JP2022180404A - 抗ｃｄ３３免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法 - Google Patents

抗ｃｄ３３免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、抗原結合性断片、および医薬組成物を含む、ＣＤ３３抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。対象におけるがんを処置または予防する方法、およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製する方法も提供する。【解決手段】特定の配列を含むヌクレオチド配列によりコードされるＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離された核酸分子を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１月２２日出願の米国仮特許出願第６２／６２０，１３９号および２０１７年３月２４日出願の米国仮特許出願第６２／４７６，４３８号に対する優先権の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年３月２０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＳｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、１２４キロバイトのサイズである。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
本発明は、アメリカ合衆国保健福祉省の機関であるアメリカ国立衛生研究所とのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔの実施において創出された。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
本開示の分野
本出願は、がんの分野、特に、ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、およびこのようなＣＤ３３抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびその使用方法に関する。
背景
がんは、ヒトの健康に対する最も致命的な脅威の１つである。米国だけで、がんは毎年ほぼ１３０万人の新たな患者が罹患し、心血管疾患に次いで２番目に多い死因であり、死亡数の約４分の１を占めている。固形腫瘍が、これらの死亡のほとんどの原因である。ある特定のがんの医学的処置においては顕著な進歩があったものの、全てのがんについての５年全生存率は過去２０年間で約１０％しか改善しなかった。がんまたは悪性腫瘍は、制御されずに迅速に転移および成長し、処置を非常に困難にする。
ＣＤ３３は、６７ｋＤａの膜貫通細胞表面糖タンパク質受容体である。ＣＤ３３は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーのメンバーである。このファミリーのタンパク質は、シアル酸付加グリカンに結合することにより白血球の内皮細胞への接着を媒介する（Ｋｅｌｍ Ｓ、Ｓｃｈａｕｅｒ Ｒ、Ｃｒｏｃｋｅｒ ＰＲ．
Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．１９９６年；１３巻：９１３～９２６頁）。さらにＣＤ３３は、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を介して阻害性受容体として機能する。ＣＤ３３受容体が活性化すると、ＣＤ３３細胞質側末端における２つのチロシン（Ｙ３４０およびＹ３５８）のリン酸化がもたらされ、ＣＤ３３細胞質側末端はＳＨＰホスファターゼのドッキング部位として機能し、カルシウム動員のダウンレギュレーションなどの阻害性シグナル伝達カスケードに関与する（Ｐａｕｌ ＳＰ１、Ｔａｙｌｏｒ ＬＳ、Ｓｔａｎｓｂｕｒｙ ＥＫ、ＭｃＶｉｃａｒ ＤＷ Ｂｌｏｏｄ．２０００年７月１５日；９６巻（２号）：４８３～９０頁）。
ＣＤ３３は骨髄細胞系列分化抗原であり、骨髄前駆細胞では高度に発現される（Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ、Ｔｏｒｏｋ－Ｓｔｏｒｂ Ｂ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ＩＤ．Ｂｌｏｏｄ
．１９８３年；６２巻：１２４～１３２頁）が、分化した骨髄細胞、つまりマクロファージおよび顆粒球では低レベルでしか発現されない（Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｄ、Ｓｅｅｄ Ｂ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８年；１４１巻：２７９７～２８００頁）。一方、ＣＤ３３は８７．８％～９９％の急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）で発現されることが報告されている（Ａ Ｅｈｎｉｎｇｅｒ１ら Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１４年）４巻、ｅ２１８頁；Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ Ｋｒｕｐｋａら Ｂｌｏｏｄ ２０１４年 １２３巻：３５６～３６５頁）。ＡＭＬは、５年生存率約２６％の重篤な疾患である（ワールドワイドウェブｃａｎｃｅｒ．ｎｅｔ／ｃａｎｃｅｒ－ｔｙｐｅｓ／ｌｅｕｋｅｍｉａ－ａｃｕｔｅ－ｍｙｅｌｏｉｄ－ａｍｌ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓで入手可能）。ＡＭＬケアの現在の標準は、高用量の化学療法または高線量の放射線による寛解導入処置からなり、その後必要に応じて同種幹細胞移植およびさらなる化学療法の過程から構成される地固めが続く（ワールドワイドウェブｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ａｃｕｔｅ－ｍｙｅｌｏｉｄ－ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｔｒｅａｔｉｎｇ／ｔｙｐｉｃａｌ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｏｆ－ａｍｌ．ｈｔｍｌで入手可能）。この処置に関連する高い毒性、および骨髄抑制またはＧＶＨＤなどの合併症リスクが、より良好な治療用代替物の探求に駆り立てる。
抗体－薬物コンジュゲート（ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、バダスツキシマブタリリン、Ｓｔｅｉｎ Ａ．Ｓ．ら（２０１５年）．Ｂｌｏｏｄ、１２６巻（２３号）、３２４頁；第Ｉ～ＩＩ相臨床試験ＮＣＴ０２７０６８９９）、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＡＭＧ３３０、Ｌａｓｚｌｏ ＧＳら Ｂｌｏｏｄ ２０１３年：１２３巻（４号）：５５４～５６１頁、ＮＣＴ０２５２０４２７）、およびＣＡＲＴ－３３細胞（Ｗａｎｇ ＱＳら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５年１月；２３巻（１号）：１８４～９１頁、ＮＣＴ０１８６４９０２）を含む、ＡＭＬを処置するためのいくつかの新規の手法が現在研究中である。しかし、新規の手法のうちいくつかが臨床毒性により差し止められている。ＳＧＮ－ＣＤ３３薬物を試験するＳｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第Ｉ相臨床試験は、肝毒性リスクにより最近保留とされた（ワールドワイドウェブｂｕｓｉｎｅｓｓｗｉｒｅ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｈｏｍｅ／２０１６１２２７００５０８７／ｅｎ／Ｓｅａｔｔｌｅ－Ｇｅｎｅｔｉｃｓ－Ａｎｎｏｕｎｃｅｓ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ－Ｈｏｌｄ－Ｐｈａｓｅ－１で入手可能）。ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗｙｅｔｈ）は、市販後臨床試験で観察された潜在的に致死性の静脈閉塞性肝疾患の発症後、２０１０年に製造業者により市場から自主回収された（Ｊａｃｏｂ Ｍ．ＲｏｗｅおよびＢｏｂ Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ Ｂｌｏｏｄ ２０１３年 １２１巻：４８３８～４８４１頁）。ＦＤＡにより、ＣＤ３３＋成人ＡＭＬおよび再発／難治性小児ＡＭＬ用にマイロターグが最近再導入されたにもかかわらず、この薬物については新たな、より保守的でより小さい投薬量、および新たなレジメンが処方されている（ＦＤＡプレスリリース２０１７年９月、ワールドワイドウェブｆｄａ．ｇｏｖで入手可能）。この処置の有効性、マイロターグに対する患者の応答の持続性、腫瘍抗原エスケープの事例、および新たなレジメン下でのその安全性プロファイルは依然として決定されていない。したがって、安全で有効かつ持続性のＡＭＬ処置の必要性が依然として差し迫っている。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、３つの本質的な単位を含むハイブリッド分子である：（１）細胞外抗原結合性モチーフ、（２）連結／膜貫通モチーフ、および（３）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達モチーフ（Ｌｏｎｇ ＡＨ、Ｈａｓｏ ＷＭ、Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅ ＣＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３年；２巻（４号）：ｅ２３６２１頁）。ＣＡＲの抗原結合性モチーフは一般に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最小の結合性ドメインである単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）を基にして作られる。代替の抗原結合性モチーフとして、例えば、受容体リガンド（即ち、ＩＬ－１３は、腫瘍が発現するＩＬ－１３受容体に結合するよう
に操作されている）、インタクトな免疫受容体、ライブラリー由来ペプチド、および自然免疫系エフェクター分子（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）も操作されている。ＣＡＲ発現のための代替の細胞標的（例えば、ＮＫまたはガンマ－デルタＴ細胞）も開発中である（Ｂｒｏｗｎ ＣＥら Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２年；１８巻（８号）：２１９９～２０９頁；Ｌｅｈｎｅｒ Ｍら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２年；７巻（２号）：ｅ３１２１０頁）。ＣＡＲベクターを形質導入するための最も活性なＴ細胞集団を定義すること、最適な培養および増殖の技術を決定すること、ならびにＣＡＲタンパク質構造自体の分子的詳細を定義することに関して、いまだにかなりの労力を要している。
ＣＡＲの連結モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインとするか、または伸長された可撓性リンカーとなるように設計することができる。ＩｇＧの定常ドメインに由来するものなどの構造モチーフを使用して、ＳｃＦｖ結合性ドメインをＴ細胞原形質膜表面から離れて延在させることができる。これは、結合性ドメインが腫瘍細胞表面膜に特に近い一部の腫瘍標的にとって重要であり得る（例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２にとって；Ｏｒｅｎｔａｓら、未公開の観察）。今日まで、ＣＡＲにおいて使用されるシグナル伝達モチーフは常にＣＤ３－ζ鎖を含んでいるが、それは、このコアモチーフが、Ｔ細胞活性化のための重要なシグナルであるからである。最初に報告された第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通配列を特徴としていた。このモチーフは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達モチーフを含有する第３世代ＣＡＲでも同様に使用された（Ｚｈａｏ Ｙら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；１８３巻（９号）：５５６３～７４頁）。新たなテクノロジーの進歩に伴い、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体に連結されたビーズによるＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ２８由来のカノニカルな「シグナル２」の存在がＣＡＲ自体によってコードされる必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を使用して、第３世代ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて第２世代ベクターよりも優れているわけではないことが見出され、また、白血病のマウスモデルにおいては第２世代ベクターを超える明らかな利益は得られなかった（Ｈａｓｏ Ｗ、Ｌｅｅ ＤＷ、Ｓｈａｈ ＮＮ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｍ、Ｙｕａｎ ＣＭ、Ｐａｓｔａｎ ＩＨ、Ｄｉｍｉｔｒｏｖ ＤＳ、Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ、Ｂａｒｒｅｔｔ ＤＭ、Ｗａｙｎｅ ＡＳ、Ｍａｃｋａｌｌ ＣＬ、Ｏｒｅｎｔａｓ ＲＪ．Ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ．２０１３年；１２１巻（７号）：１１６５～７４頁；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮら Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻（１２号）：２７０９～２０頁）。これは、第２世代ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ（Ｌｅｅ ＤＷら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、ＬＡ；１２月７～１０日、２０１３年）およびＣＤ１３７／ＣＤ３－ζシグナル伝達形式（Ｐｏｒｔｅｒ
ＤＬら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（８号）：７２５～３３頁）のＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床的成功によって裏付けられている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの他の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーも、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞において重要な持続シグナルを提供することができる（Ｙｖｏｎ Ｅら
Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９年；１５巻（１８号）：５８５２～６０頁）。ＣＡＲ Ｔ細胞集団が培養された培養条件も等しく重要である。
がんに対するＣＡＲ療法のより広範で有効な適応における現在の課題は、説得力のある標的の不足に関する。細胞表面抗原への結合因子を創出することは、現在容易に達成可能であるが、正常組織を見逃しながら腫瘍に対して特異的な細胞表面抗原を発見することは、依然として厄介な課題である。ＣＡＲ発現Ｔ細胞により高い標的細胞特異性を与えるための１つの潜在的な方法は、コンビナトリアルＣＡＲアプローチを使用することである。１つのシステムでは、ＣＤ３－ζとＣＤ２８シグナル単位が、同じ細胞において発現され
る２つの異なるＣＡＲ構築物間で分割される；別のシステムでは、２つのＣＡＲが、同じＴ細胞において発現されるが、一方はより低い親和性を有し、したがって第２のＣＡＲの完全な活性のために代替的ＣＡＲが最初に結合されることを必要とする（Ｌａｎｉｔｉｓ
Ｅら Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１３年；１巻（１号）：４３～５３頁；Ｋｌｏｓｓ ＣＣら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；３１巻（１号）：７１～５頁）。免疫療法剤としての単一のＳｃＦｖベースのＣＡＲの生成のための第２の課題は、腫瘍細胞の不均一性である。少なくとも１つのグループは、標的抗原陰性集団の成長を回避することを期待して、エフェクター細胞集団が複数の抗原（ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒａ、ＥｐｈＡ２）を同時に標的化する、神経膠芽腫のためのＣＡＲ戦略を開発している（Ｈｅｇｄｅ Ｍら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３年；２１巻（１１号）：２０８７～１０１頁）。
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、合成生物学における新たな領域になっている；複数のプロモーターおよび遺伝子産物は、これらの高度に強力な細胞を腫瘍微小環境に導くことが想定され、ここで、Ｔ細胞は、負の調節シグナルを免れることができ、かつ有効な腫瘍死滅を媒介できる。誘導性カスパーゼ９構築物のＡＰ１９０３との薬物誘導性二量体化を介した望ましくないＴ細胞の排除は、Ｔ細胞集団を制御できる強力なスイッチが薬理学的に開始され得る１つの方法を実証している（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ Ａら Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（１８号）：１６７３～８３頁）。デコイ受容体の発現によるトランスフォーミング成長因子－βの負の調節効果に対して免疫性であるエフェクターＴ細胞集団の創出は、エフェクターＴ細胞が最適な抗腫瘍活性のために操作され得る程度をさらに実証している（Ｆｏｓｔｅｒ ＡＥら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８年；３１巻（５号）：５００～５頁）。したがって、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体と類似した様式でＴ細胞活性化を誘発できるようであるが、今日までのこのテクノロジーの臨床適用に対する主要な障害は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の限定的なｉｎ ｖｉｖｏ増殖、注入後の細胞の迅速な消失、および期待外れの臨床活性である。抗ＣＤ３３抗体－薬物コンジュゲート（Ｓｔｅｉｎ Ａ．Ｓ．ら Ｂｌｏｏｄ、２０１５年、１２６巻（２３号）、３２４頁）、二重特異性Ｔ細胞誘導因子（ＢｉＴＥ）、（Ｌａｓｚｌｏ ＧＳら Ｂｌｏｏｄ ２０１３年：１２３巻（４号）：５５４～５６１頁）、およびＣＡＲ Ｔ細胞（Ｗａｎｇ ＱＳら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５年１月；２３巻（１号）：１８４～９１頁）を含む、ＣＤ３３陽性腫瘍を標的化するいくつかの抗体ベースの様式が現在開発中である。ＡＭＬの前臨床モデルでの最近の研究により、ＣＤ３３標的化様式によるＣＤ３３陽性ＡＭＬ芽球および腫瘍細胞株の溶解がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで達成可能であることが示されているが、処置関連毒性（ワールドワイドウェブｂｕｓｉｎｅｓｓｗｉｒｅ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｈｏｍｅ／２０１６１２２７００５０８７／ｅｎ／Ｓｅａｔｔｌｅ－Ｇｅｎｅｔｉｃｓ－Ａｎｎｏｕｎｃｅｓ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ－Ｈｏｌｄ－Ｐｈａｓｅ－１；Ｒｏｗｅ ＪＭおよびＬｏｗｅｎｂｅｒｇ Ｂ、Ｂｌｏｏｄ ２０１３年１２１巻：４８３８～４８４１頁、Ｗａｎｇ ＱＳら Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５年１月；２３巻（１号）：１８４～９１頁、ＮＣＴ０１８６４９０２で入手可能）および最適以下の有効性（Ｗａｌｔｅｒ ＲＢら Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻（２６号）：６１９８～６２０８頁；Ｃｏｗａｎ ＡＪら Ｂｉｏｓｃｉ ２０１３年；１８巻（４号）：１３１１～１３３４頁）を含むこの手法のいくつかの課題が、臨床の状況において明らかとなった。さらに、ＢｉＴＥベースの手法では、最適なＢｉＴＥ機能のための、高密度のＣＤ３３抗原発現に対する依存、およびさらなるＴ細胞共刺激／チェックポイント阻害が必要であることが依然として課題である（Ｌａｓｚｌｏ ＧＳら Ｂｌｏｏｄ．２０１４年；１２３巻（４号）：５５４～５６頁、Ｌａｓｚｌｏ ＧＳら Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１５年）５巻、ｅ３４０頁）。したがって、上述の欠点なしに特異的かつ有効な抗腫瘍効果を示し得る手法を使用する、ＡＭＬの処置のための新規の組成物
および方法を発見する、当該分野における緊急かつ長年にわたる要求が存在する。
本発明は、ＣＡＲ組成物、ならびにがんならびに他の疾患および／または状態を処置するために使用され得る治療的方法を提供することによって、これらの要求に対処する。特に、本明細書に開示および記載される本発明は、ＣＤ３３発現の調節不全と関連する疾患、障害または状態の処置に使用可能なＣＡＲを提供し、ここでＣＡＲは、形質導入Ｔ細胞において高い表面発現を示し、高度の細胞溶解ならびに形質導入Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖および持続を示すＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む。
概要
新規の抗ＣＤ３３抗体またはその抗原結合性ドメイン、およびこのようなＣＤ３３抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および受容体を発現する宿主細胞（例えばＴ細胞）、および受容体をコードする核酸分子が本明細書で提供される。ＣＡＲはエフェクター細胞表面に発現される単一の分子からなっていてもよく、ＣＡＲはエフェクター細胞で発現されるシグナル伝達モジュールおよび可溶性標的化モジュールから構成されていてもよく、例えば、可溶性標的化モジュールが細胞で発現されたシグナル伝達モジュールに結合すると、完全な機能的ＣＡＲが形成される。ＣＡＲは、形質導入Ｔ細胞での高い表面発現、高度の細胞溶解ならびに形質導入Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖および持続を示す。例えば対象におけるがんを処置するための、開示されるＣＡＲ、宿主細胞、および核酸分子を使用する方法も提供される。
したがって、一態様において、配列番号１、３、５、７、９、および１１からなる群から選択される核酸配列を含む、ヒト抗ＣＤ３３抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
一実施形態において、完全ヒト抗ＣＤ３３抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、および単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）からなる群から選択される断片を含む。
一実施形態において、完全ヒト抗ＣＤ３３抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、抗体またはその断片は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様において、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号１、３、５、７、９、および１１からなる群から選択される核酸配列を含むヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、コードされる細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
別の実施形態では、コードされる細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一実施形態において、ＣＡＲの標的化ドメインはモノクローナル抗体、ＳｃＦｖ Ｆａｂ、Ｆａｂ’２の形態で別々に発現され、さらなる結合タグまたはエピトープに結合させ
た、配列番号１、３、５、７、９、および１１からなる群から選択される核酸配列を含む抗原標的化ドメインを含んでおり、一方、エフェクター細胞で発現されるＣＡＲの構成要素は、可溶性ＣＡＲモジュールで発現されるタグまたはエピトープに結合するように特異的に導かれる結合性ドメインを含み、例えば、ＣＡＲの可溶性構成要素が、細胞に結合したＣＡＲの構成要素に特異的に結合すると、完全な機能的ＣＡＲ構造が形成される。
別の実施形態において、ＣＡＲの標的化ドメインはモノクローナル抗体、ＳｃＦｖ Ｆａｂ、Ｆａｂ’２の形態で別々に発現され、配列番号１、３、５、７、９、および１１からなる群から選択される核酸配列を含む抗原標的化ドメイン、ならびにさらなるｓｃＦｖを含み、一方、エフェクター細胞で発現されるＣＡＲの構成要素は、可溶性ＣＡＲモジュールで発現されるさらなるｓｃＦｖと特異的に反応するタグまたはエピトープを含み、例えば、ＣＡＲの可溶性構成要素が、細胞に結合したＣＡＲの構成要素に特異的に結合すると、完全な機能的ＣＡＲ構造が形成される。
さらに別の実施形態では、コードされるＣＡＲ細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合する少なくとも１つのリポカリンベースの抗原結合性抗原（アンチカリン）をさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、コードされる細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続される、単離された核酸分子が提供される。
別の実施形態では、コードされるＣＤ３３細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列が先行する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
さらに別の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、および１１からなる群から選択される核酸配列を含むヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメインを含むＣＡＲをコードする、単離された核酸分子が提供され、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する細胞外抗原結合性ドメインをさらにコードする。
ある特定の実施形態では、さらにコードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳｏ－１ ＴＣＲ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一態様では、本明細書で提供されるＣＡＲはリンカーまたはスペーサードメインをさらに含む。
一実施形態では、細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８またはＣＤ２８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
別の実施形態では、コードされるＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
さらに別の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
別の実施形態では、コードされる少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
さらなる実施形態では、コードされる少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一実施形態では、リーダー配列またはシグナルペプチドをさらに含み、リーダーまたはシグナルペプチドのヌクレオチド配列が配列番号１３、配列番号３９、配列番号４１、または配列番号４３のヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
さらに別の実施形態では、コードされるリーダー配列が配列番号１４、配列番号４０、配列番号４２、または配列番号４４のアミノ酸配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
一態様では、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書で提供される。
一実施形態では、細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片、または抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域、
またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲが提供される。
別の実施形態において、少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、ＣＡＲが提供される。
一部の実施形態において、ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む細胞外抗原結合性ドメインをさらにコードする、ＣＡＲが提供される。
一実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗メソセリン ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳｏ－１ ＴＣＲ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲが提供される。
別の実施形態において、細胞外抗原結合性ドメインが、免疫グロブリン可変重鎖単独（ＶＨ）抗ＣＤ１９抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ ＶＨ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ ＶＨ抗原結合性ドメイン、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含むＣＡＲが提供される。
別の実施形態において、細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗メソセリン Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＢＣ
ＭＡ（ＣＤ２６９）Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ｃ－Ｍｅｔ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７
Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２
Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｐ 抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ Ｐ 抗原結合性ドメイン、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む天然または合成配列由来であり得る、標的抗原に特異的に結合することができるタンパク質またはペプチド（Ｐ）配列を含む、ＣＡＲが提供される。別の実施形態において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。
さらに別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインを含む、ＣＡＲが提供される。
一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列は配列番号１５（ＬＴＧ １９０５ ＥＦ１ａ ＶＨ－２ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列（図２Ａ））の核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は配列番号１６（ＬＴＧ １９０５
ＥＦ１ａ ＶＨ－２ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ａ））のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列は配列番号１７（ＬＴＧ １９０６ Ｅｆ１ａ－ ＶＨ－４ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列（図２Ｂ））の核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は配列番号１８（ＬＴＧ １９０６ Ｅｆ１ａ－ ＶＨ－４ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｂ））のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列は配列番号１９（ＬＴＧ１９３６ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ９ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータＣＡＲヌクレオチド配列（図２Ｃ））の核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は配列番号２０（ＬＴＧ１９３６ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ９ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｃ））のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２１の核酸配列（ＬＴＧ１９３７ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ１０ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列（図２Ｄ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列（ＬＴＧ１９３７ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ１０ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｄ））を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列（ＬＴＧ１９３８ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１２ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列（図２Ｅ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号２４のアミノ酸配列（ＬＴＧ１９３８ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１２ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｅ））を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２５の核酸配列（ＬＴＧ１９３９ ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ１５ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼ
ータ核酸配列（図２Ｆ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号２６のアミノ酸配列（ＬＴＧ１９３９ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１５ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｆ））を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号６９の核酸配列（ＬＴＧ１９２７ ＥＦ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＣＤ８ ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ核酸配列（図１２Ａ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号７０のアミノ酸配列（ＬＴＧ１９２７ ＥＦ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＣＤ８ ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤゼータアミノ酸配列（図１２Ａ））を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号７１の核酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００３３ Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿ＣＤ２８ｚ核酸配列（図１２Ｂ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号７２のアミノ酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００３３（Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿ＣＤ２８ｚ）アミノ酸配列（図１２Ｂ））を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号７３の核酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００３４ Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿４－１ＢＢｚ核酸配列（図１２Ｃ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号７４のアミノ酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００３４ Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿４－１ＢＢｚアミノ酸配列（図１２Ｃ））を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号８７の核酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００３５ Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ Ｈ ＣＨ２ ＣＨ３ ＩｇＧ４＿ＣＤ８ＴＭ＿ＣＤ２８ｚ核酸配列（図１２Ｆ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号８８のアミノ酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００３５ Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ Ｈ ＣＨ２ ＣＨ３ ＩｇＧ４＿ＣＤ８ＴＭ＿ＣＤ２８ｚアミノ酸配列（図１２Ｆ））を含むＣＡＲをコードする。
一態様では、本明細書で開示されるＣＡＲは、診断、がん患者の無増悪生存期間などの処置転帰のモニタリングおよび／もしくは予測における使用のため、またはかかる処置の進行をモニタリングするために、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号７５の核酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００１５ Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ＢＢｚ Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲ核酸配列（図１２Ｄ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号７６のアミノ酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００１５ Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ＢＢｚ Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲアミノ酸配列（図１２Ｄ））を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号７７の核酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００１６ Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ２８ｚ Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲ核酸配列（図１２Ｅ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号７８のアミノ酸配列（ＬＴＧ＿Ｄ００１５ Ｅｆ１ａ－ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ２８ｚ Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲアミノ酸配列（図１２Ｅ））を含むＣＡＲをコードする。
