JP2022507016A - 小分子薬物およびオッセオインテグレーションを促進する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】小分子薬物およびオッセオインテグレーションを促進する方法に関する。【解決手段】象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを増強または促進するための方法であって、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む方法が、提供される。ＮＰＡＳ２の発現は、対象へのＮｐａｓ２調節化合物の投与によって増加する。【選択図】図６Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月５日に出願された米国仮出願第６２／７５５，６９８号の利益および優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを増強または促進するための方法に関し、この方法は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む。

チタン（Ｔｉ）ベースの生体材料は、整形外科および歯科用用途の埋め込み型医療機器で広く使用されている。古典的な研究では、Ｌａｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９６７）は、ウサギの筋肉に移植された金属材料の組織反応を調べ、工業用純ＴｉおよびＴｉ合金が、異物反応を最少に抑え、線維症を最小に抑えるものの１つであると結論付けた。Ｔｉインプラントの生物学的に不活性な特性により、最初に、軟組織カプセル化の層なしでの直接骨からインプラントへの接続またはオッセオインテグレーションの確立が明確にされた。Ｔｉインプラントの表面機能化は、中等度に粗い表面トポグラフィーとナノトポグラフィー、表面エネルギーの増加、骨誘導生体分子の取り込みを含む、オッセオインテグレーションプロセスを改善および促進することが示されている。これらの機能化技術の成果は、複雑な表面を有するＴｉ生体材料が生体反応を誘発し、増強されたオッセオインテグレーションの確立につながり得ることを示唆しているが、根本的なメカニズムはまだ完全には理解されていない。動物実験試験およびヒトの症例からのいくつかの報告は、宿主における健全なビタミンＤレベルがオッセオインテグレーションの確立にとって重要な要因であることを示唆している。腎臓の活性化ビタミンＤが循環中のカルシウムイオンを制御することは十分に確立されているが、骨組織におけるその正確な作用はあまり理解されていない。ビタミンＤ欠乏ラットのオッセオインテグレーション障害は、インプラント周囲の骨形成の欠如によるものではなく、むしろインプラント表面への骨結合の減少によって引き起こされた。

したがって、オッセオインテグレーションを増強するための方法および効果的な治療組成物の必要性が依然として存在する。

インプラントのオッセオインテグレーションにおけるビタミンＤの役割を決定するために、これまでに、ビタミンＤが十分なラットおよび不足しているラットに由来するインプラント周囲組織の全ゲノムマイクロアレイ研究を行った。この研究は、予想外に、分子概日時計遺伝子であるニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（Ｎｐａｓ２）が、オッセオインテグレーションの開発の成功に関連性が高いことを明らかにした。Ｎｐａｓ２は、ＤＮＡ結合のための基本的なヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）構造を含む転写因子である。概日運動出力サイクルＫａｐｕｔ（Ｃｌｏｃｋ）との配列類似性により、Ｎｐａｓ２は概日リズム調節分子のメンバーとみなされてきた。概日リズムは、全身の多くのプロセスで見られ、視床下部視交叉上核（ＳＣＮ）で見られる時間調節機構によって中枢的に調節される。分子レベルでは、コアクロック分子である脳および筋肉Ａｒｎｔ様タンパク質１（Ｂｍａｌ１）とＣｌｏｃｋが二量体化して、Ｐｅｒｉｏｄ（Ｐｅｒ）遺伝子およびＣｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ（Ｃｒｙ）遺伝子が関わる転写／翻訳フィードバックループに関与する。概日リズムは、骨を含む末梢組織にも見られる。最近、複雑な表面を有するＴｉディスクがインビトロで骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）のＮｐａｓ２発現を増加させることが明らかになった。加重遺伝子共発現ネットワーク解析により、Ｔｉインプラントによって引き起こされるＮｐａｓ２の発現増加が選択的であり、他の概日リズム関連遺伝子では見られないことが明らかになり、非依存性分子機構がＴｉ－生体材料に反応してＮｐａｓ２の増加の原因となることを示唆している。

まとめると、インプラントのオッセオインテグレーションにおけるＮｐａｓ２の機構的役割が提唱されてきた。

一態様では、本発明は、対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを増強するための方法を提供し、この方法は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む。

別の態様では、本発明は、対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを促進するための方法を提供し、この方法は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む。

さらに別の態様では、本発明は、対象におけるインプラント・骨統合を再確立するための方法を提供し、この方法は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む。

別の態様では、本発明は、対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを改善または促進するための方法を提供し、この方法は、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、Ｎｐａｓ２調節化合物は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させる。

さらなる態様では、本発明は、骨修復および創傷治癒を改善または促進するための方法を提供し、この方法は、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、Ｎｐａｓ２調節化合物は、骨髄および創傷組織における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させる。

その他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例、および図面から明らかになろう。しかし、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および修正がこの詳細な説明から当技術分野の当業者には明らかになるので、本発明の特定の実施形態を示す一方で詳細な説明および特定の実施例は、例示としてのみ示されることを理解されたい。

本発明とみなされる主題は、本明細書の結論部分で特に指摘され、明確に特許請求される。しかし、本発明は、組織および操作方法の両方に関して、その目的、特徴、および利点と併せて、以下の詳細な説明を参照することにより、添付の図面とともに読まれる場合に最も良く理解され得る。

図１Ａ～１Ｅは、ＢＭＳＣの概日時計遺伝子発現に対するＴｉ生体材料の効果を示す。図１Ａは、機械加工またはサンドブラストおよび酸エッチング（ＳＬＡ）処理された工業用純Ｔｉディスクの表面特徴を示す。図１Ｂは、光干渉プロフィロメトリーによる機械加工およびＳＬＡ処理Ｔｉディスクの表面トポグラフィー評価を示す。図１Ｃは、表面粗さの測定値を示す（群あたりｎ＝３）。図１Ｄは、ポリスチレン培養プレート、機械加工ＴｉディスクおよびＳＬＡ処理Ｔｉディスク上で培養されたヒトＢＭＳＣによる時計遺伝子の経時的発現をグラフで示す（各群の各時点でｎ＝６）。ＢＭＳＣをＳＬＡ処理Ｔｉディスク上で培養すると、ＮＰＡＳ２の発現が大幅に増加した。＊：ｐ＜０．０５。図１Ｅは、時計遺伝子発現データのトレンド除去された調和回帰分析を示す。ポリスチレン上の対照ＢＭＳＣと比較して、ＳＬＡ処理Ｔｉディスクは概日発現パターンを減衰および／または変更させた。 図２Ａ～２Ｈは、マウスインプラントオッセオインテグレーションモデルの発展を示す。図２Ａは、ハンドルを使用して設計された実験用インプラント（直径０．６ｍｍ、長さ１０ｍｍ）を示す。大腿骨骨髄に作成された骨切断部位に挿入した後、Ｔｉロッドをクリップして長さ４ｍｍのインプラントを生成した。図２Ｂは、それぞれＳＬＡまたは機械加工として処理された実験用インプラントの表面を示す。図２Ｃは、骨端軟骨および成長板との接触を避けるために、遠位大腿骨関節から４ｍｍの深さで大腿骨骨髄に配置された４ｍｍのインプラントを示す。図２Ｄは、所定の時間に、マウスの大腿骨を収集してトリミングし、インプラントの端を露出させる方法を示す。インプラントの機械的保持強度をインプラントのプッシュアウト試験によって測定した。ブレークポイント負荷（Ｎ）を、インプラントプッシュアウト値として決定した。図２Ｅは、３週間までの治癒時間にわたって増加し、その後プラトーに達したインプラントのプッシュアウト値をグラフで示す。グラフは、１、２、３、４、および８週間での平均プッシュアウト値±ＳＥＭを示している（それぞれｎ＝３、４、４、４、および４）。図２Ｆは、収集したマウス大腿骨を１０％緩衝ホルマリンで固定し、非脱灰エポキシ樹脂を埋め込んだ組織切片用に処理した別の実験をグラフで示す。Ｇｏｌｄｎｅｒトリクローム染色切片を使用して、骨インプラント収縮（ＢＩＣ）比を決定した。ＢＩＣ比は、３週間までの治癒時間にわたって増加した。グラフは、１、２、３、４、および８週間での平均ＢＩＣ比±ＳＥＭを示している（それぞれｎ＝４、４、４、４、および４）。図２Ｇは、プッシュアウト試験後に回収された３週間のインプラントの代表的なＥＤＳ元素分析を示す。組織残遺物にはＯ、Ｐ、Ｃａ元素が含まれていたが、Ｔｉ元素は減少していた。図２Ｈは、回収されたインプラントの表面全体のＥＤＳによる分析と、各インプラントのＴｉ、Ｃａ、およびＰの計算された平均元素重量％をグラフで示す。Ｔｉ重量％は、３週間までの治癒時間にわたって徐々に減少し、次いで、プラトーに達した。ＥＤＳによるＴｉ元素分析は、ＢＩＣ比の逆の傾向を反映していたが、測定値の変動は小さかった。グラフは、１、２、３、４、および８週間での平均ＥＤＳ元素含有量（重量％）±ＳＥＭを示す（それぞれｎ＝３、４、４、４、および４）。 図３Ａ～３Ｄは、野生型（ＷＴ）、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスの大腿骨の特徴を示す。図３Ａは、Ｎｐａｓ２対立遺伝子とゲノムＤＮＡＰＣＲの図である。基本的なヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）配列をコードするエクソン３（Ｅ３）がＬａｃＺ発現レポーターカセット（ＬａｃＺ／Ｎｅｏ）に置き換わったため、変異型Ｎｐａｓ２タンパク質はＤＮＡ結合機能が欠如していた。図３Ｂは、１５週齢のＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスからの大腿骨（群あたりｎ＝３）のサイズおよび形状が識別できなかったことを示している。図３Ｃは、大腿骨のマイクロＣＴ三次元海綿骨構造を示す。図３Ｄは、マイクロＣＴによって評価された大腿骨海綿骨構造（群あたりｎ＝６）の定量分析で有意差が観察されなかったことを示す。 図４Ａ～４Ｇは、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスのオッセオインテグレーション障害を示す。図４Ａは、３週間の回復後、Ｎｐａｓ２＋／－（ｎ＝８）およびＮｐａｓ２－／－（ｎ＝４）マウス内に配置されたＳＬＡインプラントのインプラントプッシュアウト値が野生型マウスのそれよりも有意に小さかったことを示す（ｎ＝１２）。ＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－、およびＮｐａｓ２－／－マウスでの機械加工インプラントのインプラントプッシュアウト値は、有意差を示さなかった。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。図４Ｂは、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－変異の影響を受けていないように見える、インプラント周囲の骨形成および骨とインプラントの接触を示す非脱灰組織切片である。切片間のばらつきのため、定量的な測定は行わなかった。図４Ｃは、インプラントプッシュアウト試験後のＳＬＡインプラントの代表的なＳＥＭ観察を示す。板状の組織残遺物は、野生型マウスから回収されたＳＬＡインプラントの表面を覆っていた。Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスから回収されたＳＬＡインプラントは、細網組織残遺物（＊）およびＴｉインプラント表面の明確な露出（矢印）に関連していた。図４Ｄは、ＥＤＳ元素分析により、野生型マウス（ｎ＝１２）から回収されたものよりもＮｐａｓ２＋／－（ｎ＝８）およびＮｐａｓ２－／－（ｎ＝４）マウスから回収されたＳＬＡインプラントのＴｉ曝露が大きいことが明らかになった。平均値±ＳＥＭ。＊：ＷＴ対照に対してｐ＜０．０５。図４Ｅは、ＳＬＡインプラントの組織残遺物のＣａおよびＰと、ＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－、およびＮｐａｓ２－／－マウスの大腿骨皮質骨のＥＤＳ分析を示す。図４Ｆは、Ｔｉ元素分析から推定され、インプラントのプッシュアウト値と相関するＳＬＡインプラントの組織被覆面積をプロットしたものである。野生型マウスでは、推定組織被覆面積とインプラントプッシュアウト値は、正の相関であったが、これらの値はＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスでは相関していなかった。図４Ｇは、ＷＴマウスから回収されたＳＬＡインプラントの残存組織中の高密度のコラ－ゲン繊維を明らかにした高倍率ＳＥＭを示しているが、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスの組織残遺物ではコラ－ゲン繊維構造は明確に観察されなかった。 図５Ａ～５Ｅは、インプラントのオッセオインテグレーションの根底にある分子機構を決定するために使用された偏りのない化学遺伝学的解析を示す。図５Ａは、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺレポーターシステムを搭載したＢＭＳＣを使用した化学遺伝学的解析のフロー図である。図５Ｂは、マウスＢＭＳＣのＮｐａｓ２－ＬａｃＺ発現のためのＬＯＰＡＣ（登録商標）１２８０化合物のハイスループットスクリーニングを示す。ヒット化合物は、ｚスコア＞２．５または＜－２．５として識別された。図５Ｃは、３つ組実験におけるヒット化合物のＮｐａｓ２－ＬａｃＺ発現の検証を示す。化合物（黒いバー）は、未処理の対照（白いバー）と比較して、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺの発現を有意に調節した（ｐ＜０．０５）。図５Ｄは、提案される神経骨格経路の変更と神経骨格経路との概略比較である。ＢＭＳＣの神経伝達物質誘発性β２アドレナリン受容体は、神経骨格調節として説明される、骨リモデリングを調節することが示されている。同定された化合物の薬理作用は、ｃＡＭＰおよびα２アドレナリン受容体の減少に集中していた。神経骨格調節の変更は、オッセオインテグレーションの分子機構として提案された。図５Ｅは、アドレナリン受容体の発現について再分析されたＴｉディスク（機械加工およびＳＬＡ）に曝露されたヒトＢＭＳＣの結果を示すグラフである。ポリスチレンプレートでの従来の培養条件と比較して、ＳＬＡ処理Ｔｉディスクに曝露されたＢＭＳＣは、α２およびβ１アドレナリン受容体の大幅な発現増加を示したが、β２アドレナリン受容体は示さなかった。 図６Ａ～６Ｂは、メチルドパが初期の治癒段階でインプラントのオッセオインテグレーションを改善することを示すためのインビボ実験の結果を示す。図６Ａは、Ｂ－ＤＡＥ－ＤＣＤ表面を有するマウスの大腿骨インプラントのプッシュアウト値が２週目（Ｗ２）に増加し、３週目（Ｗ３）にさらに増加したことを示している。図６Ｂは、マウスの大腿骨内において、機械加工された表面（滑らかな表面）のインプラント、またはＢ－ＤＡＥ－ＤＣＤ表面（粗い表面）のインプラントを使用すると、メチルドパの毎日の腹腔内（ＩＰ）注射により、ビヒクルで処置された対照マウスよりもプッシュアウト値が大きかったことを示す。

