JP2022166193A - インターフェロンレベルを低下させるのに有用な化合物 - Google Patents

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Pietrancosta Nicolas
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Smith Nikaia
エルブーヴァル，ジャン－フィリップ
Herbeuval Jean-Philippe
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Abstract

【課題】個体におけるインターフェロンレベルを低下させるのに使用するための化合物、および個体におけるインターフェロンレベルを低下させる化合物を候補化合物から同定するためのインビトロスクリーニング方法を提供する。【解決手段】個体におけるインターフェロンレベルを低下させるのに使用するためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、個体におけるインターフェロン（ＩＦＮ）レベルを低下させるのに使用するためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物に関する。
発明の背景
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染に対する免疫防御に介在する。しかし、高ＩＦＮレベルに至る遺伝性又は後天性のいずれかのＩＦＮの過剰産生は、自己免疫疾患又はインターフェロノパチーなどの種々の障害、特にエカルディ・グティエール（Aicardi-Goutieres）症候群、家族性凍傷状狼瘡、脊椎性内軟骨腫症（spondyenchondromatosis）、プロテアソーム関連自己炎症性症候群（ＰＲＡＳＳ）及びシングルトン・マーテン（Singleton-Merten）症候群を含む障害の原因であり得る。
現在のインターフェロノパチーの治療は、大抵は対症療法であり、グルココルチコイドに基づく（Munoz et al. (2015) Annales de dermatologie et de venerologie 142:653-663）。更に、コルチコイドを補うために、理学療法セッション及び心理ケアがこれらの障害の予防に不可欠な部分である。
しかし、コルチコイド中心の治療は、体重増加、ホルモン障害、高血圧、小児の成長遅延、消化系障害、睡眠障害又は気分障害のような幾つかの副作用を有する。
更に一般的には、インターフェロノパチーに現在利用可能な治療法は、疾患の根底にある原因を治療するよりも症状を軽減することを主に目的としており、長期にわたる寛解を維持することができない。
したがって、症状の処置に加えてインターフェロノパチーを効果的に治すのに有効であろう、これらの治療の代替法が必要である。
発明の概要
本発明は、インフルエンザＡ感染マウスモデルにおけるインビトロ及びインビボでのウイルス刺激形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）によるインターフェロン（ＩＦＮ）産生をアミンが阻害するという本発明者らによる予期せぬ発見から生じる。同様に、本発明者らは、この阻害効果が、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に、更にはＴＮＦ－αなどの他のサイトカイン類、又はＩＬ－６、ＩＬ－８若しくはＩＬ－１０などのインターロイキン類にも拡大できることを示した。本発明者らは更に、ＩＦＮのｐＤＣ産生を阻害するためにアミンによって使用される予期せぬ受容体としてのＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）を、更にはこの効果に介在するこれまで未知の結合部位を同定した。
よって本発明は、個体におけるサイトカインレベル、特にインターフェロン（ＩＦＮ）レベルを低下させるのに使用するためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）に関する。
ある実施態様において、本発明は、免疫細胞、特に形質細胞様樹状細胞、単球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による、サイトカイン分泌、特にＩＦＮ分泌を阻害するための、本発明の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物に関する。
別の実施態様において、本発明は、インターフェロノパチーの予防又は治療における本発明の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物に関する。
本発明はまた、個体におけるサイトカインレベル、特にインターフェロン（ＩＦＮ）レベルを低下させる方法であって、個体に有効量の少なくとも１種のＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）を投与することを含む方法に関する。
本発明はまた、個体における免疫細胞、特に形質細胞様樹状細胞、単球及びＮＫ細胞による、サイトカイン分泌、特にＩＦＮ分泌を阻害する方法であって、個体に有効量の少なくとも１種のＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）を投与することを含む方法に関する。
本発明は更に、インターフェロノパチーの予防又は治療の方法であって、個体に予防又は治療有効量の少なくとも１種の本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）を投与することを含む方法に関する。
本発明はまた、免疫細胞、特に形質細胞様樹状細胞、単球及びＮＫ細胞による、サイトカイン分泌、特にＩＦＮ分泌を阻害するための、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）のインビトロ使用に関する。
本発明はまた、免疫細胞、特に形質細胞様樹状細胞、単球及びＮＫ細胞による、サイトカイン分泌、特にＩＦＮ分泌を阻害するためのインビトロ方法であって、免疫細胞、特に形質細胞様樹状細胞、単球及びＮＫ細胞を本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）と接触させることを含む方法に関する。
本発明はまた、個体におけるサイトカインレベル、特にＩＦＮレベルを低下させる化合物を、候補化合物（ここで、候補化合物は、上で定義したＣＸＣＲ４受容体結合化合物である）から同定するためのインビトロスクリーニング方法に関する。
本発明はまた、個体におけるＩＦＮレベルを低下させる化合物を、候補化合物から同定するためのインビトロスクリーニング方法であって、
・血球を候補化合物と接触させる工程；
・接触血球によるＩＦＮの分泌のレベルを測定する工程；
・ＩＦＮの分泌の測定レベルを基準化合物に接触された血球によるＩＦＮの発現のレベルと比較する工程；
・基準化合物に対してＩＦＮの発現のレベルが低下していたか、上昇していたか又は同様であった候補化合物を選択し、それによってＩＦＮレベルを低下させる化合物を同定する工程
を含む方法［ここで、基準化合物は、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物、特に１２Ｇ５抗体又は下で定義する式（II）の化合物、更に詳しくはＦＦＮ１０２若しくはＦＦＮ５１１である］に関する。
本発明はまた、個体におけるサイトカインレベル、特にＩＦＮレベルを低下させる化合物を、候補化合物から同定するためのインビトロスクリーニング方法であって、
・ＣＸＣＲ４受容体を検出可能な上で定義したＣＸＣＲ４受容体結合化合物と結合させる工程；
・検出可能なＣＸＣＲ４受容体結合化合物に結合したＣＸＣＲ４受容体を候補化合物と接触させる工程；
・ＣＸＣＲ４受容体への検出可能なＣＸＣＲ４受容体結合化合物の結合を低下させる候補化合物を選択し、それによってＩＦＮレベルを低下させる化合物を同定する工程
を含む方法に関する。
本発明はまた、個体におけるサイトカインレベル、特にＩＦＮレベルを低下させるのに有用な化合物を候補化合物からスクリーニングするための、又は個体におけるサイトカインレベル、特にＩＦＮレベルを低下させるのに有用な化合物を設計するためのインシリコ法であって、設計された化合物又は候補化合物が、配列番号１により表されるＣＸＣＲ４受容体の少なくとも８個のアミノ酸（ここで、アミノ酸は、トリプトファン９４、トリプトファン１０２、アスパラギン酸９７、アスパラギン酸１８７、チロシン１１６、チロシン１９０、アルギニン１８３、イソロイシン１８５、バリン１１２、システイン１８６及びグルタミン酸２８８からなる群より選択される）と相互作用するかどうかを決定するコンピュータ実行工程を含む方法に関する。
発明の詳細な説明
本明細書で意図されるとき、「含む（comprising）」という用語は、「包含する（including）」又は「含有する（containing）」という意味を有しており、これはある対象が１つ又は幾つかの要素を「含む」とき、言及されたものの他の要素もまた対象に包含されてもよいことを意味する。これとは対照的に、ある対象が１つ又は幾つかの要素「からなる（consist of）」と言われるとき、この対象は、列挙された要素に限定され、言及されたものの他の要素を包含することができない。
ＣＸＣＲ４受容体結合化合物
当該分野において既知のとおり、「ＣＸＣＲ４受容体」は、フュージン又はＣＤ１８４としても知られているＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型である。本明細書で意図されるとき、「ＣＸＣＲ４受容体」という表現は、「ＣＸＣＲ４」と同等である。好ましくは、本発明のＣＸＣＲ４受容体は、ヒトＣＸＣＲ４受容体である。ＣＸＣＲ４は、特に配列番号１により表される。
本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、ＣＸＣＲ４に結合することが当該分野において知られているか、又はこれがＣＸＣＲ４に結合すると判定できるかのいずれかである。ある化合物がＣＸＣＲ４に結合すると判定することは、当業者には公知の多くの方法により実行され得る。一例として、ＣＸＣＲ４結合は、１２Ｇ５抗体のような抗ＣＸＣＲ４抗体を用いて、評価すべき化合物と接触させた、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のフローサイトメトリー分析によって評価される。この手順は、以下の実施例において更に詳細に説明される。
好ましくは、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、１～４５個の炭素原子及び少なくとも１個のｐＨ６～８で、特にｐＨ７．０～７．８で、更に詳しくはヒト個体の生理的血液ｐＨで正荷電したアミン基を含む。
好ましくはまた、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、配列番号１により表されるＣＸＣＲ４受容体の少なくとも５、６、７、８、９、１０又は１１個のアミノ酸と相互作用するが、ここで、このアミノ酸は、トリプトファン９４、トリプトファン１０２、アスパラギン酸９７、アスパラギン酸１８７、チロシン１１６、チロシン１９０、アルギニン１８３、イソロイシン１８５、バリン１１２、システイン１８６及びグルタミン酸２８８からなる群より選択される。
上記定義のアミノ酸は、本発明者らによって、免疫細胞、特に形質細胞様樹状細胞、単球及びＮＫ細胞によるＩＦＮ分泌の低下を担うＣＸＣＲ４受容体上の結合部位を規定するものとして同定されている。更には、当業者には明らかであるように、配列番号１は、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物の結合に関与するＣＸＣＲ４受容体のアミノ酸の位置を明白に定義するための基準配列としての意味しか持たない。したがって、配列番号１は、本発明のＣＸＣＲ４受容体を限定することを意味しない。実際に、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物はまた、ＣＸＣＲ４受容体の変異体、突然変異体若しくは切断型における、又はＣＸＣＲ４受容体を含むタンパク質若しくはポリペプチドにおける、上記定義のアミノ酸に結合することもでき、そして該変異体、突然変異体若しくは切断型、又はタンパク質若しくはポリペプチドにおけるアミノ酸の絶対位置を変化させうるが、それらの機能を変化させることはない。
本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、特に天然アミン又は合成アミンの、モノアミン又はポリアミンであってよい。
本発明のある実施態様において、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、天然アミンであり、かつ好ましくはセロトニン、ドーパミン、Ｌ－ドーパ、スペルミン及びスペルミジンからなる群より選択される。これらの天然アミン類は当業者には周知であり、以下の構造により表される：
Figure 2022166193000001
ヒスタミンは、下記式により表される：
Figure 2022166193000002
本発明の別の実施態様において、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、抗ＣＸＣＲ４受容体抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ抗体、又はアプタマーからなる群より選択される。
当業者には明らかであるように、本発明の抗ＣＸＣＲ４受容体抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ抗体、又はアプタマーは、全てＣＸＣＲ４受容体に対して、更に詳しくは配列番号１により表されるＣＸＣＲ４受容体の少なくとも５、６、７、８、９、１０又は１１個のアミノ酸（ここで、アミノ酸は、トリプトファン９４、トリプトファン１０２、アスパラギン酸９７、アスパラギン酸１８７、チロシン１１６、チロシン１９０、アルギニン１８３、イソロイシン１８５、バリン１１２、システイン１８６及びグルタミン酸２８８からなる群より選択される）により画定されるＣＸＣＲ４受容体の部位に対して特異的に指向される。
本明細書で意図されるように、ある化合物が、関係が無い標的、例えば、タンパク質の場合、非相同の標的に実質的に結合することなく、ある標的に結合する場合に、その化合物はその標的「に対して特異的に指向」されると言われる。
本明細書において理解されるとおり、本発明の「抗体」は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、抗体フラグメントは、モノクローナル抗体フラグメントである。好ましくはまた、本発明の抗体は、ヒト化抗体であり、本発明の抗体フラグメントは、ヒト化抗体のフラグメントである。
