JP2023500492A - Ｉｌ－３３アンタゴニストの使用方法 - Google Patents

Ｉｌ－３３アンタゴニストの使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、異常な上皮生理機能又はＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト、及びＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む、対応する予防又は治療方法に関する。

Description

本出願は、２０１９年１１月４日に提出された欧州特許出願第１９２０６９８４．７号に対する優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
本開示は、異常な上皮生理機能又はＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト、及びＩＬ－３３アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含む、対応する予防又は治療方法に関する。
ＩＬ－１Ｆ１１としても知られるインターロイキン－３３（ＩＬ－３３）は、サイトカインのＩＬ－１ファミリーのメンバーである。ＩＬ－３３は、２つのドメイン：ホメオドメインとサイトカイン（ＩＬ－１様）ドメインとからなる２７０個のアミノ酸のタンパク質である。ホメオドメインには核移行シグナル（ＮＬＳ）が含まれる。ＩＬ－３３は、異なる型；還元型（ｒｅｄＩＬ－３３）及び酸化型（ｏｘＩＬ－３３）で存在することが知られている。以前の研究は、還元型が生理学的条件下で急速に酸化されて、酸化型で少なくとも１つのジスルフィド結合を形成すること、並びに２つの型が異なる結合パターン及び効果を有する可能性があることを示していた。
還元型のＩＬ－３３は、ＳＴ２に結合し、実際には、Ｔｈ２細胞及びマスト細胞によって発現されるＳＴ２受容体の唯一の既知のリガンドであることが以前に発見された。還元ＩＬ－３３はＳＴ２に結合することによって標的細胞を刺激し、続いてＮＦκＢ及びＭＡＰキナーゼ経路を活性化させ、これがサイトカイン及びケモカイン、例えば炎症を促進するためのＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－１３などの産生につながる。可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）は、還元ＩＬ－３３シグナル伝達を妨げるデコイ受容体であると考えられている。
より近年では、酸化型のＩＬ－３３もまた、生理学的効果を有することが見出された。酸化ＩＬ－３３はＳＴ２に結合するのではないが、代わりに終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）に結合し、この代替経路を介してシグナル伝達することが判明した。
主に、ＳＴ２を刺激し、強力な炎症効果をもたらす還元型として現在知られているものの能力のために、治療標的としてのＩＬ－３３に大きな関心が寄せられている。しかしながら、酸化ＩＬ－３３経路の治療標的としての研究及び関心はほとんど存在しない。これは、後の発見もあり、ＲＡＧＥには多くのリガンドがあり、その下流の相互作用がよく理解されていないという事実があるためである。
酸化ＩＬ－３３の刺激から生じるこれらの下流のＲＡＧＥ相互作用の少なくとも１つが、本明細書でより詳細に記載される。驚くべきことに、ＲＡＧＥは、酸化ＩＬ－３３経路の一部として、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と複合体化することが見出された。還元ＩＬ－３３は急速に酸化ＩＬ－３３に変換され、次いでＲＡＧＥに結合し、ＥＧＦＲと複合体を形成してＥＧＦＲ活性を刺激する。ＥＧＦＲの関与の驚くべき発見は、ＥＧＦＲが異常な上皮生理機能の側面を含む多くの疾患の重要な治療標的であるという点で重要である。
本発見の結果として、ＩＬ－３３のいずれかの型に結合し得るアンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３のシグナル伝達を効果的に妨げることができると考えられている。これは、酸化ＩＬ－３３自体に結合することによって直接的に、又は還元ＩＬ－３３から酸化ＩＬ－３３への変換を阻害することによって間接的に、のいずれかであり得、それにより、そのどちらもＲＡＧＥの刺激及びＥＧＦＲの刺激を妨げる。このＥＧＦＲの刺激の低減は、任意のＥＧＦＲ媒介疾患において、特にＥＧＦＲが過剰に刺激される病態において、治療上の利益をもたらす。
ＥＧＦＲは上皮生理機能に様々な恒常性効果をもたらすことが知られている。ＥＧＦＲの刺激は、上皮細胞の分化を増加させ、上皮細胞遊走を増加させ、上皮粘膜の産生を増加させる。ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達の阻害は、異常な気道上皮組織のリモデリング又は粘液の過剰産生など、異常な上皮生理機能が存在する障害を治療又は予防すると考えられている。
ＩＬ－３３は、以前より、気道の組織リモデリングと関連付けられてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。しかしながら、これは、自己永続的な増幅ループを介して間接的に発生すると考えられており、それによって、ＩＬ－３３シグナル伝達は、ＩＬ－３３とその同族受容体ＳＴ２の両方の発現を上方制御し、慢性的なＳＴ２軸シグナル伝達をもたらす。ＳＴ２を介した活性が、マクロファージ及び２型自然リンパ球など、ＳＴ２が発現する自然細胞によって媒介されるためにＩＬ－３３自体が気道上皮生物機能に直接影響を与えることはこれまで確立されていないか又は示唆されていない。
上記のとおり、本開示は、ＩＬ－３３もまた、異なるメカニズム；ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ経路を介して直接作用するという発見に基づき；上皮生理機能に直接影響を与える。ＩＬ－３３アンタゴニストの治療用途を広げて、より多くの疾患、より多くの疾患の症状、及びより多くの患者を治療するために使用できるため、この新しい理解は重要である。ＩＬ－３３を標的とすることにより、ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達を直接的に制御及び阻害する治療の機会は、これまで実現されていなかった。
本出願の開示は、ＩＬ－３３アンタゴニストの使用が、ＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ媒介ｏｘＩＬ－３３活性の直接阻害により、ＣＯＰＤ又は気管支炎を有する患者など、異常な上皮生理機能を有する患者において、上皮修復反応の障害に直接影響を及ぼし、上皮杯細胞の分化及び増殖を減少させ、粘液産生を減少させ、粘膜毛様体運動を改善し得ることを初めて示している。したがって、本明細書に提示される研究は、異常な上皮生理機能の直接的な予防又は治療におけるＩＬ－３３アンタゴニストの治療的使用を支持し、これは典型的にはＥＧＦＲ媒介効果に起因し、それによりＥＧＦＲ媒介疾患に存在する。
Ｌｉ ｅｔ ａｌ ＪＡＣＩ，２０１４ １３４：１４２２－３２ Ｖａｎｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，３３７ｒａ６５ Ａｌｌｉｎｎｅ ｅｔ ａｌ ＪＡＣＩ，２０１９，１４４：１６２４－３７
第１の態様によれば、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を調節又は阻害することにより、異常な上皮生理機能の予防又は治療で使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
代替的な第１の態様によれば、患者の異常な上皮生理機能を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与して、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を調節又は阻害することを含む方法が提供される。
代替的な第１の態様によれば、異常な上皮生理機能の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＩＬ－３３アンタゴニストの使用が提供される。
第２の態様によれば、ＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
代替的な第２の態様によれば、患者のＥＧＦＲ媒介疾患を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
代替的な第２の態様によれば、ＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＩＬ－３３アンタゴニストの使用が提供される。
第３の態様によれば、上皮生理機能を改善することによる疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
代替的な第３の態様によれば、患者の上皮生理機能を改善することにより呼吸器疾患を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
代替的な第３の態様によれば、上皮生理機能を改善することによる呼吸器疾患の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＩＬ－３３アンタゴニストの使用が提供される。
第４の態様によれば、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
代替的な第４の態様によれば、患者のＥＧＦＲ媒介効果を阻害することにより呼吸器疾患を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
代替的な第４の態様によれば、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる呼吸器疾患の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＩＬ－３３アンタゴニストの使用が提供される。
更なる態様によれば、ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することによる疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
代替的な更なる態様によれば、患者のＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することにより疾患を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
代替的な更なる態様によれば、ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することによる疾患の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＩＬ－３３アンタゴニストの使用が提供される。
上記で定義された態様の更なる特徴及び実施形態は、以下の見出しのセクションで説明される。各セクションは、任意の互換性のある組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
定義
「ＩＬ－３３」タンパク質とは、本明細書で用いられるとき、インターロイキン３３、特に哺乳類インターロイキン３３タンパク質、例えばＵｎｉＰｒｏｔ番号０９５７６０で寄託されているヒトタンパク質を指す。しかしながら、この実体が単一の種ではなく、むしろ還元型及び酸化型として存在することは明らかである。還元型がｉｎ ｖｉｖｏで（例えば５分～４０分の時間で）及びｉｎ ｖｉｔｒｏで急速に酸化することを所与とすれば、先行技術によるＩＬ－３３への言及は、実際には酸化型に言及したものである。更に、市販のアッセイは還元型と酸化型を効果的に区別できない場合がある。用語「ＩＬ－３３」及び「ＩＬ－３３ポリペプチド」は、同じ意味で用いられる。特定の実施形態において、ＩＬ－３３は完全長である。別の実施形態において、ＩＬ－３３は成熟トランケート型ＩＬ－３３（アミノ酸１１２～２７０）である。最近の研究によれば、完全長ＩＬ－３３は活性であることが示唆される（Ｃａｙｒｏｌ ａｎｄ Ｇｉｒａｒｄ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６（２２）：９０２１－６（２００９）；Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３８７（１）：２１８－２２（２００９）；Ｔａｌａｂｏｔ－Ａｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８４（２９）：１９４２０－６（２００９））。しかしながら、限定はされないが、ａａ ７２～２７０、７９～２７０、９５～２７０、９９～２７０、１０７～２７０、１０９～２７０、１１１～２７０、１１２～２７０を含め、Ｎ末端プロセシングを受けた又はトランケートされたＩＬ－３３は、亢進した活性を有し得る（Ｌｅｆｒａｎｃａｉｓ ２０１２，２０１４）。別の実施形態において、ＩＬ－３３には、完全長ＩＬ－３３、その断片、又はＩＬ－３３突然変異体若しくはバリアントポリペプチドが含まれることもあり、ここでＩＬ－３３の断片又はＩＬ－３３バリアントポリペプチドは、活性ＩＬ－３３の一部又は全ての機能特性を保持している。
