CN115176008A - 用于抑制FoxP3表达的修饰反义寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含12至25个核苷酸的寡核苷酸，其中核苷酸中的至少一个包含从桥接核酸如LNA、ENA、2'氟修饰的核苷酸、2O‑甲基修饰的核苷酸、2O‑甲氧基修饰的核苷酸、FANA以及它们的组合中选择的修饰。寡核苷酸与SEQ ID NO.1的和/或SEQ ID NO.2的Foxp3杂交，使得FoxP3mRNA、FoxP3前‑mRNA或它们的组合的表达降低。本发明还涉及一种包含本发明的寡核苷酸的药物组合物，并且分别涉及在预防和/或治疗涉及FoxP3失衡的病症的方法中使用的寡核苷酸和药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于抑制FoxP3表达的寡核苷酸，如与FoxP3的核酸序列杂交的反义寡核苷酸，以及一种包含此种反义寡核苷酸的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸和药物组合物分别用于预防和/或治疗其中涉及FoxP3失衡的病症的方法中。
背景技术
FoxP3(叉头框P3)，也称为scurfin，是一种参与免疫系统反应的蛋白质。它是FOX蛋白家族的成员。FOX蛋白属于转录调节剂的叉头/翼螺旋家族。FoxP3在调节性T细胞(Treg)的发育和功能中作为调节途径的主要调节剂发挥作用。Treg通常会降低免疫反应。在癌症中，Treg功能可以防止免疫系统破坏癌细胞。在传染病中，Treg功能可以防止免疫系统对抗疾病，并且在疫苗接种方法中，Treg活性可以防止成功诱导疫苗诱导的免疫反应。
Foxp3是天然Treg(nTreg，T细胞谱系)和适应性/诱导的Treg(a/iTreg)的特异性标志物，也可通过其他特异性较低的标志物如CD25或CD45RB进行识别。FoxP3是调节不同基因的Treg特异性转录因子。一方面，FoxP3抑制促炎基因如白介素-2(IL2)和/或干扰素γ(IFNγ)的表达，另一方面，FoxP3诱导如CD25、Ctla4、Tnfrsf18等基因的表达，这些基因有助于Treg的抑制活性(Xie X.et al.,Plos Genetics,2015)。Treg在抑制肿瘤微环境中的免疫反应中起重要作用(Tanaka A.et al.,Cell Research,2017)。随着促炎基因的抑制以及抑制基因的诱导减少，Treg抑制抗肿瘤反应的能力通过FoxP3表达的减少/抑制而降低。
FoxP3是一种在Treg的细胞核内起作用的转录因子。因此，反义寡核苷酸(ASO)是靶向FoxP3的理想方式，因为抗体不能结合细胞内靶标，并且小分子在阻止转录因子活性方面无效。因此，安全且有效抑制转录因子FoxP3的功能的药剂代表了一种有前景的策略，该策略用于治疗患有受大量免疫抑制性Treg影响的疾病或病情的患者。
Treg是肿瘤微环境中免疫抑制性免疫细胞的一种主要亚型。它们占肿瘤中CD4+ T细胞的10-50％，与此相比，它们在未患癌症的个体外周血中占CD4+ T细胞的2-5％。Treg浸润到肿瘤中与患有不同类型癌症(例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和胃癌)的患者的不良预后有关(Togashi Y et al,Nat Rev Clin Oncol,2019)。Treg抑制效应T细胞识别和消除肿瘤细胞的功能。锁核酸(LNA)修饰的ASO抑制FoxP3的表达并因此削弱Treg的免疫抑制功能，其代表了产生能够消除肿瘤细胞的高功能效应T细胞的有前景的可能性。
据报道，具有免疫抑制能力的Treg数量增加也可用于慢性病毒感染，例如慢性乙型和丙型肝炎病毒感染(Jung MK et al,Immune Netw,2016)。Treg也因此促进了肝炎相关肝病如肝细胞癌的进展(Li W et al,Chronic Dis Transl Med,2016)。因此，Treg代表了一种治疗例如患有慢性乙型肝炎病毒感染的患者的潜在靶标(Yang J et al,Cell MolImmunol,2017)。对于例如人类免疫缺陷病毒(HIV)(Kleinman AJ et al,Front Immunol,2018)、巨细胞病毒(CMV)(Aandahl EM et al,J Virol,2004)、单纯疱疹病毒和呼吸道合胞病毒感染(Veiga-Parga T et al,Immunol Rev,2013)，也描述了Treg的有害作用。因此，Treg降低了保护性T细胞反应的幅度，对由效应细胞产生的抗病毒细胞因子生产表现出抑制作用，并且对保护性T细胞向感染部位的细胞运输表现出抑制作用(Veiga-Parga T et al,Immunol Rev,2013)。
通过与FoxP3特异性ASO组合可以增强治疗性疫苗接种的功效，因为T效应物/Treg平衡可以向效应物移动以改善例如对治疗性HIV-1疫苗(Hubert A et al,Hum VaccinImmunother,2018)、许多癌症例如转移性乳腺癌(Reach AJ et al,Sci Trans Med,2012)、慢性逆转录病毒感染(Knuschke T et al.,Retrovirology,2016)、慢性HBV感染或持续性幽门螺杆菌感染的疫苗特异性免疫反应。
到目前为止，已经制备了cET和FANA修饰的反义寡核苷酸和CD25抗体，但是，它们的活性似乎可以提高。因此，需要在抑制FoxP3表达方面具有改善活性的化合物，例如寡核苷酸，如反义寡核苷酸。从文献中可知，例如cET修饰的反义寡核苷酸需要以每周80mg/kg体内施用超过三周以实现约50％的靶敲低(DOI:10.1126/scitranslmed.aal5253)或以每周250mg/kg体内施用超过三周以实现约50％的靶敲低(doi:10.1126/scitranslmed.aac5272)。
因此，已经研究了与现有技术的化合物相比，FoxP3 ASO在靶敲低方面具有更高的活性，从而在较低剂量的化合物下导致有效的靶敲低，并且优选在较早的时间点导致靶敲低。减少的剂量抑制了例如类别特异性毒性的出现。此外或替代地，使用FoxP3特异性反义寡核苷酸代替抗-CD25抗体避免了在给药期间激活的CD25-表达T细胞的耗尽。
本发明的寡核苷酸如反义寡核苷酸提供了对这个问题的解决方案，其非常高效且有效地抑制FoxP3的表达。
本发明的反义寡核苷酸在抑制FoxP3的表达方面非常成功。反义寡核苷酸的作用方式不同于抗体或小分子的作用方式，并且反义寡核苷酸在例如以下方面非常有利：
(i)渗透实体瘤中的肿瘤组织，
(ii)分别阻断靶的多种功能、活动和下游效应，
(iii)反义寡核苷酸彼此或与抗体或与小分子的组合，和
(iv)抑制抗体无法到达或通过小分子不可抑制的细胞内效应。
发明内容
本发明涉及一种包含12至25个核苷酸的寡核苷酸，其中核苷酸中的至少一个包含从如LNA、ENA、2'氟修饰的核苷酸、2O-甲基修饰的核苷酸、2O-甲氧基修饰的核苷酸、FANA以及它们的组合等桥接核酸中选择的修饰，并且寡核苷酸与SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2的Foxp3的核酸序列杂交，与未处理的对照相比，这使得在首次施用所述寡核苷酸后的6至240小时内或12至120小时内FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合减少40％至99％。
在首次施用所述寡核苷酸后的24至72小时内，本发明的寡核苷酸将例如FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合减少40％至99％。
本发明的寡核苷酸例如与SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2的Foxp3杂交，其中寡核苷酸例如选自SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.322中的一个，例如在SEQ ID NO.2的位置1510至2109的区域内杂交。寡核苷酸例如在SEQ ID NO.2的位置1510至2109的区域内杂交。寡核苷酸例如在纳摩尔或微摩尔浓度下抑制FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合的表达。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸和药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或它们的组合。药物组合物进一步任选地包含抗肿瘤活性剂如化疗剂(例如铂、吉西他滨)，免疫刺激剂，疾病特异性药剂或者逆转肿瘤或感染介导的免疫抑制的药剂，另一种寡核苷酸，抗体，碳水化合物修饰的抗体，基于肽的治疗剂，基于蛋白质的治疗剂，治疗性疫苗，HERA融合蛋白，配体诱捕剂，Fab片段，纳米抗体，BiTe，DARPin，小分子或它们的组合。由药物组合物包含的抗肿瘤活性剂、疾病特异性药剂、其他寡核苷酸、抗体、碳水化合物修饰的抗体、基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe、DARPin和/或小分子抑制例如从IDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-β、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、MTDH、Xbp1、Chop以及它们的组合中选择的免疫抑制因子的表达或活性，或者刺激从4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27、2B4以及它们的组合中选择的免疫刺激因子的表达或活性。
