JP2022500400A - 免疫療法プロファイリングのための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

免疫療法の薬力学的モニタリングのための組成物および方法が本明細書に提供される。この組成物は、プロテアーゼ基質に連結された免疫療法剤を含む。投与されると、この組成物は、応答性免疫療法中にプロテアーゼがアップレギュレートされる疾患の部位を標的とし、その後に付着した基質を切断する。切断断片は身体由来サンプルにおいて検出され、断片の検出は免疫療法剤の効果を示す。一実施形態では、治療薬は、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫チェックポイント阻害剤である。プロテアーゼ基質はまた、基質に隣接する消光分子と蛍光分子を含むことができる。一実施形態では、検出可能なシグナルは、プロテアーゼのペプチド断片である。

Description

発明の技術分野
本発明は、一般に免疫療法および免疫療法の薬力学的モニタリングに関する。

発明の背景
免疫療法は、癌、臓器移植拒絶反応、感染症、アレルギー性疾患、自己免疫および慢性炎症などの無数の疾患を処置するために免疫系を利用する。免疫療法は、治療用抗体（例えばペンブロリズマブ／αＰＤ−１）、サイトカイン（例えばプロロイキン／ＩＬ−２）、および細胞に基づく治療（例えばキムリア／ＣＡＲＴ細胞）を使用して、体液性と細胞性の両方の免疫応答を用いる。例えば、遺伝子操作された細胞の養子移入によるか、または免疫チェックポイント遮断抗体による内因性抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞の再活性化によってＴ細胞免疫を利用する新しい技術は、免疫療法を癌処置研究の最前線に置いている。共刺激遮断（例えば、アバタセプト／ＣＴＬＡ−４Ｉｇ）によってＴ細胞応答を弱める免疫療法も、移植片拒絶反応を予防するか、または自己免疫障害および慢性炎症性障害を処置するための処置研究の主要な手段になっている。

免疫療法の幅広い可能性にもかかわらず、大多数の患者は臨床上の利益を達成せず、他の患者は、よく理解されていないメカニズムで処置中または処置の間に免疫療法抵抗性を示す可能性がある。免疫療法に応答性の患者は、疾患が進行していると誤解され得る特殊な応答パターンを示す場合がある。そのため、免疫療法の利益は十分に得られず、免疫応答のバイオマーカーを特定する技術は不十分である。応答のモニタリングと根底にある抵抗性メカニズムの特定が不十分であるため、疾患が集団に存続するだけでなく、医薬品開発および臨床試験も重大な障害に直面している。

組織生検は、依然として至適基準の診断のままであるが、侵襲的であり、サンプルが全疾患部位の０．１％未満である（Ｃｙｌｌら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１１７（３）：３６７−３７５（２０１７））。リキッドバイオプシーは非侵襲的アプローチを提供するが、血液中のバイオマーカー希釈は感度を大幅に制限する（Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１７３）：１２３５−１２３９（２００７）；Ｈｏｒｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，３（１０９）：１０９ｒａ１６（２０１１））。イメージング技術も、感度および特異性が低いこと、ならびに一般的に免疫療法に関連する特殊な応答パターンによって制限される可能性があり、応答性の患者を処置失敗例として誤認する可能性がある。より優れた、非侵襲的なバイオマーカーが開発されれば、応答性の患者がより早く特定され、新しい免疫療法のメカニズムが明らかにされるであろう。
したがって、本発明の目的は、免疫チェックポイント組成物およびそれらの有効性をモニタリングするための方法を提供することである。

Ｃｙｌｌら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１１７（３）：３６７−３７５（２０１７） Ｎａｇｒａｔｈ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１７３）：１２３５−１２３９（２００７） Ｈｏｒｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，３（１０９）：１０９ｒａ１６（２０１１）

免疫療法中の応答の薬力学モニタリングのための組成物および方法が本明細書に提供される。例示的な組成物は、免疫細胞および疾患部位のプロテアーゼ活性を感知し、プロテアーゼ活性の存在下で検出可能なシグナルを生成する、プロテアーゼ基質に連結された免疫療法剤を含む。投与されると、この組成物は、応答性免疫療法中にプロテアーゼがアップレギュレートされる疾患の部位を標的とし、その後に付着した基質を切断する。切断断片は身体由来サンプルにおいて検出され、断片の検出は免疫療法剤の効果を示す。

一実施形態では、治療薬は、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫チェックポイント阻害剤である。プロテアーゼ基質はまた、基質に隣接する消光分子と蛍光分子を含むことができる。一実施形態では、検出可能なシグナルは、プロテアーゼのペプチド断片である。

別の実施形態は、治療薬によって促進されるプロテアーゼ活性に応答する検出可能なシグナルを提供する、プロテアーゼ基質に連結された有効量の治療薬を対象に投与し、対象からのサンプル中のシグナルを検出および測定し、対象に対する治療薬の効果を決定し（この際、検出可能なシグナルが検出された場合、対象は治療薬に対して応答性であると判定され、検出可能なシグナルが検出されない場合、対象は治療薬に対して非応答性であると判定される）、応答性の対象に同じ有効量の治療薬を投与するか、または非応答性の対象に投与される治療薬の有効量を調整することによる、疾患の処置または予防を必要とする対象において疾患を処置または予防する方法を提供する。一実施形態では、治療薬は、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫チェックポイント阻害剤である。

一実施形態では、免疫療法剤に対して非応答性であると判定された対象には、異なる免疫療法剤が投与される。

もう一つの実施形態では、シグナルを検出および測定することには、尿サンプルまたは血液サンプルなどのサンプルを対象から収集し、サンプル中の検出可能なシグナルを測定することが含まれる。

図１は、開示された組成物および方法の例示的な実験的使用の概略図である。プロテアーゼ基質は、治療活性のある治療薬の標的部位を機能化し、そこで付着した基質は、応答性治療中にアップレギュレートされたプロテアーゼによって切断され、尿への検出シグナルを増幅する。尿サンプルは質量分析によって分析される。

図２Ａは、「αＰＤ−１セラセンサー（ｔｈｅｒａｓｅｎｓｏｒｓ）」を生成するためのグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）基質とαＰＤ−１とのアミンカップリングの概略図である。図２Ｂは、ＧｚｍＢ基質で修飾されたαＰＤ−１（Ｔｈｅｒａｓｅｎｓｏｒ）と修飾されていないＰＤ−１（αＰＤ−１）によるＰＤ−１結合を示すグラフである。Ｘ軸はαＰＤ−１濃度（μｇ／ｍＬ；Ｌｏｇ１０）を表し、Ｙ軸はＰＤ−１結合を表す。図２Ｃは、未修飾のαＰＤ−１またはＧｚｍＢ基質で修飾されたαＰＤ−１（Ｔｈｅｒａｓｅｎｓｏｒ）で同等の染色を示すＣＤ８腫瘍浸潤Ｔ細胞のフロープロットである。図２Ｄは、図２Ｃの要約を図で表したものである。図２Ｅは、ＧｚｍＢの有り無しで、または対照プロテアーゼであるトロンビンでインキュベートしたＧｚｍＢ基質で修飾されたαＰＤ−１（Ｔｈｅｒａｓｅｎｓｏｒ）のプロテアーゼ切断速度を示すグラフである。 同上。

図３Ａは、「ＣＬＴＡ−４ Ｉｇセラセンサー」を生成するためのＧｚｍＢ基質とＣＴＬＡ−４ Ｉｇとのアミンカップリングの概略図である。図３Ｂ〜３Ｃは、ＣＤ８０／ＣＤ８６抗体競合アッセイにおける、ＧｚｍＢ基質で修飾されたＣＴＬＡ−４ＩＧ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ Ｔｈｅｒａｓｅｎｓｏｒ）または未修飾のＣＴＬＡ−４ Ｉｇ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）による標的結合を示すグラフである。図３Ｄは、αＣＤ４０Ｌのみ、αＣＤ４０Ｌ＋未修飾のＣＴＬＡ４−Ｉｇ（αＣＤ４０Ｌ＋ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、αＣＤ４０Ｌ＋修飾されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ（αＣＤ４０Ｌ＋Ｔｈｅｒａｓｅｎｓｏｒ）の存在下でＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞とともに共インキュベートしたＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）標識ＢＬ／６ ＣＤ８＋細胞の増殖を示す棒グラフである。図３Ｅは、ＧｚｍＢの有り無しで、または示されたプロテアーゼでインキュベートしたＧｚｍＢ基質で修飾したＣＴＬＡ−４ＩＧのプロテアーゼ切断速度を示す折れ線グラフである（略語：ＣＴＳＢ、カテプシンＢ；ＭＭＰ２、マトリックスメタロプロテイナーゼ２；ＭＭＰ９、マトリックスメタロプロテイナーゼ９；ＭＭＰ１５、マトリックスメタロプロテイナーゼ１５；Ｃ１Ｓ、補体成分Ｓ１；ＭＡＳＰ１、マンノース関連セリンプロテアーゼ１）。 同上。

図４Ａは、腫瘍細胞ではなく活性化Ｔ細胞の上清での、ＧｚｍＢ基質で修飾されたαＰＤ−１のＧｚｍＢによる切断の概略図である。図４Ｂは、ＧｚｍＢ基質で修飾されたαＰＤ−１（ＧｚｍＢセラセンサー）、対照セラセンサー、あるいは、αＰＤ−１を、活性化Ｔ細胞、ＣＴ２６細胞、ＭＣ３８細胞、Ｂ１６細胞の上清と、または媒体のみとインキュベートした場合のプロテアーゼ切断速度を示す折れ線グラフである。図４Ｃは、Ｔ細胞が腫瘍細胞を死滅させる間のαＰＤ−１セラセンサー切断の概略図である。図４Ｄは、ＬＤＨアッセイで測定された細胞毒性率を示す棒グラフである。図４Ｅは、ＥＬＩＳＡで決定されたＧｚｍＢタンパク質分泌を示す棒グラフである。エフェクター／標的比が増加すると（１：１、５：１、１０：１）、細胞死滅とＧｚｍＢ分泌の増加が観察された。図４Ｆは、エフェクター細胞と標的細胞の複数の比にわたる、対照およびαＰＤ−１セラセンサーのプロテアーゼ活性を示す棒グラフである。図４Ｇは、Ｐ−ＭｅｌまたはＯＴ−１とともにインキュベートした細胞における、αＰＤ−１セラセンサーのプロテアーゼ活性を示す棒グラフである。図４Ｈは、ＯＴ−Ｉ細胞と、ＯＶＡ発現ＥＧ７細胞または親の非ＯＶＡ発現ＥＬ４細胞株のいずれかとの共培養からの上清に添加されたＣＴＬＡ−４Ｉｇセラセンサーのプロテアーゼ活性を示す棒グラフである（Ｅ：Ｔ比は１：１、５：１、および１０：１）。 同上。 同上。

