JP2001521040A - 全体にまたは部分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドの合成方法 - Google Patents
全体にまたは部分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドの合成方法Info
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Abstract
Description
ものであるように、かつ該単位のそれぞれ1個が、数と配列があらかじめ決めら
れた有限数のコドンに適合し、そして遺伝コード縮重の影響を排除するのに適切
であるように、分子の多少の伸長域に沿ってランダム配列を導入しうる、ポリヌ
クレオチドの合成方法である。
きものである。実際、近年その使用を必要とする応用は、科学研究の多くの分野
においてますます重要性が増大している。これは、例えば、分子構造または機能
における既知タンパク質の真の役割を立証するために、おそらく重要な位置にあ
るそのタンパク質をコードする遺伝子において機能する部位特異的突然変異誘発
の場合である。別の例は、ランダム配列合成オリゴヌクレオチドの「ボックス」
を含有するライブラリーにより提供されるが、これは、新しい生物学的機能を実
行しうる分子を選択するために実現される。
ドンだけが挿入されるように、配列のランダムさを、ある程度制御することが非
常に重要である。同様に重要なことは、該ポリヌクレオチド合成が、単純で費用
効果が高く効率的な方法で、明らかに実施されることである。
いる固相物質のことをいう;該支持体は、通常樹脂または多孔性ガラス粒からな
るが、また当業者に公知の他の任意の物質から作られていてもよい。この用語は
、ポリヌクレオチド合成の付加反応のための支持体に結合している1個またはそ
れ以上のモノマーを含むことを意味する。
持体に結合させるために行われる化学反応のことをいう。これらの反応は、当業
者に公知であり、そして通常、製造業者により与えられる使用説明書に従い、自
動DNA合成機において実現される。
という用語は、オリゴヌクレオチドの化学合成において利用される個々のヌクレ
オチドのことをいう。利用することができるモノマーは、5種の標準ヌクレオチ
ド(塩基のアデニン(それぞれAまたはdA)、グアニン(GまたはdG)、シ
トシン(CまたはdC)、チミン(T)およびウラシル(U)から誘導される)
のそれぞれのリボとデオキシリボ型の両方を含む。イノシンのような塩基誘導体
または前駆体様もまたモノマーに含まれ、さらに例えばモノマーのプリンもしく
はピリミジン塩基上、リボースもしくはデオキシリボース、またはヒドロキシル
もしくはホスフェート基上の任意の位置に、可逆性ブロッキング基を有するよう
な、化学修飾ヌクレオチドも含まれる。これらのブロッキング基は、例えば、ジ
メトキシトリチル、ベンゾイル、イソブチリル、ベータシアノエチルおよびジイ
ソプロピルアミン基を含み、そしてヒドロキシル基、ホスフェートおよびヘキソ
サイクリックアミンを保護するために使用される。しかし当業者に既知の他のブ
ロッキング剤を採用してもよい。
、前述の2個のモノマーまたはモノヌクレオチドの縮合により誘導される分子単
位のことをいう。
る単位を示す。本発明の方法主題において、これらはモノマーまたはダイマーか
らなっていてよい;これらはまた、当該分野において既知の他の方法ではトリヌ
クレオチド単位から構成されていてもよい。
プチド生合成において利用される20個の天然アミノ酸の1個を特定する、3個
の隣接したデスオキシリボヌクレオチドモノマーの配列のことをいう。この用語
はまた、どのアミノ酸もコードしないコドンであるナンセンスコドンも含む。
るポリヌクレオチドセット中の2個以上のコドンに対応する場合のことをいう。
異なるコドンの数は、各特定の位置について2〜64個に変化しうる。
の既知の規則により対応するコドンを特定する、3個の隣接したリボヌクレオチ
ドモノマーの配列のことをいう。
たはそれ以上の位置にランダム化コドンを有する、1セットのオリゴヌクレオチ
ドのことをいう。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドが、6個の長さのヌク
レオチド(すなわち、2個のコドン)からなり、そして配列の第1および第2位
の両方が、20個のアミノ酸の全てをコードするようにランダム化されているな
らば、ランダム化オリゴヌクレオチドの集団は、第1および第2位に20個のト
リプレットの可能な全組合せを有するオリゴヌクレオチドセットを含む。従って
この場合に、可能なコドンの組合せの数は、400である。同様に、全位置でラ
ンダム化されるような方法で、15個のヌクレオチド長のランダム化オリゴヌク
レオチドが合成されるならば、20個のアミノ酸のそれぞれをコードする全ての
トリプレットが、全位置に見い出されるであろう。この場合に、ランダム化オリ
ゴヌクレオチド集団は、205個の異なる可能なオリゴヌクレオチド種を含有す る。
に公知であることを意味する。
ブルーク(Sambrook)ら、1989年)を参照されたい。明瞭に定義されない化
学的性質の本質に関する他の用語は、本発明の当業者に知られていることを意味
し、そしていずれにせよこれらの定義は、エム・ジェイ・ゲイト(Gait, M.J.)
