JP2022509476A - ファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体、並びにその製造方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、フェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）がフラクトオリゴ糖の主鎖をなす糖の一部に結合された構造を有する新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を提供する。本発明に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、これに対応するフェノール酸ファイトケミカルに比べて口腔－胃腸通過条件でほとんど分解されず、大部分が大腸に到達することができるので、経口投与時、大腸にて優れた生体利用性を有する。特に、本発明に係るフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体は、商業的な大腸癌治療用薬物と比較したとき、大腸癌細胞の選択的死滅効果に優れ、大腸癌を予防、改善または治療するのに有用な食品薬学素材として使用することができる。

Description

本発明は、ファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体等に関するものであって、さらに詳しくは、フラクトオリゴ糖の主鎖をなす糖の一部にフェノール酸形態のファイトケミカルが側鎖結合されてなる新規な物質、並びにその製造方法及びその生理活性に基づいた多様な用途に関する。

大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、ＣＲＣ）は、死亡率が世界的に３番目に高い疾患であり、毎年百万人以上の人々が大腸癌に罹患すると報告されている。大腸癌発病の遺伝的リスクは約１０％であるのに対し、驚くべきことに、残りの９０％は不健康なライフスタイルと食習慣に起因する。大腸癌を治療すべく開発されたほとんどの薬物および化合物は、合成物質であったり、バイオシミラーであり、これらは治療中若しくは治療後に患者等に合併症などの深刻な副作用または生活の質を落とすなど、意図しなかった問題を惹起する。放射線療法、化学療法、および他のインターベンション治療のような伝統的な治療を受けたとき、ほとんどのＣＲＣ患者は、深刻な合併症により状況が悪化するので、ＣＲＣ患者の生存率は科学分野では最大の挑戦課題の一つである。また、治療中、回復期以降に再発する頻度が低い適切な治療計画が開発されなければならない。現在利用可能な治療計画ないしシステムは、癌を除去するための最善の努力にもかかわらず、癌が頻繁に再発される。したがって、副作用の少ない患者、若しくは副作用のない患者の回復率の高い癌治療法に対する需要が高い。また、酸化ストレス及びこれと関連する疾患も様々な健康問題及び合併症に関わっているとして知られている。

一方、食品源に由来するファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）は、植物中に含まれている化学物質であって、植物自体は、競争植物の生長を妨害したり、あらゆる微生物や害虫などから自身の体を保護するなどの役割をする。また、ファイトケミカルは、人の体に入ると、抗酸化物質や細胞の損傷を抑制する作用をし、健康を維持させたりもし、柳の樹皮から抽出されたアスピリン、マラリア特効薬であるキニーネ、発ガン物質の生成を抑制するフラボノイド、カロチノイドなどが代表的である。ファイトケミカルのうち、フェノール化合物（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、様々な健康上のメリットが得られるとして知られているが、低溶解性および生体利用率のために、これらの有益な特徴が軽減される。また、ほとんどのフェノール化合物（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、小腸で吸収され、グルグロン酸化（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｐｈａｔｉｏｎ）、及びメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）のような結合反応（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により肝臓からほとんど代謝されるので、非常に低濃度の遊離アグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）だけが血漿中で生物学的に利用される。例えば、フェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）の一つであるフェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）は、抗酸化物質として活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）のような遊離ラジカルと反応し、酸化ストレスを減少させ、ＤＮＡ損傷、癌、細胞の老化などを改善する効能を有するとして知られている。しかし、経口投与されるフェルラ酸は、主に胃や小腸で分解され吸収され、肝臓で代謝されるため、大腸まで非常に少ない量しか到達しない［Ｃｅｓａｒｅ Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．：Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ６５（２０１４）１８５－１９５参照］。したがって、植物源に由来する生理活性を有するフェノール化合物（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の血漿中の生体利用率を増加させる必要がある。また、フェノール化合物（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の大腸癌の治療効果を向上させるために、口腔、胃または小腸で分解されずに大腸に標的化されて伝達されるフェノール化合物の変形技術が求められる。前記フェノール化合物の変形技術に関する先行文献としては、日本特許公報第５９００７９２号、日本公開特許公報第２００６－８９４３７号などがある。

本発明は、従来の技術的な背景下で見出されたものであり、本発明の目的は、フェノール酸形態のファイトケミカルと同等であるか、或いは改善された生理活性を有すると同時に経口投与する際、口腔、胃および小腸の環境ではほとんど分解されずに大部分が大腸に到達することができる新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を提供することにある。

また、本発明の目的は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法を提供することにある。

また、本発明の目的は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の生理活性に基づいた多様な医薬用途、健康機能食品用途又は化粧品の用途を提供することにある。

本発明の発明者は、フェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）をフラクトオリゴ糖の主鎖をなす糖の一部に結合させ、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を合成した。また、本発明の発明者は、合成された新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体が、これに対応するフェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に比べて口腔－胃腸管通過条件でほとんど分解されずに大部分が大腸に到達することができ、同時に、癌細胞に対する選択的死滅効果に優れ、特に大腸癌の治療効果において非常に優れている点を確認し、本発明を完成した。

本発明の一目的を解決するために、本発明の一形態は、以下の化学式Iまたは化学式IIで表されるファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を提供する。
［化I］

［化II］
ＰｈＡ－Ｇｌｕ－（Ｆｒｕ）_ｎ－Ｆｒｕ

前記化学式Iと化学式IIにおいて、「ＰｈＡ」はフェノール酸形態のファイトケミカルを表し、「Ｇｌｕ」はグルコースを表し、「Ｆｒｕ」はフルクトースを表します。また、前記化学式Iと化学式IIにおいて、「ＰｈＡ」と「Ｇｌｕ」はエステル結合により連結され、「Ｇｌｕ」と「Ｆｒｕ」はグリコシド結合により連結され、「Ｆｒｕ」と「Ｆｒｕ」はグリコシド結合により連結され、「Ｆｒｕ」と「ＰｈＡ」はエステル結合により連結される。また、前記化学式Iにおいて、ｍは、グリコシド結合により連結された４つの「Ｆｒｕ」及びエステル結合によって「Ｆｒｕ」に連結された１つの「ＰｈＡ」からなる繰り返し単位数として１～１４の整数から選択される。また、前記化学式IIにおいて、ｎは、グリコシド結合により連結された「Ｆｒｕ」の数として１～５９の整数から選択される。

本発明の一目的を解決するために、本発明の一形態は、前述した新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の薬学的に許容可能な塩を提供する。

本発明の一目的を解決するために、本発明の一形態は、（ａ）反応溶媒にフェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及びエステル化反応用触媒を添加し、溶解し、加熱してファイトケミカルの活性化反応が進行し、活性化された形態のファイトケミカルを含む１次反応混合物を収得する段階と、（ｂ）前記１次反応混合物に次の一般構造式で表されるフラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を添加し、不活性ガス雰囲気下で加熱してフラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）とファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）間のエステル化反応が進行し、ファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を含む二次反応混合物を収得する段階を含むファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法を提供する。

［フラクトオリゴ糖の一般構造式］
Ｇｌｕ－（Ｆｒｕ）_ｋ

前記フラクトオリゴ糖の一般構造式において、「Ｇｌｕ」はグルコースを表し、「Ｆｒｕ」はフルクトースを表し、ｋはグリコシド結合を介して連結されたフルクトースの数として２～６０の整数から選択される。

本発明の一目的を解決するために、本発明の一形態は、前述した新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む抗癌用組成物を提供する。

本発明の一目的を解決するために、本発明の一形態は、前述した新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、大腸癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明の一目的を解決するために、本発明の一形態は、前述した新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、大腸癌転移抑制用組成物を提供する。

本発明の一目的を解決するために、本発明の一形態は、前述した新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む抗酸化用組成物を提供する。

本発明の新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、フェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）がフラクトオリゴ糖の主鎖をなす糖の一部に結合された構造を有する。本発明に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、これに対応するフェノール酸ファイトケミカルに比べて口腔－胃腸管通過条件でほとんどが分解されずに大部分が大腸に到達することができるので、経口投与時、大腸の優れた生体利用性を有する。また、本発明に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、食品源に由来する天然物質からなるので、人体に安全である。特に、本発明に係るフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体は、商業的な大腸癌の治療用薬物と比較したとき、大腸癌細胞に対する選択的死滅効果に優れ、大腸癌を予防、改善または治療することにおいて有用な食品薬学素材として用いることができる。また、本発明に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、優れた抗酸化活性を有するため、老化防止などに有用な食品医薬素材又は化粧品素材として用いられることができる。

フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びＦＡ－ＦＯＳIをＦＴＩＲ分光光度計（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析したスペクトルの結果である。 ＦＡ－ＦＯＳIをＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で分析した画像の結果である。 フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びＦＡ－ＦＯＳIIをＦＴＩＲ分光光度計（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析したスペクトルの結果である。 ヒト大腸微生物叢（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）によって疑似大腸環境条件でＦＡ－ＦＯＳIIを培養したときの分解挙動をＨＰＬＣで分析した結果である。 ＨＴ－２９細胞株及びＬｏｖｏ細胞株にオキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ＦＡ－ＦＯＳI、ＦＡ－ＦＯＳII及びフェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ、ＦＡ）を処理したときの癌細胞死滅誘導の経過をＡｎｎｅｘｉｎV及びＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅで染色後、蛍光顕微鏡で観察した結果である。 ＨＴ－２９細胞株及びＬｏｖｏ細胞株にＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIを処理したときの癌細胞死滅誘導の経過をＴＵＮＥＬアッセイ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）および付加的なＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色後、蛍光顕微鏡で観察した結果である。 ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗癌活性を評価するための実験の進行過程を概略的に示すものである。 ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗癌活性を評価した実験結果の内、（ａ）結腸での腫瘍性病変の総数、（ｂ）結腸指数、（ｃ）薬物治療終了時のマウスの体重、及び（ｄ）４週間の治療療法の間、マウスの体重増加率を表したものである。 ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗癌活性を評価した実験結果の内、免疫学的パラメータの結果を表したものである。 ラット（Ｒａｔ）の血漿からＦＡ－ＦＯＳIIから遊離したフェルラ酸（ＦＡ）の薬物動態学的放出プロファイルを表したものである。 ＨＴ－２９腫瘍保有異種移植マウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIIの抗癌活性を評価した実験結果の内、（ａ）４週間の治療後の腫瘍の体積、（ｂ）腫瘍の成長率、（ｃ）４週間の治療後の腫瘍の重量、（ｄ）４週間の治療後の体重、（ｅ）治療の間、毎日の体重増加率、及び（ｆ）治療中の体重増加プロファイルを表したものである。 ＦＡ－ＦＯＳIの抗酸化活性をＡＢＴＳ［２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］カチオンラジカル消去能分析法を用いて測定した結果である。

以下、本発明で使用した用語を説明する。

本発明で使用される用語「薬学的に許容可能な」及び「食品学的に許容可能な」とは、生物体をかなり刺激させずに投与活性物質の生物学的活性及び特性を阻害しないことを意味する。

本発明で使用される用語「大腸癌」は、盲腸、結腸または直腸に生じる悪性腫瘍を意味する。

本発明で使用される用語「予防」は、本発明の組成物の投与により、特定の疾患の症状を抑制したり、進行を遅延させるすべての行為を意味する。

本発明で使用される用語「治療」は、本発明の組成物の投与により、特定の疾患の症状を好転または有利に変更させるすべての行為を意味する。

本発明で使用される用語「改善」は、治療される状態に関連するパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。

本発明で使用される用語「投与」は、任意の適切な方法により、オブジェクトに所定の本発明の組成物を提供することを意味する。このとき、オブジェクトは、本発明の組成物を投与し、特定の疾患の症状が好転し得る疾患を有するヒト、猿、犬、ヤギ、ブタまたはラットなど、すべての動物を意味する。

本発明で使用される用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵やリスクで疾患を治療するのに十分な量を意味し、これはオブジェクトの疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物の感度、投与時間、投与経路、および排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明の一側面は、ファイトケミカルと同等又は向上された生理活性を有し、且つ経口投与時、口腔、胃および小腸の環境ではほとんど分解されずに大部分が大腸に到達することができる新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体に関する。本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、下記の一般構造式で表されるフラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）主鎖；前記主鎖の末端一側に存在するグルコースとエステル結合により連結されたフェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）；前記主鎖に存在するフルクトースとエステル結合によって選択的に連結されたフェノール酸形態のファイトケミカルからなる。

［フラクトオリゴ糖主鎖の一般構造式］
Ｇ ｌｕ－（Ｆｒｕ）_ｊ －Ｆｒｕ

前記フラクトオリゴ糖主鎖の一般構造式において、「Ｇｌｕ」はグルコースを表し、「Ｆｒｕ」はフルクトースを表し、ｊはグリコシド結合を介して連結されたフルクトースの数として１～５９の整数から選択される。前記フラクトオリゴ糖主鎖の一般構造式において、ｊはフラクトオリゴ糖の難消化性またはファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造の容易性などを考慮したとき、４～４８の整数から選択されることが好ましく、８～４０の整数から選択されることが好ましい。

本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の一構成成分であるフェノール酸形態のファイトケミカルは、医薬または健康機能食品用途で使用することができる生理活性を示すものであれば、その種類は大きく制限されず、例えば、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、コーヒー酸（Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、ケイ皮酸（Ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、クロロゲン酸（Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）、シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、チコリ酸（Ｃｉｃｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、ダイフェルラ酸（Ｄｉｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、クマル酸（Ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）、サリチル酸（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、３－ヒドロキシ安息香酸（３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、４－ヒドロキシ安息香酸（４－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、バニリン酸（Ｖａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）またはエラグ酸（Ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ）から選択することができる。

また、本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体においてファイトケミカルは、好ましくは、主鎖のグルコース６番炭素に位置するヒドロキシル基とファイトケミカルに存在するカルボキシル基との間のエステル結合によって主鎖に不可欠に連結される。また、本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体においてファイトケミカルは、好ましくは、主鎖のフルクトース６番炭素に位置するヒドロキシル基とファイトケミカルに存在するカルボキシル基との間のエステル結合によって主鎖に選択的に連結される。

また、本発明の好ましい一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、以下の化学式Iまたは化学式IIで表される化合物から選択される。
［化I］

［化II］
ＰｈＡ－Ｇｌｕ－（Ｆｒｕ）_ｎ－Ｆｒｕ

前記化学式Iと化学式IIにおいて「ＰｈＡ」は、フェノール酸形態のファイトケミカルを表し、「Ｇｌｕ」はグルコースを表し、「Ｆｒｕ」はフルクトースを表します。また、前記化学式Iと化学式IIにおいて「ＰｈＡ」と「Ｇｌｕ」は、エステル結合により連結され、「Ｇｌｕ」と「Ｆｒｕ」はグリコシド結合により連結され、「Ｆｒｕ」と「Ｆｒｕ」はグリコシド結合により連結され、「Ｆｒｕ」と「ＰｈＡ」はエステル結合により連結される。また、前記化学式Iにおいてｍは、グリコシド結合により連結された４つの「Ｆｒｕ」及びエステル結合によって「Ｆｒｕ」に連結された１つの「ＰｈＡ」からなる繰り返し単位数として１～１４の整数から選択され、好ましくは２～１３の整数から選択され、より好ましくは４～１２の整数から選択される。また、前記化学式IIにおいてｎは、グリコシド結合により連結された「Ｆｒｕ」の数として１～５９の整数から選択され、好ましくは２～４０の整数から選択され、より好ましくは４～２０の整数から選択される。

また、本発明のより好ましい一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、以下の化学式IIIまたは化学式IVで表されるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体から選択される。本発明のより好ましい一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体において、フェノール酸形態のファイトケミカルは、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）である。本発明のより好ましい一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）と比較したとき、同等又は向上された抗癌活性（特に抗－大腸癌活性）を有すると同時に経口投与時、口腔、胃および小腸の環境ではほとんど分解されずに大部分が大腸に到達するため、大腸での生体利用性に優れている。
［化III］

［化IV］

前記化学式IIIにおいてｍは、グリコシド結合により連結された４つのフルクトース及びエステル結合によってフルクトースに連結された１つのフェルラ酸からなる繰り返し単位数として１～１４の整数から選択され、好ましくは２～１３の整数から選択され、より好ましくは４～１２の整数から選択される。また、前記化学式IVにおいてｎは、グリコシド結合により連結されたフルクトースの数として１～５９の整数から選択され、好ましくは２～４０の整数から選択され、より好ましくは４～２０の整数から選択される。

また、本発明の最も好ましい一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、以下の化学式Vで表されるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体からなったり、これを主成分として含む。本発明の発明者は、以下の化学式Vで表される化合物を主成分として含むフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体を「ＦＡ－ＦＯＳI」と命名し、物理的特性を分析した結果、水に対して不溶性であり、水系環境でミセル（Ｍｉｃｅｌｌｅ）構造の球状粒子を形成することが分かった。また、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIは、口腔、胃および小腸の環境ではほとんど分解されずに大部分が大腸に到達し、大腸環境で粘液（Ｍｕｃｕｓ）を通過して、酸性条件の癌細胞に付着した後、癌細胞の死滅を誘導することが分かった。特に、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIは、転移が可能な大腸癌細胞のみを選別的に死滅させることができるので、大腸癌の転移抑制に非常に有用である。
［化V］

また、本発明の最も好ましい一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、以下の化学式VIで表されるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体からなったり、これを主成分として含む。本発明の発明者は、以下の化学式VIで表される化合物を主成分として含むフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体を「ＦＡ－ＦＯＳII」と命名し、物理的特性を分析した結果、水溶性であり、口腔、胃および小腸の環境でほとんど分解されずに大部分が大腸に到達することが確認された。また、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIIは、ヒト大腸微生物叢（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）によって疑似大腸環境条件で分解され、フェルロイドグルコース（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｇｌｕｃｏｓｅ）形態で放出され、大腸癌の予防、改善または治療に非常に有用である。
［化VI］

本発明の一側面は、前述した新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の薬学的または食品学的に許容可能な塩に関するものである。本発明では、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の薬学的または食品学的に許容可能な塩としては、遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過剰量の酸水溶液に溶解させ、この塩をメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルのような水混和性有機溶媒を用いて沈殿させて製造する。同モル量の化合物及び水中の酸またはアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、続いて前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、または析出された塩を吸引濾過することができる。このとき、遊離酸としては、有機酸と無機酸を使用することができ、無機酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸などを使用することができ、有機酸としては、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ガラクトン酸、グルタミン酸、グルタル酸（ｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アスパラギン酸、アスコルビン酸、炭素酸、バニリン酸、ヒドロヨウ素酸などを使用することができる。また、塩基を用いて薬学的または食品学的に許容可能な金属塩を製造することができる。アルカリ金属またはアルカリ土金属塩は、例えば、化合物を過剰量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩をろ過した後、ろ液を蒸発、乾燥させて得る。このとき、金属塩としては、特にナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが適しており、また、これに対応する銀塩はアルカリ金属またはアルカリ土金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得る。

