JP2022506649A - Ｐｅｇ化タンパク質の精製方法 - Google Patents

Ｐｅｇ化タンパク質の精製方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022506649A
JP2022506649A JP2021524180A JP2021524180A JP2022506649A JP 2022506649 A JP2022506649 A JP 2022506649A JP 2021524180 A JP2021524180 A JP 2021524180A JP 2021524180 A JP2021524180 A JP 2021524180A JP 2022506649 A JP2022506649 A JP 2022506649A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
kda
pegylated
pegylated protein
protein
ion exchange
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021524180A
Other languages
English (en)
Inventor
ユー，デチアン
パガノ，ジョン
フェロツ，ハシン
ソン，ユアンリ
ゴーシュ，サンチャイタ
リ，ジェンジアン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of JP2022506649A publication Critical patent/JP2022506649A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]

Abstract

本明細書は、高濃度(例えば、少なくとも６ｇ/リットル)のＰＥＧ化タンパク質をロードする工程、およびＰＥＧ化タンパク質を回収する工程を含む、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＰＥＧ化タンパク質を精製するための新規方法を提供する。

Description

(関連出願の相互参照)
本願は、２０１８年１１月５日出願の米国仮特許出願第６２/７５６,０２０号についての優先権の利益を主張するものであり、その全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる。
背景分野
ポリエチレングリコール分子(ＰＥＧ)の共有結合によるタンパク質またはバイオ医薬品の化学修飾は、未修飾タンパク質またはバイオ医薬品に比べて、いくつかの重要な利点、例えば、半減期の長期化、水溶解性の増強、毒性の低下、腎クリアランス率の低下、修飾タンパク質またはバイオ医薬品の免疫原性および抗原性の低下を提供することができる。これらの利点は、主に、中性で化学的に不活性な親水性のＰＥＧポリマーにより、分子サイズ(流体力学的半径)が顕著に増大すること、ならびに表面の変化および保護(「マスキング」)に起因すると考えられる。
ＰＥＧ化タンパク質の製造に関連する課題の１つは、ＰＥＧ化処理により不均質な生成物が生じることであって、例えば、未反応の天然タンパク質、未反応のＰＥＧおよび様々なＰＥＧ化部位および様々な結合度を持つＰＥＧ化された物質が挙げられる。ＰＥＧ化生成物を、治療薬として使用する場合、ＰＥＧ化治療分子を望ましくない残留不純物から精製することが必要である。
現在、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、最も一般的な静電気的相互作用クロマトグラフィー(イオン交換クロマトグラフィー、ＩＥＣ)などのＰＥＧ化タンパク質を精製するためのいくつかの方法が使用されている。しかし、ＰＥＧポリマーの性質に関連するいくつかの要因のために、ＰＥＧ化タンパク質の精製は複雑である。ＰＥＧポリマーは、中性かつ親水性であり、水溶液への溶解度は温度に反比例して低下する。ＰＥＧおよびＰＥＧ化タンパク質を含むＰＥＧ化反応生成物の混合物には、起泡性、粘性、およびタンパク質またはポリマーの沈殿が認められることがある。ＰＥＧ化生成物は、高分子量ポリマーであるため、表面に非特異的に吸着し、水溶液の粘度を増加させる傾向がある。この特徴のため、クロマトグラフィーによる精製を目的とした場合、クロマトグラフィー媒体の容量に合わせてローディング液の濃度を、約１グラム/リットルに下げねばならず、そのことで収率が低下し、高コストの精製方法となる。
そのため、純粋なＰＥＧ化生成物をより高い収率で得ることができる、迅速かつ経済的なＰＥＧ化生成物の精製方法の開発が求められている。
(本発明の要旨)
本明細書は、イオン交換クロマトグラフィーを用いたＰＥＧ化生成物の効率的な精製方法を提供するものである。驚くべきことに、実践されているクロマトグラフィーの原理に反して、分離マトリックスにロードされるＰＥＧ化タンパク質濃度を増加させると、イオン交換マトリックスの結合容量が予想外に増加すること、および／またはＰＥＧ化生成物の精製収率が向上することが判った。本発明の方法により、時間およびコスト双方の節約となる：(１)ロードされるタンパク質濃度を増加することにより、精製サイクルの回数が減少し、そして(２)実測されるマトリックスの高い結合容量により、クロマトグラフィーマトリックスの洗浄頻度および交換の必要性が低減する。
それ故に、いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換クロマトグラフィーマトリックス上に少なくとも６ｇ／リットルの高濃度にてＰＥＧ化タンパク質をロードする工程、およびＰＥＧ化タンパク質を回収する工程を含む、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、１ｇ／Ｌの濃度でロードして回収されるＰＥＧ化タンパク質の収量と比較して、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、回収されるＰＥＧ化タンパク質の収量が増加する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、回収されるＰＥＧ化タンパク質の収量が、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍または約４０倍増加する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、ＰＥＧ化タンパク質を１ｇ／Ｌの濃度でロードした場合のイオン交換マトリックスのローディング容量と比較して、イオン交換マトリックスのローディング容量が増加する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換マトリックスのローディング容量が、６ｇから、約７ｇ、約８ｇ、約９ｇ、約１０ｇ、約１１ｇ、約１２ｇ、約１３ｇ、約１４ｇ、約１５ｇ、約１６ｇ、約１７ｇ、約１８ｇ、約１９ｇまたは約２０ｇのＰＥＧ化タンパク質／マトリックス１Ｌのローディング容量まで増加する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、ＰＥＧ化タンパク質を１ｇ／Ｌの濃度でロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、イオン交換マトリックスの結合容量の増加をもたらす、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換マトリックスの結合容量が、ＰＥＧ化タンパク質を１ｇ／Ｌの濃度でロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約１.１倍、約１.２倍、約１.３倍、約１.５倍、約１.６倍、約１.７倍、約１.８倍、約１.９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍または約３０倍となる、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量が、少なくとも７ｇ、少なくとも７.５ｇ、少なくとも８ｇ、少なくとも８.５ｇ、少なくとも９ｇ、少なくとも９.５ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも１０.５ｇ、少なくとも１１ｇ、少なくとも１１.５ｇ、少なくとも１２ｇ、少なくとも１２.５ｇ、少なくとも１３ｇ、少なくとも１３.５ｇ、少なくとも１４ｇ、少なくとも１４.５ｇ、少なくとも１５ｇ、少なくとも１５.５ｇ、少なくとも１６ｇ、少なくとも１６.５ｇまたは少なくとも１７ｇのＰＥＧ化タンパク質／マトリックス１Ｌである、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、回収されたＰＥＧ化タンパク質が、少なくとも約２０％の純度、少なくとも約２５％の純度、少なくとも約３０％の純度、少なくとも約３５％の純度、少なくとも約４０％の純度、少なくとも約４５％の純度、少なくとも約５０％の純度、少なくとも約５５％の純度、少なくとも約６０％の純度、少なくとも約６５％の純度、少なくとも約７０％の純度、少なくとも約７５％の純度、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度または少なくとも約９８％の純度である、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換クロマトグラフィー中のＵＶ干渉が、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも９８％低下される、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ロードされるＰＥＧ化タンパク質が、ロードする前に触媒を使用せずに濃縮されている、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ロードされるＰＥＧ化タンパク質が、ロードする前にタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮されている、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質が、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｇ／Ｌ、少なくとも約４５ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約５５ｇ／Ｌまたは少なくとも約６０ｇ／Ｌの濃度を有する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質が、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約３５ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約４５ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約５５ｇ／Ｌまたは約６０ｇ／Ｌの濃度を有する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質が、約３０ｇ／Ｌの濃度を有する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質の収率が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、洗浄緩衝液を用いてマトリックスを洗浄する工程を更に含む、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、溶出緩衝液を用いてＰＥＧ化タンパク質を溶出する工程を更に含む、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換クロマトグラフィーが、カチオン交換クロマトグラフィーである、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換クロマトグラフィーが、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、カルボキシメチルセルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸ(登録商標)、アガロースに固定されたスルホプロピルおよびアガロースに固定されたスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)、ＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ－スルホン、ＷＰ ＣＢＸ、ＷＰ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ ＣＭ、Ｈｙｄｒｏｃｅｌ ＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＣＭ、ＣｅｒａｍｉｃＨｙｐｅｒＤ Ｓ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＣＭ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｚ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＳＰ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＳＰ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＳＰ、ＤＯＷＥＸ Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ強酸カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸ ＭＡＣ－３、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ５００、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ２００、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ弱／強カチオン交換体、Ｄｉａｉｏｎ弱／強カチオン交換体、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ(６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ)、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ(６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ)、ＣＭ(２３、３２、５２)、ＳＥ(５２、５３)、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ ＣおよびＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｓおよびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択されるＣＥＸ樹脂を含む、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーである、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、イオン交換クロマトグラフィーが、ＰＯＲＯＳ ＨＱ、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ(登録商標)Ｑ、ＡＮＸ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ(ｈｉｇｈ ｓｕｂ)、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ＸＬ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ビッグビーズ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) ＸＬ、Ｓｏｕｒｓｅ １５Ｑ、Ｓｏｕｒｓｅ ３０Ｑ、Ｒｅｓｏｕｒｓｅ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ、ＴＳ ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ、ＴＳ ｇｅｌ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ、Ｍａｃｒｏ－ｐｒｅｐ－ＤＥＡＥ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｑ、Ｎｕｖｉａ Ｑ、ＰＯＲＧＳ ＰＩ、ＤＥＡＥ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＡＥＸ樹脂を含む、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質が、少なくとも約５ｋＤａ、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約１５ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、少なくとも約２５ｋＤａ、少なくとも約３０ｋＤａ、少なくとも約３５ｋＤａ、少なくとも約４０ｋＤａ、少なくとも約４５ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約５５ｋＤａ、少なくとも約６０ｋＤａ、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約８０ｋＤａ、少なくとも約８５ｋＤａ、少なくとも約９０ｋＤａ、少なくとも約９５ｋＤａ、少なくとも約１００ｋＤａ、少なくとも約１０５ｋＤａ、少なくとも約１１０ｋＤａ、少なくとも約１１５ｋＤａ、少なくとも約１２０ｋＤａ、少なくとも約１３０ｋＤａ、少なくとも約１３５ｋＤａ、少なくとも約１４０ｋＤａ、少なくとも約１４５ｋＤａ、少なくとも約１５０ｋＤａ、少なくとも約１５５ｋＤａ、少なくとも約１６０ｋＤａ、少なくとも約１６５ｋＤａ、少なくとも約１７０ｋＤａ、少なくとも約１７５ｋＤａ。