ら、1984年のようなマニュアルに見いだすことができる。
オリゴヌクレオチドの使用を必要とするもの、および少なくとも部分的に縮重し
た配列またはランダム配列を有するオリゴヌクレオチドの使用を必要とするもの
。
理に基づき、1回に1個モノヌクレオチドを縮合し、初めに3’末端から出発し
、そして全反応サイクルについて各モノヌクレオチドを選択することにより、所
望の明白な配列を有するポリヌクレオチドを合成する。
必要のある配列に沿う位置では、合成サイクルは、2個またはそれ以上の異なる
モノマーの混合物を使用して進行する。どのサイクルでも、5’末端に付加され
るモノマーにおいて異なるオリゴヌクレオチド混合物は、こうして作成される。
例えば、あるサイクルで4種の異なるモノヌクレオチドがモノマーとして利用さ
れるならば、挿入される最後のヌクレオチドだけが異なる4種の異なるポリヌク
レオチドを含有する混合物が得られる。同じ種類の合成サイクルが反復されるな
らば、最後の2個の挿入されるヌクレオチドが異なる16種のポリヌクレオチド
の混合物が得られる、等々。
オチドの直接的または間接的挿入を提供し、これはある種の生体中のポリペプチ
ドへと翻訳される(インビトロの翻訳はめったに起こらない)。知られているよ
うに、DNAを翻訳する遺伝子コードは、部分的に縮重している[すなわち、3
個のヌクレオチドコードのグループにより形成される64個の可能なコドンは2
0個のアミノ酸だけ(加えて3個の終止または停止コドン)だけをコードするた
め、2個以上のコドンが単一のアミノ酸をコードする]。
(ここで、ランダム配列に関してポリヌクレオチドは、異なる配列を有するポリ
ヌクレオチドの多少複雑な混合物を意味する)は、ランダム配列のペプチドをコ
ードする(すなわち、ペプチドの混合物に関して、各ペプチドは1個またはそれ
以上のポリヌクレオチドによりコードされる)。
れるランダム配列のオリゴヌクレオチドにおいて3つの重要な結果を内包する:
混合物は、はるかに単純なポリペプチド混合物をコードする。例えば、6個の位
置が4種の天然ヌクレオチドの1個によりランダムに充填されるオリゴヌクレオ
チドの混合物は、4096個の異なる分子(単一のヌクレオチドが考慮されるな
らば46個、コドンが考慮されるならば642個)から作られるが、まさにコード
縮重により、これらは、わずか400個(すなわち202個)の異なるポリペプ チドをコードする。
化学的特徴を有するならば、この現象はそれ自体は無関係であろうが、異なる配
列は、例えば、溶解度、安定性および異なる条件での静電荷、濾過手段による吸
着などに関する、異なる性質を付与しうる。
おいて、ある百分率の末端切断型配列のペプチドが存在するであろう。実際、コ
ドンのランダムな組み込み中には停止シグナルを示すコドンも必然的に挿入され
、従って末端切断型配列のポリペプチド形成は避けがたい。
)は、第1または第2位で切断されているポリペプチドをコードする(すなわち
、第2位の64個の可能なコドンのそれぞれについて第1位の3個の可能な終止
コドン、および第1位の61個の可能なコドンのそれぞれについて第2位の3個
の可能な停止コドン)。従って、400個の可能なポリペプチドと一緒に、21
個の末端切断型ポリペプチドが見い出されよう(第1位の1個と第2位の20個
)。この現象は、長めのランダム配列を有するポリペプチドのライブラリーが作
られるときには、特別な重要性を有する。例えば、27個のヌクレオチドのライ
ブラリー(多くの応用において記載されているように、ノナペプチドライブラリ
ーをコードする)では、35%ものポリヌクレオチドが停止コドンを含む(すな
わち、[649−619]/649)。長い配列ほど、ポリペプチド鎖の早期の終 止をコードする分子を含む割合が高い。
率の存在は、出発ポリヌクレオチド混合物とは異なる複雑さを有するポリペプチ
ド混合物の誘導体化において明らかになる。遺伝子コードは、本質的にユニーク
であるが、実際、同じアミノ酸をコードする異なるコドンが翻訳される効率にお
いて、種々の生物で差がある。例えば、大腸菌(E. coli)のセリンは、コドン UCAによるよりも18倍多くコドンUCUによりコードされる。このため、初
期混合物に加えた等モル濃度の2種の異なるポリヌクレオチドは、異なる効率で
翻訳され、そして生じるポリペプチド混合物は異なるモル比の2種の分子種を含
有することになる。従って選択された細胞系の効率を最大化するためには、コー
ド配列が、その細胞系自体により主として利用される、まさしくそのコドンを含
有することが、非常に適切なことである。
ランダム化が長い配列に関する応用との両方において、ランダム配列ポリヌクレ
オチドを利用する系の効率に、大きな影響を及ぼす。しかしこの影響は、採用さ
れるランダム配列の長さと複雑さに正比例する。
仕上げた、ランダム配列ポリヌクレオチドの完全に均質な混合物(すなわち、同
じ濃度の可能な全分子種を含有するもの)の調製を妨げる。実際に、この方向の
あらゆる努力は、まさにこれら3つの要因の組合せのため、ポリペプチド分子に
ポリヌクレオチドを翻訳するときに部分的に邪魔され、そしてこれが、恐らくか
なりの多くの応用に影響する。
る発現ライブラリーの効率の場合である。
を利用する種々の系の効率の改善を狙った合成方法が、長期間かけて開発された
。
クレオチドの代わりに、あらかじめ形成したトリヌクレオチド(コドンに対応す
る)のモノマー単位としての利用を提供するポリヌクレオチド合成である(ビー
・ビルケナス(Virkenas, B.)ら、1994年;エム・ユー・リトル(Lyttle,
M.U.)ら、1995年;エイ・オノ(Ono, A.)ら、1994年)。すなわち所 望のコドンに対応する20個のトリマーを最初に合成して、少し遅れて、モノマ
ーの代わりにトリマーから作られたモノマー単位を、各合成サイクルで縮合する
ことによりポリヌクレオチド合成を行うことができる。この解決策は、一見単純
かつ有効であるが、実際には後述の利用により、複雑で費用が高く非効率的な方
法を必要とする:
って比較的単純かつ効率的な方法)に従って行われる、3個のブロック化ヌクレ
オチドの縮合により容易に達成可能であるが、合成マトリックスからの新しく形
成されたトリヌクレオチドの分離に厳密に固有の多くの問題が存在する。
が、この場合には、次にポリヌクレオチド合成において使用するという観点から
、ヌクレオチドと側鎖保護基の間の結合をそのまま残す必要があり、側鎖保護基
との結合が関与せずに、支持体マトリックスとの3’−5’結合を分解させるこ
とが試みられた。
変化する製造収率を考慮に入れる必要性は、ほとんど再現性がなく、いずれの場
合にも低い。
この場合も同様に、個々のトリヌクレオチドは、専ら3’位で使用前に選択的に
ブロックをはずす(これらを反応性にするために)必要があり、一方他の全ての
官能基はブロックしたまま残す必要がある。
の合成では、各合成サイクルで、少なくとも2種のヌクレオチドからなる混合物