本主題は、本開示の一部を形成する以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示される特定の製品、方法、条件またはパラメータに限定されず、本明細書で使用される用語は、例としてのみ特定の実施形態を説明することを目的としており、請求された発明を限定することを意図しない。

本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。

上記および本開示全体で使用されているように、以下の用語および略語は、特に明記しない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。

本開示では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形の参照を含み、特定の数値への参照は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、当業者に知られているそのような化合物およびその均等物の１つまたは複数への言及などである。本明細書で使用される「複数」という用語は、２つ以上を意味する。値の範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似として表される場合、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は包括的であり、組み合わせることができる。

本明細書で使用される場合、用語「成分」、「組成物」、「化合物の組成物」、「化合物」、「薬物」、「薬理活性物質」、「活性剤」、「生物活性剤」、「生物活性薬物」、「治療薬」、「治療」、「処置」、または「薬物」は、本明細書では言い換え可能に使用され、対象（ヒトまたは動物）に投与されたときに、局所的および／または全身作用により、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を誘導する化合物もしくは化合物（複数可）もしくは組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「処置」または「治療」（ならびにその異なる形態）という用語は、予防的処置（例えば、予防治療）、治療処置または緩和治療を含む。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害反応もしくは悪影響もしくは症状を緩和する、または軽減することを含む。

対象への「投与」は、特定の送達システムに限定されず、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内の注射を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の組成物は、局所的または非経口的に（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および筋肉内に）投与することができる。さらに、本発明の組成物は、静脈内注入または静脈内注射によって投与することができる。本発明の組成物は、筋肉内注射または皮下注射によって投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、外科的に投与することができる。本明細書で使用される場合、「組成物」または「医薬組成物」とは、１種または複数種の有効成分（例えば、Ｎｐａｓ２調節化合物）の「薬学的有効量」または「治療有効量」（これらの用語は本明細書で言い換え可能に使用される）を含む任意の組成物を指す。「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。分子の治療上有効な量は、病状、年齢、性別、および個体の体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する分子の能力などの要因に応じて変化し得る。治療上有効な量はまた、分子の毒性または有害な効果が治療上有益な効果よりも重要である量である。組成物は、対象（ヒトまたは動物）に投与されると、局所的および／または全身的作用によって、所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘発する。

「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では言い換え可能に使用され、本発明による医薬組成物による予防的治療を含む治療が提供される動物、例えばヒトを指す。本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は、本明細書では言い換え可能に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（エグマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどの哺乳類、および爬虫類、両生類、トリ、シチメンチョウなどの非哺乳類が挙げられる。

一態様では、本発明は、対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを増強または促進するための方法を提供し、この方法は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む。

「オッセオインテグレーション」という用語は、本明細書では、インプラントと骨との間の線維組織の形成／付着なしで、およびそのような軟組織／線維組織によるカプセル化なしで、骨とインプラント表面との間の直接構造的接続および機能的接続として定義される。

いくつかの実施形態では、ＮＰＡＳ２の発現は、対象へのＮｐａｓ２調節化合物の投与によって増加される。

本明細書で使用される場合、「Ｎｐａｓ２調節化合物」は、対象に投与されたときに、局所的および／または全身的作用により、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を生成または刺激する化合物（もしくは複数の化合物）もしくは組成物（例えば、薬物（複数可））であり、特に、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｎｐａｓ２遺伝子の遺伝子発現の発現増加（増加）をもたらし、それにより、その化合物によって曝露または刺激された細胞において、例えばヒト骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）において、機能性遺伝子産物である末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の合成を増加させる。

Ｎｐａｓ２調節化合物
Ａ１アデノシン受容体アゴニスト
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるアデノシン受容体アンタゴニストは、Ａ_２アデノシン受容体よりもＡ_１アデノシン受容体に対する選択性を有し（「Ａ_１選択的アンタゴニスト」とも呼ばれる）、ベータアドレナリン受容体によって誘発されるｃＡＭＰシグナル伝達を減少させる。特定の実施形態において、アデノシン受容体アンタゴニストは、８－（ｐ－スルホフェニル）テオフィリンであり、化学構造は以下のとおりである。

さらなる実施形態では、１，３－ジアルキル－８－（ｐ－スルホフェニル）キサンチンなどの１，３－ジアルキルキサンチンを、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。一実施形態では、１，３－ジプロピル－８－フェニルキサンチンは、Ａ２受容体よりもＡ１受容体において約２３倍強力でいくぶん選択的なＡ１受容体アゴニストを表す（Ｄａｌｙ， ＪＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９８５；２８（４）：４８７－４９２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｄａｌｙによれば、ｐ－ヒドロキシアリール置換基は、アデノシンＡ１受容体およびＡ２受容体の両方で１，３－ジプロピル－８－フェニルキサンチンの効力をさらに増強する。いくつかの実施形態では、Ａ１受容体に対して非常に強力かつ選択的なアンタゴニストであり、Ａ２受容体よりもアデノシンＡ１においてほぼ４００倍強力である、８－（２－アミノ－４－クロロフェニル）－１，３－ジプロピルキサンチンを、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。さらなる実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＡ２アデノシン受容体よりもＡ１アデノシン受容体に対して選択性を有するアデノシン受容体アンタゴニストは、１－イソアミル－３－イソブチルキサンチンであり、その化学構造は以下のとおりである。

いくつかの実施形態では、８－置換１，３－ジプロピルキサンチンを、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。特定の実施形態では、８－置換１，３－ジプロピルキサンチンは、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＡ１－受容体アンタゴニストであり得、以下を含むがこれらに限定されない：Ａ１受容体において強力な化合物であることが見出された（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－メチル－２－フェニルエチル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、しかし、Ａ１アデノシン受容体においてより選択的であることが見出された（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－フェニルプロピル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン（Ｐｅｅｔ， ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９９３ Ｄｅｃ １０；３６（２５）：４０１５－２０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

８－アリール基の代わりに８－シクロアルキル基を導入することは、Ａ１アデノシン受容体への親和性に有利であり、一実施形態では、ＤＰＣＰＸ（１，３－ジプロピル－８－シクロペンチルキサンチン）あるいはＣＰＸとも呼ばれる（しかし、ＣＰＸは８－シクロペンチル－１，３－ジメチルキサンチンであり、Ａ１アデノシン受容体アンタゴニストでもある）などのシクロアルキルキサンチン誘導体は、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる（Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．著者原稿；ＰＭＣ ２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ ０７で入手可能；Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｍａｙ； １８０８（５）： １２９０－１３０８、およびＡｕｃｈａｍｐａｃｈ， ｅｔ ａｌ．， ＪＰＥＴ ３０８：８４６－８５６， ２００４、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＤＰＣＰＸの化学構造は以下のとおりである。

さらなる実施形態では、Ａ２アデノシン受容体よりも選択的なアデノシンＡ１受容体アンタゴニストは、３－ノラダマンチル（例えば、ロロフィリン、すなわち、１，３－ジプロピル－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（「ＫＷ３９０２」とも呼ばれる）および１－ブチル－３－（３－ヒドロキシプロピル）－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（「ＰＳＢ－３６」とも呼ばれる））、（置換）ノルボルニル（ナキシフィリン、すなわち、１，３－ジプロピル－８－［２－（５，６－エポキシノルボニル）］－キサンチン（「ＢＧ－９７１９」、「ＣＶＴ１２４」とも呼ばれる）、およびラクトン、すなわち、ノルボルニルラクトン置換キサンチン）、ジシクロプロピルメチル（「ＭＰＤＸ」、「ＫＦ１５３７２」とも呼ばれる）、ならびに１，３－ジプロピル－８－［１－（４－プロピオネート）－ビシクロ－［２，２，２］オクチル］キサンチン（すなわち、トポナフィリン、「ＢＧ－９９２８」とも呼ばれる）といった、キサンチン８位にかさ高いシクロアルキル置換基を有し得る。これらは非常に強力かつ選択的Ａ_１アンタゴニストであり、これらのＡ１アデノシン受容体アンタゴニストの類似体は、これらに限定されないが、ＤＰＣＰＸの２－チオ類似体、２－チオ－ＤＰＣＰＸ、およびＤＰＣＰＸの３－プロピル残基のフェニル、ベンジルまたはキラルメチルベンジル残基による置換 、および、３位に極性ヒドロキシ基を有するもの、例えば、ヒドロキシル化ＤＰＣＰＸ誘導体ＰＳＢ－１６、またはそのリン酸エステル二ナトリウム塩に変換されたＰＳＢ－１６などを含むＤＰＣＰＸ類似体もまた、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる（Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．著者原稿；ＰＭＣ ２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ ０７で入手可能、およびＡｕｃｈａｍｐａｃｈ， ｅｔ ａｌ．， ＪＰＥＴ ３０８：８４６－８５６， ２００４、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ロロフィリンの化学構造は以下のとおりである。

ＰＳＢ－３６の化学構造は以下のとおりである。

ナキシフィリンの化学構造は以下のとおりである。

トポナフィリンの化学構造は以下のとおりである。

さらなる実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＡ_１選択的アデノシン受容体アンタゴニストは、３－［２－（４－アミノフェニル）エチル］－８－ベンジル－７－［２－［エチル（２－ヒドロキシエチル）アミノ］エチル］－１－プロピルプリン－２，６－ジオンまたは［１｝３－（２－（４－アミノフェニル）エチル）－８－ベンジル－７－（２－（エチル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）－１－プロピルキサンチン（「Ｌ－９７－１」とも呼ばれる）｛２］であり、Ｌ－９７－１の化学構造は以下のとおりである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＡ１選択的アデノシン受容体アンタゴニストは、ピラゾロピリジン誘導体であるＦＫ－４５３、７－デアザアデニン誘導体であるＳＬＶ３２０（Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｍａｙ； １８０８（５）：１２９０－１３０８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含むがこれらに限定されない非キサンチン化学構造を有し、それぞれの化学構造は、次のとおりである。

別の実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる非キサンチン化学構造を有するＡ１選択的アンタゴニストは、２－アミノチアゾール誘導体、２－ベンゾイルアミノ－５－ｐ－メチルベンゾイル－４－フェニルチアゾール（Ｓｃｈｅｉｆｆ， Ａ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１０； １８：２１９５－２２０３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）であり、以下の化学構造を有する。

Ｋ＋チャネル阻害剤
電位依存性カリウム（Ｋ＋）チャネルＫｖ１．３は、体全体に広く発現する膜貫通型タンパク質であるが、しかし、神経系および免疫系の両方で高度に発現する。Ｋｖ１．３は、免疫抑制の潜在的な標的として、および自己反応性エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（Ｔ_ＥＭ）によって支配される自己免疫疾患の治療薬としてみなされてきた。Ｐｓｏｒａ－４は、強力な小分子Ｋｖ１．３チャネルブロッカーとして識別されており、Ｋｖ１．３のＣタイプの不活性状態に優先的に結合し、Ｋｖ１．５も強力に遮断する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＫ＋チャネル阻害剤は、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤（Ｋｖ１．３ブロッカーとも呼ばれる）であり、ＫｖチャネルブロッカーはｃＡＭＰ刺激による神経突起生成を阻害する。特定の実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（４－フェニルブトキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－４」とも呼ばれる）であり、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。Ｐｓｏｒａ－４の化学構造は以下のとおりである。

Ｖｅｎｎｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：１３６４－１３７４，２００４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって説明されるようなＰｓｏｒａ－４類似体が開発され、Ｖｅｎｎｅｎｋａｍｐは、化合物Ｐｓｏｒａ－３、Ｐｓｏｒａ－４、Ｐｓｏｒａ－５、およびＰｓｏｒａ－９が最も強力な小分子Ｋｖ１．３ブロッカーであると結論を下した。いくつかの実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（３－フェニルプロポキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－３」とも呼ばれる）であり、その化学構造は以下のとおりである。

別の実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（５－フェニルペントキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－５」とも呼ばれる）であり、その化学構造は以下のとおりである。

さらなる実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（４－ビフェニリル）－メトキシソラレン（「Ｐｓｏｒａ－９」とも呼ばれる）であり、その化学構造は以下のとおりである。

さらに別の実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＫｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（４－フェノキシブトキシ）－ソラレン（「フェノキシアルコキシプソラレン－１」または「ＰＡＰ－１」とも呼ばれる）であり、その化学構造は以下のとおりであり、

これは、Ｓｃｈｍｉｔｚ， ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６８：１２５４－１２７０， ２００５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって説明されているように、これはＫｖ１．５よりもＫｖ１．３に対する選択性が高い。
Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＬ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤は、Ｌ－α－メチル－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、（「Ｌ、－メチルドパ」、「アルファ－メチルドパ」または「メチルドパ」とも呼ばれる）であり、これは「芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ」（または「Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ」）としても知られている酵素であるＤＯＰＡデカルボキシラーゼの阻害剤であり、ＤＯＰＡをドーパミンに変換する。メチルドパも、アルファ－２アドレナリン受容体アゴニストである。Ｌ、－メチルドパは、アルファ－２アドレナリン受容体アゴニストでもあり、細胞内ｃＡＭＰを減少させ、その化学構造は以下のとおりである。

