JP2022507464A

JP2022507464A - 脂肪酸代謝の調節に影響を与えるａｎｇｐｔｌ４オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JP2022507464A
Application number: JP2021526428A
Authority: JP
Inventors: ジャシンスキフランク; ザーデヴァッサーアンネ; ミヒェルスヴェン
Original assignee: Lipigon Pharmaceuticals AB
Current assignee: Lipigon Pharmaceuticals AB
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2022-01-18
Also published as: CN113015803A; WO2020099478A2; KR20210090660A; BR112021009054A2; AU2019382087A1; WO2020099478A3; US12024708B2; US20220162613A1; CA3117750A1; EP3880819A2; US20220010311A1; MX2021005507A; US11781139B2

Abstract

本発明は、１２～２２個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドからなるＡＮＧＰＴＬ４阻害剤であって、ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾され、オリゴヌクレオチドが配列番号１のＡＮＧＰＴＬ４（ヒト）、配列番号２のＡＮＧＰＴＬ４（ヒト）、配列番号５８のＡＮＧＰＴＬ４（マウス）および／または配列番号５９のＡＮＧＰＴＬ４（マウス）の核酸配列とハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドがＡＮＧＰＴＬ４の発現を阻害する、ＡＮＧＰＴＬ４阻害剤、ならびにかかる阻害剤と薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤またはそれらの組合せとを含む医薬組成物に関する。

Description

本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のＡＮＧＰＴＬ４の阻害剤およびかかる阻害剤を含む医薬組成物、ならびに心血管疾患、肥満、ＩＩ型糖尿病、ホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）または脂質異常症（dislipidemia）の治療へのその使用に関する。

発明の背景
血漿脂質の乱れは、心血管代謝疾患においてよく知られたリスク因子である。ＬＤＬ－コレステロールの上昇の治療の成功は８０年代半ばからもたらされており、その後の数十年間で、ＨＤＬ－コレステロールおよびトリグリセリド等の他の脂質クラスへと焦点が広げられた。疫学的研究から、血漿トリアシルグリセロール（ＴＧ）および付随するレムナントコレステロールの増加が冠状動脈性心疾患の独立したリスク因子であることが明らかにされている（Cullen, 2000）。さらに、高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）は、メタボリックシンドローム（ＭＳ）の特徴であり、肥満およびインスリン耐性を伴うことが多い（Reaven, 1995）。メタボリックシンドロームおよびＨＴＧと関連する２型糖尿病および心血管疾患（ＣＶＤ）のリスクの増加により、血漿ＴＧ恒常性の維持が非常に望ましいことが示唆される。

重度の高トリグリセリド血症を有する患者は、特にＴＧレベルが１０００～１５００ｍｇ／ｄｌを超える場合（Tsuang, 2009）、膵炎を発症する可能性もある（Athyros, 2002）。４０個もの異なる遺伝子が血漿ＴＧを調節することが現在知られているが（Johansen, 2011）、ＴＧを顕著に増加させることが知られている単一遺伝子（monogenetic）障害も、少なからず存在する（Nordestgaard and Varbo, 2014）。これらには、以下でより詳細に説明するＦＣＳが含まれる。

脂肪分解は、心臓、骨格筋および脂肪組織の毛細血管の管腔表面で起こるＴＧリッチリポタンパク質のクリアランスの重要な段階である。筋肉および脂肪細胞で合成されたＬＰＬは、毛細血管内皮細胞へと移行する。リポタンパク質上のＴＧの加水分解に関与する主要な酵素であるリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）における稀な遺伝的欠陥（Benlian, 1996）は、１０ｍｍｏｌをはるかに上回る血漿ＴＧレベルを特徴とする家族性高カイロミクロン血症症候群（ＦＣＳ）を引き起こす恐れがある。ＬＰＬの主要なタンパク質活性化因子であるアポリポタンパク質Ｃ－ＩＩ（ａｐｏＣ－ＩＩ）におけるホモ接合性欠陥も同様の高トリグリセリド血症表現型を引き起こし得る（Breckenridge, 1978）。近年では、ＬＰＬを内皮細胞の表面に結合するタンパク質であるＧＰＩＨＢＰ１における欠陥（Beigneux, 2007）およびアポリポタンパク質Ａ－Ｖ（ＡｐｏＡ－Ｖ）における突然変異（Ishihara, 2005）が、ヒトにおいて高トリグリセリド血症を引き起こすことも記載されている。リパーゼ特異的シャペロンＬＭＦ１における遺伝的欠陥もＦＣＳを促進することが見出されている。まとめると、１００００００人の患者のうち約２、３人がＦＣＳを有する。

ＬＰＬ活性化因子がＬＰＬ系に影響を及ぼすだけでなく、ａｐｏＣ３およびＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８等のＬＰＬの負の調節因子における機能喪失突然変異が、望ましい血漿脂質プロファイルおよび代謝性疾患のリスクの低下を促進することが示されている。ＡＮＧＰＴＬ４は種々のリパーゼ、特にＬＰＬの調節因子である。このタンパク質は、ＬＰＬの二量体触媒活性形態を不活性な単量体へと分解するアンフォールディングシャペロンであり、これは不可逆的事象である。例えばＬＰＬを脂質基質から離すａｐｏＣ３と比べ、ＡＮＧＰＴＬは、ＬＰＬをこのように調節する唯一の既知の因子である。加えて、ＡＮＧＰＴＬ４は、肝性リパーゼおよび内皮リパーゼに影響を及ぼすことで、血漿脂質のＴＧ部分だけでなく、ＬＤＬ－ｃおよびＨＤＬ－ｃにも影響を及ぼす。ＡＮＧＰＴＬ４は、空腹時に誘導される因子であり、肝臓だけでなく、適切な程度まで脂肪組織および骨格筋によっても発現され、すなわちＡＮＧＰＴＬ４は普遍的に発現される。ＡＮＧＰＴＬ４の発現は、種々の刺激によって調節され、例えば肝臓においてペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Peroxisome Proliferator-Activator Receptor）（ＰＰＡＲ）α、ＰＰＡＲδおよびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）のそれぞれによって誘導される。これらのＡＮＧＰＴＬが欠損した動物モデルは、ＬＰＬ活性の上昇および血漿脂質の減少を示し、ヒト変異体のトランスジェニック過剰発現を有するマウスは、逆の結果を示す。この動物研究からの所見は、ヒトの欠損および機能喪失突然変異によって支持され、ＡＮＧＰＴＬ４と血漿ＴＧレベルおよびＨＤＬ－ｃとが関連付けられる。ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子は、心血管代謝疾患との関連を示す。

このため、これまでの情報から、血漿ＴＧ恒常性におけるＬＰＬ、ＧＰＩＨＢＰ１、ＡＮＧＰＴＬおよびａｐｏＡ－Ｖの協調的な活性への新たな知見が得られる。これらの因子の中でも、ＡＮＧＰＴＬ４は興味深いことに、ホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）およびヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）において非機能的であることが多いＬＤＬ受容体に完全に依存することなく、血漿コレステロールレベル、すなわちＬＤＬ－ｃ、ＨＤＬ－ｃおよびレムナント－ｃも調節する。これにより、ＡＮＧＰＴＬ４を標的とした上で「汎用」の血漿脂質薬の機会が与えられる。

ＡＮＧＰＴＬ４は、肝臓への遊離脂肪酸の取り込みにおいて重要な役割を果たすリポタンパク質リパーゼの活性を調節する。リポタンパク質リパーゼの調節異常は、細胞において脂質過剰を引き起こし、これが例えば肥満、ＩＩ型糖尿病または心血管疾患につながる可能性がある。

ＡＮＧＰＴＬ４ノックアウトマウスは、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の分解の増加およびＶＬＤＬ産生の減少に基づくトリグリセリド（ＴＧ）レベルの低下を示す。コレステロールレベルは、やや影響を受ける。脂質レベルの高い食餌は、モノクローナル抗体で処理されたＡＮＧＰＴＬ４ノックアウトマウスにおいて、腸組織、排出（effluent）リンパ系および／または腸間膜リンパ節の脂肪肉芽腫の病変のために生存能力の低下をもたらす（Desai et al., 2007 PNAS）。ＡＮＧＰＴＬ４変異体Ｅ４０Ｋがヘテロ接合のヒトは、空腹時に顕著に低い血漿ＴＧレベルを示す。また、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベルは、Ｅ４０Ｋヘテロ接合のヒトにおいて顕著に高かった。高いＴＧレベルと低いＨＤＬコレステロールレベルとの組合せが心血管疾患を患うリスクを増大することから、ＡＮＧＰＴＬ４の低減または阻害は、リスクを低下させる可能性がある。ＡＮＧＰＴＬ４ヌル対立遺伝子はヒトで認められるが、ＡＮＧＰＴＬ４ノックアウトマウスと同等の病理は、これまでに特定されていない。

ＡＮＧＰＴＬ４の発現を阻害する本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば血漿脂質レベルをＬＤＬ受容体の機能性とは独立して低下させ、このことは、例えばＬＤＬ受容体が欠損したホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）またはヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）の治療へのオリゴヌクレオチドの使用に適している。

ＡＮＧＰＴＬ４は、脂肪酸代謝の調節に関与するだけでなく、インフルエンザ感染にも関与する。ＡＮＧＰＴＬ４は例えば、インフルエンザ肺炎においてＳＴＡＴ３媒介機構によって上方調節され、呼吸器感染および肺炎の潜在的バイオマーカーである（Li et al., Cell Reports 10, Feb. 2015）。

これまで、ＡＮＧＰＴＬ４発現の低減および阻害のそれぞれに非常に効率的であり、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡおよび／またはｐｒｅ－ｍＲＮＡとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドは存在しなかった。ＡＮＧＰＴＬ４発現を阻害するｓｉＲＮＡを用いた研究から、ｓｉＲＮＡが好適なパッケージング材料にパッケージングされた場合にのみｉｎｖｉｖｏ阻害が可能であることが示された。ｓｉＲＮＡがパッケージングされている場合であっても、ｍＲＮＡ発現の阻害の効率は多くの場合、改善することができない。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ４の発現の阻害において大きな成功を収めている。オリゴヌクレオチドの作用様式は、抗体または小分子の作用様式とは異なり、オリゴヌクレオチドは、例えば
（ｉ）組織への浸透、
（ｉｉ）標的の複数の機能および活性のそれぞれの遮断、
（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチド間の、または抗体もしくは小分子との組合せ、ならびに
（ｉｖ）抗体がアクセス可能でないもしくは特異的にアクセス可能でない、または小分子によって阻害可能でない細胞内効果の阻害
に関して高度に有利である。

