTCCCGTAGCCATGTCGTTCT GCGCCTTCCCGATG(서열번호: 17, 이 서열은 제1 고정화 서열, PCR 증폭 부위 서열, 중간 서열의 상보체로 구성됨). 1 uM의 상기 프라이머 프로브를 PBS로 희석하여 아지도(azido)로 변형된 칩에 도입하고 상온에서 1 시간 또는 밤새 반응시켰다.

(3) 공간 정보 디코딩. BGISEQ500 SE50 시퀀싱 키트의 지침에 따라, 공간 정보 서열은 디코딩되고 30 bpdml 시퀀싱 길이로 시퀀싱된다(초기 20 bp는 공간 정보 서열이고, 마지막 10 bp는 프로브 태그 서열이다). 시퀀싱에 의해 형성된 fq 파일은 나중에 사용하기 위해 저장되었다.

(4) 포획 영역의 합성:

dTT 및 HiFi 중합효소의 혼합 용액을 준비하고, DNB는 주형으로, 공간 위치 결정 영역을 포함하는 프로브 서열을 프라이머로, dTTP는 기질로 사용하여, 올리고 dT 서열을 신장시켰다.

4. 공간 정보를 포함하는 프로브의 방출

1 uM의 Spatial_RNA_BbvCI 프라이머(5Х SSC로 희석)를 준비하고, 프라이머 서열 CCTCAGCCAACTCCT(서열번호: 18)은 Beijing Liuhe BGI에 의해 합성되었다. 혼성화는 실온에서 30분 동안 수행하였다. 다음의 BbvCI 절제 시스템(1.5 ml)을 준비하였고: 15 ul RE + 150 ul 10Х CS Buffer + 1335 ul ddH2O, 공간 위치 결정 영역이 디코딩된 후 칩에 도입하여 37℃에서 1시간 또는 밤새 반응을 수행하였다. 시퀀싱 키드(MGI)의 WB2를 첨가하여 2회 세척한 후, 포름아미드를 이용하여 55℃에서 15분간 반응시킨 후 WB2로 2회 세척하였다. 얻어진 프로브의 개략도를 도 1에 나타내었고, 프로브 시퀀시는 다음과 같다:

UUU(절단 영역)TTTTTCCCGTAGCCATGTCGTTCTGCGCCTTCCCGATG(제1 고정화 서열의 상보체, 서열번호: 19)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN (위치 결정 서열의 상보체로서, 단계 1의 DNA 라이브러리 서열의 위치 결정 주형과 동일함) NNNNNNNNNN(UMI 서열로서, 단계 1에서 주형으로 사용된 UMI 주형으로부터 얻은 무작위 염기 서열의 상보적인 서열) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(포획 서열, 서열번호: 20).

5. 칩 다이싱(Chip dicing)

준비된 포획 칩을 여러 개의 작은 조각으로 자르고, 실험의 필요에 따라 조각의 크기를 조정하고 칩을 50 mM 트리스 완충액, pH 8.0에 담그고, 나중에 사용하기 위해 4℃에 보관하였다.

실시예 5. 조직 mRNA의 포획 및 cDNA 합성

1. 동결 조직 절편. 마우스의 소뇌 조직 절편은 동결 절편의 표준 절차에 따라 만들었다.

2. mRNA의 포획. 조직 절편의 크기에 따라, 실시예 4에서 제조한 적당한 크기의 칩을 채취하여 상온에 두었다. 칩 위에 액체가 증발된 후, 조직 절편과 조직 절단기의 칩 사이의 온도 차로 인해 조직 절편이 포획 칩에 부착되었다. 부착된 조직 절편을 실온에 두고, 칩에 5ХSSC 반응 용액을 첨가하고(조직이 부착된 부위를 완전히 덮음), 30℃에서 30분간 반응하여 조직 내의 mRNA가 칩 상의 포획 영역과 완전히 혼성화되도록 하였다.

3. cDNA의 합성. 5ХSSC를 이용하여 칩을 실온에서 2회 세척하고, 200 ul의 하기 역전사 반응 시스템을 준비하고, 반응 용액을 칩에 첨가하여 칩을 완전히 덮고, 42℃에서 90 내지 180분 동안 반응을 수행하였다. mRNA는 cDNA합성을 수행하기 위해 polyT를 프라이머로 사용할 것이며, mRNA의 3' 말단에는 cDNA 상보적인 가닥의 합성을 위해 TSO 태그(CGTAGCCATGTCGTTCTGCG/rG//rG//iXNA_G/) (서열번호: 21)가 있다. 상기 과정의 구조도를 도 8에 나타내었다.

4. cDNA의 방출. cDNA 제1 가닥을 칩에서 합성한 후, USER 효소 반응 시스템을 준비하였고, USER 효소 사용 설명서에 따라 반응을 진행하였다. 방출된 분자는 도 9에 개시된 구조를 가졌다. 칩으로부터 방출된 반응 용액을 수집하고, 2Х XP 마그네틱 비드를 사용하여 cDNA 가닥을 정제하고, 최종적으로 45 ul의 TE 완충액(Thermo Fisher)을 사용하여 산물을 회수하였다.

5. cDNA의 증폭. 100 ul의 하기 반응 시스템을 준비하였다:

상기 반응 시스템을 PCR 기계에 넣고, 다음의 반응 프로그램을 설정하였다: 95℃에서 3분, 11주기(98℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 3분), 72℃에서 5분, 4℃에서 ∞ 반응이 완료된 후, XP 마그네틱 비드를 사용하여 정제 및 회수하였다. 큐빗 키트를 사용하여 dsDNA의 농도를 정량화하였고, 2100을 사용하여 cDNA 단편의 분포를 검출하였다. 2100 테스트 결과는 도 3에 나타었고, 여기에서 cDNA 길이는 정상이었다.