特定の実施形態では、他の［１｝Ｌ｛２］－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤としては、これらに限定されないが、カルビドパ、ベンセラジド（セラジドまたはＲｏ－４－４６０２とも呼ばれる）、α－ジフルオロメチルドパ（ＤＦＭＤ）が挙げられ、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。これらのＤＯＰＡデカルボキシラーゼ阻害剤の化学構造は以下のとおりである。

［１｝Ｌ｛２］、－メチルドパの類似体および誘導体は、また、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができ、これに限定されないが、［１｝ＤＬ－｛２］α－メチル－α－ヒドラジノ－３，４－ジヒドロキシフェニル－プロピオン酸（ＨＭＤ）、α－ヒドラジノ－３，４－ジヒドロキシフェニル－プロピオン酸およびα－ヒドラジノ－３－ヒドロキシフェニル－プロピオン酸（Ｐｏｒｔｅｒ Ｃ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， １９６２， Ｖｏｌ． １１， ｐｐ．１０６７－１０７７， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられ、その化学構造は以下のとおりであり、

さらに、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．によって説明され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、α－メチル－α－ヒドラジノフェニル－、α－メチル－α－ヒドラジノ－（３－メトキシ－４－ヒドロキシフェニル）－、およびα－ヒドラジノ－（４－メトキシフェニル）－プロピオン酸などの芳香族ヒドラジノ酸は、本明細書に記載される実施形態に従ってＤＯＰＡデカルボキシラーゼ阻害剤として使用することができる。

様々な実施形態では、経口投与の吸収を改善するために、Ｌ、－メチルドパは、Ｈｕ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ．１， １９８９， ｐｐ．６６－７０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されるように、ｇｌｙ－Ｌ－α－メチルドパ、ｐｒｏ－Ｌ－α－メチルドパ、Ｌ－α－メチルドパ－ｐｒｏ、ｐｈｅ－Ｌ－α－メチルドパ、およびＬ－α－メチルドパ－Ｌ－フェニルアラニン（Ｌ－２－メチル１－３－（３，４－ジヒドロキシフェニル）アラニル－Ｌ－フェニルアラニン）などのジペプチジル誘導体として、またはＷａｎｇ Ｈ－Ｐ．， ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， １９９５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されるように、α－メチルドパに付着してプロドラッグを形成するＤ－フェニルグリシンもしくはＤ－ｐ－ヒドロキシフェニルグリシンを含むジペプチドとして投与されてよい。

イミダゾリン－１受容体アゴニスト
様々な実施形態では、イミダゾリンアゴニストはクロニジン塩酸塩（「クロニジン」とも呼ばれる）であり、クロニジンは、アルファ－２アドレナリン受容体および中枢イミダゾリン－１（Ｉ_１）受容体を刺激する。クロニジン塩酸塩の化学構造は以下のとおりである。

代替の実施形態では、イミダゾリンアゴニストは、Ｓｗｅｅｔ ＣＳ， Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９８４ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ； ６（５Ｐｔ ２）：１１５１－６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されるように、ＩＣＩ－１０６，２７０、ＵＫ－１４，３０４、ピクロニジン（ＬＲ－９９，８５３）、およびブリッジ類似体（ＳＴ－１９１３、ＳＴ－１９６６、ＳＴ－１９６７）を含むがこれらに限定されないクロニジン類似体であり得る。

さらなる実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるイミダゾリンアゴニストには、以下の化合物が含まれるが、これらに限定されない。

α－アドレナリン受容体アゴニストおよびイミダゾリン受容体アゴニストであるナファゾリン塩酸塩の化学構造は以下のとおりであり、

α－アドレナリン受容体アゴニストおよびイミダゾリン結合部位リガンドであるキシロメタゾリン塩酸塩の化学構造は以下のとおりであり、

α_２－アドレナリン受容体アゴニストであり、およびα_２－アドレナリン受容体よりも高親和性Ｉ_１イミダゾリン結合部位に対して選択性を示したＩ_１イミダゾリン結合部位アゴニストであるモクソニジン塩酸塩の化学構造は以下のとおりであり、

Ｉ_１－イミダゾリン結合部位選択的リガンドであり、および対α_２－アドレナリン受容体選択性がクロニジンよりも大きいＩ_１受容体を有するα_２－アドレナリン受容体アゴニストである、ヘミフマル酸リルメニジンの化学構造は以下のとおりである。

特定の実施形態では、Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｒ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７９１， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６， １０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｈａｒ．２０１６．１０．００９に記載（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のように、Ｉ１イミダゾリンおよびα－２アドレナリン受容体を活性化する２－アミノチアゾリン誘導体は、一般的な化学構造を有し、

Ｆｅｒｒｅｉｒａは、Ｉ_１－イミダゾリンおよびアルファ－２アドレナリン受容体を活性化する２－アミノチアゾリン誘導体を説明しており、これは、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる２－アミノチアゾリン誘導体としては、これらに限定されないが、ジエチルおよび２－エチル－ヘキシルアミン誘導体などのＮ－置換２－アミノチアゾリンが挙げられ、Ｆｅｒｒｅｉｒａが示すように、その化学構造は、以下のとおりである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるイミダゾリン－１受容体アゴニストは、ハルマンと呼ばれるヘテロサイクリックアミン（いわゆる、１－メチル－９Ｈ－ピリド［３，４－ｂ］インドール、「２－メチル－ｂ－カルボリン」、「ハルマン」、および「ＭＳ－１５００８６６」）であり、これは、イミダゾリン－１（「Ｉ_１」）受容体アゴニスト、さらにアルファ－２アドレナリン受容体アゴニストである。ハルマンの化学構造は以下のとおりである。

さらなる実施形態では、アグマチン（Ｌ－アルギニンの脱炭酸生成物）は、アルファ２－アドレナリン受容体およびイミダゾイン－１（Ｉ_１）受容体のアゴニストであり、ヒトＩ_１受容体に対して優先的親和性を有し、アルファ２Ａ、アルファ２Ｂおよびアルファ２Ｃアドレナリン受容体に対して同等の親和性を有し、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。アグマチンの化学構造は以下のとおりである。

代替の実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるイミダゾリン化合物は、Ｉ_１イミダゾリン受容体を活性化し、α２－アドレナリン受容体においてほとんどあるいはまったく活性を有さない。そのようなＩ_１イミダゾリン受容体アゴニストとしては、マルサニジンおよびその類似体、７－Ｍｅ－マルサニジン、７－Ｃｌ－マルサニジン、ならびに７－Ｆ－マルサニジンおよびそれらの類似体もしくは誘導体が挙げられる。

一実施形態では、イミダゾリンアゴニストはマルサニジンであり、化学構造は以下のとおりである。

別の実施形態では、イミダゾリンアゴニストは７－Ｍｅ－マルサニジンであり、化学構造は以下のとおりである。

別の実施形態では、イミダゾリンアゴニストは７－Ｃｌ－マルサニジンであり、化学構造は以下のとおりである。

別の実施形態では、イミダゾリンアゴニストは７－Ｆ－マルサニジンであり、化学構造は以下のとおりである。

これらのマルサニジン／マルサニジン類似体のうち、イミダゾリン化合物７－Ｍｅ－マルサニジンは、Ｉ_１イミダゾリン受容体に対して最も高い親和性を有し、α２－アドレナリン受容体に対しては、Ｉ_１イミダゾリン受容体に対して低い親和性を示すが、α２－アドレナリン受容体に対して高い親和性を示す７－ＣＬ－マルサニジンに続いて低い親和性を示し、一方、７－Ｆ－マルサニジンは、７－Ｃｌ－マルサニジンよりもＩ_１イミダゾリン受容体に対してより高い親和性を示すが、α２－アドレナリン受容体に対しては同等の親和性を示す。マサニジンは、α２－アドレナリン受容体に対して最も高い親和性を示し、Ｉ_１イミダゾリン受容体に対しては、最も低い親和性を示し、したがって、混合α２／Ｉ_１アゴニストというよりむしろα２アドレナリン受容体アゴニストであるように見える。（Ｂｏｂｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｐｏｌ Ｐｈａｒｍ － Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ７４， Ｎｏ．２， ｐｐ．５７９－５８６， ２０１７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

セロトニン受容体アゴニスト
いくつかの実施形態では、セロトニン受容体アンタゴニストを本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。一実施形態では、セロトニンアゴニストは、競合的α１－アドレナリン受容体ブロッカーおよび部分的α２－アドレナリン受容体アゴニストである半合成麦角アルカロイドである。様々な実施形態では、セロトニン（５－ヒドロキシトリプタミンまたは「５－ＨＴ」）受容体アンタゴニストである麦角アルカロイドは、メチセルジド（「１－メチル－Ｄ－リゼルギン酸ブタノールアミド」、「ＵＭＬ－４９１」、および「マレイン酸メチルセルジド」、その塩とも呼ばれる）であり、 セロトニン５－ＨＴ_２Ｃ受容体アンタゴニストの化学構造は以下のとおりである。

別の実施形態では、セロトニン受容体アンタゴニストは、アメセルジド（「Ｎ－シクロヘキシル－１１－イソプロピルリセルガミド」および「ＬＹ－２３７７３３」とも呼ばれる）であり、セロトニン５－ＨＴ_２Ａ、５－ＨＴ_２Ｂ、および５－ＨＴ_２Ｃ受容体の選択的アンタゴニストであり、かつα_２－アドレナリン受容体の強力なアンタゴニストである。アメチセルジドは、メチセルジドに関連があり、その化学構造は以下のとおりである。

一実施形態では、セロトニン受容体アゴニストである半合成麦角アルカロイドは、メチセルジドの活性代謝産物であるメチルエルゴメトリン（「メチルエルゴノビン」、「メチルエルゴバシン」、「Ｄ－リゼルギン酸１－ブタノールアミド」およびその塩であるメチルエルゴノビンマレイン酸塩（Ｍｅｔｈｅｒｇｉｎｅ（登録商標））とも呼ばれる）であり、セロトニン作動性受容体、ドーパミン作動性受容体およびアルファ－アドレナリン受容体のパーシャルアゴニスト／アンタゴニストであり、その化学構造は以下のとおりである。

環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤
一実施形態では、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（「ＰＤＥ」）阻害剤は、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる。ＰＤＥ３は、ｃＧＭＰ阻害ホスホジエステラーゼである。特定の実施形態では、ＰＤＥ阻害剤は、選択的ホスホジエステラーゼ３（ＰＤＥ３）阻害剤であるシロスタゾール（「６－［４－（１－シクロヘキシル－１Ｈ－テトラゾール－５－イル）－ブトキシ］－３，４－ジヒドロ－２（１Ｈ）－キノリノン」、「ＭＳ－１５０５２３０」、および「ＰＬＥＴＡＡＬ（登録商標）」とも呼ばれる）である。シロスタゾールは、ｃＡＭＰ分解を抑制することによってｃＡＭＰを増加させ、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性型を増加させ、血小板凝集の阻害に関連している。シロスタゾールの化学式は以下のとおりである。

いくつかの実施形態では、その全体が組み込まれる米国特許第８，３４９，８１７号に記載のシロスタゾール類似体およびその薬学的に許容される塩は、本明細書に記載の実施形態に従ってＰＤＥ３阻害剤として使用することができ、以下の化合物を含むがこれらに限定されない。

（式中、Ｄは重水素である。）

別の実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＰＤＥ３阻害剤は、ミルリノン（６－メチル－２－オキソ－５－ピリジン－４－イル－１Ｈ－ピリジン－３－カルボニトリル）、アムリノン（３－アミノ－５－ピリジン－４－イル－１Ｈ－ピリジン－２－オン、「イナムリノン」とも呼ばれる）、ペルリノン（２－メチル－４－オキソ－６－（ピリジン－３－イルメチルアミノ）－１Ｈ－ピリミジン－５－カルボニトリル）、エノキシモン（４－メチル－５－（４－メチルスルファニルベンゾイル）－１，３－ジヒドロイミダゾール－２－オン）、ピモベンダン（４，５－ジヒドロ－６－（２－（４－メトキシフェニル）－１Ｈ－ベンズイミダゾール）－５－イル）－５－メチル－３（２Ｈ）－ピリダジノン）、またはメリベンダン（４，５－ジヒドロ－５－メチル－６－（２－ピラゾール－３－イル－５－ベンズイミダゾリル）－３（２Ｈ）－ピリダジノン）であり、それぞれの化学構造は以下のとおりである。

いくつかの実施形態では、ＰＤＥ３阻害剤は、以下の化学構造を有するＰＤＥ３の選択的阻害剤であるシロスタミド（６－［３－（Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ－メチルカルバモイル）プロポキシ］キノリン－２［１Ｈ］－オン）である。

さらなる実施形態では、ＰＤＥ３阻害剤は、非常に強力なＰＤＥ３阻害剤トレキンシンまたはその塩であるトレキンシン塩酸塩（２，３，６，７－テトラヒドロ－９，１０－ジメトキシ－３－メチル－２－［（２，４，６－トリメチルフェニル）イミノ］－４Ｈ－ピリミド［６，１－ａ］イソキノリン－４－オン塩酸塩）であり、化学構造は以下のとおりである。

別の実施形態では、ＰＤＥ３阻害剤は、ＯＰＣ－３３５４０（６－［３－［３－シクロオクチル－３－［（１Ｒ^＊、２Ｒ^＊）－２－ヒドロキシシクロヘキシル］ウレイド］－プロポキシ］－２（１Ｈ）－キノリノン）と名付けられたシクロオクチル尿素誘導体（およびシロスタゾール類似体）である。Ｓｕｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００ Ｆｅｂ １５； ５９（４）：３４７－５６（その全体が本明細書に組み込まれる）によって説明されているように、古典的なＰＤＥ３阻害剤であるシロスタミド、シロスタゾール、ミルリノン、およびアムリノンよりも強力かつ選択的であることがわかった。ＯＰＣ－３３５４０の化学構造は以下のとおりである。