「酸化ＩＬ－３３」又は「ｏｘＩＬ－３３」とは、本明細書で用いられるとき、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達を惹起する型のＩＬ－３３を指す。酸化ＩＬ－３３とは、例えば非還元条件下でのウェスタンブロット分析によって特徴的なバンドとして現れる、特に対応する還元型（ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ）よりも４Ｄａ少ない質量を有するタンパク質を指す。詳細には、これは、システイン２０８、２２７、２３２及び２５９から独立して選択されるシステイン間に１つ又は２つのジスルフィド結合を有するタンパク質を指す。一実施形態において、酸化ＩＬ－３３はＳＴ２への結合を示さない。
「還元ＩＬ－３３」又は「ｒｅｄＩＬ－３３」とは、本明細書で用いられるとき、ＳＴ２に結合してＳＴ２媒介シグナル伝達を惹起する型のＩＬ－３３を指す。特に、還元型のシステイン２０８、２２７、２３２及び２５９はジスルフィド結合していない。一実施形態において、還元ＩＬ－３３はＲＡＧＥへの結合を示さない。
「ＷＴ ＩＬ－３３」又は「ＩＬ－３３」への言及は、それが使用される文脈から型の１つが意味されることが明らかでない限り、還元若しくは酸化型のいずれか、又は両方を指し得ると理解すべきである。
本明細書で使用される「抗原的に異なる型のＩＬ－３３」は、抗原として作用し、抗体又はその結合断片によって結合され得る任意の型のＩＬ－３３を指し、典型的には本開示の文脈において、これは酸化ＩＬ－３３、還元ＩＬ－３３、及び還元ＩＬ－３３／ｓＳＴ２複合体を意味する。
「ＳＴ２媒介シグナル伝達／効果」とは、本明細書で用いられる場合、ＳＴ２による還元ＩＬ－３３認識が、細胞表面上及び細胞内のＩＬ－１ＲＡｃＰとの二量化と、受容体複合体成分ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＩＲＡＫ１－４の細胞内ＴＩＲドメインへの動員とを促進するＩＬ－３３／ＳＴ２系を指す。従ってＳＴ２依存シグナル伝達／効果は、ＩＬ－３３とＳＴ２の相互作用を乱すことによるか、又はあるいはＩＬ－１ＲＡｃＰとの相互作用を妨げることにより妨害及び減弱し得る。
「ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達／効果」とは、本明細書で用いられるとき、ＲＡＧＥによる酸化ＩＬ－３３認識が細胞膜内のＥＧＦＲとの複合体化を促進する酸化ＩＬ－３３／ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ系を指す。従ってＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達／効果は、酸化ＩＬ－３３とＲＡＧＥの相互作用を乱すことによるか、又は還元ＩＬ－３３の酸化ＩＬ－３３への変換を妨げることにより妨害及び減弱し得る。
「～の活性を減弱させる」とは、本明細書で用いられるとき、関連する活性を低下させる若しくは阻害すること又は関連する活性を停止させることを指す。一般に、減弱及び阻害とは、本明細書では同じ意味で用いられる。
用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の実体（ｅｎｔｉｔｙ）とは、その実体の１つ以上を指すことに留意すべきである；例えば、「抗ＩＬ－３３抗体（ａｎ ａｎｔｉ－ＩＬ－３３ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つ以上の抗ＩＬ－３３抗体を表すものと理解される。そのようなものであるから、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」は、本明細書では同じ意味で用いられ得る。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」又は「治療」は、治療的処置及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指し、ここで目的は、望ましくない生理的変化又は障害を予防し又は減速させる（和らげる）ことである。有利である又は所望される臨床結果として、限定はされないが、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化した（すなわち悪化していない）状態、疾患進行の遅延又は緩徐化、病態の回復又は緩和、及び寛解（部分又は全体）、検出可能又は検出不能のいずれかが挙げられる。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延ばすことも意味し得る。治療を必要としている者には、既に病態又は障害を有する者並びに病態又は障害に罹り易い者或いは病態又は障害を予防すべき者が含まれる。
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後判定、又は治療が望ましい任意の対象、特に哺乳動物対象を意味し、対象が「健康な対象」として定義されている場合を除く。哺乳類対象には、ヒト；家畜；農業動物；例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシなどが含まれる。
ＩＬ－３３アンタゴニスト
本開示は、ＩＬ－３３アンタゴニストの医学的使用、特にＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することにより疾患を予防又は治療するための医学的使用に関する。特定の場合においては、本開示は、ＥＧＦＲ媒介疾患に見出され得る異常な上皮生理機能の予防又は治療のためのＩＬ－３３アンタゴニストの使用に関する。
「ＩＬ－３３アンタゴニスト」は、本明細書で用いられるとき、ＩＬ－３３活性、例えば、還元ＩＬ－３３活性、酸化ＩＬ－３３活性、又はその両方の活性を減弱させる任意の薬剤を指す。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、還元及び／又は酸化ＩＬ－３３に特異的である。好適には、減弱は、ＩＬ－３３を還元型又は酸化型で結合することによるものである。好適には、アンタゴニストが還元ＩＬ－３３活性及び酸化ＩＬ－３３活性を減弱させる場合、減弱は、ＩＬ－３３に還元型で結合することによる（すなわち、還元ＩＬ－３３に結合することによる）ものである。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、結合分子又はその断片である。
本開示の「結合分子」又は「抗原結合分子」は、その最も広義の意味において、抗原決定基と特異的に結合する分子を指す。好適には、結合分子は、ＩＬ－３３、特にｒｅｄＩＬ－３３又は酸化ＩＬ－３３に特異的に結合する。
好適には、結合分子は：抗体、その抗原結合断片、アプタマー、参照抗体分子のうちの少なくとも１つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲ、及び１つ以上の参照抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲから選択され得る。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、抗体又はその結合断片である。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、抗ＩＬ－３３抗体又はその結合断片である。好適には、抗ＩＬ－３３抗体又はその結合断片は、ＩＬ－３３、特に還元ＩＬ－３３又は酸化ＩＬ－３３に特異的に結合する。
「抗体」とは、本明細書で用いられる場合、以下で更に詳細に考察するとおりの免疫グロブリン分子、詳細には完全長抗体又は完全長抗体を含む分子、例えばＤＶＤ－Ｉｇ分子などを指す。
「その結合断片」とは、「その抗原結合断片」と互換可能であり、例えば結合領域を含む、特に重鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び軽鎖可変領域の３つのＣＤＲなど、６つのＣＤＲを含む、抗体断片のエピトープ／抗原結合断片を指す。
好適には、抗体又はその結合断片は：天然に存在する、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、マウス、ヒト、ヒト化、霊長類化、又はキメラから選択される。好適には、抗体又はその結合断片は、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一重鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメイン又はＶＨドメインのいずれかを含む断片、又はＦａｂ発現ライブラリによって産生される断片であってもよい。好適には、抗体又はその結合断片は、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又は一本鎖抗体であってもよい。好適には、抗体又はその結合断片は、モノクローナル抗体である。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野において公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。
本開示の免疫グロブリン又は抗体分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２など）、又はサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、好適には、酸化ＩＬ－３３の形成を阻害することにより、酸化ＩＬ－３３の活性を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、還元ＩＬ－３３の酸化ＩＬ－３３への変換を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、還元ＩＬ－３３アンタゴニストである。換言すれば、ＩＬ－３３アンタゴニストは、還元ＩＬ－３３の活性を減弱させる。好適には、減弱は、還元ＩＬ－３３に結合することによるものである。好適には、還元ＩＬ－３３に結合することにより、上記アンタゴニストはまた、その酸化ＩＬ－３３型への変換を妨げることにより、酸化ＩＬ－３３の活性を阻害する／減弱させる。
好適には、酸化ＩＬ－３３の活性の阻害により、ＲＡＧＥ依存シグナル伝達及び／又はＲＡＧＥ媒介効果が下方制御されるか、又はオフになる。好適には、阻害により、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ依存シグナル伝達及び／又はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果が下方制御されるか、又はオフになる。好適には、阻害により、ＥＧＦＲ依存シグナル伝達が下方制御されるか、又はオフになる。好適には、阻害により、ＥＧＦＲ媒介効果が下方制御されるか、又はオフになる。特に、還元ＩＬ－３３に結合するＩＬ３３アンタゴニストが、酸化ＩＬ－３３のＲＡＧＥとの結合を妨げ、それによりＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害し得ることが示された。
好適には、酸化ＩＬ－３３の活性の阻害により、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲの複合体化が下方制御されるか、又は妨げられる。好適には、阻害により、ＥＧＦＲ活性化、好適には、ＲＡＧＥ媒介ＥＧＦＲ活性化が下方制御されるか、又は妨げられる。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、上記の全ての阻害効果を有する。好適には、還元ＩＬ－３３アンタゴニストは、上記の全ての阻害効果を有する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、還元ＩＬ－３３結合分子又はその断片である。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、還元ＩＬ－３３抗体又はその結合断片、好適には、抗還元ＩＬ－３３抗体又はその結合断片である。
好適には、結合分子又はその断片は、５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－４Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、又は１０－１５Ｍ未満の結合親和性（Ｋｄ）で、ｒｅｄＩＬ－３３に特異的に結合する。好適には、ｒｅｄＩＬ－３３との結合親和性は、５×１０－１４Ｍ未満（すなわち、０．０５ｐＭ）である。好適には、結合親和性は、Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（ＫｉｎＥｘＡ）又はＢＩＡＣＯＲＥ（商標）を使用して、好適には、ＫｉｎＥｘＡを使用し、国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレット（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）（例えば、実施例１１を参照）に記載されているプロトコルをなど使用して測定されるとおりである。この結合親和性でｒｅｄＩＬ－３３に結合する結合分子は、生物学的に関連する時間尺度内で結合分子／ｒｅｄＩＬ－３３複合体の解離を防ぐためにｒｅｄＩＬ－３３に十分にしっかりと結合するように見える。理論に束縛されるものではないが、この結合強度は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体／抗原複合体の分解前の抗原の放出を妨げ、その結果、ｒｅｄＩＬ－３３は放出されず、ｒｅｄＩＬ－３３からｏｘＩＬ－３３への変換ができないと考えられる。したがって、この結合親和性でｒｅｄＩＬ－３３に結合する場合、結合分子は、ｏｘＩＬ－３３の形成を妨げ、それによってＲＡＧＥシグナル伝達を阻害することにより、ｏｘＩＬ－３３の活性を阻害又は減弱させることができる。