が使用される。この最も困難な化学的条件で、可能な4種全てのヌクレオチドが
使用されるが、これらのそれぞれの反応性が他のものとのわずかに差があっても
、これらは4成分しかなく、ポリヌクレオチド鎖の形成に各ヌクレオチドの等モ
ルの組み込みを促進する最適なモル比条件を見つけることは困難ではない。
込む必要があるときの困難さである。最初に、全ての可能なトリヌクレオチドに
は、相対的な化学反応性において4種の単純なモノヌクレオチドに比べて顕著に
大きな差が存在するという事実を考慮に入れなければならない。
容易に利用可能であるが、トリヌクレオチドは、上述の困難のため、その定性的
および定量的含量を容易には立証できない溶液として利用されよう。最後に、等
モル組み込みを与えるのに充分な、合成混合物を形成する20成分の正しいモル
比を見い出すことは明らかに困難であろう。当然ながらこれら全ての困難は、複
雑さの少ない混合物の採用により最小化される。
のアミノ酸だけをコードするとき、最初の2個のコドン塩基はしばしば一定であ
り、3番目のコドン塩基だけが異なるという事実に基づく。
クレオチド、すなわちコドンの3番目を与える)において、グアニンとチミン(
またはウラシル)の混合物から誘導されるヌクレオチドを使用し、一方以後の2
回の縮合サイクルでは4種のモノヌクレオチドの混合物を使用するならば、ポリ
ヌクレオチドで示されるコドン中の違いを減少させることができる。すなわち、
ポリヌクレオチドは、64種の可能なコドンを含まないが、NNK(ここで、N
は、4種のヌクレオシドの任意の1種であり、そしてKは、グアノシンまたはチ
ミジンである)という種類の縮重した32種だけを含むように、合成される。2
0種のコードされるアミノ酸のうち、12種は、1個のコドンだけによりコード
され、5種は、2個の可能なコドンによりコードされ、そして3種は、3個の可
能なコドンによりコードされる。最後に、32種のうち1個のコドンだけが、停
止シグナルをコードする。
顕著な利点を有するが、上述の問題をたとえ部分的ではないとしても解決しない
。具体的には、通常の方法に比較してこれは部分的な解決を与えるが、停止コド
ン導入、および末端切断型ポリペプチドの形成の問題を解決しない(ダブリュー
・ヒュアン(Huang, W.)とディー・ブイ・サンティ(Santi, D.V.)、1994
年)。
の所定の位置に挿入される異なるコドンと同じ数の合成容器(通常カラム)に細
分する原理に基づく。次に単一のコドンを全支持体上で合成し、次いでランダム
化ポリヌクレオチド混合物を得るために、種々の支持体を混合する(米国特許第
5,523,388号)。例えば、4種のアミノ酸をコードする4種のコドンを
所定の位置に挿入する必要があるならば、合成樹脂は、4つの部分に細分して、
第1のコドンは第1の樹脂で、第2のコドンは第2の樹脂でというように合成す
る。一旦合成が終了したら、4個の支持体を混合することにより、その5’末端
コドンが4種のコドンについてランダム化されている結合ポリヌクレオチドを有
する支持体樹脂が得られる。
るという利点を有する。この主な限界は、所望のコドンと同じだけ多くの部分に
合成樹脂を再分割する必要があることである。それでコドンの数が少ないならば
、合成は比較的単純になるが、コドンの数が多いならば(ランダム化を意図する
全位置について20個までの異なる合成支持体を用意する必要があるとき)、合
成は極めて複雑になる。製造コストを抑えるために比較的少量の樹脂を扱うこと
が必要であるため、樹脂を10個またはそれ以上の異なる量に細分することは、
極めて厄介で、全合成サイクルにおいて必要とされる化学反応および洗浄の複雑
な操作において取り扱いが困難なものになる。さらに、結合反応の効率を大きく
低下させずに、合成規模を数マイクロモルより大きく増大させることができない
ということに注目する必要がある。
により、上述の困難を克服することを目的とする。本発明は、コドンを含む全ト
リヌクレオチドが、1個のモノヌクレオチドと、これに続くか、または配列中で
最初にくる1個のジヌクレオチドから構成されるという考えに基づく。
クレオチド−ジヌクレオチド(表II)およびジヌクレオチド−モノヌクレオチド
(表III)の組合せを示すことが示されるコドンとの単純な比較により証明する ことができる。
チド(本明細書では以後B+Dと予備、Bは単一のヌクレオチドを意味し、そし
てDはジヌクレオチドを意味する)の組合せから生じるものとして示され、一方
表III(これもIに由来する)は、今度は第1と第2のコドン塩基に対応するジ ヌクレオチド+第3の塩基に対応する単一のヌクレオチド(本明細書では以後、
前述の用語によるD+Bとも呼ばれる)に由来するものとしてのコドンを表す。
ローチとの比較において、全てのアミノ酸をコードするのに必要な最少数のモノ
マー単位(ジヌクレオチドにより構成される)を確実に減少させられると考える
ことが可能になった。実際、表示D+Bにより、13個のジヌクレオチドに等し
く(表IIIにおいて、網掛けにより強調した)、B+Dコード表示によるなら、 さらに小さい7個という非常に小さい数になる(表IIにおいて、これも網掛けに
より強調した)。従ってB+Dの組合せは、最も好ましいものと考えなければな
らない。
う利点にもかかわらず、存在する必要なジヌクレオチドの数が少ないために、総
合的にはD+Bの組合せよりも好ましくはない。各合成混合物形成に必要なダイ
マーの数の最小に維持し続ける、大腸菌(E. coli)、酵母および真核生物細胞 における種々のコドンの示差的使用に関する知識に基づき(本発明の詳細な説明
については以下を参照のこと)、表IIから、それぞれ表IV、VおよびVIを誘導す
ることが可能である(表中、単一コドンの使用頻度が示され、一方最も便利な選
択は、網掛けにより強調される)。
ローチの特徴により、好適なものとして提案される方法は、本明細書に後述の表
IIに示されるヌクレオチド−ジヌクレオチドの組合せ(すなわち、B+Dの組合
せ)に基づくものである。
を合成する場合はU)、C、A、Gの名称で印をつけた、この目的のために使用
される通常の樹脂を含有する、4個の同一の合成カラムの調製を提供する。次に
適宜選択されるジヌクレオチドの混合物を、自動合成機の内側の樹脂上で縮合さ
せる。第1のカラム(T)では、混合物は、表IIにおいて対応して網掛けされて
いるジヌクレオチド(TT;CT;AT;GT;GG)により構成される。第2
のカラム(C)では、混合物は、表IIにおいて対応して網掛けされているジヌク
レオチド(TT;CT;AT;AA;GT)により構成される。第3のカラム(
A)では、混合物は、表IIにおいて対応して網掛けされているジヌクレオチド(
TT;TG;CT;AT;AA)により構成される。第4(G)では、混合物は
、表IIにおいて対応して網掛けされているジヌクレオチド(TT;CT;AT;
AA;GT)により構成される。この合成サイクルに、第2のサイクルが続き、
ここで単一のヌクレオチド(そして具体的には、カラムの記号で示されるもの、