特定の実施形態では、インプラントは、金属チタン、チタン合金、クロムまたは鋼を含む。別の実施形態では、インプラントは、滑らかな表面および／または複雑な表面を含む。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、インプラント位置においてインプラントの移植と同時に骨髄に投与される。さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、インプラントの移植前に骨髄に投与される。別の実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、インプラントの移植後に骨髄に投与される。一実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、その移植前にインプラント上にコーティングされる。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｎｐａｓ２を発現増加させる。一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、細胞内ｃＡＭＰを減少させる。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、α２アドレナリン受容体の発現を刺激する。いくつかの実施形態では、α２アドレナリン受容体は、α２Ａ－、α２Ｂ－および／またはα２Ｃ－アドレナリン受容体である。

実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、アデノシン受容体アンタゴニストであり、アデノシン受容体アンタゴニストは、アデノシン受容体Ａ２よりもアデノシン受容体Ａ１に対して選択性を有する。一実施形態では、［１｝アデノシン受容体アゴニストは８－（ｐ－スルホフェニル）テオフィリンである。

いくつかの実施形態では、アデノシンＡ１受容体アンタゴニストは、１，３－ジプロピル－８－フェニルキサンチン、８－（２－アミノ－４－クロロフェニル）－１，３－ジプロピルキサンチン、１－イソアミル－３イソブチルキサンチン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－メチル－２－フェニルエチル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－フェニルプロピル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、１，３－ジプロピル－８－シクロペンチルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）、８－シクロペンチル－１，３－ジメチルキサンチン（ＣＰＸ）、１，３－ジプロピル－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ロロフィリン）、１－ブチル－３－（３－ヒドロキシプロピル）－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ＰＳＢ－３６）、１，３－ジプロピル－８－［２－（５，６－エポキシノルボニル）］－キサンチン（ナキシフィリン）、ジシクロプロピルメチル（ＭＰＤＸ）、１，３－ジプロピル－８－［１－（４－プロピオネート）－ビシクロ－［２，２，２］オクチル］キサンチン（トポナフィリン）、３－（２－（４－アミノフェニル）エチル）－８－ベンジル－７－（２－（エチル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）－１－プロピルキサンチン（Ｌ－９７－１）およびそれらの類似体または塩からなる群から選択される。

特定の実施形態では、アデノシンＡ１受容体アンタゴニストは、２－アミノチアゾール誘導体からなる群から選択される非キサンチン化合物である。

様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤である。一実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（４－フェニルブトキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－４」とも呼ばれる）である。別の実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（３－フェニルプロポキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－３」とも呼ばれる）、５－（５－フェニルペントキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－５」とも呼ばれる）、５－（４－ビフェニリル）－メトキシソラレン（「Ｐｓｏｒａ－９」とも呼ばれる）および５－（４－フェノキシブトキシ）－ソラレン（「ＰＡＰ－１」とも呼ばれる）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｌ、－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤である。一実施形態では、Ｌ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤は、さらにα２アドレナリン受容体アゴニストであり、この化合物はＬ、－メチルドパまたはその類似体もしくは誘導体である。さらなる実施形態では、Ｌ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤は、カルビドパ、ベンセラジドα－ジフルオロメチルドパおよびそれらの類似体からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、イミダゾリン－１受容体アゴニストである。別の実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、ハルマン（ＭＳ－１５００８６６）である。いくつかの実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、クロニジン塩酸塩もしくはクロニジン類似体、塩ファゾリン塩酸塩、ナファゾリン塩酸塩、キシロメタゾリン塩酸塩、モクソニジン塩酸塩、リルメニジンヘミフマル酸塩、２－アミノチアゾリン誘導体、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。さらなる実施形態では、２－アミノチアゾリン誘導体は、２－ジエチル－２－アミノチアゾリン、２－エチル－ヘキシルアミン－２－アミノチアゾリン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、マルサニジン、７－メチル－マルサニジン、７－Ｃｌ－マルサニジン、７－Ｆ－マルサニジン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、滑らかな表面のインプラントは、複雑な表面をさらに含む。実施形態では、複雑な表面は、ラージグリットおよび酸エッチングを用いたサンドブラスト（ＳＬＡ）によって作成される。

いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、インプラントの表面に曝露されたヒト骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）において起こり、その表面は、滑らかな表面および／または複雑な表面である。別の実施形態では、ＢＭＳＣにおけるＮｐａｓ２の発現増加は、骨とインプラントとの間の界面組織における骨とインプラント表面との結合を促進する。様々な実施形態では、ＢＭＳＣにおけるＮｐａｓ２の発現増加は、コラーゲン構造が交差している界面組織上の高密度コラーゲン繊維の合成を刺激する。いくつかの実施形態では、ＢＭＳＣにおけるＮｐａｓ２の発現増加は、コラーゲン構造が交差しているインプラント表面での高密度コラーゲン繊維の合成をさらに刺激する。このコラーゲン構造は、界面組織で合成される。

様々な実施形態では、インプラントは、歯科インプラントまたは整形外科インプラントである。いくつかの実施形態では、ＮＰＡＳ２の発現は、アデノウイルスベクターを対象に投与することによって増加され、アデノウイルスベクターは、ヒトＮＰＡＳ２ポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、インプラント位置において対象に投与される。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、インプラントの移植前に、および／またはインプラントの移植後に、インプラント位置でのインプラントの移植と同時に骨髄に投与される。

別の態様では、本発明は、対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを促進するための方法を提供し、この方法は、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、インプラントは、チタン、チタン合金、クロムまたは鋼を含む。特定の実施形態では、インプラントは、含む、インプラントは、滑らかな表面および／または複雑な表面を含む。

種々の実施形態では、ＮＰＡＳ２の発現は、対象へのＮｐａｓ２調節化合物の投与によって増加される。別の実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、インプラント位置においてインプラントの移植と同時に骨髄に投与される。さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、インプラントの移植前に骨髄に投与される。別の実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、インプラントの移植後に骨髄に投与される。一実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、その移植前にインプラント上にコーティングされる。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｎｐａｓ２を発現増加させる。一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、細胞内ｃＡＭＰを減少させる。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、α２アドレナリン受容体の発現を刺激する。いくつかの実施形態では、α２アドレナリン受容体は、α２Ａ－、α２Ｂ－および／またはα２Ｃ－アドレナリン受容体である。

いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、アデノシン受容体アンタゴニストであり、アデノシン受容体アンタゴニストは、アデノシン受容体Ａ２よりもアデノシン受容体Ａ１に対して選択性を有する。別の実施形態では、アデノシン受容体アンタゴニストは、８－（ｐ－スルホフェニル）テオフィリンである。

さらなる実施形態では、アデノシンＡ１受容体アンタゴニストは、１，３－ジプロピル－８－フェニルキサンチン、８－（２－アミノ－４－クロロフェニル）－１，３－ジプロピルキサンチン、１－イソアミル－３－イソブチルキサンチン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－メチル－２－フェニルエチル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－フェニルプロピル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、１，３－ジプロピル－８－シクロペンチルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）、８－シクロペンチル－１，３－ジメチルキサンチン（ＣＰＸ）、１，３－ジプロピル－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ロロフィリン）、１－ブチル－３－（３－ヒドロキシプロピル）－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ＰＳＢ－３６）、１，３－ジプロピル－８－［２－（５，６－エポキシノルボニル）］－キサンチン（ナキシフィリン）、ジシクロプロピルメチル（ＭＰＤＸ）、１，３－ジプロピル－８－［１－（４－プロピオネート）－ビシクロ－［２，２，２］オクチル］キサンチン（トポナフィリン）、３－（２－（４－アミノフェニル）エチル）－８－ベンジル－７－（２－（エチル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）－１－プロピルキサンチン（Ｌ－９７－１）およびそれらの類似体または塩からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、アデノシンＡ１受容体アンタゴニストは、２－アミノチアゾール誘導体からなる群から選択される非キサンチン化合物である。

様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤である。一実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（４－フェニルブトキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－４」とも呼ばれる）である。別の実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（３－フェニルプロポキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－３」とも呼ばれる）、５－（５－フェニルペントキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－５」とも呼ばれる）、５－（４－ビフェニリル）－メトキシソラレン（「Ｐｓｏｒａ－９」とも呼ばれる）、および５－（４－フェノキシブトキシ）－ソラレン（「ＰＡＰ－１」とも呼ばれる）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｌ、－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤である。一実施形態では、Ｌ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤は、さらにα２アドレナリン受容体アゴニストであり、その化合物はＬ、－メチルドパまたはその類似体もしくは誘導体である。様々な実施形態では、Ｌ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤は、カルビドパ、ベンセラジドα－ジフルオロメチルドパおよびそれらの類似体からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、イミダゾリン－１受容体アゴニストである。別の実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、ハルマン（ＭＳ－１５００８６６）である。いくつかの実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、クロニジン塩酸塩もしくはクロニジン類似体、ナファゾリン塩酸塩、ナファゾリン塩酸塩、キシロメタゾリン塩酸塩、モクソニジン塩酸塩、リルメニジンヘミフマル酸塩、２－アミノチアゾリン誘導体、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。さらなる実施形態では、２－アミノチアゾリン誘導体は、２－ジエチル－２－アミノチアゾリン、２－エチル－ヘキシルアミン－２－アミノチアゾリン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、マルサニジン、７－メチル－マルサニジン、７－Ｃｌ－マルサニジン、７－Ｆ－マルサニジン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、インプラントは、滑らかな表面および／または複雑な表面を含む。実施形態では、複雑な表面は、ラージグリットおよび酸エッチングを用いたサンドブラスト（ＳＬＡ）によって作成される。

さらなる実施形態では、ＮＰＡＳ２の発現は、アデノウイルスベクターを対象に投与することによってさらに増加し、アデノウイルスベクターは、ヒトＮＰＡＳ２ポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、インプラント位置での滑らかな表面インプラントの移植と同時に骨髄に投与される。さらなる実施形態では、アデノウイルスベクターは、滑らかな表面インプラントの移植前に骨髄に投与される。さらなる実施形態では、アデノウイルスベクターは、滑らかな表面インプラントの移植後のものである。

別の態様では、本発明は、対象におけるインプラント・骨統合を再確立するための方法を提供し、この方法は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む。

さらなる態様では、本発明は、対象の骨髄へのチタンインプラントのオッセオインテグレーションを改善するための方法を提供し、この方法は、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、Ｎｐａｓ２調節化合物は、骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させる。

別の態様では、本発明は、骨修復および創傷治癒を改善または促進するための方法を提供し、この方法は、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、Ｎｐａｓ２調節化合物は、骨髄および創傷組織における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させる。

一実施形態では、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物は、創傷部位または骨折に直接投与される。

いくつかの実施形態では、創傷は、上皮組織、筋肉組織、結合組織または神経組織、例えば、末梢神経系（ＰＮＳ）組織または中枢神経組織（ＣＮＳ）を含む。様々な実施形態では、上皮組織は、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（皮膚（ｓｋｉｎ））組織、または胃腸管器官および他の中空器官ならびに特定の腺の内層を含む。実施形態では、筋肉組織は、平滑筋組織、心筋組織、または骨格筋組織を含む。結合組織は、適切な結合組織（緩い結合組織および密な結合組織）または特別な結合組織（細網結合組織、脂肪組織、軟骨、骨、および血液）であり得る。いくつかの実施形態では、結合組織は、繊維（弾性繊維およびコラーゲン繊維）、粉砕された物質および細胞を含み、結合組織細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞、マクロファージ、肥満細胞、および白血球で構成される。いくつかの実施形態では、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物は、損傷直後、すなわち、数秒から数時間内に（例えば、負傷後１～７時間）、創傷の炎症中（数時間内から数日まで、負傷後１～３日）、または修復過程で（負傷後数日から数週間）投与される。

これらの提供される方法のいくつかの実施形態では、ＮＰＡＳ２の発現は、対象へのＮｐａｓ２調節化合物の投与によって増加する。別の実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、インプラント位置においてチタンインプラントのインプラントと同時に骨髄に投与される。さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、チタンインプラントの移植前に骨髄に投与される。別の実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、チタンインプラントの移植後に骨髄に投与される。一実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、チタンインプラントの移植前に、チタンインプラント上にコーティングされる。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｎｐａｓ２を発現増加させる。一実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、細胞内ｃＡＭＰを減少させる。様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、α２アドレナリン受容体の発現を刺激する。いくつかの実施形態では、α２アドレナリン受容体は、α２Ａ－、α２Ｂ－および／またはα２Ｃ－アドレナリン受容体である。

特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、アデノシン受容体アンタゴニストであり、アデノシン受容体アンタゴニストは、アデノシン受容体Ａ２よりもアデノシン受容体Ａ１に対して選択性を有する。別の実施形態では、アデノシン受容体アンタゴニストは、８－（ｐ－スルホフェニル）テオフィリンである。

さらなる実施形態では、アデノシンＡ１受容体アンタゴニストは、１，３－ジプロピル－８－フェニルキサンチン、８－（２－アミノ－４－クロロフェニル）－１，３－ジプロピルキサンチン、１－イソアミル－３－イソブチルキサンチン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－メチル－２－フェニルエチル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－フェニルプロピル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、１，３－ジプロピル－８－シクロペンチルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）、８－シクロペンチル－１，３－ジメチルキサンチン（ＣＰＸ）、１，３－ジプロピル－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ロロフィリン）、１－ブチル－３－（３－ヒドロキシプロピル）－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ＰＳＢ－３６）、１，３－ジプロピル－８－［２－（５，６－エポキシノルボニル）］－キサンチン（ナキシフィリン）、ジシクロプロピルメチル（ＭＰＤＸ）、１，３－ジプロピル－８－［１－（４－プロピオネート）－ビシクロ－［２，２，２］オクチル］キサンチン（トポナフィリン）、３－（２－（４－アミノフェニル）エチル）－８－ベンジル－７－（２－（エチル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）－１－プロピルキサンチン（Ｌ－９７－１）、およびそれらの類似体または塩からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、アデノシンＡ１受容体アンタゴニストは、２－アミノチアゾール誘導体からなる群から選択される非キサンチン化合物である。