一実施形態では、開示されたＣＡＲをコードする核酸分子は、ウイルスベクターなどのベクター中に含有され得る。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、もしくはレトロウイルスベクター、また
はそれらの組合せである。
ある特定の実施形態では、ベクターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーターまたはそれらの任意の組合せであるプロモーターをさらに含む。
さらに別の実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、自殺スイッチによって、ＣＡＲ Ｔ細胞の発現を制御するため、またはＣＡＲ－Ｔ細胞を排除するために、１または複数の作動可能なエレメントを含むようにさらに改変され得る。自殺スイッチには、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物が含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようにさらに改変され得る。
別の態様では、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、例えば、対象から得られた初代Ｔ細胞である。一実施形態では、宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
さらに別の態様では、抗腫瘍有効量のヒトＴ細胞集団を含む医薬組成物であって、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲが、配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列を含むＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞ががんを有するヒトのＴ細胞である、医薬組成物が提供される。がんは、とりわけ血液学的がん、例えば、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）もしくは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫）または多発性骨髄腫、あるいはそれらの組合せを含む。
一実施形態において、ＣＡＲの少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、医薬組成物が提供される。
別の実施形態では、ヒトのがんは、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系がん（喉頭、肺および気管支）、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む、医薬組成物が提供される。
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトのヒトＴ細胞の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、がんが、１または複数の化学療法剤に対して非応答性の難治性がんである、医薬組成物が提供される。がんは、造血がん、骨髄異形成症候群、膵がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白
血病）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む成人Ｂ細胞悪性疾患、小児Ｂ細胞悪性疾患（Ｂ細胞系譜ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）を含む）、多発性骨髄腫、肺がん、乳房がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫もしくは他の血液学的がんおよび固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含む。
別の態様では、ＣＡＲ含有Ｔ細胞（以下「ＣＡＲ Ｔ細胞」）を作製する方法が提供される。この方法は、ＣＤ３３に特異的に結合する開示されるＣＡＲをコードするベクターまたは核酸分子をＴ細胞に形質導入し、それによって、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製することを含む。
さらに別の態様では、ＲＮＡ操作された細胞の集団を生成する方法であって、開示されるＣＡＲをコードする核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを対象の細胞中に導入し、ＣＡＲ細胞を生成することを含む方法が提供される。
さらに別の態様において、細胞でのＣＤ３３発現と関連する疾患、障害または状態を診断する方法であって、（ａ）細胞をヒト抗ＣＤ３３抗体またはその断片と接触させるステップであって、抗体またはその断片が配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、ならびに（ｂ）ＣＤ３３の存在を検出するステップであって、ＣＤ３３の存在が、ＣＤ３３発現と関連する疾患、障害または状態を診断する、ステップを含む方法が提供される。
一実施形態において、ＣＤ３３発現と関連する疾患、障害または状態は、造血がん、骨髄異形成症候群、膵がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む成人Ｂ細胞悪性疾患、小児Ｂ細胞悪性疾患（Ｂ細胞系譜ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）を含む）、多発性骨髄腫、肺がん、乳房がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫もしくはその他の血液学的がんおよび固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含むがんである。
別の実施形態において、哺乳動物におけるＣＤ３３と関連する疾患のリスクを診断、予後診断、または決定する方法であって、（ａ）試料をヒト抗ＣＤ３３抗体またはその断片と接触させるステップであって、抗体またはその断片が配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ステップ、ならびに（ｂ）ＣＤ３３の存在を検出するステップであって、ＣＤ３３の存在が、哺乳動物におけるＣＤ３３と関連する疾患を診断する、ステップを含む、哺乳動物由来の試料におけるＣＤ３３発現を検出するステップを含む方法が提供される。
別の実施形態において、ＣＤ３３依存性のＴ細胞阻害を阻害する方法であって、細胞をヒト抗ＣＤ３３抗体またはその断片と接触させるステップであって、抗体またはその断片が配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ステップを含む方法が提供される。一実施形態において、細胞は、ＣＤ３３を発現する腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＤ３３を発現する細胞により媒介されるＴ細胞阻害を遮断し、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害するように腫瘍微小環境を変化させる方法であって、単離された抗ＣＤ３３抗体またはその断片を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与するステップであって、抗体またはその断片が、配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ステップを含む方法が提供される。一実施形態において、細胞は、ＣＤ３３を発現する腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、および
それらの任意の組合せからなる群から選択される。
別の実施形態において、哺乳動物における抗腫瘍または抗がん免疫応答の免疫抑制を阻害、抑制または防止する方法であって、単離された抗ＣＤ３３抗体またはその断片を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与するステップであって、抗体またはその断片が、配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ステップを含む方法が提供される。一実施形態において、抗体またはその断片は、第１の細胞とＴ細胞の間の相互作用を阻害し、第１の細胞は、ＣＤ３３を発現する腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
別の態様では、哺乳動物において抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、開示されるＣＡＲをコードするベクターまたは核酸分子が形質導入された治療有効量のＴ細胞を哺乳動物に投与するステップを含む、方法が提供される。
別の実施形態では、哺乳動物においてがんを処置または予防する方法であって、１つまたは複数の開示されるＣＡＲを、哺乳動物におけるがんを処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、方法が提供される。方法は、対象において、ＣＡＲの抗原結合性ドメインと、ＣＤ３３および／または１つまたは複数の上述の抗原の細胞外ドメインとの免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、ＣＤ３３および／または１つまたは複数の上述の抗原に特異的に結合する開示されるＣＡＲを発現する治療有効量の宿主細胞を対象に投与するステップを含む。
さらに別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、抗腫瘍有効量のＴ細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲが、配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む少なくとも１つの細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞ががんを有する対象のＴ細胞である、方法が提供される。
さらに別の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、抗腫瘍有効量のＴ細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲが配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞ががんを有する対象のＴ細胞である、方法が提供される。上述の方法の一部の実施形態では、少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体の膜貫通アルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せを含む。
さらに別の実施形態では、がんと診断されたヒトにおいて、遺伝子操作されたＴ細胞の持続性の集団を生成するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞をヒトに投与するステップであって、ＣＡＲが配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、遺伝子操作されたＴ細胞の
持続性の集団、またはＴ細胞の子孫の集団が、投与の後少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、２年または３年にわたって、ヒトにおいて持続する、ステップを含む。
一実施形態では、ヒト中の子孫Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。
本明細書に記載される方法の態様および実施形態の全てにおいて、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する上述のがん、疾患、障害または状態のいずれかは、本明細書に開示されるＣＡＲのうち１または複数を使用して、処置または予防または寛解され得る。
さらに別の態様では、上記キメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製するためのキット、または上記対象において、腫瘍抗原の上昇した発現と関連するがん、疾患、障害もしくは状態のいずれかを予防、処置もしくは寛解するためのキットであって、上に開示された核酸分子、ベクター、宿主細胞もしくは組成物のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せを含むコンテナ、およびキットを使用するための指示書を含むキットが提供される。
ＣＡＲ、宿主細胞、核酸ならびに方法は、本明細書に詳細に記載される具体的な態様および実施形態を超えて有用であることが理解される。本開示の前述の特色および利点は、添付の図面を参照して進む以下の詳細な説明からより明らかになる。
新規の細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン配列を有するＣＡＲの一般的なドメイン構造を示す概略図である。キメラ抗原受容体は、細胞外ＣＤ３３結合性免疫グロブリン単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）ドメインまたは免疫グロブリン重鎖断片可変単独（ＶＨ）ドメイン、ＣＤ８（図１Ａ、１Ｂ、１Ｆ、１Ｇ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（図１Ｃ、１Ｄ）、ＩｇＧ４（図１Ｅ）由来のヒンジドメイン、ＣＤ８（図１Ａ、１Ｂ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（図１Ｃ、１Ｄ）由来の膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ（図１Ａ、１Ｃ、１Ｆ）またはＣＤ２８（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｇ）由来の細胞内シグナル伝達共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインから構成される。一部のバイシストロニックな構築物は、リボソームスキッピング２Ａ配列を介して、短縮されたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）由来のタグを組み込んでいる（図１Ｆ、１Ｇ）。 新規の細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片または連結された単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー、膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含む。図２Ａは、ＬＴＧ １９０５ ＥＦ１ａ ＶＨ－２ ＣＤ３３－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 新規の細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片または連結された単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー、膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含む。図２Ｂは、ＬＴＧ １９０６（ＥＦ１ａ－ ＶＨ－４ ＣＤ３３－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 新規の細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片または連結された単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー、膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含む。図２Ｃは、ＬＴＧ１９３６ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ９ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータヌクレオチド配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 新規の細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片または連結された単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー、膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含む。図２Ｄは、ＬＴＧ１９３７ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１０ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 新規の細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片または連結された単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー、膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含む。図２Ｅは、ＬＴＧ１９３８ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１２ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 新規の細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片または連結された単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー、膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含む。図２Ｆは、ＬＴＧ１９３９ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１５ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 初代ヒトＴ細胞における抗ＣＤ３３ ＣＡＲＴ表面発現を示す図である。可変重鎖単独標的化ドメインの使用によりＣＤ３３腫瘍抗原に対して再指向されたＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウイルス形質導入により生成した。フローサイトメトリーによりＣＡＲＴ検出を実施した。Ｔ細胞を低温のＰＢＳ－ＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄し、ＣＤ３３－Ｆｃペプチド、その後抗Ｆｃ－ＡＦ６４７試薬で染色した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０フローサイトメーターにおいて、ＡＰＣチャンネルでデータを取得した。ＮＴ－非形質導入細胞、ＧＦＰ－陰性対照。 免疫グロブリン重鎖可変ドメインバインダーを組み込んだ抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３３陽性腫瘍の細胞溶解を実証することを示すグラフである。抗ＣＤ３３構築物を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入されたＣＤ３３高（ＨＬ－６０）、ＣＤ３３中（Ｋ５６２）およびＣＤ３３低（Ｒｅｈ）標的とともに、エフェクター対標的比５、１０および２０で一晩インキュベートした。次いで、材料および方法に記載されるように、ルシフェラーゼ活性測定によりＣＡＲＴの細胞傷害活性を評価した。Ｎ＝３＋／－ＳＥＭ。 ＶＨベースのＣＤ３３特異的ＣＡＲＴ細胞が、ＣＤ３３陽性白血病株と共培養されると高レベルのサイトカインを産生することを示すグラフである。抗ＣＤ３３ ＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ３３高（ＴＨＰ－１、ＨＬ－６０）ＣＤ３３中（Ｋ５６２）またはＣＤ３３低（Ｒｅｈ）白血病株とともにＥ：Ｔ比１０：１で一晩コインキュベートし、次いで上清をＥＬＩＳＡによりサイトカイン濃度について分析した。Ｎ＝３＋／－ＳＤ。陰性対照：ＮＴ－非形質導入Ｔ細胞、１３９８－ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞。 初代ヒトＴ細胞における抗ＣＤ３３ ＣＡＲＴ表面発現を示す図である。ＳｃＦｖ標的化ドメインの使用によりＣＤ３３腫瘍抗原に対して再指向されたＣＡＲ Ｔ細胞を、レンチウイルス形質導入により生成した。フローサイトメトリーによりＣＡＲ Ｔ検出を実施した。Ｔ細胞を低温のＰＢＳ－ＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄し、ＣＤ３３－Ｆｃペプチド、その後抗Ｆｃ－ＡＦ６４７試薬で染色した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０フローサイトメーターにおいて、ＡＰＣチャンネルでデータを取得した。ＵＴＤ－非形質導入細胞、１３９８－ＧＦＰ陰性対照。 免疫グロブリン重鎖可変ドメインバインダーを組み込んだ抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ３３陽性腫瘍の細胞溶解を実証することを示すグラフである。抗ＣＤ３３構築物を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入されたＣＤ３３高（ＨＬ－６０、ＭＯＬＭ－１４）、ＣＤ３３中（Ｋ５６２）およびＣＤ３３低（Ｒｅｈ）標的とともに、エフェクター対標的比５、１０および２０で一晩インキュベートした。次いで、材料および方法に記載されるように、ルシフェラーゼ活性測定によりＣＡＲＴの細胞傷害活性を評価した。Ｎ＝３＋／－ＳＥＭ。 ＣＤ３３特異的なｓｃＦｖベースおよびＶＨベースのＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ３３陽性白血病株と共培養されると高レベルのサイトカインを産生することを示すグラフである。抗ＣＤ３３ ＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ３３高（ＨＬ－６０、ＭＯＬＭ－１４）またはＣＤ３３低（Ｒｅｈ）白血病株とともにＥ：Ｔ比１：１で一晩コインキュベートし、次いで上清をＥＬＩＳＡによりサイトカイン濃度について分析した。Ｎ＝３＋／－ＳＤ。陰性対照：ＵＴＤ－非形質導入Ｔ細胞、１３９８－ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞。 種々の抗ＣＤ３３構築物を発現するＣＡＲ Ｔ細胞の、ＨＬ－６０ ＣＤ３３＋腫瘍細胞との長期コインキュベーションアッセイについて示す図である。抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞株を、培養物中でＨＬ－６０ ＣＤ３３＋腫瘍細胞と、表示されるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で組み合わせ、１１日間維持した。次いで、共培養された細胞を採取し、フローサイトメトリーによりデータ取得した。材料および方法に記載されるように、細胞を単一の側方散乱、シングレットに基づきゲーティングし、死滅した細胞を７－ＡＡＤ染色により除外した。箱は標識通りに、各条件における生存ＨＬ－６０＋腫瘍細胞およびＣＤ３＋ＣＡＲ Ｔ細胞のパーセンテージを示す。ＵＴＤ－非形質導入Ｔ細胞対照、１３９８－ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞対照、Ｅ：Ｔ １：０はＴ細胞単独対照を表す。 生物発光画像法を使用してｉｎ ｖｉｖｏで評価された、ＣＤ３３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞による腫瘍拒絶動態を示すグラフである。０日目に、１．０×１０６のＭＯＬＭ－１４ ＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞をＮＳＧマウスに接種し、研究５日目に５．０×１０６のＣＡＲ Ｔ＋細胞／マウスを投与した。１４～３５日目の間毎週、生物発光画像法により腫瘍負荷を評価した。Ａ．平均放射輝度＋／－ＳＥＭ、Ｎ＝６マウス／群。Ｂ．実験過程にわたる、各実験群におけるマウス生存のパーセンテージを示すカプランマイヤー曲線、Ｎ＝６マウス／群。ＴＡ－腫瘍単独、ＵＴＤ－非形質導入Ｔ細胞対照。 ｉｎ ｖｉｖｏで評価されたＣＤ３３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の機能性を示すグラフである。０日目に、１．０×１０６のＭＯＬＭ－１４ ＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞をＮＳＧマウスに接種し、研究５日目に５．０×１０６のＣＡＲ Ｔ＋細胞／マウスを投与した。研究１９日目にマウスから血液を採取し、循環ＣＡＲ Ｔ、腫瘍細胞、および炎症性サイトカインレベルについて分析した。Ａ．ＣＡＲＴ細胞およびＭＯＬＭ－１４腫瘍細胞をフローサイトメトリーによりデータ取得し、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズを使用して細胞絶対数を決定した。Ｂ．マウス血漿中の炎症性サイトカインレベルを、ＭＡＣＳ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙにより評価した。Ｎ＝６マウス／群。ＴＡ－腫瘍単独、ＵＴＤ－非形質導入Ｔ細胞対照。二元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定により群を比較した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、ＮＳ－有意でない。 異なるＣＡＲ構成の状況における、新規の細胞外ＶＨ ＣＤ３３＿４抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片、細胞外リンカー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。一部の配列は、ＣＡＲ配列より下流に、２Ａリボソームスキップ配列により分離されたｔＥＧＦＲタグペプチドを含む。図１２Ａは、ＬＴＧ１９２７ ＥＦ１ａ ＣＤ３３＿４ ＣＤ８ ＴＭ ＣＤ２８ ＣＤ３ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 異なるＣＡＲ構成の状況における、新規の細胞外ＶＨ ＣＤ３３＿４抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片、細胞外リンカー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。一部の配列は、ＣＡＲ配列より下流に、２Ａリボソームスキップ配列により分離されたｔＥＧＦＲタグペプチドを含む。図１２Ｂは、ＬＴＧ＿Ｄ００３３ ＥＦ１ａ ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿ＣＤ２８ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 異なるＣＡＲ構成の状況における、新規の細胞外ＶＨ ＣＤ３３＿４抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片、細胞外リンカー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。一部の配列は、ＣＡＲ配列より下流に、２Ａリボソームスキップ配列により分離されたｔＥＧＦＲタグペプチドを含む。図１２Ｃは、ＬＴＧ＿Ｄ００３４ Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿４－１ＢＢ ＣＤ３ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 異なるＣＡＲ構成の状況における、新規の細胞外ＶＨ ＣＤ３３＿４抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片、細胞外リンカー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。一部の配列は、ＣＡＲ配列より下流に、２Ａリボソームスキップ配列により分離されたｔＥＧＦＲタグペプチドを含む。図１２Ｄは、ＬＴＧ＿Ｄ００１５ ＣＤ３３＿４ＶＨ ＣＤ８ ＢＢ ＣＤ３ゼータＴ２Ａ ｔＥＧＦＲ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 異なるＣＡＲ構成の状況における、新規の細胞外ＶＨ ＣＤ３３＿４抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片、細胞外リンカー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。一部の配列は、ＣＡＲ配列より下流に、２Ａリボソームスキップ配列により分離されたｔＥＧＦＲタグペプチドを含む。図１２Ｅは、ＬＴＧ＿Ｄ００１６ ＣＤ３３＿４ＶＨ ＣＤ８ ２８ ＣＤ３ゼータＴ２Ａ ｔＥＧＦＲ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。 異なるＣＡＲ構成の状況における、新規の細胞外ＶＨ ＣＤ３３＿４抗原結合性ドメイン配列を含むいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を示す図である。ＣＡＲについての一般的な図式は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド、抗ＣＤ３３バインダー可変重鎖断片、細胞外リンカー、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む。一部の配列は、ＣＡＲ配列より下流に、２Ａリボソームスキップ配列により分離されたｔＥＧＦＲタグペプチドを含む。図１２Ｆは、ＬＴＧ＿Ｄ００３５ Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ Ｈ ＣＨ２ ＣＨ３ ＩｇＧ４＿ＣＤ８ＴＭ＿ＣＤ２８ ＣＤ３ゼータ核酸配列を含むＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。
詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方を指す
。例えば、用語「１つの抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「１つの抗原を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の要素を排除することなく、「１つの抗原を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。語句「および／または」とは、「および」または「または」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値は、特記しない限り、おおよそであり、便宜的に提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特に適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。種々の実施形態の再検討を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。
用語「約」とは、測定可能な値、例えば、量、時間的持続期間などに言及する場合、特定された値から±２０％、または一部の例では±１０％、または一部の例では±５％、または一部の例では±１％、または一部の例では±０．１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示される方法を実施するために適切である。
特記しない限り、本明細書の技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ、１９９９年；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．によって刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって刊行されたＲｏｂｅｒｔ
Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５年；および他の類似の参考文献中に見出すことができる。
本開示は、ＣＤ３３抗体またはその断片、およびこのようなＣＤ３３抗原結合性ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲの機能的活性の増強は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の機能的活性の増強に直接関連する。これらの１つまたは複数の改変の結果として、ＣＡＲは、形質導入されたＣＡＲ発現Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖および持続レベルの増大と共に、高度のサイトカイン誘導性細胞溶解および形質導入Ｔ細胞での細胞表面発現の両方を示す。
様々なタンパク質ドメインに由来する機能性部分を組み合わせる独自の能力が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の重要かつ革新的な特色である。これらのタンパク質ドメイン各々の選択は、これらの具体的な組合せ方と同様に、重要な設計特色である。各設計ドメインは、様々なＣＡＲプラットフォームでリンパ球の機能を操作するのに使用可能な必須の構成要素である。例えば、細胞外結合性ドメインの選択によって、それ以外の場合では無効のＣＡＲを有効にすることができる。
ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインを作り出すのに使用される、免疫グロブリン由来のタンパク質配列の非可変フレームワーク構成要素は、完全に中立であるか、自己会合してＴ細胞を代謝疲弊の状態にすることがあり、そのためこのＣＡＲを発現する治療的Ｔ細胞が極度に無効となる。このことは、このＣＡＲドメインの抗原結合機能とは無関係に起こる。さらに、細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）の選択によっても、免疫療法に使用される治療的リンパ球集団の活性および耐久性が決定され得る。これらの細胞外および細胞内ドメインによって、標的抗原と結合する能力および活性化シグナルをＴ細胞に伝達する能力がそれぞれ、ＣＡＲ設計の重要な側面である一方で、細胞外抗原結合性断片の供給
源の選択が、ＣＡＲの有効性に対して顕著な効果を有し、それゆえにＣＡＲの機能および臨床的有用性において決定的な役割を有し得ることも明らかとなっている。
驚くべきことにかつ予想外に、ここで、宿主において抗マウス免疫応答およびＣＡＲ Ｔ排除を誘導する傾向がある、マウス由来の抗原結合性断片を使用するのではなく（マウス由来のＳＳ１ ＳｃＦｖ配列を使用する、ＵＰｅｎｎの資金提供を受けた臨床試験、ＮＣＴ０２１５９７１６を参照）、ＣＡＲに完全ヒト抗原結合性ドメインを使用することでも、ＣＡＲを発現するＴ細胞の機能的活性が決定され得ることが発見された。
本明細書で開示されるＣＡＲは、細胞において高レベルで発現される。ＣＡＲを発現する細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで高い増殖速度を有し、多量のサイトカインを産生し、ＣＡＲが結合するＣＤ３３抗原を表面に有する細胞に対し高い細胞傷害活性を有する。ヒト細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインの使用により、ｉｎ ｖｉｖｏでより良好に機能するＣＡＲの生成がもたらされ、一方で宿主免疫応答での抗ＣＡＲ免疫の誘導およびＣＡＲ Ｔ細胞集団の死滅が回避される。完全ヒト細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ抗原結合性ドメインを発現するＣＡＲは、ｉ）マウス由来の結合性配列で見られる、ＣＡＲ Ｔの持続および機能不足の防止；ｉｉ）有効となるべきＣＡＲの局所（即ち、胸膜内）送達がないこと；ならびにｉｉｉ）ＣＤ３３に対し高親和性および低親和性を有するバインダー両方に基づいてＣＡＲ Ｔ細胞設計を生成する能力、を含む優れた活性／特性を示す。この最後の特性により、腫瘍には正常な組織よりもＣＤ３３が多く発現していることで、親和性がより小さいバインダーは正常な組織よりも腫瘍に対しより大きい特異性を有することができ、それによりオンターゲットな腫瘍以外への毒性およびバイスタンダー細胞の死滅が防止され得るため、研究者は、ＣＡＲ Ｔ産物の毒性に対する有効性、および／または組織特異性をよりよく調整することができる。
ＣＡＲ、抗体およびその抗原結合性断片、コンジュゲート、ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞、開示されたＣＡＲを使用する処置の方法、組成物およびキットのさらなる記載と共に、それらの細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの記載を含む本発明のＣＡＲの詳細な記載は以下である。
Ａ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で開示されるＣＡＲは、ＣＤ３３に結合することが可能な少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結された、抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴には、非ＭＨＣ拘束様式で、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってＴ細胞の特異性および反応性を再指向させるそれらの能力が含まれる。非ＭＨＣ拘束的な抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、そうして、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。
本明細書に開示するように、ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、限定としてではなく、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、ＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率
的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部分を指す。
１．細胞外ドメイン
一実施形態では、ＣＡＲは、さもなければ抗原結合性ドメインまたは部分と呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。
一実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合性ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的化するように操作され得る。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合性ドメインの選択は、処置される特定の型のがんに依存する。腫瘍抗原は、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体ならびにＣＤ３３が含まれる。本明細書に開示される腫瘍抗原は、例として含まれるにすぎない。このリストは、排他的である意図はなく、さらなる例が、当業者に容易に明らかである。
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１または複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼおよびＧＰ １００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が含まれるがこれらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に独自の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３７は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、限定的な成功で、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されている。
好ましい一実施形態において、腫瘍抗原はＣＤ３３であり、ＣＤ３３発現と関連する腫瘍は、高レベルの細胞外タンパク質ＣＤ３３を発現する肺中皮腫、卵巣および膵がん、またはそれらの任意の組合せを含む。