실시예 6. cDNA 라이브러리의 구성 및 시퀀싱

1. Tn5 중단(intrruption). cDNA 농도에 따라 20 ng의 cDNA에 0.5 uM의 Tn5 효소 및 해당 완충액(Tn5 효소의 코팅 방법은 stLFR 라이브러리 구성 키트(stLFR library construction kit)에 따라 수행)을 첨가하고, 잘 혼합하여 20 ul의 반응 시스템을 형성하였다. 반응은 55℃에서 10분 동안 수행되었고, 5 ul의 0.1% SDS를 추가하고 실온에서 5분 동안 잘 혼합하여 Tn5 중단 단계를 종료하였다.

2. PCR 증폭. 100 ul의 하기 반응 시스템을 준비하였다:

상기 반응 시스템을 반응을 위해 PCR 기계에 넣고, 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분, 40℃에서 3분. 반응이 완료된 후, 얼음 위에 놓고 DNBSEQ 시퀀싱 키트에서 DNB를 제조하는데 필요한 40 ul의 혼합효소 I 과 2 ul의 혼합효소 II와 1 ul의 ATP(100 mM 모액, Thermo Fisher), 및 0.1 ul의 T4 리가아제(BGI에서 생산)를 첨가하였다. 잘 섞은 후, 상기 반응 시스템을 30℃의 PCR 기계로 옮기고 20분 동안 반응시켜 DNB를 형성하였다. MGISEQ2000의 PE50 키트에 기재된 방법에 따라 MGISEQ2000의 시퀀싱 칩에 DNB를 로딩하고, 고객 시퀀싱 모드를 사용하여 해당 지침에 따라 시퀀싱을 수행하였으며, 여기에서 제1 가닥의 시퀀싱은 2단계로 나누어, 즉, 20 bp 시퀀싱 후, 10 bp 프로브 태그 서열을 시퀀싱 하고, 및 제2 가닥에 대해 50 bp 시퀀싱을 수행하였다.

데이터 분석

1. cDNA 시퀀싱에 의해 얻어진 제1 가닥의 20 bp 서열을 칩 상의 위치 결정 서열의 fq(실시예 4의 단계 3에서 얻어진 시퀀싱 결과)와 얼라인먼트하여(by alignment) 매치시켰다. 매칭 결과를 도 11에 나타내었고, 여기에서 밝은 영역이 20 bp의 cDNA 시퀀싱이 포획 칩과 정확히 일치하는 영역을 나타내고, 이 영역은 조직 포획을 위한 포획 칩 상의 영역을 나타낸다. 포획 칩은 공간적 위치 결정 영역을 사용하여 조직 포획 영역을 정확하게 찾을 수 있음을 보여주었다.

2. cDNA 시퀀싱에 의해 포획 칩에 매칭된 DNB를 추가로 분석하였고, 이들 DNB 리드(read)의 cDNA(반응 조직 내 mRNA 발현)의 제2 가닥 시퀀싱 결과와 마우스 지놈 사이의 얼라인먼트 분석(alignment analysis)을 수행하였다. 마우스 지놈에 얼라인된(aligned) DNB의 경우, 20 bp 시퀀싱 결과를 통해 마우스 mRNA 정보를 포획 칩에 얼라인되었다(was aligned). 도 11에서 나타낸 바와 같이, 왼쪽 면은 분석된 조직 절편에서 mRNA 발현의 전체 그림을 보여주었으며, 전체 그림은 이 포획 칩이 조직에서 mRNA 발현 차이를 분석할 수 있음을 보여주었다; 도의 오른쪽 면은 마우스 소뇌(cerebellum)에서 발현되는 무작위로 선택된 유전자의 조직 발현 수준을 보여주며, 이는 이 칩이 전체 조직에서 특정 유전자의 발현 차이를 분석할 수 있음을 나타내었다.

이상, 본 발명의 구체적인 구현예에 대해 상세히 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 공개된 모든 교시 내용에 따라 세부 사항에 대해 다양한 수정 및 변경이 가능하며, 이러한 변경은 본 발명의 보호 범위 내에 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 모든 것은 첨부된 청구 범위 및 그 등가물에 의해 주어진다.

<110> BGI SHENZHEN MGI TECH CO., LTD. <120> Array and method for detecting spatial information of nucleic acids <130> PI210042 <150> CN 201910403775.6 <151> 2019-05-15 <150> CN 201911240733.1 <151> 2019-12-06 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker A <400> 1 aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aa 32 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complement of second immobilization sequence <400> 2 ctgataaggt cgcca 15 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker B <400> 3 caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac tt 42 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggcctccgac ttaagtcgga tcgt 24 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complement of second immobilization sequence <400> 5 ctgataaggt cgcca 15 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture sequence <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n = a or g or c or t <400> 6 tttttttttt tttttttttv n 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSO tag <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n = rG <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> n = rG <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n = iXNA_G <400> 7 aagtcggagg ccaagcggtc nnn 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aagtcggagg ccaagcggtc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aagtcggagg ccaagcggtc 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gagacgttct cgactcagaa gatg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ggcctccgac ttgagacgtt ctcg 24 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> immobilization sequence 1 <400> 12 gaacgacatg gctttttccc gtagccatgt cgttctgcgc cttcccgatg 50 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture sequence <400> 13 tttttttttt tttttttttt t 21 <210> 14 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavage site <400> 14 cctcagc 7 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> immobilization sequence 2 <400> 15 ccttggctca ca 12 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gacatggcta cgtgtgagcc aagg 24 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a sequence comprising a complement of first immobilization sequence, a PCR amplification site sequence and an intermediate sequence <400> 17 tttttcccgt agccatgtcg ttctgcgcct tcccgatg 38 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 cctcagccaa ctcct 15 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complement of first immobilization sequence <400> 19 tttttcccgt agccatgtcg ttctgcgcct tcccgatg 38 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture sequence <400> 20 tttttttttt tttttttttt t 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSO tag <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n = rG <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> n = rG <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n = iXNA_G <400> 21 cgtagccatg tcgttctgcg nnn 23 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 cgtagccatg tcgttctgcg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 cgtagccatg tcgttctgcg 20 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gagacgttct cgactcagaa gatg 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 cgagaacgtc tccgtagcca tgtc 24