好適には、結合分子又はその断片は、１０３Ｍ－１秒－１、５×１０３Ｍ－１秒－１、１０４Ｍ－１秒－１、又は５×１０４Ｍ－１秒－１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ｒｅｄＩＬ－３３に特異的に結合し得る。例えば、本開示の結合分子は、１０５Ｍ－１秒－１、５×１０５Ｍ－１秒－１、１０６Ｍ－１秒－１、又は５×１０６Ｍ－１秒－１若しくは１０７Ｍ－１秒－１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ｒｅｄＩＬ－３３又はその断片若しくはバリアントに結合し得る。好適には、ｋ（ｏｎ）速度は、１０７Ｍ－１秒－１以上である。
好適には、結合分子又はその断片は、５Ｘ１０－１秒－１、１０－１秒－１、５Ｘ１０－２秒－１、１０－２秒－１、５Ｘ１０－３秒－１、又は１０－３秒－１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ｒｅｄＩＬ－３３に特異的に結合し得る。例えば、本開示の結合分子は、５×１０－４秒－１、１０－４秒－１、５×１０－５秒－１、１０－５秒－１、５×１０－６秒－１、１０－６秒－１、５×１０－７秒－１、又は１０－７秒－１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））でｒｅｄＩＬ－３３又はその断片若しくはバリアントに結合すると言うことができる。好適には、ｋ（ｏｆｆ）速度は、１０－３秒－１以下である。ＩＬ－３３は、炎症性刺激に反応して急速且つ高濃度で放出されるアラーミンサイトカインである。ｒｅｄＩＬ－３３は、細胞外環境に放出されてからおよそ５～４５分後に酸化された状態に変換される。したがって、ｒｅｄＩＬ－３３からｏｘＩＬ－３３への変換を妨げるために、本明細書に記載の結合分子は、これらのｋ（ｏｎ）及び／又はｋ（ｏｆｆ）速度でｒｅｄＩＬ－３３に結合し得る。理論に束縛されるものではないが、これらのｋ（ｏｎ）／ｋ（ｏｆｆ）速度は、結合分子がｏｘＩＬ－３３に変換される前にｒｅｄＩＬ－３３に迅速に結合できることを確実にすると考えられ、それによってｏｘＩＬ－３３の形成を低減し、それによってＲＡＧＥシグナル伝達、好適にはＲＡＧＥ／ＥＧＦＲシグナル伝達を減弱させ、且つそれによってＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ媒介効果を減弱させる。
好適には、ＩＬ－３３結合分子は、ＩＬ－３３の結合分子３３＿６４００８７－７Ｂ（国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレットに記載されるとおり）への結合を競合的に阻害し得る。好適には、国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレットには、３３＿６４００８７－７Ｂが特に高い親和性でｒｅｄＩＬ－３３に結合し、ＳＴ－２とＲＡＧＥ依存ＩＬ－３３シグナル伝達の両方を減弱させることが記載されている。したがって、ＩＬ－３３の結合分子３３＿６４００８７－７Ｂへの結合を競合的に阻害する結合分子は、ｒｅｄＩＬ－３３及びｏｘＩＬ－３３シグナル伝達の両方を阻害する可能性が高く、したがって、本明細書に記載の方法での使用に特に好適である。
結合分子又はその断片は、それが所与のエピトープに対する参照抗体の結合を何らかの程度遮断する限りにおいてそのエピトープに特異的に結合する場合に、当該のエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイなどの固相アッセイ、解離促進ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、及び放射性リガンド結合アッセイによって決定し得る。例えば、当業者は、国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレットの実施例１に記載されているＨＴＲＦアッセイの誘導などのｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイを使用することにより、結合分子又はその断片がｒｅｄＩＬ－３３への結合について競合するかどうかを決定することができる。例えば、当業者は、表１の組換え抗体をドナーフルオロフォアで標識し、複数の濃度を、受容体フルオロフォア標識されたｒｅｄＩＬ－３３の固定濃度サンプルと混合することができる。その後、各サンプル内のドナーと受容体のフルオロフォア間の蛍光共鳴エネルギー移動を測定して、結合特性を確認することができる。競合的結合分子を解明するために、当業者は、最初に、様々な濃度の試験結合分子を、表１の固定濃度の標識抗体と混合することができる。標識抗体のみの陽性対照と比較して、混合物を標識ＩＬ－３３とインキュベートした場合のＦＲＥＴシグナルの減少は、ＩＬ－３３への競合的結合を示す。結合分子又はその断片は、所与のエピトープへの参照抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％競合的に阻害すると言われ得る。
いくつかの実施形態では、結合分子は、以下の抗ＩＬ－３３抗体：３３＿６４００８７－７Ｂ（国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレットに記載されるとおり）、エトキマブ（Ｅｔｏｋｉｍａｂ）として知られるＡＮＢ０２０（国際公開第２０１５／１０６０８０号パンフレットに記載されるとおり）、９６７５Ｐ（米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８号明細書に記載されるとおり）、Ａ２５－３Ｈ０４（米国特許出願公開第２０１７／０２８３４９４号明細書に記載されるとおり）、Ａｂ４３（国際公開第２０１８／０８１０７５号パンフレットに記載されるとおり）、ＩＬ３３－１５８（米国特許出願公開第２０１８／００３７６４４号明細書に記載されるとおり）、１０Ｃ１２．３８．Ｈ６．８７Ｙ．５８１ ｌｇＧ４（国際公開第２０１６／０７７３８１号パンフレットに記載されるとおり）、又はその結合断片のいずれかから選択され、その文献の各々は本明細書に参照により組み込まれる。これらの抗体の全ては、表１で参照される。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体又は抗原結合断片である。ペア１は、国際公開２０１６／１５６４４０号パンフレットに記載される３３＿６４００８７－７ＢのＶＨとＶＬドメインの配列に対応している。ペア２～７は、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８号明細書に記載される抗体のＶＨとＶＬドメインの配列に対応している。ペア８～１２は、米国特許出願公開第２０１７／０２８３４９４号明細書に記載される抗体のＶＨとＶＬドメインの配列に対応している。ペア１３は、国際公開第２０１５／１０６０８０号パンフレットに記載されるＡＮＢ０２０のＶＨとＶＬドメインの配列に対応している。ペア１４～１６は、国際公開第２０１８／０８１０７５号パンフレットに記載される抗体のＶＨとＶＬドメインの配列に対応している。ペア１７は、米国特許出願公開第２０１８／００３７６４４号明細書に記載されるＩＬ３３－１５８のＶＨとＶＬドメインの配列に対応している。ペア１８は、国際公開第２０１６／０７７３８１号パンフレットに記載される１０Ｃ１２．３８．Ｈ６．８７Ｙ．５８１ ｌｇＧ４のＶＨとＶＬドメインの配列に対応している。
Figure 2023500492000002
Figure 2023500492000003
Figure 2023500492000004
Figure 2023500492000005
Figure 2023500492000006
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１の配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１９の配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又は抗原結合断片である。これらのＣＤＲは、３３＿６４００８７－７Ｂ（国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレットに記載されるとおり）から誘導されるものに対応しており、還元ＩＬ－３３に結合し、酸化ＩＬ－３３への変換を阻害する。３３＿６４００８７－７Ｂは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレットに完全に記載されている。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号７の配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２５の配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又は抗原結合断片である。これらのＣＤＲは、抗体９６７５Ｐから誘導されるものに対応する。９６７５Ｐは、本明細書で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８号明細書に完全に記載されている。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１１の配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２９の配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又は抗原結合断片である。これらのＣＤＲは、抗体Ａ２５－３Ｈ０４から誘導されるものに対応する。Ａ２５－３Ｈ０４は、本明細書で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０２８３４９４号明細書に完全に記載されている。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３１の配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又は抗原結合断片である。これらのＣＤＲは、抗体ＡＮＢ０２０から誘導されるものに対応する。ＡＮＢ０２０は、本明細書で参照により組み込まれる国際公開第２０１５／１０６０８０号パンフレットに完全に記載されている。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１６の配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３４の配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又は抗原結合断片である。これらのＣＤＲは、抗体Ａｂ４３から誘導されるものに対応する。Ａｂ４３は、本明細書で参照により組み込まれる国際公開第２０１８／０８１０７５号パンフレットに完全に記載されている。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１７の配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３５の配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又は抗原結合断片である。これらのＣＤＲは、抗体ＩＬ３３－１５８から誘導されるものに対応する。ＩＬ３３－１５８は、本明細書で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／００３７６４４号明細書に完全に記載されている。
好適には、ＩＬ－３３結合分子は、配列番号１８の配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３６の配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む、抗体又は抗原結合断片である。これらのＣＤＲは、抗体１０Ｃ１２．３８．Ｈ６．８７Ｙ．５８１ ｌｇＧ４．から誘導されるものに対応する。１０Ｃ１２．３８．Ｈ６．８７Ｙ．５８１ ｌｇＧ４は、本明細書で参照により組み込まれる国際公開第２０１６／０７７３８１号パンフレットに完全に記載されている。
好適には、当業者は、抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖可変領域内のＣＤＲを同定するための当該技術分野で利用可能な方法を認識している。好適には、当業者は、例えば、配列に基づくアノテーションを行うことができる。ＣＤＲ間の領域は一般に高度に保存されているため、論理ルールを使用してＣＤＲの場所を決定することができる。当業者は、従来の抗体について一連の配列に基づくルール（Ｐａｎｔａｚｅｓ ａｎｄ Ｍａｒａｎａｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０１０）を使用することができ、あるいは又は追加的に、当業者は、複数配列アラインメントに基づいてルールをリファインすることができる。あるいは、当業者は、抗体配列を、ＢＬＡＳＴ＋のＢＬＡＳＴＰコマンドを使用して、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴ法で動作する公的に利用可能なデータベースと比較して、最も類似したアノテーションされた配列を同定することができる。これらの各方法は、超可変領域の残基に番号を付ける独自の残基番号付けスキームを考案し、次いで６つのＣＤＲの各々の開始と終了が特定の重要な位置に従って決定される。例えば、最も類似したアノテーションされた配列とアラインメントすると、ＣＤＲをアノテーションされた配列からアノテーションされていない配列に外挿することができ、それによってＣＤＲを同定することができる。好適なツール／データベースは：例えば、Ｋａｂａｔデータベース、Ｋａｂａｔｍａｎ、Ｓｃａｌｉｎｇｅｒ、ＩＭＧＴ、Ａｂｎｕｍである。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアを含む、抗体又は抗原結合断片である。