由药物组合物包含的疾病特异性药剂、其他寡核苷酸、抗体、碳水化合物修饰的抗体、基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe、DARPin和/或小分子抑制例如参与癌症进展和/或转移的因子的表达或活性，所述因子选自SND1、HER-2、BRAF、KRAS、VEGF、EGFR1、EGFR2、BCR/ABL、ABL、MET、ALK、JAK2、BTK、miR-223、CCL18、CCL20、Lcn2、CCL5/CCR9、DDR2、PHD2、IL6、SDF-1/CXCL12以及它们的组合。
本发明的寡核苷酸和/或药物组合物例如用于一种预防和/或治疗涉及FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合的失衡的病症的方法中。病症例如是恶性和/或良性肿瘤、慢性传染病、由感染引起的慢性炎性疾病或它们的组合。
恶性肿瘤例如选自乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、睾丸癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、网状细胞肉瘤、脂肪肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、脑膜瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、急性和慢性髓细胞性白血病、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、肠神经节神经瘤、威尔姆瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、宫颈发育不良、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病变、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、白血病、表皮样癌以及它们的组合。
慢性传染病例如选自乙型和/或丙型肝炎病毒、人体免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染或它们的组合。由感染引起的慢性炎性疾病例如选自肝脏的慢性炎性疾病，如肝纤维化、肝硬化或它们的组合。
本发明的寡核苷酸和/或药物组合物例如适合于局部或全身给药。
本发明的寡核苷酸例如是反义寡核苷酸。
本文引用的或参考的所有文献(“本文引用的文献”)和本文引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何制造商的说明、描述、产品规格和任何产品的产品表，在此通过引用并入本文，并且可用于实施本发明。更具体地，所有参考的文献都通过引用并入，就如同每个单独的文献被具体且单独地指出通过引用并入。
附图说明
图1A和图1B描绘了供体1(图1A)和供体2(图1B)的CD4+ T细胞中人类FoxP3特异性反义寡核苷酸(ASO)的第一轮筛选。在不添加转染试剂的情况下，用浓度为5μM的本发明的人类Foxp3特异性反义寡核苷酸将CD4+ T细胞处理三天。使用QuantiGene Singleplex测定(ThermoFisher)分析了FoxP3和HPRT1 mRNA表达，并将FoxP3表达值标归一化为HPRT1值。
图2A和图2B显示了供体1(图2A)和供体2(图2B)的CD4+ T细胞中人类FoxP3特异性ASO的第二轮筛选。使用来自第一轮筛选的所有测试的ASO以及来自第二轮筛选的A25073H(SEQ ID NO.58)、A25069H(SEQ ID NO.56)和A25076H(SEQ ID NO.26)进行治疗，产生了>50％的靶抑制(图2A)。来自第一轮筛选的所有测试的ASO以及来自第二轮筛选的A25085HMI(SEQ ID NO.66)、A25092HI(SEQ ID NO.73)和A25076H(SEQ ID NO.26)产生了>40％的靶抑制(图2B)。
图3显示了3、7和9天后，调节性T细胞中选定的FoxP3 ASO对FoxP3mRNA的剂量依赖性敲低。使用6μM、1.5μM、375nM、94nM、24nM、6nM和1.5nM浓度下的本发明的人类反义寡核苷酸将Treg处理了3、7或9天。
图4A至图4C描述了天然Treg中FoxP3敲低对其抑制能力的影响，显示为Treg抑制测定的上清液中Tresp(图4A)、IFN-γ(图4B)和IL-2(图4C)浓度的抑制百分比。
图5A和图5B显示了供体小鼠1(图5A)和供体小鼠2(图5B)的CD4+ T细胞中小鼠FoxP3特异性ASO的靶敲低功效筛选。在不添加转染试剂的情况下，用本发明的小鼠FoxP3反义寡核苷酸在5μM浓度下将CD4+ T细胞处理了3天。使用QuantiGene Singleplex测定(ThermoFisher)分析了FoxP3和HPRT1 mRNA表达，并且将FoxP3表达值归一化为HPRT1值。
图6描绘了CD4+ T细胞中选定的FoxP3 ASO对FoxP3 mRNA的剂量依赖性敲低。使用在6μM、2μM、600nM、200nM、60nM、20nM、6nM、2nM浓度下的本发明的小鼠ASO将CD4+ T细胞处理了3天。
图7A和图7B描绘了小鼠天然Treg中FoxP3敲低对其抑制能力的影响。在使用所调查的所有ASO处理后，FoxP3+细胞(在CD4+CD25+细胞上预先选通)的百分比被降低了超过90％，产生少于2％的CD4+CD25+FoxP3+细胞(图7A)。用7种分析的小鼠FoxP3特异性ASO中的4种处理，有效地降低了Treg的抑制能力，因为Tresp的增殖比用模拟或对照寡核苷酸处理的Treg的共培养更好(图7B)。
图8A和图8B显示了供体1(图8A)和供体2(图8B)的CD4+ T细胞中人类FoxP3特异性ASO的第三轮筛选。
图9描绘了经过3天ASO处理后，调节性T细胞中选定的FoxP3 ASO对FoxP3 mRNA的剂量依赖性敲低。
图10描绘了3、6和10天后，调节性T细胞中选定的FoxP3 ASO对FoxP3 mRNA的剂量依赖性敲低。
具体实施方式
本发明人提供了人类和小鼠特异性寡核苷酸，如反义寡核苷酸，其与FoxP3的mRNA和前-mRNA序列杂交，并且分别抑制FoxP3、FoxP3mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合的表达、功能和下游效应。因此，本发明的寡核苷酸如反义寡核苷酸代表了用于一种预防和/或治疗病症的方法中的有前景且高效的工具，在病症中，FoxP3表达、功能和下游效应分别偏离健康受试者中的表达、功能和下游效应。例如，FoxP3表达参与疾病的诱导和/或维持和/或介导对另一种疗法的抗性。本发明的寡核苷酸如反义寡核苷酸例如与SEQ ID NO.1(人类mRNA)的FoxP3核酸序列、SEQ ID NO.2(人类前-mRNA)的FoxP3核酸序列、SEQ ID NO.324(小鼠mRNA)的FoxP3核酸序列和/或SEQ ID NO.325(小鼠前-mRNA)的FoxP3核酸序列杂交，其中在给药所述反义寡核苷酸后的6至240h、12至216h、18至120h、或24至72h、或12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h、180h、192h、204h、216h、228h或240h内，所述反义寡核苷酸抑制至少40％的FoxP3表达。
本发明的寡核苷酸是适体、siRNA，优选是反义寡核苷酸。
本发明提供了例如用于降低转录因子FoxP3水平的寡核苷酸。特别地，本发明涉及化合物，特别是寡核苷酸，在优选实施方式中，其与编码FoxP3的mRNA和/或前-mRNA杂交，从而随后募集RNaseH。此类化合物降低FoxP3 mRNA和/或FoxP3前-mRNA水平并降低功能性FoxP3转录因子的量，从而损害进一步下游效应物的效应和/或表达。
根据本发明的抑制包括分别以不同的百分比和量降低如表达等效应。
本发明的构思是提供寡核苷酸如反义寡核苷酸，其介导用于蛋白质表达的可用FoxP3 mRNA的限制。为了限制蛋白质表达，寡核苷酸需要存在代表杂交靶标的互补mRNA和/或前-mRNA，从而允许形成异源双链体。本发明的寡核苷酸与SEQ ID NO.1和/或SEQ IDNO.2的RNA杂交。寡核苷酸和靶RNA之间形成异源双链体导致靶RNA的RNaseH-介导的降解或失活，从而减少用于蛋白质表达的可用FoxP3 mRNA的量。
下面，将更详细地描述本发明的要素。这些要素与特定实施方式一起列出，然而，应该理解它们可以以任何方式和任何数量组合以创建附加实施方式。各种描述的示例和实施方式不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方式。该描述应被理解为支持且涵盖将明确描述的实施方式与任何数量的公开要素组合的实施方式。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都应视为由本申请的描述所公开。
在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及如“包括(comprises)”和“含有(comprising)”的变型将被理解为暗示包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步聚的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”和“一种(an)”和“该/所述(the)”以及类似的参考将被解释为涵盖单数和复数。本文中数值范围的列举仅旨在用作单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都并入在说明书中，就如同它在本文中单独列举一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”、“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明另外要求保护的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