Claims

샘플에서 핵산의 공간 정보(spatial information)을 검출하기 위한 핵산 어레이(nucleic acid array)로서, 여러 종류의 캐리어 서열(carrier sequence)이 표면에 부착된 고체 지지체(solid support)(예를 들어, 칩)를 포함하고, 여기에서 각 종류의 캐리어 서열은 어레이에서 다른 위치를 차지하며, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피(copy)를 포함하고, 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 위치 결정 서열(positioning sequence) 및 제1 고정화 서열(first immobilization sequence)을 포함하며, 여기에서,
상기 위치 결정 서열은 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 갖고;
상기 제1 고정화 서열은 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하는, 핵산 어레이.
제 1항에 있어서, 상기 핵산 어레이는 제1 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 제1 고정화 서열의 상보체 및 위치 결정 서열의 상보체를 포함하며, 및 상기 제1 핵산 분자는 캐리어 서열의 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열과 혼성화하여 이중 가닥을 형성하고;
바람직하게, 상기 각 종류의 캐리어 서열의 각 카피는 그와 혼성화된 제1 핵산 분자를 포함하는, 핵산 어레이.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 핵산 어레이는 제2 핵산 분자를 추가로 포함하며, 상기 제2 핵산 분자는 제1 핵산 분자에 결찰되고(is ligated), 및 상기 제2 핵산 분자는 포획 서열(capture sequence)를 포함하며;
상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있고, 다음을 포함하며: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는 (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3' 말단을 갖고;
바람직하게, 각 제1 핵산 분자는 제2 핵산 분자에 결찰되는, 핵산 어레이.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 각각의 캐리어 서열은 그의 5' 말단에 제2 고정화 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 고정화 서열은 그의 상보적 뉴클레오타이드 서열에 어닐링을 허용하며;
상기 제2 고정화 서열은 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하는, 핵산 어레이.
제 4항에 있어서, 상기 핵산 어레이는 제2 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 제2 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 제2 고정화 서열의 상보체 및 포획 서열을 포함하며;
상기 제2 고정화 서열의 상보체는 캐리어 서열의 제2 고정화 서열과 혼성화하여 이중 가닥을 형성하고;
상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있으며, 다음을 포함하고: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는 (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3' 말단을 가지며;
바람직하게, 상기 각 종류의 캐리어 서열의 각 카피는 그와 혼성화된 제2 핵산 분자를 포함하는, 핵산 어레이.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 증폭에 의해 형성된 증폭 산물(amplification product)이고, 상기 증폭은 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification, RCA), 브릿지 PCR 증폭(bridge PCR amplification), 다중 가닥 치환 증폭(multiple strand displacement amplification, MDA) 또는 에멀젼 PCR 증폭(emulsion PCR amplification)에서 선택되며;
바람직하게, 상기 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 연쇄체(concatemer)에 의해 형성된 DNB이고; 바람직하게, 상기 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 롤링 서클 증폭에 의해 형성된 DNB이며;
바람직하게, 상기 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 클론 집단에 의해 형성된 DNA 클러스터이고;
예를 들어, 상기 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 브릿지 PCR 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이며;
예를 들어, 상기 캐리어 서열의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 에멀젼 PCR 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터이고;
예를 들어, 상기 캐리어의 다중 카피는 캐리어 서열의 상보적인 서열을 주형으로 사용하여 다중 가닥 치환 증폭에 의해 형성된 DNA 클러스터인, 핵산 어레이.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 분자는 고유한 분자식별자(molecular identifier, UMI) 서열을 추가로 포함하고, 상기 UMI 서열은 제1 고정화 서열의 상보체의 5' 말단에 위치하며;
상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 각 N은 독립적으로 A, C, G 및 T 중 임의의 하나이며;
바람직하게, 각각의 제1 핵산 분자에 포함된 UMI 서열은 서로 상이한, 핵산 어레이.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 핵산 분자는 UMI 서열을 추가로 포함하고, 상기 UMI 서열은 포획 서열의 5' 말단에 위치하며;
상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 각 N은 독립적으로 A, C, G 및 T 중 임의의 하나이며;
바람직하게, 각각의 제2 핵산 분자에 포함된 UMI 서열은 서로 상이한, 핵산 어레이.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체(solid support)는 칩(chip)이고;