図５Ａは、ＧｚｍＢ基質で修飾されたαＰＤ−１（αＰＤ−１セラセンサー）またはアイソタイプ対照セラセンサーで処置されたマウスにおけるＭＣ３８同系腫瘍体積を経時的に示す折れ線グラフである。図５Ｂは、２回の処置投与量の後にＭＣ３８腫瘍から分離されたＣＤ８＋ＴＩＬ内の細胞内ＧｚｍＢ染色を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。図５Ｃおよび５Ｄは、腫瘍あたりのＧｚｍＢ陽性ＣＤ８ ＴＩＬのパーセンテージ（図５Ｃ）および数（図５Ｄ）を示すグラフである。図５Ｅは、担ＭＣ３８腫瘍マウスにおけるセラセンサーの尿分析のための実験方法の概略図である。図５Ｆは、対照セラセンサーまたはα−ＰＤ１セラセンサーで処置した担腫瘍マウスにおけるペプチド断片の腎クリアランスを示すグラフである。図５Ｇ〜５Ｈは、α−ＣＴＬＡ４単剤療法（図５Ｇ）、α−ＰＤ１／ＣＴＬＡ−４併用治療（図５Ｈ）で処置した、または未処置の担ＣＴ２６腫瘍マウスにおける腫瘍体積を経時的に示すグラフである。Ｘ軸は時間（日）を表し、Ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ^２）を表す。灰色の領域は処置ウィンドウを表す。図５Ｉは、１８日目のＣＴ２６腫瘍から分離されたＣＤ８＋ＴＩＬ内の細胞内ＧｚｍＢ染色を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。図５Ｊ〜５Ｋは、腫瘍あたりのＧｚｍＢ陽性ＣＤ８ ＴＩＬのパーセンテージ（図５Ｊ）および数（図５Ｋ）を示すグラフである。図５Ｌは、担ＣＴ２６腫瘍マウスにおけるセラセンサーの尿分析のための実験方法の概略図である。図５Ｍ〜５Ｎは、αＣＴＬＡ−４、αＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４で処置されたか、または未処置の担腫瘍マウスの尿中の切断された蛍光レポーターの腎クリアランスを示すグラフである。 同上。 同上。 同上。

図６Ａは、試験手順を示すタイムラインである。図６Ｂ〜６Ｉは、皮膚の同種移植片拒絶反応を経時的に示す写真である。図６Ｊは、同種移植片および同系移植片を有するマウスの移植片および健康な皮膚組織におけるＣＤ８染色の割合を示す免疫組織化学データのプロットである。図６Ｋは、同種移植片および同系移植片を有するマウスの移植片および健康な皮膚組織におけるＧｚｍＢ染色の割合を示す免疫組織化学データのプロットである。図６Ｌは、未処置マウス、ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびαＣＤ１５４による共刺激遮断治療への応答が弱い（「非応答性」）または強い（「応答性」）処置マウスにおける皮膚同種移植片の移植片の品質を示す皮膚移植片スコアのプロットである。図６Ｉは、未処置、非応答性、および応答性の移植片の生存率を示す移植片生存曲線である。図６Ｊは、ＰＯＤ−４、７、および１５の尿中の切断された蛍光レポーターの腎クリアランスの割合を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。

図７Ａは、Ｒｉａｚら、２０１７の患者コホートの概略図である。図７Ｂは、２５０の細胞外プロテアーゼを使用する、非応答者から応答者を分類するグラフである。図７Ｃは、ラッソアルゴリズムによって重要であると特定された１４の細胞外プロテアーゼを使用する、非応答者から応答者を分類するグラフである。図７Ｄは、図７Ｃの１４の細胞外プロテアーゼの重要性の相対的な重みを示すグラフである。図７Ｅ〜７Ｆは、経路分析による抵抗性メカニズムを特定するグラフである。図７Ｅは、ＩＦＮγ経路の発現の低下が１２のプロテアーゼのパネルで予測された非応答性患者を示す。図７Ｆは、同じ１２のプロテアーゼのパネルを使用して、ＭＨＣ Ｉ抗原提示の低下した非応答性患者が分類されたことを示す。図７Ｇは、応答者と非応答者の遺伝子発現を比較した際に、失われた各分子プロセス（ＩＦＮγおよびＭＨＣ Ｉ抗原提示）からの経路の割合を示すグラフである。図７Ｈは、ＭＨＣ Ｉ提示の低下の有無にかかわらず非応答者を分類する際のラッソ係数の相対的な重みを示すグラフである。 同上。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本開示は、本明細書に記載される組成物および方法、ならびに、それ自体が変化し得る記載される実験条件に限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は添付される特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものでないことも理解されたい。

別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の属する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の組成物、方法、および材料を本発明の実施または試験に使用することができる。言及されるすべての刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。

現在請求されている発明を説明する文脈での（特に特許請求の範囲の文脈での）用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の指示対象の使用は、本明細書で別段の指示がない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方をカバーすると解釈される。

本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内にある各個別の値を個別に言及する簡単な方法として機能することを単に意図するものであり、各個別の値は、それが本明細書で個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。

「約」という用語の使用は、およそ＋／−１０％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を記述することを意図する；他の実施形態では、値は、およそ＋／−５％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を変動することがある；他の実施形態では、値は、およそ＋／−２％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を変動することがある；他の実施形態では、値は、およそ＋／−１％の範囲で述べた値より上かまたは下の値を変動することがある。上記の範囲は、文脈によって明確にされることが意図され、それ以上の制限は暗示されていない。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別段の指示がない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で記載されるありとあらゆる例、または例示的な言い回し（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく解明することを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、特許請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すと解釈されるべきではない。

本明細書において、ある分子が第２の分子に「免疫特異的に結合」することができるとは、そのような結合がその同族抗原に対する抗体の特異性および親和性を示す場合をさす。抗体は、そのような結合が免疫グロブリン分子の抗原認識部位を含む場合に、抗原の標的領域または立体構造（「エピトープ」）に免疫特異的に結合することができると言われている。特定の抗原に免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原が、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ、または当技術分野で公知の他のアッセイによって決定される抗原認識部位によって認識される、何らかの配列または立体構造の類似性を有している場合には、より低い親和性で他の抗原に結合する可能性があるが、全く関係のない抗原には結合しない。しかし、一部の実施形態では、抗体（およびその抗原結合フラグメント）は他の抗原と交差反応しない。抗体はまた、Ｆｃ領域などの抗原認識部位を含まない分子の他の領域／ドメイン内の結合ドメインによって、免疫特異的ではない方法でＦｃＲ受容体などの他の分子に結合することがある。

本明細書において、「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有し、抗体の抗原結合フラグメントを含む免疫グロブリン分子を示すことを意図している。「可変領域」という用語は、免疫グロブリンのかかるドメインを、抗体が広く共有するドメイン（抗体Ｆｃドメインなど）と区別することを意図している。可変領域には、その残基が抗原結合に関与する「超可変領域」が含まれる。超可変領域には、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（すなわち、一般に軽鎖可変ドメインのおよそ２４〜３４残基（Ｌ１）、５０〜５６残基（Ｌ２）および８９〜９７残基（Ｌ３）と重鎖可変ドメインのおよそ２７〜３５残基（Ｈ１）、５０〜６５残基（Ｈ２）および９５〜１０２残基（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））ならびに／または「超可変ループ」の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの２６〜３２残基（Ｌ１）、５０〜５２残基（Ｌ２）および９１〜９６残基（Ｌ３）と、重鎖可変ドメインの２６〜３２残基（Ｈ１）、５３〜５５残基（Ｈ２）および９６〜１０１残基（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）が含まれる。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体という用語には、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｎｕｔｔａｌｌら、２０００，Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：２５３；ＲｅｉｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５；国際公開第９４／０４６７８号および国際公開第９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号参照）、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）参照）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、ダイアボディー、トライアボディ、テトラボディ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗体に対する抗Ｉｄおよび抗抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれる。特に、そのような抗体には、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子が含まれる。

本明細書において、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）および必要に応じて抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基を含み、抗原に免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の１またはそれを超える部分を指す。そのようなフラグメントには、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、およびその変異体、自然起源の変異体、ならびに抗体の「可変領域」抗原認識部位および異種タンパク質（例えば、毒素、異なる抗原の抗原認識部位、酵素、受容体または受容体リガンドなど）を含む融合タンパク質が含まれる。

本明細書において、「断片」という用語は、少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。

本明細書において、「調節する」という用語は、効果、結果、または活性（例えば、シグナル伝達）を変化させる能力に関する。そのような調節は、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得る。アンタゴニスト性の調節は、部分的（すなわち、減衰させるが消失させない）であってもよいし、そのような活性を完全に消失させることもできる（例えば、中和）。調節には、抗体の結合後の受容体の内在化または標的細胞上の受容体の発現の減少が含まれ得る。アゴニスト性の調節は、活性（例えば、シグナル伝達）を増強するか、そうでなければ活性を増加または増強することができる。さらに別の実施形態では、そのような調節は、誘発されたシグナル伝達の性質を変えるように、リガンドとその同族受容体の相互作用の性質を変えることができる。例えば、分子は、リガンドまたは受容体に結合することにより、そのような分子が他のリガンドまたは受容体に結合する能力を変化させ、それによってそれらの全体的な活性を変化させることができる。一部の実施形態では、そのような調節は、測定可能な免疫系活性の少なくとも１０％の変化、そのような活性の少なくとも５０％の変化、またはそのような活性の少なくとも２倍、５倍、１０倍、または少なくとも１００倍の変化をもたらす。

本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）に関係なく、任意の長さのアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドという用語には、タンパク質およびその断片が含まれる。ポリペプチドは、「外因性」であり得る。これは、それらが「異種」、すなわち細菌細胞により産生されるヒトポリペプチドなど、利用される宿主細胞に対して異質であることを意味する。ポリペプチドは本明細書においてアミノ酸残基配列として開示される。これらの配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に左から右に書かれている。標準的な命名法に従って、アミノ酸残基配列は、以下に示すように、３文字または１文字のコードで表される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。

本明細書において、「処置する」、「処置すること」、「処置」および「治療用途」という用語は、疾患または障害の１またはそれを超える 症状の除去、軽減または寛解を指す。本明細書において、「治療上有効な量」とは、そのような症状の臨床的に適切な除去、軽減または寛解を媒介するのに十分な治療薬の量を指す。効果は、その大きさが、レシピエント対象の健康または予後に影響を及ぼすのに十分であれば臨床的に適切である。治療上有効な量とは、疾患の発症を遅らせるか最小化する、例えば、癌の伝播を遅らせるか最小化するのに十分な治療薬の量を指し得る。また、治療上有効な量は、疾患の処置または管理において治療上の利益を提供する治療薬の量も指し得る。

本明細書において、「予防薬」という用語は、障害または疾患の症状を検出する前に、そのような障害または疾患の予防に使用することのできる薬剤を指す。「予防的に有効な」量は、そのような保護を媒介するのに十分な予防薬の量である。また、予防的に有効な量は、疾患の予防に予防的利益を提供する予防薬の量も指すことがある。

本明細書において、「免疫性」、「免疫学的」または「免疫」応答という用語は、レシピエント患者におけるペプチドに対する有益な液性（抗体媒介性）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物により媒介される）応答の発生である。そのような応答は、免疫原の投与によって誘発される能動的応答、あるいは抗体またはプライミングされたＴ細胞の投与によって誘発される受動的応答であり得る。細胞免疫応答は、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子に関連するポリペプチドエピトープの提示によって誘発され、抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。応答には、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、好酸球の活性化、好中球または自然免疫他の成分の活性化または動員も含まれることがある。細胞媒介性免疫応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって決定することができる。免疫原の保護または治療効果に対する液性および細胞性応答の相対的な寄与は、免疫された同系動物から抗体およびＴ細胞を別々に単離し、第２の対象における保護または治療効果を測定することによって区別することができる。

侵入している病原体の分子構造に特異的な活性化Ｔ細胞は、増殖し、侵入している病原体を攻撃する。これらの攻撃は、病原体を直接死滅させるか、または病原体の食作用を増強して感染を妨害する抗体を分泌することができる。一部のＴ細胞は自然免疫系のＡＰＣに応答し、サイトカインを放出することにより免疫応答を間接的に誘導する。