発明の概要
本発明は、例えば１２～２２個のヌクレオチド、１５～２０個のヌクレオチドまたは１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のヌクレオチドを含むか、またはそれからなるオリゴヌクレオチドからなり、ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾されているＡＮＧＰＴＬ４阻害剤に関する。ＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１のＡＮＧＰＴＬ４（ヒト；ＮＭ＿１３９３１４）、配列番号２のＡＮＧＰＴＬ４（ヒト；ＧＲＣｈ３８＿１９＿８３６４１５１＿８３７４３７３）、配列番号５８のＡＮＧＰＴＬ４（マウス；ＮＭ＿０２０５８１．２）および／または配列番号５９のＡＮＧＰＴＬ４（マウス；ＧＲＣｍ３８：１７：３３７７３７５０：３３７８１５７５）の核酸配列とハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ４の発現を阻害する。修飾されたヌクレオチドは、例えばＬＮＡ、ｃＥＴ、ＥＮＡ、２’フルオロ修飾ヌクレオチド、２’Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドおよびそれらの組合せ等の架橋型核酸からなる群から選択される。

本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドは、例えば配列番号１の１７３２位～１７５９位（例えばＡ２４０４４Ｈｅ、配列番号４７；Ａ２４０７６Ｈｅ、配列番号４７）および／もしくは２３４位～２６１位（例えばＡ２４１０２Ｈｅ、配列番号１７７；Ａ２４１０３Ｈｅ、配列番号１７８）および／もしくは１２６４位～１２９３位（例えばＡ２４１１０Ｈｅ、配列番号１８５；Ａ２４１１１Ｈｅ、配列番号１８６）、ならびに／もしくは配列番号２の２８００位～２８７２位（例えばＡ２４０８３Ｈｉ、配列番号１５８；Ａ２４０８５Ｈｉ、配列番号１６０；Ａ２４０８６Ｈｉ、配列番号１６１；Ａ２４０８７Ｈｉ、配列番号１６２）および／もしくは３４１５位～３４４２位（例えばＡ２４０８９Ｈｉ、配列番号１６４）および／もしくは４９６８位～４９９４位（例えばＡ２４０９７Ｈｉ、配列番号１７２）、またはそれらの組合せから選択された活性部位とハイブリダイズする。上記阻害剤は、ＡＮＧＰＴＬ４の発現を例えばナノモル濃度またはマイクロモル濃度で阻害する。

本発明は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４阻害剤と薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤またはそれらの組合せとを含む医薬組成物にさらに関する。阻害剤および医薬組成物はそれぞれ、ＡＮＧＰＴＬ４不均衡が関与する障害を予防および／または治療する方法に使用される。かかる障害は、例えば心血管代謝疾患、肥満、２型糖尿病等の糖尿病、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）、脂質異常症、膵炎、メタボリックシンドローム、家族性高カイロミクロン血症症候群（ＦＣＳ）、インフルエンザ感染および／または癌である。高コレステロール血症は、例えばホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）およびヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）であり、癌は、例えば乳癌、肺癌、悪性黒色腫、リンパ腫、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、脳癌、喉頭、胆嚢、膵臓、精巣、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、脂肪肉腫、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、島細胞腫、原発性脳腫瘍、髄膜腫、急性および慢性のリンパ球性および顆粒球性腫瘍、急性および慢性の骨髄性白血病、有毛細胞腫、腺腫、過形成、髄様癌、腸管神経節腫、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫（leiomyomater tumor）、子宮頸部異形成、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血症、腺癌、退形成性星細胞腫、多形膠芽腫、白血病または類表皮癌である。

本発明のＡＮＧＰＴＬ４阻害剤またはＡＮＧＰＴＬ４阻害剤を含む医薬組成物は、局所的または全身的に投与される。

本明細書に引用または参照される全ての文献（「本明細書の引用文献」）、および本明細書の引用文献に引用または参照される全ての文献は、本明細書でまたは参照することにより本明細書に組み込まれる任意の文献で言及される任意の製品の任意の製造業者の取扱説明書、説明書き、製品規格および製品仕様書と共に、参照することにより本明細書に組み込まれ、本発明の実施に用いることができる。より具体的には、参照される全ての文献は、それぞれの文献が参照することにより組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同じ程度まで、参照することにより組み込まれる。