바람직하게, 상기 고체 지지체는 시퀀싱 칩(sequencing chip)과 같은, 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있으며;
바람직하게, 상기 고체 지지체는 Illumina, MGI 또는 Thermo Fisher 시퀀싱 플랫폼에서 사용되는 고처리량 시퀀싱 칩(high-throughput sequencing chip)과 같은, 고처리량 시퀀싱 칩인, 핵산 어레이.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 mRNA의 poly-A 테일과 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고;
바람직하게, mRNA를 포획할 수 있는 상기 올리고뉴클레오타이드는 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
바람직하게, 상기 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열은 10개 이상(예를 들어, 20개 이상)의 데옥시티미딘 잔기(deoxythymidine residue)를 포함하는, 핵산 어레이.
제 1항에 있어서, 상기 캐리어 서열은 위치 결정 서열의 업스트림에 위치한 포획 서열 주형을 추가로 포함하는, 핵산 어레이로서, 상기 포획 서열 주형은 포획 서열의 상보적 서열을 포함하고, 상기 포획 서열은 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화 할 수 있으며, 다음을 포함하고; (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열;
및, 상기 캐리어 서열의 제1 고정화 서열은 또한 절단 부위(cleavage site)를 포함하고, 절단은 닉킹 효소(nicking enzyme)를 사용한 효소적 절단, USER 효소를 사용한 효소적 절단, 광절단(photocleavage), 화학적 절단 또는 CRISPR-기반의 절단으로부터 선택될 수 있고;
및, 상기 핵산 어레이는 제1 핵산 분자를 추가로 포함하며, 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 결합 영역, 절단 영역, 및 캐리어 서열 상보성 영역을 포함하고,
상기 결합 영역은 고체 지지체의 표면에 결찰할 수 있는 링커(linker capable of ligating)를 포함하며;
상기 절단 영역은 절단 부위를 포함하고;
상기 캐리어 서열 상보성 영역은 캐리어 서열에 상보적일 수 있는 서열을 포함하며, 및 5'에서 3'방향으로, 제1 고정화 서열의 상보체, 위치 결정 서열의 상보체, 및 포획 서열을 포함하고; 및, 상기 포획 서열은 제1 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 자유 3'말단을 가지며;
및, 제1 핵산 분자의 캐리어 서열 상보성 영역은 캐리어 서열과 혼성화하여 이중 가닥을 형성하고;
바람직하게, 상기 각 종류의 캐리어 서열의 각 카피는 그와 혼성화된 제1 핵산 분자를 포함하는, 핵산 어레이.
제 11항에 있어서, 상기 캐리어 서열은 포획 서열 주형의 다운스트림 및 제1 고정화 서열의 업스트림에 위치한 UMI 서열의 상보체를 추가로 포함하고, 상기 UMI 서열의 상보체는 UMI 서열에 상보적이며, 상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어 5 내지 100개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 각각의 N은 독립적으로 A, C, G 및 T 중 임의의 하나인 것이며;
및, 제1 핵산 분자의 캐리어 서열 상보성 영역은 포획 서열의 업스트림 및 제1 고정화 서열의 상보체의 다운스트림에 위치한 UMI 서열을 추가로 포함하고;
바람직하게, 상기 UMI 서열의 상보체는 위치 결정 서열 및 포획 서열 주형 사이, 또는 제1 고정화 서열 및 위치결정 서열 사이에 위치하며;
바람직하게, 상기 각 종류의 캐리어 서열(즉, 동일한 위치 결정 서열을 포함하는 캐리어 서열)의 각각의 카피는 서로 상이한 UMI 서열의 상보체를 포함하는, 핵산 어레이.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 제1 핵산 분자의 링커(linker)는 활성화기(activation group)(예를 들어, NH2)와 연결할 수 있는 연결기(linking group)이고, 및 상기 고체 지지체의 표면은 활성화기(예를 들어, NH2)에 의해 변형되고;
바람직하게, 상기 링커는 -SH, -DBCO 또는 -NHS를 포함하며;
바람직하게, 상기 링커는
(DBCO)이고, 및
(Azido-dPEG®8-NHS 에스테르)는 고체 지지체의 표면에 부착된, 핵산 어레이.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 분자의 절단 영역에 포함된 절단 부위는 제어된 절단이 화학적, 효소적, 또는 광화학적 방법에 의해 수행될 수 있는 부위이고;
바람직하게, 상기 제1 핵산 분자의 절단 영역에 포함된 절단 부위는 효소 절단 부위이며;
바람직하게, 상기 제 1 핵산 분자의 절단 영역은 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위와 상이한, 핵산 어레이.
제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 칩이고;
바람직하게, 상기 고체 지지체는 시퀀싱 칩과 같은, 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있으며;
바람직하게 , 상기 고체 지지체는 Illumina, MGI 또는 Thermo Fisher 시퀀싱 플랫폼에서 사용되는 고처리량 시퀀싱 칩(high-throughput sequencing chip)과 같은, 고처리량 시퀀싱 칩인, 핵산 어레이.
제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 mRNA의 poly-A 테일과 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고;
바람직하게, 상기 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열이며;
바람직하게, poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열은 10개 이상(예를 들어, 20개 이상)의 데옥시티미딘 잔기를 포함하는, 핵산 어레이.
다음을 포함하는 키트(kit): (i) 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 어레이로서, 제2 핵산 분자를 포함하지 않는 핵산 어레이, 및 (ii) 5'에서 3'방향으로 고정화 영역 및 포획 서열을 포함하는 제2 핵산 분자;
상기 포획 서열은 포획될 수 있는 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화 할 수 있고, 및 다음을 포함하고: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및, 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3' 말단을 가진다.