少なくとも約１８０ｋＤａ、少なくとも約１８５ｋＤａ、少なくとも約１９０ｋＤａ、少なくとも約１９５ｋＤａ、少なくとも約２００ｋＤａ、少なくとも約３００ｋＤａ、少なくとも約３５０ｋＤａ、少なくとも約４００ｋＤａ、少なくとも約４５０ｋＤａ、少なくとも約５００ｋＤａ、少なくとも約５５０ｋＤａまたは少なくとも約６００ｋＤａの分子量を有する、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質が、ＰＥＧ化された野生型タンパク質、突然変異体、誘導体、バリアントまたは断片である、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質が、ＰＥＧ化された天然由来または組換えタンパク質である、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質が、サイトカイン、凝固因子、ホルモン、細胞表面受容体、成長因子またはそれらのあらゆる組み合わせである、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質が、線維芽細胞成長因子２１(ＦＧＦ２１)、インターロイキン２、第ＶＩＩＩ因子、組換えフェニルアラニンアンモニア－リアーゼ、ペグバリアーゼ、アディノベイト、インターフェロン(例えば、プレグリディなどのインターフェロンβ－１ａ)、ナロキソール(例えば、ナロキセゴール)、ペギネサチド、セルトリズマブペゴル、エリスロポエチン(例えば、メトキシポリエチレングリコール－エポエチンβ)、ペガプタニブ、組換えメチオニルヒト顆粒球コロニー刺激因子、ペグフィルグラスチム、ヒト成長ホルモン拮抗剤(例えば、ペグビソマント)、インターフェロンα(例えば、ＰＥＧインターフェロンα－２ａまたはＰＥＧインターフェロンα－２ｂ)、Ｌ－アスパラギナーゼ(例えば、ペグアスパラガーゼ)、アデノシンデアミナーゼ(例えば、ウシペグアデマーゼ)またはドキソルビシンなどが挙げられる。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質がＦＧＦ２１である、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化タンパク質がＰＥＧ化部位を含む、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化部位が、直鎖状、分岐状、モノＰＥＧ化物、ランダムＰＥＧ化物および複数ＰＥＧ化物(ＰＥＧｍｅｒ)である、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化部分が、少なくとも約１ｋＤａ、少なくとも約２ｋＤａ、少なくとも約３ｋＤａ、少なくとも約４ｋＤａ、少なくとも約５ｋＤａ、少なくとも約６ｋＤａ、少なくとも約７ｋＤａ、少なくとも約８ｋＤａ、少なくとも約９ｋＤａ、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約１１ｋＤａ、少なくとも約１２ｋＤａ、少なくとも約１３ｋＤａ、少なくとも約１４ｋＤａ、少なくとも約１５ｋＤａ、少なくとも約１６ｋＤａ、少なくとも約１７ｋＤａ、少なくとも約１８ｋＤａ、少なくとも約１９ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、少なくとも約２１ｋＤａ、少なくとも約２２ｋＤａ、少なくとも約２３ｋＤａ、少なくとも約２４ｋＤａ、少なくとも約２５ｋＤａ、少なくとも約３０ｋＤａ、少なくとも約４０ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約５５ｋＤａ、少なくとも約６０ｋＤａ、少なくとも約６５ｋＤａ、少なくとも約７０ｋＤａ、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約８０ｋＤａ、少なくとも約９０ｋＤａ、少なくとも約９５ｋＤａまたは少なくとも約１００ｋＤａである、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、ＰＥＧ化部分が、約３０ｋＤａであるＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書は、本明細書の方法を用いて精製されたＰＥＧ化タンパク質を提供する。
図１：ＰＥＧタンパク質のサイズ(Ｒｈ：ナノメートル単位の流体力学的半径；ＤＬＳ：動的光散乱法)および結合容量に対するタンパク質濃度の影響。ＰＥＧ化タンパク質の濃度が１ｇ／Ｌから３０ｇ／Ｌに上昇すると、ＰＥＧ化タンパク質のＲｈは６.１ｎｍから２.７ｎｍに減少し、結合容量は５.１ｇ／Ｌ樹脂から１２.８ｇ／Ｌ樹脂に増加した。ＡＥＸ：アニオン交換クロマトグラフィー。 現行のプロトコル(ＰＥＧ化反応生成物の３１倍希釈；左側)および本願新規方法(中央および右側)の下での、ＰＥＧ化タンパク質のローディング濃度およびＩＥＣマトリックスの結合容量の比較：例えば、希釈なし、ＴＦＦ(タンジェンシャルフロー濾過；１０ｋＤａおよび３０ｋＤａの孔サイズを示す)による濃縮およびＩＥＣマトリックスへのローディング。４－ＡＢＨ：４-アミノ安息香酸ヒドラジド(ＰＥＧ化反応の触媒)。
(発明の詳細な説明)
本明細書は、望ましくない不純物から所望のＰＥＧ化標的物を精製するための効果的な方法を提供する。当技術分野の教示に反して、本明細書の方法は、６ｇ／Ｌよりも低く希釈された溶液、例えば１ｇ／Ｌの希釈された溶液の代わりに、少なくとも６ｇ／Ｌである高濃度のＰＥＧ化タンパク質を、イオン交換マトリックスにロードすることを特徴とする。驚くべきことに、高濃度でＰＥＧ化タンパク質溶液をロードすることにより、クロマトグラフィーマトリックスの結合容量およびローディング容量が増加して、高収率にて精製タンパク質が得られることが判った。本明細書の方法は、所望のＰＥＧ化タンパク質を得るために必要な精製サイクルの回数を減らし、結果としてコストのかかるクロマトグラフィーマトリックスの洗浄および交換の必要性を減らすことで、時間、労力および費用を節約することができる。
ＰＥＧ化タンパク質は、様々な異なる化学試薬を用いて、ネイティブタンパク質にＰＥＧ鎖を化学的に結合させることにより形成される。特定の実施態様において、本明細書は、目的のＰＥＧ化タンパク質と１または複数の夾雑物質とを含む混合物から、目的のＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法を提供する。存在する可能性がある夾雑物質としては、未反応のＰＥＧ、未反応のネイティブタンパク質、反応触媒、宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)、高分子種(ＨＭＷ)、低分子種(ＬＭＷ)およびＤＮＡなどが挙げられる。本明細書はまた、クロマトグラフィーマトリックスまたはイオン交換マトリックスに、１リットルあたり少なくとも６グラムの高濃度のＰＥＧ化タンパク質を含む溶液をロードして、目的のＰＥＧ化生成物を回収することにより、溶液中の不純物から所望のＰＥＧ化標的物を精製するための方法を提供するものである。
Ｉ．定義
本明細書がより容易に理解されるように、まず特定の用語を定義する。
明細書で使用されている「および／または」という用語は、２つの指定された特徴または構成要素各々について、他方を伴うか、または他方を伴わずに具体的に開示していると解釈されるものである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句に使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」(単独)および「Ｂ」(単独)を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などのフレーズで使用される「および／または」という用語は、以下の各態様を包含することを意図する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)。
本明細書における態様が「を含む」という言葉で記述されている場合、「からなる」および／または「本質的にからなる」という別の言葉で記述された類似の態様も提供されることが理解される。
別段の記載が無ければ、本明細書で使用されているすべての技術的および科学的用語は、本明細書に関連する技術分野の通常の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を持つ。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本明細書において使用される多くの用語の一般的辞書として当業者に提供するものである。
単位、接頭辞および記号は、ＳＩ(Systeme International de Unites)で認められている形式で示されている。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。本明細書の見出しは、本明細書の様々な側面を限定するものではなく、本明細書を全体的に参照することにより得ることができる。したがって、以下に定義される用語は、本明細書全体を参照することにより完全に定義される。
代替手段(例えば、「または」)の使用は、代替手段のいずれか一方、両方またはその組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書では、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、記載または列挙された構成要素の「１つ以上」を意味すると理解すべきである。
用語「約」または「本質的に～含む」という用語は、当業者が決定した特定の値または組成物の許容誤差範囲内にある値または組成物を意味し、これは値または組成物をどのように測定または決定するか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」または「本質的に～を含む」とは、当業者による標準偏差が、１以内または１以上であることを意味することができる。あるいは、「約」または「本質的に～を含む」とは、１０％までの範囲を意味することができる。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関しては、この用語は、１桁までの値または５倍までの値を意味することができる。特定の値または組成物が本願明細書および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、「約」または「本質的に～を含む」の意味は、その特定の値または組成物について許容可能な誤差範囲内であると考えるべきである。
本明細書に記載されているように、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、別段の指示がない限り、記載された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその端数(整数の１０分の１および１００分の１など)を含むと理解されるべきである。
本明細書において、「タンパク質」または「目的のタンパク質」という用語は、最も広い意味で使用され、混合物中に存在し、精製が望まれるあらゆるタンパク質(天然または組換え体)を含む。このような目的のタンパク質には、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、免疫グロブリン(例えば、抗体)および/または任意の融合タンパク質ならびにそれらの誘導体および部分が含まれるが、これらに限定するものではない。
本明細書において互換的に使用される「精製」、「分離」または「単離」という用語は、目的のタンパク質と１以上の不純物を含む組成物またはサンプルから、目的のタンパク質の純度を高くすることを意味する。通常、組成物から少なくとも１つの不純物を(完全に、または部分的に)除去することによって、目的のタンパク質の純度を上げる。
本明細書において使用される「緩衝液」という用語は、溶液中に存在することで、加えなければならない酸またはアルカリの量を増加させて、ｐＨの単位変化をもたらす物質をいう。緩衝液は、酸と塩基の共役成分の作用により、ｐＨ変化に対する影響を受けにくい。生物学的物質と共に使用するための緩衝液は、一般的に、溶液のｐＨが生理的範囲内となるように、水素イオンの濃度を一定に保つことができる。従来の緩衝液成分には、有機および無機の塩、酸および塩基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
用語「クロマトグラフィー」とは、目的のタンパク質(例えば、ＰＥＧ化タンパク質)を、混合物中に存在する他の分子(例えば、夾雑物質)と分離するあらゆる種類の技術をいう。通常、目的のタンパク質は、混合物の個々の分子が、移動相に依って固相媒体を移動する速度の違い、ならびに結合および溶出プロセスの結果として、他の分子(例えば、夾雑物質)から分離される。「マトリックス」または「クロマトグラフィーマトリックス」という用語は、本明細書において互換的に使用され、分離プロセスにおいて目的のタンパク質(例えば、免疫グロブリンなどのＦｃ領域含有タンパク質)を、混合物中に存在する他の分子と分離するあらゆる種類の吸着剤、樹脂または固相を指す。非限定的な例としては、粒子状、モノリス状(monolithic)、繊維状の樹脂ならびにカラムまたはカートリッジに入れることができる膜などがある。マトリックスを形成するための材料の例としては、多糖類(アガロースおよびセルロースなど)；ならびにその他の物理的に安定なマトリックス、例えば、シリカ(例えば、多孔性ガラス粉体：controlled pore glass)、ポリ(スチレンジビニル)ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子および上記のいずれかの誘導体などが挙げられる。本明細書の方法に適した典型的なマトリックスタイプの例は、カチオン交換樹脂、アフィニティー樹脂、アニオン交換樹脂または混合型樹脂である。「リガンド」とは、クロマトグラフィーマトリックスと結合され、マトリックスの結合特性を決定する官能基である。「リガンド」の例としては、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、親硫黄性相互作用基、金属親和性基、アフィニティー基、バイオアフィニティー基および混合型基(前記の組み合わせ)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用できるいくつかの好ましいリガンドには、強カチオン交換基、例えばスルホプロピル、スルホン酸；強アニオン交換基、例えばトリメチルアンモニウムクロリド；弱カチオン交換基、例えばカルボン酸；弱アニオン交換基、例えば、Ｎ５ＮジエチルアミノまたはＤＥＡＥ；疎水性相互作用基、例えば、フェニル、ブチル、プロピルまたはヘキシル；ならびに親和性基、例えば、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるクロマトグラフィーに関連する「クロマトグラフィーカラム」または「カラム」という用語は、多くは、クロマトグラフィーマトリックスまたは樹脂が充填されたシリンダーまたは中空の柱の形状をしている容器を意味する。クロマトグラフィーマトリックスまたは樹脂とは、精製のために用いる物理的および／または化学的特性を提供する材料である。
「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、イオン化が可能な目的の溶質(例えば、混合物中の目的のタンパク質)が、ｐＨおよび導電性が適切な条件下で、固相イオン交換材に(例えば、共有結合により)結合された反対の電荷を有するリガンドと相互作用し、目的の溶質が、混合物中の溶質不純物または夾雑物よりも強くまたは弱く帯電した化合物と、非特異的に相互作用するようなクロマトグラフィープロセスを意味する。混合物中の夾雑溶質は、イオン交換材料のカラムから洗浄されるか、目的の溶質よりも速くまたは遅く、樹脂に結合させるか、または樹脂から排除され得る。「イオン交換クロマトグラフィー」には、具体的には、カチオン交換型(ＣＥＸ)、アニオン交換型(ＡＥＸ)および混合型クロマトグラフィーが含まれる。イオン交換クロマトグラフィーは、本明細書では、互換的にＩＥＣおよびＩＥＸと呼ばれる。