すなわち、第1ではT、第2ではC、第3ではAそして第4ではG)が各カラム
に添加される。第2サイクルの最後に、あらかじめ選択された20種全てのコド
ンが4個のカラムの樹脂に挿入されているが、各カラムには表IIに網掛けされて
いるコドンだけが存在する。配列をさらにランダム化するために、次にカラムを
開いて、合成樹脂を回収し、4種の樹脂を注意深く混合する。
前述のように2つの合成サイクルを反復する。実際には、あらゆる二重合成サイ
クルにおいて、あらかじめ選択されたコドンだけを形成するために、しかし全体
としてはランダムな仕方で、すなわち選択されたコドンに無関係に、3つの新し
い単位が形成ポリヌクレオチド鎖に加えられる。
告されているものに比較して顕著な利点を提供する。
価な市販の試薬を溶液中で使用することにより行われ、生成物の収率は85〜9
0%である(ジー・クマール(Kumar, G.)、1984年)。
特有な反応性の差よりも小さいことが期待される。主な結果は、合成混合物中に
存在する全ての分子種の形成ポリヌクレオチド鎖への均質な組み込みが、容易に
得られるということである。試薬の純度は、本反応のこの側面には決定因子であ
る。
て小さい。実際にこれは、最少7から最大20に変化し、通常の場合には、本明
細書に記載される限りでは、11個のダイマーで充分である。
少化するように行うことができる。一例として、各合成混合物が、わずか5個の
ジヌクレオチドを含有するように選択された、表IIに示されるものがある。これ
によって、全ての成分の均質な組み込みを最適化するための、適切な反応条件お
よび試薬の相対モル濃度の探索が非常に容易になる。
込むことができる。実際、ジヌクレオチドとモノヌクレオシドの注意深い選択に
よって、停止コドンのような望ましくないコドンを除外するように、合成を方向
づけることができる。停止コドンだけを特異的に排除する組合せは、例えば、表
IIに示される組合せであるが、最終配列の1個またはそれ以上の位置において、
任意の望ましくないコドンを除外するように、組合せを修飾することも可能であ
る。
酸である、グルタミン酸、GluまたはE、とアスパラギン酸、AspまたはD
)を除外するなら、所望の位置に対応する合成サイクルでカラムGに適応される
混合物からダイマーATとAAを除外すれば充分であろう。しかし同じ原理に従
って、他の無数の組合せが可能である。
ことができれば、選択された微生物のタンパク質合成において優先的に使用され
るコドンだけの挿入が可能になる。従って、ランダム配列オリゴヌクレオチド混
合物から、低い効率でこの系で翻訳されたものを除外することにより、遺伝子発
現を最大化し、こうしてオリゴヌクレオチドの均質性と生じるオリゴペプチド混
合物の均質性との間の良好な対応を得ることができる。
。実際これらは、専らB+Dの組合せに基づく方法のみに関係するのではなく、
一般的なアプローチに由来するあらゆる種類の方法に当てはまり、従って上述の
ものから推測可能である。
ることができる:先ず最初に単一モノヌクレオチドを合成樹脂上で縮合させ、第
2ラウンドでジヌクレオチド混合物だけを縮合させる。
発明者らが企図するものであるが、前述の第1の方法から本質的に推測可能であ
るため、さらに具体的には記さない。
ヌクレオチド混合物の合成のための方法であって、以下の特徴: ◆各混合物成分は、異なるポリペプチドをコードする。同じポリペプチドをコ
ードする異なるオリゴヌクレオチドは、混合物中に存在しない; ◆各混合物成分に挿入されたランダム配列部分は、配列のランダムさが、単一
のヌクレオチドの代わりに3個の隣接したヌクレオチドの単位(通常コドンに対
応する)に当てはまるように構成される; を有する上記方法が記載される。
チド単位を考慮して、各単位が、所定のリストに定義されかつ4種の天然モノヌ
クレオチドの組合せにより形成される2〜64個の可能なトリヌクレオチドを含
有する、有限数のトリヌクレオチドの配列を採用するように、構成される。
れは以下の操作に基づく:
コドンの、第2および第3の塩基を構成するジヌクレオチドにある)中の、ジヌ
クレオチドをあらかじめ選択;
らに対応するトリプレット表示における均質性を得るために、適切な濃度でa)
の操作により分類される)を含有する混合物の調製;
る1個またはそれ以上の反応容器上で、並行してまたは並行せずに行うことがで
きる合成;
の添加、およびそこに含まれる活性化ジヌクレオチドとc)の合成配列の5’末
端との、続いて起こる結合反応;
器につき1個のモノヌクレオチド)への添加、および該ジヌクレオチドの5’末
端での、続いて起こる結合反応;
しい量(ここで、nは、使用される容器の数である)]による合成容器の復元;
続操作の反復;
は並行しない、容器上での合成。
、そのため各工程は、実験室の習慣に普通に採用される応用基準に基づき修正(
または必要であれば断片化)してもよい。
オチドとの組合せを考慮して得られる、64個のトリヌクレオチドの表(例えば
表IIのような)。
の使用において考慮すべき特徴が記される。その最も普通の(ユニークではない
)形態において、これらの特徴は、天然の遺伝子コードによりコードされるアミ
ノ酸、および合成すべきポリヌクレオチドを最終的に発現する生物の天然ポリヌ
クレオチド配列において比較的多量にあるトリヌクレオチドである(表IV;Vお
よびVIのように)。トリヌクレオチドに固有の他の特徴を確立することは可能で
あると立証されるなら、これらは、合成方策の選択に関して考慮に入れることが
できよう。
て、そして表の4つのカラムにできるだけ均一に分配されるように(表II、III 、IV、VおよびVIの網掛けにより例示されるように)、所望のトリヌクレオチド
の選択が行われる。
いて、本発明は、ジー・クマール(Kumar, G.)とプーニアン(Poonian)により
報告された(ジー・クマール(Kumar, G.)とエム・エス・プーニアン(Poonian
, M.S.)、J. Org. Chem. (1984), Vol. 49, pp. 4905-4912)ように必要なジヌ
クレオチドの調製法を提供する。こうして得られるダイマーは、その5’末端を
ジメトキシ−トリチル基により保護され、一方ダイマーの3’末端は、シアノエ
チルホスホルアミジトにより誘導体化される。塩基は、当該分野において報告さ
れ、ホスホルアミジト法によるオリゴヌクレオチド合成において使用されている
保護基により保護される(特に問わないが図1に示される例のように)。ダイマ
ー純度は、薄層クロマトグラフィー(TLC)およびリン31を用いる核磁気共鳴
(31P−NMR)によって測定すると、85〜90%である。本発明の範囲を
明確にするために、種々のダイマーの合成方法は、これらがポリヌクレオチド合
成に利用される固体マトリックス上の縮合方法と矛盾のないものである限り、重
要ではない。
含有する固相合成のための4個のクロマトグラフィー用カラムを合成容器として
利用して、使用する装置の製造業者の通常のプロトコールを採用して、並行して