제 15항에 있어서, 상기 키트는 제 2항에 따른 핵산 어레이를 포함하고, 및 상기 제2 핵산 분자의 고정화 영역은 이중-가닥 핵산 서열(예를 들어, 이중-가닥 DNA 서열)을 포함하는 것인, 키트.
제 15항에 있어서, 상기 키트는 제 4항에 따른 핵산 어레이를 포함하고, 및 상기 제2 핵산 분자의 고정화 영역은 제2 고정화 서열의 상보체를 포함하는 것인, 키트.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 어레이에 포함된 제1 핵산 분자가 UMI 서열을 포함하지 않는 경우, 제 2 핵산 분자는 UMI 서열을 추가로 포함하고, 및 상기 UMI 서열은 포획 서열의 5' 말단에 위치하며;
상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 각각의 N은 독립적으로 A, C, G 및 T중 임의의 하나인, 키트.
다음의 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하기 위한 핵산 어레이를 생성하는 방법:
(1) 여러 종류의 캐리어 서열을 제공하는 단계로서, 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하며, 및 상기 캐리어 서열은 5'에서 3'방향으로 위치 결정 서열 및 제1 고정화 서열을 포함하고,
상기 위치 결정 서열은 어레이 상의 캐리어 서열 종류의 위치에 상응하는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 가지며;
상기 제1 고정화 서열은 그것의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 어닐링 및 신장 반응의 개시를 허용하는, 단계;
(2) 여러 종류의 캐리어 서열을 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 결찰시키는 단계;
(3) 제1 프라이머를 제공하고, 상기 캐리어 서열을 주형으로 사용하여 프라이머 신장 반응을 수행함으로써, 제1 고정화 서열의 영역 및 상기 캐리어 서열의 위치 결정 서열이 이중 가닥을 형성하도록 하는 단계로서, 여기에서 상기 캐리어 서열과 혼성화하는 가닥은 제1 핵산 분자이고, 상기 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열의 상보적인 서열을 포함하며; 여기에서, 제1 프라이머는 그것의 3' 말단에 제1 고정화 서열 상보성 영역을 포함하고, 상기 제1 고정화 서열 상보성 영역은 상기 제1 고정화 서열의 상보적인 서열 또는 그것의 단편이며, 및 자유 3' 말단을 가지는, 단계.
제 21항에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 상기 여러 종류의 캐리어 서열은 다음 단계에 의해 제공되는, 방법:
(i) 캐리어 서열의 상보적인 서열을 포함하는 여러 종류의 캐리어 서열 주형을 제공하는 단계;
(ii) 각 종류의 캐리어 서열 주형을 주형으로 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행하여, 각 종류의 캐리어 서열 주형의 증폭 산물을 획득하는 단계, 상기 증폭 산물은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하고;
바람직하게, 상기 증폭은 롤링 서클 증폭(RCA), 브릿지 PCR 증폭, 다중 가닥 치환 증폭(MDA) 또는 에멀젼 PCR 증폭이며;
바람직하게, 롤링 서클 증폭은 상기 캐리어 서열의 연쇄체에 의해 형성된 DNB를 얻기 위해 수행되고;
바람직하게, 브릿지 PCR 증폭, 에멀젼 PCR 증폭 또는 다중 가닥 치환 증폭은 캐리어 서열의 클론 집단에 의해 형성된 DNA 클러스터를 얻기 위해 수행된다.
제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함하는 방법:
(4) 포획 서열을 포함하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계;
상기 포획 서열은 다음을 포함하는 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있고: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및, 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3' 말단을 가지며.
(5) 제2 핵산 분자를 제1 핵산 분자에 결찰시키는 (예를 들어, 리가아제(ligase)를 사용하여 제2 핵산 분자를 제1 핵산 분자에 결찰시키는) 단계.
제 23항에 있어서, 제2 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 고정화 영역 및 포획 서열을 포함하고, 상기 고정화 영역은 이중-가닥 DNA 서열을 포함하는 것인, 방법.
제 23항에 있어서, 각각의 캐리어 서열은 그의 5' 말단에 제2 고정화 서열을 추가로 포함하고, 및 상기 제2 고정화 서열은 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 대한 어닐링을 허용하며; 다음 단계를 추가로 포함하는 방법:
(4) 5'에서 3'방향으로 제2 고정화 서열 및 포획 서열의 상보체를 포함하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계;
상기 제2 고정화 서열의 상보체는 그의 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화를 허용하고;
상기 포획 서열은 포획될 뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있으며, 및 다음을 포함하고: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및, 상기 포획 서열은 제2 핵산 분자가 신장 프라이머로서 기능할 수 있도록 하는 자유 3' 말단을 가지며.
(5) 어닐링을 허용하는 조건 하에 제2 고정화 서열의 상보체를 제2 고정화 서열과 혼성화함으로써, 제2 핵산 분자를 캐리어 서열에 결찰시키는 단계;
(6) 선택적으로, 캐리어 서열에 각각 혼성화된 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 결찰시키는 (예를 들어, 리가제를 사용하여 제2 핵산 분자를 제1 핵산 분자에 결찰시키는) 단계.
제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (3)에서, 제1 프라이머는 제 1 고정화 서열 상보성 영역의 5' 말단에 고유 분자 식별자(unique molecular identifier, UMI)를 추가로 포함하여, 제1 핵산 분자는 제1 고정화 서열의 상보체의 5' 말단에 UMI 서열을 포함하고; 또는 상기 단계 (4)에서, 제2 핵산 분자는 UMI 서열을 추가로 포함하고, 및 상기 UMI 서열은 포획 서열의 5' 말단에 위치하며;
상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 각각의 N은 독립적으로 A, C, G 및 T 중 임의의 하나인, 방법.
제 22항에 있어서,