腫瘍抗原の型は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でもあり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に独自であり、身体中の他の細胞上には存在しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に独自ではなく、その代わり、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導できない
条件下で正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり応答できない胎児発生の間に正常細胞上で発現される抗原であり得、または正常細胞上では非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上ではかなり高いレベルで発現される抗原であり得る。
ＴＳＡまたはＴＡＡの非限定的な例には、以下が含まれる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５；過剰発現された胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現された癌遺伝子および変異した腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きいタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３／ＣＡ ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０／Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが含まれる。
一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＭＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する。
好ましい実施形態において、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、細胞外ＣＤ３３抗原を標的化する。
好ましい一実施形態において、細胞外ＣＤ３３ ＶＨ－２抗原結合性ドメインをコードする単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる細胞外ＣＤ３３ ＶＨ－２抗原結合性ドメインが配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
好ましい一実施形態において、細胞外ＣＤ３３ ＶＨ－４抗原結合性ドメインをコードする単離された核酸分子は、配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる細胞外ＣＤ３３ ＶＨ－４抗原結合性ドメインが配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
好ましい一実施形態において、細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ９抗原結合性ドメインをコードする単離された核酸分子は、配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ９抗原結合性ドメインが配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
好ましい一実施形態において、細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ１０抗原結合性ドメインをコードする単離された核酸分子は、配列番号７のヌクレオチド配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ１０抗原結合性ドメインが配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８のアミノ酸配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
好ましい一実施形態において、細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ１２抗原結合性ドメインをコードする単離された核酸分子は、配列番号９のヌクレオチド配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ１２抗原結合性ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
好ましい一実施形態において、細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ１５抗原結合性ドメインをコードする単離された核酸分子は、配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、コードされる細胞外ＣＤ３３ ＳｃＦｖ１５抗原結合性ドメインが、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
本明細書に記載される特異的なＣＤ３３可変重鎖単独およびＳｃＦｖ抗原結合性断片または抗原バインダーの生成および結合の特徴を実施例１に示す。
本明細書で開示されるＣＤ３３特異的ＣＡＲについての種々の実施形態では、一般的図式が図１に示され、Ｎ末端からＣ末端へ、シグナルまたはリーダーペプチド、抗ＣＤ３３ＳｃＦｖ、細胞外リンカー、ＣＤ８膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含み、太字テキストは連結ドメインのクローニング部位を表す。
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１５の核酸配列を含み、配列番号１６［ＬＴＧ １９０５：ＥＦ１ａ ＶＨ－２ ＣＤ３３－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ａに示す）］に示すアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１５の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号１６に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列［ＬＴＧ
１９０５ ＥＦ１ａ ＶＨ－２ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ
アミノ酸配列（図２Ａに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１７の核酸配列を含み、配列番号１８［ＬＴＧ １９０６ Ｅｆ１ａ－ ＶＨ－４ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｂに示す）］に示すアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１７の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号１８に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列［ＬＴＧ１９０６ Ｅｆ１ａ－ ＶＨ－４ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｂに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態に置いて、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１９の核酸配列を含み、配列番号２０［ＬＴＧ１９３６ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ９ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｃに示す）］に示すアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。
別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１９の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号２０に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列［ＬＴＧ１９３６ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ９ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｃに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
さらに別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２１の核酸配列を含み、配列番号２２［ＬＴＧ１９３７ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ１０ ＣＤ３３ ＣＤ８
ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３アミノ酸配列（図２Ｄに示す）］に示すアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。
さらに別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２１の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号２２に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列［ＬＴＧ１９３７ Ｅｆ１ａ ＳｃＦｖ１０ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３アミノ酸配列（図２Ｄに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
さらに別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は配列番号２３の核酸配列を含み、配列番号２４に示すアミノ酸配列［ＬＴＧ１９３８ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１２ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｅに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
さらに別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２３の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号２４に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列［ＬＴＧ１９３８ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１２ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｅに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
さらに別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は配列番号２５の核酸配列を含み、配列番号２６に示すアミノ酸配列［（ＬＴＧ１９３９ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１５
ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｆに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
さらに別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号２５の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号２６に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列［（ＬＴＧ１９３９ ＥＦ１ａ ＳｃＦｖ１５ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータアミノ酸配列（図２Ｆに示す）］を含むＣＡＲをコードする。
ＣＤ３３抗原と反応する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）配列を組み込んだ抗ＣＤ３３ ＣＡＲの表面発現について、以下の実施例２に示し表２に要約する。ＳｃＦｖまたはＶＨを含む各ＣＡＲについての発現レベルは、組換えＣＤ３３－Ｆｃペプチド、その後ＡＦ６４７とコンジュゲートされた抗ヒトＦｃＦ（ａｂ’）２断片を使用する、健康なドナー由来のＬＶ形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析により決定し、ＡＰＣチャンネルで検出した（実施例２、図３および６参照）。ＶＨベースの抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物１９０５および１９０６（黒線）は２人のドナー由来のＴ細胞表面で容易に検出され、Ｔ細胞形質導入の再現性を実証した。一方、陰性対照である非形質導入Ｔ細胞（灰色線）、およびＧＦＰ対照（図示しない）ではＣＡＲ発現が検出されず、したがって、使用された検出方法の特異性が実証された（実施例２、図３および表２参照）。同様に、ＳｃＦｖベースの抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物１９３６、１９３７、１９３８および１９３９は、非形質導入Ｔ細胞対照（灰色線）と比較して、ヒト初代Ｔ細胞（黒線）で高度に発現された。１人のドナーの代表的な結果が示される。
実施例２、図４および図７に示すように、以下のＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ）を作り出し、抗白血病活性について試験すると、ＣＤ３３ ＣＡＲの高い細胞溶解活性が実証された。各実験的ＣＡＲは、４－１ＢＢ／ＣＤ３－ゼータ鎖シグナル伝達モチーフ、およびそこに特記される特異的な抗ＣＤ３３結合性モチーフ／ドメインを含む。種々のＣＤ３３表面発現を有する白血病標的株４つ：ＨＬ－６０およびＭＯＬＭ－１４（高）、ＲｅｈおよびＫ５６２（低）を使用した。ＶＨドメインベースのＣＡＲ－Ｔ構築物ＬＴＧ１９０５およびＬＴＧ１９０６はＣＤ３３低Ｋ５６２細胞を溶解させ、ＬＴＧ１９０６はｘ軸に表示されるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でより優れた細胞溶解機能を示した（図４を参照、ＬＴＧ１９０５およびＬＴＧ１９０６、それぞれ黒菱形および黒丸）。ＣＤ３３高ＨＬ－６０腫瘍株と組み合わせると、ＬＴＧ１９０６は強力な死滅機能を実証したがＬＴＧ１９０５は実証せず、構築物ＬＴＧ１９０６が強力であることが強調された。一方、陰性対照群：ＮＴ（非形質導入Ｔ細胞）、および１３９８（ＧＦＰ対照が形質導入されたＴ細胞）ではいずれも、特異的な細胞溶解活性が発揮されなかった。したがって、本発明者らがＣＤ３３を発現する腫瘍株に対して観察した、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ
ＬＴＧ１９０６およびＬＴＧ１９０５の細胞溶解活性は、標的特異的かつＣＡＲＴ依存性である。
比較すると、ＳｃＦｖベースの抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物ＬＴＧ１９３６およびＬＴＧ１９３９は、ＣＤ３３高腫瘍株ＨＬ－６０およびＭＯＬＭ－１４を効率的に溶解させることができたが、ＣＤ３３低Ｒｅｈ腫瘍株は部分的にしか溶解させず、Ｋ５６２に対しては特異的な溶解活性を有しなかった（図７参照、ＬＴＧ１３９８およびＬＴＧ１９３６ それぞれ白正方形および白逆三角）。この発見から、生成されたＣＡＲ構築物の効率および特異性が実証される。予想外に、このセットで試験されたさらなるＣＡＲ構築物、ＬＴＧ１９３７およびＬＴＧ１９３８は、ＣＤ３３高腫瘍株を溶解させるのに非効率的であり、
したがって、ＣＡＲＴ設計が些細なことではなく、可溶性抗体の特徴がＣＡＲの機能性に直接つながるわけではないことが再度実証された。
次いで、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン分泌能力を評価した。腫瘍細胞をＣＡＲ Ｔ細胞または対照Ｔ細胞とともに、エフェクター対標的比１０：１で一晩コインキュベートし、培養上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２について分析した（図５および表２参照）。注目すべきことに、ＣＡＲ Ｔを発現する細胞ＬＴＧ１９０５およびＬＴＧ１９０６は高レベルのＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２を産生したが、陰性対照ＮＴおよび１３９８群はサイトカイン誘導をほとんど生じなかった。驚くべきことに、ＣＤ３３ ＣＡＲ ＬＴＧ１９０５は、構築物ＬＴＧ１９０６と比較して、試験を行った腫瘍株全てに対してより大きいレベルの誘導サイトカインを生じる傾向があった。この結果は、ＬＴＧ１９０６と比較してより小さい、ＬＴＧ１９０５のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞溶解機能と対照的であり（図４参照）、複数のＣＡＲ Ｔの機能的エンドポイントを、構築物のベースごとに、構築物について試験する必要があることを示唆している。
任意の特定の作用機構に限定する意図はないが、本発明の例示的なＣＡＲと関連する増強された治療機能の可能な理由には、例えば、限定としてではなく、ａ）より効率的なシグナル伝達を可能にする、原形質膜内での改善された側方の動き、ｂ）脂質ラフトなどの原形質膜マイクロドメイン内の優れた位置、およびＴ細胞活性化と関連する膜貫通シグナル伝達カスケードと相互作用するより高い能力、ｃ）抑制的もしくは下方調節性の相互作用から離れる優先的な動きによる、原形質膜内の優れた位置、例えば、ＣＤ４５などのホスファターゼとあまり近接していないこと、もしくはそれとのより少ない相互作用、ならびにｄ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体（即ち、免疫シナプス）への優れたアセンブリ、またはそれらの任意の組合せが含まれると考えられる。
本開示は、例示的な細胞外ＣＤ３３可変重鎖単独およびＳｃＦｖ抗原結合性ドメインを用いて例示しているが、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用するためのＣＤ３３抗原結合性ドメインを得るのに、ＣＤ３３可変重鎖単独およびＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン内のその他のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸バリアントを使用してもよい。
標的化される所望の抗原に依存して、ＣＡＲは、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合性ドメインを含むようにさらに操作され得る。例えば、ＣＤ１９が標的化される所望の抗原である場合、ＣＤ１９に対する抗体が、ＣＡＲ中への抗原結合ドメイン取込みとして使用され得る。
例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９をさらに標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ１９ ＳｃＦｖであり、ここで、抗ＣＤ１９ ＳｃＦｖの核酸配列は、配列番号３７に示される配列を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９ ＳｃＦｖは、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ１９ ＳｃＦｖ部分は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様では、例えば、限定としてではなく、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－ＬＰ）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルスおよびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科［例えば、１型およ
び２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ならびにヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよびポックスウイルス）もしくはＣ型肝炎ウイルスに由来する抗原、またはそれらの任意の組合せを含む非ＴＳＡまたは非ＴＡＡに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
本発明の別の態様では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細菌株に由来する抗原に結合することが可能なＣＡＲが提供される。特に、感染性細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ．の細菌株（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉまたはＭ．ｇｏｒｄｏｎｅａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉに由来する抗原、またはそれらの組合せに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
２．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインに融合された１つまたは複数の膜貫通ドメインを含む。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。
本明細書に記載されるＣＡＲにおいて特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し得る（即ち、それらの膜貫通領域（複数可）を少なくとも含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端において見出される。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間での連結を形成し得る。グリシン－セリン二つ組は、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に関連する膜貫通ドメインが、上記膜貫通ドメインに加えて使用される。
一部の場合には、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するために、アミノ酸置換により選択され得る。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２７の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む
。
一実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの改変（例えば、置換）であるが２０、１０もしくは５以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または配列番号２８のアミノ酸配列に対し９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一部の場合には、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２９の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ＣＤ８ドメイン、膜貫通ＣＤ２８ドメイン、またはそれらの組合せに連結される、単離された核酸分子が提供される。
一実施形態において、本発明のＣＡＲにおける膜貫通ドメインはＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインである。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインは配列番号５１の核酸配列を含む。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインは配列番号５２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインは配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの改変（例えば、置換）であるが２０、１０もしくは５以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または配列番号５２のアミノ酸配列に対し９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
３．スペーサードメイン
ＣＡＲでは、ヒンジドメインとも呼ばれるスペーサードメインは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置され得る。スペーサードメインは、膜貫通ドメインを細胞外ドメインと連結させるように、および／または膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙され
るものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのＣＡＲの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進すると予測されるアミノ酸の例には、システイン、荷電アミノ酸、ならびに潜在的グリコシル化部位中のセリンおよびスレオニンが含まれ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。
スペーサードメインとして、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のヒンジ領域であるアミノ酸番号１１８～１７８（配列番号３１）、ＣＤ８ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５～１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５～３９６、またはＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７～１５２の全体または一部が使用され得る。また、スペーサードメインとして、抗体Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の一部（ＣＨ１領域またはＣＬ領域、例えば、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するペプチド）が使用され得る。さらに、スペーサードメインは、人工的に合成された配列であり得る。
さらに、ＣＨ１、（アミノ酸番号１～９８）、ヒンジ、配列番号８０、および対応するヌクレオチド配列番号７９、（アミノ酸番号９９～１１０）、ＣＨ２、アミノ酸配列番号８１および対応するヌクレオチド配列番号８０、（アミノ酸番号１１１～２２０）ならびにＣＨ３、配列番号８４および対応するヌクレオチド配列番号８３、（アミノ酸番号２２１～３２７）、またはそれらの組合せ、例えばＩｇＧ４ ヒンジ ＣＨ２ ＣＨ３ドメイン、配列番号８６、および対応するヌクレオチド配列番号８５を含む、ヒトＩｇＧ４（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０１８６１）の定常領域を含むアミノ酸の全体または一部が使用可能である。
一実施形態において、ＣＡＲのスペーサードメインは、配列番号５３の核酸配列を含むＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジドメインを含む。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、ＣＡＲのスペーサードメインは、配列番号５５の核酸配列を含むＴＮＦＲＳＦ１９の短縮されたヒンジドメインを含む。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９の短縮されたヒンジドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９の短縮されたヒンジドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号４９の核酸配列を含む。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、配列番号５７の核酸配列を含む形で、ＣＤ８ａヒンジドメインはＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに融合された。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに融合されたＣＤ８ａヒンジドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに
融合されたＣＤ８ａヒンジドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
さらにＣＡＲでは、リーダーペプチドとも呼ばれるシグナルペプチド配列を、Ｎ末端に連結することができる。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５～３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして上で言及されるタンパク質分子の多くは、シグナルペプチド配列を有するので、これらのシグナルペプチドがＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用され得る。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、ＣＤ８アルファリーダーペプチドは、配列番号４３の核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８アルファリーダーペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに融合されたＣＤ８ａヒンジドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
別の実施形態において、ＧＭＣＳＦリーダーペプチドは、配列番号３９の核酸配列を含む。一実施形態において、ＧＭＣＳＦリーダーペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに融合されたＣＤ８ａヒンジドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９リーダーペプチドは、配列番号４１の核酸配列を含む。一実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９リーダーペプチド、およびＣＤ８アルファリーダーペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに融合されたＣＤ８ａヒンジドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、上皮増殖因子受容体の短縮された配列（ｔＥＧＦＲ）をコードするタグ配列は、配列番号６７の核酸配列を含む。一実施形態において、ｔＥＧＦＲは配列番号６８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ｔＥＧＦＲタグは配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、タグ配列およびＣＡＲ配列のバイシストロニックな同時発現のために設計されるフューリン認識部位および下流Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列は、配列番号６５の核酸配列を含む。一実施形態において、フューリンおよびＴ２Ａ配列は、配列番号６６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ｔＥＧＦＲタグは、配列番号６６のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、タグ配列およびＣＡＲ配列のバイシストロニックな同時発現のために設計される上流のフューリン認識部位およびＴ２Ａ自己切断ペプチド配列およびフューリン認識下流部位は、配列番号６７の核酸配列を含む。一実施形態において、フューリンおよびＴ２Ａ配列は、配列番号６８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ｔＥＧＦＲタグは、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
一実施形態において、ＣＡＲの標的化ドメインはモノクローナル抗体、ＳｃＦｖ Ｆａ
ｂ、Ｆａｂ’２の形態で別々に発現され、結合タグまたはエピトープを含み、一方、エフェクター細胞で発現されるＣＡＲの構成要素は、可溶性ＣＡＲモジュールで発現されるタグまたはエピトープに結合するように特異的に導かれる結合性ドメインを含み、例えば、ＣＡＲの可溶性構成要素が、細胞に結合した構成要素に特異的に結合すると、完全な機能的ＣＡＲ構造が形成される。
４．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが中に置かれた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される限りにおいて、かかる短縮された部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語、細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
ＣＡＲでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始させるように協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体もしくはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。
ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルが、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルもまた必要とされることは公知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言われ得る：ＴＣＲを介した抗原依存的な一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
本明細書に開示されるＣＡＲにおいて特に使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。ＩＴＡＭの具体的な非限定的な例には、ＣＤ３ゼータ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１～１６４、ＦｃイプシロンＲＩガンマ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５～８６、ＦｃイプシロンＲＩベータ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１～２４４、ＣＤ３ガンマ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９～１８２、ＣＤ３デルタ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８～１７１、ＣＤ３イプシロン（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３～２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、００２２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．
２）のアミノ酸番号７０７～８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６～２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２～２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ
ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７～２５２の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。本明細書に記載されるＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされる。一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、それ自体で、またはＣＡＲの状況で有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。かかる共刺激分子の具体的な非限定的な例には、ＣＤ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６～３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１～４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７～２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６～２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１～２２０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４～２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１～２７７およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６～１９９の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。したがって、本明細書の開示は、４－１ＢＢを共刺激シグナル伝達エレメントとして主に例示するが、他の共刺激エレメントが本開示の範囲内である。
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは特定された順序で、互いに連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、連結を形成し得る。グリシン－セリン二つ組は、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８および４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号３３、配列番号４５、または配列番号５９にそれぞ
れ示される核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号３５、配列番号４７、または配列番号６１にそれぞれ示される核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号３４、配列番号４６、または配列番号６０それぞれのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号３６、または配列番号４８、または配列番号６２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号３４、配列番号４６、または配列番号６０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号３６、配列番号４８、または配列番号６２にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４５または配列番号５９にそれぞれ示される核酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号３５、配列番号４７、または配列番号６１にそれぞれ示される核酸配列を含む。
一実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４６または配列番号６０それぞれのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号３６、または配列番号４８、または配列番号６２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４６または配列番号６０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号３６、配列番号４８、または配列番号６２にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む。
５．ＣＡＲのさらなる記載
本明細書で開示されるＣＡＲの機能的部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能的部分」とは、ＣＡＲに関して使用する場合、本明細書に開示されるＣＡＲの１または複数の任意の一部または断片を指し、この一部または断片は、それがその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力、または疾患を検出、処置もしくは予防する能力を保持する、ＣＲＡの一部を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％またはそれ超を構成し得る。