本发明的如反义寡核苷酸等寡核苷酸组成为或包含例如12至25个核苷酸、12至15个核苷酸、15至20个核苷酸、12至16个核苷酸或15至19个核苷酸。寡核苷酸如反义寡核苷酸例如组成为或包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。本发明的如反义寡核苷酸等寡核苷酸包含至少一个被修饰的核苷酸。该被修饰的核苷酸例如是桥接核苷酸，例如锁核酸(LNA，例如2′,4′-LNA)、ENA、2`氟修饰的核苷酸、2`O-甲基修饰的核苷酸、2O-甲氧基修饰的核苷酸、FANA或它们的组合。本发明的如反义寡核苷酸等寡核苷酸包括具有例如相同或不同修饰的核苷酸。本发明的如反义寡核苷酸等寡核苷酸包含例如被修饰的磷酸酯骨架，其中磷酸酯例如是硫代磷酸酯。
本发明的如反义寡核苷酸等寡核苷酸在寡核苷酸的3′-和/或5′-端和/或寡核苷酸内的任何位置包含一种或多种被修饰的核苷酸，其中被修饰的核苷酸跟随在例如一行1、2、3、4、5或6个被修饰的核苷酸之后，或者被修饰的核苷酸与一个或多个未修饰的核苷酸组合。下表1呈现了寡核苷酸例如反义寡核苷酸的实施方式，其包含被修饰的核苷酸，例如由(+)指示的LNA和由(*)指示的硫代磷酸酯(PTO)。组成为或包含表1的序列的如反义寡核苷酸等寡核苷酸可以包含任何其他被修饰的核苷酸和/或被修饰的与未修饰的核苷酸的任何其他组合。表1的反义寡核苷酸与人类FoxP3的mRNA(SEQ ID NO.1；NM_014009.3)或与人类FoxP3的前-mRNA的内含子区域(SEQ ID NO.2；GRCh38.p13(GCF_000001405.39,Chr X(NC_000023.11):49,249,986K–49,226,382–前-mRNA位置)杂交，下表1中由“I”指示：
表1：人类FoxP3特异性反义寡核苷酸和对照寡核苷酸列表。反义寡核苷酸ID后的“H”指示与FoxP3 mRNA和/或前-mRNA的外显子区域结合的人类FoxP3特异性序列，反义寡核苷酸ID后的“HM”指示与前-mRNA的外显子区域结合的人类/小鼠交叉反应FoxP3序列，并且反义寡核苷酸ID后的“HI”表示与前-mRNA的内含子区域结合的人类FoxP3特异性序列。*是指跨越外显子的寡核苷酸，例如反义寡核苷酸，表1中描述的位置指示跨越外显子的寡核苷酸在mRNA SEQ ID NO.1上的位置。
本发明的如反义寡核苷酸等寡核苷酸与例如SEQ ID NO.1的人类FoxP3的mRNA和/或SEQ ID NO.2的人类FoxP3的前-mRNA的内含子杂交。这种反义寡核苷酸称为FoxP3反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸例如在杂交活性区域内杂交，该区域是例如SEQ ID NO.1的FoxP3 mRNA和/或例如SEQ ID NO.2的FoxP3前-mRNA上的一个或多个区域，其中与寡核苷酸的杂交极有可能导致FoxP3表达的有效敲低。在本发明中，出人意料地识别出了多个杂交活性区域，例如它们选自例如SEQ ID NO.2的FoxP3前-mRNA的位置1510至2109、位置1510至1809、位置1810至2109、位置2410至2709、位置2710至3009、位置3310至3609、位置3610至3909、位置3910至4209、位置4210至4509、位置4510至4809、位置4810至5109、位置5110至5409、位置5410至5709、位置5710至6009、位置6610至6909、位置7810至8109、位置8110至8409、位置8710至9009、位置9010至9309、位置9610至9909、位置9910至10209、位置10210至10509、位置10810至11109、位置11410至11709、位置11710至12009、位置12010至12309、位置12310至12609、位置12610至12909、位置12910至13209、位置13510至13809、位置14410至14709、位置14710至15009、位置15010至15309、位置15310至15609、位置15610至15909或它们的组合(包括所述范围的端数字)。与这些区域杂交的反义寡核苷酸如下表2所示：
表2显示了一些杂交活性区域和在该区域内杂交的反义寡核苷酸。
表3详细说明了与例如SEQ ID NO.1的FoxP3 mRNA杂交的跨外显子的寡核苷酸，如反义寡核苷酸：
下表4给出了寡核苷酸例如反义寡核苷酸的实例，其包含被修饰的核苷酸，例如用(+)指示的LNA和用(*)指示的硫代磷酸酯(PTO)。由表4的序列组成的或包含表4的序列的反义寡核苷酸，可以包含任何其他被修饰的核苷酸和/或被修饰的与未修饰的核苷酸的任何其他组合。表4的寡核苷酸与小鼠FoxP3的mRNA(SEQ ID NO.324；NM_001199347.1)或与小鼠FoxP3的前-mRNA的内含子区域(SEQ ID NO.325；GRCm38.p6(GCF_000001635.26,Chr X(NC_000086.7):7,578,119–7,596,800)杂交，在下表4中由“I”指示：
表4：小鼠FoxP3特异性反义寡核苷酸和对照寡核苷酸列表。反义寡核苷酸ID后的“M”指示与前-mRNA的外显子区域结合的小鼠FoxP3特异性序列，反义寡核苷酸ID后的“MR”指示与前-mRNA外显子区域结合的小鼠/大鼠交叉反应FoxP3序列，并且反义寡核苷酸ID后的“MI”指示与前-mRNA的内含子区域结合的小鼠FoxP3特异性序列。
本发明的寡核苷酸例如分别与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的FoxP3的mRNA和/或前-mRNA杂交。这种寡核苷酸称为FoxP3反义寡核苷酸。本发明的寡核苷酸，例如反义寡核苷酸，示于表1和表4中。本发明还涉及寡核苷酸，例如反义寡核苷酸，其与表1和/或表4的寡核苷酸具有80至99％、85至98％、90至95或93％的序列同源性。
例如，与未处理的对照相比，例如在6至240h、12至216h、18至120h、或24至72h、或12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h、180h、192h、204h、216h、228h或240h、优选24至72h内，本发明的寡核苷酸，例如反义寡核苷酸，抑制例如40％至99％、50％至98％、60％至95％、70％至90％或至少约40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的FoxP3表达(mRNA和/或前-mRNA)如，例如人类、大鼠或小鼠FoxP3表达。未处理的对照是例如在施用本发明的寡核苷酸之前受试者中的FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA表达或它们的组合，或未处理的样品例如细胞、血液、尿液、唾液等。
本发明的寡核苷酸例如是有活性的并且抑制例如在细胞、组织、器官或受试者中的表达。本发明的寡核苷酸，如反义寡核苷酸，在例如0.1、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950nM或1、10或100μM浓度中的纳摩尔或微摩尔浓度下，抑制FoxP3的表达。
例如，以1至100nM、5至90nM、10至80nM、15至70nM、20至60nM、25至50nM、30至45nM、或3、5、9、10、15、27、30、40、50、75、82、100、250、300、500或740nM、或1至50μM、3至40μM、5至30μM、8至25μM、10至15μM、或6μM、1.5μM、375nM、94nM、24nM、6nM、或1.5nM的浓度下使用本发明的寡核苷酸。
将本发明的寡核苷酸如反义寡核苷酸施用于细胞、组织、器官或受试者，一天一次或多次，一周一次或多次，一个月一次或多次、或一年一次或多次。
在一些实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸和药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。该药物组合物进一步包含例如化学治疗剂、另一种疾病特异性活性剂、另一种寡核苷酸、抗体、碳水化合物修饰的抗体、基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe、DARPin和/或在肿瘤治疗或例如与慢性感染有关的慢性痰症中有效的小分子。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸如反义寡核苷酸或药物组合物用于预防和/或治疗疾病的方法中。本发明的寡核苷酸或药物组合物与放射疗法相结合用于例如预防和/或治疗病症的方法。所述放射疗法可以进一步与化学疗法(例如铂、吉西他滨)相结合。例如，病症的特征在于FoxP3失衡，即FoxP3水平例如与正常、健康的细胞、组织、器官或受试者中的水平相比增加。替代地或附加地，例如，FoxP3表达参与疾病的诱导和/或维持和/或介导对另一种疗法的抗性。例如，分别通过增加FoxP3表达和功能来增加FoxP3水平。可以通过本领域技术人员已知的任何标准方法来测量FoxP3水平，例如免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹、定量实时PCR、HPLC、UHPLC、FPLC或QuantiGene测定法。