本明細書において、「免疫細胞」とは、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、およびマクロファージを含む造血起源の細胞を指す。

本明細書において、「炎症性分子」とは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、およびＭＭＰなどを含むがこれらに限定されない、サイトカインおよびメタロプロテアーゼなどを含むがこれらに限定されない炎症応答をもたらす分子をさす。

本明細書において、「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は本明細書において同義的に使用され、ヒト、マウスおよびラットなどのげっ歯類、ならびにその他の実験動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物をさす。

本明細書において、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、標準的な薬学的担体のいずれか、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水および乳濁液（油／水または水／油乳濁液など）、ならびに様々な種類の湿潤剤を包含する。

本明細書において、「免疫抑制」という用語は、免疫系ならびにその感染および他の疾患と戦う能力の抑制を指す。免疫抑制は、薬物によって意図的に誘導される場合もあり、特定の疾患、環境要因、または抗癌薬およびステロイドなどの他の薬物の副作用として生じる可能性もある。

本明細書において、「免疫抑制疾患」および「免疫不全疾患」という用語は、対象の免疫応答の部分的または完全な抑制または機能不全を特徴とする疾患をさす。

本明細書において、「癌」という用語は、細胞の異常で制御されない増殖に起因する新生物または腫瘍を指す。本明細書において、癌には、白血病およびリンパ腫が明示的に含まれる。「癌」という用語は、遠隔部位に転移する可能性を有し、非癌細胞とは異なる表現型の形質、例えば、軟寒天などの三次元基質でのコロニーの形成、あるいは三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物における管状ネットワークまたはウェブ様マトリックスの形成を示す細胞が関与する疾患を指す。非癌細胞は、軟寒天でコロニーを形成せず、三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物で明確な球状構造を形成する。
ＩＩ．免疫療法プロファイリングのための組成物および方法

本明細書では、疾患の処置を必要とする対象の疾患を処置することと、免疫療法に対する対象の免疫応答をプロファイリングすることの両方のための、免疫療法組成物およびその使用方法が提供される。例示的な組成物は、疾患もしくは組織に特異的なプロテアーゼにより免疫療法剤から切断される能力のあるプロテアーゼ基質と結合した免疫療法剤を含む。一実施形態では、免疫療法剤が疾患部位に到達して治療効果を与える場合、免疫プロテアーゼ活性の増加により、付着したプロテアーゼ基質が免疫療法剤から切断され、ペプチド断片または検出可能なシグナルを循環中に放出し、そこでそれは尿中に選択的に濾過される。循環する切断断片または検出可能なシグナルは、血液サンプルまたは尿サンプルなどの対象由来のサンプルにおいて検出することができる。
Ａ．免疫療法剤

一実施形態では、プロテアーゼ基質と結合している免疫療法剤はチェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤は、一般に、ペンブロリズマブ（αＰＤ１）またはイピリムマブ（αＣＴＬＡ−４）などの治療用抗体を用いて、ＰＤ−１などの阻害性免疫チェックポイント分子を遮断することにより、腫瘍微小環境内で免疫抑制を逆転させる（Ｔｕｍｅｈ ＰＣら、Ｎａｔｕｒｅ，５１５（７５２８）：５６８−７１（２０１４））。

一実施形態では、免疫療法剤は、抗体、抗原結合フラグメント、融合タンパク質、または小分子である。もう一つの実施形態では、免疫療法剤は、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療などのＴ細胞治療である。さらに別の実施形態では、免疫療法剤は免疫抑制剤である。免疫療法剤の標的は、以下で詳細に説明されている。
１．ＰＤ−１

Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ（プログラム細胞死）−１（ＰＤ−１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞上で誘導されると負の免疫応答を送達する。ＰＤ−１とそのリガンドの１つ（Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣ）との接触は、Ｔ細胞増殖ならびに／あるいはＴ細胞応答の強度および／または持続時間を減少させる抑制性の応答を誘導する。適したＰＤ−１アンタゴニストは、参照により本明細書にそれらの実体が具体的に組み込まれる米国特許第 ８，１１４，８４５、８，６０９，０８９号および同第８，７０９，４１６号に記載されており、それには、ＰＤ−１のリガンドに結合し、リガンドとＰＤ−１受容体との結合を妨害または阻害することを遮断するか、あるいは、ＰＤ−１受容体による抑制性シグナル伝達を誘導せずにＰＤ−１受容体に直接結合して遮断する化合物または薬剤が含まれる。

一部の実施形態では、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、抑制性シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体に直接結合し、ＰＤ−１受容体のリガンドにも結合して、リガンドがＰＤ−１受容体によるシグナル伝達を誘発することを低減または阻害する。ＰＤ−１受容体に結合して抑制性シグナルの伝達を誘発するリガンドの数および／または量を減少させることにより、ＰＤ−１シグナル伝達によって送達される負のシグナルによって弱まる細胞が少なくなり、より強固な免疫応答を実現することができる。

ＰＤ−１シグナル伝達は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されたペプチド抗原に非常に近接しているＰＤ−１リガンド（Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣなど）に結合することによって駆動されると考えられている（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１０５：１０２７５−１０２７６（２００８）参照）。したがって、Ｔ細胞膜上でのＰＤ−１とＴＣＲの共連結（ｃｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）を妨げるタンパク質、抗体、または小分子も、有用なＰＤ−１アンタゴニストである。

一部の実施形態では、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、ＰＤ−１のリガンドまたはＰＤ−１自体との結合によりＰＤ−１受容体シグナル伝達を低減または妨害する小分子アンタゴニストまたは抗体である（特に、ＰＤ−１とＴＣＲの共連結がそのような結合に従わず、それによってＰＤ−１受容体による抑制性シグナル伝達を引き起こさない場合）。

本発明の方法によって企図される他のＰＤ−１アンタゴニストには、ＰＤ−１またはＰＤ−１のリガンドに結合する抗体、および他の抗体が含まれる。

適した抗ＰＤ−１抗体としては、以下の米国特許第７３３２５８２号、同第７４８８８０２号、同第７５２１０５１号、同第７５２４４９８号、同第７５６３８６９号、同第７９８１４１６号、同第８０８８９０５号、同第８２８７８５６号、同第８５８０２４７号、同第８７２８４７４号、同第８７７９１０５号、同第９０６７９９９号、同第９０７３９９４号、同第９０８４７７６号、同第９２０５１４８号、同第９３５８２８９号、同第９３８７２４７号、同第９４９２５３９号、同第９４９２５４０号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらはすべて、参照によりその全体が組み込まれる。

例示的な抗Ｂ７−Ｈ１（抗ＰＤ−Ｌ１とも呼ばれる）抗体としては、以下の米国特許第８３８３７９６号、同第９１０２７２５号、同第９２７３１３５号、同第９３９３３０１号、および同第９５８０５０７号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。これらはすべて、参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれる。

抗Ｂ７−ＤＣ（抗ＰＤ−Ｌ２とも呼ばれる）抗体については、米国第７，４１１，０５１号、同第７，０５２，６９４号、同第７，３９０，８８８号、同第８１８８２３８号、および同第９２５５１４７号を参照されたい。これらはすべて、参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれる。

他の例示的なＰＤ−１受容体アンタゴニストには、限定されるものではないが、Ｂ７−ＤＣポリペプチドが含まれ、それにはこれらのホモログおよび変異体、ならびに前述のいずれかの活性断片、およびこれらのいずれかを組み込んだ融合タンパク質が含まれる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧなどの抗体のＦｃ部分に結合したＢ７−ＤＣの可溶性部分を含み、ヒトＢ７−ＤＣの膜貫通部分の全部または一部は組み込んでいない。

ＰＤ−１アンタゴニストはまた、例えばマウスまたはヒトなどの霊長類由来の哺乳動物Ｂ７−Ｈ１の断片であり得る。ここで、断片はＰＤ−１に結合して遮断するが、ＰＤ−１による抑制性シグナル伝達をもたらさない。断片は、融合タンパク質、例えばＩｇ融合タンパク質の部分でもあり得る。

他の有用なポリペプチドであるＰＤ−１アンタゴニストには、ＰＤ−１受容体のリガンドに結合するものが含まれる。これらには、Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣなどのＰＤ−１リガンドに結合し、内因性ＰＤ−１受容体への結合を防ぎ、それによって抑制性シグナル伝達を防ぐことができるＰＤ−１受容体タンパク質またはその可溶性フラグメントが含まれる。Ｂ７−Ｈ１は、タンパク質Ｂ７．１に結合することも示されている（Ｂｕｔｔｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１１１−１２２，（２００７））。このような断片には、天然リガンドとの結合を増加させるＡ９９Ｌ突然変異などの突然変異を含むＰＤ−１タンパク質の可溶性ＥＣＤ部分も含まれる（Ｍｏｌｎａｒら、ＰＮＡＳ，１０５：１０４８３−１０４８８（２００８））。Ｂ７−Ｈ１リガンドに結合し、内因性ＰＤ−１受容体との結合を防ぎ、それによって抑制性シグナル伝達を防ぐことができるＢ７−１またはその可溶性断片も有用である。

ＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１アンチセンス核酸（ＤＮＡとＲＮＡの両方）、ならびにｓｉＲＮＡ分子もＰＤ−１アンタゴニストになり得る。このようなアンチセンス分子は、Ｔ細胞でのＰＤ−１の発現、ならびに、Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２などのＴ細胞リガンドの産生を防ぐ。例えば、ポリエチレンイミンなどの担体と複合体を形成したｓｉＲＮＡ（例えば、長さが約２１ヌクレオチドであり、ＰＤ−１をコードする遺伝子、またはＰＤ−１リガンドをコードする遺伝子に特異的であり、そのオリゴヌクレオチドは商業的に容易に購入することができるもの）（Ｃｕｂｉｌｌｏｓ−Ｒｕｉｚら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９（８）：２２３１−２２４４（２００９）参照）は、ＰＤ−１ならびにＰＤ−１のリガンドを発現している細胞に容易に取り込まれ、これらの受容体およびリガンドの発現を低下させて、Ｔ細胞において抑制性シグナル伝達の低下を達成し、それによりＴ細胞を活性化させる。
２．ＣＴＬＡ４

細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）は、免疫チェックポイントとして機能し、免疫応答をダウンレギュレートするタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞で構成的に発現するが、活性化後は従来のＴ細胞でのみアップレギュレートされる。ＣＴＬＡ４は抑制性シグナルをＴ細胞に伝達する。一部の実施形態では、免疫療法剤は、ＣＴＬＡ４のアンタゴニスト、例えばアンタゴニスト性の抗ＣＴＬＡ４抗体である。本発明の方法での使用が企図される抗ＣＴＬＡ４抗体の例としては、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３６９０号（Ｆｉｓｃｈｋｏｆｆら、ＷＯ／２００７／０５６５３９号）に記載される抗体が挙げられる。

本発明の方法に有用な抗ＣＴＬＡ４抗体の具体例としては、例えば約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるヒト抗ＣＴＬＡ４抗体のイピリムマブ、および例えば約１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるヒト抗ＣＴＬＡ４抗体のトレメリムマブが挙げられる。２００９年１２月にオンラインで公開されたＳａｍｍａｒｔｉｎｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｋｉｄｎｅｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，３（２）：１３５−１３７（２０１０）も参照されたい。