特異的標的に対して指向される抗体、特にモノクローナル抗体を産生させる方法は、当業者には周知である。
好ましくは、本発明の抗ＣＸＣＲ４受容体抗体は、モノクローナル抗ＣＸＣＲ４受容体抗体１２Ｇ５である。この抗ＣＸＣＲ４受容体抗体は、当該分野において周知であり、特にEndres et al. (1996) Cell 87:745-756に記載されており、市販されている。好ましくはまた、本発明の抗ＣＸＣＲ４受容体抗体は、ヒト化１２Ｇ５抗体、又は１２Ｇ５抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、そして更に好ましくは全てのＣＤＲがグラフトされたヒト抗体である。
本発明の抗体フラグメントは、抗体の抗原結合部分を保持する当業者に公知の任意のタイプであってよい。特に、本発明の抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントからなる群より選択される。このようなフラグメント、及びこれらの入手方法は、当業者には周知である。好ましくは、本発明の抗体フラグメントは、１２Ｇ５抗体フラグメントである。
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体は、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）（これらは、ペプチドリンカーにより結合している）の各可変領域を含む。本発明のｓｃＦｖ抗体は、当業者に周知の多くの方法により入手することができる。
アプタマーは、一本鎖オリゴヌクレオチド分子、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、好ましくはＲＮＡである。本発明のアプタマーは、特に周知の試験管内進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）法により入手することができる。
ある実施態様において、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、下記式（Ｉ）：
Figure 2022166193000003
［式中、
ｎは、１～６の整数であり、
Ａ１、Ａ２及びＡ３は、同一であっても異なっていてもよく、
・水素原子を表すか、又は
・１～１２個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボニトリル基、トリフルオロメチル基、アミン基、尿素、若しくは１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、又は
・３～１２個の炭素原子を有する複素環、ヘテロアリール、アリール、アリールアルキル若しくはアルキルアリール基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボニトリル基、トリフルオロメチル基、アミン基、尿素、若しくは１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表し；そして
Ａ４は、３～２０個の炭素原子を有するアリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はアルキルアリール基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボニトリル基、トリフルオロメチル基、アミン基、尿素基、又は１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表す］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくは水和物である。
好ましくは、上で定義した式（Ｉ）の化合物は、クロベンプロピット（clobenpropit）（ＣＢ）及びＩＴ１ｔからなる群より選択される：
Figure 2022166193000004
好ましくはまた、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、クロベンプロピットを除いた上で定義した式（Ｉ）の化合物である。
本発明のある実施態様において、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、
Ａ１、Ａ２及びＡ３が、同一であっても異なっていてもよく、
・水素原子を表すか、又は
・１～１２個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基若しくはハロゲン原子によって置換された上記基を表すか、又は
・３～１２個の炭素原子を有するアリール、アリールアルキル若しくはアルキルアリール基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、若しくは１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキルによって置換された上記基を表し；そして
Ａ４が、３～１２個の炭素原子を有するアリール又はヘテロアリール基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、又は１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表す（ただし、Ａ４は、イミダゾールとは異なる）、上で定義した式（Ｉ）の化合物である。
本発明の式（Ｉ）の化合物は、特にThoma et al. (2008) J. Med. Chem. 51: 7915-7920 及びVan der Goot et al. European Journal of Medicinal Chemistry, 27: 511-157に記載されているとおり、当業者には容易に合成することができる。
別の実施態様において、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、下記式（II）：
Figure 2022166193000005
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、１～１２個の炭素原子を有するアルキル基（場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、アミン基又はハロゲン原子によって置換されている）を表し、ここで、Ｒ１とＲ２、及び／又はＲ２とＲ３及び／又はＲ３とＲ４は、同じ環に含まれていてもよく；
Ｘ及びＹは、同一であっても異なっていてもよく、Ｓ又はＯを表し；
Ｒ５及びＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は１～５個の炭素原子を有するアルキル基（少なくとも１個のアミン基により置換されている）を表す（ただし、Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、少なくとも１個のアミン基により置換された１～５個の炭素原子を有するアルキル基を表す）］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくは水和物である。
好ましくは、上に定義される式（II）の化合物は、ＦＦＮ１０２及びＦＦＮ５１１からなる群より選択される。
Figure 2022166193000006
有利なことに、式（II）の化合物、特にＦＦＮ１０２及びＦＦＮ５１１は蛍光性である。したがって、このような化合物は、例えば、競合試験においてＣＸＣＲ４受容体への結合を評価するために使用することができる。
本発明の式（II）の化合物は、特にGubernator et al (2009) Science, 324: 1441-1444 及びLee et al (2010) Journal of the American Chemical Society, 132: 8828-8830に記載されているとおり、当業者には容易に合成することができる。
更に別の実施態様において、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、下記式（III）：
Figure 2022166193000007
［式中、
Ｂ１及びＢ２は、同一であるか又は異なって、
・３～６個の炭素原子を有するアリール若しくはヘテロアリール基であって、場合によりヒドロキシル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ＣＦ３基、ＣＮ基、－ＮＲ７Ｒ８基、アミド若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル、Ｓ－アルキル若しくはＯ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、又は
・３～６個の炭素原子を有するシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキル基であって、場合によりヒドロキシル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ＣＦ３基、ＣＮ基、－ＮＲ７Ｒ８基、若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル、Ｓ－アルキル若しくはＯ－アルキル基によって置換された上記基を表す（ここで、Ｒ７及びＲ８は、同一であるか又は異なって、Ｈ、１～６個の炭素原子を有するアルキル基又は３～６個の炭素原子を有するヘテロシクロアルキル基を表す）］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくはその水和物である。
好ましくは、上で定義した式（III）の化合物は、Debnath et al. (2013) Theranostics 3:47-75の論文の図１９に示される化合物から選択される。
本発明の式（III）の化合物は、特にDebnath et al. (2013) Theranostics 3:47-75 pages 66-67に記載されているとおり、当業者には容易に合成することができる。
また別の実施態様において、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、下記式（IV）：
Figure 2022166193000008
［式中、
Ｄ１及びＤ２は、同一であっても異なっていてもよく、
・１～６個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、ＣＦ３基、ＣＮ基、アミン基、又は１～１２個の炭素原子を有するアルキル、Ｏ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、又は
・３～１２個の炭素原子を有するアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール若しくはアルキルヘテロポリアリール基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、ＣＦ３基、ＣＮ基、アミン基、若しくは１～１２個の炭素原子を有するアルキル、Ｏ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、あるいは
Ｄ１及びＤ２は、結合して３～１２個の炭素原子を有するＮ含有アリール又はヘテロアリール基であって、場合により、３～１２個の炭素原子を有するアルキルヘテロアリール基によって場合により置換された少なくとも１個のアミン基によって置換された上記基を形成し、そして
Ｘは、
・１～６個の炭素原子を有するアルキル基を表すか、又は
・－Ｒ９－Ｙ－Ｒ１０－（ここで、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか又は異なって、１～６個の炭素原子を有するアルキル基を表し、そしてＹは、３～６個の炭素原子を有するアリール又はヘテロアリール基であって、場合によりハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミド基、アミン基、アルコキシ基、エステル基、ＣＦ３基、ＣＮ基又は１～６個の炭素原子を有するアルキル、Ｏ－アルキル若しくはＳ－アルキル基（場合によりヒドロキシル基、アミン基又は１～６個の炭素原子を有するＯ－アルキル基によって置換されている）によって置換された上記基を表す）を表す］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくはその水和物である。
好ましくは、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、
Ｄ１及びＤ２が、同一であっても異なっていてもよく、３～１２個の炭素原子を有するアリール又はヘテロアリール基であって、場合によりヒドロキシル基又は１～６個の炭素原子を有するアルキル基によって置換された上記基を表し、
Ｘが、１～６個の炭素原子を有するアルキル基を表す、上で定義した式（IV）の化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくは水和物である。
好ましくは、上で定義した式（IV）の化合物は、Debnath et al. (2013) Theranostics 3:47-75の論文の図９及び図１６に示される化合物から選択される。
好ましくはまた、上で定義した式（IV）の化合物は、下記式（Ｖ）：
Figure 2022166193000009
［式中、
Ｅ１は、１～１２個の炭素原子を有するアルキル基、又は３～１２個の炭素原子を有するヘテロアリール基を表し、そして
Ｅ２は、１個のアミン基によって置換された、１～１２個の炭素原子を有するヘテロアルキル基を表し、そして
Ｅ３は、１～１２個の炭素原子を有するヘテロアルキル基を表す］により表される。
最も好ましくは、上で定義した式（IV）の化合物は、下記構造により表される化合物からなる群より選択される：
Figure 2022166193000010
好ましくは、本発明の式（IV）の化合物は、ＡＭＤ０７０である：
Figure 2022166193000011
本発明の式（IV）の化合物は、特にMiller et al. (2010) Bioorg. Med. Chem. Lett., 20: 3026-30に記載されているとおり、当業者には容易に合成することができる。
式（Ｉ）、（II）、（III）、及び（IV）の化合物の薬学的に許容しうる塩及び／又は水和物は、当業者には明らかであろう。好ましくは、式（Ｉ）、（II）、（III）、及び（IV）の化合物の薬学的に許容しうる塩及び／又は水和物は、臭化水素酸塩、塩酸塩、二臭化水素酸塩及び二塩酸塩からなる群より選択される。
本明細書で意図されるとき、「アルキル」という用語は、直鎖状、分岐鎖状又は環状アルキル基のことをいう。
本明細書で意図されるとき、「アリール」という用語は、少なくとも１個の芳香環を含む芳香族基を意味する。