機能的部分は、その部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、または両方の末端において、さらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識し、がんを検出し、がんを処置または予防するなどの、機能的部分の生物学的機能を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
本明細書に開示されるＣＡＲの機能的バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用する場合、親ＣＡＲに対する実質的なまたは著しい配列同一性または類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチドまたはタンパク質を指し、この機能的バリアントは、それがそのバリアントであるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを包含する。親ＣＡＲに関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲに対して、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％またはそれ超、アミノ酸配列が同一であり得る。
機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得、その結果、機能的バリアントの生物学的活性は、親ＣＡＲと比較して増加される。
ＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該分野で公知であり、これには、ある特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じまたは類似の化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を置換する酸性／負に荷電した極性アミノ酸、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）を置換する非極性側鎖を有するアミノ酸、塩基性／正に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）を置換する塩基性／正に荷電した極性アミノ酸、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を置換する極性側鎖を有する非荷電アミノ酸、ベータ分岐側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｅ、ＴｈｒおよびＶａｌ）を置換するベータ分岐側鎖を有するアミノ酸、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を置換する芳香族側鎖を有するアミノ酸などであり得る。
ＣＡＲは、本明細書に記載される特定されたアミノ酸配列（単数または複数）から本質的になり得、その結果、他の構成要素、例えば、他のアミノ酸は、機能的バリアントの生物学的活性を著しくは変化させない。
ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、任意の長さであり得る、即ち、任意の数のアミノ酸を含み、但し、ＣＡＲ（またはその機能的部分もしくは機能的バリアント）は、それらの生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において罹患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を処置もしくは予防する能力などを保持する。例えば、ＣＡＲは、約５０～約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ超アミノ酸長であり得る。
ＣＡＲ（本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１または複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、－アミノ ｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－ヒドロキシプロリンおよびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェ
ニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ν’，Ν’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、－アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、γ－ジアミノ酪酸、β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびａ－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが含まれる。
ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、もしくは酸付加塩へ変換および／または任意選択で二量体化もしくは重合、あるいはコンジュゲートされ得る。
ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、当該分野で公知の方法によって得られ得る。ＣＡＲは、ポリペプチドまたはタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製され得る。ポリペプチドおよびタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、Ｃｈａｎら、Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、２０００年；Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｉｄ，Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、２０００年；Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、２００１年；および米国特許第５，４４９，７５２号などの参考文献に記載されている。また、ポリペプチドおよびタンパク質は、標準的な組換え法を使用し、本明細書に記載される核酸を用いて組換え産生可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ ２００１；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９４を参照のこと。さらに、一部のＣＡＲ（機能性部分およびその機能性バリアントを含む）は、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、例えばラット、ヒトなどの供給源から単離および／または精製することができる。単離および精製方法は当技術分野で周知である。あるいは、本明細書に記載されるＣＡＲ（機能性部分およびその機能性バリアントを含む）を、企業が商業的に合成することもできる。この点で、ＣＡＲは合成であっても、組換えであっても、単離されていても、かつ／または精製されていてもよい。
Ｂ．抗体および抗原結合性断片
一実施形態は、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書で開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性ドメインもしくは部分をさらに提供する。本明細書で使用する場合、「ＣＡＲを発現するＴ細胞」または「ＣＡＲ Ｔ細胞」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、例えば、ＣＡＲの抗体由来の標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。
本明細書で使用する場合、「抗原結合性ドメイン」は、抗体およびその抗原結合性断片を含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（
例えば、二重特異的抗体）、およびそれらの抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば、当該分野で公知のインタクトな免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合親和性を保持するそのバリアントおよび断片が含まれる。
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体である、即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。一部の例では、モノクローナル抗体は、単一クローンのＢリンパ球によって産生された抗体、または単一の抗体（またはその抗原結合性断片）の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞、もしくはその子孫によって産生された抗体である。一部の例では、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対する影響を実質的に有さない保存的アミノ酸置換を有し得る。モノクローナル抗体の産生の例示的な方法は公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１３年）を参照のこと。
典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。
各重鎖および軽鎖は、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメインを含有する；例えば、Ｋｉｎｄｔら Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、９１頁（２００７年）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖の可変領域は、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、重鎖可変領域のみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物（camelid）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安
定である（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６～４４８頁、１９９３年；Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３巻：７３３～７３６頁、１９９６年を参照のこと）。「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗原結合性断片、例えば、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを位置付けアラインさせるように機能する。
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は
、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、（ＪＭＢ ２７３巻、９２７～９４８頁、１９９７年；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、およびＬｅｆｒａｎｃら（「 ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻：５５～７７頁、２００３年；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）に記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端へ）と呼ばれ、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であるが、ＶＬ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。
「抗原結合性断片」は、同族抗原を特異的に認識する能力を保持する全長抗体の部分、ならびにかかる部分の種々の組合せである。抗原結合性断片の非限定的な例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ＳｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれる。抗体断片には、抗体全体の改変によって産生された抗原結合性断片、または組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成された抗原結合性断片が含まれる（例えば、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１～２巻、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、２０１０年を参照のこと）。
単鎖抗体（ＳｃＦｖ）は、適切なポリペプチドリンカーによって連結された１または複数の抗体（複数可）のＶＨおよびＶＬドメインを遺伝学的に融合された単鎖分子として含有する遺伝子操作された分子である（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３～４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５巻：５８７９～５８８３頁、１９８８年；Ａｈｍａｄら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ、ＩＤｒｕｇｓ、１３巻：５４３～５４９頁、２０１０年を参照のこと）。ＳｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的には、ＳｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（ＶＨドメイン－リンカードメイン－ＶＬドメイン；ＶＬドメイン－リンカードメイン－ＶＨドメイン）を有するＳｃＦｖが使用され得る。
ｄｓＦｖでは、重鎖および軽鎖の可変鎖は、鎖の会合を安定化させるために、ジスルフィド結合を導入するように変異されている。ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異的抗体であるディアボディもまた含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０巻：６４４４～６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻：１１２１～１１２３頁、１９９４年を参照のこと）。
抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（
例えば、二重特異的抗体）などの、遺伝子操作された形態もまた含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４～１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７年もまた参照のこと。
天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得、組換え産生され得、または、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６巻：１２７５～１２８１頁（１９８９年）に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、単鎖および二機能性抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４巻：２４３～２４６頁（１９９３年）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ
３４１巻：５４４～５４６頁（１９８９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８年；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９２年）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５年）；その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を５０％以上遮断する。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。
「ヒト化」抗体または抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）抗体または抗原結合性断片由来の１または複数のＣＤＲを含む。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体または抗原結合性断片は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性断片は、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％以上同一であり得る。したがって、ヒト化抗体または抗原結合性断片の全ての部分は、おそらくはＣＤＲを除いて、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。
「キメラ抗体」は、典型的には異なる種のものである２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、１つのヒト抗体由来の１または複数のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域ならびに別のヒト抗体由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域を含む。
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）配列を含むが、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによって、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて配列を創出するためのテクノロジーを使用して、またはトランスジェニック動物を使用して、同定および単離され得る（例えば、Ｂａｒｂａｓら Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ．第１版 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００４年 Ｐｒｉｎｔ．；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻：１１１７～１１２５頁、２００５年；Ｌｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻：４５０～４５９頁、２００８年を参照のこと）。
抗体は、１または複数の結合部位を有し得る。１よりも多い結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１つの結合部位を有するが、二重特異的または二機能性抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
ＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、これには、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降および競合阻害アッセイなどが含まれる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、以下、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号Ａｌ、および米国特許第７，３３８，９２９号を参照のこと）。
また、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などを含むように改変され得る。
Ｃ．コンジュゲート
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、または本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に対して特異的なモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、当業者に公知のいくつもの手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの薬剤にコンジュゲートされ得る。共有結合および非共有結合の両方の手段が使用され得る。コンジュゲートには、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片へのエフェクター分子または検出可能なマーカーの共有結合的連結が存在する分子を含むがこれらに限定されない。当業者は、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、放射活性剤、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓ、ならびに他の標識、標的部分およびリガンドなどを含む（がこれらに限定されない）種々のエフェクター分子および検出可能なマーカーが使用され得ることを理解する。
特定のエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。
エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合性断片に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に従って変動する。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（－ＮＨ２）またはスルフヒドリル（－ＳＨ）基を含有し、これらは、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合を生じるための、抗体上の適切な官能基との反応のために利用可能である。あるいは、抗体または抗原結合性断片は、さらなる反応性官能基を曝露または結合するために誘導体化される。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能なものなどの、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合を含み得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片をエフェクター分子または検出可能なマーカーに結合させるために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーの両方への共有結合を形成することが可能である。適切なリンカーは、当業者に周知であり、これに
は、直鎖もしくは分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれるがこれらに限定されない。抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側基を介して（例えば、システインへのジスルフィド連結を介して）構成成分アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノおよびカルボキシル基に結合され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は、細胞内環境中で、抗体または抗原結合性断片からエフェクター分子または検出可能なマーカーを放出させる。さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、例えば、抗体分解によって放出される。一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。しかし、リンカーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長、例えば、１～２、１～３、２～５、３～１０、３～１５、１～５、１～１０、１～１５アミノ酸長であり得る。プロテアーゼには、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが含まれ得、その全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側での活性薬物の放出を生じることが公知である（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３巻：６７～１２３頁を参照のこと）。例えば、チオール依存的プロテアーゼであるカテプシンＢによって切断可能なペプチドリンカーが使用され得る（例えば、フェニルアラニン－ロイシンまたはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシンリンカー）。かかるリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。具体的な実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、バリン－シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーまたはフェニルアラニン－リシンリンカーである（例えば、バリン－シトルリンリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、即ち、ある特定のｐＨ値において加水分解に対して感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド（
cis-aconitic amide）、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；米国特許第５，８２４，８０５号；米国特許第５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３巻：６７～１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：１４６５３～１４６６１頁を参照のこと）。かかるリンカーは、血液中などの中性のｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回るｐＨでは不安定である。ある特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当該分野で公知であり、これには、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）－、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成され得るものが含まれる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７巻：５９２４～５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９８７年）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８巻：９２８０～９２９０頁、２００８年を参照のこと）。米国特許第４，８８０，９３５号もまた参照のこと。
さらに他の具体的な実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５巻：１３８７～９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１２９９～１３０４頁）または３’－Ｎ－アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１３０５～１２頁）である。
さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、抗体分解によって放出される（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞外環境中での切断に対して抵抗性である。例えば、コンジュゲートが細胞外環境中（例えば、血漿中）に存在する場合、コンジュゲートのサンプル中のリンカーの約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下が切断される。リンカーが細胞外環境中での切断に対して抵抗性であるか否かは、例えば、目的のリンカーを含有するコンジュゲートを、所定の期間（例えば、２、４、８、１６または２４時間）にわたって血漿と共にインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離のエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって決定され得る。コンジュゲート中で使用され得る種々の例示的なリンカーは、ＷＯ２００４－０１０９５７、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号に記載されており、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲのコンジュゲート、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体ま
たはその抗原結合性部分、および１または複数の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ドラスタチン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、トリコテシンおよびＣＣ１０６５ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体が提供される。
マイタンシノイド毒素部分としての使用に適切なマイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）化合物は、当該分野で周知であり、公知の方法に従って天然供給源から単離され得、遺伝子操作技術（Ｙｕら（２００２年）ＰＮＡＳ ９９巻：７９６８～７９７３頁を参照のこと）、または公知の方法に従って合成により調製されたマイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）およびマイタンシノールアナログを使用して産生され得る。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある特定の微生物もまた、マイタンシノールおよびＣ－３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；米国特許第４，２４８，８７０号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２６０，６０８号；米国特許第４，２６５，８１４号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３０８，２６８号；米国特許第４，３０８，２６９号；米国特許第４，３０９，４２８号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３１７，８２１号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３６２，６６３号；および米国特許第４，３７１，５３３号に開示されており，その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許第５，４１６，０６４号；米国特許第６，４４１，１６３号および欧州特許ＥＰ０ ４２５ ２３５ Ｂ１に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
さらなる毒素が、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分と共に使用され得る。例示的な毒素には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ヒマ毒、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉｎ）、リボヌクレアーゼ、サポリンおよびカリチアマイシン、ならびにボツリヌス毒素Ａ～Ｆが含まれる。これらの毒素は、当該分野で周知であり、多くは、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。企図される毒素には、これらの毒素のバリアントも含まれる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと）。
サポリンは、リボソーム複合体の６０Ｓ部分を不活性化することによってタンパク質合成を破壊する、Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する毒素である（Ｓｔｉｒｐｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：４０５～４１２頁、１９９２年）。しかし、この毒素は、細胞中への特異的進入のための機構を有さず、したがって、細胞によって効率的に取り込まれるために、内在化される細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合性断片へのコンジュゲートを必要とする。
ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素における使用のためのジフテリア毒素は、非特異的毒性を低減または排除するために変異される。完全な酵素活性を有するが非特異的毒性が顕著
に低減された、ＣＲＭ１０７として公知の変異体は、１９７０年代以降公知であり（ＬａｉｒｄおよびＧｒｏｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９巻：２２０頁、１９７６年）、ヒト臨床試験において使用されてきた。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照のこと。
ヒマ毒は、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のレクチンＲＣＡ６０である。ヒマ毒の例については、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニン（ＲＣＡ）は、それぞれ、およそ６５ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量に従って、ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と称される２つの形態で存在する（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｌａｕｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２６６巻：５４３頁、１９７２年）。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の死滅を担う。Ｂ鎖は、ヒマ毒を細胞表面ガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２４９巻：６２７～６３１頁、１９７４年および米国特許第３，０６０，１６５号）。
リボヌクレアーゼもまた、免疫毒素としての使用のために標的化分子にコンジュゲートされてきた（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７巻：２６５～７０頁、１９９９年を参照のこと）。例示的なリボトキシン、例えば、α－サルシン（α－ｓａｒｃｉｎ）およびレストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）は、例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら、Ｇｅｎｅ １９０巻：３１～５頁、１９９７年；ならびにＧｏｙａｌおよびＢａｔｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４５巻２部：２４７～５４頁、２０００年で議論されている。カリチアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離されたものであり、ＤＮＡ中にアポトーシスをもたらす二本鎖切断を生じさせて、エンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２巻：１０７０～８７頁、１９８９年を参照のこと）。この薬物は、臨床試験中の免疫毒素の毒性部分である（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１巻：７３５～４１頁、２０００年を参照のこと）。
アブリンは、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の毒性レクチンを含む。毒性素であるアブリンａ、ｂ、ｃおよびｄは、約６３ｋＤおよび６７ｋＤの分子量を有し、２つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖ＡおよびＢから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害する；Ｂ鎖（アブリン－ｂ）は、Ｄ－ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２巻：１０９５頁、１９８８年；およびＯｌｓｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０巻：３３０～３３５頁、１９７８年を参照のこと）。
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に対して特異的なモノクローナル抗体、その抗原結合性断片はまた、検出可能なマーカー；例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技術（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、コンピューター体軸断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ ａｘｉａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡下試験）による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能なマーカーの具体的な非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素的連結、放射活性同位体および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。例えば、有用な検出可能なマーカーには、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５－ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）塩化物、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含む蛍光化合物が含まれる。ルシフェラーゼ、
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーもまた使用される。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出のために有用な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどにもコンジュゲートされ得る。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分が、検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、それは、識別できる反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって検出され得る。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、視覚的に検出可能な着色反応産物をもたらす。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、ビオチンとコンジュゲートされ得、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的な測定を介して検出され得る。アビジン自体が酵素または蛍光標識とコンジュゲートされ得ることに留意すべきである。
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、ガドリニウムなどの常磁性薬剤とコンジュゲートされ得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性薬剤もまた、標識として使用される。抗体は、ランタニド（例えば、ユーロピウムおよびジスプロシウム）およびマンガンともコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合性断片はまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識され得る。
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、放射標識されたアミノ酸とコンジュゲートされ得る。放射標識は、診断目的および治療目的の両方のために使用され得る。例えば、放射標識は、ｘ線、発光スペクトルまたは他の診断技術によって本明細書に開示された抗原および抗原発現細胞のうち１または複数を検出するために使用され得る。さらに、放射標識は、対象における腫瘍の処置のため、例えば、神経芽細胞腫の処置のために、毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が含まれるがこれらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