상기 단계 (1)에서, 캐리어 서열은 위치 결정 서열의 업스트림에 위치한 포획 서열 주형을 추가로 포함하고, 상기 포획 서열 주형은 포획 서열의 상보적인 서열을 포함하며, 및 상기 포획 서열은 다음을 포함하는 포획될 핵산의 전체 또는 일부와 혼성화할 수 있고: (a) mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열; 및/또는, (b) 무작위 또는 축중 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는, (c) 특정 표적 핵산에 대한 특정 서열; 및 상기 캐리어 서열의 제1 고정화 서열은 또한 절단 부위(cleavage site)를 포함하며, 및 절단은 닉킹 효소(nicking enzyme)를 사용한 효소적 절단, USER 효소를 사용한 효소적 절단, 광절단(photocleavage), 화학적 절단 또는 CRISPR-기반의 절단으로부터 선택될 수 있고;
상기 단계 (3)에서, 제1 고정화 서열의 영역, 캐리어 서열의 위치 결정 서열 및 포획 서열 주형은 이중 가닥을 형성하여, 제1 핵산 분자가 5'에서 3'방향으로 제1 고정화 서열, 위치 결정 서열 및 포획 서열의 상보체를 포함하도록하며; 여기에서,
제1 프라이머는 5'에서 3'방향으로 결합 영역, 절단 영역, 및 제1 고정화 서열 상보성 영역을 포함하고, 상기 결합 영역은 고체 지지체의 표면에 결찰할 수 있는 링커(linker)를 포함하며, 및 상기 절단 영역은 절단 부위를 포함하고;
및, 다음 단계를 추가로 포함하며:
(4) 제1 프라이머를 고체 지지체의 표면에 결찰시키는 단계; 여기에서, 단계 (3) 및 (4)는 임의의 순서로 수행되고;
(5) 선택적으로, 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위에서 절단을 수행하여 캐리어 서열을 분해하는 단계로서, 단계 (3)의 신장 생성물(extension product)이 이러한 신장 생성물이 형성되는 주형(즉, 캐리어 서열)으로부터 분리되도록 하고, 따라서 제1 핵산 분자가 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 결찰되는, 단계;
바람직하게, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 다중 사본의 연쇄체(concatemer)에 의해 형성된 DNB인, 방법.
제 27항에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위는 닉킹 효소(nicking enzyme)의 절단 부위이며;
바람직하게, 상기 닉킹 효소는 USER, BamHI, 및 BmtI으로부터 선택되는, 방법.
제 27항 또는 제 28항에 따른 방법으로서, 상기 단계 (1)에서, 상기 캐리어 서열은 포획 서열 주형의 다운스트림 및 제1 고정화 서열의 업스트림에 위치한 UMI 서열의 상보체를 추가로 포함하고, 상기 UMI 서열의 상보체는 UMI 서열에 상보적이며, 상기 UMI 서열은 1개 이상(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상; 예를 들어, 5 내지 100개)의 뉴클레오타이드 N으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이고, 각각의 N은 독립적으로 A, C, G 및 T 중 어느 임의의 하나이며;
및, 상기 단계 (3)에서, 제1 고정화 서열의 영역, 위치 결정 영역, 포획 서열 주형, 및 캐리어 서열의 UMI 서열의 상보체는 이중 가닥을 형성하여, 제1 핵산 분자는 5'에서 3'방향으로 제1 고정화 서열의 상보체, 위치 결정 서열 및 포획 서열의 상보체, 및 포획 서열의 업스트림 및 제1 고정화 서열의 상보체의 다운스트림에 위치한 UMI 서열을 포함하고;
바람직하게, UMI 서열의 상보체는 위치 결정 서열 및 포획 서열 주형 사이, 또는 제1 고정화 서열 및 위치 결정 서열 사이에 위치하는, 방법.
제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프라이머의 링커는 활성화기(예를 들어, NH2)와 연결할 수 있는 연결기이고, 및 고체 지지체의 표면은 활성화기(예를 들어, NH2)에 의해 변형되며;
바람직하게, 상기 링커는 -SH, -DBCO 또는 -NHS를 포함하고;
바람직하게, 상기 링커는
(DBCO)이며, 및
(Azido-dPEG®8-NHS 에스테르)는 고체 지지체의 표면에 부착되는, 방법.
제 27항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프라이머의 절단 영역에 포함된 절단 부위는 제어된 절단이 화학적, 효소적, 또는 광화학적 방법에 의해 수행될 수 있는 부위이고;
바람직하게, 상기 제1 프라이머의 절단 영역에 포함된 절단 부위는 효소 절단 부위이며;
바람직하게, 상기 제1 프라이머의 절단 영역은 캐리어 서열의 제1 고정화 서열에 포함된 절단 부위와는 상이한, 방법.
제 21항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 mRNA의 poly-A 테일과 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고;
바람직하게, 상기 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열은 poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
바람직하게, poly-T 올리고뉴클레오타이드 서열은 10개 이상(예를 들어, 20개 이상)의 데옥시티미딘 잔기를 포함하는, 방법.
제 21항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 칩(chip)이고;
바람직하게, 상기 고체 지지체는 시퀀싱 칩과 같은, 시퀀싱 플랫폼으로 사용될 수 있으며;
바람직하게 , 상기 고체 지지체는 Illumina, MGI 또는 Thermo Fisher 시퀀싱 플랫폼에서 사용되는 고처리량 시퀀싱 칩(high-throughput sequencing chip)과 같은, 고처리량 시퀀싱 칩인, 방법.
제 21항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (3)에서, 신장 반응을 수행하는 동안, 상기 캐리어 서열은 상기 캐리어 서열에 포함된 위치 결정 서열의 서열 정보를 획득하도록 시퀀싱되는, 방법.
제 21항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (3) 전에, 캐리어 서열을 시퀀싱하는 단계를 포함하고;
바람직하게, 시퀀싱이 완료된 후, 시퀀싱으로 인해 합성 가닥에 첨가된 dNTP를 제거하기 위해 세척을 수행하는, 방법.
제 23항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 핵산 어레이;
바람직하게, 상기 핵산 어레이는 제 3항 및 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다.
제 27항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 핵산 어레이;
바람직하게, 상기 핵산 어레이는 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같다.