４２個のヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの初期スクリーニングを示す図である。いかなるヒトまたはマウスｍＲＮＡに対しても配列相補性を有しない対照オリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ１；配列番号５７）を対照として含めた。ヒト類上皮子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）を、それぞれのオリゴヌクレオチドで１０μＭの単一濃度にて３日間処理した。処理開始から３日後に細胞を溶解させ、ＡＮＧＰＴＬ４およびＨＰＲＴ１のｍＲＮＡレベルを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘＲＮＡアッセイを用いて決定した。ＨＰＲＴ１をＡＮＧＰＴＬ４発現の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。モック処理（mock-treated）細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現。三連ウェル、平均±ＳＤ（図１）。残存ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を調査するためのＳＫ－ＯＶ３細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの別のスクリーニングを示す図である。ＨｅＬａ細胞において１０μＭの濃度で試験した更なるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを示す図である。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち４つがＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡの５０％超のノックダウンを示す（０．５未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）。残存ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を調査するためのＳＫ－ＯＶ３細胞における更なるＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの別のスクリーニングを示す図である。ｉｎｖｉｔｒｏでの活性化Ｂ細胞の核因子「κ軽鎖エンハンサー」（ＮＦ－ｋＢ）に依存した分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）産生の活性化をモニタリングすることによってヒトＴＬＲ９の刺激を研究するために使用されるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ９細胞を示す図である。ＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドＡ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６）、Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）およびＡ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）、ならびに対照のＮｅｇ１（配列番号５７）およびＯＤＮ２００６（５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’ＰＴＯ修飾－ Invivogenのカタログ番号ｔｌｒｌ－２００６；配列番号１５３）を分析した。半数阻害濃度（ＩＣ_５０）値の決定のために選択された、ＨｅＬａおよびＳＫ－ＯＶ３細胞において最も強力なノックダウン有効性を有するヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６）、Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）およびＡ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）を示す図である。初代肝細胞を、異なる濃度（５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ）のそれぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドで３日間処理し、同時にＰＰＡＲγ（１μＭ）で処理した。処理開始から３日後に、図６に示されるようにＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘＲＮＡアッセイを用いてｍＲＮＡ発現を分析した。グラフ表示のためにモック処理細胞を０．３２ｎＭとした。初代肝細胞における付加的なＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の１回目の単回投与有効性スクリーニングを示す図である。２５０００個の細胞／ウェルを９６ウェルコラーゲンIコーティング平底プレートに播種し、それぞれのＡＳＯで５μＭの最終濃度にて処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲγで処理した。ビヒクル対照として、細胞を同量のＤＭＳＯで処理した（「ＤＭＳＯ」）。２４時間毎に、７０μｌの上清をＰＰＡＲγおよび５μＭのそれぞれのＡＳＯまたはＤＭＳＯを含有する新鮮培地に置き換えた。３日後に細胞を溶解させ、ヒトＨＰＲＴ１およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝４２）、ＳＤ＝０．２４）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ７０％および０％のノックダウン有効性（上のグラフ）またはモック処理細胞の１００％のＨＰＲＴ１発現（１００とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝４２）、ＳＤ＝３５．８、下のグラフ）を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。陽性対照ＡＳＯをアスタリスクによって示す。初代肝細胞における付加的なＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯの２回目の単回投与有効性スクリーニングを示す図である。２５０００個の細胞／ウェルを９６ウェルコラーゲンIコーティング平底プレートに播種し、それぞれのＡＳＯで５μＭの最終濃度にて処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲγで処理した。ビヒクル対照として、細胞を同量のＤＭＳＯで処理するか（「ＤＭＳＯ」）または未処理のままとした（「－ＤＭＳＯ」）。２４時間毎に、７０μｌの上清をＰＰＡＲγおよび５μＭのそれぞれのＡＳＯまたはＤＭＳＯもしくは培地のみを含有する新鮮培地に置き換えた。３日後に細胞を溶解させ、ヒトＨＰＲＴ１およびヒトＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝３６）、ＳＤ＝０．２４）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ７０％および０％のノックダウン有効性（上のグラフ）またはモック処理細胞の１００％のＨＰＲＴ１発現（１００とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝３６）、ＳＤ＝１９．３、下のグラフ）を示す。データは六連（Ａ２４０７６Ｈｅおよび陰性対照オリゴヌクレオチド）、九連（－ＤＭＳＯ）または三連（他の全てのＡＳＯ）ウェルの平均±ＳＤとして表す。陽性対照ＡＳＯをアスタリスクによって示す。ＨＥＫ－ＢｌｕｅｈＴＬＲ９ＳＥＡＰレポーター細胞におけるＮＦ－ｋＢ活性化を示す図である。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ９細胞を平底９６ウェルプレートに播種し、指定のオリゴヌクレオチドで２４時間処理した。インキュベーション後に細胞上清を採取し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液と共に４時間（図９Ａ、９Ｃおよび９Ｄ）または３．５時間（図９Ｂ）インキュベートした。６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の測定によってＳＥＡＰ活性を決定した。ＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯおよびｎｅｇ１で処理した細胞についてのデータを、５０００ｎＭＯＤＮ２００６で刺激した細胞のＯＤ単位（１００％とした）に対するＯＤ単位の三連の平均±ＳＤとして示す。ＯＤＮ２００６で処理した細胞についてのデータを六連の平均±ＳＤ（Ａ）、三連の平均±ＳＤ（Ｄ）または各プレート上での三連の平均の平均±ＳＤ（Ｂ、Ｃ）として示す。選択されたＡＮＧＰＴＬ４ＡＳＯのＩＣ_５０決定を示す図である。２５０００個の初代ヒト肝細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、異なる濃度（５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ）のそれぞれのＡＳＯで処理した。２４時間毎に、７０μｌの上清を指定の濃度のそれぞれのＡＳＯを含有する新鮮培地に置き換えた。３日後に細胞を溶解させ、ＨＰＲＴ１およびＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした（ｎ＝３６）、ＳＤ＝０．２６）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。カニクイザル肝細胞のトランスフェクション後の標的遺伝子発現に対する選択されたＡＮＧＰＴＬ４ＡＳＯの有効性を示す図である。２５０００個の初代カニクイザル肝細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、異なる濃度（２ｎＭ、０．２ｎＭ）のそれぞれのＡＳＯをトランスフェクトした。３７℃で２４時間のインキュベーション後に細胞を溶解させ、ＨＰＲＴ１およびＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした（ｎ＝１２）、ＳＤ＝０．２５）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。図１２に示されるマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドで１０μＭの単一濃度にて別個に処理したマウス胎児線維芽細胞（３Ｔ３細胞）を示す図である。処理開始から３日後にｍＲＮＡレベルをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイによって決定した。Ｈｐｒｔ１をＡＮＧＰＴＬ４発現の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。８つのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちＡ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０１７Ｍ（配列番号７６）、Ａ２４０２１Ｍ（配列番号８０）、Ａ２４０４９Ｍ（配列番号１０８）、Ａ２４０１８Ｍ（配列番号７７）、Ａ２４０４１Ｍ（配列番号１００）およびＡ２４０１０Ｍ（配列番号６９）が正規化ＡＮＧＰＴＬ４発現を５０％超低下させた。図１３に示されるＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドで１０μＭの単一濃度にて別個に処理したマウス腎癌Ｒｅｎｃａ細胞を示す図である。３日後にｍＲＮＡレベルをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイによって決定した。Ｈｐｒｔ１をＡＮＧＰＴＬ４発現の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）およびＡ２４０１９Ｍ（配列番号７８）が５０％超のＡＮＧＰＴＬ４ノックダウンをもたらした（０．５未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）。マウス乳癌細胞４Ｔ１において試験した、９個の試験済みのマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび２４個の更なるマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを示す図である。トランスフェクション試薬を使用せずに、細胞を図１４に示される５μＭのそれぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。３日後に細胞上清を５μＭのそれぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮培地に交換し、さらに３日間インキュベートした。その後、ｍＲＮＡレベルをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイによって決定した。ＧａｐｄｈをＡＮＧＰＴＬ４発現の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち１２個、すなわちＡ２４０１７Ｍ（配列番号７６）、Ａ２４０７０Ｍ（配列番号１２７）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０１９Ｍ（配列番号７８）、Ａ２４０６９Ｍ（配列番号１２６）、Ａ２４０２１Ｍ（配列番号８０）、Ａ２４０１１Ｍ（配列番号７０）、Ａ２４０７３Ｍ（配列番号１３０）、Ａ２４０１８Ｍ（配列番号７７）、Ａ２４０５５Ｍ（配列番号１１４）、Ａ２４０１０Ｍ（配列番号６９）およびＡ２４０６５Ｍ（配列番号７９）がＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡの８０％超のノックダウンを示す（０．２未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）。図１５に示される５μＭのそれぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することによって４Ｔ１細胞において試験した、２１個のマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを示す図である。３日後に細胞上清を５μＭのそれぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮培地に交換し、さらに３日間インキュベートした。その後、ｍＲＮＡレベルをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイによって決定した。Ｈｐｒｔ１をＡＮＧＰＴＬ４発現の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。Ａ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０９５Ｍｉ（配列番号１５１）、Ａ２４０９３Ｍｉ（配列番号１４９）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０９０Ｍｉ（配列番号１４６）およびＡ２４０８２Ｍｉ（配列番号１３９）がＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡの５０％超のノックダウンを示す（０．５未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）。半数阻害濃度（ＩＣ_５０）値の決定のために選択された、３Ｔ３、Ｒｅｎｃａおよび４Ｔ１細胞において最も強力なノックダウン有効性を有するＡ２４０１８Ｍ（配列番号７７）、Ａ２４０１９Ｍ（配列番号７８）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０２１Ｍ（配列番号８０）、Ａ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０５４Ｍ（配列番号１１３）、Ａ２４０６５Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０７０Ｍ（配列番号１２７）、Ａ２４０７２Ｍ（配列番号１２９）、Ａ２４０８２Ｍ（配列番号１３９）およびＡ２４０９５Ｍｉ（配列番号１５１）を示す図である。４Ｔ１細胞を異なる濃度（５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ）のこれらのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドで３日間処理した。３日後に細胞上清を５μＭのそれぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮培地に交換し、さらに３日間インキュベートした。次いで、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘＲＮＡアッセイを用いてｍＲＮＡ発現を分析した。４Ｔ１細胞における付加的なマウスＡｎｇｐｔｌ４特異的ＡＳＯの１回目の単回投与有効性スクリーニングを示す図である。２５００個の４Ｔ１細胞／ウェルを９６ウェル平底プレートに播種し、それぞれのＡＳＯで５μＭの最終濃度にて処理した。処理の３日後に、細胞上清を、ＡＳＯを含む新鮮培地に交換し、細胞を３７℃でさらに３日間インキュベートした。その後、細胞を溶解させ、マウスＨｐｒｔ１およびマウスＡｎｇｐｔｌ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝３７）、ＳＤ＝０．２１）に対する残存Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ７５％および０％のノックダウン有効性（上のグラフ）または１００％のＨｐｒｔ１レベル（下のグラフ）（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝３７）、ＳＤ＝０．１７）を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。Ｒｅｎｃａ細胞におけるマウスＡｎｇｐｔｌ４特異的ＡＳＯの２回目の単回投与スクリーニングを示す図である。２５００個のＲｅｎｃａ細胞／ウェルを９６ウェル平底プレートに播種し、それぞれのＡＳＯで５μＭの最終濃度にて処理した。処理の３日後に、細胞上清を、ＡＳＯを含む新鮮培地に交換し、細胞を３７℃でさらに３日間インキュベートした。その後、細胞を溶解させ、マウスＨｐｒｔ１およびマウスＡｎｇｐｔｌ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝３７）、ＳＤ＝０．３７）に対する残存Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ７５％および０％のノックダウン有効性（上のグラフ）または１００％のＨｐｒｔ１レベル（下のグラフ）（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」（ｎ＝３７）、ＳＤ＝０．３６）を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。選択されたＡｎｇｐｔｌ４ＡＳＯのＩＣ_５０決定を示す図である。１５０００個の初代マウス肝細胞／ウェルを９６ウェル平底プレートに播種し、異なる濃度（５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ）のそれぞれのＡＳＯで処理した。３日後に細胞を溶解させ、Ｈｐｒｔ１およびＡｎｇｐｔｌ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした（ｎ＝３６）、ＳＤ＝０．１７）に対する残存Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現。Ｎｅｇ１を黒色で示す。下のグラフにｎｏｏｌｉｇｏ（１００とした（ｎ＝３６）、ＳＤ＝１３．０）に対するＨｐｒｔ１の生の値を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

発明の詳細な説明
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡおよび／またはｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列とハイブリダイズするヒトまたはマウスオリゴヌクレオチドであり、ＡＮＧＰＴＬ４の発現および活性のそれぞれを阻害する、ＡＮＧＰＴＬ４発現の上首尾の阻害剤を提供する。ｍＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸配列のエクソンのみを含み、ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸配列のエクソンおよびイントロンを含む。このため、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ４発現および活性のそれぞれが増大している障害を予防および／または治療する方法に使用される、興味深く、非常に効率的なツールである。

以下で本発明の要素をより詳細に説明する。これらの要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の様式および任意の数で組み合わせて、付加的な実施形態を作り出すことができることを理解されたい。様々に記載される実施例および実施形態は、明示的に記載される実施形態にのみ本発明を限定するものと解釈すべきではない。本明細書は、明示的に記載される実施形態と様々な開示の要素とを組み合わせた実施形態を支持および包含するものと理解すべきである。さらに、文脈上他に指定のない限り、本願に記載される全ての要素の任意の並び替えおよび組合せが本願の明細書によって開示されるとみなされるものとする。

本明細書および特許請求の範囲全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という語、ならびに「comprises」および「comprising」等の変化形は、述べられた成員、整数もしくは工程、または成員、整数もしくは工程の群を含むことを含意するが、任意の他の成員、整数もしくは工程、または成員、整数もしくは工程の群を除外することを含意しないことが理解される。本発明の記載との関連で（特に特許請求の範囲との関連で）使用される「a」および「an」および「the」という用語、ならびに同様の指示語は、本明細書で他に指定のない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲に含まれるそれぞれの値に個別に言及する簡単な方法としての役割を意図するものにすぎない。本明細書で他に指定のない限り、それぞれの値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で他に指定のない限りまたは明らかに文脈と矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書に提示される、あらゆる例または例示的表現（例えば「等（such as）」、「例えば（for example）」）の使用は、本発明をより良く説明することを意図するにすぎず、別途特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの表現も、特許請求されていない任意の要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものと解釈すべきではない。

本発明のオリゴヌクレオチドである阻害剤は、例えば１０～２５個のヌクレオチド、１２～２２個のヌクレオチド、１５～２０個のヌクレオチドまたは１６～１８個のヌクレオチドからなるか、またはそれを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。オリゴヌクレオチドは、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のヌクレオチドからなるか、またはそれを含む。

例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自然にかつ／または人工的に修飾された、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド等のヌクレオチドが隣接した、少なくとも５個のヌクレオチド、すなわちデオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの中央ブロックからなるか、またはそれを含むギャップマーを形成する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。修飾されたヌクレオチドは、例えばロック核酸（ＬＮＡ、例えば２’，４’－ＬＮＡ）、ｃＥＴ、ＥＮＡ、２’フルオロ修飾ヌクレオチド、２’Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドまたはそれらの組合せ等の架橋型ヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾を有する１つ以上のヌクレオチドを含む。加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは任意に、ホスフェートが例えばホスホロチオエートである、修飾されたリン酸骨格を含む。