好適には、ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の配列のＶＨドメインと、配列番号１９の配列のＶＬドメインとを含む。
好適には、ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７の配列のＶＨドメインと、配列番号２５の配列のＶＬドメインとを含む。
好適には、ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１１の配列のＶＨドメインと、配列番号２９の配列のＶＬドメインとを含む。
好適には、ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３の配列のＶＨドメインと、配列番号３１の配列のＶＬドメインとを含む。
好適には、ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１６の配列のＶＨドメインと、配列番号３４の配列のＶＬドメインとを含む。
好適には、ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１７の配列のＶＨドメインと、配列番号３５の配列のＶＬドメインとを含む。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、例えば、配列番号１、７、１１、１３、１６、１７、及び１８から独立して選択される重鎖可変領域において３つのＣＤＲを含み得る結合分子である。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１に従う重鎖可変領域において３つのＣＤＲを含む結合分子である。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１９、２５、２９、３１、３４、３５、及び３６から独立して選択される軽鎖可変領域において３つのＣＤＲを含み得る結合分子である。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１９に従う軽鎖可変領域において３つのＣＤＲを含む結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、例えば、配列番号１、７、１１、１３、１６、１７、及び１８から独立して選択される重鎖可変領域において３つのＣＤＲと、例えば、配列番号１９、２５、２９、３１、３４、３５、及び３６から独立して選択される軽鎖可変領域において３つのＣＤＲとを含み得る結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号１に従う重鎖可変領域において３つのＣＤＲと、配列番号１９に従う軽鎖可変領域において３つのＣＤＲとを含む結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、それぞれ、配列番号３７、３８、及び３９の配列を有するＶＨ ＣＤＲ １～３を有する可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含み得る結合分子であり、ここで、１つ以上のＶＨＣＤＲは、３個以下の単一アミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９のＶＨＣＤＲ１～３を含むＶＨドメインを含む結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、それぞれ、配列番号３７、配列番号３８、及び配列番号３９からなるＶＨＣＤＲ１～３を含むＶＨドメインを含む結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、それぞれ、配列番号４０、４１、及び４２の配列を有するＶＬＣＤＲ１～３を有する可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）とを含み得る結合分子であり、ここで、１つ以上のＶＬＣＤＲは、３個以下の単一アミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２のＶＬＣＤＲ１～３を含むＶＬドメインを含む結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、それぞれ、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２からなるＶＬＣＤＲ１～３を含むＶＬドメインを含む結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、配列番号３７の配列を有するＶＨＣＤＲ１、配列番号３８の配列を有するＶＨＣＤＲ２、配列番号３９の配列を有するＶＨＣＤＲ３、配列番号４０の配列を有するＶＬＣＤＲ１、配列番号４１の配列を有するＶＬＣＤＲ２、及び配列番号４２の配列を有するＶＬＣＤＲ３を含み得る結合分子である。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、ＶＨは、配列番号１、７、１１、１３、１６、１７、及び１８に従うＶＨと、少なくとも９０％、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、ＶＨは、配列番号１に従うＶＨと、少なくとも９０％、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、上記で開示されるＶＨは、フレームワークの１、２、３、又は４つのアミノ酸が欠失しているか、挿入されているか、及び／又は独立して異なるアミノ酸に置換されている配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、ＶＬは、配列番号１９、２５、２９、３１、３４、３５、及び３６に従うＶＬと、少なくとも９０％、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、ＶＬは、配列番号１９に従うＶＬと、少なくとも９０％、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、上記で開示されるＶＬは、フレームワークの１、２、３、又は４つのアミノ酸が独立して欠失しているか、挿入されているか、及び／又は異なるアミノ酸に置換されている配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、ＶＨは、配列番号１、７、１１、１３、１６、１７、及び１８に従うＶＨと少なくとも９０％、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一のアミノ酸配列を有し、ＶＬは、配列番号１９、２５、２９、３１、３４、３５、及び３６に従うＶＬと少なくとも９０％、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、ＶＨは、配列番号１、７、１１、１３、１６、１７、及び１８からなるアミノ酸配列を有し、ＶＬは、配列番号１９、２５、２９、３１、３４、３５、及び３６からなるアミノ酸配列を有する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＶＨとＶＬとを含む抗体又はその結合断片であり、ここで、ＶＨは、配列番号１からなるアミノ酸配列を有し、ＶＬは、配列番号１９からなるアミノ酸配列を有する。
組成及び投与
本明細書に記載の医学的使用及び方法におけるＩＬ－３３アンタゴニストは、医薬組成物の形態で患者に投与することができる。
好適には、本明細書における「ＩＬ－３３アンタゴニスト」への言及はまた、ＩＬ－３３アンタゴニストを含む医薬組成物を指し得る。好適には、医薬組成物は、１つ以上のＩＬ－３３アンタゴニストを含み得る。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、異常な上皮生理機能、又はＥＧＦＲ媒介疾患、又は本明細書の医学的使用及び治療態様の方法で定義される呼吸器疾患のｉｎ ｖｉｖｏでの治療のために薬学的有効量で投与され得る。
好適には、「薬学的有効量」又は「治療有効量」のＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３との有効な結合を達成し、且つ利益を達成する、例えば本明細書の医学的使用／方法で記載されるような疾患又は病態の症状を改善するのに十分な量を意味するように保持されなければならない。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、治療効果を生じさせるのに十分な量で上述の治療方法／医学的使用に従いヒト又は他の動物に投与され得る。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、公知の技法に従いＩＬ－３３アンタゴニストを従来の薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の剤形で、このようなヒト又は他の動物に投与され得る。
当業者によれば、薬学的に許容される担体又は希釈剤の形態及び性質が、それと共に組み合わせる活性成分の量、投与経路及び他の周知の変動要因に左右されることが認識されるであろう。当業者は更に、ＩＬ－３３アンタゴニストの１つ以上の種を含むカクテルが特に有効であると判明し得ることを理解するであろう。
単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせることのできるＩＬ－３３アンタゴニストの量は、治療対象及び詳細な投与方法に応じて変わる。好適には、医薬組成物は、単回用量、複数回用量として、又は輸液で確立された期間にわたって投与され得る。好適には、投薬量レジメンもまた、所望される最適反応（例えば、治療的反応又は予防的反応）を実現するように調整され得る。
好適には、投与を容易にし、且つＩＬ－３３アンタゴニストの安定性を促進させるために、ＩＬ－３３アンタゴニストを製剤化する。
好適には、医薬組成物は、薬学的に許容される非毒性滅菌担体、例えば生理食塩水、非毒性バッファー、保存剤などを含むように製剤化する。
好適には、医薬組成物は、例えば、水、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドケイ酸、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート類、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂を含めた、薬学的に許容される担体を含み得る。
好適には、医薬組成物としては、無菌水性又は非水性液剤、懸濁液、及びエマルションを挙げてもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、例えば、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション又は懸濁液、例えば生理食塩水及び緩衝媒体が挙げられる。
好適には、薬学的に許容される担体としては、限定はされないが、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸バッファー又は０．８％生理食塩水が挙げられる。他の一般的な非経口担体としては、リン酸ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、又は固定油が挙げられる。静脈内用担体としては、体液及び栄養素補充液、電解質補充液、例えばリンガーのデキストロースをベースとするものなどが挙げられる。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどもまた存在し得る。
好適には、注射用途用医薬組成物としては、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散系、及び無菌の注射用溶液又は分散系の即時調製のための滅菌粉末を挙げてもよい。そのような場合、本組成物は無菌でなくてはならず、易注射針通過性が存在する程度に流動性があるべきである。本組成物は製造及び保管条件下で安定していなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されている。好適には、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び好適なそれらの混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の維持、及び界面活性剤の使用により維持することができる。
本明細書に開示される治療方法での使用に好適な製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）１６ｔｈ ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