本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)或药物组合物例如局部或全身给药，例如口服、舌下、经鼻、吸入、皮下、静脉内、腹膜内、肌内、瘤内、鞘内、经皮和/或直肠给药。替代地或组合地，给药使用本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)离体处理的免疫细胞。在另一个备选方案中，本发明的寡核苷酸用于细胞治疗方法中，并且例如与CAR-T细胞、转基因TCR-T细胞或离体扩增的TIL组合给药。本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)单独给药，或者与本发明的另一种寡核苷酸组合并且任选地与另一种化合物(如化疗剂(例如铂、吉西他滨)、另一种疾病特异性药剂,另一种寡核苷酸(例如不属于本发明部分的寡核苷酸)、抗体、碳水化合物修饰的抗体、基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe、DARPin和/或小分子)组合给药。如化疗剂、另一种疾病特异性药剂、另一种寡核苷酸(即不是本发明的一部分)、抗体、碳水化合物修饰的抗体基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe、DARPin和/或小分子等其他化合物例如有效于预防和/或治疗恶性和/或良性肿瘤、慢性感染、慢性炎性疾病或它们的组合。
本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)或药物组合物例如用于预防和/或治疗慢性炎性疾病、慢性感染、恶性和/或良性肿瘤或它们的组合的方法中。通过使用本发明的寡核苷酸或药物组合物可预防和/或可治疗的肿瘤的例子是乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、睾丸癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、网状细胞肉瘤、脂肪肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、脑膜瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、急性和慢性髓细胞性白血病、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、肠神经节神经瘤、威尔姆瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、宫颈发育不良、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病变、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、白血病、表皮样癌以及它们的组合。
本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)或药物组合物例如用于预防和/或治疗慢性传染病的方法中，其中所述慢性传染病例如选自乙型和丙型肝炎病毒、人体免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、幽门螺杆菌感染或它们的组合。
本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)或药物组合物例如用于预防和/或治疗由感染引起的慢性炎性疾病的方法中，其中所述由感染引起的慢性炎性病症例如选自肝脏的慢性炎性疾病，例如肝纤维化、肝硬化或它们的组合。
在一些实施方式中，本发明的两种或更多种寡核苷酸在相同的时间点一起给药(例如在药物组合物中)或分开给药、或以交错的间隔例如作为药物组合物给药。替代地或附加地，本发明的一种或多种寡核苷酸与另一种化合物(如化疗剂、疾病特异性药剂、另一种寡核苷酸(即不是本发明的一部分)、抗体、碳水化合物修饰的抗体、基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe,、DARPin和/或小分子)在同一时间点(例如在药物组合物中)一起给药或分开给药、或以交错的间隔给药。
本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)例如分别抑制FoxP3的表达和功能，并且抗肿瘤活性剂(如化疗剂、疾病特异性药剂、另一种寡核苷酸(即不是本发明的一部分)、抗体、碳水化合物修饰的抗体、基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe、DARPin和/或小分子)抑制(拮抗剂)免疫抑制因子和/或刺激(激动剂)免疫刺激因子或者直接和/或间接抑制参与癌症进展和/或转移的另一靶标。所述免疫抑制因子例如选自IDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-beta、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、MTDH、Xbp1、Chop以及它们的组合。所述免疫刺激因子例如选自4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27、2B4以及它们的组合。所述参与癌症进展和/或转移的因子例如选自SND1、MTDH、HER-2、BRAF、KRAS、VEGF、EGFR1、EGFR2、BCR/ABL、ABL、MET、ALK、JAK2、BTK、miR-223、CCL18、CCL20、Lcn2、CCL5/CCR9、DDR2、PHD2、IL6、SDF-1/CXCL12以及它们的组合。本发明的反义寡核苷酸或药物组合物例如与治疗性疫苗组合或包含治疗性疫苗。在这种组合中，反义寡核苷酸和治疗性疫苗一起或分开给药，例如同时或不同时间。
免疫抑制因子是表达和/或活性例如在细胞、组织、器官或受试者中降低或增加的因子。免疫刺激因子是表达和/或活性例如在细胞、组织、器官或受试者中增加或降低的因子，这取决于细胞、组织、器官或受试者及其个体状况。参与癌症进展和/或转移的因子是与健康受试者相比，其表达和/或活性例如取决于细胞、组织、器官或受试者及其个体状况而增加和降低的因子，或者例如其参与疾病的诱导和/或维持和/或介导对另一种疗法的抗性。
例如，抑制FoxP3的表达和/或功能的反义寡核苷酸或药物组合物使得促炎基因如IL2和/或IFNγ和/或粒酶B的表达增加，和/或其中FoxP3的抑制使得免疫抑制基因如CD25、CD39、CD73、NRP1、TGF-β、GARP、CCR4、Ctla4和/或Tnfrsf18的表达降低。
与本发明的寡核苷酸或药物组合物组合的抗体例如是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或双特异性抗体。与本发明的寡核苷酸(如反义寡核苷酸)或药物组合物组合的小分子是例如舒尼替尼、阿来替尼、阿法替尼、依鲁替尼、伊马替尼、乐伐替尼、索拉非尼或艾卡哚司他。与本发明的寡核苷酸或药物组合物组合的化学疗法是例如铂或吉西他滨。
此外，本发明的一种或多种寡核苷酸(如反义寡核苷酸)用于确定癌症疾病的状态。
本发明的受试者是例如哺乳动物(例如人类、狗、猫、马、牛、猪等)，鸟或鱼。
实施例
以下实施例说明本发明的不同实施方式，但本发明不限于这些实施例。以下实验是在内源性表达FoxP3的细胞上进行的，即细胞不代表包含转染报告构建体的人工系统。与更接近治疗相关体内系统的内源系统相比，此类人工系统通常显示出更高程度的抑制和更低的IC50值。进一步的，在以下实验中，未使用转染剂，即进行体操递送。已知转染剂可增加影响IC50值的寡核苷酸的活性(参见例如Zhang et al.,Gene Therapy,2011,18,326-333；Stanton et al.,Nucleic Acid Therapeutics,Vol.22,No.5,2012)。由于使用转染剂的人工系统几乎或不可能转化为治疗方法，并且到目前为止，还没有批准用于寡核苷酸的转染配方，因此以下实验在没有任何转染剂的情况下进行。
实施例1：人类FoxP3特异性反义寡核苷酸(ASO)的设计
为了设计对人类FoxP3基因内的外显子区域具有特异性的ASO，使用了具有RefSeqID NM_014009.3的FoxP3 mRNA序列。对于对人类FoxP3基因的内含子区域具有特异性的ASO，使用了从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/browser/？context＝genome&acc＝G CF_000001405.39)下载的FoxP3前-mRNA序列(GRCh38.p13(GCF_000001405.39,ChrX(NC_000023.11):49,249,986K–49,226,382–pre-mRNA位置，如以FASTA格式注释的(可见范围)。ASO ID后的“H”指示与前-mRNA的外显子区域结合的人类FoxP3特异性序列，ASO ID后的“HM”指示与前-mRNA的外显子区域结合的人类/小鼠交叉反应FoxP3序列，和ASO ID后的“HI”指示与前-mRNA的内含子区域结合的人类FoxP3特异性序列。例如，根据内部标准设计15、16、17、18和19mer，在所有实验中使用neg1(描述于WO2014154843 A1)作为对照寡核苷酸。寡核苷酸(如反义寡核苷酸)的例子如表1所示。
实施例2：第1轮筛选中，T细胞中人类FoxP3特异性ASO的靶敲低功效筛选