様々な実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤である。一実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（４－フェニルブトキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－４」とも呼ばれる）である。別の実施形態では、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤は、５－（３－フェニルプロポキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－３」とも呼ばれる）、５－（５－フェニルペントキシ）ソラレン（「Ｐｓｏｒａ－５」とも呼ばれる）、５－（４－ビフェニリル）－メトキシソラレン（「Ｐｓｏｒａ－９」とも呼ばれる）および５－（４－フェノキシブトキシ）－ソラレン（「ＰＡＰ－１」とも呼ばれる）からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物はＬ、－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤である。一実施形態では、Ｌ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤は、さらにα２アドレナリン受容体アゴニストであり、その化合物はＬ、－メチルドパまたはその類似体または誘導体である。様々な実施形態では、Ｌ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤は、カルビドパ、ベンセラジドα－ジフルオロメチルドパ、およびそれらの類似体からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｎｐａｓ２調節化合物は、イミダゾリン－１受容体アゴニストである。別の実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストはハルマン（ＭＳ－１５００８６６）である。いくつかの実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、クロニジン塩酸塩もしくはクロニジン類似体、ナファゾリン塩酸塩、ナファゾリン塩酸塩、キシロメタゾリン塩酸塩、モクソニジン塩酸塩、リルメニジンヘミフマル酸塩、２－アミノチアゾリン誘導体、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。さらなる実施形態では、２－アミノチアゾリン誘導体は、２－ジエチル－２－アミノチアゾリン、２－エチル－ヘキシルアミン－２－アミノチアゾリン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、イミダゾリン－１受容体アゴニストは、マルサニジン、７－メチル－マルサニジン、７－Ｃｌ－マルサニジン、７－Ｆ－マルサニジン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、インプラントは、滑らかな表面および／または複雑な表面を含む。実施形態では、複雑な表面は、ラージグリットおよび酸エッチングを用いたサンドブラスト（ＳＬＡ）によって作成される。

提供される方法のさらなる実施形態では、ＮＰＡＳ２の発現は、アデノウイルスベクター、ヒトＮＰＡＳ２ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを対象に投与することによって増加される。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、インプラント位置において対象に投与される。様々な実施形態では、アデノウイルスベクターは、インプラント位置でのチタンインプラントの移植と同時に骨髄に投与される。実施形態では、アデノウイルスベクターは、チタンインプラントの移植前に骨髄に投与される。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、チタンインプラントの移植後に骨髄に投与される。

提供された方法のいくつかの実施形態では、インプラントは、滑らかな表面、複雑な表面またはそれらの組み合わせを含み得る。様々な実施形態では、複雑な表面は、ラージグリットおよび酸エッチングを用いたサンドブラスト（ＳＬＡ）によって作成される。特定の実施形態では、Ｎｐａｓ２の発現増加は、インプラント表面に曝露されたヒト骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）で起こる。一実施形態では、ＢＭＳＣにおけるＮｐａｓ２の発現増加は、骨とインプラントとの間の界面組織における骨とインプラントとの結合を促進する。別の実施形態では、ＢＭＳＣにおけるＮｐａｓ２の発現増加は、コラーゲン構造が交差している界面組織上での高密度コラ－ゲン繊維の合成を刺激する。さらなる実施形態では、ＢＭＳＣにおけるＮｐａｓ２の発現増加は、コラーゲン構造が交差しているインプラント上での高密度コラ－ゲン繊維の合成をさらに刺激する。

オッセオインテグレーションを促進／増加させるための同時投与薬
インプラントのオッセオインテグレーション、すなわち、骨とインプラントの統合の成功は、インプラント表面に生物活性薬物を堆積させるか、またはインプラントを受ける対象に生物活性薬物を同時投与することによって増強することができる。いくつかの実施形態では、生物活性薬物は、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる、すなわち、インプラント表面に堆積させるか、またはコーティングするか、または対象に同時投与する。特定の実施形態では、生物活性薬物は、天然の骨ミネラルに類似するリン酸カルシウム、コラーゲン１型およびエラスチンを含むコラーゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、酵素、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および／または形質転換成長因子－β１（ＴＧＦ－β１）などの成長因子、ならびにｒｈＢＭＰ－２およびｒｈＢＭＰ－７などの組換えヒトＢＭＰを含む骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む（Ａｌｇｈａｍｄｉ， Ｈ．Ｓ．， Ｊ．Ｆｕｎｃｔ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２０１８， ９，７； ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｆｂ９０１０００７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

さらなる実施形態では、薬理学的薬物は、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができ、これらに限定されないが、バイオホスホネートなどの骨吸収抑制薬、ならびにラネル酸ストロンチウムおよびスタチンなどのタンパク質同化薬をインプラントの表面に堆積させるか、またはインプラントの移植前、移植中、もしくは移植後に対象に同時投与する（Ａｌｇｈａｍｄｉ， Ｈ．Ｓ．， Ｊ．Ｆｕｎｃｔ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２０１８， ９，７； Ｍａｉｍｕｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ． ２０１０ Ｍａｙ； ４６（５）： １４３６－４１、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるインプラントコーティングは、バイオホスホネート（ＢＰ）放出コーティングであり、薬理学的薬物は、ＢＰ（例えば、（ｉ）ＨＡ、コラーゲン１型、コンドロイチン硫酸塩およびリン酸カルシウムと組み合わせたアレンドロネート；（ｉｉ）パミンドロネートおよび（ｉｉｉ）イバンドロネートをフィブリノーゲンと一緒にまたは別々の組み合わせで；または（ｉｖ）フィブリノーゲンおよびリン酸カルシウムとともにゾレドロネート（Ｎａｊｅｅｂ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含む徐放性製剤である。

さらなる実施形態では、インプラントを、カルシウムアパタイトの鉱物形態であるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）を主に含む１層または複数層のリン酸カルシウムで、コーティングすることができ、該コーティングは、プラズマ溶射コーティング法によってプラント上に行ってよい（Ｌｅ Ｇｕｅｈｅｎｎｅｃ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３ （２００７） ８４４－８５４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＨＡコーティングは、その後の熱処理を必要とせずに、直接化学的方法によって適用することができる（Ｌｕｋａｓｚｅｗｓｋａ－Ｋｕｓｋａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．２０１８； ２７（８）：１０５５－５９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態では、インプラントを、活性剤、ゾレドロン酸、石灰化した骨に対して高い親和性を有する強力なビスホスホネートでコーティングすることができる。チタンインプラントをゾレドロン酸でコーティングすると、骨とインプラントの接触（ＢＩＣ）、インプラントを囲むインプラント周囲の骨面積（ＢＡ）、骨量／組織量、および骨塩密度（ＢＭＤ）が大幅に増加することがわかった。（Ｓｔｒａｄｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｏｌ． ２５ ２０１３， ｐｐ．３２６－４０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

様々な実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるインプラントコーティングは、酸化ジルコニウムコーティング（「ＺＯＣ」）（インプラント表面をコーティングするためのコロイド懸濁液として調製される）であり、それぞれの対照よりも、ＺＯＣコーティングされたインプラントの周囲の骨の成長がより明白であり、インプラント周囲ＺＯＣ表面に存在する骨がより成熟しているなどの特定の生物学的効果を有することが示されている（Ｓｏｌｌａｚｚｏ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｖｏｌ． ２４（３）， Ｍａｒ． ２００８， ｐｐ．３５７－３６１．、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態では、例えば、Ｔｉ０．５Ｏ０．３Ｃ０．２の化学組成を有する炭素膜をインプラント上にコーティングすることができ、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる追加のインプラントコーティングとしては、ビスホスホネート、骨刺激因子（ＢＭＰを含む、例えば、ｒｈＢＭＰ－２を含むポリラクチド／グリコリド（ＰＬＧＡ）担体；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）とインスリン様成長因子（ＩＧＦ）またはＰＤＧＦ－ＢとＩＧＦの組み合わせ）；生物活性ガラスと生物活性セラミック；フッ化物を含む生物活性インプラントコーティング；およびチタン／窒化チタンコーティングが挙げられるが、これらに限定されない（Ｘｕｅｒｅｂ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， ， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｐｒｏｓｔｈｏｄｏｎｔｉｃｓ， Ｖｏｌ ２８， Ｎｏ．１， ２０１５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

さらなる実施形態では、間葉系幹細胞における骨形成経路の新しい骨形成を刺激するエピジェネティック酵素「ハンサーオブゼステホモログ２」（「ＥＺＨ２」）の阻害剤を、本明細書に記載の実施形態に従って使用して、インプラント表面をコーティングすることができ、ＥＺＨ２阻害剤としては、これに限定されないが、ＢＭＰ－２誘導性骨形成分化も増強する特定のＥＺＨ２阻害剤であるＧＳＫ１２６が挙げられる（Ｄｕｄａｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９１（４７）：２４５９４－２４６０６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらなる実施形態では、骨形成を誘発し、インプラントのオッセオインテグレーションを促進する小分子薬物化合物は、本明細書に記載の実施形態に従って、インプラントコーティングとして使用することができる（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ａｗａｒｄｓ Ｇｒａｎｔ ｔｏ Ｎｕｍｅｒａｔｅ ｔｏ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｂｏｎｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＢｉｏＳｐａｃｅ， Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｗｉｒｅ， Ｎｏｖ． １５， ２０１７）

特定の実施形態では、インプラント表面は、オッセオインテグレーションを改善するための生物活性薬物を含むナノチューブを構成する、すなわち、ナノチューブアレイに装填されている、ＴｉＯ_２ナノチューブアレイを含む。 さらなる実施形態では、チタンインプラントは、インプラントの表面にＴｉＯ_２ナノチューブアレイを含み、ＴｉＯ_２ナノチューブアレイは、ＴｉＯ_２ナノチューブアレイから溶出されるｒｈＢＭＰ－２を含む（Ｌｅｅ， Ｊ－Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｅｂ． ２０１５， Ｖｏｌ． ２０１５：１０（１）， ｐｐ．１１４５－５４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、ＴｉＯ_２ナノチューブは、プロポリス、天然の抗菌物質および抗炎症薬を含む（Ｓｏｍｓａｎｉｔｈ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （Ｂａｓｅｌ） ２０１８， １１（１）， ６１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

さらなる実施形態では、チタンインプラントのオッセオインテグレーション特性を改善することが見出されている原子層堆積の分子層化（ＭＬ－ＡＬＤ）の方法を使用する、ナノグレイン形態のチタンインプラント上の階層的マイクロトポグラフィック／ナノトポグラフィックコーティングの製造は、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる（Ｚｅｍｔｓｏｖａ， Ｅ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１８： １３ ２１７５－２１８８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

さらなる実施形態では、ペプチドコーティングは、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる、すなわち、インプラント、例えば、チタンインプラント、特に、チタンの酸化物表面層（ＴｉＯ_２）に強く吸着する２つのｐＳｅｒ残基で装飾されたβストランドと、それに続く石灰化鉱化作用を誘発するＧｌｕリッチ「テール」で構成される二機能性ペプチドに適用することができる（Ｐｏｖｉｍｏｎｓｋｙ， Ａ．Ｇ． ａｎｄ Ｈ． Ｒａｐａｐｏｒｔ， Ｊ．Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ．Ｂ， ２０１７， ［２｝５， ２０９６－２１０５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらなる実施形態では、オッセオインテグレーションを改善するためにインプラント（例えば、チタンインプラント）にコーティングされ得るペプチドコーティングであって、ペプチドコーティングは、Ｚｈａｏ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．，（［１｝ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．｛１］， ［２｝２０１８｛３］， ［４｝４｛５］ （７）， ｐｐ ２５０５－２５１５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、それぞれ、細胞接着性配列または骨形成配列を有する２つのムール貝に触発された生物活性ペプチドの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、操作されたタンパク質コーティングは、これに限定されないが、チタンベースのインプラント（歯科および整形外科）のオッセオインテグレーションを改善することが見出された拡張ＲＧＤ配列を含む操作されたエラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）が挙げられ、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる（Ｒａｐｈｅｌ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｍａｒ． ２０１６， ｐｐ．２６９－２８２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

特定の実施形態では、炭酸カルシウムコーティングは、骨の早期内殖およびオッセオインテグレーションを改善および促進することが見出されている、サンドブラストおよび酸エッチングされたチタンインプラント上で、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる（Ｌｉｕ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｏｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１７） ９， １３３－１３８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

オッセオインテグレーション改善法の別の実施形態では、チタンインプラント表面をオゾン水で処置（洗浄）することができる。このような処置は、オッセオインテグレーション時間を短縮することがわかっており、実施形態では、インプラント表面を移植前にオゾン水で洗浄することができる（Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈａｒｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ２５９２）：１４９－１５６， ２０１６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態では、インプラント（例えば、チタンインプラント）のオッセオインテグレーションを改善または促進する方法および／または骨修復を促進する方法は、全身的に送達される薬物の治療有効量のさらなる投与方法によって増強されることができ、例えば、これらに限定されないが、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチド、シンバスタチン、プロスタグランジンＥＰ４受容体アゴニスト、ビタミンＤ、ラネル酸ストロンチウムなどの同化骨作用剤、カルシトニン、ビスホスホネート、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧシステム、および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などの化合物を含む抗異化骨作用薬（Ａｐｏｓｔｕ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， （２０１７） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ４９：１， ９２－１０４， ＤＯＩ： １０．１０８０／０３６０２５３２．２０１６．１２７７７３７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）ならびにＤＫＫ１－および抗スクレロスチン抗体、例えば、スクレロスチンおよびＤＫＫ－１の二重阻害のための二重特異性抗体（相乗的な骨形成につながることが示されている）が挙げられる（Ｆｌｏｒｉｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１６； ７： １１５０５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