本明細書で意図されるとき、「ヘテロアリール」という用語は、好ましくはＯ、Ｐ、Ｎ、Ｓ及びＳｉからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子（これは、更に好ましくはＮである）を含むアリールを意味する。
本明細書で意図されるとき、「ヘテロアルキル」、特に「ヘテロシクロアルキル」という用語は、好ましくはＯ、Ｐ、Ｎ、Ｓ及びＳｉからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子（これは、更に好ましくはＮである）を含むアルキル、特にシクロアルキルを意味する。
本明細書で意図されるとき、「アルキルアリール」という用語は、少なくとも１個のアリール基により置換されたアルキル基を意味する。
本明細書で意図されるとき、「アリールアルキル」という用語は、少なくとも１個のアルキル基により置換されたアリール基を意味する。
本発明のハロゲン原子は、当業者に公知の任意のタイプのものであってよい。好ましくは、本発明のハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択される。
好ましくは、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、ＩＴ１ｔ、クロベンプロピット、ＦＦＮ１０２、ＦＦＮ５１１及びＡＭＤ０７０からなる群より選択される。更に好ましくは、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、ＩＴ１ｔ、ＦＦＮ１０２、ＦＦＮ５１１及びＡＭＤ０７０からなる群より選択される。
予防及び治療
本発明のサイトカインは、炎症性サイトカインであっても又は抗炎症性サイトカインであってもよい。
好ましくは、本発明のサイトカインは、ＴＮＦ－α、インターロイキン（ＩＬ－６、ＩＬ－８、又はＩＬ－１０など）、又はインターフェロン（更に好ましくは、ＩＦＮ－Ｉとも表されるＩ型インターフェロン、ＩＦＮ－IIとも表されるII型インターフェロン、及びＩＦＮ－IIIとも表されるIII型インターフェロンからなる群より選択される）である。更に好ましくは、本発明のＩＦＮは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－γ及びＩＦＮ－λからなる群より選択される。最も好ましくは、本発明のインターフェロンは、ＩＦＮ－αである。
当業者には明らかであろうとおり、本発明の低下させるべきサイトカイン又はインターフェロン、好ましくはＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II又はＩＦＮ－IIIのレベルは、好ましくは異常又は病的レベルであり、そして更に好ましくは異常に又は病的に上昇しているレベルである。
本明細書で意図されるとき、インターフェロン、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II又はＩＦＮ－IIIの異常又は病的に上昇しているレベルとは、好ましくは特にヒト個体において１u.i/mlを超えるインターフェロンのレベル、即ち、インターフェロンの濃度である。
好ましくは、本発明のサイトカイン分泌、特にＩＦＮ分泌の阻害は、免疫細胞、即ち、免疫系の細胞による分泌の阻害、更に好ましくは樹状細胞、特に形質細胞様樹状細胞、単球／マクロファージ系統の細胞、特に単球、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による分泌の阻害に関する。
好ましくは、本発明の予防又は治療は、ＩＦＮ、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIの過剰産生若しくは過剰、又は高いか若しくは上昇したＩＦＮレベル、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIレベルを伴うか、又はこれらに起因する、少なくとも１つの症状、障害又は疾患の予防又は治療に関する。ＩＦＮ、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIの過剰産生若しくは過剰、又は高いか若しくは上昇したＩＦＮレベル、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIレベルは、例えば、ウイルス感染の結果として後天性であるか、又は例えば、遺伝性疾患として先天性であるかのいずれかでありうる。
更に好ましくは、本発明は、インターフェロノパチー、特にＩ型インターフェロノパチー、即ち、ＩＦＮ－Ｉに関連するインターフェロノパチーの予防又は治療に関する。
Ｉ型インターフェロノパチーは、一般に生理病理学：Ｉ型インターフェロンのアップレギュレーションを特徴とするメンデル型遺伝病の一群として定義される。インターフェロノパチーは、特にMunoz et al. (2015) Annales de Dermatologie et de venereologie, 142: 653-663に記載されている。
本発明のインターフェロノパチーは、好ましくはエカルディ・グティエール症候群、家族性凍傷状狼瘡、脊椎性内軟骨腫症、全身性エリテマトーデス（特にＴＲＥＸ遺伝子の有害なヘテロ接合性突然変異に関連する）、ＳＴＩＮＧ関連血管症、プロテアソーム関連自己炎症性症候群（ＰＲＡＡＳ）及びシングルトン・マーテン症候群からなる群より選択される。
更に好ましくはまた、本発明は、ＩＦＮ－IIの、過剰産生、アップレギュレーション、過剰、又は高レベル、上昇したレベル若しくは正常以上のレベルに起因するか、又はこれらに関連する疾患、特にBaccala et al., (2005) Immunological Reviews, 204: 9-26に記載されているような自己免疫疾患の予防又は治療に関する。
好ましくは、ＩＦＮ－IIの、過剰産生、アップレギュレーション、過剰、又は高レベル、上昇したレベル若しくは正常以上のレベルに起因するか、又はこれらに関連する疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ及びＩ型糖尿病からなる群より選択される。
好ましくはまた、本発明は、自己免疫疾患、特に、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、エカルディ・グティエール症候群、筋炎（特に多発性筋炎及び皮膚筋炎）、乾癬、全身性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、関節リウマチ、クローン病及び多発性硬化症、更にはアテローム動脈硬化症から選択される疾患の予防又は治療に関する。更に好ましくは、本発明は、関節リウマチ又は全身性エリテマトーデス、又は乾癬の予防又は治療に関する。例えば、Niewold (2014) Frontiers in Immunology 5:1-2、Goosens et al. (2010) Cell Metabolism 12:142-153、Greenberg (2010) Arthritis Research & Therapy 12(Suppl 1): S4,及びPollard et al. (2013) Discov. Med. 16:123-131に示されるように、これらの後半の全ての疾患は、ＩＦＮに関連していることが知られているか、又はＩＦＮは、これらの病因物質の１つであることが知られている。
したがって、本発明は、好ましくはエカルディ・グティエール症候群、家族性凍傷状狼瘡、脊椎性内軟骨腫症、全身性エリテマトーデス（特にＴＲＥＸ遺伝子の有害なヘテロ接合性突然変異に関連する）、ＳＴＩＮＧ関連血管症、プロテアソーム関連自己炎症性症候群（ＰＲＡＡＳ）、シングルトン・マーテン症候群、シェーグレン症候群、筋炎（特に多発性筋炎及び皮膚筋炎）、乾癬、全身性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、及びアテローム動脈硬化症からなる群より選択される疾患の予防又は治療に関する。
個体
本発明の個体は、好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒトである。好ましくはまた、本発明の個体は、小児又は乳児である。
好ましくは、本発明の個体は、異常又は病的レベルのＩＦＮ、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II及びＩＦＮ－III（更に好ましくは異常に又は病的に上昇している）を呈する。
好ましくはまた、本発明の個体は、ＩＦＮ、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIの過剰産生若しくは過剰、又は高いか若しくは上昇したＩＦＮレベル、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIレベルを呈する。ＩＦＮ、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIの過剰産生若しくは過剰、又は高いか若しくは上昇したＩＦＮレベル、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II若しくはＩＦＮ－IIIレベルは、例えば、ウイルス感染の結果として後天性であるか、又は例えば、遺伝性疾患として先天性であるかのいずれかでありうる。
本発明のある実施態様において、本発明の個体は、慢性ウイルス感染、特にＩＦＮ、特にＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－II又はＩＦＮ－IIIの過剰産生に至る慢性ウイルス感染を患っている。好ましくは、本発明の個体は、ヒト免疫不全ウイルス、ｆｌｕウイルス又はデング熱ウイルスからなる群より選択されるウイルスによる慢性ウイルス感染を患っている。
投与
好ましくは、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、ＩＦＮの過剰産生に関連する障害を予防又は治療するための、特にインターフェロノパチー又は上で定義した疾患を予防又は治療するための、予防的又は治療的に有効量で投与される。好ましくはまた、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、個体におけるＩＦＮレベルを低下させるのに適切な量で投与される。
本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、経口、又は局所経路のような、当該分野における任意の経路により投与することができる。
インビトロスクリーニング方法
好ましくは、候補化合物であって、本発明のＣＸＣＲ４受容体結合化合物である候補化合物から、個体におけるＩＦＮレベルを低下させる化合物を同定するためのインビトロスクリーニング方法は、
・血球を候補化合物と接触させる工程；
・接触血球によるＩＦＮの分泌のレベルを測定する工程；
・血球を候補化合物と接触させる前のＩＦＮの分泌レベルに対してＩＦＮの分泌レベルを低下させる候補化合物を選択し、それによってＩＦＮレベルを低下させる化合物を同定する工程を含む。
好ましくは、本発明のインビトロスクリーニング方法は、フローサイトメトリーにより実施される。
本発明の血球は、当業者に公知の任意のタイプのものであってよい。好ましくは、本発明の血球は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、更に好ましくは形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、単球又はＮＫ細胞である。
好ましくは、本発明の候補化合物から個体におけるＩＦＮレベルを低下させる化合物を同定するためのインビトロスクリーニング方法において、ＣＸＣＲ４受容体は、ＨＥＫ細胞のような細胞の表面上で発現する。
本発明の検出可能なＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、当業者に公知の任意のタイプのものであってよい。好ましくは、本発明の検出可能なＣＸＣＲ４受容体結合化合物は、検出可能な標識のある１２Ｇ５抗体のような抗体、又は上で定義した式（II）の化合物、特にＦＦＮ１０２及びＦＦＮ５１１である。
インシリコ実験
化合物をスクリーニングするためのインシリコ法は、当業者には周知である。本発明のインシリコ法は、好ましくはバイオインフォマティクスのツールを介して個体におけるＩＦＮレベルを低下させる候補化合物を同定するか、又は化合物を設計する方法のことをいう。本発明のインシリコ法は、例えば、cDockerのようなソフトウェアを用いるドッキング、構造ベース、リガンドベース、受容体依存－定量的構造活性相関（ＲＤ ＱＳＡＲ）、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）、定量的構造物性相関（ＱＳＰＲ）、ファーマコフォアモデル及びデノボ設計のような任意のタイプのものであってよい。
好ましくは、本発明の個体におけるＩＦＮレベルを低下させる化合物を、候補化合物からスクリーニングするための、又は化合物を設計するためのインシリコ法は、インシリコドッキング実験である。例えば、本発明の個体におけるＩＦＮレベルを低下させる化合物を候補化合物からスクリーニングするための、又は化合物を設計するためのインシリコ法は、ＣＢに構造的に関係する低分子リガンドを含む、特にＩＴ１ｔを含む、ＣＸＣＲ４の結晶構造を用いて、次にＣＸＣＲ４細胞外ドメイン上の結合ポケット候補を同定することによって実施することができる。
好ましくは、本発明の設計化合物又は候補化合物は、配列番号１により表されるＣＸＣＲ４受容体の少なくとも８個のアミノ酸（ここで、アミノ酸は、トリプトファン９４、トリプトファン１０２、アスパラギン酸９７、アスパラギン酸１８７、チロシン１１６、チロシン１９０、アルギニン１８３、イソロイシン１８５、バリン１１２、システイン１８６及びグルタミン酸２８８からなる群より選択される）と相互作用する。
本発明は、以下の非限定的な図面及び実施例により更に説明される。