为了研究计算机设计的FoxP3 ASO的敲低功效，在人类CD4+ T细胞中进行了两轮功效筛选。因此，在不添加转染试剂的情况下，用5μM浓度的相应ASO处理细胞三天。此外，细胞用TGF-β、ATRA、IL-2处理并用CD3/CD28珠(ThermoFisher)刺激以增加FoxP3的表达水平。三天处理期后将细胞裂解，使用QuantiGene Singleplex测定法(ThermoFisher)分析FoxP3和HPRT1 mRNA表达，并且将FoxP3表达值归一化为HPRT1值。第一轮ASO筛选结果如图1A和图1B以及表5和表6所示。如图1A和表5所示，使用ASO A25030H(SEQ ID NO.26)、A25027H(SEQID NO.23)、A25055HI(SEQ ID NO.49)、A25031H(SEQ ID NO.27)、A25038HMI(SEQ IDNO.34)和A25028H(SEQ ID NO.24)处理CD4+ T细胞产生了>50％的靶抑制(表示为与模拟处理的细胞相比，残留的FoxP3 mRNA表达<0.5)。在来自另一供体的CD4+ T细胞中进一步测试了FoxP3特异性ASO的敲低功率。如图1B和表6所示，使用ASO A25030H(SEQ ID NO.26)、A25055HI(SEQ ID NO.49)、A25031H(SEQ ID NO.27)、A25027H(SEQ ID NO.23)、A25038HMI(SEQ ID NO.34)、A25028H(SEQ ID NO.24)和A25054HI(SEQ ID NO.48)的处理产生了>50％的靶抑制(表示为与模拟处理的细胞相比，残留的FoxP3 mRNA表达<0.5)。在来自两个供体的CD4+ T细胞中，对照寡核苷酸不会产生FoxP3表达的抑制。
表5：第一轮筛选中，与模拟处理的细胞相比，经ASO处理的来自供体1的CD4+ T细胞中的平均FoxP3 mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
表6：第一轮筛选中，与模拟处理的细胞相比，经ASO处理的来自供体2的CD4+ T细胞中平均FoxP3 mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
实施例3：在第2轮筛选中，T细胞中人类FoxP3特异性ASO的靶敲低功效筛选
在第二轮筛选中测试了32种附加FoxP3特异性ASO的功效。在供体1和供体2的CD4+T细胞中，与来自第一轮筛选的3种ASO(A25027H(SEQ ID NO.23)、A25030H(SEQ ID NO.26)和A25055HI(SEQ ID NO.49))一起测试了ASO的敲低功效。如图2A和表7所示，使用来自第一轮筛选的所有测试的ASO以及来自第二轮筛选的A25073H(SEQ ID NO.58)、A25069H(SEQ IDNO.56)和A25076H(SEQ ID NO.26)的处理，在供体1的CD4+ T细胞中产生了>50％的靶抑制(表示为与模拟处理的细胞相比，残留FoxP3 mRNA表达<0.5)。此外，在供体2的CD4+ T细胞中，来自第一轮筛选的所有测试的ASO以及来自第二轮筛选的A25085HMI(SEQ ID NO.66)、A25092HI(SEQ ID NO.73)和A25076H(SEQ ID NO.26)产生了>40％的靶抑制(表示为与模拟处理的细胞相比，残留FoxP3 mRNA表达<0.6)(图2B和表8)。相反，对照寡核苷酸没有产生FoxP3表达的抑制。
表7：在第二轮筛选中，与模拟处理的细胞相比，经ASO处理的来自供体1的CD4+ T细胞中平均FoxP3 mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
表8：在第二轮筛选中，与模拟处理的细胞相比，经ASO处理的来自供体2的CD4+ T细胞中平均FoxP3 mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
实施例4：在调节性T细胞中研究通过选定的人类FoxP3特异性ASO的剂量依赖性靶敲低
在mRNA和蛋白质水平上研究了FoxP3 ASO在人调节性T细胞中对FoxP3 mRNA表达的剂量依赖性敲低，并且计算了各自的IC50值。因此，用以下浓度的相应ASO将Tregs处理3、7或9天：6μM、1.5μM、375nM、94nM、24nM、6nM和1.5nM。在处理期后，将细胞裂解，使用QuantiGene Singleplex测定法(ThermoFisher)分析了FoxP3和HPRT1 mRNA表达，并且FoxP3表达值归一化为HPRT1值(图3和表9)。替代地，通过流式细胞术分析了Foxp3蛋白表达并且计算了蛋白水平的IC50值(表10)。在用所有测试的FoxP3 ASO处理后观察了FoxP3 mRNA和蛋白质的剂量依赖性敲低(图3)，IC50值在45.3nM(A25069H(SEQ ID NO.56)，第9天)和404.3nM(A25073H(SEQ ID NO.58)第3天)之间(表9和10)。
表9：选定的FoxP3 ASO对Treg中FoxP3 mRNA表达的剂量依赖性抑制以及在3、7和9天后各自的IC50值。
表10：Treg中FoxP3蛋白表达的剂量依赖性抑制：在3、7和9天后的IC50值。
实施例5：Treg抑制测定
选择了五种人类FoxP3特异性ASO(A25028H(SEQ ID NO.24)、A25031H(SEQ IDNO.27)、A25038HMI(SEQ ID NO.34)、A25069H(SEQ ID NO.56)和A25073H(SEQ ID NO.58))以研究Treg中FoxP3的敲低是否会降低它们对应答T细胞(Tresp)的抑制能力。因此，进行了Treg抑制测定。因此，在ASO处理开始四天后，开始经ASO处理的Treg与Tresp(用细胞增殖染料染色)的共培养。在开始共培养三开后，通过流式细胞术分析了Tresp的增殖。使用所有五种经分析的FoxP3特异性ASO的处理有效地降低了Treg的抑制能力，因为Tresp可以比在用模拟或对照寡核苷酸处理的Treg的共培养物中更好地增殖(图4A和表11)。此外，在共培养的上清液中分析了促炎细胞因子IFN-γ和IL-2的浓度。与模拟处理的细胞或用对照寡核苷酸neg1处理的细胞相比，所有FoxP3 ASO处理的细胞中两种细胞因子的浓度均有提高(图4B、图4C和表11)。
表11：与模拟处理的细胞相比Tresp的％抑制的平均值列表，Treg抑制测定的上清液中的IFN-γ和IL-2浓度。
实施例6：小鼠FoxP3特异性反义寡核苷酸(ASO)的设计
为了设计对小鼠FoxP3基因具有特异性的ASO，使用了具有RefSeq ID NM_001199347.1的FoxP3 mRNA序列。为了设计对小鼠FoxP3基因内的内含子区域具有特异性的ASO，使用了FoxP3前-mRNA序列(GRCm38.p6(GCF_000001635.26,Chr X(NC_000086.7):7,578,119–7,596,800)。ASO ID后面的“M”指示与前-mRNA外显子区域结合的小鼠FoxP3特异性序列，ASO ID后的“MR”指示与前-mRNA外显子区域结合的小鼠/大鼠交叉反应FoxP3序列，并且ASO ID后面的“MI”指示与前-mRNA内含子区域结合的小鼠FoxP3特异性序列。根据内部标准设计了16和17mers，并且在所有实验中将neg1(描述于WO2014154843 A1)用作对照寡核苷酸(表4)。
实施例7：T细胞中小鼠FoxP3特异性ASO的靶敲低功效筛选
为了研究计算机设计的小鼠FoxP3 ASO的敲低功效，在小鼠CD4+ T细胞中进行功效筛选。此外，用TGF-β、ATRA、IL-2处理细胞，并且用CD3/CD28珠(ThermoFisher)刺激，从而增加FoxP3的表达水平。因此，在不添加转染试剂的情况下，用浓度为5μM的相应ASO将细胞处理三天。在三天处理期之间将细胞裂解，使用QuantiGene Singleplex测定(ThermoFisher)分析FoxP3和HPRT1 mRNA表达，并且将FoxP3表达值归一化为HPRT1值。结果如图5以及表12和表13所示。如图5A和表12所示，处理开始后三天，在供体小鼠1的CD4+ T细胞中，70种测试的ASO的30种(43％)可以观察到>70％的敲低(表示为与模拟处理的细胞相比，残留FoxP3 mRNA表达<0.3)。在使用来自供体小鼠2的CD4+ T细胞的第二次筛选中，使用70种测试的ASO中的25种的处理(36％)导致了>70％的靶表达抑制(表示为与模拟处理的细胞相比，残留FoxP3 mRNA表达<0.3)(图5B和表13)。值得注意的是，用对照寡核苷酸的处理对从供体小鼠1分离的细胞中的FoxP3表达没有影响。相比之下，用对照寡核苷酸处理影响了从供体小鼠2分离的细胞中FoxP3的表达，尽管与大多数特异性ASO相比程度较小。然而，在进一步的实验中并未观察到这一点。
表12：与模拟处理的细胞相比，经ASO处理的供体小鼠1的CD4+ T细胞中平均FoxP3mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
表13：与模拟处理细胞相比，经ASO处理的来自供体小鼠2的CD4+ T细胞中平均FoxP3 mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
实施例8：T细胞中通过选定的小鼠FoxP3特异性ASO的剂量依赖性靶敲低的研究
在小鼠CD4+ T细胞中研究了FoxP3 ASO对FoxP3 mRNA表达的剂量依赖性敲低，并计算了各自的IC50值。因此，用以下浓度的相应ASO将CD4+ T细胞处理三天：6μM、2μM、600nM、200nM、60nM、20nM、6nM、2nM。在处理期后，将细胞裂解，并且使用QuantiGene Singleplex测定(ThermoFisher)分析了FoxP3和HPRT1 mRNA表达，并且将FoxP3表达值归一化为HPRT1值。在用所有测试的FoxP3 ASO处理后观察到FoxP3 mRNA的剂量依赖性敲低(图6)，IC50值在146.9nM(A25064MI(SEQ ID NO.389))和2304.4nM(A25021M(SEQ ID NO.346))之间(表14)。
表14：选定的FoxP3 ASO对CD4+ T细胞中FoxP3 mRNA表达的剂量依赖性抑制和各自的IC50值
实施例9：Treg抑制测定