行われる。いずれにしても本特許において、一例としてパーキンエルマー(Perk
in Elmer)社の方法を記載するが、他の任意のセット、または同じかもしくは充
分類似の化学反応に基づく固相合成法を利用することも同様に可能である。
)単一かつ所定の配列を有する3’末端部分の並行合成に利用する。ここには、
しばしば制限酵素のための切断部位、またはクローニングもしくはポリヌクレオ
チドの他の任意の望ましい応用のために有用な他の任意の配列を含んでいる。
、T、C、AおよびGとも呼ぶ)上に、それぞれT、C、AおよびGに対応する
ジヌクレオチド混合物を、選択される参照用の表(例えば、本項のα、βおよび
γに前述されるように作成した、表II、IV、V、VIまたは他のものの1つ)に特
定されるコドンの明確化のために加えられる。Tに対応するジヌクレオチドを含
有する混合物は、混合物Tと命名され、Aに対応するものは混合物Aと命名され
、ほかも同様である。
。
物中に存在する単一のジヌクレオチドの相対モル濃度は、単一のジヌクレオチド
の純度とその反応性を考慮に入れて、等モル濃度から逸脱してもよい。単一のジ
ヌクレオチドの反応性の指標は、ヴィルネカス(Virnekas)ら(ヴィルネカス(
Virnekas)ら、1994年);オノ(Ono)ら(オノ(Ono)ら、1994年);
カグシン(Kagushin)ら(カグシン(Kagushin)ら、1994年)に考察された
ように、同じ3’末端ジヌクレオチドを有するトリヌクレオチドの反応性から推
測することができる。
収率で起こる。
に後述の混合である: カラム1(混合物T)5’−O−ジメトキシトリチル、チミジン、3’−O−
シアノエチルホスホルアミジト カラム2(混合物C)5’−O−ジメトキシトリチル、デオキシシチジン N
4−ベンゾイル 3’−O−シアノエチルホスホルアミジト カラム3(混合物A)5’−O−ジメトキシトリチル、デオキシアデノシン
N6−ベンゾイル 3’−O−シアノエチルホスホルアミジト カラム4(混合物G)5’−O−ジメトキシトリチルモノマー、デオキシグア
ノシン N2−イソブチリル 3’−O−シアノエチルホスホルアミジト。
化(古典的合成工程による)後、合成は停止する。
る。
成機に再接続する。
オチドの数に必要とされるだけの回数反復する。
した官能基を有する、所定配列のポリヌクレオチドの5’末端テールを合成して
通常終了する。 従って、開示された全事項を考慮に入れて、本発明の主題は、全体にまたは部
分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドの化学合成方法であり、そのた
めランダム配列では、コドンに対応する各トリヌクレオチド単位は、有限数のあ
らかじめ決められた配列をとりうる。この方法は、ランダム配列部分合成のモノ
マー単位としてあらかじめ合成したモノヌクレオチドとジヌクレオチドを利用す
るという事実、および該合成は、多数の支持体上で行われるという事実を特徴と
し、そのため該支持体のそれぞれの上には、該ジヌクレオチドの混合物が結合し
ている少なくとも1個の反応サイクルが、少なくとも1個のモノヌクレオチドが
結合している反応サイクルと互い違いになっている。好適な実施態様において、
1個のコドン合成に必要なn回の反応サイクルの最後に、支持体が、混合され、
次に2個またはそれ以上の反応容器に再分割される。
ドンの、第2および第3塩基、または第1および第2塩基を作るジヌクレオチド
のケースである。
ヌクレオチドから構成されるケース、さらにこれらがリボヌクレオチドから作ら
れるケースである。
好適な実施態様に見られるように、B+D構造に相当する)が利用されるとき、
本方法は、a)〜i)の操作において上記で詳細に説明したものである。
利用される類似したケース(D+Bスキームに対応する)では、方法は、d)と
e)においてその操作を逆転させるほかは、ほぼ完全に同じである。
う数であるとき、支持体は樹脂から構成され、そして容器はカラムから構成され
る。
レオチド、そして具体的にはそれぞれジヌクレオチドのTT、TC、TG、CT
、CC、CG、AC、AA、AG、GT、GG、ジヌクレオチドTC、TG、C
C、AC、AG、GC、GGおよびジヌクレオチドTT、TC、TG、CT、C
A、AC、AA、AG、GT、GA、GGを利用する方法である。
C;TG;CC;AC;AA;X=TG;CG;AC;AG;GT;Y=TT;
CT;AC;AA;GT;Z=TC;CT;AC;GT;GG;として混合され
るケースが特に考えられ、およびコドンが以下のグループ分け: AW1=イソロイシン、メチオニン、トレオニン、アスパラギン、リジン; CX1=ロイシン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン; GY1=バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン; TZ1=フェニルアラニン、セリン、チロシン、システイン、トリプトファン ;によって4種の樹脂カラム上で得られるケースが考えられる。
合されるケースを同じ関連で考えられる。
徴、利点および操作の様式をより理解できるように、その具体的実施態様をさら
に詳細に説明する。これらの例は、例示のためだけであって、添付される請求の
範囲により定義される本発明の範囲を限定する目的であるのではない。
成に必要なダイマーを調製するために、ジー・クマール(Kumar, G.)とプーニ アン(Poonian)が報告した方法(ジー・クマール(Kumar, G.)とエム・エス・
プーニアン(Poonian, M.S.)、J. Org. Chem. (1984), Vol. 49, pp. 4905-491
2)により、表中で網掛けされて示す11個のジヌクレオチドを調製することを 決定した。こうして得られたダイマーは、その5’末端でジメトキシトリチル基
により保護され、一方ダイマーの3’部分は、シアノエチルホスホルアミジトに
より誘導体化される。塩基は、クーマール(Koomar)とプーニアン(Poonian) により報告され図1で特定される、ホスホルアミジト法によりオリゴヌクレオチ
ドの合成において使用される保護基で保護される。
ストから推測した:
(4×2’−H)、2.80−2.90(2H,m,−CH2CNおよび2H, m,OCH2 シアノエチル)、3.70−3.90(13H,m,5’ヌクレ オシドの2×5’−H,DMTrの2×OCH3,POCH3および2H,m,−
CH−イソプロピル)、4.00−4.50(4H,3’ヌクレオシドの2×5
’−Hおよび2×4’−H)、5.00−5.35(2H,m,3’−H)、6
.20−6.50(2H,m,1’H)、6.80−6.95(4H,d,J=
8.8Hz,DMTrの3,3’,5,5’−H)、7.15−7.30(DM
Trの9H)
48.60(2×P(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 10 85.03(M+Na+);Rf:0.44(5% MeOH/DCM)