本発明の一側面は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法に関するものである。本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法は、（ａ）反応溶媒にフェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）及びエステル化反応用触媒を添加し、溶解し、加熱してファイトケミカルの活性化反応を進行し、活性化された形態のファイトケミカルを含む１次反応混合物を得する段階と、（ｂ）前記１次反応混合物に以下の一般構造式で表されるフラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を添加し、不活性ガス雰囲気下で加熱し、フラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）とファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）との間のエステル化反応を進行し、ファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を含む二次反応混合物を収得する段階を含む。また、本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法は、好ましくは、（ｃ）前記２次反応混合物を冷却し、放置し、ファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を沈殿させ、遠心分離及び洗浄を順次進行し、精製されたファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を収得する段階をさらに含むことができる。
［フラクトオリゴ糖の一般構造式］
Ｇｌｕ－（Ｆｒｕ）_ｋ

前記フラクトオリゴ糖の一般構造式において、「Ｇｌｕ」はグルコースを表し、「Ｆｒｕ」はフルクトースを表す。また、前記ｋはグリコシド結合を介して連結されたフルクトースの数として２～６０の整数から選択され、５～４９の整数から選択されることが好ましく、９～４１の整数から選択されることが好ましい。

本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法において最終的に収得されるファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の構造的な特徴は、前述した部分を参照にしており、具体的な説明を省略する。

本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法において、前記（ａ）段階のファイトケミカル活性化反応は、４５～１２０℃で２～２０ｈｒの間、進行されることが好ましく、５０～８０℃で５～１８ｈｒの間、進行されることがより好ましい。また、前記（ａ）段階で使用される反応溶媒は、フェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、エステル化反応用触媒及びフラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を溶解することができるものであれば、その種類が大きく制限されず、有機合成の分野で使用される公知の様々な有機溶媒から選択されることができる。例えば、前記反応溶媒は、極性有機溶媒から選択することができ、具体的な種類としては、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、ヘキサメチルホスホルアミド（Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、Ｎ－メチルピロリドン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）、酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）、アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、プロピレンカーボネート（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）などがある。また、前記（ａ）段階で使用されるエステル化反応用触媒は、カルボン酸（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）とアルコールとの間のエステル化反応またはカルボン酸とヒドロキシル基との間のエステル化反応に使用される様々な公知の触媒から選択されることができ、具体的な種類としては、カルボニルジイミダゾール（Ｎ、Ｎ’－ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＣＤＩ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ヨウ化２－ブロモ－１－メチルピリジウム（２－ｂｒｏｍｏ－１－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）などがある。

また、本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法で使用されたフェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、エステル化反応用触媒及びフラクトオリゴ糖のモル比は、１：１：１～４０：４０：１の範囲で選択されることが好ましく、２：２：１～３５：３５：１の範囲で選択されることが好ましい。例えば、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIを製造する場合、フェルラ酸、エステル化反応用触媒及びフラクトオリゴ糖のモル比は、２０：２０：１～３５：３５：１であることが好ましい。また、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIIを製造する場合、フェルラ酸、エステル化反応用触媒及びフラクトオリゴ糖のモル比は２：２：１～１０：１０：１であることが好ましい。

また、本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フロックトオリゴ糖結合体の製造方法において、前記（ｂ）段階のエステル化反応は、７０～１５０℃で２～１５ｈｒの間進行されていることが好ましく、８０～１２０℃で３～１０ｈｒの間進行されることがより好ましい。

また、本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法において、前記（ｃ）段階のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を洗浄するために炭素数２～５の低級アルコール溶媒を使用することができる。例えば、前記低級アルコール溶媒としては、エタノール、イソプロピルアルコールなどがある。

本発明の一形態に係る新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法において、フェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）としてフェルラ酸を用い、エステル化反応用触媒としてカルボニルジイミダゾール（Ｎ，Ｎ’－ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＣＤＩ）を用いる場合、前記（ａ）段階は、フェルラ酸の活性化の段階として以下の化学反応式１のように表すことができ、前記（ｂ）段階は、活性化されたフェルラ酸をフラクトオリゴ糖にグラフティング段階として以下の化学反応式２のように表すことができる。
［化１］

［化２］

本発明の一側面は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の生理活性に基づいた多様な医薬用途、健康機能食品用途又は化粧品用途に関するものである。本発明の一形態は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に（または食品学的に）許容可能な塩を有効成分とする抗癌用組成物を提供する。また、本発明の一形態は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に（または食品学的に）許容可能な塩を有効成分とする大腸癌の予防、改善または治療用組成物を提供する。また、本発明の一形態は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分とする大腸癌の転移抑制用組成物を提供する。また、本発明の一形態は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分とする抗酸化用組成物を提供する。

本発明の一形態に係る抗癌用組成物において、有効成分である新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、前述したＦＡ－ＦＯＳIまたはＦＡ－ＦＯＳIIであることが好ましい。また、本発明の一形態に係る大腸癌予防、改善または治療用組成物において、有効成分である新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、前述したＦＡ－ＦＯＳIまたはＦＡ－ＦＯＳIIであることが好ましく、ＦＡ－ＦＯＳIIであることがより好ましい。また、本発明の一形態に係る大腸癌の転移抑制用組成物において有効成分である新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、前述したＦＡ－ＦＯＳIまたはＦＡ－ＦＯＳIIであることが好ましく、ＦＡ－ＦＯＳIであることがより好ましい。また、本発明の一形態に係る抗酸化用組成物において有効成分である新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体は、前述したＦＡ－ＦＯＳIまたはＦＡ－ＦＯＳIIであることが好ましく、ＦＡ－ＦＯＳIであることがより好ましい。

本発明の一形態に係る抗癌用組成物、大腸癌の予防、改善または治療用組成物、大腸癌の転移抑制用組成物または抗酸化用組成物は、使用目的ないし様相によって薬学組成物、食品添加物、食品組成物（特に健康機能食品）又は飼料添加物などで具体化することができる。また、本発明の一形態に係る抗酸化用組成物は、皮膚の老化防止のための化粧料組成物に具体化することができる。

また、本発明の一形態に係る様々な組成物において、有効成分である新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の含有量も組成物の具体的な形態、使用目的ないし様相によって様々な範囲で調整することができる。

本発明に係る薬学組成物において、有効成分である新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の含有量は大きく制限されず、例えば、組成物の総重量を基準として０．０１～９９重量％、好ましくは０．５～５０重量％、より好ましくは１～３０重量％であることができる。また、本発明に係る薬学組成物は、有効成分の他に、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤のような添加剤をさらに含むことができる。本発明の薬学組成物に含まれうる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油を挙げることができる。また、本発明の薬学組成物は、新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の他に、抗癌活性、特に抗－大腸癌活性を有する公知の有効成分を１種以上さらに含有することができる。本発明の薬学組成物は、通常の方法により経口投与のための剤形または非経口投与のための剤形として製剤化することができ、製剤化する場合、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製することができる。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、これらの固形製剤は、有効成分に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ショ糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）またはゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレートタルクのような潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤およびシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純な希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれることができる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の基剤としては、前記ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されることができる。さらに、当分野の適正な方法で、或いはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに開示されている方法を用いて、各疾患に応じて、または成分によって好ましく製剤化することができる。本発明の薬学組成物は、目的とする方法によって、ヒトを含む哺乳類に経口投与されるか、又は非経口投与されることができ、非経口投与の方法としては、皮膚外用、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式などがある。本発明の薬学組成物の投与量は、薬学的に有効な量であれば、大きく制限されず、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によってその範囲が様々である。本発明の薬学組成物の通常の１日投与量は、大きく制限されないが、好ましくは、有効成分を基準にしたときに１０～９０００ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは１００～５０００ｍｇ／ｋｇであり、一日１回または数回に分けて投与することができる。

また、本発明に係る食品組成物において、有効成分である新規なファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の含有量は、組成物の総重量を基準として０．０１～９９重量％、好ましくは０．１～５０重量％、より好ましくは０．５～２５重量％であるが、これに限定されるものではない。本発明の食品組成物は、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセル、または液剤などの形態を含んでおり、具体的な食品例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康機能食品をすべて含む。本発明の食品組成物は、有効成分の他に、食品学的に許容可能な担体、数々の香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。また、本発明の食品組成物は、多様な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。

また、本発明に係る化粧料組成物は、当業界で通常に製造されるいかなる剤型にも製造することができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤－含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化されることができるが、これに限定されるものではない。具体的には、本発明の化粧料組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造することができる。

以下、本発明を実施形態を通してより具体的に説明する。ただし、以下の実施形態は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を限定するものではない。