かかる検出可能なマーカーを検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーは、発せられた照明を検出するために光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、発色標識は、着色標識を単純に可視化することによって検出される。
Ｄ．ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞
本明細書に記載されるＣＡＲ、抗体またはその抗原結合性部分（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、本発明の一実施形態によってさらに提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン改変され得る。特定の理論に束縛されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンに置換し、そうして翻訳効率を増加させることを含み得る。ヌクレオチド配列の最適化
はまた、翻訳を妨害する二次ｍＲＮＡ構造を低減させ得、そうして翻訳効率を増加させる。
本発明の実施形態では、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメインをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。
「核酸」は、本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」を含み、一般に、一本鎖または二本鎖の、合成のまたは天然供給源から得られた（例えば、単離および／または精製された）ものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得、未改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）連結またはホスホロチオエート連結を含有し得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。一部の実施形態では、核酸は、いずれの挿入、欠失、逆位および／または置換も含まない。しかし、一部の場合には、本明細書で議論されるように、核酸は、１または複数の挿入、欠失、逆位および／または置換を含むことが適切であり得る。
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列の２つのさもなければ分離されたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、化学的合成によって、またはより一般的には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されるものなどの遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって達成される場合が多い。核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学的合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学合成され得る。核酸を生成するために使用され得る改変型ヌクレオチドの例には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換されたアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６－ジアミノプリンが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうち１または複数は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）などの会社から購入できる。
核酸は、ＣＡＲまたはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかと縮重するヌクレオチド配列、または縮重配列の組合せを含み得る。
一実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列、または本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸もまた提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得る。「高いストリンジェンシーの条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシーの条件には、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域（例えば、３～１０塩基）を偶然に有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、またはいくつかの散在するミスマッチしか含有しないポリヌクレオチドを識別する条件が含まれる。相補性のかかる小領域は、１４～１７またはそれ超塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシーの条件には、例えば、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたは等価物によって、約５０～７０℃の温度で提供されるような、低塩および／または高温条件が含まれる。かかる高いストリンジェンシーの条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチをほとんど忍容せず、本発明のＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に適切である。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントにされ得ることが理解される。
本明細書に記載される核酸のいずれかに対して、少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供される。
一実施形態では、核酸は、組換え発現ベクター中に取り込まれ得る。これに関して、一実施形態は、核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、構築物が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、およびベクターが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが細胞内で発現されるのに十分な条件下で細胞と接触させられる場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターは、全体としては天然に存在しない。
しかし、ベクターの一部は、天然に存在し得る。組換え発現ベクターは、一本鎖または二本鎖の、合成または一部天然供給源から得られたものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、またはその両方の型の連結を含み得る。好ましくは、天然に存在しないまたは変更されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写も複製も邪魔しない。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、
任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、繁殖および増殖のためもしくは発現のため、またはその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群から選択され得る。
バクテリオファージベクター、例えば、λυΤΙ Ο、λυΤΙ １、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４およびλΝΜΙ １４９もまた使用され得る。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯｌ．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、特に、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７巻（８号）：１４５３～１４６４頁（２００９年）に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。クリニックにおいて使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、限定としてではなく、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ ｐｌｃのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
いくつかのトランスフェクション技術が、当該分野で一般に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６～４６７頁（１９７３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６年）；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ、１３巻：９７頁（１９８１年）を参照のこと）。
トランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈（例えば、Ｇｒａｈａｍら、上記を参照のこと）、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、２２巻：４７９～４８８頁（１９８０年）を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：７４２～７５１頁（１９８８年）を参照のこと）、リポソーム媒介性遺伝子移入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２～６９０頁（１９８８年）を参照のこと）、脂質媒介性形質導入（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：７４１３～７４１７頁（１９８７年）を参照のこと）および高速微小推進剤（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０～７３頁（１９８７年）を参照のこと）が含まれる。
一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。環状または直鎖状である発現ベクターの構築物は、原核生物または真核生物宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
組換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮に入れて、必要に応じて、ベクターが導入される宿主細胞の型（例えば、細菌、真菌、植
物または動物）に特異的な調節配列、例えば、転写および翻訳開始および終結コドンを含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限部位を含み得る。
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする、１または複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが含まれる。本発明の発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なもしくはかかるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブまたは非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列において見出されるプロモーターであり得る。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導性発現のために作製され得る。
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死なせる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、この遺伝子が発現される細胞に薬物などの薬剤に対する感受性を付与する遺伝子、または細胞が薬剤と接触した場合もしくは薬剤に曝露された場合にその細胞を死なせる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｃａｒｏｌｉｎｅ Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｔ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｕｔｔｏｎ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００４年を参照のこと）、これには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびニトロレダクターゼが含まれる。
一実施形態は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌もしくは藻類であり得る、または原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生生物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であり得る、即ち、ヒトなどの生物から直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、即ち、懸濁物中で成長する細胞であり得る。適切な宿主細胞は、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＤＨ５ａ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが含まれる。組換え発現ベクターを増幅または複製することを目的とすると、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、ＤＨ５ａ細胞であり得る。組換えＣＡＲを産生することを目的とすると、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細
胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の型の組織に起源し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。宿主細胞は、Ｔ細胞であり得る。
本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど由来のＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、メモリー幹細胞、即ち、Ｔｓｃｍ、ナイーブＴ細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、適切な非Ｔ細胞において使用され得る。かかる細胞は、免疫エフェクター機能を有する細胞、例えば、多能性幹細胞から生成されたＮＫ細胞およびＴ様細胞などである。
本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた、一実施形態によって提供される。細胞の集団は、いずれの組換え発現ベクターも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均一な集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり得、ここで、集団は主に、組換え発現ベクターを含む（例えば、それらから本質的になる）宿主細胞を含む。集団はまた、細胞のクローン性集団であり得、ここで、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞は、その組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン性集団である。
ＣＡＲ（その機能的部分およびバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）および抗体（その抗原結合性部分を含む）は、単離および／または精製され得る。例えば、精製（または単離）された宿主細胞の調製物は、宿主細胞が身体内のその天然環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって産生され得る。一部の実施形態では、宿主細胞の調製物は精製され、その結果、宿主細胞は、調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％を示す。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％もしくは約８０％よりも上であり得、または約１００％であり得る。
Ｅ．処置の方法
本明細書で開示されるＣＡＲは、哺乳動物において疾患を処置または予防する方法において使用され得ることが企図される。これに関して、一実施形態は、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、ならびに／または医薬組成物を、哺乳動物においてがんを処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてがんを処置または予防する方法を提供する。
一実施形態は、本明細書に開示されるＣＡＲを投与するステップの前に、哺乳動物をリ
ンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）ステップをさらに含む。リンパ枯渇の例には、非骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、全身照射などが含まれ得るがこれらに限定されない。
宿主細胞、または細胞の集団が投与される方法を目的として、細胞は、哺乳動物にとって同種または自家である細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物にとって自家である。本明細書で使用する場合、同種とは、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を意味する。１または複数の遺伝子座において遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は、互いに同種であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体由来の同種材料は、抗原性に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。本明細書で使用する場合、「自家」とは、個体に後に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を意味する。
本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、齧歯目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにウサギ（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）目の哺乳動物、例えば、ウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））を含む食肉目由来であり得る。哺乳動物は、ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目由来、またはウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものであり得る。哺乳動物は、霊長目、新世界ザル（Ｃｅｂｏｉｄ）目もしくはサル（Ｓｉｍｏｉｄ）目（サル（ｍｏｎｋｅｙ））または類人猿（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）目（ヒトおよび類人猿（ａｐｅ））のものであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
これらの方法に関して、がんは、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん（例えば、膀胱癌）、骨がん、脳がん（例えば、髄芽腫）、乳房がん、肛門、肛門管もしくは肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢もしくは胸膜のがん、鼻、鼻腔もしくは中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ－慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）およびバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がんならびに尿管がんのいずれかを含む任意のがんであり得る。
用語「処置する」および「予防する」ならびにそれらから派生した単語は、本明細書で使用する場合、１００％または完全な処置または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益な効果または治療効果を有すると認識する、種々の程度の処置または予防が存在する。これに関して、この方法は、任意の量または任意のレベルの、哺乳動物におけるがんの処置または予防を提供し得る。
さらに、この方法によって提供される処置または予防には、処置または予防されているがんなどの疾患の１または複数の状態または症状の処置または予防が含まれ得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発病を遅延させることを包含し得る。
別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、（ａ）哺乳動物由来の１または複数の細胞を含む試料を、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、または医薬組成物と接触させ、それによって、複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）複合体を検出するステップであって、複合体の検出が、哺乳動物におけるがんの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。
試料は、任意の適切な方法、例えば、生検または剖検によって得られ得る。生検は、個体からの組織および／または細胞の取り出しである。かかる取り出しは、取り出された組織および／または細胞に対する実験を実施するために、個体から組織および／または細胞を収集することであり得る。この実験には、個体がある特定の状態もしくは疾患状態を有するかどうか、および／またはある特定の状態もしくは疾患状態に罹患しているかどうかを決定するための実験が含まれ得る。状態または疾患は、例えば、がんであり得る。
哺乳動物における増殖障害、例えばがんの存在を検出する方法の実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、細胞全体、その溶解物、または細胞全体溶解物の画分、例えば、核もしくは細胞質画分、タンパク質全体画分、または核酸画分を含む試料であり得る。試料が細胞全体を含む場合、これらの細胞は、哺乳動物の任意の細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の臓器または組織の細胞であり得る。
接触させるステップは、哺乳動物に関してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。好ましくは、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。
また、複合体の検出は、当該分野で公知の多くの方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載される、本明細書に開示されるＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体もしくはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、上に開示される放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などで標識され得る。
標的細胞を認識する能力および抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６３巻：５０７～５１３頁（１９９９年）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ－ａ）またはインターロイキン２（ＩＬ－２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４巻：４４１５～４４２３頁（２００５年）に記載されるように、細胞傷害性の測定によって評価され得る。
別の実施形態は、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体もしくはその抗原結合性部分、および／または医薬組成物の使用、哺乳動物におけるがんなどの増殖障害の処置または予防を提供する。がんは、本明細書に記載されるがんのいずれかであり得る。
局所および全身投与を含む任意の投与方法が、開示された治療剤のために使用され得る。例えば、外用、経口、静脈内などの血管内、筋内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内および皮下投与が使用され得る。特定の投与様式および投薬レジメンは、症例の特徴（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、および処置が予防的かどうか）を考慮して、担当の臨床医によって選択される。１よりも多い薬剤または組成物が投与されている場合、
１または複数の投与経路が使用され得る；例えば、化学療法剤は、経口投与され得、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートまたは組成物は、静脈内投与され得る。投与方法には、ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞、コンジュゲート、抗体、抗原結合性断片または組成物が、非毒性の医薬的に許容される担体、例えば、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、固形油、オレイン酸エチルまたはリポソーム中に提供される注射が含まれる。一部の実施形態では、開示された化合物の局所投与は、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍発達の傾向があると疑われる領域に、抗体または抗原結合性断片を適用することによって使用され得る。一部の実施形態では、治療有効量の抗体または抗原結合性断片を含む医薬調製物の持続性の腫瘍内（または腫瘍近傍）放出が有益であり得る。他の例では、コンジュゲートが、角膜に点眼薬として外用で、または目に硝子体内で適用される。
開示された治療剤は、正確な投薬量の個々の投与に適切な単位剤形で製剤化され得る。さらに、開示された治療剤は、単一の用量でまたは複数用量のスケジュールで投与され得る。複数用量のスケジュールは、処置の主要な過程が、１よりも多い別々の用量、例えば１～１０用量と、その後の、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じて引き続く時間間隔で与えられる他の用量とによるものであり得るスケジュールである。処置は、数日～数カ月またはさらには数年の期間にわたる、１日用量または複数の１日用量の化合物（複数可）を含み得る。したがって、投薬レジームはまた、処置される対象の特定の要求に基づいて少なくとも一部決定され、投与する実務者の判断に依存する。
抗体またはコンジュゲートの典型的な投薬量は、約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
特定の例では、対象には、複数の１日投薬スケジュールで、例えば、少なくとも２連続日、１０連続日など、例えば、数週間、数カ月または数年の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物、ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ細胞またはさらなる薬剤のうち１または複数を含む治療組成物が投与される。一例では、対象には、少なくとも３０日、例えば、少なくとも２カ月、少なくとも４カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物またはさらなる薬剤が投与される。
一部の実施形態では、開示された方法は、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて、手術、放射線療法および／または化学療法薬を（例えば、連続的に、実質的に同時にまたは同時に）対象に提供することを含む。かかる薬剤および処置の方法および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。さらなる薬剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得る、または当業者によって実験的に決定される通りであり得る。かかる化学療法についての調製および投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ、（１９９２年）Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄにも記載されている。
一部の実施形態では、併用治療は、治療有効量のさらなるがん阻害剤の、対象への投与を含み得る。併用治療で使用され得るさらなる治療剤の非限定的な例には、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節因子ならびに血管新生阻害剤が含まれる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、任意の適切な抗がん剤または抗血管新生剤は、本明細書に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗体、抗原結合性断片またはコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。方法およびかかる薬剤の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟
練の臨床医によって決定され得る。
さらなる化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーのメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ；腫瘍親和性感光色素、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブおよびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。かかる薬剤の選択および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
併用療法は、相乗作用を提供し得、相乗的であることが証明され得る、即ち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果は、それらの化合物を別々に使用することから生じ得る効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）共製剤化され、併用される単位投薬製剤と同時に投与もしくは送達される場合；（２）別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）一部の他のレジメンによる場合に、達成され得る。交互に送達される場合、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別々のシリンジ中の異なる注射によって連続的に投与または送達される場合に達成され得る。一般に、交代の間、有効投薬量の各活性成分が、連続的に、即ち、順次に投与されるが、併用療法では、有効投薬量の２以上の活性成分が一緒に投与される。
一実施形態では、本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片またはそのコンジュゲートの有効量が、抗がん処置後に腫瘍を有する対象に投与される。投与された抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートがそれぞれのがん細胞上で発現された抗原と免疫複合体を形成するのに十分な量の時間が経過した後で、免疫複合体が検出される。免疫複合体の存在（または非存在）は、処置の有効性を示す。例えば、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の増加は、その処置が有効でないことを示し、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の減少は、その処置が有効であることを示す。
Ｆ．バイオ医薬組成物
担体（例えば、医薬的に許容される担体）中に、開示されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＣＡＲ、または本明細書に開示された１もしくは複数の抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む、遺伝子治療、免疫療法および／または細胞療法における使用のためのバイオ医薬組成物または生物製剤組成物（本明細書で以下「組成物」）が、本明細書で提供される。これらの組成物は、対象への投与のために単位投薬形態で調製され得る。所望の転帰を達成するための投与の量およびタイミングは、処置を行う臨床医の裁量である。これらの組成物は、全身（例えば、静脈内）または局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化され得る。一例では、開示されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲートは、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、腫瘍、例えば、限定としてではなく、神経芽細胞腫の、例えば、処置および検出などのために使用される。一部の例では、これらの組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、例えば、病理学的血管新生の検出にも使用される。
投与のための組成物には、水性担体などの薬学的に許容される担体中に溶解されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片の溶液が含まれ得る。例えば緩衝食塩水などの種々の水性担体が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。組成物は、従来の周知の無菌化技術によって無菌化され得る。組成物は、生理学的条件に近付くのに必要な医薬的に許容される補助的物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、アジュバント薬剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。遺伝子治療、免疫療法および／または細胞療法における使用のためのかかる投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または明らかとなる。
静脈内投与のための典型的な組成物は、１日当たり対象１人当たり約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇの抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート（あるいは対応する用量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート）を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５年）などの刊行物中により詳細に記載されている。
ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、凍結乾燥形態で提供され得、投与前に無菌水で再水和され得るが、これらは、既知の濃度の無菌溶液中でも提供される。次いで、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの溶液が、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加され、一部の場合には、０．５～１５ｍｇ／体重ｋｇの投薬量で投与される。抗体または抗原結合性断片およびコンジュゲート薬物の投与では、当該分野でかなりの経験が利用可能である；例えば、抗体薬物は、１９９７年のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の承認以降、米国で市販されている。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片およびそれらのコンジュゲートは、静注または静脈内ボーラスでではなく、緩徐な注入によって投与され得る。一例では、より高い負荷用量が、より低いレベルで投与される引き続く維持用量と共に投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の抗体または抗原結合性断片（または対応する用量の、抗体もしくは抗
原結合性断片を含むコンジュゲート）が、およそ９０分の期間にわたって注入され得、その後、以前の用量が十分に忍容された場合に３０分の期間にわたって注入される４～８週間にわたる２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量が注入され得る。
制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射として、または粒状の系として作製され得る。タンパク質送達系の広い概説については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．、 Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９５年）を参照のこと。粒状の系には、ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして、細胞毒または薬物などの治療的タンパク質を含有する。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子の至る所に分散される。約１μｍよりも小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと呼ばれる。毛細管は、ナノ粒子だけが静脈内投与されるように、およそ５μｍの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋内投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２１９～３４２頁（１９９４年）；ならびにＴｉｃｅおよびＴａｂｉｂｉ、Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、３１５～３３９頁（１９９２年）を参照のこと。
ポリマーは、本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート組成物のイオン制御された放出のために使用され得る。制御された薬物送達に使用される種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ、Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６巻：５３７～５４２頁、１９９３年）。例えば、ブロックコポリマーであるポロキサマー４０７（ｐｏｌａｘａｍｅｒ ４０７）は、低温で粘性であるがなお可動性の液体として存在するが、体温では半流動性ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン－２およびウレアーゼの製剤化および持続性送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９巻：４２５～４３４頁、１９９２年；およびＰｅｃら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４巻（２号）：５８～６５頁、１９９０年）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御された放出のための微小担体として使用されてきた（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２巻：２１５～２２４頁、１９９４年）。さらに別の態様では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御された放出および薬物標的化に使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９３年））。治療的タンパク質の制御された送達のための多数のさらなる系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
Ｇ．キット
一態様では、本明細書に開示されるＣＡＲを使用するキットもまた提供される。例えば