「カチオン交換樹脂」または「カチオン交換膜」とは、負の電荷を帯びた固相であって、固相上または固相を通過した水溶液中のカチオンと交換するための遊離カチオンを有する固相をいう。カチオン交換樹脂を形成するのに適した固相に結合した負電荷のリガンドであればどのようなものでも使用することが可能であり、例えば、後記のカルボン酸塩、スルホン酸塩などが挙げられる。市販のカチオン交換樹脂としては、下記に限定しないが、例えば、スルホン酸塩系の基を有するもの(例えば、ＧＥヘルスケア社のＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｃａｐｔｏ Ｓ、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、東ソー社のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ(登録商標) ＳＰ－６５０ＳおよびＳＰ－６５０Ｍ、ＢｉｏＲａｄ社のＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ(登録商標) Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｐａｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｓ、ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ(登録商標) ＭおよびＬＳ ＳＰ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＳＰ)；スルホエチル系の基を有するもの(例えば、ＥＭＤ社のＦＲＡＣＴＯＧＥＬ(登録商標) ＳＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＰＯＲＯＳ(登録商標) Ｓ－１０およびＳ－２０)；スルホプロピル系の基を有するもの(例えば、東ソー社のＴＳＫゲルＳＰ ５ＰＷおよびＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＰＯＲＯＳ(登録商標) ＨＳ－２０、ＨＳ ５０およびＰＯＲＯＳ(登録商標) ＸＳ)；スルホイソブチル系の基を有するもの(例えば、ＥＭＤ社のＦＲＡＣＴＯＧＥＬ(登録商標) ＥＭＤ ＳＯ３－)；スルホキシエチル系の基を有するもの(例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社のＳＥ５２、ＳＥ５３、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｓ)；カルボキシメチル系の基を有するもの(例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ社のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＣＭ、ＢｉｏＲａｄ社のＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ(登録商標) ＣＭ、Ｐａｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＣＭ、ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ(登録商標) Ｍ ＣＭおよびＴＲＩＳＡＣＲＹＬ(登録商標) ＬＳ ＣＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭａｔｒｘ ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ(登録商標) Ｃ５００およびＣ２００、Ｗｈａｔｍａｎ社のＣＭ５２、ＣＭ３２、ＣＭ２３およびＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｃ、東ソー社のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ(登録商標) ＣＭ－６５０Ｓ、ＣＭ－６５０ＭおよびＣＭ－６５０Ｃ)；スルホン酸およびカルボン酸系の基を有するもの(例えば、Ｊ.Ｔ.Ｂａｋｅｒ社のＢＡＫＥＲＢＯＮＤ(登録商標) Ｃａｒｂｏｘｙ－Ｓｕｌｆｏｎ)；カルボン酸系の基を有するもの(例えば、Ｊ.Ｔ.Ｂａｋｅｒ社のＷＰ ＣＢＸ、Ｄｏｗ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社のＤＯＷＥＸ(登録商標) ＭＡＣ－３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡＭＢＥＲＬＩＴＥ(登録商標) Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ、ＤＯＷＥＸ(登録商標) Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ ＥｘｃｈａｎｇｅｒおよびＤＩＡＩＯＮ(登録商標) Ｗｅａｋ Ｃａｔｉｏｎ ＥｘｃｈａｎｇｅｒならびにＥＭＤ社のＦＲＡＣＴＯＧＥＬ(登録商標) ＥＭＤ ＣＯＯ－－)；スルホン酸系の基を有するもの(例えば、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ社のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＳＰ、Ｄｏｗ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社のＤＯＷＥＸ(登録商標) Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ Ｓｔｒｏｎｇ Ａｃｉｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ、Ｊ.Ｔ.Ｂａｋｅｒ社のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ， ＷＰ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社のＳＡＲＴＯＢＩＮＤ(登録商標) Ｓ メンブレン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡＭＢＥＲＬＩＴＥ(登録商標) Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ(登録商標) Ｓｔｒｏｎｇ ＣａｔｉｏｎおよびＤＩＡＩＯＮ(登録商標) Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ)；またはオルトリン酸系の基を有するもの(例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社のＰ１１など)が挙げられる。他のカチオンイオン交換樹脂としては、カルボキシメチルセルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸＴＭ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｚ、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ５００、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ２００などが挙げられる。
「アニオン交換樹脂」または「アニオン交換膜」とは、正の電荷を帯びた固相であって、固相に１以上の正の電荷を帯びたリガンドが結合している。アニオン交換樹脂を形成するのに適した固相に結合した正電荷のリガンドであればどのようなものでも使用することが可能であり、例えば、第四級アミノ基などがある。市販のアニオン交換樹脂としては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＤＥＡＥセルロース、ＰＯＲＯＳ(登録商標)ＰＩ２０、ＰＩ５０、ＨＱ１０、ＨＱ２０、ＨＱ５０、Ｄ５０；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社のＳＡＲＴＯＢＩＮＤ(登録商標)Ｑ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＭｏｎｏＱ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑおよび３０Ｑ、Ｑ ＤＥＡＥおよびＡＮＸ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ(登録商標)およびＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)；Ｊ.Ｔ.Ｂａｋｅｒ社のＷＰ ＰＥＩ、ＷＰ ＤＥＡＭ、ＷＰ ＱＵＡＴ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ社のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＱＡ；Ｂｉｏｒａｄ社のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑ、ＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ(登録商標)、ＤＥＡＥおよびＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ(登録商標)Ｈｉｇｈ Ｑ；Ｐａｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｑ、ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＤＥＡＥ、ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ(登録商標)ＭおよびＬＳ ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＤＥＡＥ、ＱＭＡ ＳＰＨＥＲＯＳＩＬ(登録商標)ＬＳ、ＱＭＡ ＳＰＨＥＲＯＳＩＬ(登録商標). ＭおよびＭＵＳＴＡＮＧ(登録商標)Ｑ；ＤＯＷ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社のＤＯＷＥＸ(登録商標)Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ Ａｎｉｏｎ ＲｅｓｉｎｓおよびＤＯＷＥＸ(登録商標)ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ Ｅ ７７弱塩基性アニオン；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＩＮＴＥＲＣＥＰＴ(登録商標)Ｑメンブレン、Ｍａｔｒｅｘ ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ(登録商標)Ａ２００、Ａ５００、Ｑ５００およびＱ８００；ＥＭＤ社のＦＲＡＣＴＯＧＥＬ(登録商標)ＥＭＤ ＴＭＡＥ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ(登録商標)ＥＭＤ ＤＥＡＥおよびＦＲＡＣＴＯＧＥＬ(登録商標)ＥＭＤ ＤＭＡＥ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡＭＢＥＲＬＩＴＥ(登録商標)弱／強アニオン交換体タイプＩおよびＩＩ、ＤＯＷＥＸ(登録商標)弱／強アニオン交換体タイプＩおよびＩＩ、ＤＩＡＩＯＮ(登録商標)弱／強アニオン交換体タイプＩ・ＩＩおよびＤＵＯＬＩＴＥ(登録商標)；東ソー社のＴＳＫゲルＱおよびＤＥＡＥ ５ＰＷおよび５ＰＷ－ＨＲ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ(登録商標)ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ＱＡＥ－５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ－６５０Ｍおよび６５０Ｃ；Ｗｈａｔｍａｎ社のＱＡ５２、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５１、ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ ＤまたはＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｑ；およびＳＡＲＴＯＢＩＮＤ(登録商標)Ｑ(Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ)が挙げられる。その他のアニオン交換樹脂としては、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ(登録商標)Ｑ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) ＸＬ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ビッグビーズ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) ＸＬ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ、Ｎｕｖｉａ ＱまたはＰＯＲＧＳ ＰＩなどが挙げられる。
本明細書において使用される「夾雑物質」という用語は、混合物内の任意の望ましくない成分または化合物をカバーするために、最も広い意味で使用されている。細胞培養物、細胞溶解物または清澄化されたバルク(例えば、清澄化された細胞培養上清)中において、夾雑物質には、例えば、細胞培養培地中に存在する宿主細胞核酸(例えば、ＤＮＡ)および宿主細胞タンパク質が含まれる。宿主細胞の夾雑タンパク質には、宿主細胞によって自然にまたは組換え的に産生されたタンパク質ならびに目的のタンパク質に関連するタンパク質またはそれから得られるタンパク質(例えば、タンパク質分解断片)およびその他のプロセスに関連する夾雑物質が含まれる。特定の実施態様において、夾雑物質の沈殿物は、遠心分離、滅菌濾過、深層濾過およびタンジェンシャルフロー濾過などの別の手段を用いて、細胞培養物から分離される。
用語「抗体」とは、いくつかの実施態様において、ジスルフィド結合によって相互に結合された少なくとも２つの重鎖(Ｈ)および２つの軽鎖(Ｌ)を含むタンパク質をいう。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではＶＨと略す)および重鎖定常領域(本明細書ではＣＨと略す)から構成される。一部の抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体においては、重鎖定常領域は、ヒンジならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。一部の抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体においては、各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではＶＬと略す)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン(本明細書ではＣＬと略す)で構成されている。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変領域に細分され、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる高度に保存された領域が散在している。３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでおり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが存在する。重鎖は、Ｃ末端のリジンを有していても、有していなくてもよい。「抗体」という用語には、二重特異性抗体または多重特異性抗体を含み得る。
本明細書において使用される「ＩｇＧ抗体」、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体は、いくつかの実施態様において、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有しており、即ち、同じサブクラスの天然に存在するＩｇＧ抗体と同じ数の重鎖および軽鎖ならびにジスルフィド結合を有している。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体は、２本の重鎖(ＨＣ)と２本の軽鎖(ＬＣ)から構成されていてよく、２本のＨＣおよびＬＣは、天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体に各々存在するジスルフィド結合と同じ数と位置に連結されている(抗体が、突然変異してジスルフィド結合が変更されていない限り)。
イムノグロブリンは、一般的に知られているいずれのアイソタイプでもよく、例えば、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含み得るが、これらに限定するものではない。ＩｇＧアイソタイプは、ある種の生物ではサブクラスに分かれている：ヒトにおいては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３に分かれている。イムノグロブリン、例えばＩｇＧ１は、いくつかのアロタイプが存在し、これらは、多くて数個のアミノ酸が互いに相違している。「抗体」には、天然の抗体および非天然の抗体の両方；モノクローナル抗体とポリクローナル抗体；キメラ抗体とヒト化抗体；ヒト抗体と非ヒト抗体；および全合成抗体などが挙げられる。