他の実施形態では、アンタゴニストは小分子である。一連の小型の有機化合物は、Ｂ７−１リガンドに結合してＣＴＬＡ４との結合を防ぐことが示されている（Ｅｒｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：７３６３−７３６８（２００２）参照）。このような小型の有機物は、単独で、または抗ＣＴＬＡ４抗体と一緒に投与されて、Ｔ細胞の抑制性シグナル伝達を低下させることができた。
３．その他の免疫チェックポイント阻害剤

もう一つの実施形態では、免疫療法剤は、限定されるものではないが、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７、およびＳＩＧＬＥＣ９などの他の免疫チェックポイント分子の活性を阻害する免疫チェックポイント阻害剤である。

ＣＤ２７６としても公知であるＢ７−Ｈ３は、Ｂ７ファミリーの免疫チェックポイント分子である。Ｂ７−Ｈ３は、Ｔ細胞性免疫応答の調節に関与している。また、これはナチュラルキラーに媒介される細胞溶解の阻害による腫瘍細胞を保護する役割と、神経芽細胞腫細胞を検出するためのマーカーの役割も果たす。また、これは急性および慢性の移植拒絶反応の発症、および粘膜表面でのリンパ球活性の調節にも関与している。Ｂ７−Ｈ３免疫療法剤は当技術分野で公知である。例示的な抗Ｂ７−Ｈ４剤としては、そのすべてが参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれる、以下の米国特許第７８４７０８１号、同第８８０２０９１号、および同第９３７１３９５号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、免疫抑制特性をもつトリプトファン分解酵素である。ＩＤＯは、Ｔ細胞とＮＫ細胞を抑制し、Ｔｒｅｇと骨髄系由来サプレッサー細胞を生成して活性化し、腫瘍血管新生を促進することが公知である。ＩＤＯ免疫療法剤は当技術分野で公知である。例示的な抗ＩＤＯ剤としては、そのすべてが参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれる、以下の米国特許第７５９８２８７号、同第９５９８４２２号、および同第１０３２３００４号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）は、抗原活性化Ｔ細胞の抑制性受容体である。ＬＡＧ３は、ＦＧＬ１などのリガンドに結合すると抑制性シグナルを送達する。ＴＣＲの関与の後、ＬＡＧ３は免疫シナプスでＣＤ３−ＴＣＲと会合し、Ｔ細胞の活性化を直接阻害する。ＬＡＧ３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞への直接的な効果だけでなく、Ｔｒｅｇへの作用によって免疫応答を抑制する。ＬＡＧ３免疫療法剤は当技術分野で公知である。例示的な抗ＬＡＧ３剤としては、そのすべてが参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれる、以下の米国特許第１０１８８７３０号、および同第１０３５８４９５号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｔ細胞活性化のＶ型免疫グロブリンドメイン含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）は、Ｔ細胞応答を阻害する免疫調節受容体である。ＶＩＳＴＡは造血細胞で発現する。ＶＩＳＴＡ免疫療法剤は当技術分野で公知である。例示的な抗ＶＩＳＴＡ剤としては、そのすべてが参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれる、以下の米国特許第９３８１２４４号および同第１０２７３３０１号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
４．ＣＡＲ−Ｔ細胞

開示される組成物および方法での使用が企図されている免疫療法のもう一つの形態は、ＣＡＲ−Ｔ細胞である。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、人工Ｔ細胞受容体を産生するように遺伝子操作されたＴ細胞である。これにより、操作されたＴ細胞は特定のタンパク質を標的とする能力を持つ。ＣＡＲ−Ｔ免疫療法の基本は、癌細胞を認識するようにＴ細胞を改変して、癌細胞をより効果的に標的にして破壊することである。Ｔ細胞は対象から収集され、特定のＴ細胞受容体を発現するように遺伝子改変され、次に、結果として得られるＣＡＲ−Ｔ細胞が対象に注入されてその腫瘍を攻撃する。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、対象自身の血液中のＴ細胞に由来するもの（自己由来）か、または他の健康なドナーのＴ細胞に由来するもの（同種異系由来）のいずれかであり得る。対象から分離されると、これらのＴ細胞は、特定のＣＡＲを発現するように遺伝子操作され、腫瘍の表面に存在する抗原を標的とするようにプログラムされる。安全のために、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、健康な細胞では発現しない、腫瘍で発現する抗原に特異的になるように操作されている。

一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞が罹患細胞に影響を与えるときに産生されるプロテアーゼによってＣＡＲ−Ｔ細胞から切断されるプロテアーゼ基質と結合している。そのような実施形態では、対象の尿中に分離された検出可能なシグナルが検出されることにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞が対象に効果を与えていることが示される。
５．免疫抑制剤

もう一つの実施形態では、免疫療法剤は免疫抑制剤である。免疫抑制剤には、他のリンパ球表面マーカー（例えば、ＣＤ４０、α−４インテグリン）に対するまたはサイトカインに対する抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（オレンシア（登録商標））、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（エンブレル（登録商標）））、ＴＮＦ−αブロッカー（エンブレル、レミケード、シムジアおよびヒュミラなど）、シクロホスファミド（ＣＴＸ）（すなわち、エンドキサン（登録商標）、シトキサン（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、メトトレキサート（ＭＴＸ）（すなわち、リウマトレックス（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））、ベリムマブ（すなわち、ベンリスタ（登録商標））、または他の免疫抑制薬（例えば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６様化合物、ラパマイシン化合物、またはステロイド）、抗増殖剤、細胞傷害性薬剤、あるいは免疫抑制を助ける可能性がある他の化合物があるが、これらに限定されない。

免疫抑制剤は、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（アバタセプト）などのＣＴＬＡ−４融合タンパク質であり得る。ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質は、抗原提示細胞上のＣＤ８０／ＣＤ８６（Ｂ７−１／Ｂ７−２）への結合について、Ｔ細胞上の共刺激受容体ＣＤ２８と競合し、したがってＴ細胞の活性化を阻害するように機能する。もう一つの実施形態では、免疫抑制剤は、ベラタセプトとして公知のＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質である。ベラタセプトは、インビボでのＣＤ８６とのその結合活性を著しく高める２つのアミノ酸置換（Ｌ１０４ＥおよびＡ２９Ｙ）を含む。もう一つの実施形態では、免疫抑制剤はＭａｘｙ−４である。

もう一つの実施形態では、免疫抑制剤はシクロホスファミド（ＣＴＸ）である。シクロホスファミド（エンドキサン（登録商標）、シトキサン（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標）の一般名）、サイトホスファンとしても知られ、オキサゾホリン群のナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。これは様々な種類の癌および一部の自己免疫障害を処置するために使用される。シクロホスファミド（ＣＴＸ）は、腎ループス患者のびまん性増殖性糸球体腎炎に使用される主要な薬物である。

本明細書で使用される用語「ラパマイシン化合物」には、中性の三環式化合物であるラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、およびラパマイシンと同じ作用機序（例えば、サイトカイン機能の阻害）を有すると考えられる他のマクロライド化合物が含まれる。「ラパマイシン化合物」という用語は、ラパマイシンと構造的に類似している化合物、例えば、それらの治療効果を高めるために修飾された類似の大環状構造を有する化合物を含む。例示的なラパマイシン化合物は当技術分野で公知である（例えば国際公開第９５１２２９７２号、国際公開第９５１１６６９１号、国際公開第９５１０４７３８号、米国特許第６，０１５，８０９号；同第５，９８９，５９１号；米国特許第５，５６７，７０９号；同第５，５５９，１１２号；同第５，５３０，００６号；同第５，４８４，７９０号；同第５，３８５，９０８号；同第５，２０２，３３２号；同第５，１６２，３３３号；同第５，７８０，４６２号；同第５，１２０，７２７号参照）。

「ＦＫ５０６様化合物」という用語は、ＦＫ５０６、およびＦＫ５０６誘導体および類似体、例えば、ＦＫ５０６と構造的に類似している化合物、例えば、その治療効果を高めるように修飾された類似の大環状構造を有する化合物を含む。ＦＫ５０６様化合物の例としては、例えば、国際公開第００１０１３８５号に記載されるものが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で使用される「ラパマイシン化合物」という用語は、ＦＫ５０６様化合物を含まない。
Ｂ．検出可能なシグナル分子

開示される免疫療法剤は、プロテアーゼによって切断されるプロテアーゼ基質と結合し、ペプチド断片または治療薬からの検出可能なシグナルを放出する。一部の実施形態では、検出シグナルは、プロテアーゼ基質自体の切断産物またはペプチド断片である。切断されると、プロテアーゼの断片が循環に放出され、質量分析によって尿で検出される。

他の実施形態では、検出シグナルは、切断部位の前の消光分子と切断部位の後の蛍光レポーターで操作されたプロテアーゼ基質である。プロテアーゼ基質が切断されると、消光剤と蛍光レポーターは分離され、レポーターが循環に放出される。蛍光シグナルは、フローサイトメトリーなどの標準的な方法で尿中で検出される。

プロテアーゼ基質は、当分野で公知の方法を使用して免疫療法剤に結合させることができる。一実施形態では、プロテアーゼ基質は、プロテアーゼ基質と免疫療法剤との間に共有結合体を形成するリンカーを導入することによって免疫療法剤に結合される。プロテアーゼ基質を連結するために使用することができる例示的な反応としては、ＮＨＳエステルを使用するアミン−アミン架橋、マレイミドを使用するチオール−チオール架橋、ＮＨＳエステルとマレイミドを使用するアミン−チオール架橋、およびビオチン／ストレプトアビジン相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、プロテアーゼ基質は、アミンカップリング反応によって免疫療法剤に結合される。
１．プロテアーゼ基質

治療応答の有効性を決定するための開示された組成物およびそれらの使用方法は、プロテアーゼ基質を切断し、ペプチド断片または治療薬からの検出可能なシグナルを放出するプロテアーゼ活性に依存している。プロテアーゼは、ヒトゲノム内にコードされた５５０を超えるメンバーを含む酵素のクラスであり、その多くは、免疫における重要な役割を含む、疾患に特異的な役割を有する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞に媒介される標的細胞の死滅は、プロテアーゼ主導のプロセスであり、１）細胞死受容体のシグナル伝達と、その活性が細胞死を媒介するプロテアーゼであるカスパーゼの活性化、および２）パーフォリン依存性メカニズムによって標的細胞に入りカスパーゼ媒介細胞死を活性化するプロテアーゼであるグランザイムの分泌を伴う。さらに、プロテアーゼは、細胞移動、マトリックスの分解と修復、および補体の活性化を含む、免疫活性の他の側面の中核をなし、一方で、炎症性プロテアーゼおよびマトリックス分解プロテアーゼなどの腫瘍プロテアーゼは、癌の特徴として確立されている（Ａｒｉａｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ，３（６）：４０７−４２２（２０１７）；Ｅｇｅｂｌａｄら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２（３）：１６１−１７４（２００２））。