、対象における腫瘍を処置するためのキットまたは本明細書に開示されるＣＡＲのうち１もしくは複数を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を作製するためのキット。キットは、典型的には、本明細書に開示される、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１よりも多くが、キット中に含まれ得る。
キットは、コンテナ、およびコンテナ上のまたはコンテナと関連したラベルまたは添付文書を含み得る。適切なコンテナには、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。コンテナは、典型的には、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、コンテナは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。
ラベルまたは添付文書は、典型的には、例えば、腫瘍を処置もしくは予防する方法、またはＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法における、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用のための指示書をさらに含む。添付文書は、典型的には、治療的製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／またはかかる警告についての情報を含む、治療的製品の市販の包装中に習慣的に含まれる指示書を含む。教材は、電子的形態（例えば、コンピューターディスケットまたはコンパクトディスク）で書かれ得、または視覚的（例えば、動画ファイル）であり得る。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするためのさらなる構成要素もまた含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
本発明は以下の実施例によってさらに例証され、これらの実施例は決して本発明の範囲に制約を課すものとして解釈すべきではない。反対に、その様々な他の実施形態、変更形態、および均等物に頼らなければならず、これらは本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、当業者の念頭に浮かび得ることは容易に理解される。
実施例１
ファージディスプレイした完全ヒトＳｃＦｖおよびＶＨライブラリーからのＣＤ３３特異的抗体の単離
材料および方法：
ａ）ファージディスプレイしたヒトＳｃＦｖおよびＶＨ ＣＤ３３特異的抗体の産生
５０人の健康なドナーの末梢血Ｂ細胞から構築されたナイーブヒトｓｃＦｖ（免疫グロブリンの組換え単鎖断片可変）ファージディスプレイライブラリー（およその多様性、１０１０の独自の特異性）（Ｚ．Ｙ．ＺｈｕおよびＤ．Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、未公開データ）、およびヒトＶＨ（免疫グロブリン重鎖可変ドメイン）ライブラリーを、組換えヒトＣＤ３３に特異的なｓｃＦｖまたはＶＨの選択に使用した。ファージディスプレイした１０１２のＳｃＦｖまたはＶＨの増幅されたライブラリーを、体積５×１００μｌでコーティングされたＣＤ３３ ５、３、および１μｇとともにインキュベートし、第１、第２お
よび第３のラウンドそれぞれのバイオパニング中に９６ウェルプレートのウェル５つに等しく分配し室温で２時間置いた。各ラウンドのインキュベーション後に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で、第１のラウンドでは５回、その後のラウンドでは１０回ウェルを洗浄して非特異的に結合したファージを除去し、結合したファージをＴＧ１コンピテント細胞と３７℃で１時間混合し、感染させた細胞からファージを増幅させて次のラウンドのバイオパニングに使用した。第３のラウンドのバイオパニング後、感染させたＴＧ１細胞から３８０のクローンをランダムに選び、それぞれを、自動ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ ＢｉｏＰｉｃｋコロニーピッキングシステム（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用することにより、９６ウェルプレート中の、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび０．２％グルコースを含む２ＹＴ培地１５０μｌに接種した。細菌培養物が６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）０．５に到達した後、感染多重度（ＭＯＩ）１０のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７および５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）のカナマイシンを培地に添加し、プレートを振とう機において２５０ｒｐｍで、３０℃で一晩さらにインキュベートした。ファージ上清を体積比４：１で、ＰＢＳ中３％脱脂乳溶液と混合し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用して、高ＣＤ３３結合親和性を有するＳｃＦｖまたはＶＨを提示するファージのクローンを同定した。上清を、９６ウェルプレート中で１ウェルあたり５０ｎｇのコーティングされた組換えヒトＣＤ３３とともに室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、（４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ中３％脱脂乳溶液でブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。）ＣＤ３３に結合したファージを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗Ｍ１３抗体を使用して検出した。抗体とともにインキュベートした後、ウェルを洗浄することにより、非特異的に結合した抗体を除去し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、４５０ｎｍでの溶液吸光度（Ａ４５０）を測定した。Ａ４５０が１．０を超える、ＣＤ３３に結合したクローンをさらなる特徴決定のために選択した。
ｂ）選択された可溶性ＳｃＦｖまたはＶＨの発現および精製
選択されたクローンのＶＨおよびＶＬ、ならびにドメインバインダーのＶＨをＤＮＡ配列決定し、独自の配列を有するクローンによりコードされるｓｃＦｖまたはＶＨを下記のように発現させ、精製した。これらのクローンから抽出されたプラスミドを、ＨＢ２１５１細胞の形質転換に使用した。新しく形質転換された細胞を含むプレートから単一コロニーを選び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．２％グルコースを含む２ＹＴ培地２００ｍｌに接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした。６００ｎｍでの培養物ＯＤが０．９０に到達すると、最終濃度０．５ｍＭでイソプロピル－β－ｄ－チオガラクトピラノシドを添加し、培養物を３０℃で一晩さらにインキュベートした。８，０００×ｇで２０分間遠心分離した後、細菌ペレットを収集し、０．５ｍＵポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。５０ｒｐｍで回転させながら室温で３０分間インキュベートした後、再懸濁したペレットを２５，０００×ｇで２５分間、４℃で遠心分離し、上清を、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を使用して供給業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＳｃＦｖ精製に使用した。
ｃ）ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈された組換えヒトＣＤ３３ ５０μｌを、９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。ＨｉｓおよびＦｌａｇタグを有する精製されたＳｃＦｖまたはＶＨ（上記より）を段階希釈し、標的タンパク質でコーティングされたウェルに添加した。洗浄後、１：３０００に希釈された、ＨＲＰとコンジュゲートされた抗Ｆｌａｇ抗体をＲＴで１時間添加した。洗浄後、３、３、５、５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、室温で１０分間インキュベートした後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、Ｏ．Ｄ．を４５０ｎｍで読み取って、ＳｃＦｖの、ＣＤ３３に結
合する相対的能力を定量化した。
結果：
ＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果に基づき、組換えヒトＣＤ３３に特異的な別々のＳｃＦｓクローン４種を同定し、それぞれヒト抗ＣＤ３３ ＳｃＦｖバインダーｍ１０３３－９（ＳｃＦｖ９）、ｍ１０３３－１０（ＳｃＦｖ１０）、ｍ１０３３－１２（ＳｃＦｖ１２）およびｍ１０３３－１５（ＳｃＦｖ１５）と標識した。２種の独自のＶＨドメインバインダーｍ１０３３－２（ＶＨ－２）およびｍ１０３３－４（ＶＨ－４）も、ＥＬＩＳＡ結合アッセイから同定した。ＶＨ－２、ＶＨ－４、ＳｃＦｖ９、ＳｃＦｖ１０、ＳｃＦｖ１２およびＳｃＦｖ１５ヒト抗ＣＤ３３バインダーを発現するキメラ抗原受容体の生成について、以下の実施例２で概説する。
実施例２
抗ＣＤ３３完全ヒト重鎖Ｉｇ単独ベースの、またはｓｃＦｖベースの結合性配列を発現するＣＡＲ
この実施例では、新規の完全ヒト免疫グロブリン重鎖単独、または単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）バインダー配列由来の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞について記載する。新規の抗ＣＤ３３ ＣＡＲＴ構築物は、初代ヒトＴ細胞における高レベルの発現、ならびにＣＤ３３陽性腫瘍細胞に対する特異的かつ強力な細胞傷害機能およびサイトカイン機能を実証した。
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＣＤ３３（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３、ＳＩＧＬＥＣ３、ＳＩＧＬＥＣ－３、ｇｐ６７、ｐ６７）は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する十分に研究された標的である。ＣＤ３３ヒト化抗体（リンツズマブ）およびＣＤ３３抗体－薬物コンジュゲート（ゲムツズマブオゾガマイシン、またはＧＯ、Ｐｆｉｚｅｒ）はある程度の有効性を示したが、臨床試験において強力な治療上の利益を実証しなかった（１．Ｆｅｌｄｍａｎ ＥＪら Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００５年；２３巻（１８号）：４１１０～４１１６頁、２．Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ ＳＨら Ｂｌｏｏｄ ２０１３年；１２１巻（２４号）：４８５４～４８６０頁）。ＡＭＧ３３０、ＣＤ３３－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導因子（ＢｉＴＥ）も研究中である（Ｋｒｕｐｋａ Ｃら Ｂｌｏｏｄ ２０１４年 １２３巻：３５６～３６５頁）。今年の時点で、ＧＯは変更された、はるかにより小さい用量で、かつ改訂されたレジメンで医院に再導入されたが、この薬剤の再評価のための十分な臨床データが蓄積される必要が未だある。現在開発中の別の薬剤、ＣＤ３３標的化抗体－薬物コンジュゲートバダスツキシマブタリリン（ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ）は、最近、肝毒性によりいくつかの第Ｉ／ＩＩ相試験に対する臨床差し止めを招いており（ワールドワイドウェブｉｎｖｅｓｔｏｒ．ｓｅａｔｔｌｅｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｈｏｅｎｉｘ．ｚｈｔｍｌ？ｃ＝１２４８６０＆ｐ＝ｉｒｏｌ－ｎｅｗｓＡｒｔｉｃｌｅ＆ＩＤ＝２２３２８８０で入手可能）、安全かつ有効なＣＤ３３標的化様式を同定する差し迫った必要性を強調している。
ＥＦ１ａプロモーターの制御下で、免疫グロブリンＶＨドメイン、または全長ＳｃＦｖのいずれかに由来するＣＤ３３結合性配列を使用してＣＤ３３ ＣＡＲを設計し、形質導入効率、死滅機能およびサイトカイン産生についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。
材料および方法：
（ａ）細胞株
ヒト細胞株前骨髄球性白血病ＨＬ－６０、急性リンパ性白血病Ｒｅｈ、単球性白血病ＴＨＰ－１、および骨髄性白血病Ｋ５６２細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。急性骨髄性白血病ＭＯＬＭ－１４株を、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。細胞株を、１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（ＡＴＣＣ）で培養した。ＴＨＰ－１培養培地は０．０５％ベータメルカプトエタノールも含んでいた。ＧＦＰ含有または不含の、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を野生型白血病株に安定に形質導入し、その後限界希釈してルシフェラーゼ陽性クローンを選択することで、ルシフェラーゼを発現するサブクローンを生成した。
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の創出－発現ベクター
ＣＡＲの抗原結合性ドメイン配列は、ヒト抗ＣＤ３３ ＳｃＦｖまたは重鎖可変断片に由来していた。バインダー配列をインフレームで、ＣＤ８ａ連結および膜貫通ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ Ｐ０１７３２、ａａ １３８－２０６）、次いで４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ａａ２１４－２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ Ｑ０７０１１）シグナル伝達ドメインならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ａａ５２－１６３、Ｒｅｆ配列ＩＤ：ＮＰ＿０００７２５．１）に連結することにより、ＣＡＲ Ｔ構築物を生成した。一部の構築物では、４－１ＢＢ共刺激配列ではなくＣＤ２８共刺激配列を使用した。一部の構築物では、ＣＤ８連結および／または膜貫通ドメインを、ＴＮＦＲＳＦ１９タンパク質由来のドメインで置換した。一部の配列では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入細胞のタグ化を可能にするため、かつｉｎ ｖｉｖｏでの適用における自殺スイッチとして、短縮された上皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）タグを２Ａペプチドを介してＣＡＲ構築物に組み込んだ。ＣＡＲ構築物配列を第３世代のレンチウイルスプラスミド骨格（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター（ＬＶ）を含む上清を生成し、レンチウイルスベクターを含む上清を遠心処理することによりベクターをペレットにして、－８０℃で保存した。
（ｃ）初代Ｔ細胞精製および形質導入
正常なドナー由来のヒト初代Ｔ細胞を、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を免疫磁性ビーズで選択した後にバフィーコートから精製し、密度０．３～２×１０６細胞／ｍｌで、４０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で活性化し、２日目に１０μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）存在下で一晩、ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、４日目に培地を交換した。３日目に、２００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地に培養物を移し、７～１０日目の採取まで繁殖させた。
（ｄ）免疫エフェクターアッセイ（ＣＴＬおよびサイトカイン）
細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞５，０００個を種々のエフェクター対標的比でＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせ、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を各ウェルに添加し、生じた発光を秒あたりのカウントとして定量化した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）および１％Ｔｗｅｅｎ－２０を加えた標的のみのウェル（最小ＣＰＳ）を使用してアッセイ範囲を決定した。特異的な溶解のパーセントを（１－（試料ＣＰＳ－最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ－最小ＣＰＳ））として算出した。Ｅ：Ｔ比１０：１の共培養物から上清を取り出し、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２濃度についてＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により分析した。
（ｅ）ＣＡＲ表面発現のフローサイトメトリー分析
細胞染色では、ＣＡＲ Ｔ形質導入細胞５０万個を培養物から採取し、０．５％ウシ血清アルブミンを添加した低温のＡｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で２回洗浄して、ＣＤ３３－Ｆｃペプチド（Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、その後抗Ｆｃ－ＡＦ６４７コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）での染色により、ＣＡＲ表面発現を検出した。陰性対照として非形質導入細胞を使用した。全ての研究で、死滅した細胞は７ＡＡＤ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により除外した。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーによる定量分析前に染色緩衝液２００μｌで再懸濁させた。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でフローサイトメトリー分析を実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用してデータプロットを生成した。
（ｆ）ＣＡＲ Ｔ機能のｉｎ ｖｉｖｏ分析
ＣＤ３３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の機能性をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。０日目に、６～８週齢のＮＳＧマウス、１群あたり６匹に１．０×１０６のＭＯＬＭ－１４ ＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞を接種した。４日目にＩＶＩＳ生物発光画像法により腫瘍負荷を決定し、研究５日目に等しい平均腫瘍負荷の群にマウスをランダム化して、５．０×１０６のＣＡＲ Ｔ＋細胞／マウスを投与した。１４、２１、２８および３５日目に、生物発光画像法により腫瘍退行を決定した。研究終了時にマウス生存について記録および分析した。ＣＡＲ Ｔおよび腫瘍細胞の存在を決定するため、研究１９日目に全ての動物から血液を収集した。フローサイトメトリーにより血液ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭＯＬＭ－１４腫瘍細胞の絶対数を決定し、ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカイン１２ヒトキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により、製造業者のプロトコールに従って血漿中の炎症性サイトカインレベルを測定した。
（ｇ）マウス血液中のＣＡＲ Ｔおよび腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーでは、血液５０μｌを収集し、ＣＡＲ ＴおよびＭＯＬＭ－１４腫瘍細胞の数について分析した。まず、赤血球をＲｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により製造業者の説明書に従って溶解させ、白血球をヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、および７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で染色してＭＡＣＳＱｉａｎｔ１０フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でデータ取得した。ＧＦＰレポーター遺伝子を安定に発現するＭＯＬＭ－１４細胞はＢ１チャンネルで検出した。７－ＡＡＤ陽性の死滅細胞は分析から除外した。血液中のヒトＴ細胞およびＭＯＬＭ－１４数の直接定量化を容易にするため、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）をデータ取得前に各試料に添加し、製造業者のプロトコールに従って、対応する細胞絶対数を算出した。
（ｈ）長期のＣＡＲ Ｔおよび腫瘍コインキュベーションアッセイ
５または１１日間、種々の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物および対照を発現するＣＡＲＴ細胞株を、腫瘍標的ＨＬ－６０細胞と５：１～０．０４：１の範囲のエフェクター対標的比で組み合わせた。陰性対照ＵＴＤ（非形質導入細胞）、Ｔ細胞単独（Ｅ：Ｔ １：０）およびＧＦＰ発現Ｔ細胞（１３９８）を含めた。各時点で、抗ヒトＣＤ３３およびＣＤ３抗体ならびに７－ＡＡＤで細胞を染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０フローサイトメーターでデータ取得した。各条件での生存ＣＡＲ Ｔ細胞および腫瘍細胞のパーセンテージを決定するため、前方散乱および側方散乱、シングレット、７－ＡＡＤ－、ＣＤ３＋またはＣＤ３３＋について細胞をゲーティングした。
結果：
新規の抗ＣＤ３３完全ヒトＳｃＦｖ結合性配列を評価するため、重鎖単独バインダー配列ＶＨ－２もしくはＶＨ－４、またはＳｃＦｖ配列ＳｃＦｖ９、ＳｃＦｖ１０、ＳｃＦｖ１２、もしくはＳｃＦｖ１５のうち各１つを腫瘍抗原結合性ドメインとして組み込んだＣＡＲ構築物を設計した。各ＣＡＲ設計では、腫瘍標的化ドメインの後に、ヒトＣＤ８タンパク質由来のリンカーおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメインならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが続いた（以下の表１）。配列Ｍｙ９６由来のＳｃＦｖ結合性ドメインを組み込んだ構築物ＬＴＧ１９４０を、参照対照または比較対象として使用した。
Figure 2022180404000002
抗ＣＤ３３キメラ抗原受容体が形質導入されたＴ細胞は、表面発現および細胞溶解活性を実証する。
ａ）抗ＣＤ３３ ＣＡＲの表面発現
新規の抗ＣＤ３３ ＣＡＲを評価するため、ヒトＥＦ１ａプロモーターの制御下で、ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を、材料および方法に記載されるように生成した。次いで、２人の別々の健康なドナー由来のヒト初代Ｔ細胞に、ＣＡＲをコードする４種のレンチウイルスベクターを形質導入した。同じドナー由来の非形質導入細胞（ＮＴ）または同じドナー由来のＧＦＰ形質導入細胞は、陰性対照として機能した。
培養０日目に、材料および方法に記載されるように、ＩＬ－２の存在下でＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ細胞試薬（ＣＤ３およびＣＤ２８抗原の活性な結合、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｉｎｃ．）でＴ細胞を活性化した。培養１０日目に、Ｔ細胞表面における抗ＣＤ３３ ＣＡＲの発現をＣＤ３３－Ｆｃペプチド、その後抗Ｆｃ－ＡＦ６４７により検出し、フローサイトメトリーにより分析した。抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物は、表面ＣＡＲ発現を実証した。
ｂ）抗ＣＤ３３ ＣＡＲの細胞溶解アッセイ
生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解機能を実証するため、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するＨＬ－６０－ｌｕｃ、ＭＯＬＭ－１４（ＣＤ３３高）、Ｒｅｈ－ｌｕｃおよびＫ５６２－ｌｕｃ（ＣＤ３３低）白血病株を使用して、ルシフェラーゼベースの死滅アッセイを実施した。ＣＡＲＴ細胞および標的細胞をエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比２０、１０および５で組み合わせ、一晩コインキュベートして、次いで材料および方法に記載されるように、発光により細胞死滅を評価した（図３図４；図６および図７）。ＶＨベースの抗ＣＤ３３ ＣＡＲを試験すると、ＣＡＲ Ｔ構築物ＬＴＧ１９０６が、ＣＤ３３高ＨＬ－６０－ｌｕｃ株に対してはＥ：Ｔ比依存性の強い細胞傷害性、より少ないＣＤ３３を発現するＫ５６２株では中程度の細胞溶解を示し、ＣＤ３３低Ｒｅｈ－ｌｕｃ株では弱い細胞溶解活性しか示さなかった。したがって、細胞溶解活性は白血病ごとのＣＤ３３発現レベルに直接関連していた。さらに、陰性対照ＧＦＰ構築物ＬＴＧ１３９８、およびＮＴ（同じドナー由来の非形質導入Ｔ細胞）は細胞溶解性でなく、細胞傷害性がＣＡＲＴ依存性であることを実証した。特に、ＬＴＧ１９０５ ＣＡＲ構築物はＨＬ－６０ｌｕｃ株では細胞溶解性でなく、Ｋ５６２－ｌｕｃ株では弱い細胞溶解性でしかなかった。
同様に、構築物ＬＴＧ１９０６は、ＣＤ３３が高度に陽性の腫瘍株ＴＨＰ－１およびＨＬ－６０に応答して高レベルのＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２を産生したが、低レベルのＣＤ３３抗原を発現する白血病株Ｋ５６２またはＲｅｈに曝露されると、ＣＡＲ Ｔから分泌されたサイトカインは低レベルのままであった（図５）。興味深いことに、構築物ＬＴＧ１９０５は、ＣＤ３３陽性ＨＬ－６０白血病の非効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの死滅にもかかわらず、ＥＬＩＳＡにより検出されたように非常に高レベルのＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２を産生した。したがって、一部のバインダーが可溶性ＩｇＧまたはＳｃＦｖ形式において活性で、ＣＡＲ Ｔ形式におけるＴ細胞表面での発現に適しているが、それにも関わらずＣＤ３３陽性腫瘍を死滅させることにおいては非効率的であることから、ＣＡＲ設計およびバインダー選択は些細なことではない。
比較すると、ＳｃＦｖ抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞を試験すると、構築物ＬＴＧ１９３６およびＬＴＧ１９３９がＣＤ３３高腫瘍株ＨＬ－６０およびＭＯＬＭ－１４に対して強力な死滅活性を実証し、一方で、活性はＣＤ３３低Ｒｅｈ腫瘍株に対してははるかにより小さく、ＣＤ３３低Ｋ５６２細胞に対しては実質的に検出不能であった（図７）。驚くべきことにかつ予想外に、ＣＡＲ構築物ＬＴＧ１９３７およびＬＴＧ１９３８は、ＣＤ３３陽性腫瘍標的を溶解させることにおいて非効率的であった。このことは、可溶性抗体の結合特性および／または溶解性および／または多量体化特性などがＣＡＲの機能性に直接つながるわけでないことから、抗体断片に基づくＣＡＲ Ｔ構築物設計が些細なことではないことを再度実証している。ＶＨ単独構築物１９０６と同様に、ｓｃＦｖベースの構築物１９３６、１９３９およびＭｙ９６ ｓｃＦｖベースの比較対象構築物１９４０は全て、高度にＣＤ３３＋の腫瘍株ＨＬ－６０およびＭＯＬＭ１４に曝露されると高レベルのＩＦＮガンマおよびＴＮＦアルファを産生したが、ＣＤ３３低株Ｒｅｈの存在下では、または標的株非存在下でＣＡＲＴ細胞が単独でインキュベートされた場合には、実質的にサイトカイン誘導を示さなかった。不十分なｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅機能を示したＣＡＲ構築物１９３７、１９３８は、腫瘍細胞に応答してのサイトカイン産生においても非効率的であった（データは示さない）。ＭＯＬＭ１４およびＨＬ６０によるサイトカイン誘導を比較すると、ＭＯＬＭ１４はより大きいＣＤ３３抗原密度（ＭＯＬＭ１４では細胞あたり３０，０００部位に対し、ＨＬ－６０では細胞あたり２５，０００部位、データは示さない）を示し、これは、試験を行った抗ＣＤ３３構築物全てについて、ＭＯＬＭ１４により惹起されたＩＦＮガンマおよびＴＮＦアルファの誘導がより大きいことに対応している。再度、このことは抗ＣＤ３３ ＣＡＲ活性化の抗原特異的な性質を実証している。予想外に、ＩＬ－２の誘導はＣＡＲ構築物１９０６および１９４０では強いが、ＣＡＲ構築物１９３６および１９３９では中度であった。
次いで、培養物中で、様々な構築物を組み込んだＣＡＲ Ｔ細胞を、ＨＬ－６０ ＣＤ３３＋腫瘍細胞と５：１～０．０４：１の範囲のＥ：Ｔ比で組み合わせることにより、長期のコインキュベーションアッセイを実施した。ＵＴＤ、非形質導入Ｔ細胞、１３９８、ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞、およびＥ：ｔ ０．１、Ｔ細胞単独をアッセイ対照として使用した。５日（データは示さない）または１１日のいずれかの間、細胞を共培養し、両方の日数で各ＣＡＲ構築物についてＨＬ－６０の排除における同様の傾向が実証された（図９）。陰性対照群、ＵＴＤおよび１３９８では腫瘍細胞が増殖してＴ細胞が消失し、細胞溶解活性およびＣＡＲ Ｔ生存の延長にはＣＡＲ媒介性のＴ細胞の刺激が必要であることが実証された。一晩のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは成績は良好ではなかったＣＡＲ構築物１３９８、１３９８は、この長期アッセイでもＨＬ－６０死滅において有効でなく、１：１以下のＥ：Ｔ比全てにおいて培養物からＣＡＲ Ｔ細胞が消失し腫瘍が持続し、陰性対照群と同様の成績であった。一方、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物１９０６、１９３６および１９３９は、ＣＴＬ機能において比較対象構築物１９４０と等しく強力であり、０．２：１と低いＥ：Ｔ比でＨＬ－６０腫瘍細胞の排除に成功した（図９）。したがって、構築物１９０６、１９３６、１９３９および１９４０を、ＡＭＬのｉｎ ｖｉｖｏモデルでのさらなる評価用に選択した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物の比較を容易にするため、材料および方法に記載されるように異種移植片マウスモデルを利用した。簡潔に言えば、０日目にホタルルシフェラーゼおよびＧＦＰを安定に発現するＭＯＬＭ－１４細胞をＮＳＧマウスに接種し、研究５日目にマウスあたりＣＡＲ Ｔ細胞５００万個を投与した。研究１４、２１、２８、３５日目に、ＩＶＩＳ生物発光画像法により腫瘍増殖動態を測定し、研究１９日目にマウス血液中でのＣＡＲ Ｔ機能を評価した。
図１０Ａに示すように、ＭＯＬＭ－１４腫瘍を移植され、未処置で放置されたマウス（ＴＡ）、または非形質導入Ｔ細胞対照を投与されたマウス（ＵＴＤ）は研究１４日目までに疾患で死亡した。ＣＡＲ構築物１９３６および１９３９は、部分的な有効性および腫瘍増殖の遅延および生存の延長を実証した。際立って、ＣＡＲ構築物１９０６および比較対象構築物１９４０はＭＯＭＬ－１４腫瘍拒絶を媒介し、これらの群の動物は全て、３９日目の研究終了時まで生存した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
各処置群についての血液中のＣＡＲ Ｔ細胞レベル、血液中のＭＯＬＭ－１４腫瘍細胞レベル、およびＣＡＲ Ｔから分泌された血液サイトカインレベルを評価するため、研究１９日目に各動物から血液を採取した。フローサイトメトリーにより血液試料中のＣＡＲＴおよび腫瘍細胞の絶対数を測定した（図１１Ａ、左パネル）。各群のＣＡＲ Ｔ細胞数には有意な差がなかったが、構築物１９０６を発現するＣＡＲ Ｔ細胞はその他の群より多い傾向があり、ＣＡＲ比較対象構築物１９４０がそれに続いた。興味深いことに、非形質導入Ｔ細胞から構成されるＵＴＤ対照群でも、おそらくはこの群に注入された細胞数が最初に多かったために（８．０×１０６細胞／マウス）Ｔ細胞レベルが高かった。特に、ＵＴＤ対照と比較して、全てのＣＡＲ Ｔ群で循環血液ＭＯＬＭ－１４腫瘍細胞数の統計的に有意な減少を本発明者らは検出した（図１１Ａ、右パネル）。さらに、ＣＡＲ Ｔ群を互いに比較すると、ＣＡＲ１９０６および１９４０が、ＣＡＲ１９３６および１９３９よりも有意に大きい最強のＭＯＬＭ－１４細胞減少を刺激した。したがって、ＣＡＲ１９０６および１９４０が、血液中のＭＯＬＭ－１４レベルを制御することにおいて最も効率的であり、ＣＡＲ１９３６およびＣＡＲ１９３９がそれに続いた。
測定可能なレベルの炎症性サイトカインＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮガンマおよびＩＬ－２が、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＵＴＤ対照を投薬されたマウスで検出された。これらのサイトカインのレベル間の差は有意でなかったが、構築物１９０６についての血漿ＧＭ－ＣＳＦお
よびＩＦＮガンマレベルはより高い傾向があり、一方でＩＬ－２レベルはＣＡＲ１９０６ならびにＣＡＲ構築物１９４０および１９３６で増大する傾向があった（図１１Ｂ）。これらの結果は、活性化されたＣＡＲ Ｔ細胞による炎症性サイトカインの上昇した分泌を強調する。おそらくは研究１９日目にＣＡＲ Ｔ細胞が既に最大の活性化を通過していた可能性があるため（注目すべきことに、早くも研究１４日には腫瘍負荷の差が検出されている、図１０Ａ）、実験群間で有意な差は検出されなかったが、腫瘍拒絶において最も有効であったＣＡＲ１９０６および１９４０が、より大きいレベルのサイトカインを分泌する傾向もあった。
要約すれば、新規の完全ヒト抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物ＬＴＧ１９０６の高い機能性、ならびに構築物ＬＴＧ１９３６およびＬＴＧ１９３９の部分的な機能性（以下の表２）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで実証された。構築物ＬＴＧ１９３６およびＬＴＧ１９３９の機能性が、これらが標的とする特定のエピトープに対しより良好に到達させるため、または腫瘍エピトープ結合に対するＣＡＲ応答レベルを増大させるため、ＣＡＲスペーサー、リンカーまたは共刺激ドメインの再設計によりさらに改善され得ることが想定できる。ＶＨベースの抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物ＬＴＧ１９０５は、フローサイトメトリーによる検出可能な表面発現および高いサイトカイン分泌にもかかわらず低い細胞溶解効果を有していた。ＳｃＦｖベースのＣＡＲ Ｔ構築物ＬＴＧ１９３７およびＬＴＧ１９３８も、高度に発現されるにもかかわらずｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞株を溶解させることにおいて非効率的であった。
実施例３
完全ヒト重鎖単独、またはＳｃＦｖベースの結合性配列を発現する抗ＣＤ３３ ＣＡＲの構造を変化させることにより、ＣＤ３３ ＣＡＲ部分の機能特性の改善が達成され得る
この実施例では、新規の完全ヒト免疫グロブリン重鎖単独またはｓｃＦｖバインダー配列由来の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞の様々な構造上の構成について記載する。
共刺激ドメインを欠くＣＤ３ゼータなどの活性化ドメイン（第１世代ＣＡＲ）とともに、単一のＣＤ２８由来、対、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ由来の共刺激ドメイン（第２世代ＣＡＲ）をＣＡＲ構造にインフレームで組み込むこと、または複数の共刺激ドメインを直列で（第３世代ＣＡＲ）組み込むことなどにより、ＣＡＲＴ細胞は、抗原を発現する腫瘍細胞に曝露されると、ＩＬ－２、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファなどの炎症性サイトカインをより大きいまたはより小さいレベルで分泌すると想定される。
一部の構築物では、ヒトＴＮＦＲＳＦ１９配列由来のドメインなどの新規のヒンジおよび膜貫通ドメインの組み込みにより、腫瘍細胞の死滅およびサイトカイン応答における増強された効力がＣＡＲに付与され得る。
さらに、ＣＤ８アルファ由来のリンカードメインを、種々の長さのＴＮＦＲＳＳＦ１９由来ドメイン、または免疫グロブリン定常領域および／もしくはヒンジ由来のドメイン、例えば免疫グロブリン分子のＣＨ２、および／またはＣＨ３、および／またはヒンジドメイン、またはそれらの改変を組み込んだＩｇＧ１由来のリンカードメインまたはＩｇＧ４由来のリンカードメインで置換することなどにより、ＣＡＲヒンジすなわちリンカードメインの長さおよび組成を変化させることで、腫瘍抗原がＣＡＲ結合性ドメインに対しより良好に到達できるようになる可能性がある。これは、ＣＡＲヒンジ／リンカードメインの適切な長さおよび柔軟性が、最適な到達しやすさ、腫瘍抗原への結合、およびＣＡＲ Ｔ細胞活性化に必要であることによるものである。
さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞表面で発現されるＣＡＲ構築物配列にタグ分子を組み込むと、１）製造中および臨床での適用における、フローサイトメトリーによるＣＡＲ Ｔ細胞の
同定に、２）製造中のＣＡＲ Ｔ細胞の選別／単離に、３）抗ＣＤ１９ ＣＡＲに応答してのＢ細胞形成不全、サイトカイン放出症候群、またはＣＡＲ関連神経毒性などのＣＡＲ関連毒性に備えての、患者の体からＣＡＲ Ｔ細胞を排除するための自殺タグとして、有用である。この目的のために、ＣＡＲ構築物配列は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ｅｒｂＢ－２、ＮＧＦＲ／ＬＮＧＦＲ／ＣＤ２７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはその他のタンパク質などのネイティブの膜貫通タンパク質の短縮されたエクトドメインおよび膜貫通部分を含んでいてもよい。これらのまたはその他の配列のミモトープも使用可能である。患者の循環からのタグ付きＣＡＲ Ｔ細胞の除去は、ＥＧＦＲ（セツキシマブ）、ＨＥＲ２（トラスツズマブ）、ＣＤ２０（リツキシマブ）またはその他のタンパク質を標的化する抗体などの、タグ反応性の臨床グレード抗体の投与により達成されるはずである。
上で言及されるＣＡＲ構成の選択された例を図１２Ａ～１２Ｆにそれぞれ示す。免疫グロブリンＶＨドメインＣＤ３３＿４由来のＣＤ３３結合性配列を使用して、示される抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築物を設計したが、ＳｃＦｖ形式でのバインダー配列も使用可能である。
材料および方法：
（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の創出－発現ベクター
ＣＡＲの抗原結合性ドメイン配列は、ヒト抗ＣＤ３３ ＳｃＦｖまたは重鎖可変断片に由来していた。バインダー配列をインフレームで、ＣＤ８ａ連結および膜貫通ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ Ｐ０１７３２、ａａ １３８－２０６）、次いで４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ａａ２１４－２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ Ｑ０７０１１）シグナル伝達ドメインならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ａａ５２－１６３、Ｒｅｆ配列ＩＤ：ＮＰ＿０００７２５．１）に連結することにより、ＣＡＲ Ｔ構築物を生成した。一部の構築物では、４－１ＢＢ共刺激配列ではなくＣＤ２８共刺激配列（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１０７４７、膜貫通ドメイン、ａａ１５３－１７９）を使用した。一部の構築物では、ＣＤ８連結および／または膜貫通ドメインを、ＴＮＦＲＳＦ１９タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９ＮＳ６８）由来の種々の長さのドメインで置換した。一部の配列では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入細胞のタグ化を可能にするため、かつｉｎ ｖｉｖｏでの適用における自殺スイッチとして、短縮された上皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）タグ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ００５３３、種々の配列）を２Ａペプチドを介してＣＡＲ構築物に組み込んだ。ＣＡＲ構築物配列を第３世代レンチウイルスプラスミド骨格（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にクローニングした。レンチウイルスベクター（ＬＶ）を含む上清を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより生成し、レンチウイルスベクターを含む上清の遠心処理によりベクターをペレットにし、－８０℃で保存した。