１．フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の製造及び置換度分析
（１）ＦＡ－ＦＯＳIの製造
反応容器にジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）及びフェルラ酸を添加し、フェルラ酸をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）に溶解させ、５％（ｗ／ｖ）濃度のフェルラ酸溶液を製造した。それから、反応容器にカルボニルジイミダゾール（Ｎ、Ｎ’－ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＣＤＩ）を添加し、約６０℃で約１６ｈｒの間攪拌し、フェルラ酸を活性化させた。前記フェルラ酸の活性化形態は、フェルロイルイミダゾール（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）である。その後、反応容器にフラクトオリゴ糖［約２～６０個のＤ－フルクトース残基がβ（２→１）結合により連結されており、末端一側に１つのＤ－グルコースがＤ－フルクトースにα（１→２）結合により連結された形態の重合体である］を添加し、溶解させた後、反応容器を密封した。密封された反応容器内に存在するフェルラ酸、カルボニルジイミダゾール及びフラクトオリゴ糖のモル比は、３２：３２：１であった。その後、反応容器の温度を９０℃に増加させ、不活性ガス（窒素）雰囲気下で約７ｈｒの間連続して攪拌し、フラクトオリゴ糖に活性化されフェルラ酸をグラフティング（Ｇｒａｆｔｉｎｇ）させる反応を進行した。反応終了後、反応混合物を室温に冷却させ、ここで氷のように冷たいイソ－プロピルアルコールを反応混合物の約３倍の体積の量で添加し、約４℃で一晩放置してフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体（ＦＡ－ＦＯＳ）を沈殿させた。以後、反応混合物を遠心分離して（４０００×ｇ、２０分）ペレットを収得し、収得したペレットをイソ－プロピルアルコールで約３回洗浄し、未反応フェルラ酸、カルボニルジイミダゾール及びフェルロイルイミダゾールを除去し、再び蒸留水で洗浄し、最終反応産物であるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体Ｉ（「ＦＡ－ＦＯＳＩ」と略称する）を収得した。最終反応産物であるＦＡ－ＦＯＳIの製造収率は約８９％であった。

（２）ＦＡ－ＦＯＳIIの製造
反応容器にジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）及びフェルラ酸を添加し、フェルラ酸をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）に溶解させ、５％（ｗ／ｖ）濃度のフェルラ酸溶液を製造した。それから、反応容器にカルボニルジイミダゾール（Ｎ、Ｎ’－ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＣＤＩ）を添加し、約６０℃で約１６ｈｒの間攪拌し、フェルラ酸を活性化させた。前記フェルラ酸の活性化形態は、フェルロイルイミダゾール（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）である。以後、反応容器にフラクトオリゴ糖［約２～６０個のＤ－フルクトース残基がβ（２→１）結合により連結されており、末端一側に１つのＤ－グルコースがＤ－フルクトースにα（１→２）結合により連結された形態の重合体である］を添加し、溶解させた後、反応容器を密封した。密封された反応容器内に存在するフェルラ酸、カルボニルジイミダゾール及びフラクトオリゴ糖のモル比は４：４：１であった。その後、反応容器の温度を９０℃に増加させ、不活性ガス（窒素）雰囲気下で約７ｈｒの間連続して攪拌し、フラクトオリゴ糖に活性化されフェルラ酸をグラフティング（Ｇｒａｆｔｉｎｇ）させる反応を進行した。反応終了後、反応混合物を室温に冷却させ、ここに氷のように冷たいイソ－プロピルアルコールを反応混合物の約３倍の体積の量で添加し、約４℃で一晩放置してフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体（ＦＡ－ＦＯＳ）を沈殿させた。その後、反応混合物を遠心分離して（４０００×ｇ、２０分）ペレットを収得し、収得したペレットをイソ－プロピルアルコールで約３回洗浄し、未反応フェルラ酸、カルボニルジイミダゾール及びフェルロイルイミダゾールを除去し、最終反応産物であるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体II（「ＦＡ－ＦＯＳII」と略称する）を収得した。最終反応産物であるＦＡ－ＦＯＳIIの製造収率は約８９％であった。

（３）ＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIのフェルラ酸置換度分析
ＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIでフェルラ酸の置換度（Ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、フラクトオリゴ糖基本単位当たり付着した置換基フェルラ酸の平均数として定義される。２Ｍ濃度のＮａＯＨ水溶液にＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIをそれぞれ添加し、２ｈｒの間培養し、結合体からフェルラ酸基（Ｆｅｒｕｌａｔｅ ｇｒｏｕｐ）を放出させた。それから、ＮａＯＨ水溶液に６Ｎ濃度のＨＣｌ水溶液を添加し、ｐＨを２に調整し、放出されたフェルラ酸基（Ｆｅｒｕｌａｔｅ ｇｒｏｕｐ）を遊離フェルラ酸（Ｆｒｅｅ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）形態で酸性化させた。以後、酢酸エチルでフェルラ酸を３回抽出し、放出されたフェルラ酸の量をＨＰＬＣで定量化し、以下の式でフェルラ酸の置換度（Ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を計算した。

１６２：フラクトオリゴ糖基本単位の分子量
１９４．１９：フェルラ酸の分子量
％Ｆｅｒｕｌａｔｅ：結合体全重量を基準にしたフェルラ酸重量％

下記表１において、ＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIの％Ｆｅｒｕｌａｔｅ及びフェルラ酸の置換度を表した。

前記表に示すようにＦＡ－ＦＯＳIのフェルラ酸置換度は、ＦＡ－ＦＯＳIIよりも約１０倍近く高かった。ＦＡ－ＦＯＳIは、水及び有機溶媒に溶解されなかったのに対し、ＦＡ－ＦＯＳIIは、水及び有機溶媒にすぐに溶解された。フェルラ酸の置換度がたかければ高いほど、ＦＡ－ＦＯＳの水に対する溶解度は低くなることが分かった。ＦＡ－ＦＯＳIは、両親媒性により水に対して不溶性であり、テトラブチルホスホニウムアセテート（Ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ）、テトラブチルアンモニウムアセテート（Ｔｅｔｒａ ｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）のようなイオン性液体にすぐに溶解された。

２．フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の構造的特徴の分析
（１）ＦＡ－ＦＯＳI
図１は、フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、及びＦＡ－ＦＯＳIをＦＴＩＲ分光光度計（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析したスペクトルの結果である。図１にてＦＡ－ＦＯＳIは、「ＦＡ ＦＯＳI」で表した。図１に示すように、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の３４００cm^－１における緩やかなピークは、ヒドロキシル基の数が減少するにつれて、ＦＡ－ＦＯＳIで強度が大幅に減少した。ＦＡ－ＦＯＳIの１７２６cm^－１におけるピークは、置換またはエステル化反応を表し、２９４７cm^－１ 、３００８cm^－１ 、および２８４２cm^－１で発生する２つのピークは、フェルロイル（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ）置換と関連するメチル及びメチレンＣＨのストレッチングに起因する。ＦＯＳの９００～１２００cm^－１間のピークは、ＣＯのストレッチングによるものであり、ＦＡ－ＦＯＳIの３０７４cm^－１におけるピークは、リングのメタンハイドロゲン関連のＣＨのストレッチングに起因したものである。

また、フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びＦＡ－ＦＯＳIを１３Ｃ（Ｌ ａｒｍｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：４００．２５ＭＨｚ）条件の固体核磁気共鳴（Ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ＮＭＲ）分光器で分析した。ＦＡ－ＦＯＳIは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒に溶解されないので、その構造を説明するために、固体核磁気共鳴（Ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ＮＭＲ）を行った。ＦＡ－ＦＯＳIの１３Ｃ固体核磁気共鳴（Ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ＮＭＲ）スペクトルでフェルラ酸の芳香族炭素は、１００ｐｐｍ～１５０ｐｐｍの間で観察され、フェルラ酸のカルボニル炭素（－ＣＯＯＨ）移動が１５０ｐｐｍ超領域で観察された。純粋なフェルラ酸のピークの移動は、１７３．１３ｐｐｍで観察されるが、ＦＡ－ＦＯＳIの場合、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）とフェルラ酸のエステル結合形成によりピークの移動が１６４．１７ｐｐｍで観察された。また、純粋なフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）において脂肪族炭素は、５０ｐｐｍ～１００ｐｐｍにわたって多数の狭いピークで観察されたが、ＦＡ－ＦＯＳIの場合、フラクトオリゴ糖の脂肪族炭素は、５５．１７ｐｐｍで単一の広いピークで観察された。これらの結果は、ＦＡ－ＦＯＳIにおいてフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の末端グルコースとフェルラ酸が結合し、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）のフルクトースが４つおきにフェルラ酸と結合するからである。ＦＡ－ＦＯＳIの１３Ｃ固体核磁気共鳴（Ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ＮＭＲ）スペクトルで観察された多重線（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ）は、以下の通りである。

１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ）：ｄ＝２６３．９、２５１．１、２３３．４、２２３．３、２１７．４、１８０．４、１６４．４、１５１．９、１４８．１、１４４．７、１４２．２、１３３．６、１２４．２、１１７．６、１０９．０、７６．７、６５．０、５５．３、４３．１、３４．１、２４．４、１８．５ｐｐｍ

また、フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びＦＡ－ＦＯＳIを１Ｈ（Ｌ ａｒｍｏｒ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：４００．６６ＭＨｚ、ｓｐｉｎ ｒａｔｅ：１４ＫＨＺ）条件の固体核磁気共鳴（Ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ＮＭＲ）分光器で分析した。ＦＡの１Ｈ固体核磁気共鳴（Ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ＮＭＲ）スペクトルで１３．１９ｐｐｍのピークは、フェルラ酸に存在するカルボン酸（Ｒ－ＣＯＯＨ）の化学的移動に該当する。その反面、ＦＡ－ＦＯＳIではフェルラ酸がフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の糖分子であるグルコース及びフルクトースと結合するため、前記１３．１９ｐｐｍのピークは存在せず、４．９４ｐｐｍで強いピークが観察された。前記４．９４ｐｐｍにおける強いピークは、ＦＡ－ＦＯＳIでフェルラ酸の芳香族基に結合されている－ＯＨ基を示す。また、ＦＡ－ＦＯＳIで観察される６．９４ｐｐｍにおけるピークは、フェルラ酸の芳香環に結合された－Ｈに該当し、純粋なフラクトオリゴ糖のＮＭＲスペクトルには存在しない。また、ＦＡ－ＦＯＳIで観察される２．５６ｐｐｍの明確なピークはフェルラ酸がフラクトオリゴ糖に置換されて存在するカルボニル基に起因したものであり、これはフェルラ酸とフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）のコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）に対する強力な証拠となる。