好適には、微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムなど、糖類、多価アルコール類を医薬組成物に含めることが好適であろう。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めると、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
好適には、滅菌注射用溶液は、本明細書に列挙される成分の１つ又は組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、単独の、又は他の活性薬剤と組み合わせた、ＩＬ－３３アンタゴニスト）を適宜配合し、続いて濾過滅菌することにより調製し得る。一般に、分散液は活性化合物を滅菌媒体に配合することにより調製され、これには基本となる分散媒と上記に列挙したものからの必要な他の成分とが含まれる。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥させてもよく、それにより予め滅菌濾過したその溶液から活性成分＋任意の追加的な所望の成分の粉末が生じる。
ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物をそれを必要としている対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、又は当業者によって容易に決定される。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるか又は局所であり得る。好適には、非経口という用語は、本明細書で使用されるとき、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は腟内投与を含む。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は溶液剤をはじめとする許容される剤形で、経口投与されてもよい。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、鼻エアロゾル又は吸入によって投与されてもよい。このような組成物は、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを亢進させる吸収促進剤、及び／又は他の従来の可溶化剤又は分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製されてもよい。
好適には、非経口製剤は、単回ボーラス用量、輸液、又は負荷ボーラス用量とそれに続く維持用量であり得る。これらの組成物は、特定の定若しくは変動間隔で、例えば、１日１回、又は「必要に応じて」投与されてもよい。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、疾患又は病態、例えば異常な上皮生理機能の部位に直接送達され、それにより罹患組織の治療剤への曝露を増加させる。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、疾患又は病態の部位に直接投与される。したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、異常な上皮生理機能、ＥＧＦＲ媒介疾患、又は呼吸器疾患の部位に投与される。
一実施形態では、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物の投与は、気道への投与である。好適には、鼻腔内投与による。好適には、鼻腔内吸入による。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、吸入デバイスで提供されてもよい。好適な吸入デバイスは、当該技術分野において周知である。
一実施形態では、本明細書で定義される病態又は疾患の予防又は治療に使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物を含む吸入器が提供される。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、液体組成物として配合される。好適には、エアロゾル化できる液体組成物としてである。
一実施形態では、ＩＬ－３３アンタゴニスト又はその医薬組成物は、エアロゾルとして提供される。
好適には、本明細書に記載の医薬組成物を調製するための上記に記載の成分は、キットの形態で包装及び販売することができる。このようなキットは、好適には、関連する医薬組成物が、疾患又は障害に罹患しているか又はそれに罹り易い対象の治療に有用であることを示すラベル又は添付文書を有し得る。
好適には、液体製剤用成分は、当該技術分野において公知の方法に従い処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ又はバイアルなどの容器に充填され、無菌条件下で密封される。好適には、容器は加圧することができ、好適には、これらはエアゾール容器であり得る。これらの容器は、上記のようにキットに含まれていてもよい。好適には、キットは、吸入デバイスを更に含んでもよい。好適には、吸入デバイスは、本明細書に記載のＩＬ－３３アンタゴニスト若しくは医薬組成物を含むか、又は本明細書に記載のＩＬ－３３アンタゴニスト若しくは医薬組成物を含み得る上記のような容器を含むように動作可能である。
異常な上皮生理機能
本開示は、異常な上皮生理機能を予防又は治療するためのＩＬ－３３アンタゴニストの医学的使用に関する。
「異常な上皮生理機能」は、本明細書で用いられるとき、人体における上皮の機能の任意の異常を意味する。人体における上皮の機能としては：下の組織を保護するためのバリアとして機能；組織と空洞の間の化学物質の調節及び交換；空洞への化学物質の分泌；並びに感覚が挙げられる。これらの機能のいずれかの異常は、壊滅的な生理学的影響を与える可能性がある。上皮は、皮膚、気道、胃腸管、生殖管、尿路、外分泌腺、及び内分泌腺を含む体内の広範囲の組織に存在し、そのようなものであるため、上皮内の異常は、広範囲の疾患又は病態に関与している可能性がある。好適には、上皮は、気道上皮であり、異常な上皮生理機能は、異常な気道上皮生理機能である。
「異常な」とは、本明細書で用いられるとき、健康な対象における上記機能と比較した機能の違いを意味し、典型的には、健康な対象における上記機能と比較した機能の増加又は減少を意味する。
好適には、上皮は：扁平、立方体、円柱状、及び偽重層から選択される。好適には、上皮は円柱状である。
好適には、上皮は繊毛性である。好適には、上皮は繊毛円柱である。好適には、異常な上皮生理機能は、異常な繊毛円柱上皮生理機能である。
好適には、異常な上皮生理機能には、異常な上皮細胞遊走が含まれる。好適には、異常な上皮生理機能には、上皮細胞遊走の減少が含まれ得る。好適には、異常な上皮生理機能には、異常な上皮細胞増殖が含まれ得る。好適には、異常な上皮生理機能には、上皮細胞増殖の減少が含まれ得る。
好適には、上皮細胞遊走の減少は、創傷を修復する上皮の能力の障害につながる。好適には、異常な上皮生理機能には、創傷修復の障害が含まれる。創傷修復の障害には、創傷閉鎖の障害及び創傷細胞密度の低下が含まれ得る。
好適には、異常な上皮生理機能の治療には、上皮細胞遊走を増加又は改善することが含まれ得る。好適には、異常な上皮生理機能の治療には、上皮創傷修復の増加又は改善が含まれ得る。好適には、異常な上皮生理機能の治療には、創傷閉鎖の増加又は改善が含まれ得る。好適には、異常な上皮生理機能の治療には、創傷細胞密度の増加又は改善が含まれ得る。
好適には、異常な上皮生理機能は、異常な粘膜毛様体生理機能である。
「異常な粘膜毛様体生理機能」は、本明細書で用いられるとき、特に上皮の粘膜毛様体の役割の機能の任意の異常を意味する。上皮の粘膜毛様体の役割の機能の異常は、粘膜毛様体機能の鍵となる繊毛円柱細胞及び／又は杯細胞の機能の異常が原因である可能性がある。好適には、異常な粘膜毛様体生理機能は、杯細胞の異常な機能が原因である。
「粘膜毛様体」とは、本明細書で用いられるとき、粘液を分泌及び移動させる上皮内の繊毛円柱細胞及び杯円柱細胞の機能を指す。上皮の粘膜毛様体の役割には：杯細胞の増殖；杯細胞の分化；粘液の分泌；粘液組成の調節；及び／又は粘液の移動若しくはクリアランスが含まれ得る。
一実施形態では、上皮の異常な粘膜毛様体生理機能などの異常な粘膜毛様体生理機能の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、患者における上皮の異常な粘膜毛様体生理機能などの異常な粘膜毛様体生理機能を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
異常な粘膜毛様体生理機能には、上皮の繊毛円柱細胞又は杯細胞の任意の異常な機能が含まれ得る。好適には、異常な粘膜毛様体生理機能には：異常な粘液産生；異常な杯細胞分化；異常な杯細胞増殖；異常な上皮厚さ；異常な粘液クリアランス；及び／又は異常な粘液組成が含まれる。
好適には、異常な粘液産生は、異常なＭＵＣ５ＡＣ産生を含む。好適には、異常な杯細胞分化は、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化を含む。好適には、異常な杯細胞増殖は、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞増殖を含む。好適には、上皮の異常な厚さは、上皮の全組織領域の異常な量のＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞を含む。
好適には、異常な粘膜毛様体生理機能には：杯細胞数の増加；粘液産生の増加；杯細胞分化の増加；上皮の厚さの増加；及び／又は粘液クリアランスの減少が含まれる。
好適には、粘液産生の増加は、ＭＵＣ５ＡＣ産生の増加を含む。好適には、杯細胞分化の増加は、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化の増加を含む。好適には、杯細胞増殖の増加は、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞増殖の増加を含む。好適には、上皮の厚さの増加は、上皮の全組織領域で増加した量のＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞を含む。
好適には、ＭＵＣ５ＡＣ産生の増加は、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現の増加によって引き起こされる。好適には、異常な粘膜毛様体生理機能は、上皮細胞におけるＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現の増加を含む。好適には、異常な粘膜毛様体生理機能は、上皮の杯細胞におけるＭＵＣ５ＡＣの発現の増加を含む。
好適には、異常な粘膜毛様体生理機能には、粘液組成の変化が含まれる。このような変化は、粘液に含有される様々な粘液化合物の比率の増加若しくは減少；１つ以上の特異的粘液化合物の増加若しくは減少、又は粘液の濃度若しくは濃さの増加若しくは減少を含み得る。
粘液組成の変化は、ムチンＭＵＣ５ＡＣとＭＵＣ５Ｂの比率の増加又は減少など、異なるムチンの比率の増加又は減少を含み得る。
粘液組成の変化は、ムチンの濃度の増加又は減少を含み得る。好適には、粘液組成の変化は、ムチン５ＡＣの濃度の減少を含む。好適には、粘液組成の変化は、上方制御されたＭＵＣ５ＡＣ発現を有する杯細胞の数の減少を含む。
粘液に含まれるムチンのこのような変化は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／２０４５９８号パンフレットに記載されているように測定及び計算することができる。
好適には、異常な粘液組成は、ＭＵＣ５ＡＣ：ＭＵＣ５Ｂの比率の増加を含む。好適には、異常な粘液組成は、粘液に含有されるＭＵＣ５ＡＣの増加を含む。好適には、異常な粘液組成は、粘液の濃さの増加を含む。
異常な粘膜毛様体生理機能は、上記の症状のいずれか１つ以上を組み合わせて含んでもよい。
好適には、異常な上皮生理機能には、異常な組織リモデリング、例えば異常な上皮リモデリングなどが含まれる。好適には、異常な上皮生理機能には、組織リモデリングの増加が含まれる。好適には、異常な上皮生理機能には、上皮リモデリングの増加が含まれる。
異常な上皮生理機能は、上記の症状のいずれか１つ以上を組み合わせて含んでもよい。
異常な上皮生理機能の治療若しくは予防、又は異常な粘膜毛様体生理機能の治療若しくは予防は：
粘膜毛様体クリアランスの改善若しくは増加；
粘液産生の低減若しくは阻害；
異常な粘液組成の阻害；
上皮リモデリングの低減若しくは阻害；並びに／又は
杯細胞の分化及び／若しくは増殖の低減若しくは阻害を含み得る。
好適には、粘液産生の低減又は阻害は、ＭＵＣ５ＡＣ産生の低減又は阻害を含む。したがって、好適には、治療又は予防は、ＭＵＣ５ＡＣ産生を低減又は阻害する。
好適には、異常な粘液組成の阻害は、通常の粘液組成を回復することを含み得る。好適には、これは、ＭＵＣ５ＡＣ：ＭＵＣ５Ｂの比率の低減を含む。したがって、好適には、治療又は予防は、ＭＵＣ５ＡＣ：ＭＵＣ５Ｂの比率を低減する。好適には、予防又は治療は、粘液中のＭＵＣ５ＡＣを阻害又は低減する。好適には、予防又は治療は、粘液の濃さを低減する。
好適には、杯細胞分化及び／又は増殖の低減又は阻害は、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞の分化又は増殖の低減又は阻害を含む。したがって、好適には、治療又は予防は、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化又は増殖を低減又は阻害する。