プロテアーゼが免疫、腫瘍学、および複数の疾患の病態生理学の根底にある生物学において中心的な役割を果たしていることを考えると、プロテアーゼは免疫療法応答モニタリングのための革新的なアプローチを提供する（Ｄｕｄａｎｉら、Ａｎｎ Ｒｅｖ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２０１８））。例えば、「熱い」腫瘍のマークは、主にパーフォリン依存性のグランザイムに媒介される経路によって癌細胞を死滅させる細胞傷害性Ｔ細胞の効果的な免疫浸潤によって示され、グランザイムは強力なセリンプロテアーゼのファミリーを構成する（Ｌａｒｉｍｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７７（９）：２３１８−２３２７（２０１７）；Ｖｏｓｋｏｂｏｉｎｉｋら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５（６）：３８８−４００（２０１５））。炎症性プロテアーゼおよびマトリックス分解プロテアーゼを含むプロテアーゼの腫瘍発現は、血管新生、成長、および転移をはじめとする基本的な腫瘍生物学の特徴として十分に確立されている（Ｄｕｄａｎｉら、Ａｎｎ Ｒｅｖ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２０１８））。これらのプロテアーゼシグネチャは、癌のステージ分類、進行および退行の監視、および薬物応答の初期徴候を得るために使用することができる。一実施形態では、開示された免疫療法剤は、処置の初期に免疫および疾患部位特異的プロテアーゼの活性を定量化して、治療効果を予測し、免疫療法に対する抵抗性を示す活性バイオマーカーの特定を可能にする能力を有する。

一実施形態では、触媒プロテアーゼは、疾患または治療部位での検出シグナルを増幅する（１０００倍）。プロテアーゼ切断に続いて、本明細書に開示される免疫療法剤は、血液で希釈される代わりに、尿に濃縮され、さらにシグナルを１００倍にまで濃縮する。これにより、疾患部位でのＸ線検査で検出可能な変化に先だって、Ｔ細胞活性の超高感度かつ早期検出が可能になる。

プロテアーゼ基質には、プロテアーゼが切断するための認識配列が含まれている。免疫療法剤に結合したプロテアーゼ基質の切断は、免疫療法剤から基質に連結された検出可能なシグナル分子の基質のペプチド断片を放出する。一部の実施形態では、免疫療法剤に結合しているプロテアーゼ基質は、腫瘍特異的プロテアーゼ基質である。例示的な腫瘍関連プロテアーゼとしては、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン１、カリクレイン３（ＰＳＡ）、カリクレイン１０、カリクレイン１５、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、カスパーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、およびＡＤＡＭなどのマトリックスメタロプロテイナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。もう一つの実施形態では、プロテアーゼ基質は、Ｔ細胞特異的プロテアーゼ基質などの細胞特異的プロテアーゼ基質である。例示的な細胞特異的プロテアーゼとしては、カテプシンＧ、好中球エラスターゼ、およびプロテイナーゼ３などの好中球セリンプロテアーゼ、粘膜関連リンパ組織１（ＭＡＬＴ１）、グランザイム、およびカスパーゼ−３、−６、−７、−８などのカスパーゼファミリーのシステインプロテイナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
２．その他の検出分子

一部の実施形態では、検出シグナルは、切断部位の前の消光分子と切断部位の後のフルオロフォアまたは蛍光レポーターで操作されたプロテアーゼ基質である。消光分子は当技術分野で公知である。例示的な消光分子としては、Ｄｅｅｐ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１（登録商標）、ＢＨＱ−２（登録商標）、ＢＨＱ−３（登録商標）、ＢＢＱ（登録商標）−６５０、ＥＣＬＩＰＳＥ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）消光剤、およびＱＳＹが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なフルオロフォアまたは蛍光レポーターとしては、６−ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、シアニン３、ＲＯＸ（商標）、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、シアニン５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、プロテアーゼ基質は、アビジン、ビオチン、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのその他の検出可能な分子で操作される。そのような実施形態では、検出可能な分子は、免疫療法剤に付着したままであるプロテアーゼ基質から切断され、循環中に放出される。次に、検出可能な分子は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、イムノアッセイ、および生物発光アッセイなどであるがこれらに限定されない適切な検出方法を使用して、尿サンプル中で検出される。
Ｃ．薬学的組成物

開示される活性感知免疫療法剤を含む医薬組成物が提供される。免疫療法剤を含む薬学的組成物は、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン泳動もしくはエレクトロポレーションを使用）、または経粘膜（鼻腔、膣、直腸、または舌下）の投与経路によるか、あるいは生体浸食性インサートを使用して投与することができ、各投与経路に適切な剤形に製剤化することができる。

一部のインビボアプローチでは、本明細書に開示される組成物は、治療上有効な量で対象に投与される。本明細書において、「有効量」または「治療上有効な量」という用語は、処置されている障害の１またはそれを超える症状を処置、阻害、または軽減するのに十分な、あるいは、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を提供するのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、および実施される処置などの多様な要因によって異なることになる。

開示される免疫調節剤については、さらなる研究が行われるにつれて、様々な患者の様々な症状の処置のための適切な投与量レベルに関する情報が明らかになることになり、通常の熟練者であれば、レシピエントの治療の状況、年齢、全体的な健康を考慮して、適した投薬を確認することができるであろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の処置期間に依存する。開示された免疫調節剤の場合、一般に、毎日０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルが哺乳動物に投与される。抗ＰＤ−１、抗Ｂ７−Ｈ１、および抗ＣＴＬＡ４抗体の投与量は、当技術分野で公知であり、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、または１〜５０ｍｇ／ｋｇ、または１０〜２０ｍｇ／ｋｇのより短い範囲であり得る。ヒト対象に対する適切な用量は、５〜１５ｍｇ／ｋｇの間であり得、１０ｍｇ／ｋｇの抗体（例えば、ヒト抗ＰＤ−１抗体）が特定の実施形態である。一般に、静脈内注射または注入の場合、投与量は少なくなる可能性がある。

特定の実施形態では、免疫調節剤は、例えば処置される部位に直接注射することにより、局所的に投与される。一般に、この注射により、全身投与によって得られる濃度よりも高い免疫調節剤組成物の局所濃度が得られる。免疫調節剤組成物は、上記のようにマトリックスと組み合わせることで、処置される部位からのポリペプチドの受動拡散を減少させることにより、ポリペプチド組成物の局所濃度を高めるのを助けることができる。
１．非経口投与のための製剤

一部の実施形態では、ペプチドおよびポリペプチドを含むものを含む、本明細書に開示される組成物は、非経口注射によって水溶液中で投与される。製剤はまた、懸濁液または乳濁液の形態であってもよい。一般に、薬学的組成物は、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含んで提供され、必要に応じて、薬学的に許容され得る希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体を含む。そのような組成物は、必要に応じて、以下の１またはそれを超える成分を含む：希釈剤、滅菌水、様々な緩衝液内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝生理食塩水；および洗剤および可溶化剤などの添加剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート−８０））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、および防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）。非水性溶媒または媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。製剤は、使用直前に凍結乾燥し、再溶解／再懸濁してよい。製剤の滅菌は、例えば、細菌保持フィルタによる濾過によって、組成物を滅菌剤に組み込むことによって、組成物を照射することによって、または組成物を加熱することによっておこなってよい。
２．経口投与のための製剤

実施形態では、組成物は経口送達用に製剤化される。経口固形剤形は、一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．１８０４２）第８９章に記載されている。固形剤形には、錠剤、カプセル剤、ピル、トローチまたはロゼンジ、カシェ、ペレット、粉末、または顆粒、あるいはポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の粒状調製物またはリポソームへの材料の組み込みが含まれる。このような組成物は、開示物の物理的状態、安定性、生体内での放出の速度、および生体内クリアランス速度に影響を与えることがある。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２）１４３５−１７１２頁を参照されたい。組成物は、液体形態で調製されてもよいし、乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）形態であってもよい。リポソームまたはプロテイノイドカプセル化を使用して、組成物を製剤化してもよい。リポソームカプセル化を使用してもよく、リポソームを様々なポリマーで誘導体化してもよい（例えば、米国特許第 ５，０１３，５５６）。Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｉｎ：Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ Ｃｈａｐｔｅｒ １０，１９７９も参照されたい。一般に、製剤は、ペプチド（またはその化学修飾形態）と、胃環境でペプチドを保護し、腸で生物活性物質を放出する不活性成分を含む。

薬剤は、誘導体の経口送達が効果的であるように化学的に修飾することができる。一般に、企図される化学修飾は、少なくとも１つの部分を成分の分子自体に付着させることであり、その部分は、胃または腸からの血流の取り込み、あるいは腸粘膜への直接の取り込みを可能にする。また、１または複数の成分の全体的な安定性の向上および体内の循環時間の増加も望まれる。ペグ化は、医薬品用途の化学修飾の例である。使用できる他の部分としては、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカンが挙げられる［例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（１９８１）「Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ，」ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ．Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ、ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）ｐｐ．３６７−３８３；およびＮｅｗｍａｒｋら（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９参照］。

もう一つの実施形態は、薬学的に許容され得る乳濁液、溶液、懸濁液、およびシロップ剤をはじめとする経口投与用の液体剤形を提供し、これらは不活性希釈剤；湿潤剤、乳化剤、懸濁剤などのアジュバント；および甘味料、香味料、および香料をはじめとする他の成分を含んでいてもよい。

制御放出経口製剤が望ましい場合がある。薬剤は、拡散または浸出メカニズムのいずれかによる放出を可能にする不活性マトリックス、例えばガムに組み込むことができる。また、徐々に変性するマトリックスを製剤に組み込んでもよい。制御放出のもう一つの形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく、すなわち、薬物は、浸透圧効果によって水を入れ、一つの小さな開口部から薬物を押し出すことを可能にする半透膜に封入されている。

経口製剤の場合、放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、または回腸）、または大腸であってよい。一部の実施形態では、放出は、薬剤（または誘導体）の保護によるかまたは腸内などの胃環境を超えた薬剤（または誘導体）の放出のいずれかによって、胃環境の有害な影響を回避するであろう。十分な胃の抵抗性を確保するために、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性のコーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ（商標）、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ（商標）、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ（商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ（商標）、およびＳｈｅｌｌａｃ（商標）である。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。
３．局所投与のための製剤

開示される免疫療法剤は、局所的に適用することができる。局所投与は、ほとんどのペプチド製剤ではうまく機能しないが、特に肺、鼻、鼻腔（舌下、頬側）、膣、または直腸粘膜に適用した場合に効果的であり得る。

組成物は、空気力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾルまたは噴霧乾燥粒子のいずれかとして送達される場合、吸入時に肺に送達され、肺上皮内層を横切って血流に移動することができる。

治療薬の肺送達用に設計された広範囲の機械的装置を使用することができ、それには、限定されるものではないが、ネブライザー、定量噴霧式吸入器、および粉末吸入器が挙げられ、これらはすべて当業者の精通するものである。市販の装置のいくつかの具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量噴霧式吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）である。Ｎｅｋｔａｒ社、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社、およびＭａｎｎｋｉｎｄ社はすべて、承認されたかまたは臨床試験中の吸入可能なインスリン粉末調製物を有しており、この技術を本明細書に記載の製剤に適用することができ得る。

粘膜に投与するための製剤は、一般に噴霧乾燥された薬物粒子であり、これは、錠剤、ゲル、カプセル懸濁液、または乳濁液に組み込むことができる。標準的な医薬品添加物はどの製剤業者からも入手可能である。

経皮製剤も調製することができる。これらは、一般に軟膏、ローション、スプレー、またはパッチとなり、それらはすべて標準的な技術を使用して調製することができる。経皮製剤は、浸透促進剤の包含を必要とする場合がある。
Ｄ．使用方法