図１は、１０μMの濃度のヒスタミン又はＣＢで前処理し、次に微小胞（モック）単独で又はＨＩＶで一晩刺激したｐＤＣによる、上清中のＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－α産生（ng/ml）の大きさを示す。３個の星印の記号（＊＊＊）はＰ＜０．００１を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰ＜０．０１を表し、そして１個の星印の記号（＊）はＰ＜０．０５を表す。 図２は、ホモジナイザーを用いて脾臓から得られ、３５％等張性Percoll密度勾配（Amersham Biosciences）を用いて精製したマウスＭＮＣ（多核細胞）による、上清中でＥＬＩＳＡにより定量されたＩＦＮ－αを示す。脾臓ＭＮＣは、赤血球溶解緩衝液（「材料と方法」に加えた８．３mg/mL ＮＨ４Ｃｌ、１mg/mL ＫＨＣＯ３、及び３．７２μg/mL ＥＤＴＡ）を用いてＲＢＣを枯渇させた。野生型（ＷＴ）（ｎ＝１４）又はＨ４ＲＫＯマウス（ｎ＝１０）脾臓ＭＮＣをＣＢ（１０μM）と共にプレインキュベートし、次にｆｌｕＡウイルスと共に一晩培養した。 図３は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定して、ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した、ヒスタミン、ＣＢ、ドーパミン、セロトニン及びスペルミジンと共にプレインキュベートし、ＨＩＶで一晩刺激した精製ｐＤＣからのＴＲＡＩＬ及びＩＦＮ－（α、β）のｍＲＮＡレベルを示す。特定していない場合には、示されるデータは、３回の独立した実験の代表値である。Ｐ値（ｐ）は、両側スチューデントｔ検定を用いて決定された。３個の星印の記号（＊＊＊）はＰ＜０．００１を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰ＜０．０１を表し、そして１個の星印の記号（＊）はＰ＜０．０５を表す。 図４Ａ～４Ｃは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定して、ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した、ヒスタミン、及びＣＢと共にプレインキュベートし、Ｆｌｕで一晩刺激したＰＢＭＣからのＩＦＮ－α（図４Ａ）、ＩＦＮ－β（図４Ｂ）及びＩＦＮ－λ２／３（図４Ｃ）のｍＲＮＡレベルを示す。示されるデータは、３回の独立した実験の代表値である。 図４Ａ～４Ｃは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定して、ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した、ヒスタミン、及びＣＢと共にプレインキュベートし、Ｆｌｕで一晩刺激したＰＢＭＣからのＩＦＮ－α（図４Ａ）、ＩＦＮ－β（図４Ｂ）及びＩＦＮ－λ２／３（図４Ｃ）のｍＲＮＡレベルを示す。示されるデータは、３回の独立した実験の代表値である。 図４Ａ～４Ｃは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定して、ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した、ヒスタミン、及びＣＢと共にプレインキュベートし、Ｆｌｕで一晩刺激したＰＢＭＣからのＩＦＮ－α（図４Ａ）、ＩＦＮ－β（図４Ｂ）及びＩＦＮ－λ２／３（図４Ｃ）のｍＲＮＡレベルを示す。示されるデータは、３回の独立した実験の代表値である。 図５Ａ～５Ｃは、Ｘ３１（８００ ＴＣＩＤ５０）を感染させた２９Ｓ８マウスからの、ＥＬＩＳＡにより測定されたＢＡＬ液中のＩＦＮ－α（図５Ａ）、ＩＦＮ－β（図５Ｂ）及びＩＦＮ－λ２／３（図５Ｃ）レベルを示す。ボンフェローニ（Bonferroni）の事後分析を伴う二元配置分散分析により、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰ＜０．０００１を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰ＜０．００１を表し、そして１個の星印の記号（＊）はＰ＜０．０１を表す。 図５Ａ～５Ｃは、Ｘ３１（８００ ＴＣＩＤ５０）を感染させた２９Ｓ８マウスからの、ＥＬＩＳＡにより測定されたＢＡＬ液中のＩＦＮ－α（図５Ａ）、ＩＦＮ－β（図５Ｂ）及びＩＦＮ－λ２／３（図５Ｃ）レベルを示す。ボンフェローニ（Bonferroni）の事後分析を伴う二元配置分散分析により、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰ＜０．０００１を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰ＜０．００１を表し、そして１個の星印の記号（＊）はＰ＜０．０１を表す。 図５Ａ～５Ｃは、Ｘ３１（８００ ＴＣＩＤ５０）を感染させた２９Ｓ８マウスからの、ＥＬＩＳＡにより測定されたＢＡＬ液中のＩＦＮ－α（図５Ａ）、ＩＦＮ－β（図５Ｂ）及びＩＦＮ－λ２／３（図５Ｃ）レベルを示す。ボンフェローニ（Bonferroni）の事後分析を伴う二元配置分散分析により、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰ＜０．０００１を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰ＜０．００１を表し、そして１個の星印の記号（＊）はＰ＜０．０１を表す。 図６は、１２Ｇ５抗体（抗ＣＸＣＲ４）で染色する前に４℃で３０分間、ＣＸＣＬ１２（１００nM）、ＨＡ（１mM）又はＣＢ（１mM）と共にインキュベートしたJurkat細胞からのフローサイトメトリーによるＣＸＣＲ４への化合物固定を示す。 図７は、対照のｆｌｕ曝露ヒトＰＢＭＣにおけるｍＲＮＡ発現レベル（１００％）に対する、１０μM／５０μM ＣＢ又は１０μM／５０μM ＩＴ１ｔの存在下でのｆｌｕ曝露ヒトＰＢＭＣにおけるＴＲＡＩＬ（第１のバー）、ＩＦＮ－α（第２のバー）及びＩＦＮ－β（第３のバー）ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 図８は、クロベンプロピット（ＣＢ）又はモノクローナル抗体１２Ｇ５の非存在下（／）又は存在下でのヒトｐＤＣによるＨＩＶ刺激Ｉ型インターフェロン産生を示す。 図９は、ＩＴ１ｔ、クロベンプロピット（ＣＢ）及びスペルミジンで１時間処理したか又は処理せず、次にＫ５６２細胞株により活性化したＮＫ細胞により発現したＩＦＮ－γ（白いバー）、ＴＮＦ－α（斜線のバー）及びＣＤ１０７ａ（黒いバー）の、フローサイトメトリーで測定された細胞内レベルを示す。 図１０は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定して、ＲＰＬ１３Ａ発現に対して正規化した、ＣＢ、ＩＴ１ｔ又はクロロキンと共にプレインキュベートし、次にＨＩＶ又はリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激した単球からのＩＦＮ－γのｍＲＮＡレベルを示す。 図１１は、試験日数にわたる、ＰＢＳ（黒い四角）、プレドニゾロン（三角）並びにＩＴ１ｔの３mg/kg（mpk）（円）、１０mg/kg（mpk）（菱形）及び３０mg/kg（mpk）（四角）での１日１回腹腔内注射を受けたマウスの関節炎（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）の兆候の平均スコアを示す。 図１２は、試験日数にわたる、ＰＢＳ（黒い四角）、プレドニゾロン（三角）並びにクロベンプロピットの３mg/kg（mpk）（円）、１０mg/kg（mpk）（菱形）及び３０mg/kg（mpk）（四角）での１日１回腹腔内注射を受けたマウスの関節炎（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）の兆候の平均スコアを示す。 図１３は、１４日目（終了日）に測定された、ＰＢＳ（黒いバー）、プレドニゾロン（縦線）並びにＩＴ１ｔの３mg/kg（mpk）（右下がり斜線）、１０mg/kg（mpk）（左下がり斜線）及び３０mg/kg（mpk）（横線）での１日１回腹腔内注射により処置したマウス（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）のＩＬ－βの平均血漿濃度を示す。１個の星印の記号（＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０５を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０１を表し、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．００１を表し、４個の星印の記号（＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０００１を表し、５個の星印の記号（＊＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ＜０．００００１を表す。 図１４は、ＰＢＳ（黒いバー）、プレドニゾロン（縦線）並びにクロベンプロピットの３mg/kg（mpk）（右下がり斜線）、１０mg/kg（mpk）（左下がり斜線）及び３０mg/kg（mpk）（横線）での１日１回腹腔内注射により処置したマウス（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）のＩＬ－βの平均血漿濃度を示す。１個の星印の記号（＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０５を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０１を表し、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．００１を表し、４個の星印の記号（＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０００１を表し、５個の星印の記号（＊＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ＜０．００００１を表す。 図１５は、ＰＢＳ（黒いバー）、プレドニゾロン（縦線）並びにＩＴ１ｔの３mg/kg（mpk）（右下がり斜線）、１０mg/kg（mpk）（左下がり斜線）及び３０mg/kg（mpk）（横線）での１日１回腹腔内注射により処置したマウス（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）のＩＬ－６の平均血漿濃度を示す。１個の星印の記号（＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０５を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０１を表し、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．００１を表し、４個の星印の記号（＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０００１を表し、５個の星印の記号（＊＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ＜０．００００１を表す。 図１６は、ＰＢＳ（黒いバー）、プレドニゾロン（縦線）並びにクロベンプロピットの３mg/kg（mpk）（右下がり斜線）、１０mg/kg（mpk）（左下がり斜線）及び３０mg/kg（mpk）（横線）での１日１回腹腔内注射により処置したマウス（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）のＩＬ－６の平均血漿濃度を示す。１個の星印の記号（＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０５を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０１を表し、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．００１を表し、４個の星印の記号（＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０００１を表し、５個の星印の記号（＊＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ＜０．００００１を表す。 図１７は、ＰＢＳ（黒いバー）、プレドニゾロン（縦線）並びにＩＴ１ｔの３mg/kg（mpk）（右下がり斜線）、１０mg/kg（mpk）（左下がり斜線）及び３０mg/kg（mpk）（横線）での１日１回腹腔内注射により処置したマウス（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）のＴＲＡＩＬの平均血漿濃度を示す。１個の星印の記号（＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０５を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０１を表し、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．００１を表し、４個の星印の記号（＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０００１を表し、５個の星印の記号（＊＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ＜０．００００１を表す。 図１８は、ＰＢＳ（黒いバー）、プレドニゾロン（縦線）並びにクロベンプロピットの３mg/kg（mpk）（右下がり斜線）、１０mg/kg（mpk）（左下がり斜線）及び３０mg/kg（mpk）（横線）での１日１回腹腔内注射により処置したマウス（コラーゲン誘発性関節炎のマウスモデル）のＴＲＡＩＬの平均血漿濃度を示す。１個の星印の記号（＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０５を表し、２個の星印の記号（＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０１を表し、３個の星印の記号（＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．００１を表し、４個の星印の記号（＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ≦０．０００１を表し、５個の星印の記号（＊＊＊＊＊）はＰＢＳに対してｐ＜０．００００１を表す。 図１９は、ビヒクル（ＰＢＳ）（菱形）、陽性対照（プレドニゾロン）（破線を伴う黒い四角）並びにクロベンプロピットにて３mg/kg（三角）、１０mg/kg（点線を伴う黒い四角）及び３０mg/kg（星印）で処置したマウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおけるプリスタン誘発性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデル）の体重（グラム（ｇ））を示す。 図２０は、ビヒクル（ＰＢＳ）（菱形）、陽性対照（プレドニゾロン）（破線を伴う黒い四角）並びにＩＴ１ｔにて３mg/kg（円）、１０mg/kg（点線を伴う黒い四角）及び３０mg/kg（黒い線）で処置したマウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおけるプリスタン誘発性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデル）の体重（グラム（ｇ））を示す。 図２１は、ビヒクル（黒いバー）、プレドニゾロン（点付きのバー）、クロベンプロピットの３mg/kg（右下がり斜線のバー）、１０mg/kg（破線を伴うバー）、３０mg/kg（タイルのバー）、ＩＴ１ｔの３mg/kg（白いタイルを伴う黒いバー）、１０mg/kg（菱形を伴うバー）、３０mg/kg（縦線のバー）で処置したＢａｌｂ／Ｃマウスにおけるプリスタン誘発性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデルのｄｓＤＮＡレベルを示す。
実施例Ｉ
ウイルスで刺激した形質細胞様樹状細胞によるインターフェロン産生の阻害
Ａ．材料と方法
１．血液試料、白血球の単離及び培養。
健常なＨＩＶ－１血清陰性血液バンクドナーから血液を入手した。ヒト血液を用いた実験手順は、欧州連合の指針及びヘルシンキ宣言にしたがって行われた。末梢血白血球分離培地（Cambrex, Gaithersburg, MD）から密度勾配遠心分離法によって単離されたヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いてインビトロ実験を行った。ｐＤＣを、ヒト形質細胞様ＤＣ濃縮キット（StemCell Technologies）を用いたネガティブ選択によって精製した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan, UT）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Invitrogen, Gaithersburg, MD）中で培養した。精製後、得られた純度はｐＤＣについて９１％より高かった。
２．ウイルス刺激及び感染。
ＰＢＭＣを１．１０６細胞／１mLで播種するか、又は精製ｐＤＣを５．１０４細胞／１００μlで播種し、次に以下のウイルスで刺激した：不活化ＡＴ－２ ＨＩＶ－１ＭＮ（ＣＸＣＲ４共受容体特異的）又はＡＴ－２ ＨＩＶ－１ＡＤＡ（ＣＣＲ５共受容体特異的）を６０ng/mL ｐ２４ＣＡ当量で（J.D. Lifson（SAIC-NCI, Frederick, MD）により提供を受けた）、感染性ヒトｆｌｕＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（Ｆｌｕ）、力価１：８１９２を希釈度１：１０００で、又はＤＥＮＶ－２ １６６８１をＭＯＩ１０で。感染性ＨＩＶ－１ＭＮ［組織培養５０％感染量（ＴＣＩＤ５０）＝１０６］及びＨＩＶ－１ＡＤＡ（ＴＣＩＤ５０＝１，０００）を同じ濃度で使用した。ウイルスで一晩刺激した後、精製ｐＤＣをアミノ化合物で１時間前処理した。サイトカイン検出のために上清を集めた。ウイルスを産生するための培養物と釣り合う非感染細胞培養物から単離した微小胞を陰性対照として使用した（モック）。
３．化合物。
ヒスタミン二塩酸塩、クロベンプロピット二臭化水素酸塩、ドーパミン、セロトニン及びスペルミジン（Sigma-Aldrich, MO, USA）を純水中に希釈し、ＩＴｌｔ（R＆D system/Tocris）をＤＭＳＯ中に希釈した。様々なウイルスの刺激の１時間前又は刺激なしに、化合物を１０μM（又は指定されている場合は別の濃度）でｐＤＣ培養物に添加した。ヒスタミンについては、ヒスタミナーゼを回避するためにX-vivo培地（Lonza）を使用した。蛍光化合物ＦＦＮ－５１１及びＦＣ－ＣＯ２ －は、Gubernator et al (2009) Science, 324: 1441-1444 及び Lee et al (2010) Journal of the American Chemical Society, 132: 8828-8830に記載されている手順と同様に合成した。細胞を、ＣＢ又はヒスタミンインキュベーションの前に、ＡＭＤ（２０μM）（Sigma-Aldrich, MO, USA）と１時間プレインキュベートした。ｐＤＣをオリゴジヌクレオチドＡ１５１（ＴＴＡＧＧＧ）ＯＤＮ（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）５mMの存在下で培養した。ヒスタミン受容体アンタゴニスト（Ｈ１Ｒについてはピリラミン／ＰＹＲ、Ｈ２Ｒについてはシメチジン／ＣＩＭ、Ｈ３Ｒについてはチオペラミド／ＴＨＩＯ、Ｈ４ＲについてはＪＮＪ７７７７１２０／ＪＮＪ及びＡ９４３９３１）（Sigma-Aldrich, MO, USA）を１０μMで使用した。
４．Ｈ４Ｒ及びＣＸＣＲ４ノックアウト実験。
ｐＤＣを９６ウェルプレートに１０５細胞／mLで播種し、そして３７℃でインキュベートした。Ｈ４Ｒ及びＣＸＣＲ４低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Smart Pool, Dharmarcon）をＤＯＴＡＰ（Roche Applied Sciences）中に希釈した。混合物を穏やかに混合し、そして室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を１６０nMの最終濃度で培養中の細胞に添加した。最後に、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後、様々なウイルスを一晩添加した。対照はｓｉＲＮＡ対照を用いて行った。
５．フローサイトメトリー。
培養細胞を、適切な抗体であるフィコエリトリン（ＰＥ）結合ＴＲＡＩＬクローンＲＩＫ－２（BD Bioscience, San Jose, CA）、ＡＰＣ結合ＢＤＣＡ－４、ＦＩＴＣ－ＣＤ１２３（Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany）、ＦＩＴＣ－ＨＬＡＤＲ、ＰｅｒｃＰ－ｃｙ５．５－ＣＣＲ７、ＡＰＣ－ＣＤ４０、ＢＶ４２１－ＣＤ８０、ＦＩＴＣ－ＣＤ８６、ＰＥ－ＣＸＣＲ４クローン１２Ｇ５（Biolegend, San Diego, CA）と共に、又は適切なアイソタイプ適合対照抗体（それぞれ５μg/mL）と共に２％マウス血清（Sigma, Saint Louis, MO）及びＦＣ受容体遮断薬（BD Biosciences, San Jose, CA）を含有するＰＢＳ中４℃で２０分間インキュベートした。フローサイトメトリー分析は、フローサイトメトリーDivaソフトウェア（BD Biosciences, San Jose, CA）を使用して、フローサイトメトリーCanto II又はLSR IIフローサイトメーターで行った。FlowJoソフトウェア（Treestar, Ashland, OR）を使用してデータを解析した。
６．サイトカイン検出。
製造業者の取扱説明書にしたがってＥＬＩＳＡ（PBL Assay Science, NJ, USA）により多種類の可溶性ＩＦＮ－αについてｐＤＣの上清を試験した。
７．ＲＴ－ｑＰＣＲ分析。
製造業者の取扱説明書にしたがってRNeasy Microキットを用いて全ＲＮＡを抽出し、DNase処理（Qiagen）に付した。ＲＮＡ濃度及び純度は分光光度法（Biophotometer, Eppendorf）によって評価した。PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect Real Time, Takara）を用いて、ＲＮＡ ５００ngを反応液１０μl中で逆転写した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）上でTakyon ROX SYBR MasterMixブルーｄＴＴＰ（Eurogentec）を使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を二重反復で行った。以下のプログラムを用いて転写物を定量した：９５℃で３分間、続いて９５℃で１５秒間、６０℃で２０秒間及び７２℃で２０秒間を３５サイクル。各転写物の値は、２－ΔΔＣｔ法を用いてＲＰＬ１３Ａ（６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａ）の発現レベルに対して正規化した。リアルタイム定量ＰＣＲによる転写物の定量化に使用したプライマーを以下に示す：
Figure 2022166193000012
８．マウスのインビボ処置。
MRC-National Institute for Medical Research（NIMR）で特定の病原菌を含まない条件下で繁殖させた１２週齢の１２９Ｓ８マウス（Jackson Laboratory）を、クロベンプロピット二臭化水素酸塩（Sigma-Aldrich、Ｃ２０９）（４５０μg/３０μL/マウス）、ヒスタミン二塩酸塩（Sigma-Aldrich、Ｈ７２５０）（４５０μg/３０μL/マウス）又はビヒクル対照（ＰＢＳ）（３０μL/マウス）で感染の１８時間前に処置した。マウスをｆｌｕＡ型ウイルスＸ３１株（Ｈ３Ｎ２）（J. Skehel博士（MRC-NIMR）の好意により提供を受けた）に８００ＴＣＩＤ／３０μLで感染させた。Ｘ３１を１０日孵化鶏卵の尿膜腔内で増殖させ、細菌、マイコプラズマ、及び内毒素の混入がなく、－７０℃で保存し、Spearman-Karber法によりＭＤＣＫ細胞上で力価測定した。全てのマウスを軽いイソフルラン誘発麻酔下で処置し、鼻腔内（ｉ．ｎ）感染させた。感染後３日目にマウスを安楽死させ、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を集めた。ＢＡＬ試料を１，３００rpm、４℃で５分間遠心し、上清を回収した。次に製造業者の取扱説明書にしたがってＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮα（eBioscience）、ＩＦＮβ（Biolegend UK）及びＩＦＮλ（R&D）の濃度について試料を分析した。
９．三次元顕微鏡法。
場合によっては、精製ｐＤＣ細胞を、ＨＩＶ－１の存在下及び様々な化合物（ＣＢ、ＦＦＮ－５１１及びＦＣ－ＣＯ２ －）と共に一晩培養した。ｐＤＣ（１×１０５細胞／スライド）をコラーゲン被覆スライド上に塗布し、そして４％パラホルムアルデヒドで固定した。次に細胞を抗ＣＸＣＲ４抗体（Biolegend, San Diego, CA）と共に、膜染色のために飽和緩衝液ＰＢＳ－ＢＳＡ ０．５％中で、又はモノクローナル抗体の抗ＴＲＡＩＬ（Biolegend, San Diego, CA, USA）と共に１％サポニンを含む浸透化緩衝液中でインキュベートした。ＣＸＣＲ４はロバ抗マウスＩｇＧ－ＡＦ６４７（Molecular Probes, OR, USA）によって明らかになり、ＴＲＡＩＬはロバ抗マウスＩｇＧ－シアニン３（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）によって明らかになった。核をＤＡＰＩ（Molecular Probes, Paisley, UK）を用いて染色した。スライドをFluoromount－G（eBioscience, CA, USA）でマウントし、１００倍Plan Apo VCピエゾ対物レンズ（ＮＡ １．４）及びChromaブロックフィルター（ＥＴ－ＤＡＰＩ、ＥＴ－ＧＦＰ）を使用してNikon Eclipse 90i Upright顕微鏡（Nikon Instruments Europe, Badhoevedorp, The Netherlands）でスキャンし、続いてMeinelアルゴリズム及び８回の反復で畳み込みを解き、Metamorph（登録商標）（MDS Analytical Technologies, Winnersh, UK）を用いて解析した。ＴＲＡＩＬ／ＤＡＰＩ／オーバーレイ／共焦点面：代表的な２Ｄ焦点図。明るいオーバーレイ：明るい。再畳み込みオーバーレイ：Ｚ軸に沿った最大強度ピクセルの２Ｄ投影。
他の場合には、細胞を培地単独で一晩培養し、次に氷冷ＰＢＳ－ＢＳＡ ０．２％中で洗浄し、そして４℃で１時間ＣＸＣＲ４抗体（R&D Systems）で染色した。次に細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ ０．２％で洗浄し、４℃で１時間ＣＢで刺激した。データは、残留表面発現及び細胞内染色についての平均百分率±ＳＥＭ平均チャネル蛍光強度（ＭＦＩ）値として表される。懸濁液中で染色後、ｐＤＣ（１×１０５細胞／スライド）をShandon Cytospin（登録商標）Cytocentrifuge（Thermo Scientific, St-Herblain, France）を用いて４００rpmで１０分間回転させ、４％パラホルムアルデヒドで固定した。次に細胞を膜上又はTriton ０．２％で透過処理した後のいずれかに、二次抗体の抗マウス－ＡＦ６４７（Molecular Probes, OR, USA）で染色した。最後に、スライドをＰＢＳ中で洗浄し、Hoechst 33342で対比染色し、Fluoromount-G培地にマウントした。６３倍 PL APO O.N.=1.4 油浸対物レンズを使用してZeiss LSM 710共焦点顕微鏡で画像をデジタルで取得した。
全ての解析は、ImageJソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて実施された。
１０．画像定量化。
核を囲む各Ｚ切片について各スライドから７枚の写真を撮った。Manderの係数を用いた精製ｐＤＣの細胞質における共局在化の定量化は、ImageJのJACoPプラグインによる解析後に得られた。
１１．ＣＸＣＲ４内部移行。
ＣＸＣＲ４との相互作用。ＣＸＣＲ４へのＣＢ及びヒスタミンの結合は、抗ヒトＣＸＣＲ４抗体を用いてJurkat細胞のフローサイトメトリー分析（FACSCantoII; Becton Dickinson）によって評価した。簡単に述べると、Jurkat細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ－１％ ＦＣＳ）中、４℃で３０分間、ＣＢ、ヒスタミン（１，０００μM）又は緩衝液と共にプレインキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次にＰＥ標識抗ヒトＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５（Pharmingen）で４℃で３０分間染色した。洗浄後、細胞を４℃で５分間、ＦＡＣＳ緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで固定した。サイトメーター（FACSCantoII, Becton-Dickinson）上でフローサイトメトリー分析（試料当たり１０，０００細胞）によりＣＸＣＲ４染色を定量した。データはFACSDivaソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて処理した。全ての値は、三重反復実験からの緩衝液処理細胞中のＣＸＣＲ４レベル（１００％）に対する細胞の平均蛍光強度±ＳＤを表す。GraphPad Prism Version 5.03を使用して、両側対応のあるスチューデントｔ検定で統計計算を行った。ｐ＜０．０５を有意と見なした。