また、フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びＦＡ－ＦＯＳIをＸＲＤ（Ｘ－ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）分光器で分析した。その結果、ＦＡ ＦＯＳＩは、約１７．６５°（２θ）と２５．５５°（２θ）にて強い回折ピークを示し、１０．５°、１２．７０°、２０．３１°、２３．７３°、２８．０７°（２θ）では小さく広いピークを示した。ＦＡ ＦＯＳＩは、Ａ型結晶相と非晶相との混合であるとみられ、ＦＯＳのピークと比較するとＦＯＳに比べて、より多くの結晶構造を有する。前記の結果から、ＦＡ ＦＯＳＩに存在する鎖状フルクトースは、非晶質領域に寄与し、末端グルコースでフェルラ酸とのコンジュゲーションおよび４番目のフルクトースでフルクトースとのコンジュゲーションは、結晶領域に寄与すると見ることができる。

また、ＦＡ－ＦＯＳIをＵＶ－Ｖｉｓ分光器（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）及び蛍光分光光度計（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で分析した。その結果、ＦＡ－ＦＯＳIは、８０ｎｍで光を吸収し、３１０ｎｍで光を放出した。

また、フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びＦＡ－ＦＯＳIの熱重量分析（Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＴＧＡ）を行った。その結果、ＦＯＳは、２３８℃で約４１．０６％の重量損失を示し、ＦＡ－ＦＯＳIは、４００℃で約４１．５％の重量損失を示した。これはＦＡ－ＦＯＳIがＦＯＳと比較して、より高い熱安定性を有すると見ることができる。

また、ＦＡ－ＦＯＳIのゼータ電位を測定し、動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）を用いて粒子の大きさを測定した。その結果、ＦＡ－ＦＯＳIのゼータ電位は、－１４．５±４．８８ｍＶであることが示され、粒子の平均直径は１．８３９±０．３３９μｍであることが示された。ＦＡ－ＦＯＳIの低いゼータ電位は、フェルラ酸のそのラフティングによって惹起したとみられ、ＦＡ－ＦＯＳIは、水（ｗａｔｅｒ）において均質な懸濁液を生成する高次構造で自己凝集（ｓｅｌｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）されていることが分かる。また、ＤＬＳを介して測定したＦＡ－ＦＯＳIの多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）は０．２４３であり、均質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示す。

図２は、ＦＡ－ＦＯＳIをＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で分析した画像の結果である。図２のｉは、ディスク型の構造を示す低倍率画像であり、ｉｉは、ディスク型の粒子の断面画像であり、ｉｉｉは、ディスク型微細粒子を示す高倍率の画像である。図２に示すようなＦＡ－ＦＯＳIは、自己凝集（ｓｅｌｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）によって平均直径が約２μｍであるディスク状の構造を有する。また、図２のｉｉｉによれば、ディスク状の構造を有するＦＡ－ＦＯＳIは空洞（ｃａｖｉｔｙ）を有する層状のシーツ疑似造粒化によって形成される。

ＦＡ－ＦＯＳIの構造的特徴を分析した結果から、ＦＡ－ＦＯＳIの主成分は、以下の化学式Vで表されるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体であることがわかる。
［化V］

（２）ＦＡ－ＦＯＳII
図３は、フェルラ酸（ＦＡ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びＦＡ－ＦＯＳIIをＦＴＩＲ分光器（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析したスペクトルの結果である。図３においてＦＡ－ＦＯＳIIは、「ＦＡ ＦＯＳII」と表された。図３に示すようにフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の３４００cm^－１における緩やかなピークは、ヒドロキシル基の数が減少するにつれて、ＦＡ－ＦＯＳIIで強度が減少した。ＦＡ－ＦＯＳIIの１７１７cm^－１における小さなピークは、エステル化されたカルボニル基を表し、９００～１２００cm^－１の間のピークはＦＯＳ分子に由来するＣ－Ｏストレッチングによるものである。

また、ＦＡ－ＦＯＳIIを１３Ｃ条件の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光器及び１Ｈ条件の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光器で分析した。ＦＡ－ＦＯＳIIの１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルで観察された多重線（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ）は、以下の通りである。

１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０４．２５、１０３．５２、１０３．３８、８１．８９、７６．８８、７４．４６、６２．３３、６１．７９、４０．６４、２５．７６、ＦＡ－ＦＯＳIIの１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルで観察された多重線（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ）は、以下の通りである。

１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：６．８２－６．６１（ｍ、０Ｈ）、５．１１（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１１Ｈ）、４．６７（ｄ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１０Ｈ）、４．５６（ｔ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、１１Ｈ）、４．０１（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、１０Ｈ）、３．８２－３．７２（ｍ、１２Ｈ）、３．５９（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１１Ｈ）、３．５５（ｓ、６Ｈ）、３．４３（ｄ、Ｊ＝１９．１Ｈｚ、１５Ｈ）、３．３５（ｓ、１１Ｈ）、２．４７（ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、０Ｈ）、２．４６（ｓ、１Ｈ）、２．４５（ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、０Ｈ）、１．００（ｓ、１Ｈ）、０．９８（ｓ、１Ｈ）。

ＦＡ－ＦＯＳIIの構造的特徴を分析した結果から、ＦＡ－ＦＯＳIIの主成分は、以下の化学式VIで表されるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体であることがわかる。また、ＦＡ－ＦＯＳIIをＬＣ－ＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）およびＭＳ－ＭＳ（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析した結果、ＦＡ－ＦＯＳIIの主鎖に存在するフルクトースの数は３～２４本と多様に分布されていた。
［化VI］

３．フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の口腔－疑似胃腸条件などにおける安定性及び分解特性
（１）口腔－疑似胃腸条件における安定性実験
ＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIをそれぞれ疑似唾液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｓａｌｉｖａｒｙ ｆｌｕｉｄ、ＳＳ）、疑似胃液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｆｌｕｉｄ、ＳＧＦ）及び疑似小腸液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｆｌｕｉｄ、ＳＳＩ）に入れ、３７℃で０分、１５分、３０分、および１ｈｒないし４ｈｒの間、培養したときの安定性特性をＨＰＬＣで測定した。フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の口腔－疑似胃腸条件での安定性特性測定実験で使用した疑似唾液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｓａｌｉｖａｒｙ ｆｌｕｉｄ、ＳＳ）、疑似胃液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｆｌｕｉｄ、ＳＧＦ）、及び疑似小腸液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｆｌｕｉｄ、ＳＳＩ）の組成は、以下の通りである。

＜疑似唾液組成＞
１００ｍｌを基準にＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０２２８％、ＮａＣｌ ０．１０１７％、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ０．０２０４％、ＭｇＣｌ_２ ０．００６１％、Ｋ_２ＣＯ_３ ０．０６０３％、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ０．０２７３％、α－ａｍｙｌａｓｅ ２００ｕｎｉｔｓ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ０．００１５％で構成され、ｐＨは７．４である。

＜疑似胃液組成＞
１００ｍｌを基準にＳｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ８０μＭ、Ｌｅｃｉｔｈｉｎ ２０μＭ、Ｐｅｐｓｉｎ ０．０１％、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ０．０１％、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ３４．２ｍＭで構成され、ｐＨは１．６である。

＜疑似小腸液組成＞
１００ｍｌを基準にＳｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ３ｍＭ、Ｌｅｃｉｔｈｉｎ ０．２ｍＭ、Ｍａｌｅｉｃ ａｃｉｄ １９．１２ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ３４．８ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ６８．６２ｍＭ、Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ（４ＵＳＰ／ｍｇ）０．０５ｇで構成され、ｐＨは６．５である。

（２）ヒト微生物叢により疑似大腸環境条件での消化特性実験
滅菌された嫌気性最小基礎培地（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｉｎｉｍａｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）１０ｍｌが収容されたそれぞれのバイアルに滅菌されたＦＡ－ＦＯＳI、ＦＡ－ＦＯＳII及びフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）を０．０５ｇ添加し、嫌気条件で人糞を１％（ｗ／ｖ）の量で接種して密封した。以降、密封されたバイアルを３７℃で１２ｈｒ、２４ｈｒ、そして３６ｈｒないし４８ｈｒの間、培養し、間欠攪拌した。培養が完了した後、培養された培地を遠心分離して上澄み液を回収し、回収した上澄み液に６Ｎ濃度のＨＣｌ水溶液を添加し、ｐＨを２に調整し、２倍体積のエチルアセテートで遊離フェルラ酸を３回抽出した。その後、抽出液を窒素雰囲気下で蒸発させて酢酸エチルを除去し、５０％メタノール水溶液に溶解させて分析試料を準備した。それから、分析試料をＨＰＬＣで分析し、疑似大腸環境条件での遊離フェルラ酸排出量を決定した。前記の実験に使用した嫌気性最小基礎培地（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｉｎｉｍａｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）の組成は、以下の通りである。

＜嫌気性最小基礎培地の組成＞
１００ｍｌを基準にＰｅｐｔｏｎｅ ０．２ｇ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．１ｇ、ＮａＣｌ ０．０１ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．００４ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．００４ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．００１ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．００１ｇ、ＮａＨＣＯ_３ ０．２ｇ、Ｂｉｌｅ ｓａｌｔｓ ０．０５ｇ、Ｌ－Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＨＣｌ ０．０５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．２ｍｌ、０．０５％Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ ０．１ｍｌ、Ｈｅｍｉｎ ０．０００５ｇ、０．０２Ｍｍ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ_１ １０μｌで構成される。