開示される活性感知免疫療法剤は、疾患または障害の処置のために免疫療法剤を投与されている対象における免疫療法応答の予測および薬力学的モニタリングに有用である。そのような用途では、対象は、疾患または障害の処置を受けており、単一の組成物を使用する処置への応答について非侵襲的に監視されている。一実施形態では、対象は、免疫療法剤または免疫療法剤を含む組成物を投与される。一定期間後、サンプルが対象から採取される。サンプルは血液または尿であり得る。サンプルは、免疫療法剤に関連する検出可能なシグナルの存在について分析される。一実施形態では、検出可能なシグナルは、ＥＬＩＳＡ、質量分析、フローサイトメトリー、比色分析、バイオルミネッセンス、またはイムノアッセイによって分析される。

一実施形態では、検出可能なシグナル分子が検出可能な限界を超えてサンプル中に存在する場合、対象は処置に応答性であるとみなされ、最初に投与された有効量で残りの治療計画が投与される。検出可能なシグナル分子がサンプル中に存在しない場合、被験者は非応答性であるとみなされ、治療計画から外されるか、または治療計画の投与量を次の投与量まで増やし、検出プロセスが繰り返される。対象が尿サンプル中に検出可能なシグナル分子の兆候を継続的に示さない場合、その対象は治療計画から外される。一部の実施形態では、対象は、本明細書に開示される異なる治療薬に切り替えられるか、または対象は、化学療法またはＣＡＲ−Ｔ細胞治療などの異なる種類の治療に切り替えられる。

もう一つの実施形態では、複数の免疫療法剤または複数の免疫療法剤を含む組成物が対象に投与され、対象の尿中の検出可能なシグナルの各々を分析してシグナルプロファイルが作製される。そのような実施形態では、免疫療法剤のパネルを用いて非応答性の対象の抵抗性のメカニズムを区別することができる。開示される免疫療法剤は、対象が免疫療法に対して一次抵抗性を有するか、または後天性抵抗性を有するかを判断することができる。一次抵抗性では、対象は、免疫療法剤の初回投与時に免疫療法剤に非応答性である。一部の実施形態では、対象は、腫瘍抗原がないためにＴ細胞に認識されないため、一次抵抗性を有する。他の実施形態では、癌細胞は腫瘍抗原を持っているかもしれないが、ＭＨＣによって制限された表面に抗原を提示することを回避するメカニズムを開発する可能性がある。

後天性抵抗性は、免疫療法剤に対する、その後にその免疫療法剤を投与した際の抵抗性である。一部の実施形態では、後天性抵抗性は、Ｔ細胞機能の低下、腫瘍抗原提示のダウンレギュレーションによるＴ細胞認識の不足、および癌におけるエスケープ突然変異体の発生が原因で生じる。一実施形態では、発現パターンによって対象を異なるクラスの免疫療法剤抵抗性に分類することができる、免疫療法剤のパネルが構築される。免疫療法抵抗性の一般的なメカニズムとしては、ＩＦＮ−γに対する感度の低下、ＭＨＣ上の受容体の発現の低下、阻害性受容体の共発現、代替阻害チェックポイントのアップレギュレーション、および腫瘍における高い突然変異過負荷が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、癌抵抗性プロテアーゼは当技術分野で公知であり、そのようなプロテアーゼのパネルを用いて抵抗性を分類することができる。一実施形態では、ＩＦＮ−γによるシグナル伝達の低下に起因する抵抗性は、ＧＺＭＡ、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ４８、ＫＬＫ１５、ＭＭＰ２１、ＣＰＡ１、ＭＭＰ２３Ａ、ＣＴＲＢ１、ＭＭＰ２４、ＰＲＳＳ３Ｐ２、ＴＰＳＧ１、ＯＶＣＨ２、ＰＨＥＸ、およびＫＬＫ１４の全部または一部を含むがこれらに限定されないプロテアーゼ基質を結合させた、免疫療法剤のパネルを使用して判定することができる。もう一つの実施形態では、ＭＨＣ Ｉでのβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）発現の低下に起因する抵抗性は、ＰＬＡＵ、ＡＤＡＭ８、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＡＳＰ４、ＣＰＤ、ＭＭＰ２５、ＭＭＥ、ＮＵＰ９８、ＣＹＬＤ、ＡＳＴＬ、ＥＣＥ１、およびＵＳＰ３２の全部または一部を含むがこれらに限定されないプロテアーゼ基質を結合させた、免疫療法剤のパネルを使用して判定することができる。
１．処置対象
ａ．癌

開示される組成物および方法は、癌を処置するために使用することができる。一般に、薬剤は、開示される活性感知免疫療法剤の量を対象に投与することによって、対象の癌に対する免疫応答を刺激または増強するために使用される。免疫療法剤は、阻害性免疫チェックポイント分子またはその受容体に結合して、免疫チェックポイント分子によるシグナル伝達を阻害することにより、免疫応答を促進または増強することができる。この方法は、癌の１またはそれを超える症状を減らすことができる。

一実施形態では、開示される免疫療法剤は、阻害性免疫チェックポイント分子を遮断することにより、腫瘍微小環境内の免疫抑制を逆転させる。

癌細胞は、その発生中にさまざまなメカニズムを通じて、特徴的な一連の機能的な能力を獲得する。そのような能力には、アポトーシスの回避、成長シグナルの自給自足、抗成長シグナルに対する非感受性、組織浸潤／転移、無限の複製可能性、および持続的な血管形成が含まれる。「癌細胞」という用語は、前悪性癌細胞と悪性癌細胞の両方を包含することが意味される。一部の実施形態では、癌とは、局在したままである良性腫瘍をさす。他の実施形態では、癌とは、隣接する体の構造に侵入して破壊し、遠位部位に転移している、悪性腫瘍をさす。さらに他の実施形態では、癌は、特定の癌抗原（例えば、汎癌腫抗原（ＫＳ１／４）、卵巣癌腫抗原（ＣＡ１２５）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２／ｎｅｕなど）と関連している。

本明細書に開示される方法および組成物は、以下の、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌および皮膚癌（扁平上皮癌を含む）を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキット（Ｂｅｒｋｅｔｔｓ）リンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｃｏｍａ）を含む間葉系起源の腫瘍；メラノーマ、精上皮腫、奇形腫、神経芽細胞腫および神経膠腫を含むその他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、およびシュワン細胞腫を含む中枢神経系および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒａｍａ）、および骨肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；ならびにメラノーマ、色素性幹皮症（ｘｅｎｏｄｅｒｍａ ｐｅｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）、ケラトアカントーマ（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌を含む他の腫瘍を含むがこれらに限定されない多様な癌または他の異常な増殖性疾患の処置または予防に有用である。

アポトーシスの異常によって引き起こされる癌も、開示される方法および組成物によって処置することができる。そのような癌には、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を伴う癌腫、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに、家族性大腸腺腫症、および骨髄異形成症候群などの前癌病変が含まれ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、悪性腫瘍または異常増殖性の変化（例えば化生および異形成など）、または過剰増殖性障害は、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、または子宮において本方法および組成物によって処置または予防される。他の特定の実施形態では、肉腫、メラノーマ、または白血病が本方法および組成物によって処置または予防される。

本明細書に開示される方法および組成物によって処置または予防することができる具体的な癌および関連する障害としては、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病、および骨髄異形成症候群など、慢性白血病、例えば、限定されるものではないが、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病を含むがこれらに限定されない白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫、例えば、限定されないが、ホジキン病または非ホジキン病リンパ腫など（例えば、びまん性未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；びまん性未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性、ＡＬＫ＋未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、急性骨髄性リンパ腫（ＡＭＬ））；多発性骨髄腫、例えば、限定されないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫およ髄外性形質細胞腫など；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性単クローン性高ガンマグロブリン血症；重鎖疾患；骨肉腫および結合組織肉腫、例えば、限定されないが、骨肉腫（ｂｏｎｅ ｓａｒｃｏｍａ）、骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）（血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ））、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫など；限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹膠腫、上衣腫、乏突起細胞腫、非グリア腫瘍（ｎｏｎｇｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ）、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫を含む脳腫瘍；腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌を含むがこれらに限定されない乳癌；褐色細胞腫および副腎皮質癌を含むがこれらに限定されない副腎癌；甲状腺癌、例えば、乳頭様甲状腺癌または濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および組織非形成性甲状腺癌などであるがこれらに限定されない；インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは膵島腫瘍を含むがこれらに限定されない膵臓癌；クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、およびインシピウス型糖尿病を含むがこれらに限定されない下垂体癌；虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および繊毛体黒色腫などの眼の黒色腫、および網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない眼の癌；扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫を含むがこれらに限定されない膣癌；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病を含むがこれらに限定されない外陰癌；扁平上皮癌、および腺癌を含むがこれらに限定されない子宮頸癌；子宮内膜癌および子宮肉腫を含むがこれらに限定されない子宮癌；卵巣上皮癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質性腫瘍を含むがこれらに限定されない卵巣癌；扁平上皮癌、腺癌、腺様細胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌を含むがこれらに限定されない食道癌；腺癌、菌状（ポリープ状）癌、潰瘍性癌、表在性拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫を含むがこれらに限定されない胃癌；結腸癌；直腸癌；肝細胞癌および肝芽腫を含むがこれらに限定されない肝臓癌、腺癌を含むがこれらに限定されない胆嚢癌；乳頭状、結節状、およびびまん性を含むがこれらに限定されない胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮癌（表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌を含むがこれらに限定されない肺癌；胚腫瘍、精上皮腫、未分化型、古典的（典型的）、精母細胞性、非精上皮腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）を含むがこれらに限定されない精巣癌、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫を含むがこれらに限定されない前立腺癌；腎癌（ｐｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）；扁平上皮癌を含むがこれらに限定されない口腔癌；基底細胞癌；腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌を含むがこれらに限定されない唾液腺癌；扁平上皮癌、および疣状癌を含むがこれらに限定されない咽頭癌；基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子由来黒色腫、末端黒子型黒色腫を含むがこれらに限定されない皮膚癌；腎細胞癌、腺癌、グラヴィッツ腫瘍、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂および／または子宮）を含むがこれらに限定されない腎臓癌；ウィルムス腫瘍；移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫を含むがこれらに限定されない膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、中皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性肺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が含まれる（そのような障害の概説には、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａおよびＭｕｒｐｈｙら、１９９７，Ｉｎｆｏｒｍｅｄ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，Ｖｉｋｉｎｇ Ｐｅｎｇｕｉｎ，Ｐｅｎｇｕｉｎ Ｂｏｏｋｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ参照）。
ｂ．感染性疾患

開示される組成物および方法は、感染症および感染性疾患を処置するために使用することができる。一般に、薬剤は、免疫チェックポイント分子の発現、リガンド結合、架橋、抑制性シグナル伝達、またはそれらの組み合わせを調節する活性感知免疫療法剤の量を対象に投与することによって、対象の感染に対する免疫応答を刺激または増強するために使用される。一実施形態では、免疫療法剤は、免疫チェックポイント分子による抑制性免疫シグナル伝達を阻害、低減、または遮断する。一もう一つの実施形態では、免疫療法剤は、免疫チェックポイント分子によるシグナル伝達を誘導、促進、または増強することによって免疫応答を誘導、促進、または増強する。この方法は、感染症の１またはそれを超える症状を減らすことができる。

感染症または疾患は、細菌、ウイルス、原生動物、蠕虫、または細胞内に侵入して攻撃するその他の病原性微生物によって、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球によって引き起こされ得る。

感染症または疾患は急性または慢性であり得る。急性感染症は、一般に短期間の感染症である。急性微生物感染の間、免疫細胞は免疫調節性の受容体を発現し始める。したがって、一部の実施形態では、本方法は急性感染に対する免疫刺激応答を増加させることを含む。