様々な実施形態では提供される方法のうち、インプラントは歯科インプラントまたは整形外科インプラントである。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に説明するために提示されている。しかし、それらは、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

動物を使用するすべての実験プロトコルは、ＵＣＬＡ動物研究委員会（ＡＲＣ＃１９９７－１３６）によって検討および承認され、実験動物の人道的ケアおよび使用に関するＰＨＳポリシーおよびＵＣＬＡ動物ケアおよび使用トレーニングマニュアルのガイドラインに従った。すべての動物は餌と水を自由に摂取でき、１２時間の明／暗周期で通常の飼育場で飼育された。

統計分析
インビボおよびインビトロでの生物学的アッセイでは、すべてのデータを一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、Ｈｏｌｍ’ｓ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ手順による複数の試料補正によって比較した。すべてのグラフは、特に指定のない限り、平均値±ＳＤを示している。

実施例１
Ｔｉ生体材料に曝露されたヒトＢＭＳＣは時計遺伝子の概日発現パターンを調節した
Ｔｉ生体材料の表面改質
インビトロ研究のために、工業用純Ｔｉディスク（直径３２ｍｍおよび厚さ１ｍｍ）を作製した。Ｔｉディスクの表面を、市販の歯科インプラント（Ｎｅｏｂｉｏｔｅｃｈ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）の製造プロトコルを使用して、ラージグリットと酸エッチングでサンドブラストする（ＳＬＡ）ことによって処理した（図１Ａ）。対照Ｔｉディスクは、機械加工したままであった。Ｔｉディスクの表面は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と光干渉プロフィロメトリー（各群でｎ＝３）によって特徴づけた（図１Ｂおよび１Ｃ）。

マウスのオッセオインテグレーションを評価するためのインビボ研究では、ロッド形の実験用Ｔｉインプラント（長さ４ｍｍ、直径０．６ｍｍ）をマウスの大腿骨骨髄に適合するように設計した。Ｔｉインプラントの表面は、ＳＬＡで処理するか、または機械加工したままにした。各Ｔｉインプラントにハンドルを接続し、ガス滅菌して、個別に包装した。
ヒト骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）における概日リズム遺伝子発現

不死化したヒトＢＭＳＣ（ｉＭＳＣ３、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＢＣ， Ｃａｎａｄａ）を、ポリスチレン３５ｍｍ培養皿、機械加工Ｔｉディスク、またはＳＬＡ処理Ｔｉディスクで培養した（２０，０００細胞／ｃｍ２）。１０μＭフォルスコリンとの同調後２４時間から開始し４８時間まで、各群のＢＭＳＣを４時間ごとに収集し、全ＲＮＡを調製した（各群の各時点でｎ＝４）。Ｔａｑｍａｎベースの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）を、ＰＥＲ１、ＰＥＲ２、ＰＥＲ３、ＢＭＡＬ１、ＣＬＯＣＫ、およびＮＰＡＳ２用の市販のプローブを使用し、ＧＡＰＤＨを内部標準として使用して行った（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）。各時点の振幅（各群でｎ＝６）は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）および事後テューキーＨＳＤ検定によって比較した。異なる培養基質における各時計遺伝子の概日リズムを、Ｙａｎｇ，Ｒ．，およびＳｕ，Ｚ．（２０１０） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６， ｉ１６８－１７４によるトレンド除去された調和回帰分析によって分析した。

結果：
この研究では、機械加工生体材料およびＳＬＡ処理Ｔｉ生体材料を使用した。表面のマイクロトポグラフ特徴と測定値（図１Ａ～１Ｃ）は、公開されたデータ（Ｂｕｓｅｒ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ ８３， ５２９－５３３）と一致していた。

時計遺伝子は２４時間の周期長で変動するため、時計遺伝子の発現に対するＴｉディスクの効果を、同調細胞で４時間ごとに２４時間試験した。従来の培養プレート上に維持されたフォルスコリン同調ヒトＢＭＳＣは、ＰＥＲ１、ＰＥＲ２、およびＰＥＲ３の概日発現を示し、３６時間～４４時間でピーク発現を示した（図１Ｄ）。これは本発明者らの以前の観察と一致した（Ｈａｓｓａｎ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， （２０１７） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２， ｅ０１８３３５９）。ＢＭＳＣをＳＬＡディスクに曝露したとき、２４時間の期間にわたりＮＰＡＳ２の著しい発現増加があった（図１Ｄ）。トレンド除去された調和回帰分析は、Ｔｉ生体材料が試験したすべての時計遺伝子の概日発現パターンを有意に変化させたことを明らかにした（図１Ｅ）。特に、ＳＬＡディスク環境は、ＣｌｏｃｋとＮｐａｓ２の概日タイミングを変化させたが、一方ではＰｅｒ遺伝子の振幅が減少した。また、機械加工Ｔｉディスクの効果は、重要性が低いとはいえ注目された。

この研究の結果により、複雑な表面を有するＴｉ生体材料に曝露されたＢＭＳＣによる増強されたオッセオインテグレーションの確立のための分子調節機構を提案することになった。上述したように、ＳＬＡ処理されたＴｉディスクに曝露されたヒトＢＭＳＣは、Ｎａｎｏｔｉｔｅ（商標）処理されたＴｉディスクを用いて得られた以前のデータで再現性が高かったＮＰＡＳ２の大幅な発現増加を示した（図１Ｄ）が、一方、他の時計遺伝子に対するＴｉディスクの効果は一貫性が低いように見えた。Ｎｐａｓ２はマウス大腿骨ＢＭＳＣで検出されず、したがって、骨のリモデリングおよび恒常性に関与できなかったことが報告されている。現在の発見は、Ｔｉ生体材料によって誘発されたＮｐａｓ２がＢＭＳＣを調節してインプラントのオッセオインテグレーションを促進することを示唆している。

実施例２
マウス大腿骨に配置されたＴｉインプラントはオッセオインテグレーションを示した
マウス大腿骨における実験用Ｔｉインプラント埋入
１０～１５週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスにＴｉインプラントの外科的埋入を施した。イソフルラン吸入による麻酔後、大腿四頭筋－膝蓋骨複合体の側方変位を伴う内側傍膝蓋骨関節切開術を介して遠位大腿骨にアクセスした。大腿顆間ノッチを位置づけた後、大腿髄内管を手動で２５ゲージ針でリーマで広げて管に挿入し、さらに２３ゲージ針でリーマ加工した。Ｔｉインプラントを、マウスの各大腿骨に逆行的に挿入した。Ｔｉインプラントを４ｍｍでクリップし、歯周プローブを使用してさらに４ｍｍ挿入した。大腿四頭筋－膝蓋骨複合体をその解剖学的位置まで縮小し、手術部位を、Ｖｉｃｒｙｌ５－０縫合糸を使用して閉じた。カルプロフェン（５．０ｍｇ／ｋｇ）（Ｒｉｍａｄｙｌ、Ｚｏｅｔｉｓ ＵＳ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）を、手術時および手術後２日間は２４時間ごとに皮下投与した。
オッセオインテグレーションのインプラントプッシュアウト測定

マウスを安楽死させ、所定の治癒時間に大腿骨を収集した。遠位骨端軟骨と大腿骨の内側半分は、過熱することなくインプラントを位置づけるために、歯科用ダイヤモンドディスクを使用して除去した。次いで、大腿骨をアクリル樹脂ブロックに垂直に埋め込んで、インプラントの内側の平らな端を露出させた。機械的保持強度を、１０００Ｎロードセル（Ｉｎｓｔｒｏｎ， Ｃａｎｔｏｎ， ＭＡ）上に取り付けたカスタムメイドのステンレス鋼押し込みロッドを使用して、インプラントを大腿骨骨髄から押し出すことによって測定した。インプラントに軸方向の荷重を１ｍｍ／分のクロスヘッド速度で加え、インプラントの変位と荷重を記録した。変位荷重（Ｎ）をインプラントのプッシュアウト値として使用した。

最初の研究では、機械加工およびＳＬＡインプラント埋入の１、２、３、４、および８週間後にマウスを安楽死させ（それぞれｎ＝３、４、４、４、および４）、時間経過データを取得した。その後の研究では、インプラント埋入の３週間後に大腿骨試料を収集した。

エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＳ）および走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
インプラントプッシュアウト試験後、脱臼させたＴｉインプラントを大腿骨から回収した。インプラント表面をＥＤＳ（前掲４０ＶＰ ＳＥＭ、ＺＥＩＳＳ， Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， ＮＹ）でスキャンした。ＥＤＳ分析は、インプラントの全長を覆う５つのセグメントで完了した。Ｔｉ、カルシウム（Ｃａ）、およびリン（Ｐ）の元素組成を、各インプラントの５つのセグメント測定値の平均から決定した。回収したインプラントを、さらにイリジウム（Ｉｒ）でスパッタコーティングし、ＳＥＭ（前掲４０ＶＰ ＳＥＭ、ＺＥＩＳＳ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で検査した。

Ｔｉインプラントを含むマウス大腿骨の非脱灰組織診断
別の実験では、Ｔｉインプラント埋入後１、２、３、４週間で大腿骨を収集し（各時点でｎ＝４）、１０％緩衝ホルマリンで固定した。大腿骨を最初にｍｉｃｒｏＣＴスキャン（μＣＴ４０、Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｗａｙｎｅ， ＰＡ）にかけ、次いで脱灰されていない縦方向の組織切片のために処理した（Ｒａｔｌｉｆｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔ， ＬＬＣ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， ＴＮ）。ｍｉｃｒｏＣＴ画像をガイドとして使用して、各標本の組織切片（３０μｍ）を接地システムで調製し、Ｇｏｌｄｎｅｒトリクロームで染色した。骨とインプラントの接触（ＢＩＣ）比をインプラントの全周にわたって決定した。

結果：
骨端軟骨と成長板を介して大腿骨の骨髄空間に逆行性のＴｉワイヤーを配置した、または小さなロッドもしくはスクリューを大腿骨の中央に垂直に挿入したマウスインプラントモデルが報告されている。機械加工表面またはＳＬＡ表面を備えた実験用Ｔｉインプラントを、骨端軟骨および成長板と接触することなく、マウス大腿骨骨髄の遠位半分に配置した（図２Ａ～２Ｃ）。機械的保持せん断強度は、オッセオインテグレーションの成功の特徴である。インプラントプッシュアウト試験を、この研究のせん断破壊点での荷重を測定するように設計した（図２Ｄ）。インプラントプッシュアウト試験は、ＳＬＡインプラントと機械加工インプラントの両方で機械的保持強度の進展を示したが、前者は後者よりもはるかに高いインプラントプッシュアウト値を生成した。ＳＬＡインプラントのプッシュアウト値は、インプラント埋入後３週間で増加し、４週間で注目すべき一時的な減少を伴ってプラトーに達した（図２Ｅ）。脱灰されていない組織切片で測定されたＳＬＡインプラントのＢＩＣ比は、１週間～３週間の漸進的増加と、それに続く４週間でのわずかな減少を明らかにした（図２Ｆ）。機械加工インプラントのＢＩＣ比は、ゆっくりと増加した。ＢＩＣ比が大幅な変動を示したことを留意すべきである。このモデルのインプラントプッシュアウト試験では、１０％～１５％のＢＩＣ比は、機械的保持機能に寄与していないように思われる。

プッシュアウト試験後に除去したＴｉインプラントをＥＤＳ分析にかけた。インプラント表面の元素は、主にＴｉ、Ｃａ、Ｐ、Ｏであった（図２Ｇ）。回収したＳＬＡインプラントのＴｉの重量％は、１週間～３週間に徐々に減少し、プラトーに達した。Ｔｉ重量％のＥＤＳデータは、ＢＩＣの逆の傾向を反映した。したがって、はるかに少ない変動で明確な傾向を示した、曝露されたＴｉ重量％のＥＤＳ元素分析は、ＢＩＣの実行可能な代理測定であり得る。ＰとＣａの重量％は３週間まで増加した（図２Ｈ）。３週間と４週間でプラトーに達すると、ＳＬＡインプラントのＣａとＰの測定値は安定した比率を維持した。

実施例３
大腿骨の異常がないＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－のマウス
Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスの大腿骨の特徴
Ｃ５７Ｂｌ／６ＪバックグラウンドのＮｐａｓ２＋／－マウス（２４）は、凍結保存された精子試料（Ｂ６．１２９Ｓ６－Ｎｐａｓ２ｔｍ１Ｓｌｍ／Ｊ， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から生成され、ＵＣＬＡで活発な繁殖コロニーが確立された。遺伝子型をＰＣＲによって決定した。Ｃ５７Ｂｌ６Ｊ野生型（ＷＴ：Ｎｐａｓ２＋／＋）、Ｎｐａｓ２＋／－、およびＮｐａｓ２－／－マウスの大腿骨の解剖学的長さを測定し、マイクロＣＴで特徴づけた。大腿骨を、ＣａとＰについてＥＤＳによっても評価した。

結果：
Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスにおける大腿骨異常がない
Ｎｐａｓ２の機能的なベーシックヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）ドメインは、主に、ＬａｃＺ／Ｎｅｏカセットに置き換えられたエクソン３によってコードされ（図３Ａ）、ＤＮＡ結合ｂＨＬＨドメインなしでＮｐａｓ２分子が合成される。ＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－、およびＮｐａｓ２－／－マウスから収集した大腿骨は、解剖学的サイズと形状（図３Ｂ）および内部の骨梁構造（図３Ｃおよび３Ｄ）の点で区別がつかなかった。したがって、Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスを、この研究でインプラントのオッセオインテグレーション機構を調査するための適切なマウスモデルであると決定した。