Figure 2022180404000003
本文中に引用したそれぞれの出願と特許、および（訴訟中のそれぞれの交付済特許、「出願引用文書」を含めた）それぞれの出願と特許中で引用されたそれぞれの文書または参照文献、およびこれらの出願と特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張するそれぞれのＰＣＴと外国出願または特許、およびそれぞれの出願引用文書中で引用もしくは参照されたそれぞれの文書は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施する際に利用することができる。より一般的には、文書または参照文献は本文中、特許請求の範囲の前の参照文献一覧中、または本文自体中のいずれかに引用され、それぞれのこれらの文書または参照文献（「本明細書中引用参照文献」）、および（任意の製造者の仕様書、説明書などを含めた）それぞれの本明細書中引用参照文献中に引用されたそれぞれの文書または参照文献は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれる。
一部の具体的実施形態の前述の記載によって、他者が、本発明の知識を適用することによって、一般的概念から逸脱せずに、具体的実施形態などの様々な適用例に関して容易に変更または適合させることができるのに充分な情報を与え、したがってこのような適合および変更形態は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内と理解すべきであり、理解することが意図されている。本明細書で利用する語句または述語は、限定の目的ではな
く記載の目的であることは理解される。図面および記載中、例示的実施形態を開示しており、特異的用語が利用された可能性はあるが、他に言及しない限り、それらは限定の目的ではなく一般的および叙述的な意味でのみ使用され、したがって特許請求の範囲もそのように限定されない。さらに当業者は、本明細書で論じた方法の、ある特定ステップは別の順序で順に並べることができ、またはステップを組み合わせることができることを理解する。したがって、添付の特許請求の範囲は本明細書で開示した詳細な実施形態に限られないことが意図される。当業者は、ごく普通の実験を使用した、本明細書に記載した本発明の実施形態の多くの均等物を理解し、把握することができる。このような均等物は以下の特許請求の範囲によって包含される。
配列表への参照
本出願は、タイトル「配列表」のＰＤＦファイルにより、アメリカ合衆国特許商標庁に電子的に提出された配列表を含む。配列表は参照により組み込まれる。
本開示の配列
以下に列挙する核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で規定されるように、ヌクレオチド塩基用の標準的な略語、およびアミノ酸用の３文字コードを使用して示される。各核酸配列のうち一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示される鎖を参照することによって含まれるものと理解される。添付の配列表では：
配列番号１ ＣＤ３３反応性免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ－２）のヌクレオチド配列
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgagctgggtccgccaggctccaaggaagggcctggagtggattggggaaatcaatcatagtggaagcaccaactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacagccacgtattactgtgcgagacccctcaactactactactactacatggacgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctca
配列番号２ ＣＤ３３反応性免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ－２）のアミノ酸配列
E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y G M S W V R Q A P R K G L E W I G E I N H S G S T N Y N P S L K S R V T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A T Y Y C A R P L N Y Y Y Y Y M D V W G K G T T V T V S S
配列番号３ ＣＤ３３反応性免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ－４）のヌクレオチド配列
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgagctgggtccgccaggctccaagacaagggcttgagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaatactatgcggactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacagccacgtattactgtgcgaaagaaaatgtggactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctca
配列番号４ ＣＤ３３反応性免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ－４）のアミノ酸配列
E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y G M S W V R Q A P R Q G L E W V A N I K Q D G S E K Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A T Y Y C A K E N V D W G Q G T L V T V S S
配列番号５ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ９結合性ドメインのヌクレオチド配列
caggtgcagctggtgcaatctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaggatctcctgtaagggttctggattcagttttcccacctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagactagttggagatggctacaatacgggggcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggaggtggcgggtctggtggtggcggtagcggtggtggcggatccgatattgtgatgacccacactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgc
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配列番号６ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ９結合性ドメインのアミノ酸配列
Q V Q L V Q S G A E V K K P G E S L R I S C K G S G F S F P T Y W I G W V R Q M P G K G L E W M G I I Y P G D S D T R Y S P S F Q G Q V T I S A D K S I S T A Y L Q
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配列番号７ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ１０結合性ドメインのヌクレオチド配列
caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacactgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtat aatgattatgcagtccctgtgaaaagtcgaataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagagaaacgtattactatggttcggggagttattgggatgcttttgatatctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggtggcgggtctggtagtggcggtagcggtggtggcggatcccagtctgtcgtgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgtatcctggtaccagcagctcccaggcacggcccccaaactcttcatctataaaaataatcagcggccctcagaggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgacgatgaggctgactactactgtgcagcatgggatgacaggctgaatggatatgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtccta
配列番号８ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ１０結合性ドメインのアミノ酸配列
Q V Q L Q Q S G P G L V K P S Q T L S L T C A I S G D S V S S N T A A W N W I R Q S P S R G L E W L G R T Y Y R S K W Y N D Y A V P V K S R I T I N P D T S K N Q F
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配列番号９ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ１２結合性ドメインのヌクレオチド配列
caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggagggacatactacaggtccaagtggtataatgattatgcagtatctgtgaaaagtcgaataattatcaacgcagacacatcgaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaggggatattactatgatagtaccgactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggaggtggcgggtctggtggtggcggtagcggtggtggcggatcctcttctgagctgactcaggacccaactgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagaagctattatgcaagctggtaccagcagaagccaggacaggcccctgtacttgtcatctatggtaaaaacaaccggccctcagggatcccagaccgattctctggctccagctcaggaaacacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaagatgaggctgactattactgttcctcccgggacggcagtggtcatccatatctcttcggacctgggaccaaggtcaccgttctt
配列番号１０ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ１２結合性ドメインのアミノ酸配列
Q V Q L Q Q S G P G L V K P S Q T L S L T C A I S G D
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配列番号１１ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ１５結合性ドメインのヌクレオチド配列
gaggtccagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagactgactacggctgggggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggtggcgggtctggtggtggcggtagcggtggtggcggatccgaaattgtgctgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcaaagcctcgtacacagtgatggaaacacctacttgagttggcttcaccagaggccaggccagcctccaagactcctaatgtataagatttctaaccggttctctggggtcacagacagattcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaaggtatacacctaccgctcactttcggcggagggaccAagctggagatcaaa
配列番号１２ ＣＤ３３反応性ＳｃＦｖ１５結合性ドメインのアミノ酸配列
E V Q L V Q S G A E V K K P G E S L K I S C K G S G Y S F T S Y W I G W V R Q M P G K G L E W M G I I Y P G D S D T R Y S P S F Q G Q V T I S A D K S I S T A Y L Q W S S L K A S D T A M Y Y C A R L T T A G G M D V W G Q G T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S E I V L T Q S P L S L P V T L G Q P A S I S C R S S Q S L V H S D G N T Y L S W L H Q R P G Q P P R L L M Y K I S N R F S G V T D R F S G S G S G T D F T L K I S R V E A E D V G V Y Y C M Q G I H L P L T F G G G T K L E I K
配列番号１３ リーダー／シグナルペプチド配列のヌクレオチド配列
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccg
配列番号１４ リーダー／シグナルペプチド配列のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号１５ ＬＴＧ１９０５＿（ＥＦ１ａ－ ＶＨ－２ ＣＤ３３－ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAGACCCCTCAACTACTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号１６ ＬＴＧ１９０５＿（ＥＦ１ａ－ ＶＨ－２ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARPLNYYYYYMDVWGKGTTVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１７ ＬＴＧ１９０６（ＥＦ１ａ－ ＶＨ－４ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）核酸配列のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号１８ ＬＴＧ１９０６（ＥＦ１ａ－ＶＨ－４ ＣＤ３３ －ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１９ ＬＴＧ１９３６＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ９ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータＣＡＲ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATTCAGTTTTCCCACCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTAGTTGGAGATGGCTACAATACGGGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGCGGATCCGATATTGTGATGACCCACACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGAAAGACCTATTTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCACAGCTCCTGATCTATGGAGCTTCCAACCGGTTCTCTGGAGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAAGTATACAGCTTCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号２０ ＬＴＧ１９３６＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ９ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－
４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFSFPTYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLVGDGYNTGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTHTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYGASNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSIQLPITFGQGTRLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２１ ＬＴＧ１９３７＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ１０ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータＣＡＲ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACACTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTCCCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGAAACGTATTACTATGGTTCGGGGAGTTATTGGGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTAGTGGCGGTAGCGGTGGTGGCGGATCCCAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGCACGGCCCCCAAACTCTTCATCTATAAAAATAATCAGCGGCCCTCAGAGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGACGATGAGGCTGACTACTACTGTGCAGCATGGGATGACAGGCTGAATGGATATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号２２ ＬＴＧ１９３７＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ１０ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNTAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVPVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARETYYYGSGSYWDAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGSGGSGGGGSQSVVTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLFIYKNNQRPSEVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSDDEADYYCAAWDDRLNGYVFGTGTKVTVLAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２３ ＬＴＧ１９３８＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ１２ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAGGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAATTATCAACGCAGACACATCGAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGATATTACTATGATAGTACCGACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCAACTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTTCCTCCCGGGACGGCAGTGGTCATCCATATCTCTTCGGACCTGGGACCAAGGTCAC
CGTTCTTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号２４ ＬＴＧ１９３８＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ１２ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGGTYYRSKWYNDYAVSVKSRIIINADTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGYYYDSTDWFDPWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPTVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCSSRDGSGHPYLFGPGTKVTVLAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２５ ＬＴＧ１９３９＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ１５ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTGACTACGGCTGGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGCGGATCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATGGAAACACCTACTTGAGTTGGCTTCACCAGAGGCCAGGCCAGCCTCCAAGACTCCTAATGTATAAGATTTCTAACCGGTTCTCTGGGGTCACAGACAGATTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTATACACCTACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号２６ ＬＴＧ１９３９＿（ＥＦ１ａ＿ＳｃＦｖ１５ ＣＤ３３ ＣＤ８ ＴＭ－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLTTAGGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLHQRPGQPPRLLMYKISNRFSGVTDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGIHLPLTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２７ ＤＮＡ ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gc
配列番号２８ ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
配列番号２９ ＤＮＡ ＣＤ８ヒンジドメインのヌクレオチド配列
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg
gacttcgcct gtgat
配列番号３０ ＣＤ８ヒンジドメインのアミノ酸配列
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
配列番号３１ ＣＤ８．アルファ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１７５９．３）のアミノ酸番号１１８～１７８ヒンジ領域のアミノ酸配列
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
配列番号３２ ヒトＩｇＧ ＣＬ配列のアミノ酸配列
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
配列番号３３ ４－１ＢＢのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt
gaactg
配列番号３４ ４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
配列番号３５ ＣＤ３－ゼータのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc
配列番号３６ ＣＤ３ゼータのアミノ酸配列
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号３７ Ｓｃｖｆ ｃｄ１９のヌクレオチド配列
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcaccatcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctac
cat acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca
ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca
配列番号３８ ＳｃｖＦ ｃｄ１９のアミノ酸配列
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号３９ ＧＭＣＳＦリーダーペプチドのヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTG
ATTCCG
配列番号４０ ＧＭＣＳＦリーダーペプチドのアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号４１ ＴＮＦＲＳＦ１９リーダーペプチドのヌクレオチド配列
GGCTCTGAAAGTGCTGTTGGAACAAGAAAAGACCTTCTTCACCTTGCTCGTGTTGCTGGG
GTACCTGTCCTGCAAAGTCACCTGT
配列番号４２ ＴＮＦＲＳＦ１９リーダーペプチドのアミノ酸配列
MALKVLLEQEKTFFTLLVLLGYLSCKVTC
配列番号４３ ＣＤ８アルファリーダーペプチドのヌクレオチド配列
atggcgctgccggtgaccgcgctgctgctgccgctggcgctgctgctgcatgcggcgcgc
ccg
配列番号４４ ＣＤ８アルファリーダーペプチドのアミノ酸配列
MALPVTALLLPLALLLHAARP
配列番号４５ ＣＤ２８共刺激ドメインのヌクレオチド配列
CGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGG TCC
配列番号４６ ＣＤ２８共刺激ドメインのアミノ酸配列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号４７ ＣＤ３ゼータ活性化ドメインのヌクレオチド配列
AGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号４８ ＣＤ３ゼータ活性化ドメインのアミノ酸配列
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER
RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４９ ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジおよび膜貫通ドメインのヌクレオチド配列（膜貫通ドメインに下線を引いた）
GCGGCCGCGGTCGGATTCCAAGACATGGAATGCGTGCCCTGCGGCGACCCGCCACCTCCT
TACGAGCCGCACTGCGCATCGAAGGTCAACCTCGTGAAGATCGCGAGCACCGCGTCCTCA
CCCCGGGATACTGCTCTG GCCGCCGTGATTTGTTCCGCCTTGGCCACCGTGCTTCTGGCC
CTGCTGATCCTCTGTGTGATC
配列番号５０ ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列（膜貫通ドメインに下線を引いた）
A A A V G F Q D M E C V P C G D P P P P Y E P H C A S K V N L V K I A S T A S S
P R D T A L A A V I C S A L A T V L L A L L I L C V I
配列番号５１ ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインのヌクレオチド配列
GCCGCCGTGATTTGTTCCGCCTTGGCCACCGTGCTTCTGGCCCTGCTGATCCTCTGTGTG
ATC
配列番号５２ ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインのアミノ酸配列
A A V I C S A L A T V L L A L L I L C V I
配列番号５３ ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジドメインのヌクレオチド配列
GCGGCCGCGGTCGGATTCCAAGACATGGAATGCGTGCCCTGCGGCGACCCGCCACCTCCT
TACGAGCCGCACTGCGCATCGAAGGTCAACCTCGTGAAGATCGCGAGCACCGCGTCCTCA
CCCCGGGATACTGCTCTG
配列番号５４ ＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジドメインのアミノ酸配列
A A A V G F Q D M E C V P C G D P P P P Y E P H C A S K V N L V K I A S T A S S P R D T A L
配列番号５５ 短縮されたＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジドメインのヌクレオチド配列
TACGAGCCTCACTGCGCCAGCAAAGTCAACTTGGTGAAGATCGCGAGCACTGCCTCGTCC
CCTCGGGACACTGCTCTGGC
配列番号５６ 短縮されたＴＮＦＲＳＦ１９ヒンジドメインのアミノ酸配列
Y E P H C A S K V N L V K I A S T A S S P R D T A L
配列番号５７ ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに融合されたＣＤ８ａヒンジドメインのヌクレオチド配列（膜貫通配列に下線を引いた）
GCGGCCGCGCCCGCCCCTCGGCCCCCGACTCCTGCCCCGACGATCGCTTCCCAACCTCTC
TCGCTGCGCCCGGAAGCATGCCGGCCCGCCGCCGGTGGCGCTGTCCACACTCGCGGACTG
GACTTTGATACCGCACTG GCGGCCGTGATCTGTAGCGCCCTGGCCACCGTGCTGCTGGCG
CTGCTCATCCTTTGCGTGATCTACTGCAAGCGGCAGCCTAGG
配列番号５８ ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインに融合されたＣＤ８ａヒンジドメインのアミノ酸配列（膜貫通配列に下線を引いた）
A A A P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F D T A L A A V I C S A L A T V L L A L L I L C V I Y C K R Q P R
配列番号５９ ＣＤ２８共刺激ドメインのヌクレオチド配列
CGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCC
GGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGG
TCC
配列番号６０ ＣＤ２８共刺激ドメインのアミノ酸配列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号６１ ＣＤ３ゼータバージョン２のヌクレオチド配列
cgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctg
tataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggc
cgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataac
gaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgc
cgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacc
tatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc
配列番号６２ ＣＤ３ゼータバージョン２のアミノ酸配列
R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G
R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P R R K N P
Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R
配列番号６３ フューリンＰ２Ａフューリンのヌクレオチド配列
CGCGCGAAACGCAGCGGCAGCGGCGCGACCAACTTTAGCCTGCTGAAACAGGCGGGCGAT GTGGAAGAAAACCCGGGCCCGCGAGCAAAGAGG
配列番号６４ フューリンＰ２Ａフューリンのアミノ酸配列（フューリン配列に下線を引いた）
RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRAKR
配列番号６５ フューリンＴ２Ａのヌクレオチド配列
AGAGCTAAACGCTCTGGGTCTGGTGAAGGACGAGGTAGCCTTCTTACGTGCGGAGACGTGGAGGAAAACCCAGGACCC
配列番号６６ フューリンＴ２Ａのアミノ酸配列（フューリン配列に下線を引いた）
RAKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
配列番号６７ 短縮されたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）タグのヌクレオチド配列
AGGAAGGTTTGCAATGGAATCGGTATAGGGGAGTTTAAGGATTCACTTAGCATAAACGCT
ACTAATATTAAACACTTCAAAAACTGTACGAGTATAAGTGGAGATCTTCACATTTTGCCG
GTTGCATTCCGAGGCGATTCATTCACCCACACGCCACCGCTTGACCCACAAGAATTGGAT
ATTCTTAAAACCGTTAAAGAAATAACGGGGTTTTTGCTCATTCAAGCGTGGCCAGAAAAT
CGCACTGACCTCCATGCTTTCGAGAACCTGGAGATTATAAGAGGACGAACTAAGCAGCAT
GGTCAATTCTCCCTTGCTGTGGTCAGCCTGAACATCACCAGTCTTGGTTTGCGGTCCCTC
AAGGAAATTTCAGATGGAGATGTCATCATAAGCGGCAACAAGAATTTGTGCTATGCAAAT
ACCATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGCACTTCCGGCCAGAAAACCAAGATTATTTCAAAT
CGGGGTGAGAACAGCTGCAAAGCCACCGGCCAGGTTTGTCATGCCTTGTGCTCTCCGGAA
GGCTGTTGGGGGCCAGAACCCAGGGACTGCGTCAGTTGCAGAAACGTCTCAAGAGGCCGC
GAATGCGTTGACAAGTGTAACCTCCTTGAGGGTGAGCCACGAGAGTTTGTTGAGAACAGC
GAGTGTATACAATGTCACCCTGAATGTTTGCCCCAGGCTATGAATATAACCTGCACAGGC
CGCGGGCCTGATAACTGCATCCAGTGTGCTCATTACATAGATGGACCTCACTGTGTGAAA
ACCTGCCCGGCCGGAGTTATGGGAGAAAACAACACTCTGGTGTGGAAATACGCTGATGCA
GGCCACGTGTGCCACCTTTGTCACCCGAATTGTACATATGGGTGTACCGGTCCTGGACTT
GAAGGTTGCCCTACCAATGGCCCTAAAATACCCAGTATCGCAACTGGCATGGTAGGCGCT
CTTCTCTTGCTCTTGGTAGTTGCTCTCGGCATAGGTCTTTTTATG
配列番号６８ 短縮されたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）タグのアミノ酸配列
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELD
ILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSL
KEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPE
GCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTG
RGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGL
EGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
配列番号６９ ＬＴＧ１９２７（ＥＦ１ａ－ＣＤ３３＿４－ＣＤ８ ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ－ｃｆｒａｇ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTG
ATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGC
CAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAA
TACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG
CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAA
GAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCGACTACC
ACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTG
CGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTC
GCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCT
CTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATG
AACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCT
CGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCC
TACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATAT
GACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAG
AACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCC
GAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGC
CTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号７０ ＬＴＧ１９２７（ＥＦ１ａ－ＣＤ３３＿４－ＣＤ８ ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ－ｃｆｒａｇ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVR
QAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAK
ENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDF
ACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP
RDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK
NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７１ ＬＴＧ＿Ｄ００３３（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿ＣＤ２８ｚ）ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTG
ATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGC
CAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAA
TACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG
CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAA
GAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGTCGGA
TTCCAAGACATGGAATGCGTGCCCTGCGGCGACCCGCCACCTCCTTACGAGCCGCACTGC
GCATCGAAGGTCAACCTCGTGAAGATCGCGAGCACCGCGTCCTCACCCCGGGATACTGCT
CTGGCCGCCGTGATTTGTTCCGCCTTGGCCACCGTGCTTCTGGCCCTGCTGATCCTCTGT
GTGATCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGA
AGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCA
TACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAG
AACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAA
CGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGC
CTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAG
GGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACT
AAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号７２ ＬＴＧ＿Ｄ００３３（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿ＣＤ２８ｚ）ヌクレオチド配列のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVR
QAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAK
ENVDWGQGTLVTVSSAAAVGFQDMECVPCGDPPPPYEPHCASKVNLVKIASTASSPRDTA
LAAVICSALATVLLALLILCVIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAA
YRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG
LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７３ ＬＴＧ＿Ｄ００３４（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿４－１ＢＢｚ）ヌクレオチドのヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTG
ATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGC
CAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAA
TACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG
CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAA
GAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGTCGGA
TTCCAAGACATGGAATGCGTGCCCTGCGGCGACCCGCCACCTCCTTACGAGCCGCACTGC
GCATCGAAGGTCAACCTCGTGAAGATCGCGAGCACCGCGTCCTCACCCCGGGATACTGCT
CTGGCCGCCGTGATTTGTTCCGCCTTGGCCACCGTGCTTCTGGCCCTGCTGATCCTCTGT
GTGATCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCC
GTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGG
GGATGCGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGA
CAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGAC
AAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAG
GGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATG
AAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCC
ACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号７４ ＬＴＧ＿Ｄ００３４（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＴＮＦＲＳＦ１９ Ｈ＿ＴＭ＿４－１ＢＢｚ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVR
QAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAK
ENVDWGQGTLVTVSSAAAVGFQDMECVPCGDPPPPYEPHCASKVNLVKIASTASSPRDTA
LAAVICSALATVLLALLILCVIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEG
GCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE
GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７５ ＬＴＧ＿Ｄ００１５（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ＢＢｚ
Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTG
ATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGC
CAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAA
TACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG
CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAA
GAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACC
ACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTG
CGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTT
GCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCG
CTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAG
CCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCT
GAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCC
GCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAG
TACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGG
AAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTAC
TCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAG
GGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCC
CGGTCTAGAGCTAAACGCTCTGGGTCTGGTGAAGGACGAGGTAGCCTTCTTACGTGCGGA
GACGTGGAGGAAAACCCAGGACCCCGAGCCAAACGAATGCTGCTGCTTGTTACAAGCCTT
TTGCTCTGCGAACTCCCCCATCCAGCTTTTCTCCTGATTCCAAGGAAGGTTTGCAATGGA
ATCGGTATAGGGGAGTTTAAGGATTCACTTAGCATAAACGCTACTAATATTAAACACTTC
AAAAACTGTACGAGTATAAGTGGAGATCTTCACATTTTGCCGGTTGCATTCCGAGGCGAT
TCATTCACCCACACGCCACCGCTTGACCCACAAGAATTGGATATTCTTAAAACCGTTAAA
GAAATAACGGGGTTTTTGCTCATTCAAGCGTGGCCAGAAAATCGCACTGACCTCCATGCT
TTCGAGAACCTGGAGATTATAAGAGGACGAACTAAGCAGCATGGTCAATTCTCCCTTGCT
GTGGTCAGCCTGAACATCACCAGTCTTGGTTTGCGGTCCCTCAAGGAAATTTCAGATGGA
GATGTCATCATAAGCGGCAACAAGAATTTGTGCTATGCAAATACCATAAACTGGAAAAAA
CTGTTTGGCACTTCCGGCCAGAAAACCAAGATTATTTCAAATCGGGGTGAGAACAGCTGC
AAAGCCACCGGCCAGGTTTGTCATGCCTTGTGCTCTCCGGAAGGCTGTTGGGGGCCAGAA
CCCAGGGACTGCGTCAGTTGCAGAAACGTCTCAAGAGGCCGCGAATGCGTTGACAAGTGT
AACCTCCTTGAGGGTGAGCCACGAGAGTTTGTTGAGAACAGCGAGTGTATACAATGTCAC
CCTGAATGTTTGCCCCAGGCTATGAATATAACCTGCACAGGCCGCGGGCCTGATAACTGC
ATCCAGTGTGCTCATTACATAGATGGACCTCACTGTGTGAAAACCTGCCCGGCCGGAGTT
ATGGGAGAAAACAACACTCTGGTGTGGAAATACGCTGATGCAGGCCACGTGTGCCACCTT
TGTCACCCGAATTGTACATATGGGTGTACCGGTCCTGGACTTGAAGGTTGCCCTACCAAT
GGCCCTAAAATACCCAGTATCGCAACTGGCATGGTAGGCGCTCTTCTCTTGCTCTTGGTA
GTTGCTCTCGGCATAGGTCTTTTTATG
配列番号７６ ＬＴＧ＿Ｄ００１５（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ＢＢｚ
Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVR
QAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAK
ENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDF
ACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP
EEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR
KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
RSRAKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPRAKRMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNG
IGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVK
EITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDG
DVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPE
PRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNC
IQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTN
GPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
配列番号７７ ＬＴＧ＿Ｄ００１６（Ｅｆ１ａ ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ２８ｚ
Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTG
ATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGC
CAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAA
TACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG
CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAA
GAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCGACTACC
ACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTG
CGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTC
GCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCT
CTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATG
AACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCT
CGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCC
TACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATAT
GACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAG
AACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCC
GAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGC
CTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
AGAGCTAAACGCTCTGGGTCTGGTGAAGGACGAGGTAGCCTTCTTACGTGCGGAGACGTG
GAGGAAAACCCAGGACCCCGAGCCAAACGAATGCTGCTGCTTGTTACAAGCCTTTTGCTC
TGCGAACTCCCCCATCCAGCTTTTCTCCTGATTCCAAGGAAGGTTTGCAATGGAATCGGT
ATAGGGGAGTTTAAGGATTCACTTAGCATAAACGCTACTAATATTAAACACTTCAAAAAC
TGTACGAGTATAAGTGGAGATCTTCACATTTTGCCGGTTGCATTCCGAGGCGATTCATTC
ACCCACACGCCACCGCTTGACCCACAAGAATTGGATATTCTTAAAACCGTTAAAGAAATA
ACGGGGTTTTTGCTCATTCAAGCGTGGCCAGAAAATCGCACTGACCTCCATGCTTTCGAG
AACCTGGAGATTATAAGAGGACGAACTAAGCAGCATGGTCAATTCTCCCTTGCTGTGGTC
AGCCTGAACATCACCAGTCTTGGTTTGCGGTCCCTCAAGGAAATTTCAGATGGAGATGTC
ATCATAAGCGGCAACAAGAATTTGTGCTATGCAAATACCATAAACTGGAAAAAACTGTTT
GGCACTTCCGGCCAGAAAACCAAGATTATTTCAAATCGGGGTGAGAACAGCTGCAAAGCC
ACCGGCCAGGTTTGTCATGCCTTGTGCTCTCCGGAAGGCTGTTGGGGGCCAGAACCCAGG
GACTGCGTCAGTTGCAGAAACGTCTCAAGAGGCCGCGAATGCGTTGACAAGTGTAACCTC
CTTGAGGGTGAGCCACGAGAGTTTGTTGAGAACAGCGAGTGTATACAATGTCACCCTGAA
TGTTTGCCCCAGGCTATGAATATAACCTGCACAGGCCGCGGGCCTGATAACTGCATCCAG
TGTGCTCATTACATAGATGGACCTCACTGTGTGAAAACCTGCCCGGCCGGAGTTATGGGA
GAAAACAACACTCTGGTGTGGAAATACGCTGATGCAGGCCACGTGTGCCACCTTTGTCAC
CCGAATTGTACATATGGGTGTACCGGTCCTGGACTTGAAGGTTGCCCTACCAATGGCCCT
AAAATACCCAGTATCGCAACTGGCATGGTAGGCGCTCTTCTCTTGCTCTTGGTAGTTGCT
CTCGGCATAGGTCTTTTTATG
配列番号７８ ＬＴＧ＿Ｄ００１６（Ｅｆ１ａ ＣＤ３３＿４ ＶＨ ＣＤ８ ２８ｚ
Ｔ２Ａ ｔＥＧＦＲ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVR
QAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAK
ENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDF
ACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPP
RDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK
NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
RAKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPRAKRMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIG
IGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEI
TGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDV
IISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPR
DCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQ
CAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGP
KIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
配列番号７９ ヒトＩｇＧ４ヒンジのヌクレオチド配列
GAGAGCAAATACGGGCCGCCATGTCCCCCGTGTCCG
配列番号８０ ヒトＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列
ESKYGPPCPPCP
配列番号８１ ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのヌクレオチド配列
GCACCACCAGTTGCTGGCCCTAGTGTCTTCTTGTTCCCTCCCAAGCCCAAAGACACCTTG
ATGATTTCCAGAACTCCTGAGGTTACCTGCGTTGTCGTAGATGTTTCTCAGGAGGACCCA
GAGGTCCAATTTAACTGGTACGTTGATGGGGTGGAAGTTCACAATGCGAAGACAAAGCCG
CGGGAAGAACAATTTCAGTCCACTTACCGGGTTGTCAGCGTTCTGACGGTATTGCATCAA
GACTGGCTTAATGGAAAGGAATATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAAGGTTTGCCGAGCAGT
ATTGAGAAGACCATATCAAAGGCGAAG
配列番号８２ ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA K
配列番号８３ ヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列
GGGCAGCCGCGCGAGCCACAAGTTTACACTTTGCCGCCATCTCAAGAGGAAATGACTAAA
AACCAGGTATCCTTGACATGCCTCGTAAAAGGATTTTATCCATCTGATATTGCTGTGGAA
TGGGAGTCTAACGGGCAGCCGGAAAATAATTACAAAACTACACCACCTGTGCTCGATTCA
GATGGAAGTTTCTTCCTTTACAGTAGACTTACGGTGGACAAATCTAGGTGGCAGGAAGGG
AATGTGTTTAGTTGTAGTGTAATGCACGAGGCACTTCATAACCACTATACACAGAAGTCA
CTGAGTTTGAGTCTTGGCAAA
配列番号８４ ヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号８５ ヒトＩｇＧ４ヒンジＣＨ２ ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列
GAGAGCAAATACGGGCCGCCATGTCCCCCGTGTCCGGCACCACCAGTTGCTGGCCCTAGT
GTCTTCTTGTTCCCTCCCAAGCCCAAAGACACCTTGATGATTTCCAGAACTCCTGAGGTT
ACCTGCGTTGTCGTAGATGTTTCTCAGGAGGACCCAGAGGTCCAATTTAACTGGTACGTT
GATGGGGTGGAAGTTCACAATGCGAAGACAAAGCCGCGGGAAGAACAATTTCAGTCCACT
TACCGGGTTGTCAGCGTTCTGACGGTATTGCATCAAGACTGGCTTAATGGAAAGGAATAT
AAGTGTAAGGTGTCCAACAAAGGTTTGCCGAGCAGTATTGAGAAGACCATATCAAAGGCG
AAGGGGCAGCCGCGCGAGCCACAAGTTTACACTTTGCCGCCATCTCAAGAGGAAATGACT
AAAAACCAGGTATCCTTGACATGCCTCGTAAAAGGATTTTATCCATCTGATATTGCTGTG
GAATGGGAGTCTAACGGGCAGCCGGAAAATAATTACAAAACTACACCACCTGTGCTCGAT
TCAGATGGAAGTTTCTTCCTTTACAGTAGACTTACGGTGGACAAATCTAGGTGGCAGGAA
GGGAATGTGTTTAGTTGTAGTGTAATGCACGAGGCACTTCATAACCACTATACACAGAAG
TCACTGAGTTTGAGTCTTGGCAAA
配列番号８６ ヒトＩｇＧ４ヒンジＣＨ２ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号８７ ＬＴＧ＿Ｄ００３５（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ Ｈ ＣＨ２ ＣＨ３ ＩｇＧ４＿ＣＤ８ＴＭ＿ＣＤ２８ｚ）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTG
ATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGC
CAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAA
TACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACG
CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAA
GAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAGAGAGC
AAATACGGGCCGCCATGTCCCCCGTGTCCGGCACCACCAGTTGCTGGCCCTAGTGTCTTC
TTGTTCCCTCCCAAGCCCAAAGACACCTTGATGATTTCCAGAACTCCTGAGGTTACCTGC
GTTGTCGTAGATGTTTCTCAGGAGGACCCAGAGGTCCAATTTAACTGGTACGTTGATGGG
GTGGAAGTTCACAATGCGAAGACAAAGCCGCGGGAAGAACAATTTCAGTCCACTTACCGG
GTTGTCAGCGTTCTGACGGTATTGCATCAAGACTGGCTTAATGGAAAGGAATATAAGTGT
AAGGTGTCCAACAAAGGTTTGCCGAGCAGTATTGAGAAGACCATATCAAAGGCGAAGGGG
CAGCCGCGCGAGCCACAAGTTTACACTTTGCCGCCATCTCAAGAGGAAATGACTAAAAAC
CAGGTATCCTTGACATGCCTCGTAAAAGGATTTTATCCATCTGATATTGCTGTGGAATGG
GAGTCTAACGGGCAGCCGGAAAATAATTACAAAACTACACCACCTGTGCTCGATTCAGAT
GGAAGTTTCTTCCTTTACAGTAGACTTACGGTGGACAAATCTAGGTGGCAGGAAGGGAAT
GTGTTTAGTTGTAGTGTAATGCACGAGGCACTTCATAACCACTATACACAGAAGTCACTG
AGTTTGAGTCTTGGCAAAATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTT
CTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCC
GACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTAC
GCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGAT
GCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGG
GAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCG
AGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAA
GCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTG
TACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTG
CCCCCGCGG
配列番号８８ ＬＴＧ＿Ｄ００３５（Ｅｆ１ａ＿ＣＤ３３＿４ ＶＨ Ｈ ＣＨ２ ＣＨ３ ＩｇＧ４＿ＣＤ８ＴＭ＿ＣＤ２８ｚ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVR
QAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAK
ENVDWGQGTLVTVSSAAAESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSLGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPY
APPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP
RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL
PPR

Claims (48)

  1. 配列番号１、３、５、７、９、または１１を含むヌクレオチド配列によりコードされるＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離された核酸分子。
  2. コードされる前記少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. コードされる前記少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. コードされる前記少なくとも１つのＣＤ３３抗原結合性ドメイン、前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  5. コードされる前記リンカーまたはスペーサードメインが、ＣＤ８、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはＣＤ２８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメイン連結されている、請求項４に記載の単離された核酸分子。
  6. コードされる前記細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインに、リーダーペプチドをコードするリーダーヌクレオチド配列が先行する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  7. 前記リーダーヌクレオチド配列が、配列番号１４のリーダーアミノ酸配列をコードする配列番号１３、または配列番号４０のリーダーアミノ酸配列をコードする配列番号３９、または配列番号４２のリーダーアミノ酸配列をコードする配列番号４１、または配列番号４４のリーダーアミノ酸配列をコードする配列番号４３を含むヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。
  8. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの任意の組合せを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  9. 前記細胞外ＣＤ３３抗原結合性ドメインをコードする核酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む核酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  10. コードされる前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  11. コードされる前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置されている、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
  12. コードされる前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の単離
    された核酸分子。
  13. コードされる前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
  14. 請求項１に記載の単離された核酸分子によりコードされるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  15. 配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含むＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。
  16. 前記ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  17. 前記ＣＤ３３抗原結合性ドメインが、ＣＤ３３に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  18. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの任意の組合せを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  19. 前記ＣＤ８膜貫通ドメインが、配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２８のアミノ酸配列に対し８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＣＡＲ。
  20. 配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のアミノ酸配列を含むＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む前記少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、および前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって前記膜貫通ドメインに接続されている、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  21. 前記リンカーまたはスペーサードメインが、ＣＤ８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＩｇＧ４、またはＣＤ２８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、請求項２０に記載のＣＡＲ。
  22. 前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。
  23. 前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインを含む、請求項２２に記載のＣＡＲ。
  24. 請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
  25. ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載のベクター。
  26. プロモーターをさらに含む、請求項２４に記載のベクター。
  27. 前記プロモーターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、自殺プロモーター、またはそれらの任意の組合せである、請求項２６に記載のベクター。
  28. 請求項２４に記載のベクターを含む細胞。
  29. Ｔ細胞である、請求項２８に記載の細胞。
  30. 前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２８に記載の細胞。
  31. ヒト細胞である、請求項２８に記載の細胞。
  32. 請求項２４に記載のベクターをＴ細胞に形質導入するステップを含む、細胞を作製する方法。
  33. ＲＮＡ操作された細胞の集団を生成する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞中に導入するステップを含み、前記ＲＮＡが請求項１に記載の核酸分子を含む、方法。
  34. 哺乳動物における抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、有効量の請求項２８に記載の細胞を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
  35. 哺乳動物においてがんを処置または予防する方法であって、請求項１５に記載のＣＡＲを、前記哺乳動物におけるがんを処置または予防するのに有効な量で前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
  36. 抗腫瘍有効量のヒトＴ細胞集団を含む医薬組成物であって、前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲが配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含むＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記Ｔ細胞ががんを有するヒトのＴ細胞である、医薬組成物。
  37. 前記少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４、またはそれらの任意の組合せを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 前記Ｔ細胞が、血液学的がんを有するヒトのＴ細胞である、請求項３６に記載の医薬組成物。
  39. 前記血液学的がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 前記白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、または急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病（Ｂ－ＡＬＬ）である、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫である、請求項３９に記載の医薬組成物。
  42. 前記血液学的がんが多発性骨髄腫である、請求項３８に記載の医薬組成物。
  43. ヒトがんが、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系がん（喉頭、肺および気管支）、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
  44. 腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、抗腫瘍有効量のＴ細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲが、配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含むＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記Ｔ細胞ががんを有する対象のＴ細胞である、方法。
  45. それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、抗腫瘍有効量のＴ細胞集団を含む医薬組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲが、配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含むＣＤ３３抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記Ｔ細胞ががんを有する対象のＴ細胞である、方法。
  46. 前記少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４、またはそれらの任意の組合せを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. キメラ抗原受容体発現細胞を産生する方法であって、請求項１に記載の単離された核酸を細胞に導入するステップを含む、方法。
  48. 請求項４７に記載のキメラ抗原受容体発現細胞を産生する方法であって、前記細胞がＴ
    細胞またはＴ細胞を含む細胞集団である、方法。
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