感染は、例えば、限定されるものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって引き起こされ得る。

一部の実施形態では、開示される組成物は、慢性感染症、例えば、Ｔ細胞枯渇またはＴ細胞アネルギーが発生し、感染症が長期間にわたって宿主にとどまる原因となる感染症を処置するために使用される。

処置される例示的な感染症は、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、またはヒトパピローマウイルスによって引き起こされる慢性感染症である。

ウイルス感染は主にＴ細胞によって除去されるため、Ｔ細胞活性の増加は、感染性ウイルス剤のより迅速または完全な除去が動物またはヒトの対象にとって有益である状況で治療上有用である。したがって、開示される組成物は、免疫不全（例えば、ＨＩＶ）、乳頭腫（例えば、ＨＰＶ）、疱疹（例えば、ＨＳＶ）、脳炎、インフルエンザ（例えば、ヒトインフルエンザウイルスＡ）、および感冒（例えば、ヒトライノウイルス）および、例えば、ＨＴＬＶ、肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ワクシニアウイルス、および狂犬病ウイルスによって引き起こされる他のウイルス感染を含むがこれらに限定されない局所または全身性ウイルス感染の処置のために投与することができる。この分子は、ヘルペス病変または帯状疱疹、または性器疣贅などのウイルス性皮膚疾患を処置するために局所投与することができる。分子はまた、エイズ、インフルエンザ、感冒、または脳炎を含むがこれらに限定されない全身性ウイルス性疾患を処置するために全身投与することができる。

処置することができる代表的な感染症としては、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙｐｅ Ｂ（ＨＩＢ）、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ Ａ、ＢおよびＣ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉを含むがこれらに限定されない微生物によって引き起こされる感染症が含まれるが、これらに限定されない。

開示される組成物および方法を使用して処置することができるその他の微生物には、細菌、例えばＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａの細菌など；コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽病、ペスト、およびライム病に関連する病原体；あるいは真菌または寄生虫病原体、例えばＣａｎｄｉｄａ（ａｌｂｉｃａｎｓ、ｋｒｕｓｅｉ、ｇｌａｂｒａｔａ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓなど）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ｎｉｇｅｒ、など）、Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ（ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ（ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ（ｉｍｍｉｔｉｓ）およびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ（ｃａｐｓｕｌａｔｕｍａ）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉなど）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ、またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａなどが含まれる。
ｃ．移植片拒絶

もう一つの実施形態では、開示される組成物および方法は、移植片拒絶または移植片対宿主病を減少または阻害するために予防的または治療的に使用することができる。移植拒絶反応は、移植された臓器または組織が移植レシピエントの体に受け入れられない場合に起こる。通常、拒絶反応は、レシピエントの免疫系が移植された臓器または組織を攻撃するために起こる。開示される方法は、有効量の１またはそれを超える開示される活性感知免疫療法剤を対象に投与することによって、レシピエントによる移植片またはグラフトの免疫寛容を促進するために使用することができる。一実施形態では、免疫寛容の誘導は、移植片拒絶反応の減少または阻害のための免疫療法剤を投与されている対象の尿中に放出されている検出可能な分子の量を分析することによって測定することができる。

移植される材料は、細胞、組織、器官、手足、指、または体、例えば人体の一部であり得る。移植片は通常、同種または異種である。開示される組成物は、移植拒絶反応を減少または阻害するための有効量で対象に投与される。組成物は、任意の許容され得る投与経路によって全身または局所に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、移植の前に、移植時に、または移植後に移植部位に投与される。一実施形態では、組成物は、皮下注射などにより非経口的に移植部位に投与される。

他の実施形態では、組成物は、生体外で移植される細胞、組織または器官に直接投与される。一実施形態では、移植材料は、移植前、移植後、またはその両方で組成物に接触させる。

他の実施形態では、組成物は、リンパ節または脾臓などの免疫組織または器官に投与される。

移植材料はまた、移植拒絶反応などの免疫応答に関与していることが知られているかまたは疑われる細胞表面タンパク質、炭水化物、または脂質を除去する酵素または他の材料で処置することもできる。
ｉ．細胞

あらゆる種類の細胞の集団が対象に移植され得る。細胞は同種であっても異種であってもよい。異種とは、その細胞集団が１を超える種類の細胞を含むことを意味する。例示的な細胞には、ドナーから採取して対象に移植することができる幹細胞および多能性細胞などの前駆細胞が含まれる。細胞は、上記のように移植前に必要に応じて処置される。
ｉｉ．組織

あらゆる組織が移植片として使用され得る。例示的な組織には、皮膚、脂肪組織、心血管組織、例えば静脈、動脈、毛細血管、弁など；神経組織、骨髄、肺組織、眼組織、例えば角膜および水晶体など、軟骨、骨、および粘膜組織が含まれる。
ｉｉｉ．臓器

移植に使用することができる例示的な臓器には、腎臓、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、肺、胃、眼、舌、膵臓、腸などが含まれるが、これらに限定されない。移植される器官はまた、上記のように移植前に修飾することができる。

一実施形態は、対照と比較して慢性移植拒絶反応を阻害または低減するための有効量の組成物を投与することによって、対象における慢性移植拒絶反応を阻害または低減する方法を提供する。
ｉｖ．移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）

開示される組成物および方法は、ＧＶＨＤに関連する１またはそれを超える症状を軽減するための有効量の組成物を投与することにより、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するために使用することができる。ＧＶＨＤは、移植された骨髄の機能的免疫細胞がレシピエントを「外来」として認識し、免疫学的攻撃を開始する、同種造血幹細胞移植に関連する主要な合併症である。また、これは特定の状況下で輸血中に起こる可能性もある。ＧＶＨＤの症状には、皮膚の発疹または皮膚の色や質感の変化、下痢、悪心、肝機能異常、皮膚の黄変、感染に対する感受性の増加、目の乾燥および炎症、ならびに口内過敏または口内乾燥が含まれる。
ｄ．自己免疫および慢性感染症

開示される免疫療法剤はまた、炎症性または自己免疫性の疾患および障害を処置するために使用することもできる。そのような実施形態では、免疫療法剤は、免疫チェックポイント分子の発現、リガンド結合、架橋、抑制性シグナル伝達、またはそれらの組み合わせを調節する薬剤である。代表的な炎症性または自己免疫 疾患／障害としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳障害、自己免疫性リンパ増殖症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ ｆａｔｉｇｕｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、Ｉｇａ腎症、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、炎症性または自己免疫性疾患は、病原体によって引き起こされるか、または感染の結果である。

実施例１：プロテアーゼ基質で修飾されたチェックポイント遮断免疫療法剤は、標的結合を保持し、グランザイムＢ活性を感知する。
材料および方法：

治療活性および応答モニタリング能力を組み合わせるために、αＰＤ−１癌免疫療法抗体を、アミン反応性化学を使用してグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）プロテアーゼ感知バイオマーカーで機能化した（図２Ａ）。
結果：

αＰＤ−１は、未修飾αＰＤ−１に対して評価したＥＣ５０が同様であることによって決定されるように、ＧｚｍＢプロテアーゼ基質で機能化された場合もターゲティング能力を維持した（図２Ｂ）。機能化されたαＰＤ−１は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞への標的結合も保持していた（図２Ｃ）。

ＧｚｍＢが抗体結合基質にアクセスして切断することができるかどうかを判断するために、切断部位の前に消光分子、後に蛍光レポーター（ＦＡＭ）を用いて操作したＧｚｍＢ基質でαＰＤ−１を機能化した（図１）。切断後、レポーターを消光剤から分離し、定量化のための蛍光シグナルを生成する。インビトロ切断アッセイを使用すると、機能化されたαＰＤ−１は、一般的な血清プロテアーゼであるトロンビンによって交差切断されずに、ＧｚｍＢによる特異的切断を示した（図２Ｅ）。

実施例２．機能化された共刺激遮断療法剤は、機能性であり、グランザイムＢ活性を感知する。
材料および方法：

他のタンパク質生物製剤へのこのアプローチの適用性を決定するために、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合してＴ細胞共刺激を遮断するＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質であるアバタセプトを、上記および図３Ａに示すようにＧｚｍＢ基質で機能化した。
結果：

機能化されたＣＴＬＡ−４Ｉｇは、抗ＣＤ８０およびＣＤ８６抗体との競合的結合によって決定されるように、未修飾のＣＴＬＡ−４Ｉｇと同様の効力でＣＤ８０／ＣＤ８６を標的とした（図３Ｂ〜３Ｃ）。ＧｚｍＢプロテアーゼ基質で機能化しても、未修飾タンパク質に対して評価した場合に、ＣＴＬＡ−４がＴ細胞の活性化および増殖を弱める能力を損なわれなかった（図３Ｄ）。インビトロ切断アッセイを使用すると、修飾されたＣＴＬＡ−４Ｉｇは、マトリックス、補体、または免疫プロテアーゼによって交差切断されずに、ＧｚｍＢによる特異的切断を示した（図３Ｅ）。以上のことから、別の免疫療法剤（αＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４Ｉｇ）は、機能を低下させることなくプロテアーゼ感知基質で機能化することができることが示される。

実施例３．ＧｚｍＢで機能化した免疫療法剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞毒性を感知する。
材料および方法：

機能化された免疫療法剤がＴ細胞活性を検出する能力を決定するために、ＧｚｍＢ基質で機能化したαＰＤ−１を、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞またはさまざまな癌細胞株（ＣＴ２６、ＭＣ３８、またはＢ１６細胞株）から分離した上清とともにインキュベートした（図４Ａ）。
結果：

機能化されたαＰＤ−１は、いずれの癌細胞株の上清とインキュベートしても切断されなかったが、活性化Ｔ細胞上清とインキュベートした場合は経時的に蛍光シグナルの増加を示した（図４Ｂ）。補体プロテアーゼＣ１の対照基質（ＬＱＲＩＹＫ、（配列番号３））に結合した対照αＰＤ−１も、活性化Ｔ細胞上清によって切断されなかった。ＧｚｍＢ活性の感知は、Ｐｍｅｌ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウス（ｇｐ１００特異的）から分離したＣＤ８＋Ｔ細胞とＢ１６メラノーマ細胞（ｇｐ１００を発現、Ｐｍｅｌ Ｔ細胞に認識される）の共インキュベーション中に試験した（図４Ｃ）（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１７（１６）：５３４３−５３５２（２０１１）；Ａｂａｄら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３１（１）：１−６（２００８）；Ｏｖｅｒｗｉｊｋら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９８（４）：５６９−５８０（２００３））。対照αＰＤ−１ではなく、機能化されたαＰＤ−１を添加すると、複数のＴ細胞対標的細胞比で蛍光シグナルが大幅に増加した、これは細胞死滅およびＧｚｍＢタンパク質分泌の増加に対応している（図４Ｄ〜４Ｆ）。Ｂ１６細胞を認識しないＯＴ−ＩＴ細胞と共培養した場合にはシグナルの増加は観察されず、測定されたプロテアーゼ活性が抗原特異的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性に相当することが確認された（図４Ｇ）。ＧｚｍＢ基質で機能化されたＣＴＬＡ−４Ｉｇの切断は、ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）由来のペプチドエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）を認識し、ＥＧ７細胞を発現するＯＶＡを標的とするが、ＯＶＡを発現しない親ＥＬ４細胞株を認識しない、トランスジェニックＯＴ−ＩＴ細胞系を用いて試験した。ＥＬ４対照細胞ではなくＥＧ７−ＯＶＡ細胞とともにＯＴ−ＩＴ細胞をインキュベートすると、蛍光シグナル伝達が増加した（図４Ｈ）。以上のことから、プロテアーゼ感知基質で機能化した免疫療法剤（αＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４Ｉｇ）は、Ｔ細胞活性を感知し、特に細胞毒性を感知することができることが示される。