実施例４
Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異は、ＳＬＡ表面とのインプラントオッセオインテグレーションを減少させたが、機械加工表面とは減少させなかった
ＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスにおけるインプラントオッセオインテグレーション
記載のように、１０～１５週齢の雄のＷＴ、Ｎｐａｓ２＋／－、およびＮｐａｓ２－／－マウスの大腿骨にＴｉインプラントを投与した。インプラント埋入から３週間後、マウスの大腿骨を収集し、インプラントのプッシュアウト試験を行った。インプラントのプッシュアウト試験後、除去したＴｉインプラントを大腿骨骨髄から注意深く回収し、ＥＤＳおよびＳＥＭ分析にかけた。別の実験では、インプラント埋入の３週間後に大腿骨を収集し、組織学的観察のためにプラスチックを埋め込んだ大腿骨とインプラントの非脱灰縦断切片を作成した。

結果：
Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異は、ＳＬＡ表面とのインプラントのオッセオインテグレーションを減少させたが、機械加工表面は減少させなかった。
Ｎｐａｓ２ ＫＯマウスの大腿骨に３週間インプラントを埋入した後のオッセオインテグレーションに対するＮｐａｓ２の役割を調べた。ＳＬＡインプラントのプッシュアウト値は、ＷＴマウスと比較してＮｐａｓ２＋／－マウスとＮｐａｓ２－／－マウスの両方で大幅に減少した（図４Ａ）。対照的に、機械加工インプラントのプッシュアウト値は、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異の影響を受けなかった。非脱灰組織学により、ＷＴおよびＮｐａｓ２ ＫＯマウスのＴｉインプラント周囲の骨組織の形成が明らかになった。骨とインプラントの接触が、ＷＴマウスとＮｐａｓ２ ＫＯマウスで生じるようであった（図４Ｂ）。実験用インプラントをプッシュアウト試験後に回収し、ＳＥＭ分析にかけた。ＷＴマウスから回収したＳＬＡインプラントの表面は、組織残遺物で広く覆われていたが、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスから回収したものは、Ｔｉ基材を露出する多数のパンチ穴とともに独特の細網構造の組織残遺物を有した（図４Ｃ）が、機械加工インプラントには組織の付着がなかった（データ不図示）。

ＥＤＳ分析により、ＷＴマウスから回収されたインプラントよりもＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスから回収されたインプラントの方がはるかに高いＴｉ含有量であることが明らかになった（図４Ｄ）。界面組織による被覆面積は、インプラントの表面全体のＴｉ重量％から推定された。

２π０．６ｘ４．０ｘ（１００－Ｔｉ％）／１００（ｍｍ２）、これはＷＴマウスよりもＮｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスにおいて大幅に小さかった（図４Ｆ）。ＥＤＳ分析から推定されるＣａ／Ｐ比（図４Ｅ）は、ＳＬＡインプラントおよび大腿骨表面の両組織残遺物についてＮｐａｓ２ ＫＯ変異の影響を示さなかった。

Ｎａｐｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウス内に配置されたＳＬＡインプラント上に形成された異常組織
次いで、界面組織の被覆がインプラントの機械的保持強度に影響を与えたかどうかを調べた。回帰分析により、ＷＴマウス内に配置されたインプラントに正の相関関係があることが明らかになった（Ｒ２＝０．５５１、図４Ｆ）。対照的に、Ｎｐａｓ２ ＫＯマウス内に配置されたインプラントの組織被覆面積とインプラントプッシュアウト値との間に相関関係はなかった。これらのデータは、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異が、骨とインプラントの結合を促進する界面組織に影響を及ぼしたことを示している。高倍率のＳＥＭ画像は、ＷＴマウスから回収されたインプラントの組織残遺物中に交差構造を有する十分に発達したコラ－ゲン繊維を示す（図４Ｇ）。対照的に、コラーゲン構造は、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスから回収されたインプラントの組織残遺物ではあまり見えなかった。

本研究では、微細なマウス大腿骨Ｔｉインプラントモデル（図２Ａ～２Ｃ）をＮｐａｓ２ ＫＯマウスに適用した。Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異は、ＳＬＡインプラントのオッセオインテグレーションの確立を著しく損なうことがわかった。Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスは、インプラントプッシュアウト値の大幅な減少を示した（図４Ａ）。さらに、組織学的骨組織は影響を受けていないように見えたが、ＢＩＣの代理測定としてのＥＤＳベースのＴｉ元素分析は、変異動物において骨とインプラントの接触面積の減少を示唆した（図４Ｆ）。ＢＭＳＣでのＮｐａｓ２の発現は、Ｔｉ基材との密接な接触によってのみ増加したことを考慮すれば、Ｎｐａｓ２ ＫＯ変異の下流の表現型が界面組織に影響を与える可能性がある。回収されたインプラントの組織残遺物は、骨とインプラントの間の界面組織である可能性が高く、Ｎｐａｓ２＋／－およびＮｐａｓ２－／－マウスで形成された界面組織は、十分に組織化されたコラ－ゲン繊維が欠如していた（図４Ｇ）。Ｎｐａｓ２は、コア概日分子時計と配列が類似しているｂＨＬＨ転写因子である。しかし、ＳＣＮ内のその分布の欠如は、Ｎｐａｓ２が中央時計のコア概日リズムの維持にあまり関与していない可能性があるが、末梢組織でより主要な役割を果たす可能性があることを示唆している。マウス肝臓組織のＤＮＡ塩基配列決定（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）によるクロマチン免疫沈降は、Ｎｐａｓ２関連の標的遺伝子が概日リズム関連遺伝子に限定されなかったことを示した。報告されてきたように、ｂＨＬＨ転写因子がＢＭＳＣ分化に影響を与えることが知られている。したがって、本発明者らは、Ｔｉ生体材料によって誘発されたＮｐａｓ２が、オッセオインテグレーションを確立するのに適したＢＭＳＣ挙動を修正し得ると推測する。

実施例５
化学遺伝学的解析は、Ｎｐａｓ２の発現増加機構が神経骨格経路の変化を伴うことを示唆した
この研究では、化学遺伝学戦略を使用して、Ｔｉ生体材料によって誘発されたＮｐａｓ２を明白に示す 機構をさらに調べた。化学遺伝学は、環境の手がかりに応答するシグナル伝達経路を分析するのに適している可能性がある小分子ツールを使用した生物系の研究として定義されている。

化学遺伝学的解析
Ｎｐａｓ２－／－マウスから収集した大腿骨ＢＭＳＣは、以前にＬａｃＺ発現について特徴づけられており、この研究では、薬理学的に活性な化合物のライブラリ（ＬＯＰＡＣ（登録商標）１２８０）のハイスループット、不偏のスクリーニングのために使用した。（Ｈａｓｓａｎ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．，（２０１７） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２， ｅ０１８３３５９）。３８４ウェルプレートを使用して、各ウェルに１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含む２５μＬの非フェノールレッドＤＭＥＭを充填し、５００ｎＬのピンツール（Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を使用して５０ｎＬのＬＯＰＡＣ（登録商標）１２８０化合物（最終濃度：１μＭ）を添加した。各ウェルに、ＢＭＳＣ（Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ）を１５００細胞／２５μＬ懸濁液として入れ、室温で１時間インキュベートした後、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺの発現を測定するために、市販のアッセイ（Ｂｅｔａ－Ｇｌｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｓｕｍｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＣＡ）を使用してβ－ガラクトシダーゼ活性を測定した。

Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ発現データを、オンラインデータ分析ツール（ＣＤＤ Ｖａｕｌｔ， Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｉｎｃ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）にアップロードして、データを正規化し、Ｚファクターを計算した。この研究では、ヒット化合物をＺスコア＞２．５または＜－２．５として選択した。

選択したヒット化合物（最終濃度：１μＭ）を、マウスＢＭＳＣ（Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ）を使用して３つ組の３８４ウェルプレートで検証した。化合物は、未処理の細胞と比較して、ＢＭＳＣのβ－ガラクトシダーゼ活性を大幅に増加または減少させた。候補化合物のクラス、作用機構、および関連する機能は、ＣＣＤＶａｕｌｔデータベースおよび文献のレビューから取得した。

ヒトＢＭＳＣによるアドレナリン受容体の発現
上記のようにポリスチレンプレート、ＳＬＡ処理Ｔｉディスクまたは機械加工Ｔｉディスク上で培養されたヒトＢＭＳＣから単離された全ＲＮＡを、α１ａ、α１ｂ、α１ｄ、α２ａ、α２ｂ、α２ｃ、β１、β２およびβ３アドレナリン受容体の定常状態のｍＲＮＡレベルについて、ＴａｑｍａｎベースのＲＴＰＣＲを使用して調べた。

結果：
化学遺伝学的解析は、神経骨格経路の変化が関わるＮｐａｓ２の発現増加機構を示唆した
Ｎｐａｓ２－／－マウスに由来する大腿骨ＢＭＳＣは、ＬａｃＺ（２２）の発現について以前に特徴づけられおり、ＬＯＰＡＣ（登録商標）１２８０のハイスループットスクリーニングに使用された（図５Ａ）。Ｚスコア＞２．５または＜－２．５について分析されたスクリーニングの出力データは、合計２４のヒット、７つのＮｐａｓ２－発現増加化合物と１６のＮｐａｓ２－減少化合物をもたらした（図５Ｂ）。検証研究により、化学遺伝学的解析を受けた合計１４種の化合物が特定された（図５Ｃ）。Ｎｐａｓ２増加化合物は、細胞内ｃＡＭＰを減少させるか、α２アドレナリン受容体を刺激することがわかった（表１）。対照的に、Ｎｐａｓ２を減少させる化合物は、ｃＡＭＰを刺激または蓄積するか、またはｃＡＭＰ応答エレメント結合（ＣＲＥＢ）の活性化を誘導する。

骨芽細胞のβ２アドレナリン受容体が主要な役割を果たすと考えられている神経骨格調節として、交感神経系が骨リモデリングに及ぼす影響が広く調査されている（図５Ｄ）。不偏の化学遺伝学的解析は、Ｎｐａｓ２の発現増加がα２アドレナリン受容体に関わる可能性があることを示唆した。Ｔｉディスクに曝露されたヒトＢＭＳＣを調べたところ、ＳＬＡディスクによるα２Ａ、α２Ｂ、およびα２Ｃアドレナリン受容体の発現の大幅な増加が見られたが、β２アドレナリン受容体は影響を受けなかった（図５Ｅ）。

Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺレポーター遺伝子発現による薬理学的に活性な化合物のハイスループットスクリーニングにより、３つの経路で既知の機能を有する小分子が得られた。第１の群は、細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達を調節する共通の機能に集まっていた。ｃＡＭＰを増加または減少させる化合物は、それぞれ、Ｎｐａｓ２発現を減少または増加させることが見出された（表１）。第２の群は、Ｎｐａｓ２を増加させるα２アドレナリン受容体のアゴニストで構成されていた。第３の群は細胞骨格を分解することが知られており、ＢＭＳＣの生存能力を低下させ、Ｎｐａｓ２－ＬａｃＺ活性の検出を人為的に低くし得る。化合物機能の第１および第２の群は、Ｔｉ生体材料によって誘発されたＮｐａｓ２におけるα２アドレナリン受容体の活性化の関与の可能性を示唆した。実際に、ＳＬＡ処理Ｔｉディスクに曝露されたヒトＢＭＳＣは、α２アドレナリン受容体の大幅な発現増加を示した（図５Ｅ）。アゴニスト活性化α２アドレナリン受容体は、抑制性Ｇタンパク質（Ｇｉ）に対して最も高い親和性でＧタンパク質へのカップリングを活性化することが示されている。α２アドレナリン受容体活性化Ｇｉタンパク質は、アデニル酸シクラーゼ活性を低下させ、細胞内ｃＡＭＰを低下させる。

マウスｉＰＳ細胞の骨形成分化中、β２アドレナリン受容体ｍＲＮＡは一貫して発現していることがわかったが、α２アドレナリン受容体ｍＲＮＡは検出されなかった。β２アドレナリン受容体の活性化は、ｃＡＭＰシグナル伝達を介してマウスＢＭＳＣの骨形成に関与していた。骨リモデリングに対する神経伝達物質の影響は、神経骨格調節として知られており、主にＢＭＳＣのβ２アドレナリン受容体が関わっている。α２アドレナリン受容体アゴニストおよびβ２アドレナリン受容体遮断薬は、一般的に高血圧症の治療に使用されている。βアドレナリン受容体の非選択的遮断薬は、ラットのインプラントオッセオインテグレーションを増強することが示された。最近の後ろ向き臨床コホート研究は、降圧薬の使用がより高い歯科インプラント残存と関連していることを報告した。

コンタクトガイダンスとは、細胞が基材生体材料のパターンに従って配向と形状を調整する現象を指す。コンタクトガイダンスの効果は、さらに、付着細胞のシグナル伝達を広げ、粗い表面と滑らかな表面の間で異なる細胞挙動をもたらす。しかし、細胞挙動の複雑さは、オッセオインテグレーションの経路を決定するための障壁となってきた。この研究の結果は、促進されたオッセオインテグレーションの分子機構および細胞機構を明らかにするための新しい手がかりを提供した。ここで、本発明者らは、増強されたオッセオインテグレーションの確立につながるＢＭＳＣの分子機構としての神経骨格調節経路の変更を提案する。Ｔｉ生体材料によって誘発されるα２アドレナリン受容体の発現およびＮｐａｓ２の発現増加も、オッセオインテグレーションを改善する、またはインプラント・骨統合を再確立するための将来の治療戦略に光を当てることができる。

実施例６
メチルドパはインビボでインプラントのオッセオインテグレーションを改善する
Ｂ－ＤＡＥ－ＤＣＤ表面を用いたマウスの実験用インプラント研究を、インプラントプッシュアウト試験を使用してオッセオインテグレーションの時間経過について試験した。図６Ａに示すように、プッシュアウト値は２週目（Ｗ２）から増加し、さらに３週目（Ｗ３）まで増加した。したがって、Ｗ２でのＮｐａｓ２増加化合物（メチルドパ）の効果を試験した。