다음 단계를 포함하는 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하는 방법:
(1) 제 3항 또는 제 5항에 따른 핵산 어레이를 제공하거나, 제 23항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 핵산 어레이를 얻는 단계; 여기에서,
상기 핵산 어레이는 고체 지지체(예를 들어, 칩)의 표면에 부착된 여러 종류의 캐리어 서열을 포함하며, 각 종류의 캐리어 서열은 어레이에서 상이한 위치를 차지하고, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하며;
각각의 캐리어 서열은 그와 혼성화된 제1 핵산 분자를 포함하고, 상기 제1 핵산 분자는 제2 핵산 분자에 결찰되거나, 또는 각각의 캐리어 서열은 이와 혼성화되는 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 포함하며;
상기 제1 핵산 분자는 어레이 상의 캐리어 서열의 종류의 위치에 상응하는 위치 결정 서열의 상보체를 포함하고,
상기 제2 핵산 분자는 샘플에서 핵산을 포획할 수 있는 포획 서열을 포함하며;
(2) 어닐링을 허용하는 조건에서 상기 핵산 어레이를 테스트할 샘플과 접촉시켜, 테스트될 샘플 내의 핵산이 제2 핵산 분자의 포획 서열에 어닐링되도록 하고, 따라서 핵산의 위치는 핵산 어레이 상의 캐리어 서열의 위치와 연관될 수 있게 하는 단계;
(3) (i) 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자가 서로 결찰되지 않은 경우, 각각의 캐리어 서열에 혼성화된 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 결찰시키는(예를들어, 리가아제를 사용) 단계;
상기 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 사용하여, 상기 포획된 핵산 분자에 혼성화하는 가닥이 공간 정보 태그로서 상기 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 갖는 신장 산물(extension product)를 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계; 및/또는
포획된 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 상기 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 주형으로 사용하여, 신장된 포획된 핵산 분자가 공간 정보 태그로서 위치 결정 서열을 갖는 신장된 포획된 핵산 분자를 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계;
대안적으로, (ii) 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자가 서로 결찰되지 않은 경우, 상기 제2 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 사용하여, 신장된 제2 핵산 분자가 포획된 핵산의 상보적인 서열을 포함하는 신장된 제2 핵산 분자를 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계; 각각의 캐리어 서열에 혼성화된 제1 핵산 분자 및 신장된 제2 핵산 분자를 결찰시키는 단계(예를 들어, 리가아제를 사용), 여기에서 제1 핵산 분자에 결찰된 신장된 제2 핵산 분자는 공간 정보 태그로서 상기 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정의 상보체를 가지며;
대안적으로, (iii) 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자가 서로 결찰된 경우, 상기 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 사용하여, 상기 포획된 핵산 핵산 분자에 혼성화하는 가닥이 공간 정보 태그로서 상기 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 갖는 신장 산물을 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계; 및/또는
포획된 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 상기 결찰된 제1 및 제2의 연결된 핵산 분자를 주형으로 사용하여, 신장된 포획된 핵산 분자가 공간 정보 태그로서 위치 결정 서열을 갖는 신장된 포획 핵산 분자를 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는 단계;
(4) 어레이의 표면으로부터 공간 정보 태그로 표지된 핵산 분자의 적어도 일부를 방출하는 단계; 여기에서 일부는 위치 결정 서열 또는 그의 상보적인 가닥 및 포획된 핵산 분자 또는 그의 상보적인 가닥을 포함하고; 및
(5) 상기 단계 (4)에서 방출된 핵산 분자의 서열을 직접적으로 또는 간접적으로 분석하는 단계;
바람직하게, 상기 핵산의 공간 정보는 상기 핵산의 위치, 분포 및/또는 발현을 포함하고;
바람직하게, 상기 샘플은 조직 절편(section)과 같은 조직 샘플이며;
바람직하게, 상기 조직 절편은 고정된 조직, 예를 들어, 포르말린-고정 파라핀-포매된(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 조직 또는 냉동(deep-frozen) 조직으로부터 제조된다.
제 38항에 있어서, 다음을 포함하는 샘플에서 전사체(tanscriptome)를 검출하기 위해 사용되는 방법:
(a) 상기 단계 (3)의 (i)에서, 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 역전사 프라이머로 사용하여 포획된 RNA 분자로부터 cDNA 분자를 생성하고, 상기 cDNA 분자는 공간 정보 태그로서 상기 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 가지며, 선택적으로 상기 cDNA 분자를 증폭시키는 것인, 단계; 또는, 상기 단계 (3)의 (ii)에서, 제2 핵산 분자를 역전사 프라이머로 사용하여 포획된 RNA로부터 cDNA를 생성하고, 공간 정보 태그로서 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 갖는 cDNA 분자를 생성하기 위해, 제1 핵산 분자 및 각각의 캐리어 서열에 혼성화하는 cDNA 분자를 결찰시키며(예를 들어, 리가아제 사용), 선택적으로 상기 cDNA 분자를 증폭시키는 것인, 단계; 또는, 상기 단계 (3)의 (iii)에서, 결찰된 제1 및 제2 핵산 분자를 역전사 프라이머로 사용하여 포획된 RNA로부터 cDNA를 생성하고, 상기 cDNA 분자는 공간 정보 태그로서 상기 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 가지며, 선택적으로 상기 cDNA 분자를 증폭시키는 것인, 단계; 및