（３）腸内の消化酵素に対する安定性実験
２５０ｍｇのＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIをそれぞれ腸内消化酵素液に添加し、３７℃で１２ｈｒ、２４ｈｒ、３６ｈｒ、そして４８ｈｒの間、培養した。腸内消化酵素液は、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）溶液に、大腸内の生殖細菌によって産生されるＣｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｅｎｄｏ－ｇａｌａｃｔｏｕｒａｎａｓｅ、ｅｎｄｏ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｓｅ、ｅｘｏ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ及びＦｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅを添加し、製造した液状混合酵素液であり、ｐＨは６である。具体的には、前記腸内消化酵素液は、ｐＨ６．０のＭＯＰＳ ｂｕｆｆｅｒ５ｍｌにＤｒｉｓｅｌａｓｅ（Ａｍａｎｏ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｊａｐａｎ）５０ｍｇ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｍ Ａｍａｎｏ（Ａｍａｎｏ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｊａｐａｎ）５０ｍｇ、ＤＥＰＯＬ ６７０Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ、ＵＫ）５０μｌ、ＤＥＰＯＬ ７４０Ｌ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ、ＵＫ）５０μｌ及び０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）が溶解されたものである。その後、培養液を遠心分離して上澄み液を回収し、回収した上澄み液に６Ｎ濃度のＨＣｌ水溶液を添加し、ｐＨを２に調整し、３倍体積の酢酸エチルアセテートで遊離フェルラ酸を３回抽出した。以後、抽出液を窒素雰囲気下で蒸発させて酢酸エチルを除去し、５０％メタノール水溶液に溶解させて分析試料を準備した。その後、分析試料をＨＰＬＣで分析した。

（４）実験結果
以下の表２は、ＦＡ－ＦＯＳIの口腔－疑似胃腸条件での安定性実験は、ヒト微生物叢によって疑似大腸環境条件での消化特性実験及び腸内消化酵素に対する安定性実験の結果を表したものである。また、次の表３は、ＦＡ－ＦＯＳIIの口腔－疑似胃腸条件での安定性実験は、ヒト微生物叢によって疑似大腸環境条件での消化特性実験及び腸内消化酵素に対する安定性実験の結果を表したものである。

＊安定性（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）は、培養前のフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体に含有されたフェルラ酸の量と、３７℃で培養した後、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体から放出される遊離フェルラ酸の量を比較して百分率で表した。

＊＊半減期（Ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）は、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体に含有されたフェルラ酸の半分が培地内に放出される時間で表した。

前記表２および表３に示すように、口腔－疑似胃腸条件でのＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIの安定性及び半減期の結果によれば、ＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIは、疑似唾液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｓａｌｉｖａｒｙ ｆｌｕｉｄ、ＳＳ）、疑似胃液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｇａｓｔｒｉｃ ｆｌｕｉｄ、ＳＧＦ）、及び疑似小腸液（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｆｌｕｉｄ、ＳＳＩ）でほぼ分解されなかった。

前記表２に示すようにＦＡ－ＦＯＳIは、ヒト大腸微生物叢（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）によってほとんど分解されないことが分かった。

図４は、ヒト大腸微生物叢（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）によって疑似大腸環境条件でＦＡ－ＦＯＳIIを培養した際の分解挙動をＨＰＬＣで分析した結果である。前記表３及び図４から見られるように、ＦＡ－ＦＯＳIIは、ヒト大腸微生物叢（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）によってフェルラ酸（Ｆｅｒｕｌａｔｅ）形態で分解されて放出されることが分かった。また、ヒト大腸微生物叢（Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）によって疑似大腸環境条件でＦＡ－ＦＯＳIIを培養したときの最終的な代謝産物をＬＣ－ＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）およびＭＳ－ＭＳ（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で分析した結果、ヒト大腸環境でＦＡ－ＦＯＳiiの最終代謝産物は、フェルロイルグルコース（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｇｌｕｃｏｓｅ）であることが確認された。

前記表２および表３に示すようにＦＡ－ＦＯＳIは、ＦＡ－ＦＯＳIIに比べて腸内消化酵素に対してより抵抗性を有し、放出される遊離フェルラ酸の量も非常に少なかった。

４．フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の生体外（Ｉｎ－Ｖｉｔｒｏ）の実験における抗癌活性
（１）癌細胞死滅誘導経過観察及び分析
ＣＣＤ １８Ｃｏ（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）のようなヒト正常大腸細胞株、ＨＴ－２９（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ）のような大腸癌細胞株またはＬｏｖｏ（Ｄｕｋｅ’ｓ ｔｙｐｅ Ｃ、ｇｒａｄｅ ＩＶ、Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）のような転移性大腸癌細胞株に対して薬物としてオキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＦＡ－ＦＯＳi、ＦＡ－ＦＯＳii及びフェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ、ＦＡ）を処理し、細胞死滅誘導経過を観察した。具体的には９６－ｗｅｌｌプレートの各ウェルに培養された細胞株をウェル当り１８，０００細胞数の密度で分注し、一晩培養した後、培養培地に種々の濃度で溶解した薬物で細胞を処理し、加湿培養器内で３７℃の温度及び５％ＣＯ_２の条件で７２ｈｒの間培養した。培養終了後、培地を除去し、１００μｌのＰＢＳに置き換えた後、ここにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８； Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）溶液１０μｌを添加し、３ｈｒ培養して反応させた。以後、反応液の発色程度を４５０ｎｍでの吸光度で測定し、メーカーの指示に従って、細胞増殖数を計算した。

ＨＴ－２９細胞は、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地で培養され、ＬｏＶｏ細胞はＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈ’ｓ）培地で培養され、ＣＣＤ １８Ｃｏ細胞は、ＤＭＥＭで培養され、すべての培地には、使用前に１０％Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍと１００Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加された。

図５は、ＨＴ－２９細胞株及びＬｏｖｏ細胞株にオキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、ＦＡ－ＦＯＳI、ＦＡ－ＦＯＳII及びフェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ、ＦＡ）を処理したときの癌細胞死滅誘導経過をＡｎｎｅｘｉｎV及びＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅで染色後、蛍光顕微鏡で観察した結果である。また、図６は、ＨＴ－２９細胞株及びＬｏｖｏ細胞株にＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIを処理したときの癌細胞死滅誘導経過をＴＵＮＥＬアッセイ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）および付加的なＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色後、蛍光顕微鏡で観察した結果である。また、以下の表４に処理した薬物の様々な細胞株に対するＩＣ_５０（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）値と選択指数（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ、ＳＩ）値を表した。

＊ＳＩ＝選択指数、正常細胞に対するＩＣ_５０（ＣＣＤ １８Ｃｏ）／がん細胞に対するＩＣ_５０

図５、図６、および前記表４に示すようにＦＡ－ＦＯＳI及びＦＡ－ＦＯＳIIは、優れた大腸癌細胞死滅効果を表した。特に、ＦＡ－ＦＯＳIは、商業薬物であるオキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及び５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）と比較したときより高い選択性指数を有することが確認された。また、ＦＡ－ＦＯＳIは、ＦＡに比べてより低いＩＣ_５０値を表した。

（２）フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIの細胞死滅誘導機序の分析
ＦＡ－ＦＯＳＩによる細胞死滅誘導機序を理解するためにＬｏＶｏ細胞株にＦＡ－ＦＯＳＩを０．１９８ｕｇ／ｍｌの濃度で１２ｈｒ間処理した後、遺伝子発現をプロファイリングした。処理された細胞からの総ｍ－ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ｍ－ＲＮＡ抽出および精製キットを使用して抽出し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ ａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｋｉｔを用いて分析した。以下の表５にＦＡ－ＦＯＳＩで処理されたＬｏＶｏ細胞株で細胞死滅に関連して発現された遺伝子のプロファイリング結果を表した。

前記表５に示すようにＬｏＶｏ細胞株にＦＡ－ＦＯＳＩ処理時、１２個の遺伝子がアップレギュレーションされ、７個の遺伝子がダウンレギュレーションされた。前記表５にアップレギュレーションされた遺伝子であるＴＮＦＲＳＦ９は、ＴＮＦ－受容体スーパーファミリーに属するＣＤ１３７とも呼ばれ、Ｔ細胞（免疫細胞）のクローンの拡張、生存および発達に関与し、Ｔ細胞を活性化させ、免疫反応を起こし、ＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒ Ｌｕｋｉｎ ２）の分泌と免疫細胞の浸潤を誘導し、腫瘍を除去するとして知られている。ＴＮＦＲＳＦ９のアップレギュレーションは、ＦＡ－ＦＯＳＩが免疫細胞媒介を介して生体内の腫瘍／癌細胞を除去する可能性の手がかりを提供する。