选择了七种小鼠FoxP3特异性ASO(A25014M(SEQ ID NO.339)、A25015M(SEQ IDNO.340)、A25021M(SEQ ID NO.346)、A25027M(SEQ ID NO.352)、A25032M(SEQ ID NO.357)、A25049MI(SEQ ID NO.374)和A25064MI(SEQ ID NO.389))来在蛋白质水平上确定天然Treg中FoxP3特异性ASO的敲低功效。在用的有研究过的ASO进行处理后，FoxP3+细胞的百分比(在CD4+CD25+细胞上预先选通)降低了超过90％，产生低于2％的CD4+CD25+FoxP3+细胞(图7A和表15)。为了进一步研究，Treg中FoxP3的敲低是否会降低Treg对应答T细胞(Tresp)的抑制能力，进行了Treg抑制测定。因此，在ASO治疗开始后四天开始ASO-处理的Treg与Tresp的共培养(用细胞增殖染料染色)。共培养开始三天后，通过流式细胞术分析了Tresp的增殖及其绝对细胞数。用七种分析过的FoxP3特异性ASO中的四种进行处理有效地降低了Treg的抑制能力，因为Tresp可以比在用模拟或对照寡核苷酸处理的Treg的共培养中更好地增殖(图7B和表15)。
| ASO | ％FoxP3<sup>+</sup>细胞(CD4+CD25+的) | 绝对数T<sub>resp</sub> |
| A25014M | 1.05 | 2936.33 |
| A25015M | 1.17 | 4146.33 |
| A25021M | 1.47 | 2551.67 |
| A25027M | 0.95 | 1778.67 |
| A25032M | 0.62 | 1752.67 |
| A25049MI | 0.93 | 1831.00 |
| A25064MI | 0.86 | 2683.33 |
| 模拟处理过的细胞 | 25.43 | 1411.33 |
| neg 1 | 56.03 | 1583.00 |
表15：在Treg抑制测定中，与模拟处理的细胞相比，ASO-处理的调节性T细胞的FoxP3+细胞平均值列表以及应答T细胞的绝对数量。
实施例10：在第三轮筛选中T细胞中人类FoxP3特异性ASO的靶敲低功效筛选
为了研究计算机设计的FoxP3 ASO的敲低功效，在人类CD4+ T细胞中进行了第三轮功效筛选。因此，将细胞激活，在不添加转染试剂的情况下，用浓度为5μM的相应ASO处理三天。在三天处理期后将细胞裂解，使用QuantiGene Singleplex测定(ThermoFisher)分析了FoxP3和HPRT1mRNA表达，并且将FoxP3表达值归一化为HPRT1值。结果示于图8A和8B以及表16和17中。如图8A和表16所示，用ASO A25096H(SEQ ID NO.56)、A25101H(SEQ IDNO.58)、A25105H(SEQ ID NO.23)、A25110H(SEQ ID NO.26)、A25107H(SEQ ID NO.26)、A25069H(SEQ ID NO.56)和A25126H(SEQ ID NO.81)处理CD4+ T细胞导致>70％的靶抑制(表示为与模拟处理的细胞相比，残留FoxP3 mRNA表达<0.3)。在来自另一供体的CD4+ T细胞中进一步测试了FoxP3特异性ASO的敲低功效。如图8B和表17所示，用ASO A25127H(SEQID NO.82)、A25126H(SEQ ID NO.81)、A25069H(SEQ ID NO.56)、A25028H(SEQ ID NO.24)、A25096H(SEQ ID NO.56)、A25101H(SEQ ID NO.58)和A25073H(SEQ ID NO.58)的处理导致了>70％的靶抑制(表示为与模拟处理的细胞相比，残留FoxP3 mRNA表达<0.3)。在来自两个供体的CD4+ T细胞中，对照寡核苷酸不导致FoxP3表达的抑制。
表16：在第三轮筛选中，与模拟处理的细胞相比，ASO处理的来自供体1的CD4+ T细胞中平均FoxP3 mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
表17：第三轮筛选中，与模拟处理的细胞相比，ASO处理的来自供体2的CD4+ T细胞中平均FoxP3 mRNA表达值列表。将表达值归一化为HPRT1。
实施例11：调节性T细胞中选定的人类FoxP3特异性ASO的剂量依赖性靶敲低的研究
在mRNA水平上研究了FoxP3 ASO在人类调节性T细胞中对FoxP3mRNA表达的剂量依赖性敲低，并计算了各自的IC50值。因此，用以下浓度的相应ASO将Treg处理了三天：6μM、1.5μM、375nM、94nM、24nM、6nM和1.5nM。在处理期后，将细胞裂解，使用QuantiGene Singleplex测定(ThermoFisher)分析FoxP3和HPRT1 mRNA表达，并且将FoxP3表达值归一化为HPRT1值(图9和表18)。在用所有测试的FoxP3 ASO处理后，观察到FoxP3 mRNA的剂量依赖性敲低(图9)，IC50值在109nM(A25101H；SEQ ID NO.58)和1758nM(A25151H；SEQ ID NO.104)之间(表18)：
表18：选定的FoxP3 ASO对调节性T细胞中FoxP3 mRNA表达的剂量依赖性抑制以及ASO处理3天后各自的IC50值
实施例12：调节性T细胞中选定的人类FoxP3特异性ASO的剂量依赖性靶敲低的研究
在mRNA和蛋白质水平上进一步研究了FoxP3 ASO在人类调节性T细胞中对FoxP3mRNA表达的剂量依赖性敲低，并计算了各自的IC50值。因此，使用下列浓度的各自ASO将Treg处理了三、六和十天：6μM、1.5μM、375nM、94nM、24nM、6nM和1.5nM。在处理期后，将细胞裂解，使用QuantiGene Singleplex测定(ThermoFisher)分析了FoxP3和HPRT1mRNA表达，并且将FoxP3表达值归一化为HPRT1值(图10和表19)。替代地，通过流式细胞术分析了Foxp3蛋白质表达并且计算了蛋白质水平上的IC50值(表20)。在用所有测试的FoxP3 ASO处理后，观察到FoxP3 mRNA和蛋白质的剂量依赖性敲低(图10)，IC50值在12.5nM(A25150H(SEQ ID NO.103)第10天)和603.1nM(A25150H第3天)之间(表19和20)：
表19：选定的FoxP3 ASO对Treg中FoxP3 mRNA表达的剂量依赖性抑制以及在3、6和10天后各自的IC50值
表20：Treg中FoxP3蛋白表达的剂量依赖性抑制：在3、6和10天后的IC50值。
Claims (15)
1.一种包含12至25个核苷酸的寡核苷酸，其中，所述核苷酸中的至少一个包含从桥接核酸如LNA、ENA、2'氟修饰的核苷酸、2O-甲基修饰的核苷酸、2O-甲氧基修饰的核苷酸、FANA以及它们的组合中选择的修饰，并且所述寡核苷酸与SEQ ID NO.1的和/或SEQ ID NO.2的Foxp3核酸序列杂交，使得与未处理的对照相比，在首次施用所述寡核苷酸后6至240小时或12至120小时内，FoxP3、FoxP3mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合减少40％至99％。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，在首次施用所述寡核苷酸后24至72小时内，使得FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合减少40％至99％。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，与SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2的Foxp3杂交，其中所述寡核苷酸在SEQ ID NO.2的位置1510至2109或位置1810至2109的区域内杂交。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含SEQ IDNO.58、SEQ ID NO.81、SEQ ID NO.103、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.83、SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.85、SEQID NO.86、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.88、SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.102、SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.106、SEQ ID NO.107、SEQ ID NO.108、SEQ IDNO.167、SEQ ID NO.194、SEQ ID NO.195、SEQ ID NO.196、SEQ ID NO.197、SEQ ID NO.198、SEQ ID NO.199、SEQ ID NO.200、SEQ ID NO.201、SEQ ID NO.202、SEQ ID NO.203、SEQ IDNO.204、SEQ ID NO.205、SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.101、SEQID NO.166、SEQ ID NO.187、SEQ ID NO.188、SEQ ID NO.189、SEQ ID NO.190、SEQ IDNO.191、SEQ ID NO.192、SEQ ID NO.193或它们的组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸选自：