好適には、上皮リモデリングの低減又は阻害は、呼吸上皮の厚さの低減を含む。したがって、好適には、治療又は予防は、呼吸上皮の厚さを低減する。
好適には、上皮リモデリングの低減又は阻害は、上皮の全組織領域でＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞の量を低減することを含む。したがって、好適には、治療又は予防は、上皮の全組織領域でＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞の量を低減又は阻害する。
粘膜毛様体クリアランスの改善又は増加は、粘膜毛様体運動の改善又は増加を含む。したがって、好適には、治療又は予防は、粘膜毛様体運動を改善する又は増加させる。
好適には、上皮は呼吸上皮である。好適には、異常な上皮生理機能は、呼吸上皮における異常な上皮生理機能である。
一実施形態では、呼吸器疾患における異常な上皮生理機能の治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、呼吸器疾患を有する患者の異常な上皮生理機能を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
好適な呼吸器疾患は本明細書の他所に定義されている。
好適には、異常な上皮生理機能は、呼吸上皮における異常な粘膜毛様体生理機能である。
一実施形態では、呼吸器上皮における異常な粘膜毛様体生理機能の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、患者の呼吸上皮の異常な粘膜毛様体生理機能を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
好適には、異常な上皮生理機能は、呼吸器疾患における異常な粘膜毛様体生理機能である。
一実施形態では、呼吸器疾患における異常な粘膜毛様体生理機能の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、呼吸器疾患を有する患者の異常な粘膜毛様体生理機能を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
好適には、異常な上皮生理機能は、気道に存在する。好適には、異常な上皮生理機能は、気道の異常な上皮生理機能である。好適には、異常な上皮生理機能は、気道の異常な粘膜毛様体生理機能である。
気道には、上気道及び下気道が含まれる。典型的には、上気道には、鼻腔、副鼻腔、咽頭、及び喉頭が含まれる。典型的には、下気道には、気管、気管支、細気管支、肺胞管、及び肺胞が含まれる。
好適には、異常な上皮生理機能は、気管支などの下気道の異常な上皮生理機能である。
好適には、異常な上皮生理機能は、下気道の異常な上皮生理機能である。好適には、異常な上皮生理機能は、気管支の異常な上皮生理機能である。好適には、異常な下気道上皮生理機能は、下気道の異常な粘膜毛様体生理機能である。好適には、下気道の異常な粘膜毛様体生理機能は、気管支の異常な粘膜毛様体生理機能である。
一実施形態では、下気道の異常な粘膜毛様体生理機能の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、患者の下気道の異常な粘膜毛様体生理機能を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
一実施形態では、気管支の異常な粘膜毛様体生理機能の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、患者の気管支の異常な粘膜毛様体生理機能を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
ＥＧＦＲシグナル伝達
本開示は、酸化ＩＬ－３３はＲＡＧＥに結合し、ＲＡＧＥは順次ＥＧＦＲと複合体化し、上皮の恒常性を破壊するように作用するという発見に基づいている。ＩＬ－３３アンタゴニストの使用は、酸化ＩＬ－３３のシグナル伝達を阻害し、それによってＲＡＧＥの活性化を阻害し、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体化を阻害する可能性がある。本明細書に開示されるデータは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体の形成を妨げることにより、ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達が妨げられ、正常な上皮生理学が回復することを実証している。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３シグナル伝達を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３のＲＡＧＥへの結合を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体の形成を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ３３－ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体の形成を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲのクラスター化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、細胞膜のＥＧＦＲのクラスター化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲのインターナリゼーションを阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、細胞膜内のＲＡＧＥとＥＧＦＲの共局在を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体のインターナリゼーションを阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲの活性化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体によって媒介される効果を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ３３－ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体によって媒介される効果を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ３３－ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３のＲＡＧＥへの結合を阻害し、それによりＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体化を阻害し、それにより下流のシグナル伝達などのＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を阻害する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲ効果を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲ効果を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３媒介ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ効果を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、酸化ＩＬ－３３媒介ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果は、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体化によって、好適には、酸化ＩＬ－３３－ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ複合体化によって引き起こされる。
好適には、このような効果は、典型的には、本明細書においてＥＧＦＲシグナル伝達又はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達と呼ばれ得る下流のシグナル伝達を含み得る。好適には、このようなＥＧＦＲシグナル伝達には、リン酸化及び／又はケモカイン放出が含まれ得る。
好適には、このようなＥＧＦＲシグナル伝達には、ＥＧＦＲのリン酸化と、それに続くＥＧＦＲ、ＰＬＣ、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２、ｐ３８、及びＳＴＡＴ５などのＥＧＦＲ経路の成分のリン酸化が含まれる。好適には、ＥＧＦＲシグナル伝達には、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ｐ３８などのチロシンキナーゼのリン酸化が含まれる。
好適には、ＥＧＦＲシグナル伝達には、ＩＬ－８などのケモカインの放出の増加が含まれる。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介リン酸化及び／又はケモカイン放出を阻害する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ経路の成分のリン酸化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは：ＥＧＦＲ、ＰＬＣ、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２、ｐ３８、及びＳＴＡＴ５のうちのいずれか１つのリン酸化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは：ＥＧＦＲ、ＰＬＣ、ＪＮＫ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２、ｐ３８、及びＳＴＡＴ５のうちのいずれか１つのＥＧＦＲ媒介リン酸化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、チロシンキナーゼのリン酸化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは：ＪＮＫ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ｐ３８から選択されるチロシンキナーゼのリン酸化を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは：ＪＮＫ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、及びｐ３８から選択されるチロシンキナーゼのＥＧＦＲ媒介リン酸化を阻害する。
したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ケモカインの放出を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－８の放出を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ケモカインのＥＧＦＲ媒介放出を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－８のＥＧＦＲ媒介放出を阻害する。
一実施形態では、ＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
別の実施形態では、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる呼吸器疾患の予防又は治療で使用するためのものであり得る。
更に、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介疾患における異常な上皮生理機能の予防又は治療で使用するためのものであり得る。
一実施形態では、異常な上皮生理機能を改善することによるＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
好適には、ＥＧＦＲ媒介疾患はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患である。
好適には、ＥＧＦＲ媒介効果はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果である。
好適には、ＥＧＦＲ媒介効果はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達である。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することにより疾患又は病態を治療又は予防する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストはＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を阻害する。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ－媒介効果を阻害することにより疾患又は病態を治療又は予防する。