本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’および／または５’末端、および／またはオリゴヌクレオチド内の任意の位置に１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、ここで修飾ヌクレオチドが、例えば１、２、３、４、５または６つの修飾ヌクレオチドの列に連なるか、または修飾ヌクレオチドが１つ以上の非修飾ヌクレオチドと組み合わされる。以下の表１～４に修飾ヌクレオチド、例えば（＋）で示されるＬＮＡおよび（^＊）で示されるホスホロチオエート（ＰＴＯ）を含むＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドの例を挙げる。表１もしくは２（ヒト）、または表３もしくは４（マウス）の配列からなるか、またはそれを含むＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドは、任意の他の修飾ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとの任意の他の組合せを含んでいてもよい。表１のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドは、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡおよび／またはｐｒｅ－ｍＲＮＡとハイブリダイズする：

表２のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドもヒトＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡおよび／またはｐｒｅ－ｍＲＮＡとハイブリダイズする：

表３のオリゴヌクレオチドは、特にマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡおよび／またはｐｒｅ－ｍＲＮＡとハイブリダイズする：

表４のオリゴヌクレオチドも、特にマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡおよび／またはｐｒｅ－ｍＲＮＡとハイブリダイズする：

オリゴヌクレオチドは、例えば高活性のＡＳＯが富化された部位であるハイブリダイズ活性部位（hybridizing active area）においてハイブリダイズする。ハイブリダイズ活性部位は例えば、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが、ＡＮＧＰＴＬ４発現の強力なノックダウンをもたらす可能性が高い、例えば配列番号１のＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ、および／または例えば配列番号２のＡＮＧＰＴＬ４ｐｒｅ－ｍＲＮＡ上の１つ以上の領域である。本発明では、例えば、驚くべきことに、例えば配列番号１の１７３２位～１７５９位（例えばＡ２４０４４Ｈｅ、配列番号４７；Ａ２４０７６Ｈｅ、配列番号４７）および／または配列番号２の６６０３位～６６３１位（例えばＡ２４０２２Ｈｉ、配列番号２５；Ａ２４０２３Ｈｉ、配列番号２６；Ａ２４０７１Ｈｉ、配列番号５４）から選択されるハイブリダイズ活性部位から選択される幾つかのハイブリダイズ活性部位が特定された。更なるハイブリダイズ活性部位は、ヒト配列番号１の２３４位～２６１位（例えばＡ２４１０２Ｈｅ、配列番号１７８；Ａ２４１０３Ｈｅ、配列番号１７９）および／もしくは１２６４位～１２９３位（例えばＡ２４１１０Ｈｅ、配列番号１８６；Ａ２４１１１Ｈｅ、配列番号１８７）、ならびに／またはヒト配列番号２の２８００位～２８７２位（例えばＡ２４０８３Ｈｉ、配列番号１５９；Ａ２４０８５Ｈｉ、配列番号１６１；Ａ２４０８６Ｈｉ、配列番号１６２；Ａ２４０８７Ｈｉ、配列番号１６３）および／もしくは３４１５位～３４４２位（例えばＡ２４０８９Ｈｉ、配列番号１６５）および／もしくは４９６８位～４９９４位（例えばＡ２４０９７Ｈｉ、配列番号１７３）である。マウス配列番号５８または配列番号５９上のハイブリダイズ活性部位は、例えば配列番号５８の１３７位～１６３位（例えばＡ２４０５４Ｍ、配列番号１１３）および／もしくは２１５位～２９９位（例えばＡ２４０１８Ｍ、配列番号７７；Ａ２４０１９Ｍ、配列番号７８；Ａ２４０２０Ｍ、配列番号７９；Ａ２４０２１Ｍ、配列番号８０；Ａ２４０６５Ｍ、配列番号７９）および／もしくは１３４３位～１３７１位（例えばＡ２４０４２Ｍ、配列番号１０１；Ａ２４１０９Ｍ、配列番号２１２）および／もしくは１７３８位～１７７１位（例えばＡ２４０４７Ｍ、配列番号１０６；Ａ２４０７０Ｍ、配列番号１２７；Ａ２４０７２Ｍ、配列番号１２９）、ならびに／または配列番号５９の１２８６位～１３１４位（例えばＡ２４０８２Ｍｉ、配列番号１３９；Ａ２４１２５Ｍｉ、配列番号２２６）および／もしくは５４８５位～５５１１位（例えばＡ２４０９５Ｍｉ、配列番号１５１；Ａ２４１４８Ｍｉ、配列番号１５１）である。

例えば、本発明のオリゴヌクレオチドはＡＮＧＰＴＬ４、例えばヒトまたはマウスのＡＮＧＰＴＬ４発現を少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ４の発現をナノモル濃度またはマイクロモル濃度、例えば０．１ｎＭ～１００μＭ、０．５ｎＭ～１５ｎＭ、０．６ｎＭ～１０ｎＭ、１ｎＭ～１０μＭ、５ｎＭ～５μＭ、１０ｎＭ～１μＭ、１５ｎＭ～９５０ｎＭ、２０ｎＭ～９００ｎＭ、２５ｎＭ～８５０ｎＭ、３０ｎＭ～８００ｎＭ、３５ｎＭ～７５０ｎＭ、４０ｎＭ～７００ｎＭ、４５ｎＭ～６５０ｎＭ、５０ｎＭ～５００ｎＭもしくは４０ｎＭ～１５０ｎＭの濃度範囲、または０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００もしくは９５０ｎＭ、もしくは１、１０もしくは１００μＭの濃度で阻害する。

本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドは、例えば１ｎＭ～１０μＭ、５ｎＭ～６．６μＭ、１０ｎＭ～５μＭ、１５ｎＭ～３μＭ、２０ｎＭ～２．２μＭ、２５ｎＭ～１μＭ、３０ｎＭ～８００ｎＭ、５０ｎＭ～５００ｎＭ、６０ｎＭ～３００ｎＭ、７０ｎＭ～２５０ｎＭ、８０ｎＭ～２００ｎＭ、９０ｎＭ～１２０ｎＭの濃度範囲、または１、１．６、３、５、８、９、１０、１５、２０、２５、２７、３０、４０、５０、７５、８２、１００、２００、２５０、３００、５００もしくは７４０ｎＭ、もしくは１、２．２、３、５、６．６もしくは１０μＭの濃度で使用される。

本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドは、例えば１回もしくは繰り返して、例えば数週間、数ヶ月もしくは数年にわたって１２時間に１回、２４時間に１回、４８時間に１回投与されるか、または毎週、２週間に１回、３週間に１回、もしくは毎月、もしくは３ヶ月に１回もしくは６ヶ月に１回投与される。

幾つかの実施形態では、本発明は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドと薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。任意に、医薬組成物は化学療法薬、別の疾患特異的活性薬剤、例えばインスリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、本発明のものではない別のオリゴヌクレオチド、抗体、ＨＥＲＡ融合タンパク質、リガンドトラップ（ligand trap）、Ｆａｂフラグメント、ナノボディ、ＢｉＴｅ、ならびに／または例えば腫瘍治療、糖尿病およびその副作用の治療、心血管疾患、肥満、ＩＩ型糖尿病、ホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）等の高コレステロール血症、もしくは脂質異常症の治療に効果的な小分子をさらに含む。

本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、障害、例えばＡＮＧＰＴＬ４不均衡が関与する障害を予防および／または治療する方法に使用される。任意に、障害を予防および／または治療する方法への本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の使用を放射線療法と組み合わせる。放射線療法は、化学療法（例えば白金、ゲムシタビン）とさらに組み合わせることができる。障害は、例えばＡＮＧＰＴＬ４不均衡を特徴とし、すなわち、ＡＮＧＰＴＬ４レベルが正常、健常な細胞、組織、器官または被験体におけるレベルと比較して上昇している。ＡＮＧＰＴＬ４レベルは、例えばＡＮＧＰＴＬ４発現および活性のそれぞれの増大によって上昇する。ＡＮＧＰＴＬ４レベルは、当業者に既知の免疫組織化学、ウエスタンブロット、定量的リアルタイムＰＣＲまたはＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ等の任意の標準方法によって測定される。

本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所的または全身的に、例えば経口、舌下、経鼻、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、髄腔内、経皮および／または直腸投与される。代替的にまたは組み合わせて、ｅｘｖｉｖｏで処理した免疫細胞を投与する。ＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドは、単独でまたは本発明の別のＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて、任意に、本発明のものではない別のオリゴヌクレオチド、抗体、ＨＥＲＡ融合タンパク質、リガンドトラップ、Ｆａｂフラグメント、ナノボディ、ＢｉＴｅ、小分子および／もしくは化学療法薬（例えば白金、ゲムシタビン）等の別の化合物、ならびに／またはインスリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤および／もしくはアンジオテンシン受容体遮断薬等の別の疾患特異的薬剤と組み合わせて投与される。

本発明のものではないオリゴヌクレオチド、抗体、ＨＥＲＡ融合タンパク質、リガンドトラップ、Ｆａｂフラグメント、ナノボディ、ＢｉＴｅおよび／または小分子は、腫瘍、インフルエンザ感染、ＩＩ型糖尿病等の糖尿病およびその副作用、心血管疾患、肥満、ホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）等の高コレステロール血症、または脂質異常症の予防および／または治療に効果的である。本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、例えば固形腫瘍または血液系腫瘍を予防および／または治療する方法に使用される。本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を用いて予防可能かつ／または治療可能な癌の例は、乳癌、肺癌、悪性黒色腫、リンパ腫、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、脳癌、喉頭、胆嚢、膵臓、精巣、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、脂肪肉腫、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、島細胞腫、原発性脳腫瘍、髄膜腫、急性および慢性のリンパ球性および顆粒球性腫瘍、急性および慢性の骨髄性白血病、有毛細胞腫、腺腫、過形成、髄様癌、腸管神経節腫、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫、子宮頸部異形成、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血症、腺癌、退形成性星細胞腫、多形膠芽腫、白血病または類表皮癌である。

本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を用いて予防可能かつ／または治療可能な、癌以外の疾患の更なる例は、例えばＩＩ型糖尿病等の糖尿病およびその副作用、心血管疾患、肥満、ホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）等の高コレステロール血症、または脂質異常症である。