+C*+G*+T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*G*+G*T*+G(A25073H；SEQ ID NO.58)，
+G*+A*+A*G*T*A*A*T*C*T*G*T*G*C*G*+A*+G*+C(A25126H；SEQ ID NO.81)，
+A*+T*+G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*+G*+G*+T(A25150H；SEQ ID NO.103)，
+G*A*+G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*T*T*+G*+G(A25097H,SEQ ID NO.56)，
+G*+A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*T*T*+G*+G(A25098H,SEQ ID NO.56)，
+C*G*+T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*G*+G*+T*+G(A25099H；SEQ ID NO.58)，
+C*G*+T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*G*+G*T*+G(A25100H,SEQ ID NO.58)，
+T*G*+A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*+T*+G(A25102H；SEQ ID NO.24)，
+T*G*+A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*T*+G(A25103H；SEQ ID NO.24)，
+G*+C*C*G*T*G*T*G*T*G*T*G*A*G*+C*+G*+A(A25106H,SEQ ID NO.25)，
+G*+C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*+G*+G*+T(A25107H,SEQ ID NO.26)，
+G*+C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*+G*G*+T(A25108H,SEQ ID NO.26)，
+A*G*+C*T*C*G*G*C*T*G*C*A*G*T*+T*+T*+A(A25109H,SEQ ID NO.27)，
+G*C*+G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*+G*+G*+T(A25110H；SEQ ID NO.26)，
+A*T*+G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*+A*+G(A25111H；SEQ ID NO.59)，
+G*+T*G*A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*T*+G(A25128H；SEQ ID NO.83)，
+T*G*+T*G*A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*+T(A25129H；SEQ ID NO.84)，
+G*+G*+C*C*G*T*G*T*G*T*G*T*G*A*G*+C*G*+A(A25130H,SEQ ID NO.85)，
+A*+A*+T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*C*C*G*+T*+G*+T(A25131H；SEQ ID NO.86)，
+G*+T*+G*A*A*T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*+C*+C*+G(A25132H；SEQ ID NO.87)，
+T*+A*+T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*+A*+G(A25133H；SEQ ID NO.88)，
+C*+A*+T*A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*+C*+A*+C(A25134H；SEQ ID NO.89)，
+C*+T*+C*G*G*C*T*G*C*A*G*T*T*T*A*+T*+T*+G(A25135H；SEQ ID NO.90)，
+G*+A*+A*T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*C*C*G*+T*+G*+T(A25149H,SEQ ID NO.102)，
+T*+A*+T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*+A*+G*+G(A25151H,SEQ ID NO.104)，
+A*+T*+A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*+A*+G(A25152H；SEQ ID NO.105)，
+A*+T*A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*+C*+A*+G(A25153H；SEQ ID NO.105)，
+A*T*+A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*+A*+G(A25154H；SEQ ID NO.105)，
+A*+T*A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*+A*+G(A25155H；SEQ ID NO.105)，
+G*+T*G*C*A*T*A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*+T*A*+C(A25156H,SEQ ID NO.106)，
+G*+T*G*C*A*T*A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*+A*+C(A25157H；SEQ ID NO.106)，
+G*+C*+T*C*G*G*C*T*G*C*A*G*T*T*T*A*+T*+T*+G(A25158H,SEQ ID NO.107)，
+G*+G*+A*G*C*T*C*G*G*C*T*G*C*A*G*T*+T*+T*+A(A25159H；SEQ ID NO.108)，
+T*+C*+G*G*C*T*G*C*A*G*T*T*T*A*T*+T*+G*+G(A25219H；SEQ ID NO.167)，
+T*+G*T*G*A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*+T*+G(A25249H；SEQ ID NO.194)，
+G*+T*G*T*G*A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*+T(A25250H；SEQ ID NO.195)，
+G*+G*C*C*G*T*G*T*G*T*G*T*G*A*G*C*G*+A*+G(A25251H；SEQ ID NO.196)，
+T*C*+T*A*A*C*A*G*G*C*C*G*T*G*T*G*+T*+G*+T(A25252H；SEQ ID NO.197)，
+A*+A*+T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*C*C*G*T*+G*+T*+G(A25253H；SEQ ID NO.198)，
+T*+G*+A*A*T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*C*C*+G*+T*+G(A25254H,SEQ ID NO.199)，
+G*+T*+G*A*A*T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*C*+C*+G*+T(A25255H；SEQ ID NO.200)，
+G*G*+T*G*A*A*T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*C*+C*+G(A25256H；SEQ ID NO.201)，
+G*G*+T*G*A*A*T*T*C*T*A*A*C*A*G*G*+C*C*+G(A25257H；SEQ ID NO.201)，
+C*+A*+T*A*T*G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*+A*+C*+A(A25258H；SEQ ID NO.202)，
+G*+T*+T*C*C*T*C*T*G*C*A*G*T*C*T*A*+A*+G*+C(A25259H；SEQ ID NO.203)，
+G*+T*+A*G*T*T*C*C*T*C*T*G*C*A*G*T*+C*+T*+A(A25260H；SEQ ID NO.204)，
+C*+T*+C*G*G*C*T*G*C*A*G*T*T*T*A*T*+T*+G*+G(A25261H,SEQ ID NO.205)，
+T*+G*+A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*+T*+G(A25028H；SEQ ID NO.24)，
+G*+C*C*G*T*G*T*G*T*G*T*G*A*G*+C*+G*+A(A25029H,SEQ ID NO.25)，
+G*+C*+G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*+G*+G*+T(A25030H；SEQ ID NO.26)，