細胞周期停止（Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ａｒｒｅｓｔ）は、テトラサイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）と呼ばれる細胞周期チェックポイント調節剤を調節することにより、腫瘍細胞の増殖を検査するもので、抗癌剤の機能の一つである。細胞周期停止からＦＡ－ＦＯＳＩの機能を調査するために、ＬｏＶｏ細胞株とＨＴ－２９細胞株のそれぞれを培養プレートに播種し、ＦＢＳのない培養培地を使用して、４８ｈｒ間増殖を増やさないように、同期させた後、ＦＡ－ＦＯＳＩとＦＡを多様な濃度で処理し、ＬｏＶｏ細胞株に対して２４ｈｒ培養し、ＨＴ－２９細胞株に対して７２ｈｒ培養した後、増殖した細胞をＤＡＰＩで着色した後、細胞数をＦＡＣＳで分析した。ＦＡ－ＦＯＳＩは、細胞周期のＧ0期で用量依存的に細胞周期を停止させた。具体的には、ＨＴ－２９細胞株にＦＡ－ＦＯＳＩを０．１９８ｕｇ／ｍｌの濃度で処理した場合、約９１．２２％がＧ0期で停止され、ＨＴ－２９細胞株にＦＡ－ＦＯＳ Ｉを０．９８８ｕｇ／ｍｌの濃度で処理した場合、約９４．１６％がＧ0期で停止した。また、ＬｏＶｏ細胞株にＦＡ－ＦＯＳＩを０．１９８ｕｇ／ｍｌの濃度で処理した場合、約６２．７４％がＧ0期で停止され、ＬｏＶｏ細胞株にＦＡ－ＦＯＳＩを０．９８８ｕｇ／ｍｌの濃度で処理した場合、約７９．５２％がＧ0期で停止され、これらの結果は、対照群（無処理）の４８．６４％に比べて非常に高い値である。

また、細胞周期停止に対するＦＡ－ＦＯＳＩの機能を検証するために、ＬｏＶｏ細胞株から総タンパク質を抽出し、サイクリンＢ１、Ｅ、およびサイクリン依存性キナーゼ阻害タンパク質ｐ２１の発現プロファイリングを密度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。その結果、ＦＡ－ＦＯＳＩは、細胞周期を調節するすべてのテトラサイクリンを抑制するｐ２１の発現をアップレギュレーション（Ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）し、Ｇ２期から有糸分裂への細胞プログレッション（ｃｅｌｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）に関与するサイクリンＢ１の発現をダウンレギュレーション（Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）し、Ｇ０／Ｇ１期からＳ期への細胞のプログレッションに関与するＣｙｃｌｉｎ Ｅをダウンレギュレーションすることにより、細胞周期停止を誘導することが分かった。

また、ＦＡ－ＦＯＳＩを０．１９８ｕｇ／ｍｌの濃度で２４ｈｒ間処理したＬｏＶｏ細胞株を使用して、細胞周期関連遺伝子発現の向上を調査した。遺伝子発現量は、ＱｉａｇｅｎのＲＴ２ Ｐｒｏｌｉｆｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅを使用して測定した。下記の表６にＦＡ－ＦＯＳＩで処理されたＬｏＶｏ細胞株で細胞周期に関連して発現された遺伝子のプロファイリング結果を表した。下記の表６に示すように、細胞周期の進行及び増殖に直接関与する９つの主要なアップレギュレーション遺伝子および４つの主要なダウンレギュレーション遺伝子があることが観察された。

５．フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の生体内（Ｉｎ－Ｖｉｖｏ）実験での抗癌活性
（１）ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスモデルでフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗癌活性
ＡＯＭ（Ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ）－ＤＳＳ（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）で大腸癌が誘発されたマウスモデルを用いて、ＦＡ－ＦＯＳＩ及びＦＡ－ＦＯＳIIの抗癌活性を評価した。５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、それぞれ７匹ずつ以下の６個群に無作為に割り当て、各群に必要な処理を行った。

（ｉ）正常群（Ｎａｉｖｅ）
（ｉｉ）対照群（Ｃｏｎｒｔｏｌ）：ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスであって、別途薬物を投与しない。
（ｉｉｉ）オキサリプラチン処理群（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）：オキサリプラチンを水（ｗａｔｅｒ）に溶解させて薬物を用意して、オキサリプラチン量を基準に、マウスに３０ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ）の用量で経口投与する。
（ｉｖ）フェルラ酸処理群（ＦＡ）：フェルラ酸を水に溶解させて薬物を用意し、フェルラ酸の量を基準に、マウスに１００ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ）の用量で経口投与する。
（ｖ）ＦＡ－ＦＯＳＩ処理群（ＦＡ ＦＯＳ－Ｉ）：フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳＩを水に懸濁して薬物を用意し、ＦＡ－ＦＯＳＩ量を基準に５００ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ）の用量で経口投与する。
（ｖｉ）ＦＡ－ＦＯＳII処理群（ＦＡ ＦＯＳ－II）：フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIIを水に溶解させて薬物を用意し、ＦＡ－ＦＯＳII量を基準に３８９０ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ）の用量で経口投与する。

参考として、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳＩ及びＦＡ－ＦＯＳIIをフェルラ酸の量で換算して比較すると、ＦＡ－ＦＯＳＩ ５００ｍｇ及びＦＡ－ＦＯＳII３８９０ｍｇは、フェルラ酸１００ｍｇに該当する。

図７は、ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗癌活性を評価するための実験の進行過程を概略的に示すものである。

図８は、ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗癌活性を評価した実験結果のうち、（ａ）結腸における腫瘍性病変の総数、（ｂ）結腸指数、（ｃ）薬物治療終了時のマウスの体重、及び（ｄ）４週間の治療療法の間、マウスの体重増加率を表したものである。図８に示すように、ＦＡ－ＦＯＳII処理群で腫瘍性病変の数が対照群に比べて、７７．１％（ｐ＜０．００１）減少した。また、ＦＡ－ＦＯＳII処理群は、オキサリプラチン処理群及びフェルラ酸処理群に比較して、より高い腫瘍の減少を表した。また、マウス結腸指数はＦＡ－ＦＯＳII処理群と正常群の間で有意な差はなかった。

図９は、ＡＯＭ－ＤＳＳによって結腸癌が誘発されたマウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗癌活性を評価した実験結果のうち、免疫学的パラメータの結果を表したものである。図９（ａ）は、全体の血液中の白血球（ＷＢＣ）数、（ｂ）は総骨髄細胞数、（ｃ）は胸腺指数（胸腺／体重）、（ｄ）は脾臓指数（脾臓／体重）（ｅ）は血漿中インターロイキン３濃度、および（ｆ）は血漿中のインターフェロンガンマの濃度の結果である。図９に示すように免疫関連パラメータのＷＢＣの数は、対照群と比較したとき、ＦＡ－ＦＯＳＩ処理群で約６．９０％減少し（ｐ＜０．０１）ＦＡ－ＦＯＳII処理群で約５．３８％減少した（ｐ ＜０．０５）。しかし、骨髄細胞数、胸腺指数及び脾臓指数などを考慮したとき、ＦＡ－ＦＯＳＩ処理及びＦＡ－ＦＯＳII処理によって誘導された免疫抑制はないものと判断される。一方、マウスの血漿に存在するＩＬ－３の濃度は、ＦＡ－ＦＯＳII処理群で対照群に比べて約１５％増加した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＦＡ－ＦＯＳIIによってＴ細胞の腫瘍抗原に対する刺激／感作が存在することを示唆する。

（２）ラット（ｒａｔ）からＦＡ－ＦＯＳIIの生体内薬物動態学
ＦＡ－ＦＯＳIIの生体内薬物動態学を評価するためにラット（ｒａｔ）の結腸でＦＡ－ＦＯＳIIから遊離したフェルラ酸（ＦＡ）の放出プロファイルを調査した。具体的には、体重がそれぞれ１８０～２５０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを以下のように３つの群に無作為に割り当てた。

（ｉ）正常群：別途の薬物を投与していない。
（ｉｉ）フェルラ酸（ＦＡ）群：フェルラ酸（ＦＡ）を水に溶解させて薬物を用意し、所定の容量で経口投与する。
（ｉｉｉ）ＦＡ－ＦＯＳII群：ＦＡ－ＦＯＳIIを水に溶解させ、薬物を用意し、所定の容量で経口投与する。

フェルラ酸（ＦＡ）は、滅菌水に溶解された状態で、フェルラ酸（ＦＡ）の量を基準として１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で経口投与された。また、ＦＡ－ＦＯＳIIは、滅菌水に溶解された状態で、ＦＡ－ＦＯＳIIの量を基準に３．８９ｇ／ｋｇ体重（フェルラ酸の量に換算すると１００ｍｇ／ｋｇ体重に該当）の容量で経口投与された。経口摂食により単一の容量投与後、ラットの血液を０、０．５、１、３、６、８、１２、２４ｈｒにわたって連続してサンプリングした。サンプリングした試料について物質分子量１９３．０／１３３．９ Ｄａ（ＦＡのｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ／ｆｒａｇｍｅｎｔ ｍａｓｓ）の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）方式でＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析を行い、血漿中の遊離したＦＡを定量化した。

図１０は、ラット（Ｒａｔ）血漿からＦＡ－ＦＯＳIIから遊離したフェルラ酸（ＦＡ）の薬物動態学的放出プロファイルを示すものである。図１０に示すように、ＦＡ－ＦＯＳII群でＦＡ－ＦＯＳIIから遊離したＦＡのＴｍａｘは、約３０分であった。一方、フェルラ酸（ＦＡ）投与群ではＴｍａｘは約５分であった。また、図１０に示すようにＦＡ－ＦＯＳII群でＦＡ－ＦＯＳIIから遊離したＦＡの平均滞留時間は約２４０分で、フェルラ酸（ＦＡ）投与群では、Ｔ_１／２が約３０分のものと比較したとき、比較的長い時間であった。ＦＡ－ＦＯＳII投与後に観察されたガラスＦＡのＣｍａｘは、２７．０８μＭであった。ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ）は、薬物分子が身体に露出した程度（血漿中の薬物分子の広がり）を表す、ＦＡ－ＦＯＳII群でＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ）は６２３４．７７μＭ＊Ｍｉｎ／Ｌであった。これフェルラ酸（ＦＡ）を基準に同一容量のフェルラ酸（ＦＡ）を投与した群でのＡＵＣよりも約２．０２倍高い値である。したがって、フェルラ酸（ＦＡ）の分子の生体利用率は、ＦＡ－ＦＯＳIIを投与したときフェルラ酸（ＦＡ）自体を投与したものに比べて、約２倍となることがわかる。