本明細書において使用される抗体の「抗原結合部分」とは、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片をいう。それは、抗体の抗原結合機能が、完全長抗体の断片により発揮できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＬＣおよびＣＨ１ドメインを含むＦａｂ断片(パパイン切断による断片)または同様の一価の断片；(ｉｉ)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含むＦ(ａｂ')２断片(ペプシン切断による断片)または同様の二価の断片；(ｉｉｉ)ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片；(ｉｖ)抗体のシングルアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片；(ｖ) ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；(ｖｉ)単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)；および(ｖｉｉ)所望により合成リンカーで結合されていてもよい２以上の単離されたＣＤＲの組み合わせがある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、組み換え方法を用いて、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として形成できる合成リンカーにより、それらを結合させることができる(単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られている；例えば、Bird et al. (1988)Science 242：423-426；およびHuston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)を参照されたい)。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者には既知の従来技術を用いて得られ、その断片は、インタクトな抗体と同様の方法で有用性をスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術またはインタクトなイムノグロブリンを酵素的または化学的に切断することにより生成することができる。
本明細書において使用される「組換えヒト抗体」という用語には、組換え手段によって調製、発現、作成または単離された全てのヒト抗体が含まれ、例えば、(ａ)ヒトイムノグロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーム動物(例えば、マウス)またはそれらから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、(ｂ)抗体を発現するように形質転換された宿主細胞(例えば、トランスフェクトーマ)から単離された抗体、(ｃ)組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ならびに(ｄ)ヒトイムノグロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む別の手段により調製、発現、作成または単離された抗体である。
本明細書において、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。
アミノ酸は、本明細書においては、一般的に知られている３文字の記号またはＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ生化学命名法委員会が推奨する１文字の記号のいずれかにより示される。ヌクレオチドも同様に、一般的に認められている１文字のコードにより示される。
本明細書においては、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合(ペプチド結合とも呼ばれる)によって直線的に連結されたモノマー(アミノ酸)からなる分子を意味する。また、「ポリペプチド」という用語は、２以上のアミノ酸のあらゆる鎖をいい、特定の長さを指すものではない。本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、１以上のポリペプチドで構成される分子を包含することを意図しており、これらのポリペプチドは、場合によっては、アミド結合以外の結合により結合することができる。一方で、タンパク質は、単一のポリペプチド鎖であってもよい。この後者の例においては、単一のポリペプチド鎖は、いくつかの例では、一緒に融合してタンパク質を形成する２以上のポリペプチドサブユニットを含むことができる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、発現後の修飾生成物(例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断または天然に存在しないアミノ酸による修飾なども含むが、これに限定するものではない)を指す。ポリペプチドまたはタンパク質は、天然の生物学的ソースから得られるか、または組換え技術によって産生されるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。また、化学合成を含めたあらゆる方法で、生成することができる。
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、１つの核酸だけでなく、複数の核酸も包含することを意図しており、単離された核酸分子または構築体、例えば、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)またはプラスミドＤＮＡ(ｐＤＮＡ)を指す。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来的な結合(例えば、ペプチド核酸(ＰＮＡ)に見られるようなアミド結合)を含む。
用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在するいずれか１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ断片をいう。核酸またはポリヌクレオチドに適用される場合、「単離された」という用語は、本来の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指し、例えば、ベクターに含まれる抗原結合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種の宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の他のポリヌクレオチドから(部分的または実質的に)精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、本明細書のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物が含まれる。本明細書による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成的に生成されたそのような分子も含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位または転写終結シグナルなどの調節エレメントを含むことができる。
タンパク質の「等電点」または「ｐＩ」とは、タンパク質が正味の電荷を持たない状態の溶液のｐＨを示す指標である。ｐＩに相当するｐＨにあるタンパク質は、全体的に中性の電荷を帯びている。ｐＩが溶液のｐＨよりも低いタンパク質は、正味の負の電荷を帯びている。同様に、溶液のｐＨよりも高いｐＩを持つタンパク質は、正味の正電荷を持つことになる。
「ロードディング緩衝液」とは、混合物またはサンプルを調製して、クロマトグラフィー装置にロードするために使用される緩衝液のことである。
「チェイス緩衝液」とは、ロードディング緩衝液の後に、混合物またはサンプルをクロマトグラフィー処理に付すために使用される緩衝液のことをいう。
「ＨＭＷ種」とは、混合物中に存在する１以上のあらゆる不要なタンパク質のことである。高分子種には、二量体、三量体、四量体またはその他の多量体が含まれる。これらの種は、殆どが製品に付随する不純物とみなされ、共有結合または非共有結合のいずれかで結合されている可能性があり、例えば、疎水性アミノ酸残基が極性溶媒に暴露されてミスフォールドしたモノマーを含み、凝集を引き起こす可能性がある。
「ＬＭＷ種」とは、混合物中に存在する１以上のあらゆる不要な物質を指す。低分子種は、殆どが製品に付随する不純物とみなされ、切断された種または二量体を意図した化合物(モノクローナル抗体など)の半分子などが含まれる。
「宿主細胞タンパク質」(ＨＣＰ)とは、目的とする所定タンパク質の生成とは無関係に宿主細胞から生成される望ましくないタンパク質を指す。望ましくない宿主細胞タンパク質は、初期段階(upstream)の細胞培養液上清に分泌され得る。また、望ましくない宿主細胞タンパク質も、細胞の溶解中に放出され得る。初期段階の細胞培養に使用される細胞は、成長、転写およびタンパク質合成のためにタンパク質を必要とするが、これらの無関係なタンパク質は、最終的な薬物製品においては望ましくない。
本明細書において使用される用語「ローディング／ロードすること」およびその文法上等価物は、精製されるべき目的の物質を含む溶液を固相と接触させる精製方法の工程を示す。これは、ａ)溶液を固相が配置されたクロマトグラフィー装置に加える、またはｂ)溶液に固相を加えることを意味する。ａ)の場合、精製したい物質を含む溶液が固相を通過することで、固相と溶液中の物質との間に相互作用を生じさせる。条件(例えば、ｐＨ、導電率、塩濃度、温度および/または流速など)に応じて、溶液中の一部の物質は固相に結合することで、結果としてその溶液から除かれる。他の物質は溶液中に残留する。溶液中に残った物質は、フロースルー中に存在し得る。「フロースルー」とは、クロマトグラフィー装置を通過した後に得られる溶液のことで、目的の物質を含むローディング後の溶液である場合もあれば、カラムを洗浄するため、または固相に結合した１以上の物質を溶出させるために使用される緩衝液の場合もあり得る。一実施態様において、クロマトグラフィー装置は、カラムまたはカセットである。目的の物質は、例えば、沈殿、塩析、限外濾過、透析、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、溶媒の減容化など、当業者には既知の方法により、精製工程後の溶液から回収または「収集」して、目的の物質を実質的に均質な形態で得ることができる。ｂ)の場合、固相は、例えば固体として、精製したい目的の物質を含む溶液に添加され、固相と溶液中の物質との間に相互作用を生じさせる。相互作用の後、固相は、例えば濾過により取り出され、目的の物質は固相に結合して、溶液から除去されるか、または固相に結合せずに溶液中に残留するかのいずれかである。
本明細書において使用される「結合に適した条件下で」という用語およびその文法上等価物は、目的の物質、例えばＰＥＧ化タンパク質を、イオン交換材などの固相に接触させたときに結合することを示す。これは、必ずしも１００％の目的の物質が固相に結合することを意味するものではなく、実質的に１００％の目的の物質が結合すること、即ち、少なくとも５０％の目的の物質が結合し、より好ましくは少なくとも７５％の目的の物質が結合し、さらに好ましくは少なくとも８５％の目的の物質が結合し、特に好ましくは９５％以上の目的の物質が、固相に結合することを意味する。
本明細書において使用される「緩衝液」という用語は、酸性物質や塩基性物質の添加または放出によるｐＨの変化が、緩衝物質によって平衡化される溶液を意味する。このような効果をもたらすあらゆる緩衝物質を使用することができる。いくつかの実施態様において、医薬的に許容される緩衝物質が使用され、例えば、リン酸またはその塩、酢酸またはその塩、クエン酸またはその塩、モルホリン、２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸またはその塩、ヒスチジンまたはその塩、グリシンまたはその塩あるいはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(ＴＲＩＳ)またはその塩などが挙げられる。一実施態様において、リン酸またはその塩、酢酸またはその塩、クエン酸またはその塩またはヒスチジンまたはその塩が緩衝物質として使用される。所望により、緩衝液は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウムなどの付加塩を含み得る。
一般的なクロマトグラフィー法およびその使用は、当業者に知られている。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F, and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；あるいは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al (eds), John Wiley & Sons, Inc.である。
本明細書による「ＰＥＧ」または「ＰＥＧ基」とは、ポリ(エチレングリコール)を必須部分として含む残基を意味する。そのようなＰＥＧは、分子の化学合成から生じる結合反応(即ち、コンジュゲーション反応)に必要な化学基あるいは分子の一部分の至適距離のためのスペーサーである化学基をさらに含むことができる。さらに、このようなＰＥＧは、１以上のＰＥＧ側鎖が一緒に連結されたものであってもよい。１以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多枝ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、様々なポリオール(例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトールなど)にポリエチレンオキシドを添加することにより製造できる。
「ＰＥＧ化」という用語は、ポリペプチドのＮ末端および／または内部アミノ酸(例えば、リジン残基)でのポリ(エチレングリコール)残基の共有結合を意味する。タンパク質のＰＥＧ化は広く知られており、例えば、Bonora G., Diroli S. Reactive PEGs for protein conjugation. In:Veronese FM, ed. PEGylated Protein Drugs: basic Science and Clinical Applications. Basel: Birkhauser; 2009:33-45に説明されており、またVeronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417も参照されたい。ＰＥＧは、様々な官能基を用いて結合することができ、異なる分子量を持つポリエチレングリコール、直鎖状ＰＥＧおよび分岐状ＰＥＧならびに様々な連結基を持つポリエチレングリコールが当技術分野では知られている(Francis, G. E., et al.、Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304)。ＰＥＧ化は、ＮＨＳで活性化された直鎖状または分岐状のＰＥＧ分子を用いて、記載のようなＰＥＧ化試薬と共に水溶液中で行うことができる。ＰＥＧ化は、Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229に従って固相で行うこともできる。
適切なＰＥＧ誘導体は、約２ｋＤａ～約４０ｋＤａの平均分子量、一実施態様において約２０ｋＤａ～約４０ｋＤａ、好ましくは約３０ｋＤａ～約３５ｋＤａの平均分子量を有する活性化ＰＥＧ分子である。ＰＥＧ誘導体は、一実施態様において、直鎖状または分枝状のＰＥＧである。ＰＥＧ－タンパク質結合体およびＰＥＧ－ペプチド結合体の調製に使用するのに適した様々なＰＥＧ誘導体は、Shearwater Polymers(Huntsville, Ala., U.S.A.; www.nektar.com)から入手できる。
活性化されたＰＥＧ誘導体は、当技術分野では知られており、例えばＰＥＧ-ビニルスルホンについては、Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7(1996) 363-368に記載されている。直鎖状および分岐状のＰＥＧは、ＰＥＧ化断片の調製に適している。反応性ＰＥＧ試薬の例としては、ヨード-アセチル-メトキシ-ＰＥＧまたはメトキシ-ＰＥＧ-ビニルスルホン(ｍは好ましくは約４５０～約９００の整数であり、Ｒは、メチル、エチル、イソプロピルなどの１～６個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状のＣ１～Ｃ６アルキルである)が挙げられる。これらのヨウ素活性化物質の使用は、当技術分野では知られており、例えばHermanson, G.T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p.147-148に記載されている。
ＩＩ．精製方法
タンパク質のＰＥＧ化により、通常、様々な化合物の混合物(例えば、ポリＰＥＧ化タンパク質、モノＰＥＧ化タンパク質、非ＰＥＧ化タンパク質、活性化ＰＥＧエステルの加水分解物(例えば、遊離のＰＥＧ化された酸)、タンパク質自体の加水分解物、ＰＥＧ化反応触媒など)となる。所望のＰＥＧ化生成物を得るためには、これらの物質を分離して、目的のＰＥＧ化タンパク質を精製しなければならない。
従って、一態様において、本明細書は、高濃度のＰＥＧ化タンパク質の溶液を、イオン交換材にロードして、精製されたＰＥＧ化タンパク質を回収または収集することを特徴とする、実質的に精製された形態のＰＥＧ化タンパク質を得るための方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、少なくとも約６グラム／リットル(ｇ／Ｌ)、例えば、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌまたは少なくとも約３０ｇ／Ｌの高濃度のＰＥＧ化タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーマトリックス上にロードして、ＰＥＧ化タンパク質を回収することを特徴とする、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法に関する。