実施例４．グランザイムＢプロテアーゼ活性は、応答性免疫療法に対応する。
結果：

プロテアーゼ活性の応答性免疫療法のバイオマーカーとしての重要性を決定するために、ＰＤ−１応答性ＭＣ３８腫瘍モデルでの免疫療法処置中に、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞内でＧｚｍＢプロテアーゼ発現動態を規定した（図５Ａ）。ＰＤ−１遮断中の応答性免疫療法は、細胞傷害性メディエーターＧｚｍＢを発現するＣＤ８＋ＴＩＬの数の増加に対応していた（図５Ｂ〜５Ｄ）。次に、ＭＣ３８マウスをＧｚｍＢ基質で機能化されたαＰＤ−１またはアイソタイプコントロールで処置し、処置前（１１日目）および処置初期（１４および１７日目）のプロテアーゼ活性の定量化を可能にした（図５Ｅ−５Ｆ）。応答性治療は、αＰＤ−１の１７日目の尿シグナルの増加によって決定されるＧｚｍＢ活性の増加と相関したが、アイソタイプ対照で処置したマウスでは相関しなかった。ＣＴ２６腫瘍モデルを使用すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＧｚｍＢ発現と、切断されたバイオマーカーの尿中分泌によって検出される活性は、応答性αＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４併用治療中の処置の初期にも増加したが、非応答性αＣＴＬＡ−４単独療法中には増加しなかった（図５Ｇ〜５Ｎ）。総合すると、これらのデータは、ＧｚｍＢプロテアーゼ活性が免疫療法に対する早期処置応答のバイオマーカーとして役立ち得ることを示す。この技術の今後の開発は、応答性免疫療法に対応するプロテアーゼシグネチャを特定して、ＧｚｍＢおよびその他の最高に濃縮された免疫および疾患特異的プロテアーゼを含むマルチプレックスバイオマーカーライブラリーの構築を通知することになる。

実施例５．移植部位でのＣＤ８Ｔ細胞の蓄積およびグランザイムＢプロテアーゼの発現は急性細胞拒絶反応の発症に対応する。
結果：

ＡＣＲの重症度を段階分けするための組織学的基準には、抗移植片Ｔ細胞応答の下流の効果である、組織損傷およびアポトーシス細胞の存在などの特徴が含まれる。疾患の病理を推進するプロテアーゼの活性測定は、早期のバイオマーカーとなり、ＭＭＰ活性を使用して肝線維症の進行および退行を予測するなど、疾患の軌跡を予測する可能性がある。そのため、ＧｚｍＢプロテアーゼ基質と結合した酸化鉄ナノ粒子コア（ＩＯＮＰ）からなるＧｚｍＢ活性ナノセンサーをＡＣＲの早期検出に使用する可能性を調査した（図６Ａ）。皮膚移植片の健康および拒絶反応の動態を定量化するために、健康な同種移植片に４点を割り当て、完全な拒絶には０点を割り当て、生存皮膚と壊死皮膚の比率および潰瘍または痂皮の存在などの特徴に基づいて中間のスコアを割り当てた。これらの測定基準に従って、移植片のスコアは移植後９日目に有意に減少し始め、移植後２週間以内に同種移植片が完全に拒絶された時点でエンドポイントに達した（図６Ｂ〜６Ｈ）。ＧｚｍＢのアップレギュレーションの最も早い時点を特定するために、７日目に移植片組織を免疫組織化学によって分析すると、移植片浸潤ＣＤ８Ｔ細胞およびＧｚｍＢ発現量の両方で有意な増加が見出された（図６Ｉ〜６Ｊ）。総合すると、このデータは、ＧｚｍＢ発現および活性が急性細胞拒絶反応の開始時に同種移植組織で有意にアップレギュレートされている証拠を提供する。

実施例６．応答性および非応答性ＣＴＬＡ−４Ｉｇ処置群は、グランザイムＢプロテアーゼ活性によって層別化することができる。
結果：

ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合してＴ細胞の共刺激を遮断するＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質である、アバタセプトは、移植された臓器の拒絶反応を防ぎ、さまざまな慢性炎症性疾患および自己免疫疾患を処置するために診療所で使用されている。皮膚移植レシピエントマウス（ＢＡＬＢ／ｃ皮膚からＢＬ／６レシピエントマウス）をＣＴＬＡ−４Ｉｇで処置し、移植片の健康および生存を監視する、共刺激遮断治療モデルが開発された。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ処置は、一部の動物の移植片生着期間を延長したが（「応答」）、他のマウスは、処置に非応答性のままであり、最終的には未処置動物と同様の速度で移植片を拒絶した（「非応答」）（図６Ｋ〜６Ｌ）。ＧｚｍＢ機能化ＣＴＬＡ−４Ｉｇを使用すると、未処置およびＣＴＬａ−４Ｉｇ非応答群はでＰＯＤ１５で有意に増加したＧｚｍＢ活性が観察されたが、ＣＴＬＡ−４応答群では観察されず、移植片生着期間の延長に対応していた（図６Ｍ）。

実施例７．ＩＣＢ応答および後天性抵抗性の腫瘍プロテアーゼシグネチャ。
結果：

客観的な応答を示す患者のかなりの割合が、チェックポイント阻害剤による処置を継続しているにもかかわらず、最終的に再発する（例、メラノーマの場合は最大３分の１）。抵抗性のメカニズムには、Ｔ細胞認識の不全（抗原提示機構の低下）または活性不全（ＩＦＮ−γシグナル伝達に対する非感受性）が含まれる。チェックポイント阻害剤の応答中および抵抗中のプロテアーゼ発現の変化を特定するために、αＰＤ−１による処置前および処置初期の６８名の黒色腫 患者の連続生検の独立した研究（Ｈｕｇｏら、Ｃｅｌｌ，１６５：３５−４４（２０１６）；Ｒｉａｚら、Ｃｅｌｌ，１７１：９３４−９４９（２０１７））を調査した（図７Ａ）。２５０の細胞外プロテアーゼの発現量を、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）による二項分類で応答と非応答者を分類するための特徴として使用した（図７Ｂ）。均等に分割された訓練および試験検証コホートにおいて、プロテアーゼ発現を使用して、ほぼ完璧なＡＵＲＯＣ（＞０．９８）で、反応者と非反応者を識別することができることが見出された。次に、分類に最も重要な２５０のプロテアーゼについて質問し、ラッソアルゴリズムを適用することにより、同じ患者をＡＵＲＯＣ＞０．９６で分類するために使用することができる、１４の重要なプロテアーゼの短縮リストが定義された（図７Ｃ〜図７Ｄ）。これらの結果は、プロテアーゼの発現を使用して、患者の応答者を非応答者から分類することができることを示している。

次に、プロテアーゼの発現を使用して抵抗性のメカニズムを定義することができるかどうかを決定した。非応答性の患者全遺伝子転写物を分析して、応答性の患者と比較して差次的に発現する遺伝子を見出した（ｔｓｃｏｒｅ＞１００の遺伝子）。これらの遺伝子を使用して、特に２つの経路：ＩＦＮγシグナル伝達およびＭＨＣ Ｉ抗原提示に焦点を当てた免疫チェックポイント治療に対する抵抗性の高頻度メカニズムについて経路分析を実行した（図７Ｅ〜図７Ｆ）。この手法を使用して、非応答者のＩＦＮγに対する感度の低下という抵抗性メカニズムを特定することができるプロテアーゼのパネルが見出され、ＭＨＣ Ｉ抗原提示の低下を特定することができるプロテアーゼのパネルも見出された（図７Ｈ）。それぞれの抵抗性メカニズム（ＩＦＮγおよびＭＨＣ Ｉ提示）の経路の割合によると、喪失は、別個の患者に示されていた（図７Ｇ）。

前述の明細書では、本発明はその特定の実施形態に関連して説明されており、多くの詳細が説明のために示されているが、本発明が追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載される特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることが当業者には明らかであろう。

本明細書において引用されるすべての参考文献は、参照によりその全文が組み込まれる。本発明は、その精神または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化されてもよい。したがって、本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書ではなく、添付される特許請求の範囲を参照するべきである。

Claims (27)

1. 免疫療法を必要とする対象において免疫療法を投与し、免疫療法に対する応答を監視する方法であって、
   治療薬によって促進されるプロテアーゼ活性に応答して検出可能なシグナルを提供する、プロテアーゼ基質に連結された有効量の少なくとも１つの前記治療薬を前記対象に投与するステップと；
   前記対象からのサンプル中の前記シグナルを検出し、測定するステップと；
   前記対象に対する前記治療薬の効果を決定するステップであって、前記検出可能なシグナルが検出された場合、前記対象は前記治療薬に対して応答性であると判定され、前記検出可能なシグナルが検出されない場合、前記対象は前記治療薬に対して非応答性であると判定されるステップと；
   応答性の対象に同じ有効量の前記治療薬を投与するか、または非応答性の対象に投与される治療薬の前記有効量を調整するステップとを含む方法。
2. 前記治療薬が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１に記載の方法。
3. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２に記載の方法。
4. 前記治療薬が免疫抑制剤である、請求項１に記載の方法。
5. 前記免疫抑制剤がＣＴＬＡ−４Ｉｇである、請求項４に記載の方法。
6. 前記プロテアーゼ基質がレポーター分子に結合されている、請求項１に記載の方法。
7. 前記レポーター分子が、蛍光分子、生物発光分子、またはマスタグである、請求項６に記載の方法。
8. 前記プロテアーゼ基質が、前記基質に隣接する消光分子および蛍光分子を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記検出可能なシグナルが、前記プロテアーゼ基質由来のペプチド断片である、請求項１に記載の方法。
10. 前記検出可能なシグナルが蛍光レポーターである、請求項１に記載の方法。
11. 前記検出可能なシグナルがマスタグである、請求項１に記載の方法。
12. 前記有効量の免疫療法剤を調整するステップが、異なる免疫療法剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記サンプルが、尿サンプルまたは血液サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記シグナルを測定するステップが、前記サンプルを質量分析、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡに付すことを含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記非応答性の対象が免疫抵抗性を有する、請求項１に記載の方法。
16. 前記対象が癌を有する、請求項１に記載の方法。
17. 前記対象が感染性疾患を有する、請求項１に記載の方法。
18. 前記対象が移植された臓器を有する、請求項１に記載の方法。
19. 前記治療薬によって促進されるプロテアーゼ活性に応答して検出可能なシグナルを提供するプロテアーゼ基質に結合した治療薬を含む組成物。
20. 前記治療薬が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記治療薬が免疫抑制剤である、請求項１９に記載の組成物。
23. 前記免疫抑制剤がＣＴＬＡ−４Ｉｇである、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記検出可能なシグナルが、前記プロテアーゼ基質由来のペプチド断片である、請求項１９に記載の組成物。
25. 前記プロテアーゼ基質がレポーター分子に結合されている、請求項１９に記載の組成物。
26. 前記レポーター分子が、蛍光分子、生物発光分子、またはマスタグである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記プロテアーゼ基質が、前記基質に隣接する消光分子および蛍光分子を含む、請求項１９に記載の方法。

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