本明細書に記載の「ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果」は、細胞膜においてＲＡＧＥのＥＧＦＲとの複合体化及び結果として生じる異常なＥＧＦＲ活性によって引き起こされる任意の生理学的効果を指す。ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果はまた、本明細書において「ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達」、任意選択的には「ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達」を含んでもよく、及び／又はそのように称してもよい。このようなＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果は、典型的には、上皮に見られ、異常な上皮生理機能として現れる。異常な上皮生理機能は上記で定義されているが、以下に対する悪影響が含まれる場合がある：バリアの完全性；組織と空洞の間の化学物質の調節及び交換；空洞への化学物質の分泌；及び感覚。
好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患及び／又は効果は、異常なＥＧＦＲ活性を特徴とする。好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患及び／又は効果は、異常なＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を特徴とする。好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果及び／又はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達は、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患を特徴とする。
好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患は、異常な上皮生理機能を特徴とする疾患であり得る。
好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患は、呼吸上皮における異常な上皮生理機能を特徴とする疾患であり得る。
好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患は、異常な粘膜毛様体生理機能を特徴とする疾患であり得る。
好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患は、呼吸上皮における異常な粘膜毛様体生理機能を特徴とする疾患であり得る。
好適なＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患は、本明細書中以下において定義される呼吸器疾患のいずれかから選択され得る。
呼吸器疾患
本開示は、上皮生理機能を改善することによるか、又はＥＧＦＲ媒介効果を調節することによる、好適には、ＥＧＦＲ媒介を阻害することによる、好適には、ＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる、呼吸器疾患の予防又は治療のためのＩＬ－３３アンタゴニストの医学的使用に関する。
好適には、異常な上皮生理機能は、呼吸器疾患の症状であり得る。したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、異常な上皮生理機能を特徴とする呼吸器疾患の治療又は予防で使用するためのものであり得る。
更なる実施形態で定義されるとおり、上皮生理機能を改善することによる呼吸器疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
異常な上皮生理機能は、本明細書の他所に定義されている。
好適な上皮生理機能の改善は、異常な上皮生理機能の改善を含んでもよい。
異常な上皮生理機能の改善の好適な手段は、本明細書上記に記載されている。
好適には、異常な上皮生理機能を改善することによる呼吸器疾患の治療は：
粘膜毛様体クリアランスの改善若しくは増加；
粘液産生の低減若しくは阻害；
異常な粘液組成の阻害；
異常な上皮リモデリングの低減若しくは阻害；及び／又は
杯細胞分化若しくは増殖の低減若しくは阻害を含み得る。
これらの効果の各々に関する更なる詳細は、異常な上皮生理機能の治療又は予防に関連して上記で提供されており、本明細書では、呼吸器疾患の治療と組み合わせてもよい。
好適には、異常なＥＧＦＲ活性は、呼吸器疾患の症状であり得る。したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、異常なＥＧＦＲ活性を特徴とする呼吸器疾患の治療又は予防で使用するためのものであり得る。
更なる実施形態で定義されるとおり、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる呼吸器疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
ＥＧＦＲ媒介効果は、本明細書の他所に定義される。
好適には、呼吸器疾患は、下呼吸器疾患であり、好適には、呼吸器疾患は、気管、気管支、細気管支、肺胞管、及び／又は肺胞に影響を与える疾患である。好適には、呼吸器疾患は、気管支疾患である。
好適には、呼吸器疾患は：ＣＯＰＤ、気管支炎、肺気腫、ＣＦ－気管支拡張症又は非－ＣＦ－気管支拡張症などの気管支拡張症、喘息、喘息とＣＯＰＤのオーバーラップ（ＡＣＯ）から選択され得る。
好適には、呼吸器疾患はＣＯＰＤである。好適には、呼吸器疾患は気管支炎性ＣＯＰＤである。気管支炎性ＣＯＰＤは、ＣＯＰＤを有する患者に慢性気管支炎が見られる特定の形態のＣＯＰＤである。気管支炎性ＣＯＰＤは、肺機能の低下が速く、症状が増加し、二次感染のリスクが高まるため、ＣＯＰＤ患者よりも患者の死亡率が高くなる。特に、気管支炎性ＣＯＰＤ患者は総ムチン濃度が高く、粘液分泌過多である。したがって、気管支炎性ＣＯＰＤ患者は、ＩＬ－３３アンタゴニストがＥＧＦＲ活性を阻害し、粘膜毛様体生理機能を改善するという発見によって、本明細書に記載されているように、ＩＬ－３３アンタゴニストによる治療から特に利益を得る可能性がある。
好適には、同じ理由で、呼吸器疾患は、気管支喘息であり得る。
一実施形態では、気管支炎性ＣＯＰＤを予防又は治療するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、患者の気管支炎性ＣＯＰＤを予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。
ＳＴ２シグナル伝達
本開示は、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達及び効果を阻害するためのＩＬ－３３アンタゴニストの医学的使用に関するが、ＩＬ－３３アンタゴニストがＳＴ２媒介シグナル伝達及び効果を阻害し得ることはすでに知られている。したがって、本明細書で記載される医学的使用は、ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果の両方の調節を想定している。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を調節することによる異常な上皮生理機能の予防及び治療で使用するためのものである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を阻害することによる異常な上皮生理機能の予防及び治療で使用するためのものである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を阻害することによる異常な上皮生理機能の予防及び治療で使用するためのものである。異常な上皮生理機能は、本明細書の他所に定義されているとおりである。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を調節することによるＥＧＦＲ媒介疾患の予防及び治療で使用するためのものである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を阻害することによるＥＧＦＲ媒介疾患の予防及び治療で使用するためのものである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を阻害することによるＥＧＦＲ媒介疾患の予防及び治療で使用するためのものである。ＥＧＦＲ媒介疾患は、本明細書の他所に定義されるとおりである。
好適には、ＳＴ２媒介効果は、炎症を含む。したがって、好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を調節することによるＳＴ２媒介疾患の予防及び治療で使用するためのものである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を阻害することによるＳＴ２媒介疾患の予防及び治療で使用するためのものである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ媒介効果及びＳＴ２媒介効果を阻害することによるＳＴ２媒介疾患の予防及び治療で使用するためのものである。好適なＳＴ２媒介疾患としては、炎症を特徴とする疾患を挙げてもよい。好適なＳＴ２媒介疾患としては、炎症性疾患を挙げてもよい。
ＳＴ２媒介疾患又は炎症性疾患としては：ＣＯＰＤ；喘息、慢性副鼻腔炎、食物アレルギー、湿疹、及び皮膚炎などのアレルギー性疾患；肺線維症などの線維増殖性疾患；肺好酸球増多症；胸膜悪性病変；関節リウマチ；膠原血管病；アテローム硬化性血管疾患；蕁麻疹（ｕｔｉｃａｒｉａ）；炎症性腸疾患；クローン病；セリアック病（ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）；全身性エリテマトーデス；進行性全身性硬化症；ウェゲナー肉芽腫症；敗血症性ショック；及びベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）を挙げてもよい。
好適には、ＳＴ２媒介疾患又は炎症性疾患は、呼吸性である。好適には、ＳＴ２媒介疾患又は炎症性疾患は、上記で定義された気道に存在する。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、炎症又は炎症性疾患の予防及び治療で追加的に使用するためのものである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＳＴ２媒介炎症及びＳＴ２媒介炎症性疾患の予防及び治療で追加的に使用するためのものであり得る。
好適には、ＳＴ２媒介疾患及びＥＧＦＲ媒介疾患はオーバーラップする。換言すれば、ＳＴ２媒介効果及びＥＧＦＲ媒介効果、好適には、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果は、疾患病理に寄与する。有利には、単一のＩＬ－３３アンタゴニストの医学的使用は、ＩＬ－３３によるＲＡＧＥとＳＴ２の両方の活性化を阻害する可能性があると考えられている。したがって、単一のＩＬ－３３アンタゴニストは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介性疾患とＳＴ２媒介性疾患の両方を同時に治療し得る。
一実施形態では、異常な上皮生理機能及び炎症の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。一実施形態では、患者における異常な上皮生理機能及び炎症を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを投与することを含む方法が提供される。
好適には、異常な上皮生理機能及び炎症は、呼吸器疾患の症状であってもよい。したがって、これらの症状の治療及び予防に関する記述は、呼吸器疾患の文脈にあってもよく、好適には呼吸器疾患における異常な上皮生理機能及び炎症の治療又は予防を含んでもよい。
一実施形態では、ＥＧＦＲ媒介疾患及びＳＴ２媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストが提供される。
一実施形態では、患者におけるＥＧＦＲ媒介疾患及びＳＴ２媒介疾患を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを投与することを含む方法が提供される。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、還元ＩＬ－３３アンタゴニストである。好適には、還元ＩＬ－３３アンタゴニストは、上記に定義されたとおりである。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、上記に定義されたとおりである。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、３３＿６４００８７－７Ｂである。
あるいは、様々なＩＬ－３３アンタゴニストを組み合わせ療法として使用して、ＩＬ－３３によるＲＡＧＥとＳＴ２の両方の活性化を阻害することができる。したがって、ＩＬ－３３アンタゴニストの組み合わせは、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介性疾患とＳＴ２媒介性疾患の両方を同時に治療することが想定されている。
好適には、呼吸器疾患は、上記に定義されたとおりである。好適には、呼吸器疾患は、異常なＥＧＦＲ活性及び異常なＳＴ２活性を特徴とする。
したがって、好適には、一実施形態では、異常な上皮生理機能の予防又は治療で使用するための第１のＩＬ－３３アンタゴニストと炎症の予防又は治療で使用するための第２のＩＬ－３３アンタゴニストが組み合わせて提供される。