ＣＸＣＲ４の内部移行。抗ヒトＣＸＣＲ４抗体を用いてJurkat細胞のフローサイトメトリー分析によりＣＸＣＲ４の内部移行を評価した。簡単に述べると、Jurkat細胞を、無血清培地中、３７℃で３０分間、ＣＢ（１０μM）、ＣＸＣＬ１２（２５０nM）又は緩衝液と共にプレインキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離によりＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次に４℃で３０分間、ＰＥ標識抗ヒトＣＸＣＲ４抗体（1D9, BD Pharmingen）で連続染色した。洗浄後、細胞を４℃で５分間、ＦＡＣＳ緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＣＸＣＲ４発現は、サイトメーターでのフローサイトメトリー分析（試料当たり１０，０００細胞）によって定量した。データはFACSDivaソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて処理した。全ての値は、三重反復実験からの緩衝液処理細胞におけるＣＸＣＲ４発現（１００％）に対する細胞の平均蛍光強度±ＳＤを表す。GraphPad Prism Version 5.03を使用して、両側対応のあるスチューデントｔ検定で統計計算を行った。ｐ＜０．０５を有意と見なした。
１２．種々のリガンドとのＣＸＣＲ４の分子モデリング。
分子ドッキングプログラムcDOCKERを自動分子ドッキングシミュレーションに使用して、種々のスコア関数を使用してポーズをランク付けした：Jain、cDocker Interaction Optimized、Ludi。ＰＤＢファイルを、Discovery Studio 4.1のタンパク質調製プロトコールを用いてクリーンにし、膜をIm.Wアルゴリズムにより添加した。リガンド及びその配座異性体は、配座生成後にリガンド調製プロトコールを用いて調製した。複合体は、スコア関数の妥協と同様に、幾何学的マッチング品質と組合せた相互作用エネルギーの基準に基づいて選択された。図は、Discovery Studio 4.1グラフィックシステムで生成された。Discovery Studioの分子構造相互作用の２Ｄ表現は、リガンドとＣＸＣＲ４との間の詳細な相互作用の描写に使用された（ＰＤＢコード：３ＯＤＵ）。ファンデルワールス比が０．７であれば相互作用は疎水性相互作用と考えられ、それが列挙されたドナーとアクセプターとの間であって、かつ水素結合を囲む原子によって形成される角度と距離がデフォルト基準内にあれば水素結合と考えられた。ＲＭＳＤは、Discovery studio 4.1を使用し、基準としてＣＸＣＲ４／ＩＴ１ｔ共結晶中のＩＴ１ｔを用いて計算した（ＰＤＢコード：３ＯＤＵ）。
１３．統計解析。
Ｐ値（Ｐ）は両側スチューデントｔ検定を使用して決定された。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意と見なした。＊＝Ｐ＜０．０５；＊＊＝Ｐ＜０．０１；そして＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。フローサイトメトリーデータの単変量分布は、FlowJoソフトウェアを使用して３００ビンで確率ビニング（binning）によって行った。
マウスのデータについては、データは平均±標準誤差として示した。試料の大きさは、動物の使用を最小限に抑えながら、統計的な検出力が得られるように設計された。データセットをボンフェローニ事後分析を伴う二元配置分散分析によって分析した（サイトカイン濃度の経時変化）。GraphPad Prism 5（GraphPad Software, San Diego, CA）を、データ解析及び全てのグラフの作成に使用した。０．０１未満のＰ値を統計的に有意であると見なした。
Ｂ．結果
１．ヒスタミン及びクロベンプロピットはＨＩＶ誘発ｐＤＣ活性化を阻害する。
ＨＩＶ－１によるｐＤＣ活性化に及ぼすヒスタミンの効果が調べられた。用量範囲分析は、明らかな毒性なしにヒスタミンが精製ｐＤＣに対して１０μMで活性であることを示した。Ｈ４Ｒアゴニストのクロベンプロピット（ＣＢ）の効果が試験された。ＣＢは、ヒスタミンよりも強い阻害効果を示し、そしてＨＩＶ刺激後に分泌されるＩＦＮ－αのレベルを約９０％減少させた（図１）。ＣＢは１０μMの濃度で細胞傷害効果を示さなかった。次に、ＩＦＮ－α産生速度論を評価して、ＣＢが９時間のインキュベーション後にＨＩＶ刺激ｐＤＣによるＩＦＮ－α産生を阻害することが判った。ＣＢ阻害効果をＴＬＲ－７アンタゴニストのＡ１５１と比較したところ、両方の分子が同様に活性であることを示すことができた。相対的ＴＲＡＩＬ ｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって評価して、これらの結果を確認した。ＣＢはまた、Ｆｌｕ及びデング熱ウイルスと共に培養したｐＤＣによるＩＦＮ－α産生及び膜ＴＲＡＩＬ発現を強く阻害したが、このことはＣＢの効果がＨＩＶに限定されないことを実証した。
次に、内因性及び合成アミンを、ヒトＦｌｕ活性化初代ＰＢＭＣ上のＩ型ＩＦＮ産生及びＴＲＡＩＬ発現に関して５．１０－７～１０－３Mの範囲で試験した。更に、幾つかの濃度のアミンの下での細胞生存率が同時に検討された。大部分の分子についてアミン最適効果が１０－５～５．１０－５Mの間で観察されたことが示された。濃度が高いほど、高レベルの細胞死を誘導した（表１）。
Figure 2022166193000013
２．ヒスタミン受容体はｐＤＣの阻害に関与していない。
ＣＢの活性がヒスタミン受容体に依存するかどうかが試験された。様々なヒスタミン受容体アンタゴニストの存在下でのＣＢを、Ｆｌｕ刺激ｐＤＣに対して１０μMで評価した（Ｈ１Ｒについてはピリラミン／ＰＹＲ、Ｈ２Ｒについてはシメチジン／ＣＩＭ、Ｈ３Ｒについてはチオペラミド／ＴＨＩＯ、及びＨ４ＲについてはＪＮＪ７７７７１２０／ＪＮＪ又はＡ９４３９３１化合物）。これらのアンタゴニストのいずれもが、ＣＢにより引き起こされるＩＦＮ－α産生の阻害を逆転させないことが見い出された。これらの結果を確認するために、野生型（ＷＴ）又はＨ４Ｒノックアウト（ＫＯ）マウスから単離されたｐＤＣのウイルス活性化についてＣＢ及びヒスタミンを分析した。これらの実験では、Ｆｌｕを用いて細胞を刺激した。
実際、マウスｐＤＣは、ｐＤＣの認識及び活性化に必須であるＨＩＶ共受容体ＣＤ４を発現しないため、ＨＩＶは、マウスｐＤＣにおいてＩ型ＩＦＮ又はＴＲＡＩＬ発現を誘導することができない。ＣＢは、野生型マウスおよびＨ４Ｒ ＫＯマウスの両方からのＦｌｕ刺激ｐＤＣによるＩＦＮ －α産生を阻害した（図２）。次に、ｓｉＲＮＡによってヒト初代ｐＤＣにおいてＨ４Ｒを発現停止させ、次にヒスタミン及びＣＢの効果を決定した。本発明者らは、Ｈ４Ｒノックダウンが、ＨＩＶ刺激ｐＤＣによるＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及びＴＲＡＩＬ産生に及ぼすヒスタミンの阻害活性もＣＢの阻害活性をも遮断しないことを見い出した。よって、Ｈ４Ｒは、ヒスタミン又はＣＢによるｐＤＣ調節のモデルには関与していないことから、別のメカニズムが示唆される。よって、アミンが一般にｐＤＣ活性化に対して阻害効果を示すかどうかが検討され、そして天然アミンのドーパミン、セロトニン及びスペルミジンが分析された。全てのアミンは、ＨＩＶが介在する膜ＴＲＡＩＬ及びＨＬＡＤＲを阻害し、更にはＨＩＶ刺激ｐＤＣによるＣＣＲ７、ＣＤ４０、ＣＤ８６及びＣＤ８０発現のような遊走及び成熟マーカー、またＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ－α／β ｍＲＮＡをも阻害した（図３）。特に、これらの分子はいずれも使用濃度において細胞傷害性ではなかった。ヒト初代ｐＤＣ培養物への様々なアミン単独も試験した。陽性対照として、ｐＤＣによるサイトカイン産生を刺激するためにＨＩＶを使用した。膜ＴＲＡＩＬ及びＨＬＡＤＲ、更にはＣＣＲ７、ＣＤ４０、ＣＤ８６及びＣＤ８０発現のような遊走及び成熟マーカーは、アミンによって影響を受けなかった。ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及びＴＲＡＩＬのｍＲＮＡ発現をＲＴ－ＰＣＲによって定量したところ、試験したアミンのいずれもがＩ型ＩＦＮ産生に対して単独では効果がないことが示された。
３．ヒスタミン及びクロベンプロピットはＰＢＭＣ及び１２９Ｓ８マウスにおけるＦｌｕ誘発性のインターフェロン産生を阻害する。
ｆｌｕ曝露ヒトＰＢＭＣに及ぼすＣＢ及びヒスタミンの効果が最初に試験された。細胞をＦｌｕ曝露前にヒスタミン又はＣＢで前処理した場合、ＩＦＮ－α／β及びＩＦＮ－λ２／３ ｍＲＮＡレベルは有意に減少し、アミンが種々の免疫細胞集団を含む混合培養系において阻害活性を有することが立証された（図４Ａ～４Ｃ）。次に、アミンがインビボで抗ウイルス性サイトカイン応答に対して阻害活性を示すかどうかを調べた。本発明者らは、Ｘ３１ Ｆｌｕ株に感染させたか、又はビヒクル対照を接種した１２週齢の１２９Ｓ８マウスにおいて、ヒスタミン及びＣＢがどのようにＩＦＮ産生に影響を及ぼすかを決定した。インフルエンザ感染の３日目に、ＣＢで前処置したマウスは、未処置Ｆｌｕ感染マウスと比較して、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中のＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及びＩＦＮ－λ２／３タンパク質産生の大幅な減少を示した（図５Ａ～５Ｃ）。インフルエンザ感染の前にマウスをヒスタミンで処置した場合、統計学的に有意ではないＩＦＮ減少の傾向が見られた。この結果は、ヒスタミンが天然のアミンであり、したがって血清中に見い出されるヒスタミナーゼによって分解されるという事実によって説明され得る。
４．アンモニウム基（ＮＨ３ ＋）はｐＤＣ活性化を阻害するのに重要である。
ｐＤＣ活性化に対するアミンの役割を更に検討するために、セロトニンの蛍光アミン模倣物であるＦＦＮ－５１１を合成した。この化合物は、顕微鏡検査及びフローサイトメトリー分析を可能にするアンモニウム基（ＮＨ３ ＋）及び蛍光クマリンコアを含有する。ＦＦＮ－５１１（５０μM）は、何ら明らかな細胞傷害作用なしにＨＩＶ刺激ｐＤＣによるＩ型ＩＦＮ産生を大幅に減少させた。ＮＨ３ ＋官能基の役割を更に調べるために、ＦＦＮ－５１１の負に荷電した類似体、ＦＣ－ＣＯ２ －を合成したが、ここではアンモニウム基（ＮＨ３ ＋）をカルボン酸（ＣＯ２ －）残基により置き換えた。アミンＦＦＮ－５１１及びその類似体ＦＣ－ＣＯ２ －の効果を、ＲＴ－ｑＰＣＲプロファイリングアッセイを用いて、一連の活性化マーカーに対して調べた。ウイルス曝露後に通常活性化される一連の遺伝子を選択した：ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－λ１及びＩＦＮ－λ２／３）、インターロイキン（ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０及びＩＬ１５）、ケモカイン（ＣＸＣＬ１０）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及び初期ＩＳＧ（ＩＳＧ５６）。各転写物についての値は、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）の発現レベルに対して正規化した。全てのウイルス誘導遺伝子は、ＨＩＶ－１によってｐＤＣにおいて誘導され、それらの転写は、ＣＢ及びＦＦＮ－５１１によって劇的に阻害されたが、ＦＣ－ＣＯ２ －によっては阻害されなかった。しかし、ＣＢもＦＦＮ－５１１もｉＮＯＳ又はＩＬ－１５遺伝子発現には影響を及ぼさないため、細胞内遺伝子転写に対する全体的な効果よりもむしろウイルス誘導性遺伝子発現の特異的阻害が示唆される。
５．合成及び天然アミンはＨＩＶ刺激ｐＤＣの膜におけるＴＲＡＩＬ再局在化を阻害する。
ウイルス曝露は、細胞質から細胞膜へのＴＲＡＩＬの再局在化をもたらす。よって、３次元（３Ｄ）顕微鏡法を用いて、アミンがこのプロセスに影響を及ぼすかどうかが調べられた。予想どおり、ＴＲＡＩＬは非活性化ｐＤＣにおいて大部分はサイトゾルに局在していたが、ＨＩＶ刺激により原形質膜で検出可能になった。ＣＢ及びＦＦＮ－５１１は、ＨＩＶ刺激ｐＤＣにおいて細胞膜へのＴＲＡＩＬ局在化を有意に阻害したが、ＦＣ－ＣＯ２ －は阻害しなかった。膜ＴＲＡＩＬの画像定量化を行い、フローサイトメトリーの結果によって検証した。したがって、ＨＩＶ－１曝露により、アミンはＴＲＡＩＬの細胞内プールの表面へのアクセスを妨げ、よってＨＩＶ活性化ｐＤＣ１０のプロキラー活性を阻害する。
６．ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４はｐＤＣに対するアミンの阻害作用に必要である。
ＨＡ及びＣＢがＴ細胞へのＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５の結合を阻害することが見い出され（図６）、よってアミンとＣＸＣＲ４との直接相互作用が確認された。更には、ＣＸＣＲ４の細胞内レベル及び／又は細胞外レベルを、透過化及び非透過化ｐＤＣを受容体特異的抗体で染色することによって評価した。細胞をＣＢとインキュベートした場合、未処理細胞と比較して、ＣＸＣＲ４の大部分が細胞内で検出された。更に、抗ヒトＣＸＣＲ４抗体クローン１Ｄ９３１を用いて、Jurkat Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析によってもＣＸＣＲ４の内部移行を評価した。ＣＸＣＲ４とアミンとの相互作用を可視化するために、ＦＦＮ－５１１の蛍光特性を利用した。ｐＤＣの共焦点顕微鏡検査は、ＦＦＮ－５１１とＣＸＣＲ４との強度の共局在化を実証した。化合物がＣＸＣＲ４を内部移行できたことが示されたため、ｐＤＣ活性化に対するＣＸＣＲ４天然リガンド、ＣＸＣＬ１２の効果を検討した。精製ｐＤＣを様々な時点（１５分、３０分、６０分）のＣＸＣＬ１２（６２．５nM）でプレインキュベートした。プレインキュベーションの時間にかかわらず、ＣＸＣＬ１２は、ＨＩＶ刺激ｐＤＣによるＩＦＮ－α／β ｍＲＮＡ発現を減少させなかったことが見い出された。これらの驚くべき結果を確認するために、アミンに使用した濃度（１０μM）でＣＸＣＬ１２を使用したが、この濃度でもＣＸＣＬ１２はＩ型ＩＦＮ ｍＲＮＡ発現を阻害しなかった。よって本発明者らは、ＣＸＣＬ１２がアミンとして作用せず、ヒトｐＤＣのウイルス活性化を阻害することができないことを証明した。次に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてＣＸＣＲ４をｐＤＣ中で発現停止させた。ＣＸＣＲ４遺伝子サイレンシングは、ＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶ－１によって刺激されたｐＤＣにおいて、Ｉ型ＩＦＮ及びＴＲＡＩＬに対するヒスタミン又はＣＢの阻害効果を抑制した。ＣＸＣＲ４はＨＩＶ－１によるｐＤＣ活性化には必要でないことに注意すべきである。所見を一般化するために、ＣＸＣＲ４サイレンシングはまた、ＣＣＲ５指向性（Ｒ５）ＨＩＶ－１及びＦｌｕによって活性化されたｐＤＣに対するＣＢの阻害効果も遮断することが確認された。よってアミンは、ＣＸＣＲ４の会合によってｐＤＣにおけるウイルス感知を阻害する。