幾つかの例では、２つ以上の本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドを共に、同じ時点で、例えば医薬組成物中でもしくは別々に、または間隔をずらして投与する。幾つかの例では、２つ以上の本発明のＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドを共に、同じ時点で、例えば医薬組成物中でもしくは別々に、または間隔をずらして投与する。他の例では、本発明の１つ以上のオリゴヌクレオチドを本発明のものではない別のオリゴヌクレオチド、抗体、ＨＥＲＡ融合タンパク質、リガンドトラップ、Ｆａｂフラグメント、ナノボディ、ＢｉＴｅ、小分子および／または化学療法薬等の別の化合物と共に、同じ時点で、例えば医薬組成物中でもしくは別々に、または間隔をずらして投与する。

本発明の被験体は、例えば哺乳類、鳥類または魚類である。

実施例
以下の実施例では、本発明の種々の実施形態を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。以下の実験は、ＡＮＧＰＴＬ４を内因性発現する細胞に対して行われ、すなわち、細胞はトランスフェクトされたレポーター構築物を含む人工系ではない。かかる人工系は概して、治療に関連したｉｎｖｉｖｏ系により近い内因性系よりも高度の阻害および低いＩＣ_５０値を示す。さらに、トランスフェクション剤は以下の実験に使用されず、すなわちジムノティック送達（gymnotic delivery）が行われる。トランスフェクション剤がオリゴヌクレオチドの活性を上昇させ、これがＩＣ_５０値に影響を与えることが知られている（例えば、Zhang et al., Gene Therapy, 2011, 18, 326-333；Stanton et al., Nucleic Acid Therapeutics, Vol. 22, NO. 5, 2012を参照されたい）。トランスフェクション剤を用いた人工系を治療アプローチに転換することが困難または不可能であり、トランスフェクション製剤は、これまでオリゴヌクレオチドについて承認されていないため、以下の実験は、トランスフェクション試薬を使用した実施例１１の実験を除いて、トランスフェクション剤を用いずに行われる。

実施例１：ＨｅＬａ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの１回目のスクリーニング
５０００個のＨｅＬａ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、図１に示すそれぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドで１０μＭの最終濃度にて処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲδ（Sigma Aldrich、カタログ番号ＳＭＬ１４９１）で処理した。本実施例に使用したＰＰＡＲδは、例えば５ｍｇのＰＰＡＲδ（分子量：４５３．５０）を１．１ｍｌのＤＭＳＯに溶解することによって調製したＰＰＡＲδストック溶液（１０ｍＭ）をベースとしている。最終濃度１μＭのＰＰＡＲδについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌのＰＰＡＲδストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。処理開始から３日後に細胞を溶解させ、ヒトＨＰＲＴ１およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した（図１）。本実施例に使用したＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイは例えば、標的ｍＲＮＡと特異的プローブセット（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲｅａｇｅｎｔＳｙｓｔｅｍの一部）との協調的ハイブリダイゼーションに依存する分岐ＤＮＡ技術（ｂＤＮＡ）に基づく。アッセイは、製造業者のプロトコル（Thermo Fisher Scientific）に従って行われ、ＲＮＡレベルの決定に用いられる。細胞溶解に用いられるＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＳａｍｐｌｅＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＫｉｔと対象のＲＮＡのハイブリダイゼーション、増幅および検出に用いられるＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲｅａｇｅｎｔＳｙｓｔｅｍとを組み合わせる。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲｅａｇｅｎｔＳｙｓｔｅｍは、対象の特定のＲＮＡを検出するように設計されたＲＮＡ特異的プローブセットをベースとしている。

ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ７０％および５０％または０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図１に示されるように、２つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）およびＡ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６））は、正規化ＡＮＧＰＴＬ４発現を７０％超低下させた（０．３未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）。さらに、３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａ２４００３Ｈｅ（配列番号５）、Ａ２４０４２Ｈｅ（配列番号４５）、Ａ２４００５Ｈｉ（配列番号７））が７０％～５０％のノックダウン有効性を示し、対照オリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ１）は、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を低下させなかった。

実施例２：ＳＫ－ＯＶ３細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの２回目のスクリーニング
５０００個のＳＫ－ＯＶ３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、それぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドで１０μＭの最終濃度にて処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲδ（Sigma Aldrich、カタログ番号ＳＭＬ１４９１；１０ｍＭストック溶液の調製については実施例１を参照されたい）で処理した。最終濃度１μＭのＰＰＡＲδについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌのＰＰＡＲδストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。

処理開始から３日後に細胞を溶解させ、ヒトＨＰＲＴ１およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を図２に示す。実線および点線は、それぞれ６０％および０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

ＳＫ－ＯＶ３細胞におけるＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドスクリーニングの繰り返しにより、６０％超のノックダウン効率を有する３つのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０４４Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６））が得られた。

実施例３：ＨｅＬａ細胞における更なるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの１回目の単回投与有効性スクリーニング
５０００個のＨｅＬａ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、ＨｅＬａ（図１）およびＳＫ－ＯＶ３（図２）における１回目のスクリーニングからの最も効率的なＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６）、Ａ２４０４４Ｈｅ（配列番号４７））および更なるＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）、Ａ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０７５Ｈｅ（配列番号５）、Ａ２４０７３Ｈｉ（配列番号５５）、Ａ２４０６５Ｈｉ（配列番号５１）、Ａ２４０６７Ｈｉ（配列番号５２）、Ａ２４０７７Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０７４Ｈｉ（配列番号５６））で１０μＭの最終濃度にて処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲδ（Sigma Aldrich、カタログ番号ＳＭＬ１４９１；１０ｍＭストック溶液の調製については実施例１を参照されたい）で処理した。最終濃度１μＭのＰＰＡＲδについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌのＰＰＡＲδストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。

処理開始から３日後に細胞を溶解させ、ヒトＨＰＲＴ１およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を図３に示す。実線および点線は、それぞれ５０％および０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図３に示されるように、試験したＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドのうち４つ（Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６）、Ａ２４０４４Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４））がＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡの５０％超のノックダウンを示し（０．５未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）、Ｎｅｇ１陰性対照オリゴヌクレオチドでの処理は、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡレベルの低下をもたらさなかった。

実施例４：ＳＫ－ＯＶ３細胞における更なるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの２回目の単回投与有効性スクリーニング
５０００個のＳＫ－ＯＶ３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、それぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）、Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０４４Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６）、Ａ２４０７７Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０７５Ｈｅ（配列番号５）、Ａ２４０７３Ｈｉ（配列番号５５））で１０μＭの最終濃度にて処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲδ（Sigma Aldrich、カタログ番号ＳＭＬ１４９１；１０ｍＭストック溶液の調製については実施例１を参照されたい）で処理した。最終濃度１μＭのＰＰＡＲδについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌのＰＰＡＲδストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。

処理開始から３日後に細胞を溶解させ、ヒトＨＰＲＴ１およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を図４に示す。実線および点線は、それぞれ５０％および０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

ＳＫ－ＯＶ３細胞における最適化されたＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドスクリーニングの繰り返しにより、５０％超のノックダウン効率を有する５つのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）、Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０４４Ｈｅ（配列番号４７）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６））が得られた（図４）。

実施例５：選択されたヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｔｒｏＴＬＲ９アッセイ
免疫刺激リガンド、例えば細菌ＤＮＡ、または非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むもしくは含まない免疫刺激オリゴヌクレオチドの結合は、ＴＬＲ活性化をもたらす。免疫活性化が過剰なサイトカイン放出の重度の、場合によっては致死的な病態を引き起こす恐れがあることから、ヒトにおいてサイトカイン放出を予測する前臨床試験系が緊急に必要とされている。

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ９（Invivogenのカタログ番号ｈｋｂ－ｈｔｌｒ９）細胞を平底９６ウェルプレートに播種し、ＡＮＧＰＴＬ４オリゴヌクレオチドＡ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６）、Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）およびＡ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）で２４時間処理した。次いで、細胞上清を採取し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液（Invivogenのカタログ番号ｒｅｐ－ｑｂｓ）と共に４時間インキュベートした。ＳＥＡＰ活性を光学密度の測定によって決定した。５０００ｎＭＯＤＮ２００６で刺激した細胞のＯＤ単位（１００とした）に対するＯＤ単位の平均および標準偏差を図５に示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図５に示されるように、試験したＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いずれもＴＬＲ９活性化を誘導しなかった。対照的に、陽性対照のＣｐＧオリゴヌクレオチドＯＤＮ２００６（５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’ＰＴＯ修飾－ Invivogenのカタログ番号ｔｌｒｌ－２００６；配列番号１５３）は、ＮＦκＢ活性化を明らかに刺激した（図５）。

実施例６：選択されたヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ_５０決定
３００００個の初代ヒト肝細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭおよび１．６ｎＭの種々の濃度の種々のＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド：Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０２３Ｈｉ（配列番号２６）、Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）およびＡ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）で処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲγ（Sigma Aldrich、カタログ番号Ｒ２４０８）で処理した。ＰＰＡＲγストック溶液（１０ｍＭ）は、１０ｍｇのＰＰＡＲγ（分子量：３５７．４３）を２．８ｍｌのＤＭＳＯに溶解することによって調製した。最終濃度１μＭのＰＰＡＲγについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌＰＰＡＲγストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。２４時間毎に、７０μｌの上清を１μＭＰＰＡＲγおよび指定の濃度のそれぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮培地に置き換えた。処理開始から３日後に細胞を溶解させ、ＨＰＲＴ１およびＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現。グラフ表示のためにモック処理細胞を０．３２ｎＭとした。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図６および表５から、選択されたＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現をナノモル範囲のＩＣ_５０値で用量依存的に阻害することが実証される。