本明細書の精製を構成するクロマトグラフィーステップの一例として、モノＰＥＧ化タンパク質またはポリＰＥＧ化タンパク質の混合物は、水性緩衝液中でイオン交換クロマトグラフィーカラムに、少なくとも約６ｇ／Ｌのタンパク質濃度で適用される。一態様において、混合物を、タンジェンシャルフロー濾過を用いて濃縮し、ＵＶ干渉およびタンパク質濃度の測定値を下げるために触媒を除去する。さらなる実施態様においては、適用の前および後に、最初のカラムを同じ緩衝液で洗浄する。イオン交換材に結合したポリペプチドの回収工程においては、イオン交換カラムを通過する緩衝液／溶液のイオン強度、すなわち導電率を上げる。これは、緩衝液の塩分濃度を上げるか、あるいは別の塩(溶出用塩と呼ばれる)を緩衝液に加えることにより達成される。溶出方法に応じて、濃縮された緩衝液または溶出用塩溶液を分割して添加することにより、緩衝液／塩濃度を、一度に(段階的溶出法)または連続的に(連続溶出法)増加させる。好ましい溶出用の塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウムまたはクエン酸やリン酸の他の塩あるいはこれらの成分の任意の混合物である。一実施態様において、溶出用の塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはこれらの混合物である。
いくつかの実施態様において、本発明の方法の後に回収したＰＥＧ化タンパク質の収量は、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍または少なくとも約４０倍に増加する。
いくつかの実施態様において、高濃度で、例えば、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌまたは少なくとも約３０ｇ／ＬのＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌよりも低い濃度で、例えば、約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌまたは約１ｇ／Ｌでロードした時のイオン交換マトリックスのローディング容量と比較して、イオン交換マトリックスのローディング容量が増加する。
いくつかの実施態様において、イオン交換マトリックスのローディング容量は、１Ｌのマトリックスあたり、約６ｇから、約７ｇ、約８ｇ、約９ｇ、約１０ｇ、約１１ｇ、約１２ｇ、約１３ｇ、約１４ｇ、約１５ｇ、約１６ｇ、約１７ｇ、約１８ｇ、約１９ｇまたは約２０ｇまでＰＥＧ化タンパク質が増加する。いくつかの実施態様において、イオン交換マトリックスのローディング容量は、マトリックス１Ｌあたり、約６.５ｇから約１０ｇまでＰＥＧ化タンパク質が増加する。いくつかの実施態様において、イオン交換マトリックスのローディング容量は、マトリックス１Ｌあたり約６.５ｇから１１ｍｇまでＰＥＧ化タンパク質が増加する。いくつかの実施態様において、イオン交換マトリックスのローディング容量は、マトリックス１Ｌあたり、約６.５ｇから１２ｇまでＰＥＧ化タンパク質が増加する。いくつかの実施態様において、イオン交換マトリックスのローディング容量は、マトリックス１Ｌあたり、約６.５ｇから１３ｇまでＰＥＧ化タンパク質が増加する。いくつかの実施態様において、イオン交換マトリックスのローディング容量は、マトリックス１Ｌあたり、約６.５ｇから１４ｇまでＰＥＧ化タンパク質が増加する。いくつかの実施態様において、イオン交換マトリックスのローディング容量は、マトリックス１Ｌあたり、約６.５ｇから１５ｇまでＰＥＧ化タンパク質が増加する。
いくつかの実施態様において、高濃度で、例えば、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌまたは少なくとも約３０ｇ／ＬのＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌよりも低い濃度で、例えば、約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、イオン交換マトリックスの結合容量が増加する。
いくつかの実施態様において、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードした時のイオン交換マトリックスの結合容量は、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌよりも低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約１.１倍、約１.２倍、約１.３倍、約１.５倍、約１.６倍、約１.７倍、約１.８倍、約１.９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍または約３０倍となる。
いくつかの実施態様において、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードした時のイオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも７ｇ、少なくとも７.５ｇ、少なくとも８ｇ、少なくとも８.５ｇ、少なくとも９ｇ、少なくとも９.５ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも１０.５ｇ、少なくとも１１ｇ、少なくとも１１.５ｇ、少なくとも１２ｇ、少なくとも１２.５ｇ、少なくとも１３ｇ、少なくとも１３.５ｇ、少なくとも１４ｇ、少なくとも１４.５ｇ、少なくとも１５ｇ、少なくとも１５.５ｇ、少なくとも１６ｇ、少なくとも１６.５ｇまたは少なくとも１７ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌのマトリックスである。いくつかの実施態様において、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードした時のイオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも８ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも９ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１０ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１１ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１２ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１３ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１４ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１５ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１６ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量は、少なくとも１７ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである。
いくつかの実施態様において、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードした場合のイオン交換クロマトグラフィー後に回収されたＰＥＧ化タンパク質は、少なくとも約２０％の純度、少なくとも約２５％の純度、少なくとも約３０％の純度、少なくとも約３５％の純度、少なくとも約４０％の純度、少なくとも約４５％の純度、少なくとも約５０％の純度、少なくとも約５５％の純度、少なくとも約６０％の純度、少なくとも約６５％の純度、少なくとも約７０％の純度、少なくとも約７５％の純度、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度または少なくとも約９８％の純度である。
いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィー中のＵＶ干渉は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも９８％低下される。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約５～約２５％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約１０～約３０％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約２０～約５０％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約３０～約６０％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約４０～約７５％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約５０～約８０％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約６０～約８５％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約７０～約９０％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約８５～約９５％低下する。いくつかの実施態様において、ＵＶ干渉は、約８５～約９９％低下する。
いくつかの実施態様において、ロードされるＰＥＧ化タンパク質は、ローディング前に触媒を使用せずに濃縮される。いくつかの実施態様において、触媒は、４－アミノベンゾヒドラジド、４ＡＢＨまたはその誘導体もしくはその低級形態である。濃縮とは、溶質分子を保持したまま、溶液から液体を除去するという単純な工程である。溶質の濃度は、溶液の体積が減少するに比例して増加する(即ち、体積を半分にすると、濃度が実質２倍になる)。
いくつかの実施態様においては、ロードされるＰＥＧ化タンパク質は、ローディング前にタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮される。タンジェンシャルフロー濾過は、流体圧力を利用して限外濾過膜を通して低分子の移動を促し、同時に大きい分子を保持する限外濾過の手法である。一般的には、保持すべきタンパク質の分子量よりも３～６倍小さい分子量のカットオフ(ＭＷＣＯ)の膜が選択される。適切なＭＷＣＯの選択には、当業者には既知のその他の要因、例えば流速、処理時間、膜間圧力、分子形状や構造、溶質濃度、その他の溶質の存在およびイオン条件なども影響する。ＴＦＦの主な用途は、濃縮、透析濾過(脱塩および緩衝液交換)および大きな生体分子と小さな生体分子との分画である。
透析濾過とは、最終的に濃度を変えずに、小さい分子は膜を通過させて洗い流し、大きい分子を元の液中に残す分画処理である。これを利用して、塩類を除去するか、または緩衝液を交換できる。エタノールまたはその他の小分子の溶質または添加物を除去することもできる。
透析濾過は、連続的または非連続的に行い得る。連続的な透析濾過では、濾液が生じる速度と同じ速度で、透析濾過用の溶液(水または緩衝液)がサンプル供給リザーバーに加えられる。このようにして、サンプルリザーバ内の体積は一定に保たれるが、膜を自由に透過できる小分子(例えば、塩)は洗い流される。塩分除去を例とすれば、透析濾過量(ＤＶ)の添加ごとに塩分濃度がさらに低下する(１回の透析濾過量は、システム内の生成物量と等量の水または緩衝液を供給リザーバーに加えて等しくした後、開始時の容量に戻す。例えば、開始時に２００ｍＬのサンプルであれば、１ＤＶ＝２００ｍＬである)。２ＤＶを使用すると、連続的な透析濾過ではイオン強度が約９９％低下する。
非連続的な透析濾過では、最初に溶液を希釈して、次に開始容量にまで濃縮する。その後、リザーバー内に残っている低分子(例えば、塩)が必要な濃度に達するまで、この処理を繰り返す。ＤＶを添加する度に、塩分濃度はさらに低下する。連続的な透析濾過では、非連続的な透析濾過と同程度の塩分減少を達成するのに、より少ない濾液容量により行われる。最初にサンプルを濃縮することで、所定のイオン強度を達成するために必要な透析濾過溶液の量を大幅に減らすことができる。
いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーの前のタンジェンシャルフロー濾過後のＰＥＧ化タンパク質の濃度は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約２６ｇ／Ｌ、少なくとも約２７ｇ／Ｌ、少なくとも約２８ｇ／Ｌ、少なくとも約２９ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約３１ｇ／Ｌ、少なくとも約３２ｇ／Ｌ、少なくとも約３３ｇ／Ｌ、少なくとも約３４ｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｇ／Ｌ、少なくとも約３６ｇ／Ｌ、少なくとも約３７ｇ／Ｌ、少なくとも約３８ｇ／Ｌ、少なくとも約３９ｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｇ／Ｌ、少なくとも約４１ｇ／Ｌ、少なくとも約４２ｇ／Ｌ、少なくとも約４３ｇ／Ｌ、少なくとも約４４ｇ／Ｌ、少なくとも約４５ｇ／Ｌまたは少なくとも約５０ｇ／Ｌである。いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーの前のタンジェンシャルフロー濾過後のＰＥＧ化タンパク質の濃度は、少なくとも約３５ｇ/Ｌである。
いくつかの実施態様において、本明細書の高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質は、少なくとも約７ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、少なくとも約９ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１１ｇ／Ｌ、少なくとも約１２ｇ／Ｌ、少なくとも約１３ｇ／Ｌ、少なくとも約１４ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約２５ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約３５ｇ／Ｌ、少なくとも約４０ｇ／Ｌ、少なくとも約４５ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約５５ｇ／Ｌまたは少なくとも約６０ｇ／Ｌの濃度である。いくつかの実施態様において、本明細書の高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質は、約６ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約６０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌまたは約３０ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌの濃度を有する。
いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーにロードされる高濃度のＰＥＧ化タンパク質は、約１０ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約３５ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約４５ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約５５ｇ／Ｌまたは約６０ｇ／Ｌである。
いくつかの実施態様において、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質は、約１５ｇ／Ｌの濃度を有する。いくつかの実施態様において、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質は、約２０ｇ／Ｌの濃度を有する。いくつかの実施態様において、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質は、約２５ｇ／Ｌの濃度を有する。いくつかの実施態様において、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質は、約３０ｇ／Ｌの濃度を有する。いくつかの実施態様において、高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質は、約３５ｇ／Ｌの濃度を有する。
いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、約１０％～約２０％増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質が６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約１５％～約３０％増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質が６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約２０％～約３５％に増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質が６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約２５％～約４０％増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約４５％～約６０％増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約６５％～約８０％増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約８５％～約９０％増加する。いくつかの実施態様において、本明細書のイオン交換クロマトグラフィーを行った後のＰＥＧ化タンパク質のタンパク質収率は、ＰＥＧ化タンパク質を６ｇ／Ｌより低い濃度、例えば約１ｇ／Ｌでロードした場合のイオン交換マトリックスの結合容量と比較して、約９０％～約９９％増加する。いくつかの実施態様において、本方法は、洗浄用緩衝液を用いてマトリックスを洗浄することをさらに含む。緩衝液のｐＨとイオン強度は、すべての形態のイオン交換クロマトグラフィーにとって極めて重要である。緩衝液の対イオンは、樹脂と同じ電荷を持つべきであり、トリス緩衝液は一般に正電荷を帯びたアニオン交換樹脂に使用され、リン酸緩衝液は一般に負電荷を帯びたカチオン交換樹脂に使用される。
いくつかの実施態様において、本方法は、ＰＥＧ化タンパク質を、溶出緩衝液を用いて溶出することをさらに含む。溶出緩衝液は、イオン交換材に結合したポリペプチドを、回収または収集するように調製される。一般的に、イオン交換カラムを通過する緩衝液／溶液のイオン強度、即ち導電性を高める。これは、緩衝液の塩の濃度を上げるか、あるいは他の塩(溶出用塩と呼ばれる)を緩衝液に加えることで達成される。溶出方法に応じて、濃縮された緩衝液または溶出用塩溶液を、分割して添加することにより、緩衝液／塩濃度を、一度に(段階的溶出法)または連続的に(連続溶出法)増加させる。好ましい溶出用の塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウムまたはクエン酸やリン酸の他の塩またはこれらの成分の任意の混合物である。一実施態様では、溶出用の塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはこれらの混合物である。
いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換クロマトグラフィーである。カチオン交換クロマトグラフィーは、正味の正の表面電荷を有する分子に親和性のある負電荷を帯びたイオン交換樹脂を使用する。カチオン交換クロマトグラフィーは、分取および分析の両方の目的で使用され、アミノ酸やヌクレオチドから大きなタンパク質まで、広範囲の分子を分離することができる。
いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、カルボキシメチルセルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸ(登録商標)、アガロースに固定化されたスルホプロピルおよびアガロースに固定化されたスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)、ＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ Ｃａｒｂｏｘｙ－Ｓｕｌｆｏｎ、ＷＰ ＣＢＸ、ＷＰ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ ＣＭ、Ｈｙｄｒｏｃｅｌ ＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＣＭ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｓ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＣＭ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｚ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＳＰ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＳＰ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＳＰ、ＤＯＷＥＸ Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ強酸性カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸ ＭＡＣ－３、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ５００、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ２００、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ Ｗｅａｋ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、Ｄｉａｉｏｎ Ｗｅａｋ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ(６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ)、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ(６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ)、ＣＭ(２３、３２、５２)、ＳＥ(５２、５３)、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ ＣおよびＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｓならびにこれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるＣＥＸ樹脂を含む。
いくつかの実施態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーである。アニオン交換クロマトグラフィーは、正味の負の表面電荷を有する分子に親和性を有する正電荷を帯びたイオン交換樹脂を使用する。アニオン交換クロマトグラフィーは、分取および分析の両方の目的で使用され、アミノ酸やヌクレオチドから大きなタンパク質まで、広範囲の分子を分離することができる。
いくつかの実施態様において、アニオン交換クロマトグラフィーは、ＰＯＲＯＳ ＨＱ、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ(登録商標)Ｑ、ＡＮＸ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (ｈｉｇｈ ｓｕｂ)、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ＸＬ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ｂｉｇ ｂｅａｄｓ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ＸＬ、Ｓｏｕｒｓｅ １５Ｑ、Ｓｏｕｒｓｅ ３０Ｑ、Ｒｅｓｏｕｒｓｅ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、ＭｏｎｏＱ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ、ＴＳ ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ、ＴＳ ｇｅｌ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＭＡＥ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ、Ｍａｃｒｏ－ｐｒｅｐ－ＤＥＡＥ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｑ、Ｎｕｖｉａ Ｑ、ＰＯＲＧＳ ＰＩ、ＤＥＡＥ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ、Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤおよびこれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるＡＥＸ樹脂を含む。
いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、分子量が、少なくとも約５ｋＤａ、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約１５ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、少なくとも約２５ｋＤａ、少なくとも約３０ｋＤａ、少なくとも約３５ｋＤａ、少なくとも約４０ｋＤａ、少なくとも約４５ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約５５ｋＤａ、少なくとも約６０ｋＤａ、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約８０ｋＤａ、少なくとも約８５ｋＤａ、少なくとも約９０ｋＤａ、少なくとも約９５ｋＤａ、少なくとも約１００ｋＤａ、少なくとも約１０５ｋＤａ、少なくとも約１１０ｋＤａ、少なくとも約１１５ｋＤａ、少なくとも約１２０ｋＤａ、少なくとも約１２５ｋＤａ、少なくとも約１３０ｋＤａ、少なくとも約１３５ｋＤａ、少なくとも約１４０ｋＤａ、少なくとも約１４５ｋＤａ、少なくとも約１５０ｋＤａ、少なくとも約１５５ｋＤａ、少なくとも約１６０ｋＤａ、少なくとも約１６５ｋＤａ、少なくとも約１７０ｋＤａ、少なくとも約１７５ｋＤａ、少なくとも約１８０ｋＤａ、少なくとも約１８５ｋＤａ、少なくとも約１９０ｋＤａ、少なくとも約１９５ｋＤａ、少なくとも約２００ｋＤａ、少なくとも約３００ｋＤａ、少なくとも約３５０ｋＤａ、少なくとも約４００ｋＤａ、少なくとも約４５０ｋＤａ、少なくとも約５００ｋＤａ、少なくとも約５５０ｋＤａまたは少なくとも約６００ｋＤａである。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約２ｋＤａ～約１５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約１５ｋＤａ～約３５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約３５ｋＤａ～約５５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約５０ｋＤａ～約７５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約７０ｋＤａ～約９５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約８０ｋＤａ～約１１５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約９５ｋＤａ～約１４０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約１３５ｋＤａ～約１７０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約１６０ｋＤａ～約２００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約１８０ｋＤａ～約２３５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約２０５ｋＤａ～約２５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約２２５ｋＤａ～約２８０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約２７０ｋＤａ～約３３０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約３２５ｋＤａ～約３６０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約３５０ｋＤａ～約４２５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約４１５ｋＤａ～約４６５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約４５０ｋＤａ～約５００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約４８５ｋＤａ～約５２５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約５００ｋＤａ～約５５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約５３０ｋＤａ～約５７５ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、約５６０ｋＤａ～約６０５ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、ＰＥＧ化されている野生型タンパク質、突然変異体、誘導体、バリアントまたは断片であり、そのタンパク質は、哺乳類、真核生物または原核生物起から得ることが可能であり、これらには、例えば、成長因子(例えば、ＦＧＦ２１、ヒト顆粒球コロニー刺激因子)；インターロイキン(例えば、インターロイキン２)；血液凝固因子(例えば、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子)；インターフェロン(例えば、インターフェロンα－１ａ、インターフェロンα－１ｂ、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンβ１)；オピオイドアンタゴニスト；ホルモン(例えば、エリスロポエチン)；ホルモンアンタゴニスト(例えば、ヒト成長ホルモンアンタゴニスト)；酵素(例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ウリカーゼ、ヒアルロニダーゼ)；抗体(例えば、抗体のＦａｂ１またはＦａｂ２断片、例えば、ヒト腫瘍壊死因子α(ＴＮＦα)に対するモノクローナル抗体のＦａｂ断片)；サイトカイン(例えば、ＩＬ１０)；ＰＥＧ化リポソーム封入タンパク質(例えば、ドキソルビシン)；および抗生物質が挙げられる。
いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、ＰＥＧ化された天然に存在するタンパク質もしくは組換え的に産生されたタンパク質または融合タンパク質である。
いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、タンパク質の由来が哺乳類、真核生物または原核生物であり得る抗体であって、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体、抗体の抗原結合部分、例えば、抗体のＦａｂ１またはＦａｂ２断片、例えばヒト腫瘍壊死因子α(ＴＮＦα)に対するモノクローナル抗体のＦａｂ断片、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片、抗体のシングルアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片、ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)および任意に合成リンカーによって結合することができる２以上の単離されたＣＤＲの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。
いくつかの実施態様において、本発明のために有用なＰＥＧ化タンパク質は、サイトカイン、凝固因子、ホルモン、細胞表面受容体、成長因子またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化タンパク質は、線維芽細胞増殖因子２１である、ＦＧＦ２１の野生型または修飾ＦＧＦ－２１ポリペプチドである。本明細書で使用する場合、「修飾ＦＧＦ－２１ポリペプチド」とは、野生型ＦＧＦ－２１と異なっており、通常、線維芽細胞増殖因子２１の少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチドおよびタンパク質を含んでおり、これらには、ＦＧＦ－２１アナログ、ＦＧＦ－２１アイソフォーム、ＦＧＦ－２１模倣体、ＦＧＦ－２１断片、ハイブリッドＦＧＦ－２１タンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、ホモログ、グリコシル化パターンバリアント、バリアント、スプライスバリアントおよびそれらの突然変異タンパク質(mutein)などが挙げられるが、その生物学的活性に関わらず様々なものが含まれる。ある種のＦＧＦ－２１ポリペプチドおよびその使用は、米国特許公開第２００１００１２６２８号、米国特許公開第６,７１６,６２６号、米国特許公開第２００４／０２５９７８０号、ＷＯ０３／０１１２１３号、Kharitonenkov, et. al., J Clin Invest. 2005 June;115(6):1627-35，ＷＯ０３／０５９２７０、米国特許公開第２００５／０１７６６３１、ＷＯ２００５／０９１９４４、ＷＯ２００７／０２９３４３０、米国特許公開第２００７／０２９３４３０、ＷＯ／２００８／１２１５６３、米国特許第４,９０４,５８４号、ＷＯ９９／６７２９１号、ＷＯ９９／０３８８７号、ＷＯ００／２６３５４号および米国特許第５,２１８,０９２号の各々を出典明示により、その全体を本明細書に組み込む。
いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化タンパク質は、ＰＥＧ化部分を含む。
いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、直線状、分枝状、単一のＰＥＧ化、ランダムＰＥＧ化および多重ＰＥＧ化(ＰＥＧｍｅｒｓ)である。
いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００ｋＤaである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約１～約１００ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約２～約５ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約１０～約２０ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約２５～約５０ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約２～約５０ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約２０～約１００ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約５～約３０ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約５～約４０ｋＤａである。いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約１０～約８０ｋＤａである。
いくつかの実施態様において、ＰＥＧ化部分は、約３０ｋＤａである。
いくつかの実施態様において、本明細書の方法を用いて精製されたＰＥＧ化タンパク質は、例えば、繊維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、インターロイキン２、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、インターフェロン(例えば、インターフェロンβ－１ａ)、ナロキソールなどのオピオイドアンタゴニスト、セルトリズマブペゴル、エリスロポエチン(例えば、メトキシポリエチレングリコール－エポエチンβ)、ペガプタニブ、組換えメチオニルヒト顆粒球コロニー刺激因子、ペグフィルグラスチム、ヒト成長ホルモンアンタゴニスト(例えば、ペグビソマント)、インターフェロンα(例えば、ＰＥＧインターフェロンα－２ａまたはＰＥＧインターフェロンα－２ｂ)、Ｌ－アスパラギナーゼ(例えば、ペグアスパラガーゼ)、アデノシンデアミナーゼ(例えば、ウシペグアデマーゼ, Adagen)、ＰＥＧ－ウリカーゼ、ペグロチナーゼ、尿酸代謝酵素(Ｋｒｙｓｔｅｘｘａ)、組換えヒトヒアルロニダーゼ、アスパラギナーゼ、ヒト化抗体(例えば、アラシズマブ)、モノクローナル抗体のＦａｂ断片(例えば、セルトリズマブ)、可溶性腫瘍壊死因子(ペグスネルセプト)、インターロイキン(例えば、組換えマウスＩＬ－１０)、ドキソルビシンなどが挙げられる。
ＰＥＧ化タンパク質の例には、以下のものが挙げられるが、これらに限定するものではない：
・ＰＡＬＹＮＺＩＱ(登録商標)－フェニルケトン尿症の治療のためのＰＥＧ化された組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(Biomarin)、２０１８年５月に米国ＦＤＡから承認済
・ＡＤＹＮＯＶＡＴＥ(登録商標)－血友病Ａ患者の治療のためのＰＥＧ化組換え抗血友病因子第ＶＩＩＩ因子(Baxalta, 2015)
・ＰＬＥＧＲＩＤＹ(登録商標)－再発型多発性硬化症患者の治療のためのＰＥＧ化インターフェロンβ－１ａ(Biogen, 2014)
・ＭＯＶＡＮＴＩＫ(登録商標)(Naloxegol)－成人の慢性非癌性疼痛患者におけるオピオイド誘発性便秘の治療に使用されるＰＥＧ化されたナロキソール(ペグ化されていないメタドンは、有害な胃腸反応を引き起こす可能性がある)(AstraZeneca, 2014)
・ＯＭＯＮＴＹＡ(登録商標)(Peginesatide)－透析を受けている成人患者の慢性腎臓病の随伴性貧血を治療するための薬剤(月１回投与用)(Affymax/Takeda Pharmaceuticals, 2012)
・ＫＲＹＳＴＥＸＸＡ(登録商標)(Pegloticase)－ＰＥＧ化された痛風治療用ウリカーゼ(Savient, 2010)
・ＣＹＭＺＩＡ(登録商標)(Certolizumab pegol)－中等度から重度の関節リウマチおよび炎症性胃腸障害であるクローン病の治療用モノクローナル抗体(Nektar/UCB Pharma, 2008)
・ＭＩＲＣＥＲＡ(登録商標)(メトキシポリエチレングリコール-エポエチンβ)－ＰＥＧ化されたエリスロポエチン製剤の慢性腎臓病随伴性貧血の治療薬(Roche, 2007)
・ＭＡＣＵＧＥＮ(登録商標)(Pegaptanib)－血管新生加齢黄斑変性症の治療薬(Pfizer, 2004)
・ＮＥＵＬＡＳＴＡ(登録商標)(Pegfilgrastim：ペグフィルグラスチム)－重度の癌化学療法誘発性好中球減少症に対するＰＥＧ化した組み換えメチオニルヒト顆粒球コロニー刺激因子(Amgen, 2002)
・ＳＯＭＡＶＥＲＴ(登録商標)(Pegvisomant：ペグビソマント)－先端巨大症を治療するためのＰＥＧ－ヒト成長ホルモンムテイン拮抗薬(Pfizer, 2002)
・ＰＥＧＡＳＹＳ(登録商標)(ペグインターフェロンα２a)－慢性のＣ型肝炎およびＢ型肝炎の治療に使用されるＰＥＧ化されたインターフェロンα(Hoffmann-La Roche, 2002)
・ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ(登録商標)(ペグインターフェロンα２ｂ)－慢性のＣ型肝炎およびＢ型肝炎の治療に使用されるＰＥＧ化インターフェロンα(Schering-Plough/Enzon, 2000)
・ＤＯＸＩＬ(登録商標)/ＣＡＥＬＹＸ(登録商標)(ドキソルビシン塩酸塩リポソーム)－がん治療のためのドキソルビシンを含むＰＥＧ化リポソーム(Alza 1995)
・ＭＹＯＣＥＴ(登録商標)(ドキソルビシン塩酸塩リポソーム)－がん治療用のドキソルビシンを含むＰＥＧ化リポソーム(Teva UK)
・ＯＮＣＡＳＰＡ(登録商標)(Pegaspargase)－未修飾Ｌ－アスパラギナーゼに過敏な患者の急性リンパ性白血病を治療するために使用されるＰＥＧ化Ｌ－アスパラギナーゼ(Enzon, 1994)。本剤はフロントラインでの使用も承認されている。
・ＡＤＡＧＥＮ(登録商標)(Pegademase bovine)－重症複合免疫不全症(ＳＣＩＤ)治療用ＰＥＧ－アデノシンデアミナーゼ(Enzon, 1990)。
ＩＩＩ．組成物および治療方法
本明細書は、本願方法に従って精製されたタンパク質を包含する。いくつかの実施態様において、精製されたタンパク質は、哺乳類、例えば、ヒトに投与するために適切に製剤化され得る。別の実施態様において、本明細書は、本願方法により精製されたタンパク質を投与することを特徴とする、疾患または症状を治療または予防するための方法を包含する。
特許請求の範囲を解釈するために使用されるのは、「発明の詳細な説明」のセクションであって、「概要」および「要旨」のセクションではないことを理解されたい。「概要」および「要旨」の部分は、本発明者が考えている本明細書の１以上の実施態様の例示を記載するものであるが、全ての例ではないため、本明細書および添付した特許請求の範囲をいかなる方法によっても限定することは意図していない。
本明細書は、指定された機能およびその関連についての実施を例示する機能構成単位を用いて説明されている。これらの機能構成単位の区別は、説明の便宜上、本明細書において任意に定義されている。特定の機能およびその関係が適切に実施される限り、別の境界を定義することもできる。
本明細書の特定の実施態様の説明により、本明細書の一般的な性質は、十分明らかにされているため、当業者の範囲内の知識を適用することにより、過度の実験を行うことなく、本明細書の一般的な概念から逸脱することなく、特定の実施態様を様々な用途のために容易に変更および／または適用することができる。従って、かかる適用および修正は、本明細書に提示された教示およびガイダンスに基づいて、開示された実施態様の意味および等価物の範囲内にあることが意図される。本明細書の表現または用語は、説明を目的としており、限定するためのものではなく、本明細書の用語または表現は、教示およびガイダンスに照らして当業者により解釈されるべきであることを理解されたい。
本明細書の領域および範囲は、本明細書に記載された実施態様の例示のいずれかによって制限されるべきではなく、以下の請求項およびその等価物に基づいてのみ規定されるべきである。
実施例１
イオン交換クロマトグラフィーにおけるＰＥＧ化タンパク質のサイズおよびその吸着に対するタンパク質濃度の影響
全てのサイズのタンパク質を、治療目的で薬物動態プロファイルを改善するためにＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化タンパク質は、下流の処理工程においていくつかの課題がある。ＰＥＧ化タンパク質の精製には、イオン交換クロマトグラフィーが使用される。しかし、ＰＥＧ化タンパク質の動的結合能力は、ネイティブなタンパク質に比べて著しく低い。その原因として、結合したＰＥＧポリマー鎖によるタンパク質の電荷の遮断およびＰＥＧ化タンパク質のサイズが大きいことによる樹脂ビーズ内での拡散性の低下などが考えられる。
本研究では、ＰＥＧ化タンパク質の濃度が、ＰＥＧ化タンパク質のサイズおよび構造、ひいてはイオン交換クロマトグラフィーでのその結合挙動に影響を与えることを明らかにした(図１を参照されたい)。ＰＥＧ化反応に随伴するもう１つの課題は、ＰＥＧ化反応触媒のＵＶ吸光度が、その後のクロマトグラムおよびタンパク質濃度の測定に干渉することである。
タンジェンシャルフロー濾過を用いて、ＰＥＧ化したタンパク質を濃縮し、触媒およびその他の夾雑物を除去した。タンジェンシャルフロー濾過は、ＰＥＧ化混合物の最初の希釈、ＡＥＸローディング緩衝液による透析濾過、ＡＥＸローディングのための最終濃縮により行った。ＡＥＸを、カラムの平衡化、タンパク質のローディング、カラムの洗浄、リニアグラジエントを用いた溶出、その後の後処理および洗浄により行った。ダイアフィルトレーションにより濃縮したＰＥＧ化タンパク質を用いることで、より高い結合およびローディング容量が得られ、イオン交換クロマトグラフィー中のＵＶ干渉も除かれた(図１を参照されたい)。
濃縮されたＰＥＧ化ＦＧＦ２１に対するＡＥＸ樹脂の結合容量およびＰＥＧ化ＦＧＦ２１の流体力学的半径を、ＡＥＸ樹脂にロードされたＰＥＧ化ＦＧＦ２１濃度の関数として決定した(図１を参照されたい)。ＦＧＦ２１は、当該技術分野において既知の方法に従ってＰＥＧ化された。
流体力学的半径は、当該技術分野において一般的に使用されている方法である動的光散乱法を用いて決定した。動的結合容量は、ＡＥＸカラムにタンパク質をロードし、当分野で一般的に使用される方法であるＵＶ２８０による解析前に、結合したタンパク質をモニターすることにより決定した。
図２に示すように、ＰＥＧ化反応物を３１倍に希釈した後、１ｇのＰＥＧ化ＦＧＦ２１／Ｌのローティング濃度でアニオン交換クロマトグラフィーを行った今回の工程では、ＡＥＸ樹脂の結合容量が６.５ｇのＰＥＧ化ＦＧＦ２１／Ｌとなった。一方、ＰＥＧ化ＦＧＦ２１を、３０ｇのＰＥＧ化ＦＧＦ２１／Ｌのローディング濃度となるようにタンジェンシャルフロー濾過(孔サイズが１０ｋＤａまたは３０ｋＤａのいずれかを示す)により濃縮した場合、得られた結合容量は、１ＬのＡＥＸ樹脂あたり、１０ｇＰＥＧ化ＦＧＦ２１であった。
略語の説明：Ｒｈ、流体力学的半径；ＤＬＳ、動的光散乱；ＤＢＣ、動的結合容量；ＡＥＸ、アニオン交換クロマトグラフィー；ＴＦＦ、タンジェンシャルフロー濾過；ＤＶ、ダイアフィルトレーション容量；ＱＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；４ＡＢＨ、４－アミノ安息香酸ヒドラジド；ＰＡＢＡ、ｐ－アミノ安息香酸。

Claims (34)

  1. イオン交換クロマトグラフィーマトリックスに少なくとも６ｇ／リットルの高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードする工程、およびＰＥＧ化タンパク質を回収する工程を含む、ＰＥＧ化タンパク質を精製するための方法。
  2. １ｇ／Ｌの濃度でロードして回収されたＰＥＧ化タンパク質の収量と比較して、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、回収されたＰＥＧ化タンパク質の収量が増加する、請求項１記載の方法。
  3. 回収されたＰＥＧ化タンパク質の収量が、少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍または約４０倍増加する、請求項２記載の方法。
  4. ＰＥＧ化タンパク質を１ｇ／Ｌ濃度でロードした場合のイオン交換マトリックスのローディング容量と比較して、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスのローディング容量が増加する、請求項１～３いずれか一項に記載の方法。
  5. イオン交換マトリックスのローディング容量が、マトリックス１Ｌあたり、６ｇから、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１１ｇ、１２ｇ、１３ｇ、１４ｇ、１５ｇ、１６ｇ、１７ｇ、１８ｇ、１９ｇおよび２０ｇのＰＥＧ化タンパク質に増加する、請求項４記載の方法。
  6. ＰＥＧ化タンパク質を１ｇ／Ｌ濃度でロードした場合のイオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量と比較して、高濃度のＰＥＧ化タンパク質をロードすることにより、イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量が増加する、請求項１～５いずれか一項に記載の方法。
  7. イオン交換マトリックスの結合容量が、約１.１倍、約１.２倍、約１.３倍、約１.５倍、約１.６倍、約１.７倍、約１.８倍、約１.９倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍または約３０倍増加する、請求項６記載の方法。
  8. イオン交換クロマトグラフィーマトリックスの結合容量が、少なくとも７ｇ、少なくとも７.５ｇ、少なくとも８ｇ、少なくとも８.５ｇ、少なくとも９ｇ、少なくとも９.５ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも１０.５ｇ、少なくとも１１ｇ、少なくとも１１.５ｇ、少なくとも１２ｇ、少なくとも１２.５ｇ、少なくとも１３ｇ、少なくとも１３.５ｇ、少なくとも１４ｇ、少なくとも１４.５ｇ、少なくとも１５ｇ、少なくとも１５.５ｇ、少なくとも１６ｇ、少なくとも１６.５ｇまたは少なくとも１７ｇのＰＥＧ化タンパク質／Ｌマトリックスである、請求項６または７記載の方法。
  9. 回収されたＰＥＧ化タンパク質が、少なくとも約２０％の純度、少なくとも約２５％の純度、少なくとも約３０％の純度、少なくとも約３５％の純度、少なくとも約４０％の純度、少なくとも約４５％の純度、少なくとも約５０％の純度、少なくとも約５５％の純度、少なくとも約６０％の純度、少なくとも約６５％の純度、少なくとも約７０％の純度、少なくとも約７５％の純度、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約８５％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９８％の純度である、請求項１～８いずれか一項に記載の方法。
  10. イオン交換クロマトグラフィー中のＵＶ干渉が、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも９８％低下する、請求項１～９いずれか一項に記載の方法。
  11. ロードされるＰＥＧ化タンパク質が、ロードする前に触媒を使用せずに濃縮されている、請求項１～１０項いずれか一項に記載の方法。
  12. ロードされるＰＥＧ化タンパク質が、ロードする前にタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮されている、請求項１～１１いずれか一項に記載の方法。
  13. 高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質が、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０ｇ／Ｌの濃度である、請求項２～１２いずれか一項に記載の方法。
  14. 高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質が、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０ｇ／Ｌの濃度である、請求項１３記載の方法。