図６Ｂは、機械加工表面（滑らかな表面）またはＢ－ＤＡＥ－ＤＣＤ表面（粗い表面）がマウスの大腿骨に配置された実験用インプラント研究の結果を示す。マウスを、メチルドパ（Ｌ－（－）－ａ－メチルドパ：ＣＡＳ５５５－３０－０６、０．９％ＮａＣｌ溶液中７５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射で毎日、またはＩＰ注射によるビヒクル０．９％ＮａＣｌで２週間処置した。インプラント手術の２週間後にマウスの大腿骨を収集し、インプラントのプッシュアウト試験を行った。化合物（メチルドパ）で処置したマウスは、ビヒクルで処置した対照マウスよりも大きなプッシュアウト値を示した；^＊：ｐ＜０．０５ｖｓ．化合物なしの機械加工インプラント。

このインビボでの研究は、Ｎｐａｓ２アップレギュレーター化合物メチルドパが初期の治癒段階でインプラントのオッセオインテグレーションを改善することを示している。

本明細書で引用された刊行物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

実施例は、本発明の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかし、実施例は、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

添付の図面を参照して本発明の特定の実施形態を説明したが、本発明は正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本明細書内の種々の変更および修正が当業者によって影響を受け得ることを理解されたい。

Claims (67)

1. 対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを増強または促進するための方法であって、前記骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させることを含む方法。
2. ＮＰＡＳ２の発現が、Ｎｐａｓ２調節化合物を前記対象に投与することによって増加する、請求項１に記載の方法。
3. 前記インプラントが、チタン、チタン合金、クロムまたは鋼を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記インプラントが、滑らかな表面および／または複雑な表面を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、インプラント位置において前記インプラントの移植と同時に前記骨髄に投与される、請求項２に記載の方法。
6. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、前記インプラントの移植前に前記骨髄に投与される、請求項２に記載の方法。
7. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、前記インプラントの移植後に前記骨髄に投与される、請求項２に記載の方法。
8. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、前記インプラントの移植前に前記インプラントの表面上にコーティングされる、請求項２に記載の方法。
9. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、Ｎｐａｓ２を発現増加させる、請求項２に記載の方法。
10. Ｎｐａｓ２の発現増加が、細胞内ｃＡＭＰを減少させる、請求項９に記載の方法。
11. Ｎｐａｓ２の発現増加が、α２アドレナリン受容体発現を刺激する、請求項９に記載の方法。
12. 前記α２アドレナリン受容体が、α２Ａ－、α２Ｂ－および／またはα２Ｃ－アドレナリン受容体である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、アデノシンＡ１受容体アンタゴニストであり、前記アデノシンＡ１受容体アンタゴニストが、アデノシン受容体Ａ２よりもアデノシン受容体Ａ１に対して選択性を有する、請求項２に記載の方法。
14. 前記アデノシンＡ１受容体アンタゴニストが、８－（ｐ－スルホフェニル）テオフィリンである、請求項１３に記載の方法。
15. アデノシンＡ１受容体アンタゴニストが、１，３－ジプロピル－８－フェニルキサンチン、８－（２－アミノ－４－クロロフェニル）－１，３－ジプロピルキサンチン、１－イソアミル－３－イソブチルキサンチン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－メチル－２－フェニルエチル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－フェニルプロピル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、１，３－ジプロピル－８－シクロペンチルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）、８－シクロペンチル－１，３－ジメチルキサンチン（ＣＰＸ）、１，３－ジプロピル－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ロロフィリン）、１－ブチル－３－（３－ヒドロキシプロピル）－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ＰＳＢ－３６）、１，３－ジプロピル－８－［２－（５，６－エポキシノルボニル）］－キサンチン（ナキシフィリン）、ジシクロプロピルメチル（ＭＰＤＸ）、１，３－ジプロピル－８－［１－（４－プロピオネート）－ビシクロ－［２，２、２］オクチル］キサンチン（トポナフィリン）、３－（２－（４－アミノフェニル）エチル）－８－ベンジル－７－（２－（エチル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）－１－プロピルキサンチン（Ｌ－９７－１）およびその類似体または塩からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記アデノシンＡ１受容体アンタゴニストが、２－アミノチアゾール誘導体からなる群から選択される非キサンチン化合物である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤である、請求項２に記載の方法。
18. 前記Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤が、５－（４－フェニルブトキシ）ソラレン（Ｐｓｏｒａ－４）である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤が、５－（３－フェニルプロポキシ）ソラレン（Ｐｓｏｒａ－３）、５－（５－フェニルペントキシ）ソラレン（Ｐｓｏｒａ－５）、５－（４－ビフェニリル）－メトキシソラレン（「Ｐｓｏｒａ－９」）（Ｐｓｏｒａ－９）および５－（４－フェノキシブトキシ）－ソラレン（ＰＡＰ－１）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤である、請求項２に記載の方法。
21. 前記Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤が、さらにα２アドレナリン受容体アゴニストであり、前記化合物が、Ｌ，－メチルドパまたはその類似体もしくは誘導体である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤が、カルビドパ、ベンセラジドα－ジフルオロメチルドパおよびそれらの類似体からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
23. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、イミダゾリン－１受容体アゴニストである、請求項２に記載の方法。
24. 前記イミダゾリン－１受容体アゴニストが、ハルマンである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記イミダゾリン－１受容体アゴニストが、クロニジン塩酸塩もしくはクロニジン類似体、ナファゾリン塩酸塩、ナファゾリン塩酸塩、キシロメタゾリン塩酸塩、モクソニジン塩酸塩、リルメニジンヘミフマル酸塩、２－アミノチアゾリン誘導体、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
26. 前記２－アミノチアゾリン誘導体が、２－ジエチル－２－アミノチアゾリン、２－エチル－ヘキシルアミン－２－アミノチアゾリンおよびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記イミダゾリン－１受容体アゴニストが、マルサニジン、７－メチル－マルサニジン、７－Ｃｌ－マルサニジン、７－Ｆ－マルサニジンおよびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
28. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、メチセルジド、アメセルジドおよびメチルエルゴメトリンからなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項２に記載の方法。
29. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤であり、前記ＰＤＥ阻害剤がＰＤＥ３阻害剤である、請求項２に記載の方法。
30. 前記ＰＤＥ３阻害剤が、シロスタゾール、シロスタゾール類似体、ミルリノン、アムリノン、ペルリノン、エノキシモン、ピモベンダン、メリベンダン、シロスタミド、ＯＰＣ－３３５４０およびトレキンシンからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記滑らかな表面のインプラントが複雑な表面をさらに含む、請求項４に記載の方法。
32. 前記複雑な表面が、ラージグリットと酸エッチングを使用したサンドブラスト（ＳＬＡ）によって作成される、請求項３１に記載の方法。
33. Ｎｐａｓ２の発現増加が、前記インプラントの表面に曝露されたヒト骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）中で起こり、前記表面が滑らかな表面および／または複雑な表面である、請求項１または３１のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記ＢＭＳＣ中のＮｐａｓ２の発現増加が、骨とインプラントの間の界面組織における前記骨と前記インプラント表面の結合を促進する、請求項３３に記載の方法。
35. 前記ＢＭＳＣ中のＮｐａｓ２の発現増加が、前記界面組織上の高密度コラ－ゲン繊維の合成を刺激し、前記コラーゲン構造が交差している、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ＢＭＳＣ中のＮｐａｓ２の発現増加が、前記インプラント表面での高密度コラ－ゲン繊維の合成をさらに刺激し、前記コラーゲン構造が交差している、請求項３５に記載の方法。
37. 前記インプラントが、歯科インプラントまたは整形外科インプラントである、請求項１に記載の方法。
38. ＮＰＡＳ２の発現が、アデノウイルスベクターを前記対象に投与することによって増加し、前記アデノウイルスベクターが、ヒトＮＰＡＳ２ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
39. 前記アデノウイルスベクターが、インプラント位置において前記対象に投与される、請求項３８に記載の方法。
40. 前記アデノウイルスベクターが、前記インプラント位置での前記インプラントの移植と同時に、前記骨髄に投与される、請求項３８に記載の方法。
41. 前記アデノウイルスベクターが、前記インプラントの移植前に前記骨髄に投与さる、請求項３８に記載の方法。
42. 前記アデノウイルスベクターが、前記インプラントの移植後に前記骨髄に投与される、請求項３８に記載の方法。
43. 対象の骨髄へのインプラントのオッセオインテグレーションを促進するための方法であって、ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたはＮｐａｓ２調節化合物を含む医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＮＰＡＳ２ポリペプチドまたは前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、前記骨髄における末梢時計ニューロンＰＡＳドメインタンパク質２（ＮＰＡＳ２）の発現を増加させる、方法。
44. 前記インプラントが、チタン、チタン合金、クロムまたは鋼を含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記インプラントが、含む、前記インプラントが、滑らかな表面および／または複雑な表面を含む、請求項４３に記載の方法。
46. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、アデノシン受容体Ａ２よりもアデノシン受容体Ａ１に対して選択性を有するアデノシンＡ１受容体アンタゴニストである、請求項４３に記載の方法。
47. 前記アデノシンＡ１受容体アンタゴニストが、８－（ｐ－スルホフェニル）テオフィリンである、請求項４６に記載の方法。
48. アデノシンＡ１受容体アンタゴニストが、１，３－ジプロピル－８－フェニルキサンチン、８－（２－アミノ－４－クロロフェニル）－１，３－ジプロピルキサンチン、１－イソアミル－３－イソブチルキサンチン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－メチル－２－フェニルエチル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、（Ｒ）－３，７－ジヒドロ－８－（１－フェニルプロピル）－１，３－ジプロピル－１Ｈ－プリン－２，６－ジオン、１，３－ジプロピル－８－シクロペンチルキサンチン（ＤＰＣＰＸ）、８－シクロペンチル－１，３－ジメチルキサンチン（ＣＰＸ）、１，３－ジプロピル－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ロロフィリン）、１－ブチル－３－（３－ヒドロキシプロピル）－８－（３－ノラダマンチル）キサンチン（ＰＳＢ－３６）、１，３－ジプロピル－８－［２－（５，６－エポキシノルボニル）］－キサンチン（ナキシフィリン）、ジシクロプロピルメチル（ＭＰＤＸ）、１，３－ジプロピル－８－［１－（４－プロピオネート）－ビシクロ－［２，２、２］オクチル］キサンチン（トポナフィリン）、３－（２－（４－アミノフェニル）エチル）－８－ベンジル－７－（２－（エチル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）エチル）－１－プロピルキサンチン（Ｌ－９７－１）およびその類似体または塩からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
49. 前記アデノシンＡ１受容体アンタゴニストが、２－アミノチアゾール誘導体からなる群から選択される非キサンチン化合物である、請求項４６に記載の方法。
50. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、５－（４－フェニルブトキシ）ソラレン（Ｐｓｏｒａ－４）であるＫｖ１．３カリウムチャネル阻害剤である、請求項４３に記載の方法。
51. 前記Ｋｖ１．３カリウムチャネル阻害剤が、５－（３－フェニルプロポキシ）ソラレン（Ｐｓｏｒａ－３）、５－（５－フェニルペントキシ）ソラレン（Ｐｓｏｒａ－５）、５－（４－ビフェニリル）－メトキシソラレン（「Ｐｓｏｒａ－９」とも呼ばれる）（Ｐｓｏｒａ－９）、および５－（４－フェノキシブトキシ）－ソラレン（ＰＡＰ－１）からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
52. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物がＬ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤である、請求項４３に記載の方法。
53. 前記Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤が、さらにα２アドレナリン受容体アゴニストであり、前記化合物がＬ，－メチルドパまたはその類似体もしくは誘導体である、請求項５２に記載の方法。
54. 前記Ｌ－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤が、カルビドパ、ベンセラジドα－ジフルオロメチルドパおよびそれらの類似体からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
55. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、イミダゾリン－１受容体アゴニストである、請求項４３に記載の方法。
56. 前記イミダゾリン－１受容体アゴニストが、ハルマンである、請求項５５に記載の方法。
57. 前記イミダゾリン－１受容体アゴニストが、クロニジン塩酸塩もしくはクロニジン類似体、ナファゾリン塩酸塩、ナファゾリン塩酸塩、キシロメタゾリン塩酸塩、モクソニジン塩酸塩、リルメニジンヘミフマル酸塩、２－アミノチアゾリン誘導体、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
58. 前記２－アミノチアゾリン誘導体が、２－ジエチル－２－アミノチアゾリン、２－エチル－ヘキシルアミン－２－アミノチアゾリン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
59. 前記イミダゾリン－１受容体アゴニストが、マルサニジン、７－メチル－マルサニジン、７－Ｃｌ－マルサニジン、７－Ｆ－マルサニジン、およびそれらの類似体または誘導体からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
60. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、メチセルジド、アメセルジド、およびメチルエルゴメトリンからなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項４３に記載の方法。
61. 前記Ｎｐａｓ２調節化合物が、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤であり、前記ＰＤＥ阻害剤が、ＰＤＥ３阻害剤である、請求項４３に記載の方法。
62. 前記ＰＤＥ３阻害剤が、シロスタゾール、シロスタゾール類似体、ミルリノン、アムリノン、ペルリノン、エノキシモン、ピモベンダン、メリベンダン、シロスタゾール、ＯＰＣ－３３５４０、およびトレキンシンからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
63. ＮＰＡＳ２の発現が、前記対象にアデノウイルスベクターを投与することによってさらに増加し、前記アデノウイルスベクターがヒトＮＰＡＳ２ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項４３に記載の方法。
64. 前記アデノウイルスベクターが、インプラント位置において前記対象に投与される、請求項６３に記載の方法。
65. 前記アデノウイルスベクターが、前記インプラント位置での前記インプラントの移植と同時に前記骨髄に投与される、請求項６３に記載の方法。
66. 前記アデノウイルスベクターが、前記インプラントの移植前に前記骨髄に投与される、請求項６３に記載の方法。
67. 前記アデノウイルスベクターが、前記インプラントの移植後に前記骨髄に投与される、請求項６３に記載の方法。
    

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