実施例７：初代肝細胞における付加的なヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の１回目の単回投与スクリーニング
合計でさらに４９個のＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。ヒト細胞株における２回の初期スクリーニング（データは示さない）に基づいて、１７個の有望なＡＳＯを初代ヒト肝細胞における１回目のスクリーニングに選択した（図７）。いかなるヒトまたはマウスｍＲＮＡに対しても配列相補性を有しない、異なる長さ（それぞれ１６、１７および１８ヌクレオチド）の３つの対照オリゴヌクレオチド（Ｒ０１００２、Ｒ０１０１４、Ｎｅｇ１）を陰性対照として含め、ノックダウン効率が確認された３つのＡＮＧＰＴＬ４特異的オリゴヌクレオチドを陽性対照（Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）、Ａ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７））として使用した。ヒト初代肝細胞（Lonza）を、トランスフェクション試薬を使用せずに、それぞれのオリゴヌクレオチドで５μＭの単一濃度にて３日間処理した。ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を誘導するために、細胞を同時に１μＭＰＰＡＲγ（Sigma Aldrich、カタログ番号Ｒ２４０８；１０ｍＭストック溶液の調製については実施例６を参照されたい）で処理した。最終濃度１μＭのＰＰＡＲγについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌのＰＰＡＲγストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。

処理開始から３日後に細胞を溶解させ、ｍＲＮＡレベルをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイによって決定した。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）をＡＮＧＰＴＬ４発現の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。図７に示されるように、ＰＰＡＲγ刺激は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較してＡＮＧＰＴＬ４レベルの約５０％の上昇をもたらした（ｎｏｏｌｉｇｏ）。

８つのＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯ（Ａ２４０９６Ｈｉ（配列番号１７２）、Ａ２４１０３Ｈｅ（配列番号１７９）、Ａ２４０９１Ｈｉ（配列番号１６７）、Ａ２４１２３Ｈｅ（配列番号１９７）、Ａ２４０８３Ｈｉ（配列番号１５９）、Ａ２４０８７Ｈｉ（配列番号１６３）、Ａ２４１０２Ｈｅ（配列番号１７８）、Ａ２４１１６Ｈｅ（配列番号１９２））および陽性対照ＡＳＯ（Ａ２４０２２Ｈｉ（配列番号２５）、Ａ２４０７１Ｈｉ（配列番号５４）、Ａ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７））での処理は、ＡＮＧＰＴＬ４発現を７０％超低下させた（０．３未満の残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現に相当する）。対照オリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ１、Ｒ０１００２、Ｒ０１０１４）は、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を低下させなかった。

実施例８：初代肝細胞における付加的なヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の２回目の単回投与スクリーニング
残りの新たに設計したＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯを初代肝細胞において実施例７の実験条件下で試験した（図８）。これらのＡＳＯは、その後のｉｎｖｉｔｒｏ試験において良好な耐容性を示した（データは示さない）。ノックダウン効率が確認された１つのＡＮＧＰＴＬ４特異的オリゴヌクレオチドを陽性対照として使用し（Ａ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７））、いかなるヒトまたはマウスｍＲＮＡに対しても配列相補性を有しない、異なる長さ（それぞれ１６、１７および１８ヌクレオチド）の３つの対照オリゴヌクレオチド（Ｒ０１００９、Ｒ０１０１９、Ｎｅｇ１）を陰性対照として含めた。

１０個のＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯ（Ａ２４０８３Ｈｉ（配列番号１５９）、Ａ２４０８９Ｈｉ（配列番号１６５）、Ａ２４１１７Ｈｅ（配列番号１９３）、Ａ２４１２４Ｈｅ（配列番号４６）、Ａ２４１０３Ｈｅ（配列番号１７９）、Ａ２４０９７Ｈｉ（配列番号１７３）、Ａ２４１１０Ｈｅ（配列番号１８６）、Ａ２４１２１Ｈｅ（配列番号１９５）、Ａ２４０８６Ｈｉ（配列番号１６２）、Ａ２４０８５Ｈｉ（配列番号１６１））での処理は、ＡＮＧＰＴＬ４発現を７０％超低下させ（０．３未満の残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現に相当する）、一方で、陽性対照ＡＳＯＡ２４０７６Ｈとのインキュベーションは、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を約６３％低下させた（図８）。対照オリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ１、Ｒ０１００９、Ｒ０１０１９）は、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を僅かに（６～２０％）しか低下させなかった。

実施例９：ヒトアンジオポエチン様タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）特異的ＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに応答したヒトＴｏｌｌ様受容体９（ｈＴＬＲ９）の活性化
ＴＬＲ９を活性化するヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的ＬＮＡ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ２４０７６Ｈ（配列番号４７）、Ａ２４０８３Ｈｉ（配列番号１５９）、Ａ２４０８５Ｈｉ（配列番号１６１）、Ａ２４０８６Ｈｉ（配列番号１６２）、Ａ２４０８７Ｈｉ（配列番号１６３）、Ａ２４０８９Ｈｉ（配列番号１６５）、Ａ２４０９６Ｈｉ（配列番号１７２）、Ａ２４１０２Ｈｅ（配列番号１７８）、Ａ２４１０３Ｈｅ（配列番号１７９）、Ａ２４１１０Ｈｅ（配列番号１８６）、Ａ２４１１１Ｈｅ（配列番号１８７）、Ａ２４１１３Ｈｅ（配列番号１８９）、Ａ２４１１６Ｈｅ（配列番号１９２）およびＡ２４１２３Ｈｅ（配列番号１９７）の可能性を試験した。実験を１回（Ａ２４０７６Ｈ、Ａ２４０９６Ｈ、Ａ２４１０２Ｈｅ、Ａ２４１１３Ｈｅ、Ａ２４１１６ＨｅおよびＡ２４１２３Ｈｅ）または２回（他の全てのＡＳＯ）、ＴＬＲ９レポーター細胞株であるＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ９細胞（Invivogenのカタログ番号ｈｋｂ－ｈｔｌｒ９）において実施例５の実験条件下で行った。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄに示されるように、異なる濃度のそれぞれのヒトＡＮＧＰＴＬ４ＡＳＯでの細胞の処理後にＮＦ－κＢの用量依存的な活性化は観察されなかった。対照的に、ＮＦ－κＢは、陽性対照ＯＤＮ２００６（５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’ＰＴＯ修飾－ Invivogenのカタログ番号ｔｌｒｌ－２００６；配列番号１５３）での処理後に用量依存的に活性化された。

実施例１０：選択されたヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のＩＣ_５０決定
初代肝細胞（図７および８）におけるノックダウン効率に基づいて、最も強力なノックダウン有効性を有し、トランスフェクション後にカスパーゼ３／７の誘導を示さない（データは示さない）ＡＳＯをＩＣ_５０値の決定のために選択した。陽性対照として、ノックダウン効率が確認されたＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯＡ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）を使用した。

初代ヒト肝細胞（Primacyt）を、異なる濃度のＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯまたは陰性対照オリゴヌクレオチドＮｅｇ１、Ｒ０１００９およびＲ０１０１９で３日間処理した。同時に、細胞をＰＰＡＲγ（１μＭ）（Sigma Aldrich、カタログ番号Ｒ２４０８；１０ｍＭストック溶液の調製については実施例６を参照されたい）で処理し、ＡＮＧＰＴＬ４発現を誘導した。最終濃度１μＭのＰＰＡＲγについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌのＰＰＡＲγストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。３日後に、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘＲＮＡアッセイを用いてｍＲＮＡ発現を分析した。

表６および図１０から、８つのＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯ（Ａ２４０８３Ｈｉ（配列番号１５９）、Ａ２４０８５Ｈｉ（配列番号１６１）、Ａ２４０８７Ｈｉ（配列番号１６３）、Ａ２４０８９Ｈｉ（配列番号１６５）、Ａ２４０９７Ｈｉ（配列番号１７３）、Ａ２４１０３Ｈｅ（配列番号１７９）、Ａ２４１１０Ｈｅ（配列番号１８６）およびＡ２４１１１Ｈｅ（配列番号１８７））および陽性対照Ａ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）がＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現をナノモル範囲のＩＣ_５０値で用量依存的に阻害することが実証される。ＡＳＯＡ２４０８６Ｈｉ（配列番号１６２）での処理は、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現の用量依存的な低下をもたらさなかった（Ｒ^２＝０．５）。したがって、データは含めなかった。

以下の表６には、初代ヒト肝細胞において決定された選択ヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ_５０値およびＲ^２を示す。^＊は、Ｒ^２が０．８５未満でる。

実施例１１：カニクイザル肝細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的オリゴヌクレオチドのｉｎｖｉｔｒｏ有効性
ｉｎｖｉｖｏで耐容性を示すヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ２４０７６Ｈ（配列番号４７）、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４配列に対して１つのミスマッチのみを有する３つの更なるヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯ（表７）を初代カニクイザル肝細胞において試験した（図１１）。試験した全てのＡＳＯでヒト細胞株および初代肝細胞においてノックダウン効率が確認されることが示された。いかなるヒトまたはマウスＲＮＡに対しても配列相補性を有しない、異なる長さ（それぞれ１６および１７ヌクレオチド）の２つの対照オリゴヌクレオチド（Ｒ０１００９、Ｒ０１０１９）を陰性対照として含めた。

表７に、ｉｎｖｉｔｒｏでカスパーゼ３／７誘導を引き起こさない、ヒト細胞におけるノックダウン効率が証明されたヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯを示す。カニクイザル（Ｍｆａ、マカク・ファシクラリス（macaca fascicularis））ＡＮＧＰＴＬ４配列との交差反応性（ＣｒｏｓｓＲｅａｃｔ）およびミスマッチの数、ならびにｉｎｖｉｔｒｏでの初代カニクイザル肝細胞における活性（図１１）を示す：

初代カニクイザル肝細胞（Primacyt）に、異なる濃度のＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯまたは陰性対照オリゴヌクレオチドＲ０１００９およびＲ０１０１９を３日間トランスフェクトした。同時に、細胞をＰＰＡＲδ（１μＭ）（Sigma Aldrich、カタログ番号Ｒ２４０８；１０ｍＭストック溶液の調製については実施例６を参照されたい）で処理し、ＡＮＧＰＴＬ４発現を誘導した。最終濃度１μＭのＰＰＡＲγについては、９６ウェルプレートに播種した細胞を、０．０１μｌのＰＰＡＲγストック溶液を添加した１００μｌの培地と共にインキュベートした。陰性対照として、細胞を同容量のＤＭＳＯで処理した。３日後に、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘＲＮＡアッセイを用いてｍＲＮＡ発現を分析した。