(b) 상기 단계 (4)에서, 어레이의 표면으로부터 cDNA 분자 및/또는 그들의 앰플리콘(amplicon)의 적어도 일부를 방출하고, 여기에서 방출된 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 그의 앰플리콘의 첫 번째 및/또는 두 번째 가닥일 수 있고, 여기에서 상기 일부는 위치 결정 서열 또는 그의 상보적인 가닥을 포함하는 것인, 단계;
바람직하게, 상기 단계 (1)에서, 포획된 서열은 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다음 단계를 포함하는 샘플에서 핵산의 공간 정보를 검출하는 방법:
(1) 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 핵산 어레이를 제공하거나, 또는 제 27항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 핵산 어레이를 얻는 단계; 여기에서 상기 핵산 어레이는 그의 표면에 여러 종류의 캐리어 서열을 갖는 고체 지지체(예를 들어, 칩)를 포함하며, 각 종류의 캐리어 서열은 어레이에서 상이한 위치를 차지하고, 상기 각 종류의 캐리어 서열은 캐리어 서열의 복수의 카피를 포함하며;
각각의 캐리어 서열은 그와 혼성화된 제1의 핵산 분자를 포함하고, 상기 제1 핵산 분자는 어레이 상의 캐리어 서열의 종류의 위치에 상응하는 위치 결정 서열의 상보체 및 샘플 내의 핵산을 포회할 수 있는 포획 서열을 포함하며;
(2) 어닐링을 허용하는 조건에서 상기 핵산 어레이를 테스트할 샘플과 접촉시켜, 테스트될 샘플 내의 핵산이 제1 핵산 분자의 포획 서열에 어닐링되도록 하고, 따라서 핵산의 위치는 핵산 어레이 상의 제1 핵산 분자의 위치와 연관될 수 있는, 단계;
(3) 상기 제1 핵산 분자를 프라이머로 사용하고, 프라이머 신장이 가능한 조건에서 포획된 핵산 분자를 주형으로 사용하여, 상기 포획된 핵산 분자에 혼성화하는 가닥이 공간 정보 태그로서 상기 제1 핵산 분자에 포함된 위치 결정 서열의 상보체를 갖는 신장 산물을 생성하기 위해 프라이머 신장 반응을 수행하는, 단계;
(4) 어레이 표면으로부터 공간 정보 태그로 표지된 핵산 분자의 적어도 일부를 방출하고, 여기에서 일부는 위치 결정 서열 또는 그의 상보적인 가닥 및 포획된 핵산 분자 또는 그의 상보적인 가닥을 포함하는, 단계; 및
(5) 상기 단계 (4)에서 방출된 핵산 분자의 서열을 직접적으로 또는 간접적으로 분석하는 단계;
바람직하게, 상기 핵산의 공간 정보는 핵산의 위치, 분포 및/또는 발현을 포함하고;
바람직하게, 상기 샘플은 조직 절편과 같은 조직 샘플이며;
바람직하게, 상기 조직 절편은 고정된 조직, 예를 들어, 포르말린-고정 파라핀- 포매된(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) 조직 또는 냉동 조직으로부터 제조된다.
제 40항에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는 샘플에서 전사체를 검출하기 위해 사용되는 것인, 방법:
상기 단계 (3)에서, 제1 핵산 분자를 RT 프라이머로 사용하여 포획된 RNA 분자로부터 cDNA 분자를 생성하고, 상기 cDNA 분자는 공간 정보 태그로서 상기 제1 핵산 분자에 포함된 위치지정 서열의 상보체를 가지며, 선택적으로 상기 cDNA 분자를 증폭시키고;
상기 단계 (4)에서, 어레이의 표면으로부터 cDNA 분자 및/또는 그들의 앰플리콘의 적어도 일부를 방출하고, 여기에서 방출된 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 그의 앰플리콘의 첫 번째 및/또는 두 번째 가닥일 수 있고, 여기에서 상기 일부는 위치 결정 서열 또는 그의 상보적인 가닥을 포함하며;
바람직하게, 상기 단계 (1)에서, 포획된 서열은 mRNA를 포획할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
제 38항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어 서열의 다중 카피는 상기 캐리어 서열의 연쇄체에 의해 형성된 DNB이거나, 캐리어 서열의 다중 카피는 상기 캐리어 서열의 클론 집단에 의해 형성된 DNA 클러스터인, 방법.
제 38항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (5)에서, 서열 분석은 시퀀싱 또는 서열-특이적 PCR 반응을 포함하는, 방법.
제 38항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 단계 (6)을 추가로 포함하는 방법: 상기 단계 (5)에서 얻어진 서열 분석 정보를 샘플의 이미지와 연관시키는 단계; 여기에서 샘플은 상기 단계 (3) 이전 또는 이후에 이미지화되고;
바람직하게, 상기 샘플의 이미지화는 광, 명시야, 암시야, 위상차, 형광, 반사, 간섭, 공초점 현미경 또는 이들의 조합을 사용한다.
제 38항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 공간 정보 태그로 표지된 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자) 또는 공간 정보 태그로 표지된 cDNA 분자가 어레이의 표면으로부터 방출되기 전 또는 후에, 상보적 가닥 또는 두 번째 가닥 cDNA가 생성되고;
바람직하게, 상기 상보적인 가닥 또는 두 번째 가닥의 합성은 무작위 프라이머 및 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)를 사용하는, 방법.
제 38항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 분석 전에, 공간 정보 태그로 표지된 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자) 또는 cDNA 분자를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하고;
바람직하게, 상기 증폭시키는 단계는 공간 정보 태그로 표지된 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자) 또는 cDNA 분자가 어레이로부터 방출된 후에 수행되거나, 상기 증폭시키는 단계는 어레이 상에서 제자리에서(in situ) 수행되며;
바람직하게, 증폭시키는 단계는 PCR을 포함하는, 방법.
제 38항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 분석 전에, 방출된 핵산 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 38항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (4) 전에, 어레이를 세척하여 샘플(예를 들어, 조직)의 잔류물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제 38항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (4)에서, 핵산 분자는 다음의 방법에 의해 어레이의 표면으로부터 방출되는, 방법: (i) 핵산 절단; (ii) 변성; 및/또는 (iii) 물리적 방법.