+G*+A*+G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*T*T*+G*+G(A25069H；SEQ ID NO.56)，
+G*+A*+G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*T*T*+G*+G(A25096H；SEQ ID NO.56)，
+C*+G*+T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*G*+G*T*+G(A25101H；SEQ ID NO.58)，
+G*+T*+T*G*T*T*T*G*A*G*T*G*T*A*C*+T*+G*+A(A25127H；SEQ ID NO.82)，
+T*+G*+A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*T*+G(A25104H；SEQ ID NO.24)，
+T*+G*+A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*T*+G(A25070H,SEQ ID NO.24)，
+G*+T*G*A*G*C*G*A*G*C*A*C*G*T*G*+T*+T(A25071H；SEQ ID NO.57)，
+G*+C*C*G*T*G*T*G*T*G*T*G*A*G*+C*+G*+A(A25072；SEQ ID NO.25)，
+G*+C*+G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*G*+G*+T(A25074H；SEQ ID NO.26)，
+G*+C*+G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*+G*G*+T(A25075H,SEQ ID NO.26)，
+G*+C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*A*+G*+G*+T(A25076H,SEQ ID NO.26)，
+A*+T*+G*C*G*T*G*A*G*A*T*A*C*A*C*+A*+G(A25077H；SEQ ID NO.59)，
+A*G*+C*T*C*G*G*C*T*G*C*A*G*T*+T*+T*+A(A25078H；SEQ ID NO.27)，
+C*G*+C*T*G*C*T*T*C*T*G*T*G*T*+A*+G*+G(A25105H；SEQ ID NO.23)，
+C*+G*C*T*G*C*T*T*C*T*G*T*G*T*A*G*+G*C*+C(A25147H；SEQ ID NO.101)，
+C*+G*C*T*G*C*T*T*C*T*G*T*G*T*A*G*G*+C*+C(A25148H；SEQ ID NO.101)，
+T*+G*+A*A*G*T*A*A*T*C*T*G*T*G*C*+G*+A*+G(A25218H,SEQ ID NO.166)，
+C*+T*+G*A*A*G*T*A*A*T*C*T*G*T*G*C*+G*+A*+G(A25242H；SEQ ID NO.187)，
+C*+C*+T*G*A*A*G*T*A*A*T*C*T*G*T*G*+C*+G*+A(A25243H；SEQ ID NO.188)，
+G*+T*+T*G*T*T*T*G*A*G*T*G*T*A*C*T*+G*+A*+G(A25244H；SEQ ID NO.189)，
+G*+G*+T*T*G*T*T*T*G*A*G*T*G*T*A*C*+T*+G*+A(A25245H,SEQ ID NO.190)，
+A*+C*+G*C*T*G*C*T*T*C*T*G*T*G*T*A*+G*G*+C(A25246H；SEQ ID NO.191)，
+G*+A*+C*G*C*T*G*C*T*T*C*T*G*T*G*T*A*+G*+G(A25247H；SEQ ID NO.192)，
+G*+G*+T*A*C*T*G*A*C*G*C*T*G*C*T*T*C*+T*+G(A25248H；SEQ ID NO.193)，
+C*+G*C*T*G*C*T*T*C*T*G*T*G*T*+A*+G*+G(A25027H,SEQ ID NO.23)，
+C*+G*C*T*G*C*T*T*C*T*G*T*G*T*+A*G*+G(A25068H；SEQ ID NO.23)
或它们的组合，其中+指示LNA修饰的核苷酸且*指示核苷酸之间的硫代磷酸酯(PTO)键。
6.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸在纳摩尔或微摩尔浓度下抑制FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合的表达。
7.一种药物组合物，包含根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸以及药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或它们的组合。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，进一步包含抗肿瘤活性剂如化疗剂(例如铂、吉西他滨)、免疫刺激剂、疾病特异性药剂或逆转肿瘤或感染介导的免疫抑制的药剂、另一种寡核苷酸、抗体、碳水化合物修饰的抗体、基于肽的治疗剂、基于蛋白质的治疗剂、治疗性疫苗、HERA融合蛋白、配体诱捕剂、Fab片段、纳米抗体、BiTe、DARPin、小分子或它们的组合。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述抗肿瘤活性剂、所述疾病特异性药剂、所述其他寡核苷酸、所述抗体、所述碳水化合物修饰的抗体、所述基于肽的治疗剂、所述基于蛋白质的治疗剂、所述治疗性疫苗、所述HERA融合蛋白、所述配体诱捕剂、所述Fab片段、所述纳米抗体、所述BiTe、所述DARPin和/或所述小分子抑制从IDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-β、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、MTDH、Xbp1、Chop以及它们的组合中选择的免疫抑制因子的表达或活性，或者刺激从4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27、2B4以及它们的组合中选择的免疫刺激因子的表达或活性。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中，所述抗肿瘤活性剂、所述疾病特异性药剂、所述其他寡核苷酸、所述抗体、所述碳水化合物修饰的抗体、所述基于肽的治疗剂、所述基于蛋白质的治疗剂、所述治疗性疫苗、所述HERA融合蛋白、所述配体诱捕剂、所述Fab片段、所述纳米抗体、所述BiTe、所述DARPin和/或所述小分子抑制参与癌症进展和/或转移的因子的表达或活性，所述因子选自SND1、MTDH、HER-2、BRAF、KRAS、VEGF、EGFR1、EGFR2、BCR/ABL、ABL、MET、ALK、JAK2、BTK、miR-223、CCL18、CCL20、Lcn2、CCL5/CCR9、DDR2、PHD2、IL6、SDF-1/CXCL12以及它们的组合。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸或根据权利要求7至10中任一项所述的药物组合物，用于在一种预防和/或治疗病症的方法中使用，其中，所述病症中涉及FoxP3、FoxP3 mRNA、FoxP3前-mRNA或它们的组合的失衡。
12.根据权利要求11所述的用于使用的寡核苷酸或药物组合物，其中，所述病症为恶性和/或良性肿瘤、慢性传染病、由感染引起的慢性炎症性疾病或它们的组合。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的用于使用的寡核苷酸或药物组合物，其中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、睾丸癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、网状细胞肉瘤、脂肪肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、脑膜瘤、急性和慢性淋巴细胞和粒细胞肿瘤、急性和慢性髓细胞性白血病、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、肠神经节神经瘤、威尔姆瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、宫颈发育不良、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌、局部皮肤病变、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、白血病、表皮样癌以及它们的组合。
14.根据权利要求10至12中任一项所述用于使用的寡核苷酸或药物组合物，其中，所述慢性传染病例如选自乙型和/或丙型肝炎病毒、人体免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染或它们的组合，或其中所述由感染引起的慢性炎症性疾病选自肝脏的慢性炎症性疾病，例如肝纤维化、肝硬化或它们的组合。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的用于使用的寡核苷酸或药物组合物，其中，所述寡核苷酸和/或组合物适合局部或全身给药。
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