図１１に示されるように、ＰＰＡＲδでの処理は、約８倍のＡＮＧＰＴＬ４発現を誘導した（図１１、ＤＭＳＯ対照）。カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４配列と完全に交差反応性であるＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯＡ２４０７６Ｈｅ（配列番号４７）での処理は、ＡＮＧＰＴＬ４の７０％超のノックダウンをもたらした（０．３の残存ｍＲＮＡ発現に相当する）。また、カニクイザル配列と１つのミスマッチを有するヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的オリゴヌクレオチド（Ａ２４０８９Ｈｉ（配列番号１６５）、Ａ２４１１０Ｈｅ（配列番号１８６）、Ａ２４１１１Ｈｅ（配列番号１８７））は、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡを最大で５１％低下させた（０．４９の残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現に相当する）。陰性対照オリゴヌクレオチドＲ０１００９は、初代カニクイザル肝細胞においてＡｎｇｐｔｌ４発現を低下させず、一方で、対照オリゴヌクレオチドＲ０１０１９は、２ｎＭの濃度を用いた場合に、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を約２５％と僅かにしか低下させなかった（０．７５の残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現に相当する）。

実施例１１に基づく結論：
まとめると、ｉｎｖｉｔｒｏ実験により、カニクイザルにおけるＡＳＯベースのＡＮＧＰＴＬ４標的治療薬の試験に適した極めて強力なヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯが特定された。かかる薬物は、例えば脂質異常症患者の全身治療に、リポタンパク質リパーゼＬのＡＮＧＰＴＬ４媒介性阻害を低減し、細胞脂質過負荷、肥満、ＩＩ型糖尿病および心血管疾患を予防するために使用される。

実施例１２：３Ｔ３細胞におけるマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの１回目の単回投与スクリーニング
４５００個の３Ｔ３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、図１２に示されるＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドで１０μＭの最終濃度にて処理した。細胞を溶解させ、マウスＨｐｒｔ１およびマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１００とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」）に対する残存ＡＮＧＰＬＴ４－ｍＲＮＡ発現を図１２に示す。実線および点線は、それぞれ５０％および０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図１２に示されるように、８つのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちＡ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０１７Ｍ（配列番号７６）、Ａ２４０２１Ｍ（配列番号８０）、Ａ２４０４９Ｍ（配列番号１０８）、Ａ２４０１８Ｍ（配列番号７７）、Ａ２４０４１Ｍ（配列番号１００）およびＡ２４０１０Ｍ（配列番号６９）が正規化ＡＮＧＰＴＬ４発現を５０％超低下させ、対照オリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ１）は、ＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現を低下させなかった（図１２）。

実施例１３：Ｒｅｎｃａ細胞におけるマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの２回目の単回投与有効性スクリーニング
５０００個のＲｅｎｃａ細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、図１３に示されるＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドで１０μＭの最終濃度にて処理した。処理開始から３日後に細胞を溶解させ、マウスＨｐｒｔ１およびマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ５０％および０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図１３に示されるように、２つのＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちＡ２４０２０Ｍ（配列番号７９）およびＡ２４０１９Ｍ（配列番号７８）での処理は、５０％超のＡＮＧＰＴＬ４ノックダウンをもたらした（０．５未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）（図１３）。

実施例１４：４Ｔ１細胞における更なるマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの試験
２５００個の４Ｔ１細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、図１４に示されるＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）で５μＭの最終濃度にて処理した。３日後に、細胞上清を、ＡＳＯを含む新鮮培地に交換した。処理開始から６日後に細胞を溶解させ、マウスＧａｐｄｈおよびマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｇａｐｄｈの発現に対して正規化した。Ｎｅｇ１処理細胞（１とした）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ８０％および０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図１４に示されるように、試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち１２個、すなわちＡ２４０１７Ｍ（配列番号７６）、Ａ２４０７０Ｍ（配列番号１２７）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０１９Ｍ（配列番号７８）、Ａ２４０６９Ｍ（配列番号１２６）、Ａ２４０２１Ｍ（配列番号８０）、Ａ２４０１１Ｍ（配列番号７０）、Ａ２４０７３Ｍ（配列番号１３０）、Ａ２４０１８Ｍ（配列番号７７）、Ａ２４０５５Ｍ（配列番号１１４）、Ａ２４０１０Ｍ（配列番号６９）およびＡ２４０６５Ｍ（配列番号７９）がＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡの８０％超のノックダウンを示す（０．２未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）。

実施例１５：４Ｔ１細胞におけるイントロン標的化マウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの単回投与有効性スクリーニング
２５００個の４Ｔ１細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、図１５に示されるＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）で５μＭの最終濃度にて処理した。処理開始から３日後に、細胞上清を、ＡＳＯを含む新鮮培地に交換し、細胞をさらに３日間インキュベートした。次いで、細胞を溶解させ、マウスＨｐｒｔ１およびマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」対照）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。実線および点線は、それぞれ５０％および０％のノックダウン有効性を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図１５に示されるように、試験したＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチドのうち６つ、すなわちＡ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０９５Ｍｉ（配列番号１５１）、Ａ２４０９３Ｍｉ（配列番号１４９）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０９０Ｍｉ（配列番号１４６）およびＡ２４０８２Ｍｉ（配列番号１３９）がＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡの５０％超のノックダウンを示す（０．５未満の残存ｍＲＮＡレベルに相当する）。

実施例１６：選択したマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ_５０決定
２５００個の４Ｔ１細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、それぞれのＡＮＧＰＴＬ４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）Ａ２４０１８Ｍ（配列番号７７）、Ａ２４０１９Ｍ（配列番号７８）、Ａ２４０２０Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０２１Ｍ（配列番号８０）、Ａ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０５４Ｍ（配列番号１１３）、Ａ２４０６５Ｍ（配列番号７９）、Ａ２４０７０Ｍ（配列番号１２７）、Ａ２４０７２Ｍ（配列番号１２９）、Ａ２４０８２Ｍ（配列番号１３９）およびＡ２４０９５Ｍｉ（配列番号１５１）で５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭおよび１．６ｎＭの種々の濃度にて処理した。処理開始から３日後に、細胞上清を、ＡＳＯを含む新鮮培地に交換し、細胞をさらに３日間インキュベートした。次いで、細胞を溶解させ、マウスＨｐｒｔ１およびマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＲＮＡ発現を、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイを用いて測定した。ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現値をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ１の発現に対して正規化した。モック処理細胞（１とした「ｎｏｏｌｉｇｏ」対照）に対する残存ＡＮＧＰＴＬ４－ｍＲＮＡ発現を示す。データは三連ウェルの平均±ＳＤとして表す。

図１６および表８から、選択されたＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡ発現をナノモル範囲のＩＣ_５０値で用量依存的に阻害することが実証される。

実施例１７：４Ｔ１細胞における付加的なマウスＡｎｇｐｔｌ４特異的ＡＳＯの１回目の単回投与スクリーニング
マウスＡｎｇｐｔｌ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。初期スクリーニングでは、Ａｎｇｐｔｌ４ｍＲＮＡを標的とする５３個のＡＳＯを試験した。いかなるヒトまたはマウスｍＲＮＡに対しても配列相補性を有しない、異なる長さ（それぞれ１６、１７および１８ヌクレオチド）の３つの対照オリゴヌクレオチド（Ｒ０１００２、Ｒ０１０１４、Ｎｅｇ１）を陰性対照として含め、ノックダウン効率が確認された３つのＡＮＧＰＴＬ４特異的オリゴヌクレオチド（Ａ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０７２Ｍ（配列番号１２９）、Ａ２４０９５Ｍｉ（配列番号１５１））を陽性対照として使用した。マウス乳癌細胞（４Ｔ１細胞）を、それぞれのオリゴヌクレオチドで５μＭの単一濃度にて処理した。３日後に、細胞上清を５μＭのそれぞれのＡＳＯを含有する新鮮培地に交換し、さらに３日間インキュベートした。その後、細胞を溶解させ、ｍＲＮＡレベルをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＲＮＡＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイによって決定した。Ｈｐｒｔ１をＡｎｇｐｔｌ４発現の正規化のためにハウスキーピング遺伝子として使用した。

図１７に示されるように、１５個のＡＳＯ（Ａ２４１４６Ｍｉ（配列番号２４７）、Ａ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４１２６Ｍｉ（配列番号２２７）、Ａ２４１２０Ｍｉ（配列番号２２１）、Ａ２４１０４Ｍ（配列番号２０７）、Ａ２４１０８Ｍ（配列番号２１１）、Ａ２４１１０Ｍ（配列番号２１３）、Ａ２４１３９Ｍｉ（配列番号２４０）、Ａ２４１０３Ｍ（配列番号２０６）、Ａ２４１１２Ｍ（配列番号１０７）、Ａ２４１２２ＨＭｅ（配列番号１９６）、Ａ２４１１３Ｍ（配列番号１０８）、Ａ２４１２５Ｍｉ（配列番号２２６）、Ａ２４０９９Ｍ（配列番号２０２）、Ａ２４０９５Ｍｉ（配列番号１５１））がＡｎｇｐｔｌ４発現を７５％超低下させ（０．２５未満の残存Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現に相当する）、対照オリゴヌクレオチド（Ｎｅｇ１、Ｒ０１００２、Ｒ０１０１４）は、Ａｎｇｐｔｌ４ｍＲＮＡ発現を５０％未満しか低下させなかった（０．５超の残存Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現に相当する）（図１７）。