（３）ＨＴ－２９腫瘍（ヒト腫瘍）保有異種移植マウスモデルでＦＡ－ＦＯＳIIの抗癌活性
ＨＴ－２９腫瘍を保有する異種移植マウスを使用してＦＡ－ＦＯＳIIの抗癌活性を評価した。具体的にはＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを以下の４つの群に無作為に割り当て、各群に必要な処理を行った。また、ＨＴ－２９腫瘍を保有する異種移植マウスモデルは、次のような方法で製造した。まず、ＨＴ－２９細胞株を、５％ＣＯ_２の条件で、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ １６４０培地で培養し、収穫した。収穫したＨＴ－２９細胞株の培養液を希釈し、１×１０^７ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌ／ｍｉｃｅの量でＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側面皮下領域に注射した後、腫瘍体積が１５０～２００ｍｍ^３に達するまで待った。

（ｉ）正常群（Ｎａｉｖｅ）
（ｉｉ）対照群（ｃｏｎｒｔｏｌ）：ＨＴ－２９腫瘍を保有する異種移植マウスであって、別途の薬物を投与していない。
（ｉｉｉ）５－フルオロウラシル処理群（５－Ｆｕ）：５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）を０．９％食塩水に溶解させて薬物を用意し、腹腔内にＩＰ投与する／０．２ｍｌ以下で１週間の間、５日連続で、一日に一回投与し、１週間休み、５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）量を基準に、マウスに１回当たり１５ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ）の容量で２週間、１週間に２回ＩＰ投与する（これらの特定の治療療法は、研究者によって観察された５－ＦＵの副作用により選択される。）
（ｉｖ）ＦＡ－ＦＯＳII処理群（ＦＡ ＦＯＳII）：フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIIを蒸留水に溶解させて薬物を用意し、ＦＡ－ＦＯＳII量を基準に３８９０ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ）の容量で４週間、毎日経口投与する。

図１１は、ＨＴ－２９腫瘍保有異種移植マウスモデルを用いて、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIIの抗癌活性を評価した実験結果のうち、（ａ）４週間の治療後、腫瘍体積、（ｂ）腫瘍の成長率、（ｃ）４週間の治療後の腫瘍重量、（ｄ）４週間の治療後の体重、（ｅ）治療過程の間、毎日の体重増加率、及び（ｆ）治療中の体重増加プロファイルを表したものである。図１１に示すようにＦＡ－ＦＯＳII処理群では、腫瘍体積は、対照群と比較すると約５０％減少した（ｐ＜０．０５）。また、ＦＡ－ＦＯＳII処理群において平均従量重量は、対照群と比較すると、約３７．３４％減少した。薬物治療の毒性または副作用を間接的に調べるために測定した体重は、ＦＡ－ＦＯＳII処理群において対照群と比較したとき、約６％増加した。また、毎日の体重増加率もＦＡ－ＦＯＳII処理群で対照群と比較したとき、約４１．４７％増加した。全治療期間の間、ＦＡ－ＦＯＳII処理群での体重増加が対照群よりより高いことを示し、これらの結果は、フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体ＦＡ－ＦＯＳIIが副作用を誘発しないことを示唆する。

６．フェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体の抗酸化活性
ＦＡ－ＦＯＳIの抗酸化活性をＡＢＴＳ［２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］カチオンラジカル消去能分析法を用いて測定した。ＡＢＴＳカチオンラジカル消去能分析法は、Ａｒｄａ Ｓｅｒｐｅｎ ｅｔ ａｌ．、２００７に基づいて行われた。具体的には、エッペンドルフチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）内に凍結乾燥されたＦＡ－ＦＯＳIを様々な量で添加した後、ここにＭｎＯ_２を使用して化学的に予め生成したＡＢＴＳカチオンラジカル試薬１．７ｍｌを添加した後、２分間攪拌して均一に混合し、６分間反応を進行した。以後、反応混合物を遠心分離して上澄み液を回収し、ＵＶ－ＶＩＳプレートリーダーを用いて、上澄み液の吸光度を７３４ｎｍで測定した。図１２は、ＦＡ－ＦＯＳIの抗酸化活性をＡＢＴＳ［２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］カチオンラジカル消去能分析法を用いて測定した結果である。図１２「ＦＡ ＦＯＳI」は、ＦＡ－ＦＯＳIを示す。また、１２で示すように、ＦＡ－ＦＯＳIは、優れた抗酸化活性を表し、ＦＡ－ＦＯＳIのＥＣ_５０は、約７．１６ｍｇであった。

以上、本発明を実施形態を通して説明したが、本発明は、必ずしもここに限定されるものではなく、本発明の範疇と思想を逸脱しない範囲内で種々の変形実施が可能であることはもちろんである。したがって、本発明の保護範囲は、本発明に添付された特許請求の範囲に属するすべての実施形態を含むものと解釈されるべきである。

Claims (15)

1. 以下の化学式IIで表される化合物から選択されるファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体；
   ［化II］
   ＰｈＡ－Ｇｌｕ－（Ｆｒｕ）_ｎ－Ｆｒｕ
   前記化学式IIにおいて、
   「ＰｈＡ」はフェノール酸形態のファイトケミカルを表し、「Ｇｌｕ」はグルコースを表し、「Ｆｒｕ」はフルクトースを表し、
   「ＰｈＡ」と「Ｇｌｕ」は、エステル結合により連結され、「Ｇｌｕ」と「Ｆｒｕ」は、グリコシド結合により連結され、「Ｆｒｕ」と「Ｆｒｕ」は、グリコシド結合により連結され、
   ｎはグリコシド結合により連結された「Ｆｒｕ」の数として１～５９の整数から選択される。
2. 前記フェノール酸形態のファイトケミカルは、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、コーヒー酸（Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、ケイ皮酸（Ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、クロロゲン酸（Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、クマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ）、シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、チコリ酸（Ｃｉｃｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、ダイフェルラ酸（Ｄｉｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、クマル酸（Ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）、サリチル酸（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、３－ヒドロキシ安息香酸（３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、４－ヒドロキシ安息香酸（４－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、バニリン酸（Ｖａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）またはエラグ酸（Ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ）から選択されることを特徴とする請求項１に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体。
3. 前記フェノール酸形態のファイトケミカルは、グルコース６番炭素に位置するヒドロキシル基とファイトケミカルに存在するカルボキシル基との間のエステル結合により連結されることを特徴とする請求項１に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体。
4. 以下の化学式IVで表されるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体から選択されることを特徴とする請求項１に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体；
   ［化IV］
   

   

   前記化学式IVにおいて、ｎは１～５９の整数から選択される。
5. 以下の化学式VIで表されるフェルラ酸－フラクトオリゴ糖結合体からなる、またはこれを主成分として含むことを特徴とする請求項４に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体。
   ［化VI］
   

   
6. 請求項１～５のいずれか一項から選択されるファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の薬学的に許容可能な塩。
7. （ａ）反応溶媒にフェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）とエステル化反応用触媒を添加および溶解し、加熱し、ファイトケミカルの活性化反応を進行して活性化された形態のファイトケミカルを含む１次反応混合物を得する段階と、
   （ｂ）前記１次反応混合物に以下の一般構造式で表されるフラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を添加し、不活性ガス雰囲気下で加熱し、フラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）とファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）との間のエステル化反応を進行し、請求項１～５のいずれか一項に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を含む二次反応混合物を収得する段階を含むファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法：
   ［フラクトオリゴ糖の一般構造式］
   Ｇｌｕ－（Ｆｒｕ）_ｋ
   前記フラクトオリゴ糖の一般構造式において、「Ｇｌｕ」はグルコースを表し、「Ｆｒｕ」はフルクトースを表し、ｋはグリコシド結合を介して連結されたフルクトースの数として２～６０の整数から選択される。
8. 以下の段階をさらに含むファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法：
   （ｃ）前記２次反応混合物を冷却し、放置し、ファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を沈殿させ、遠心分離及び洗浄を順次進め、精製されたことを特徴とする請求項７に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を収得する段階。
9. 前記（ａ）段階のファイトケミカル活性化反応は、４５～１２０℃で２～２０ｈｒの間進行されることを特徴とする請求項７に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法。
10. 前記（ｂ）段階のエステル化反応は、７０～１５０℃で２～１５ｈｒの間進行されることを特徴とする請求項７に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法。
11. 前記エステル化反応用触媒は、カルボニルジイミダゾール（Ｎ、Ｎ’－ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＣＤＩ）であることを特徴とする請求項７に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法。
12. 前記ファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体を製造するために使用されたフェノール酸（Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）形態のファイトケミカル（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、エステル化反応用触媒及びフラクトオリゴ糖のモル比は２：２：１～１０：１０：１の範囲で選択されることを特徴とする請求項７に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体の製造方法。
13. 請求項４または５のいずれか一項に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む抗癌用組成物。
14. 請求項４又は５のいずれか一項に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、大腸癌の予防または治療用薬学組成物。
15. 請求項４又は５のいずれか一項に記載のファイトケミカル－フラクトオリゴ糖結合体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、大腸癌転移抑制用組成物。

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