７．ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン上のアミンの結合ポケットの同定。
アミンとＣＸＣＲ４との分子間相互作用を更に理解するために、インシリコドッキング実験を行った。ＩＴ１ｔを分子モデリングプロトコールを検証するための内部標準として使用した。よってＩＴ１ｔ及び化合物はＣＸＣＲ４のＩＴ１ｔ結合ポケットにドッキングした。最初に、ＩＴ１ｔが結晶構造と比較して適切に置き換えられたことが確認された。実際、結晶構造で分解されたＩＴ１ｔ重原子（ＰＤＢコード ３ＯＤＵ）及びスコアリング後のＩＴ１ｔドッキングポーズのＲＭＳＤは、約１Åである（３ＯＤＵ共結晶中のＩＴ１ｔを他の共結晶構造（ＰＤＢコード ３ＯＥ６－３ＯＥ８－３ＯＥ９）と比較した場合に観測される変動と同等）（表２）。
Figure 2022166193000014
ヒスタミン、ＣＢ、及びＦＦＮ－５１１の種々の配座異性体をＣＸＣＲ４にドッキングし、そして複合体を最小化して最適モデルを確立した。
２Ｄ表現は、リガンドとＣＸＣＲ４との間の詳細な相互作用の描写に使用された。このモデルでは、試験した全てのリガンドが、ＩＴ１ｔと同じ細胞外ポケット内でＣＸＣＲ４と、及び以前に特性決定された重要な残基と相互作用している可能性があった（表３）。
Figure 2022166193000015
ポーズをスコア付けし、化合物をその特性に応じて分類した。高いスコアは、ポケット内の種々の残基との強い相互作用を示す。予想どおり、ＦＣ－ＣＯ２ －は最低のスコアを示したが、これは、化合物とＣＸＣＲ４の結合部位との間の弱い相互作用を示している。更に、化合物のインシリコスコアはその実験的効力と直接相関があった。ＣＸＣＲ４中のアミンの推定結合部位はＩＴ１ｔの結合ポケットと重なり合うため、ＩＴ１ｔがウイルス曝露ｐＤＣによるＩ型ＩＦＮ及びＴＲＡＩＬ産生を阻害できるかどうかが検討された。
８．ＩＴ１ｔはヒトｐＤＣ又はＰＢＭＣにおけるＨＩＶ又はｆｌｕ誘発性のインターフェロン発現を阻害する
ヒトｐＤＣをＩＴ１ｔと共に１時間培養した後、ＨＩＶ Ｘ４に曝露した。ＩＴ１ｔがＨＩＶ刺激ｐＤＣによるＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β及びＴＲＡＩＬ発現を阻害することが見い出された。活性化ｐＤＣのサイトカイン産生に及ぼすＣＢ及びＩＴ１ｔの効果を比較することによって、ＣＢよりも強いＩＴ１ｔの効果が示された。ｆｌｕ曝露ヒトＰＢＭＣについても同様の結果が得られた（図７）。
ＩＴ１ｔは効率的な濃度では毒性がなかったが、恐らくそれを希釈したＤＭＳＯのせいで、もっと高い濃度では幾らかの毒性を示した。更に、ＩＴ１ｔ活性にはＣＸＣＲ４会合が介在していることを実証するために、ヒトｐＤＣにおけるＣＸＣＲ４ ＲＮＡサイレンシングを行った。これらの条件において、ＩＴ１ｔは、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲ）をトランスフェクトした細胞においてＩ型ＩＦＮを減少させたが、ＨＩＶ Ｘ４又はＨＩＶ Ｒ５で刺激されたＣＸＣＲ４ ｓｉＲＮＡ処理細胞においてその生物学的活性を失ったことが示された。よって、ＩＴ１ｔは、内因性アミンと同様に、ＣＸＣＲ４会合を通してＩ型ＩＦＮを阻害した。
次に周知のＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００がＨＩＶ刺激ｐＤＣ上のインターフェロン産生を阻害できるかどうかを評価した。興味深いことに、ＡＭＤ３１００単独ではＨＩＶ活性化ｐＤＣによるＩ型ＩＦＮ発現もＴＲＡＩＬ発現も遮断しないことが確認され、ＩＴ１ｔ及び他のアミンとは異なる作用機序が示唆された。次にＡＭＤ３１００がＩＴ１ｔポケットのアクセスを制限することによってアミン作用を遮断することができるかどうかを試験した。実際、ＡＭＤ－３１００結合部位は、同定されたアミン結合ポケットと重なり合っていた。ＴＲＡＩＬ、ＩＦＮ－α及びＩＦＮ－βの発現もまた、ＡＭＤ３１００で処理されたか、されていないｐＤＣにおいて定量された。精製細胞をＡＭＤ３１００と共に１時間プレインキュベートし、次にヒスタミン又はＣＢと１時間インキュベートし、最後に一晩ＨＩＶ－１に曝露した。ＡＭＤ３１００は、ＨＩＶ活性化ｐＤＣに対するヒスタミン及びＣＢの生物学的活性を劇的に無効化した。実際、ＡＭＤ３１００処理は、ＨＩＶ活性化ｐＤＣにおけるヒスタミン又はＣＢによって阻害された、Ｉ型ＩＦＮ ｍＲＮＡ及びタンパク質、並びにＴＲＡＩＬ産生を回復させることができた。これらの結果は、一連のｐＤＣサイトカイン分泌（ＩＦＮ－γ及びＩＬ６）及びＩＳＧ（ＩＳＧ５６）で確認された。まとめると、これらの結果は、ＣＸＣＲ４が、ｐＤＣ活性化に及ぼすアミンの阻害活性に必要であることを明確に実証している。
９．Ｍａｂ １２Ｇ５は、Ｉ型インターフェロンのＨＩＶ誘発性産生を阻害する。
本発明者らは、１２Ｇ５モノクローナル抗体がＩＦＮ－Ｉ産生を阻害することを示すことができた（図８）。
１０．ＮＫ細胞によるＩＦＮ－II分泌はアミンによって阻害される
ＩＴ１ｔ、クロベンプロピット（ＣＢ）及びスペルミンの非存在下又は存在下でのＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＣＤ１０７ａの発現レベルをフローサイトメトリーによって測定した（図９）。
よって本発明者らは、ＩＴ１ｔ、クロベンプロピット（ＣＢ）及びスペルミンが、Ｋ５６２細胞によって活性化されたＮＫ細胞によるＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＣＤ１０７ａの発現を低下させることを示すことができた。
１１．単球によるＩＦＮ－II分泌はアミンによって阻害される
ＨＩＶ及びＬＰＳによって活性化される前に、単球をクロベンプロピット（ＣＢ）、ＩＴ１ｔ又はクロロキンと共にプレインキュベートした。ＩＦＮ－γレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって測定し、ＲＰＬ１３Ａ ｍＲＮＡ発現に対して正規化した。
よって図１０は、クロベンプロピット（ＣＢ）、ＩＴ１ｔ及びクロロキンが、ＨＩＶ又はＬＰＳ刺激単球によるＩＦＮ－γ発現を阻害することを示す。
実施例II
ＤＢＡ１／Ｊマウスでの治療用コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける試験化合物の抗関節炎有効性
Ａ．材料と方法
１．動物
ＤＢＡ１／Ｊマウス（オス、７～８週齢）８０頭を受け取り、毎日検査しながら３日間隔離した。個体識別用にマウスに耳標を付ける。
２．プロトコール
脱イオン水１６０mlに氷酢酸０．１mlを加えることにより、０．０１M酢酸を調製する。
４～８℃で一晩撹拌しながら０．０１M酢酸に４mg/mlで溶解することにより、ウシII型コラーゲン溶液を調製する。
－１日目：コラーゲン溶液と完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（結核菌Ｈ３７Ｒａ懸濁液：４mg/ml）との１：１容量比の組合せを乳化することにより免疫原を調製する。
０日目：マウスの個別体重を記録した。後足蹠の厚さをデジタルノギスで記録した。２５Ｇ針を装着した１mlシリンジを用いて、マウス８０頭の皮下にコラーゲン／ＣＦＡエマルション（０．０５ml/マウス；１００μg/マウスのＣＦＡ中コラーゲン）を注射した。マウスをケージに戻した。
２０日目：４～８℃で一晩撹拌しながら０．０１M酢酸に４mg/mlで溶解することにより、II型ウシコラーゲンを調製する。
２１日目：マウス８０頭をコラーゲン／ＩＣＦＡエマルションで追加免疫した。次にこれらの個別体重を記録した。
コラーゲン溶液と不完全フロイントアジュバント（ＩＣＦＡ）との１：１容量比の組合せを乳化（ホモジナイザー）することにより免疫原を調製する。
２５Ｇ針を装着した１mlシリンジを用いて、免疫原（０．０５０ml/マウス；１００μg/マウスのＩＣＦＡ中コラーゲン）を皮下注射する。次にマウスをケージに戻した。
２８日目：治療的投薬群への割り当てのためのマウスの選択。
この選択は、動物において関節炎がどのように発症したかに応じて、２８日目より数日早く又は遅く行われた。

関節炎の兆候についてマウスにスコア付けした。
１）各足蹠にスコアを付ける
２）０＝関節炎の目に見える影響なし
３）１＝１指の浮腫及び／又は紅斑
４）２＝２指の浮腫及び／又は紅斑
５）３＝２指を超える浮腫及び／又は紅斑
６）４＝足蹠及び指全体の重度の関節炎
７）個別の足蹠スコアを加算することにより関節炎指数（ＡＩ）を計算して記録する。
８）最大ＡＩ＝１６
２～６の範囲内のＡＩスコアを有するマウスを、表４におけるように治療的投薬群への割り当てのために選択した。
各群がほぼ同じ群平均ＡＩを有するように、選択されたマウス（コラーゲンで免疫された合計１００頭から）を８群に割り当てた（Ｎ＝８）。
表４にしたがって１日１回（ＱＤ）腹腔内（ＩＰ）投与を開始する。
化合物クロベンプロピット（ＣＢ）及びＩＴ１ｔを試験した。ＣＢ及びＩＴ１ｔを４℃で保存した。処置の前にＰＢＳに溶解することにより化合物を新たに調製した（両方の化合物について溶解度は水中で＞５０mg/mlである）。これらの化合物は、１４日間毎日１週間に７日（土曜日と日曜日を含む）投与された。
Figure 2022166193000016
２８～４２日目：マウスを秤量し、兆候又は関節炎についてスコアを付け、そして後足蹠厚さを週３回（月曜日、水曜日及び金曜日）デジタルノギスにより測定する。治療に対して副作用が出たら記録した。
終了：各肢についてＡＩスコアを記録した。後肢の足蹠厚さをデジタルノギスで測定する。マウスを麻酔し、そして予冷したＥＤＴＡチューブに放血させた。
１）血液を処理して血漿にし、これを４本のラベルを付けたエッペンドルフチューブに－８０℃で保存した。
２）血漿をＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＲＡＩＬについてＥＬＩＳＡによりアッセイした。
次に、全四肢を集めた。
１）切除後、存在しうる組織病変のために四肢を１０％中性緩衝ホルマリン中で個別に固定した。
Ｂ．結果
ＩＴ１ｔの腹腔内注射による毎日の治療的処置（図１１及び図１３）は、疾患の兆候、並びにＩＬ－１β及びＩＬ－６の血漿濃度の有意な用量依存的減少をもたらした。ＴＲＡＩＬは用量にかかわらず有意に阻害された。
クロベンプロピットの毎日の腹腔内注射による治療的処置（図１２及び図１４）は、疾患の兆候、並びにＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＲＡＩＬの血漿濃度の有意な用量依存的減少をもたらした（図１８）。
１．疾患の発症
動物が疾患を発症したとき、投薬計画の開始に先だって、それぞれ２～４の範囲のＡＩ及び２．６の平均群ＡＩを有するマウス８頭の処置群に分類された。恐らく動物が四肢全てよりも後肢だけで立っている時間が長いという事実のため、疾患は後肢で最初に発症するように見えた。ＰＢＳを毎日１回腹腔内注射する（群１）と、４２日目（投与１４日目）に１３．１のＡＩが得られた。試験終了時に、罹患マウスは２５pg/mlのＩＬ－１β、１５６pg/mlのＩＬ－６、及び３２８pg/mlのＴＲＡＩＬという血漿レベルを有していた。
２．プレドニゾロンによる治療的処置（群２）
２８日目に開始する３mg/kg プレドニゾロンの毎日の腹腔内注射は、４２日目に疾患の重症度の８２％の阻害が得られる疾患進行の即時停止をもたらした（平均ＡＩ＝２．４）。この試験の陽性対照として、この処置計画はＩＬ－１β（６２％）、ＩＬ－６（７９％）、及びＴＲＡＩＬ（７２％）の血漿レベルを有意に減少させた（図１７）。
３．ＩＴ１ｔによる治療的処置（群３～５）
ＩＴ１ｔの毎日の腹腔内注射は、疾患進行の用量依存的な阻害をもたらした。最低用量（３mg/kg、群３）では、試験終了時の肉眼的疾患スコア（平均ＡＩ＝１３．１）に改善効果は観察されなかった。しかしながら、この処置計画は、ＩＬ－１β（４９％）（図１３）及びＴＲＡＩＬ（６２％）（図１７）の最終血漿濃度の有意な減少をもたらした。
中間用量（１０mg/kg、群４）では、疾患の進行速度は減衰し、試験終了時に疾患の重症度の有意な４０％減少が得られた（平均ＡＩ＝７．９）。この処置計画はまた、ＩＬ－１β（５３％）（図１３）、ＩＬ－６（３０％）（図１５）、及びＴＲＡＩＬ（４６％）（図１８）の最終血漿濃度の有意な減少をもたらした。
最高用量（３０mg/kg、群５）では、疾患の進行速度は大幅に低下し、最終疾患重症度の有意な６３％減少が得られた（ＡＩ＝４．９）。この処置計画はまた、ＩＬ－１β（６９％）（図１３）、ＩＬ－６（６６％）（図１５）、及びＴＲＡＩＬ（５１％）（図１８）の最終血漿濃度の有意な減少をもたらした。
４．クロベンプロピットによる治療的処置（群６～８）
クロベンプロピットの毎日の腹腔内注射は、疾患進行の用量依存的な阻害をもたらした。最低用量（３mg/kg、群６）では、疾患の進行速度の緩やかな減少が観察され、試験終了時に疾患重症度の有意な２５％阻害が得られた（平均ＡＩ＝９．８）。この処置計画はまた、ＩＬ－１β（６４％）（図１４）及びＩＬ－６（４９％）（図１６）の最終血漿濃度の有意な減少をもたらした。この処置計画はまた、ＴＲＡＩＬの最終血漿濃度にも影響を及ぼした（図１８）。
中間用量（１０mg/kg、群７）では、疾患の進行速度は大幅に低下し、試験終了時に疾患重症度の有意な６６％減少が得られた（平均ＡＩ＝４．４）。この処置計画はまた、ＩＬ－１β（７５％）（図１４）及びＩＬ－６（８０％）（図１６）の最終血漿濃度の有意な減少をもたらした。この処置計画はまた、ＴＲＡＩＬの最終血漿濃度にも影響を及ぼした（図１８）。
最高用量（３０mg/kg、群８）では、処置の開始により疾患の兆候を直ちに逆転させたため、試験終了時には疾患重症度の有意な８７％減少が記録された（ＡＩ＝１．８）。この処置計画はまた、ＩＬ－１β（８２％）（図１４）、ＩＬ－６（８２％）（図１６）、及びＴＲＡＩＬ（図１８）の最終血漿濃度の有意な減少をもたらした。
実施例III
プリスタン（Pristane）誘発性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデルにおける化合物クロベンプロピット及びＩＴ１ｔの抗炎症有効性
Ａ．材料と方法
１．動物
メスのＢａｌｂ／Ｃ（２０～２５ｇ）マウス７０頭を受け取り隔離（ＳＯＰ ５６０）して、オートクレーブ処理した寝わらを備えたフィルター付きのケージに収容する。