−8.80(4H,m,アデニンの2−Hおよび8−H)。31P(CDCl3) :δ −1.69、−1.91(2×P(V)ジアステレオマー);148.1
0、148.60(2×P(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1289.5(M+Na+)、Rf:0.47(5% MeOH/DCM)
6−H)、7.50−8.20(10H,m,bz.)。31P(CDCl3): δ −1.19、−1.94(2×P(V)ジアステレオマー);147.88
、149.07(2×P(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1242.5(M+H+);Rf:0.48(5% MeOH/DCM)
H3)、2.40−2.55(2H,m,イソブチリルのCH)、7.50−7 .60(2H,m,グアニンの8−H)。31P(CDCl3):δ −2.19 、−1.51(2×P(V)ジアステレオマー);147.69、148.19
(2×P(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1253.2( M+H+);Rf:0.37(5% MeOH/DCM)
.45−8.20(5H,m,bz)。31P(CDCl3):δ 1.00、− 1.98(2×P(V)ジアステレオマー);147.8、148.4(2×P
(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1152.4(M+H+)
;Rf:0.41(5% MeOH/DCM)
1H,m,イソブチリルのCH)、7.20−7.25(1H,m,チミンの6
−H)、7.40−7.70(1H,m,グアニンの8−H)。31P(CDCl 3 ):δ −2.20、−3.00(2×P(V)ジアステレオマー);147 .20、148.20(2×P(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m /z 1158.4(M+H+);Rf:0.37(5% MeOH/DCM)
デニンの2,8−H)。31P(CDCl3):δ −1.63、−2.20(2 ×P(V)ジアステレオマー);147.06、148.54(2×P(III) ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1271.4(M+H+);Rf :0.38(5% MeOH/DCM)
H)、7.50−8.70(12H,m,bzの2×(2,3,4,5,6−H
)およびアデニンの2,8−H)。31P(CDCl3):δ −0.19、0. 29(2×P(V)ジアステレオマー);147.66、148.66、148
.55(2×P(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1266 .1(M+H+);Rf:0.44(5% MeOH/DCM)
.40(3H,m,シトシンの5,6−Hおよびチミンの6−H)、7.50−
8.05(5H,m,bz)。31P(CDCl3):δ −1.53、−1.9 8(2×P(V)ジアステレオマー);148.20、148.45(2×P(
III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1175(M+Na+);1
191(M+K+);Rf:0.42(5% MeOH/DCM)
−H)、7.70−7.75(1H,m,グアニンの8−H)。31P(CDCl 3 ):δ −0.40、−1.00(2×P(V)ジアステレオマー);148 .00、148.80(2×P(III)ジアステレオマー)。ESI−MS:m /z 1158.5(M+H+);1181(M+Na+);1196.4(M+
K+);0.41(5% MeOH/DCM)
,m,シトシンの5,6−H)、7.45−8.30(6H,m,5H Bzお
よびグアニンの8−H)。31P(CDCl3):δ −2.47、−2.69( 2×P(V)ジアステレオマー);147.75、148.16(2×P(III )ジアステレオマー)。ESI−MS:m/z 1246(M+H+);0.4 4(5% MeOH/DCM)
測することができる。
リヌクレオチドを意味する)。
ドから構成されるであろう。
れる:
IED BIOSYSTEM)394DNA/RNA合成機に、それぞれ機械の5,6,7, 8の位置に載せる。全ての試薬(溶媒、アクチベーター、および40nmol規模の
合成カラム)はパーキンエルマー(PERKIN ELMER)から購入して、製造業者の指
示書により使用した。
びZを加え、3分の結合時間で反応を行う。ダイマーの縮合反応は、トリチル放
出により測定して、通常90〜95%の収率で行われる。カラム上で以下のオリ
ゴヌクレオチドが合成される: カラム1 W TCG ACC T −3’ カラム2 X TCG ACC T −3’ カラム3 Y TCG ACC T −3’ カラム4 Z TCG ACC T −3’
の添加が続く: カラム1 AW TCG ACC T −3’ カラム2 CX TCG ACC T −3’ カラム3 GY TCG ACC T −3’ カラム4 TZ TCG ACC T −3’
される。カラムを分解し、開き、そして4個の合成カラムの樹脂をひとつにして
(全体で40mg)、均質に混合する。
ムにまた再分割する: カラム1 P TCG ACC T −3’ カラム2 P TCG ACC T −3’ カラム3 P TCG ACC T −3’ カラム4 P TCG ACC T −3’ (ここで、P=(AW+CX+GY+TZ)である)。
する。この時点で、第2の縮重コドンP’を合成したため、カラムは以下を含有
する: カラム1 P’ P TCG ACC T −3’ カラム2 P’ P TCG ACC T −3’ カラム3 P’ P TCG ACC T −3’ カラム4 P’ P TCG ACC T −3’ (ここで、P’=P=(AW、CX、GY、TZ)である)。
側面を接するオリゴヌクレオチド[AGT CGC G]を4個のカラム上に並
行して合成し、従って配列オリゴヌクレオチド: 5’−AGT CGC G P’ P TCG ACC T−3’ [ここで、コドン:ATC、ATG、ACC、AAC、AAA、CTG、CCG
、CAC、CAG、CGT、GTT、GCT、GAC、GAA、GGT、TTC
、TCT、TAC、TGTおよびTGGに対応する、P’=P=(AW、CX、
GY、TZ)である]を構成する。
外して、O−メチルホスホルアミジトの化学を使用して、合成オリゴヌクレオチ
ドの作成に採用された古典的方法により脱保護する(7)。
、CAC、CAG、CGT、GTT、GCT、GAC、GAA、GGT、TTC
、TCT、TAC、TGTおよびTGGに対応する、P’=P=(AW、CX、