  15. 高濃度でロードされるＰＥＧ化タンパク質が、約３０ｇ/Ｌの濃度である、請求項１４記載の方法。
  16. 回収されたＰＥＧ化タンパク質の収率が、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である、請求項１３記載の方法。
  17. 洗浄緩衝液を用いてマトリックスを洗浄する工程を更に含む、請求項１～１６いずれか一項に記載の方法。
  18. 溶出緩衝液を用いてＰＥＧ化タンパク質を溶出する工程を更に含む、請求項１～１７いずれか一項に記載の方法。
  19. イオン交換クロマトグラフィーが、カチオン交換クロマトグラフィーである、請求項１～１８いずれか一項に記載の方法。
  20. イオン交換クロマトグラフィーが、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ、カルボキシ－メチル－セルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸ(登録商標)、アガロースに固定されたスルホプロピルおよびアガロースに固定されたスルホニル、ＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ、３０Ｓ、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)、ＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤカルボキシ－スルホン、ＷＰ ＣＢＸ、ＷＰ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ ＣＭ、Ｈｙｄｒｏｃｅｌ ＳＰ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＣＭ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｓ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＣＭ、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｚ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ ＳＰ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ ＬＳ ＳＰ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＳＰ、ＤＯＷＥＸ Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ強酸カチオン樹脂、ＤＯＷＥＸ ＭＡＣ－３、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ５００、Ｍａｔｒｅｘ Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ２００、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ３－、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＣＯＯ－、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ弱／強カチオン交換体、Ｄｉａｉｏｎ 弱／強カチオン交換体、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ(６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ)、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ(６５０Ｓ、６５０Ｍ、６５０Ｃ)、ＣＭ(２３、３２、５２)、ＳＥ(５２、５３)、Ｐ１１、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ ＣおよびＥｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｓならびにそれらのあらゆる組合せからなる群から選択されるＣＥＸ樹脂を含む、請求項１９記載の方法。
  21. イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１～１８いずれか一項に記載の方法。
  22. アニオン交換クロマトグラフィーが、ＰＯＲＯＳ ＨＱ、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ(登録商標) Ｑ、ＡＮＸ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ(登録商標)(ｈｉｇｈ ｓｕｂ)、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ＸＬ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標)ビッグビーズ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ(登録商標) ＸＬ、Ｓｏｕｒｓｅ １５Ｑ、Ｓｏｕｒｓｅ ３０Ｑ、Ｒｅｓｏｕｒｓｅ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｍｏｎｏ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ、ＴＳ ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ、ＴＳ ｇｅｌ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＭＡＥ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ、Ｍａｃｒｏ－ｐｒｅｐ－ＤＥＡＥ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｑ、Ｎｕｖｉａ Ｑ、ＰＯＲＧＳ ＰＩ、ＤＥＡＥ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤおよびＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤならびにそれらのあらゆる組合せからなる群から選択されるＡＥＸ樹脂を含む、請求項２１記載の方法。
  23. ＰＥＧ化タンパク質が、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０または少なくとも約６００ｋＤａの分子量を有する、請求項１～２２いずれか一項に記載の方法。
  24. ＰＥＧ化タンパク質が、野生型タンパク質、突然変異体、誘導体、バリアントまたはそれらの断片である、請求項１～２３いずれか一項に記載の方法。
  25. ＰＥＧ化タンパク質が、天然または組み換え産生されたタンパク質である、請求項１～２４いずれか一項に記載の方法。
  26. ＰＥＧ化タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、請求項１～２５いずれか一項に記載の方法。
  27. ＰＥＧ化タンパク質が、サイトカイン、凝固因子、ホルモン、細胞表面受容体、成長因子またはそのいずれかの組合せである、請求項１～２６いずれか一項に記載の方法。
  28. ＰＥＧ化タンパク質が、繊維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、インターロイキン２、第ＶＩＩＩ因子、組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、ペグバリアーゼ、アディノベイト、インターフェロン(例えば、プレグリディなどのインターフェロンβ－１ａ)、ナロキソール(例えば、ナロキセゴール)、ペギネサチド、セルトリズマブペゴル、エリスロポエチン(例えば、メトキシポリエチレングリコール－エポエチンβ)、ペガプタニブ、組換えメチオニルヒト顆粒球コロニー刺激因子、ペグフィルグラスチム、ヒト成長ホルモンアンタゴニスト(例えば、ペグビソマント)、インターフェロンα(例えば、ペグインターフェロンα－２ａまたはペグインターフェロンα－２ｂ)、Ｌ－アスパラギナーゼ(例えば、ペグアスパラガーゼ)、アデノシンデアミナーゼ(例えば、ウシペグアデマーゼ)またはドキソルビシンである、請求項１～２７いずれか一項に記載の方法。
  29. ＰＥＧ化タンパク質が、ＦＧＦ２１である、請求項１～２８いずれか一項に記載の方法。
  30. ＰＥＧ化タンパク質が、ＰＥＧ化部分を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. ＰＥＧ化部分が、直線状、分枝状、モノＰＥＧ化物、ランダムＰＥＧ化物および複数ＰＥＧ化物(ＰＥＧｍｅｒ)である、請求項３０記載の方法。
  32. ＰＥＧ化部分が、少なくとも約１ｋＤａ、少なくとも約２ｋＤａ、少なくとも約３ｋＤａ、少なくとも約４ｋＤａ、少なくとも約５ｋＤａ、少なくとも約６ｋＤａ、少なくとも約７ｋＤａ、少なくとも約８ｋＤａ、少なくとも約９ｋＤａ、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約１１ｋＤａ、少なくとも約１２ｋＤａ、少なくとも約１３ｋＤａ、少なくとも約１４ｋＤａ、少なくとも約１５ｋＤａ、少なくとも約１６ｋＤａ、少なくとも約１７ｋＤａ、少なくとも約１８ｋＤａ、少なくとも約１９ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、少なくとも約２１ｋＤａ、少なくとも約２２ｋＤａ、少なくとも約２３ｋＤａ、少なくとも約２４ｋＤａ、少なくとも約２５ｋＤａ、少なくとも約３０ｋＤａ、少なくとも約４０ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約５５ｋＤａ、少なくとも約６０ｋＤａ、少なくとも約６５ｋＤａ、少なくとも約７０ｋＤａ、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約８０ｋＤａ、少なくとも約９０ｋＤａ、少なくとも約９５ｋＤａまたは少なくとも約１００ｋＤａである、請求項３１記載の方法。
  33. ＰＥＧ化部分が約３０ｋＤａである、請求項３２記載の方法。
  34. 請求項１～３３いずれか一項に記載の方法により精製されたタンパク質。
JP2021524180A 2018-11-05 2019-11-04 Ｐｅｇ化タンパク質の精製方法 Pending JP2022506649A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862756020P 2018-11-05 2018-11-05
US62/756,020 2018-11-05
PCT/US2019/059658 WO2020096958A1 (en) 2018-11-05 2019-11-04 Method for purifying pegylated protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022506649A true JP2022506649A (ja) 2022-01-17

Family

ID=68655752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021524180A Pending JP2022506649A (ja) 2018-11-05 2019-11-04 Ｐｅｇ化タンパク質の精製方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220017570A1 (ja)
EP (1) EP3876996A1 (ja)
JP (1) JP2022506649A (ja)
KR (1) KR20210090649A (ja)
CN (1) CN113301922A (ja)
WO (1) WO2020096958A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201900201YA (en) 2016-08-16 2019-02-27 Regeneron Pharma Methods for quantitating individual antibodies from a mixture
SG11201902667UA (en) 2016-10-25 2019-05-30 Regeneron Pharma Methods and systems for chromatography data analysis
TW202005694A (zh) 2018-07-02 2020-02-01 美商里珍納龍藥品有限公司 自混合物製備多肽之系統及方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
EP1881005B1 (en) 1997-07-14 2013-04-03 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of G-CSF and related proteins
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
ES2289824T3 (es) 1998-10-30 2008-02-01 Novozymes A/S Proteinas glicosiladas con alergenicidad reducida.
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
CA2557782A1 (en) * 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
WO2006065582A2 (en) 2004-12-14 2006-06-22 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2007010552A2 (en) * 2005-03-17 2007-01-25 Serum Institute Of India Limited N- terminal peg conjugate of erythropoietin
SI2068909T1 (sl) * 2007-03-30 2012-09-28 Ambrx Inc Modificirani fgf-21 polipeptidi in njihova uporaba
KR101476472B1 (ko) 2007-03-30 2015-01-05 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
UY35874A (es) * 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210090649A (ko) 2021-07-20
EP3876996A1 (en) 2021-09-15
WO2020096958A1 (en) 2020-05-14
US20220017570A1 (en) 2022-01-20
CN113301922A (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6913066B2 (ja) 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト
US9708399B2 (en) Protein purification using displacement chromatography
US9957318B2 (en) Protein purification methods to reduce acidic species
EP2768857B1 (en) Methods of purifying antibodies
JP2022506649A (ja) Ｐｅｇ化タンパク質の精製方法
US20140288278A1 (en) Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates
JP5814978B2 (ja) ペグ化ポリペプチドの精製
ES2704013T3 (es) Procedimiento para la regeneración de una columna de cromatografía
WO2013177118A2 (en) Novel purification of non-human antibodies using protein a affinity chromatography
WO2013176754A1 (en) Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
KR20130131307A (ko) 단백질 정제
AU2019343053A1 (en) Methods for purifying heterodimeric, multispecific antibodies
KR20210021542A (ko) 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하는 방법
WO2020084503A1 (en) A composition comprising antibody with reduced level of basic variants thereof
WO2014142882A1 (en) Protein purification using displacement chromatography