７２時間の隔離期間中に１日１回マウスを検査し、臨床的苦痛、疾患又は損傷の兆候があれば記録する。兆候を示さない動物を試験に受け入れる。
受け入れた動物は日常的な維持管理に移され、１ケージ当たり８頭収容される。処置群はケージカードによって識別される。
動物を秤量し、個体識別用に耳標を付け、そして動物各８頭の８処置群及び動物３頭の２群（生存の３０mg/kgでの予備耐性試験用）に無作為に割り当てる。
プリスタンの腹腔内注射によるＳＬＥの誘発及び化合物による処置計画を表５に示す。
２．試験化合物
試験項目化合物のクロベンプロピット（ＣＢ）及びＩＴ１ｔは４℃で保存される。化合物はＰＢＳ（ビヒクル）に溶解することにより処置前に新たに調製される（両方の化合物について溶解度はＰＢＳ中で＞５０mg/mlである）。
Figure 2022166193000017
３．モニタリング／測定パラメータ
マウスの体重を週に２回記録し、そして臨床的兆候について毎日観察する。
血清収集：
群１～８：投与前及び４週目
収集された血清は、４、８及び１０週目に自己抗体を測定するために－８０℃で保存される（使用可能性のために投与前血清は－８０℃で保持される）。抗ｄｓＤＮＡレベルは、ＳＬＥモデルにおける試験化合物の有効性を同定するための標準的なスクリーニングの読み値である。
測定：４、８、１０週目：（１）ＥＬＩＳＡによる自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ）、コラーゲン及びサイトカインのＴＮＦα、ＩＬ－６及びＴＲＡＩＬ、並びに（２）ＩＦＡによるＡＮＡ抗体。
終了（１０週目）：全てのマウスを麻酔し（ＳＯＰ１８１０）そして放血させる（ＳＯＰ１６８７）。血液を収集し、処理して血清にし（ＳＯＰ６００１）、そして自己抗体、コラーゲン及びサイトカインの測定のために－８０℃で保存する。
脾臓と腎臓の摘出：脾臓と腎臓を摘出し、使用可能性のために１０％中性緩衝ホルマリン中で固定する。
４．結果
ＣＢ（図１９）及びＩＴ１ｔ（図２０）で処置されたマウスは、投与開始日と比較して、試験中に体重の減少を示さない。この結果は、試験化合物が体重減少に関して毒性がないこと；そして長期処置に使用できる見込みがあることを示している。更に、観察により、ＣＢ及びＩＴ１ｔが処置マウスにおけるプリスタン誘発性全身性エリテマトーデスの症状を軽減させることが示される。実際、群１（ビヒクル）と比較して試験化合物（ＣＢ、ＩＴ１ｔ）ではｄｓ－ＤＮＡレベルの阻害がある（図２１）。

Claims (16)

  1. 個体におけるインターフェロン（ＩＦＮ）レベルを低下させるのに使用するためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）。
  2. １～４５個の炭素原子及び少なくとも１個のｐＨ６～８で正荷電したアミン基を含む、請求項１記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  3. 配列番号１により表されるＣＸＣＲ４受容体の少なくとも８個のアミノ酸（ここで、アミノ酸は、トリプトファン９４、トリプトファン１０２、アスパラギン酸９７、アスパラギン酸１８７、チロシン１１６、チロシン１９０、アルギニン１８３、イソロイシン１８５、バリン１１２、システイン１８６及びグルタミン酸２８８からなる群より選択される）と相互作用する、請求項１又は２記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  4. －セロトニン、ドーパミン、Ｌ－ドーパ、スペルミン、又はスペルミジン、
    －抗ＣＸＣＲ４受容体抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ抗体、又はアプタマー、
    －下記式（Ｉ）：
    Figure 2022166193000018
    ［式中、
    ｎは、１～６の整数であり、
    Ａ１、Ａ２及びＡ３は、同一であっても異なっていてもよく、
    ・水素原子を表すか、又は
    ・１～１２個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボニトリル基、トリフルオロメチル基、アミン基、尿素、若しくは１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、又は
    ・３～１２個の炭素原子を有する複素環、ヘテロアリール、アリール、アリールアルキル若しくはアルキルアリール基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボニトリル基、トリフルオロメチル基、アミン基、尿素、若しくは１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキルによって置換された上記基を表し；そして
    Ａ４は、３～２０個の炭素原子を有するアリール、アリールアルキル又はアルキルアリール基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボニトリル基、トリフルオロメチル基、アミン基、尿素基、又は１～１２個の炭素原子を有するＯ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表す］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくは水和物；
    －下記式（II）：
    Figure 2022166193000019
    ［式中、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、１～１２個の炭素原子を有するアルキル基（場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、アミン基又はハロゲン原子によって置換されている）を表し、ここで、Ｒ１とＲ２、及び／又はＲ２とＲ３及び／又はＲ３とＲ４は、同じ環に含まれていてもよく；
    Ｘ及びＹは、同一であっても異なっていてもよく、Ｓ又はＯを表し；
    Ｒ５及びＲ６は、同一であっても異なっていてもよく、水素原子又は１～５個の炭素原子を有するアルキル基（少なくとも１個のアミン基により置換されている）を表す（ただし、Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、少なくとも１個のアミン基により置換された１～５個の炭素原子を有するアルキル基を表す）］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくは水和物；
    －下記式（III）：
    Figure 2022166193000020
    ［式中、
    Ｂ１及びＢ２は、同一であるか又は異なって、
    ・３～６個の炭素原子を有するアリール若しくはヘテロアリール基であって、場合によりヒドロキシル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ＣＦ３基、ＣＮ基、－ＮＲ７Ｒ８基、アミド若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル、Ｓ－アルキル若しくはＯ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、又は
    ・３～６個の炭素原子を有するシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキル基であって、場合によりヒドロキシル基、ハロゲン原子、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ＣＦ３基、ＣＮ基、－ＮＲ７Ｒ８基、若しくは１～６個の炭素原子を有するアルキル、Ｓ－アルキル若しくはＯ－アルキル基によって置換された上記基を表す（ここで、Ｒ７及びＲ８は、同一であるか又は異なって、水素原子、１～６個の炭素原子を有するアルキル基又は３～６個の炭素原子を有するヘテロシクロアルキル基を表す）］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくは水和物；
    －下記式（IV）：
    Figure 2022166193000021
    ［式中、
    Ｄ１及びＤ２は、同一であっても異なっていてもよく、
    ・１～６個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、ＣＦ３基、ＣＮ基、アミン基、若しくは１～１２個の炭素原子を有するアルキル、Ｏ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、又は
    ・３～１２個の炭素原子を有するアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、若しくはヘテロシクロアルキル基であって、場合により少なくとも１個のヒドロキシル基、ハロゲン原子、ＣＦ３基、ＣＮ基、アミン基、若しくは１～１２個の炭素原子を有するアルキル、Ｏ－アルキル若しくはＳ－アルキル基によって置換された上記基を表すか、あるいは
    Ｄ１及びＤ２は、結合して３～１２個の炭素原子を有するＮ含有アリール又はヘテロアリール基であって、場合により、３～１２個の炭素原子を有するアルキルヘテロアリール基によって場合により置換された少なくとも１個のアミン基によって置換された上記基を形成し、そして
    Ｘは、
    ・１～６個の炭素原子を有するアルキル基を表すか、又は
    ・－Ｒ９－Ｙ－Ｒ１０－（ここで、Ｒ９及びＲ１０は、同一であるか又は異なって、１～６個の炭素原子を有するアルキル基を表し、そしてＹは、３～６個の炭素原子を有するアリール又はヘテロアリール基であって、場合によりハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミド基、アミン基、アルコキシ基、エステル基、ＣＦ３基、ＣＮ基又は１～６個の炭素原子を有するアルキル、Ｏ－アルキル若しくはＳ－アルキル基（場合によりヒドロキシル基、アミン基又は１～６個の炭素原子を有するＯ－アルキル基によって置換されている）によって置換された上記基を表す）を表す］で示される化合物、又はその薬学的に許容しうる塩及び／若しくはその水和物
    からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  5. ＩＴ１ｔ、クロベンプロピット、ＡＭＤ０７０、ＦＦＮ１０２、ＦＦＮ２０２、及びＦＦＮ５１１からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  6. インターフェロン（ＩＦＮ）が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）、II型インターフェロン（ＩＦＮ－II）及びIII型インターフェロン（ＩＦＮ－III）からなる群より選択される、請求項１～５のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  7. 免疫細胞によるＩＦＮ分泌を阻害するための、請求項１～６のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  8. 形質細胞様樹状細胞、単球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群より選択される免疫細胞によるＩＦＮ分泌を阻害するための、請求項１～７のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  9. インターフェロノパチー又は自己免疫疾患の予防又は治療における、請求項１～８のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  10. エカルディ・グティエール症候群、家族性凍傷状狼瘡、脊椎性内軟骨腫症、乾癬、全身性エリテマトーデス、ＳＴＩＮＧ関連血管症、クローン病、プロテアソーム関連自己炎症性症候群（ＰＲＡＡＳ）、シングルトン・マーテン症候群、シェーグレン症候群、筋炎、全身性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、及びアテローム動脈硬化症からなる群より選択される疾患の予防又は治療における、請求項１～９のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  11. 個体が、慢性ウイルス感染を有する、請求項１～１０のいずれか１項記載の使用のためのＣＸＣＲ４受容体結合化合物。
  12. 免疫細胞によるＩＦＮ分泌を阻害するための、請求項１～５のいずれか１項に定義した通りのＣＸＣＲ４受容体結合化合物（ただし、このＣＸＣＲ４受容体結合化合物はヒスタミンとは異なる）のインビトロ使用。
  13. 個体におけるＩＦＮレベルを低下させる化合物を候補化合物から同定するためのインビトロスクリーニング方法であって、候補化合物が、請求項１～５のいずれか１項に定義した通りのＣＣＸＣＲ４受容体結合化合物である方法。
  14. 請求項１３記載のインビトロスクリーニング方法であって、
    ・血球を候補化合物と接触させる工程；
    ・接触血球によるＩＦＮの分泌のレベルを測定する工程；
    ・血球を候補化合物と接触させる前のＩＦＮの分泌のレベルに対してＩＦＮの分泌のレベルを低下させる候補化合物を選択し、それによってＩＦＮレベルを低下させる化合物を同定する工程
    を含む方法。
  15. 個体におけるＩＦＮレベルを低下させる化合物を候補化合物から同定するためのインビトロスクリーニング方法であって、
    ・ＣＸＣＲ４受容体を請求項１～５のいずれか１項に定義した通りのＣ検出可能なＣＸＣＲ４受容体結合化合物と結合させる工程；
    ・検出可能なＣＸＣＲ４受容体結合化合物に結合したＣＸＣＲ４受容体を候補化合物と接触させる工程；
    ・ＣＸＣＲ４受容体への検出可能なＣＸＣＲ４受容体結合化合物の結合を低下させる候補化合物を選択し、それによってＩＦＮレベルを低下させる化合物を同定する工程
    を含む方法。
  16. 個体におけるＩＦＮレベルを低下させるのに有用な化合物を、候補化合物からスクリーニングするための、又は個体におけるＩＦＮレベルを低下させるのに有用な化合物を設計するためのインシリコ法であって、設計された化合物又は候補化合物が、配列番号１により表されるＣＸＣＲ４受容体の少なくとも８個のアミノ酸（ここで、アミノ酸は、トリプトファン９４、トリプトファン１０２、アスパラギン酸９７、アスパラギン酸１８７、チロシン１１６、チロシン１９０、アルギニン１８３、イソロイシン１８５、バリン１１２、システイン１８６及びグルタミン酸２８８からなる群より選択される）と相互作用するかどうかを決定するコンピュータ実行工程を含む方法。
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