GY、TZ)である]を有する、例2において合成されたポリヌクレオチドの機
能性および遺伝子解析 例2において合成された縮重ポリヌクレオチドは、400個のポリヌクレオチ
ドの混合物から作られる。本例において、この混合物は便宜上「ポリヌクレオチ
ドB」と呼んだ。その真の組成を分析し、合成に期待される400の分子種全て
が混合物中に存在することを実際に確認するために、以下の工程を行った:
の3’末端部分(7種のヌクレオチド)、およびオリゴヌクレオチドBの5’末
端部分とその5’末端部分(7種のヌクレオチド)の両方において相補的になる
よう設計した。 配列(A)=5'CGCGACTA AGG TCG A 3' 配列(B)=5' TCC AGC T[P P'] GCGCTG A 3' 配列(A)=5' CGCGAC T AGGTCGA 3'
混合し、95℃で変性して、次にゆっくり温度を15℃にしてアニーリングと重
合を行った。
一緒にインキュベートすることにより反応を完了させた。連結反応は、2つの結
合したオリゴヌクレオチドAおよびBにより構成されたDNA単位の連続「ヘッ
ド−テール」反復を含有する、二重らせんDNA断片の形成を伴う。
coRV部位にクローン化した。次に連結混合物は、EcoRV消化により組換
えクローンを濃縮して、コンピテントXL−1ブルー細菌細胞を形質転換するの
に使用した。
量的選択により同定した。
列をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)により増幅およびクローン化した。
を測定した。
チドBに含まれる170個の可変部分が決定された。
について観察された頻度を示す。表VIIIから、本実験計画(表IVに従う)におい
て期待された全てのトリヌクレオチドが存在し、その頻度は、均一な分布から有
意には突出しないことが判る。
0個のコドンの配列決定から観察されたトリプレットの頻度。
プローチシリーズ」 (1984) IRLプレス・オックスフォード・ワシントンDC ●ダブリュー・ファン(Huang, W)とディー・ブイ・サンティ(Santi, D.V. )、(1994) Anal. Biochem. 218, p.454-457 ●エイ・エル・カユシン(Kayushin, A.L.)、エム・ディー・コロステレヴァ
(Korosteleva, M.D.)、エイ・アイ・ミロシュニコフ(Miroshnikov, A.I.)、
ダブリュー・コッシュ(Kosch, W.)、ディー・ズボフ(Zubov, D.)およびエヌ
・ピール(Piel, N.)、(1996) Nucleic Acid Research vol.24, No.19 ●ジー・クマール(Kumar, G.)とエム・エス・プーニアン(Poonian, M.S.) 、J. Org. Chem. (1984), Vol. 49, pp. 4905-4912 ●エム・エイチ・リトル(Lyttle, M.H.)、イー・ダブリュー・ナポリターノ
(Nabolitano, E.W.)、ビー・エル・カリオ(Calio, B.L.)およびエル・エム ・カウヴァー(Kauvar, L.M.)、Biotechniques (1995), Vol.19, N 2, p.274-2
80 ●エイ・オノ(Ono, A.)、エイ・マツダ(Matsuda, A.)、ジェイ・ザオー(
Zhao, J.)およびディー・ブイ・サンティ(Santi, D.V.)、Nucleic Acids Res
earch (1994), Vol.22; N25, p.5600-5607 ●ジェイ・サムブルーク(Sambrook, J.)、イー・エフ・フリッシュ(Fritsc
h, E.F.)およびティー・マニアティス(Maniatis, T.) (1989) 「分子クロー ニング。実験室マニュアル」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、第2
版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州 ●ビー・ビルネカス(Virnekas, B.)、エル・ゲー(Ge, L.)、エイ・プルッ
クスタン(Plucksthun, A.)、ケイ・シー・シュナイダー(Schneider, K.C.) 、ジー・ウェルンホッファー(Wellnhofer, G.)およびエス・イー・モロニー(
Moroney, S.E.)、Nucleic Acids Research (1994), Vol.22; N25, p.5600-560
7
学構造を示す。各ダイマーは、各ダイマーについて特定されるように、B2位の
基および次にB1位の基を置換することにより得られる。
Claims (20)
- 【請求項1】 ランダム配列部分について、1個のコドンに対応する各トリ
ヌクレオチド単位が、有限数のあらかじめ決められた配列をとりうる、全体にま
たは部分的にランダムな配列を有するポリヌクレオチドの化学合成方法であって
、ランダム配列部分のモノマー合成単位として、あらかじめ合成したモノヌクレ
オチドとジヌクレオチドを利用すること、および該合成が多数の支持体上で行わ
れ、ここで該支持体のそれぞれの上には、該ジヌクレオチドの混合物が結合して
いる少なくとも1個の反応サイクルが、少なくとも1個のモノヌクレオチドが結
合している反応サイクルと互い違いになっていることを特徴とする、上記方法。 - 【請求項2】 1個のコドン合成に必要なn回の反応サイクルの最後に、支
持体が、混合され、次に2個またはそれ以上の反応容器に再分割されることを特
徴とする、請求項1に記載のポリヌクレオチドの化学合成方法。 - 【請求項3】 ポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドから作られ
る、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項4】 ポリヌクレオチドが、リボヌクレオチドから作られる、請求
項1または2に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項5】 ジヌクレオチドが、それぞれ第1または第3の塩基を共有す
るコドンまたはアンチコドンの、第2および第3の塩基、または第1および第2
の塩基を構成する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの化
学合成方法。 - 【請求項6】 本質的に下記の工程: a)群(各群は、配列中に存在するはずのかつ第1の塩基を共有する、少なく
とも1個のコドンまたはアンチコドンの、第2および第3の塩基を構成する少な
くとも1個のジヌクレオチドからなる)中の、ジヌクレオチドをあらかじめ選択
する工程; b)活性化および保護ジヌクレオチド(該ジヌクレオチドは、該混合物中に分
布し、さらに対応するトリプレット表示における均質性を得るために、適切な濃