実施例１８：Ｒｅｎｃａ細胞におけるマウスＡｎｇｐｔｌ４特異的ＡＳＯの２回目の単回投与スクリーニング
異なる細胞株における更なる確認のために、実施例１７と同じ処理をマウスＲｅｎｃａ細胞に適用した。これにより、１９個のＡｎｇｐｔｌ４特異的ＡＳＯ（Ａ２４１４３Ｍｉ（配列番号２４４）、Ａ２４０４７Ｍ（配列番号１０６）、Ａ２４０９５Ｍｉ（配列番号１５１）、Ａ２４１２５Ｍｉ（配列番号２２６）、Ａ２４１１０Ｍ（配列番号２１３）、Ａ２４１４８Ｍｉ（配列番号１５１）、Ａ２４１２０Ｍｉ（配列番号２２１）、Ａ２４１０４Ｍ（配列番号２０７）、Ａ２４１０９Ｍ（配列番号２１２）、Ａ２４１３９Ｍｉ（配列番号２４０）、Ａ２４１０３Ｍ（配列番号２０６）、Ａ２４１２２ＨＭｅ（配列番号１９６）、Ａ２４１３１Ｍｉ（配列番号２３２）、Ａ２４１３８Ｍｉ（配列番号２３９）、Ａ２４１２３Ｍｉ（配列番号２２４）、Ａ２４１４６Ｍｉ（配列番号２４７）、Ａ２４１１７Ｍｉ（配列番号２１８）、Ａ２４１３０Ｍｉ（配列番号２３１）、Ａ２４１４４Ｍｉ（配列番号２４５））での処理が７５％超のＡｎｇｐｔｌ４ノックダウンをもたらした（０．２５未満の残存Ａｎｇｐｔｌ４－ｍＲＮＡ発現に相当する）（図１８）。

実施例１９：選択されたマウスＡＮＧＰＴＬ４特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのＩＣ_５０決定
４Ｔ１およびＲｅｎｃａ細胞におけるノックダウン効率の結果（図１７、１８）に基づいて、Ｒｅｎｃａおよび４Ｔ１細胞において最も強力なノックダウン有効性を有する９つのＡＳＯ（Ａ２４１０３Ｍ（配列番号２０６）、Ａ２４１１０Ｍ（配列番号２１３）、Ａ２４１２２ＨＭｅ（配列番号１９６）、Ａ２４１２０Ｍｉ（配列番号２２１）、Ａ２４１２５Ｍｉ（配列番号２２６）、Ａ２４１３９Ｍｉ（配列番号２４０）、Ａ２４１４３Ｍｉ（配列番号２４４）、Ａ２４１４６Ｍｉ（配列番号２４７）、Ａ２４１４８Ｍｉ（配列番号１５１））を半数阻害濃度（ＩＣ_５０）値の決定のために選択した。

初代マウス肝細胞を異なる濃度のそれぞれのＡＳＯで３日間処理した。３日後に、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＳｉｎｇｌｅｐｌｅｘＲＮＡアッセイを用いてｍＲＮＡ発現を分析した。図１９および表９から、選択されたＡｎｇｐｔｌ４特異的ＡＳＯがＡｎｇｐｔｌ４ｍＲＮＡ発現をナノモル範囲のＩＣ_５０値で用量依存的に阻害することが実証される。

表９に、初代ヒト肝細胞において決定された選択Ａｎｇｐｔｌ４特異的ＡＳＯのＩＣ_５０値を示す。^＊は、Ｒ^２０．８５未満である；Ｈｐｒｔ１レベルの用量依存的な低下をもたらすカスパーゼ３／７を誘導する可能性が増大したＡＳＯ：

実施例７～１１および１７～１９に基づく結論：
ヒトＡＮＧＰＴＬ４に対して特異性を有する４７個の一連の更なるＡＳＯを試験して、初代肝細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ４の発現をｍＲＮＡレベルで強く低下させる幾つかのＡＳＯを選択した。試験したＡＳＯのうち１６個での処理が、初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ４ｍＲＮＡの７０％超のノックダウンを示した。これにより、最も強力な候補のＩＣ_５０値は低ナノモル範囲であった。

マウスモデルにおいてｉｎｖｉｖｏ実験を行うために、マウスＡｎｇｐｔｌ４に対して特異性を有するＡＳＯを設計し、上首尾の候補ＡＳＯをｉｎｖｉｔｒｏでマウスＡｎｇｐｔｌ４発現を強くノックダウンするｉｎｖｉｖｏ研究に選択した。

まとめると、包括的な一連のｉｎｖｉｔｒｏ実験を行うことで、ＡＳＯベースのＡＮＧＰＴＬ４標的治療薬の開発に適した極めて強力なヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的ＡＳＯが特定された。

Claims

１２～２２個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドからなるＡＮＧＰＴＬ４阻害剤であって、前記ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾され、前記オリゴヌクレオチドが配列番号１のＡＮＧＰＴＬ４（ヒト）、配列番号２のＡＮＧＰＴＬ４（ヒト）、配列番号５８のＡＮＧＰＴＬ４（マウス）および／または配列番号５９のＡＮＧＰＴＬ４（マウス）の核酸配列とハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドがＡＮＧＰＴＬ４の発現を阻害する、ＡＮＧＰＴＬ４阻害剤。
ハイブリダイズ活性部位が、配列番号１の１７３２位～１７５９位、２３４位～２６１位、１２６４位～１２９３位および／もしくは配列番号２の２８００位～２８７２位、３４１５位～３４４２位、４９６８位～４９９４位、またはそれらの組合せから選択される、請求項１記載の阻害剤。
修飾された前記ヌクレオチドがＬＮＡ、ｃＥＴ、ＥＮＡ、２’フルオロ修飾ヌクレオチド、２’Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチドおよびそれらの組合せ等の架橋型核酸からなる群から選択される、請求項１または２記載の阻害剤。
配列番号４７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１７３、配列番号１７９、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６およびそれらの組合せからなる群から選択される配列を含む配列番号１のＡＮＧＰＴＬ４、配列番号２のＡＮＧＰＴＬ４、配列番号５８のＡＮＧＰＴＬ４および／または配列番号５９のＡＮＧＰＴＬ４とハイブリダイズする、請求項１から３までのいずれか１項記載の阻害剤。
前記オリゴヌクレオチドが、＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ（配列番号４７）、＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ（配列番号４７）、＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ（配列番号４７）、＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ（配列番号１５９）、＋Ａ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ（配列番号１６１）、＋Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ（配列番号１６３）、＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ（配列番号１６５）、＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号１７３）、＋Ｔ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ（配列番号１７９）、＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｇ（配列番号１８６）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ（配列番号１８７）、＋Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号３）、＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ（配列番号４）、＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ（配列番号５）、＋Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ（配列番号６）、＋Ｇ^＊Ｃ^＊＋Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ（配列番号７）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号８）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ｃ（配列番号９）、＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ（配列番号１０）、＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ａ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ（配列番号１１）、＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ（配列番号１２）、＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊＋Ｃ^＊Ａ^＊＋Ｔ（配列番号１３）、＋Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊＋Ａ^＊Ｇ^＊＋Ｇ（配列番号１４）、＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ（配列番号１５）、＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ（配列番号１６）、＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｔ（配列番号１７）、＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ（配列番号１８）、＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ（配列番号１９）、＋Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｇ（配列番号２０）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ａ（配列番号２１）、＋Ｇ^＊Ｃ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ｃ（配列番号２３）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ａ（配列番号２４）、＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ（配列番号２５）、
＋Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ（配列番号２６）、＋Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ（配列番号２７）、＋Ｃ^＊Ａ^＊＋Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ（配列番号２８）、＋Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ（配列番号２９）、＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ（配列番号３０）、＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ（配列番号３１）、＋Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号３２）、＋Ａ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号３３）、＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号３４）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ（配列番号３５）、＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ（配列番号３６）、＋Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ（配列番号３７）、＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ（配列番号３８）、＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ（配列番号３９）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ（配列番号４０）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ（配列番号４１）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ（配列番号４２）、＋Ａ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ（配列番号４３）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊＋Ｔ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ（配列番号４４）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｔ^＊＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ（配列番号４５）、＋Ａ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号４６）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊＋Ｇ（配列番号４８）、＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ａ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ（配列番号４９）、＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ（配列番号５０）、＋Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｃ^＊Ａ^＊Ｃ^＊０^＊０^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ａ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｇ（配列番号５１）、＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ（配列番号４）、＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊０^＊Ａ^＊Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ（配列番号５２）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ｃ（配列番号８）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ（配列番号５３）、＋Ｇ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊＋Ａ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ（配列番号５３）、＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ（配列番号５４）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ（配列番号５５）、＋Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊＋Ｃ^＊＋Ａ（配列番号５５）、＋Ｇ^＊＋Ｇ^＊＋Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊＋Ｃ^＊＋Ｇ^＊＋Ｃ（配列番号５６）、＋Ｃ^＊＋Ｔ^＊＋Ｇ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｇ^＊Ａ^＊Ａ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊＋Ａ^＊＋Ｔ^＊＋Ｃ（配列番号５）およびそれらの組合せからなる群から選択され、ここで、＋はＬＮＡヌクレオチドを示し、^＊はヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＴＯ）結合を示す、請求項１から４までのいずれか１項記載の阻害剤。
前記阻害剤が、ＡＮＧＰＴＬ４の発現をナノモル濃度またはマイクロモル濃度で阻害する、請求項１から５までのいずれか１項記載の阻害剤。
請求項１から６までのいずれか１項記載の阻害剤と薬学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤またはそれらの組合せとを含む医薬組成物。
ＡＮＧＰＴＬ４不均衡が関与する障害を予防および／または治療する方法への使用のための、請求項１から６までのいずれか１項記載の阻害剤または請求項７記載の医薬組成物。
前記障害が心血管代謝疾患、肥満、２型糖尿病等の糖尿病、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）、脂質異常症、膵炎、メタボリックシンドローム、家族性高カイロミクロン血症症候群（ＦＣＳ）、インフルエンザ感染および／または癌である、請求項８記載の使用のための阻害剤または医薬組成物。
前記高コレステロール血症が、ホモ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）またはヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）である、請求項８または９記載の使用のための阻害剤または医薬組成物。
前記癌が乳癌、肺癌、悪性黒色腫、リンパ腫、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、脳癌、喉頭、胆嚢、膵臓、精巣、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、脂肪肉腫、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、島細胞腫、原発性脳腫瘍、髄膜腫、急性および慢性のリンパ球性および顆粒球性腫瘍、急性および慢性の骨髄性白血病、有毛細胞腫、腺腫、過形成、髄様癌、腸管神経節腫、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫、子宮頸部異形成、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫、真性多血症、腺癌、退形成性星細胞腫、多形膠芽腫、白血病または類表皮癌である、請求項８から１０までのいずれか１項記載の使用のための阻害剤または医薬組成物。
前記阻害剤または前記組成物が、局所的または全身的に投与するのに適している、請求項８から１１までのいずれか１項記載の使用のための阻害剤または医薬組成物。
組成物が１回または繰り返して投与するのに適している、請求項８から１２までのいずれか１項記載の使用のための阻害剤または医薬組成物。