度でa)の操作により組立てられる)を含有する混合物を調製する工程; c)最終配列の3’末端に生じる既知配列の固相合成のための支持体上で行わ
れる、合成する工程; d)b)の活性化および保護ジヌクレオチドの混合物を、合成支持体(各支持
体につき1回)に、およびそこに含まれる活性化ジヌクレオチドとc)の合成配
列の5’末端との続いて起こる結合反応に、加える工程; e)少なくとも1個の活性化および保護モノヌクレオチドを、少なくとも1個
の合成支持体(各支持体につき1個のモノヌクレオチド)に、および該ジヌクレ
オチドの5’末端での続いて起こる結合反応に、加える工程; f)容器を開け支持体を混合して、均質な反応混合物を得る工程; g)ある量の均質な混合物[前工程f)において各支持体につき1/n画分に
等しい量(ここで、nは、使用される支持体の数である)]を用いて合成支持体
を復元する工程; h)応用目的に必要とされるだけの回数、d)、e)、f)の連続操作を反復
する工程; i)最終ポリヌクレオチド産物の5’末端に生じる既知配列を合成する工程;
の組合せを含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド
の化学合成方法。 - 【請求項7】 下記の操作: a1)群(各群は、配列中に存在するはずの、第3の塩基を共有する、少なく とも1個のコドンの、第1および第2の塩基を構成する少なくとも1個のジヌク
レオチドからなる)中の、ジヌクレオチドをあらかじめ選択する操作; b1)活性化ジヌクレオチド(該ジヌクレオチドは、該混合物中に分布し、さ らに対応するトリプレット表示における均質性を得るために、適切な濃度でa1 )の操作により分類される)を含有する混合物を調製する操作; c1)最終配列の3’末端に生じる既知配列の固相合成のための支持体上で行 われる、合成する操作; d1)少なくとも1個の活性化および保護モノヌクレオチドを、少なくとも1 個の合成カラム(各カラムにつき1個のモノヌクレオチド)に、およびc1)で 合成される配列の5’末端での続いて起こる結合反応に、加える操作; e1)b1)の活性化および保護ジヌクレオチドの混合物を、合成支持体(各支
持体につき1回)に、およびそこに含まれる活性化ジヌクレオチドとd1)のモ ノヌクレオチド5’末端との続いて起こる結合反応に、加える操作; f1)容器を開け支持体を混合して、均質な反応混合物を得る操作; g1)前操作f1)のある量の均質な混合物[各支持体につき1/n画分に等し
い量(ここで、nは、使用される支持体の数である)]を用いて合成支持体を復
元する操作; h1)応用目的に必要とされるだけの回数、d1)、e1)、f1)およびg1) の連続操作を反復する操作; i1)最終ポリヌクレオチド産物の5’末端に生じる既知配列を合成する操作 ; の組合せを含んでなることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の
ポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項8】 合成は、支持体上で並行して行われる、請求項1〜7のいず
れか1項に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項9】 ジヌクレオチド混合物と関連合成支持体は、4個である、請
求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項10】 支持体は樹脂から作られる、請求項1〜9のいずれか1項
に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項11】 容器はカラムにより構成される、請求項1〜10のいずれ
か1項に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項12】 使用されるジヌクレオチドは、トリヌクレオチド単位の形
成を決定し、その配列は、大腸菌(Escherichia coli)ゲノムにおける最もよく
あるコドンに対応する、請求項1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチ
ド配列の化学合成方法。 - 【請求項13】 ジヌクレオチドは、TT、TC、TG、CT、CC、CG
、AC、AA、AG、GT、GGである、請求項12に記載のポリヌクレオチド
配列の化学合成方法。 - 【請求項14】 ジヌクレオチドは、下記: W=TC;TG;CC;AC;AA; X=TG;CG;AC;AG;GT; Y=AA;AC;CT;GT;TT; Z=GG;AC;CT;GT;TC; のとおり4個の混合物として混合される、請求項13に記載のポリヌクレオチド
配列の化学合成方法。 - 【請求項15】 コドンは、下記の群: AW1=イソロイシン、メチオニン、トレオニン、アスパラギン、リジン; CX1=ロイシン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン; GY1=バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン; TZ1=フェニルアラニン、セリン、チロシン、システイン、トリプトファン ; のアミノ酸をコードするように、合成支持体上で得られる、請求項13に記載の
ポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項16】 ジヌクレオチドは、下記の割合: W2:[AA]=[CC]=[TC]=[AC]=1M、および[TG]=1 .5M; X2:[TG]=[AC]=[GT]=[CG]=1M、および[AG]=1 .5M; Y2:[GT]=[AC]=[CT]=[AA]=1M、および[TT]=1 .5M; Z2:[GG]=2M、[AC]=[CT]=[GT]=1Mおよび[TC] =1.5M で混合される、請求項13に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。
- 【請求項17】 使用されるジヌクレオチドは、トリヌクレオチド単位の形
成を決定し、その配列は、真核生物ゲノムにおける最もよくあるコドンに対応す
る、請求項1〜11に記載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項18】 あらかじめ合成されたジヌクレオチドは、TC、TG、C
C、AC、AG、GC、GGである、請求項17に記載のポリヌクレオチド配列
の化学合成方法。 - 【請求項19】 真核生物は、酵母(Yeasts)である、請求項17に記載の
ポリヌクレオチド配列の化学合成方法。 - 【請求項20】 あらかじめ合成されたジヌクレオチドは、TT、TC、T
G、CT、CA、AC、AA、AG、GT、GA、GGである、請求項19に記
載のポリヌクレオチド配列の化学合成方法。
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