したがって、好適には、一実施形態では、患者における異常な上皮生理機能及び炎症を予防又は治療する方法であって：有効量の第１のＩＬ－３３アンタゴニストを有効量の第２のＩＬ－３３アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む方法が提供される。
したがって、好適には、一実施形態では、ＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するための第１のＩＬ－３３アンタゴニストとＳＴ２媒介疾患の予防又は治療で使用するための第２のＩＬ－３３アンタゴニストが組み合わせて提供される。
したがって、好適には、一実施形態では、患者におけるＥＧＦＲ媒介疾患及びＳＴ２媒介疾患を予防又は治療する方法であって：有効量の第１のＩＬ－３３アンタゴニストを有効量の第２のＩＬ－３３アンタゴニストと組み合わせて投与することを含む方法が提供される。
好適には、第１のＩＬ－３３アンタゴニストは、異常な上皮生理機能及び／又はＥＧＦＲ媒介疾患を予防又は治療するためのものである。
好適には、第２のＩＬ－３３アンタゴニストは、炎症及び／又はＳＴ２媒介疾患を予防及び治療するためのものである。
好適には、第１及び第２のＩＬ－３３アンタゴニストは異なる。
好適には、第１のＩＬ－３３アンタゴニストは上記に定義されたとおりである。好適には、第２のＩＬ－３３アンタゴニストは、ＳＴ２媒介効果を阻害することで知られている任意の他のＩＬ－３３アンタゴニストであってもよい。好適には、第２のＩＬ－３３アンタゴニストもまた、上記に定義されたとおりである。
好適には、第１のアンタゴニストは、還元又は酸化ＩＬ－３３アンタゴニストであってもよい。好適には、第２のＩＬ－３３アンタゴニストは還元ＩＬ－３３アンタゴニストである。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストのうち少なくとも１つは、３３＿６４００８７－７Ｂである。好適には、第１のアンタゴニストは３３＿６４００８７－７Ｂである。
好適には、第１及び第２のＩＬ－３３アンタゴニストは、組み合わせて投与されてもよい。好適には、第１及び第２のＩＬ－３３アンタゴニストは、組み合わせて同時に又は異なる時点で投与されてもよい。好適な投与計画は、医療専門家によって決定され得る。
これらの記述は、ＳＴ－２媒介疾患も予防又は治療され得る上記の医学的使用／治療方法に等しく適用される。
あるいは、更なる実施形態では、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＳＴ２阻害剤と組み合わせて投与されてもよい。好適には、ＳＴ２阻害剤は、ＩＬ－３３アンタゴニストでない場合があるが、他の手段でＳＴ２受容体を阻害する可能性がある。好適には、ＳＴ２阻害剤は、上記のようにＳＴ２媒介疾患を治療又は予防するように機能してもよい。
したがって、一実施形態では、異常な上皮生理機能の治療又は予防で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストと炎症の治療又は予防で使用するためのＳＴ２阻害剤が組み合わせて提供される。
一実施形態では、患者における異常な上皮生理機能及び炎症を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを有効量のＳＴ２阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法が提供される。
好適には、異常な上皮生理機能及び炎症は、呼吸器疾患の症状であってもよい。したがって、これらの症状の治療及び予防に関する記述は、呼吸器疾患の文脈にあってもよく、好適には呼吸器疾患における異常な上皮生理機能及び炎症の治療又は予防を含んでもよい。
したがって、一実施形態では、ＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストとＳＴ２媒介疾患の治療又は予防で使用するためのＳＴ２阻害剤が組み合わせて提供される。
一実施形態では、患者におけるＳＴ２媒介疾患と組み合わされたＥＧＦＲ媒介疾患を予防又は治療する方法であって：有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを有効量のＳＴ２阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法が提供される。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、本明細書の他の箇所で定義されたとおりである。好適なＥＧＦＲ媒介疾患及びＳＴ２媒介疾患は、本明細書の他の箇所で定義されたとおりである。
好適には、ＳＴ２阻害剤は、当該技術分野で公知の任意のこのような阻害剤、例えば、ＧＳＫ３７７２８４７（国際公開第２０１３／１６５８９４号パンフレットに記載）及びＲＧ６１４９（国際公開第２０１３／１７３７６１号パンフレット）であり得、両方とも参照により本明細に組み込まれる。
好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト及びＳＴ２阻害剤は、組み合わせて投与されてもよい。好適には、ＩＬ－３３アンタゴニスト及びＳＴ２阻害剤は、組み合わせて同時に又は異なる時点で投与されてもよい。好適な投与計画は、医療専門家によって決定され得る。
患者
方法及び医学的使用は、患者又は対象に関して実践される。患者は、異常な上皮生理機能、ＥＧＦＲ媒介疾患、又は呼吸器疾患などの生理学的病態又は疾患の識別、診断、又は治療を必要とする患者であってもよい。
好適には、患者はヒトであってもよい。患者は医療を受けているか、又は個体が医療を要求している場合がある。好適には、患者は男性又は女性である。好適には、患者は大人又は子供である。
好適には、本明細書に記載される方法において、好適な患者は、異常な上皮生理機能、又はＥＧＦＲ媒介疾患、又は呼吸器疾患を有していると信じられている者であってもよい。例えば、好適な患者は、このような病態と一致する症状を有し得る。
あるいは、本明細書に記載される方法の文脈における好適な患者は、異常な上皮生理機能、又はＥＧＦＲ媒介疾患、又は呼吸器疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。例えば、このような患者は、このような病態に苦しんでいる個体と接触していた可能性があるか、関連する病態に苦しんでいる可能性があるか、又は喫煙、老年期、アレルギーなどの上記病態に関連する危険因子を満たす可能性がある。
実施形態
本開示の一部は、以下の実施形態によって特徴付けることができる：
実施形態１は、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態２は、ＥＧＦＲ媒介効果が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果である、実施形態１に従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態３は、ＥＧＦＲ媒介効果が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達である、実施形態１又は２に従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態４は、疾患が呼吸器疾患である、実施形態１～３のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態５は、疾患が、異常な上皮生理機能及び／又は異常ＥＧＦＲ活性を特徴とする、実施形態１～４のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態６は、疾患が：ＣＯＰＤ、気管支炎、肺気腫、ＣＦ－気管支拡張症又は－ＣＦ－気管支拡張症などの気管支拡張症、喘息、又は喘息とＣＯＰＤのオーバーラップ（ＡＣＯ）から選択される、実施形態１～５のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態７は、呼吸器疾患が、気管支炎性ＣＯＰＤである、実施形態４～６のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態８は、治療が：粘液クリアランスを改善し；異常な粘液産生を阻害し；異常な上皮リモデリングを阻害し；及び／又は異常な杯細胞分化を阻害する、実施形態１～７のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態９は、ＩＬ－３３アンタゴニストが、酸化ＩＬ－３３の活性を阻害する、実施形態１～８のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態１０は、ＩＬ－３３アンタゴニストが、酸化ＩＬ－３３のＲＡＧＥとの結合を妨げ、それによりＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する、実施形態１～９のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態１１は、ＩＬ－３３アンタゴニストが、抗ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片、好ましくは、抗還元ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１～１０のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態１２は、抗ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片が、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、実施形態１１に従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態１３は、抗ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片が、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアを含む、実施形態１２に従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態１４は、抗ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片が、配列番号３７の配列を有するＶＨＣＤＲ１、配列番号３８の配列を有するＶＨＣＤＲ２、配列番号３９の配列を有するＶＨＣＤＲ３、配列番号４０の配列を有するＶＬＣＤＲ１、配列番号４１の配列を有するＶＬＣＤＲ２、及び配列番号４２の配列を有するＶＬＣＤＲ３を含む、実施形態１１～１３のいずれか１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態１５は、ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号１の配列のＶＨドメインと、配列番号１９の配列のＶＬドメインとを含む、ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片である、実施形態１１～１４のいずれ１つに従って使用するためのＩＬ－３３アンタゴニストについて記載する。
実施形態は、次の図面を参照して、例示として説明する。
図１は、ＭＡＰキナーゼリン酸化抗体アレイの検出アッセイの各々について、非処理の対照と比較した、キナーゼリン酸化の倍増のグレースケールヒートマップを示す。還元ＩＬ－３３（それぞれ、ＩＬ－３３－０１及びＩＬ－３３－１６）は、ベースラインを超えるシグナルは発生しなかった。ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、複数のキナーゼのリン酸化増加を引き起こした。 図２は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性アレイの各刺激条件の信号パターンを示す。それぞれ、ｏｘＩＬ－３３は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対応するＲＴＫアレイで正のシグナルを惹起したが、還元ＩＬ３３－０１及びＩＬ３３－１６は惹起しなかった。ドット強度は、受容体チロシンキナーゼリン酸化と相関する。 図３Ａは、ＩＬ－３３又はＥＧＦＲリガンドの濃度を増加させて刺激された正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞におけるｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）活性を示している。ｏｘＩＬ－３３は、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、及びＴＧＦαと同様にＥＧＦＲのリン酸化を促進したが、還元ＩＬ－３３（ＩＬ３３－０１）は促進しなかった。 図３Ｂは、ＩＬ－３３又はＥＧＦＲリガンドの濃度を増加させて刺激されたＡ５４９細胞におけるｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）活性を示している。ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、ＮＨＢＥ細胞で見られるのと同様のパターンで、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、及びＴＧＦαと同様にＥＧＦＲのリン酸化を促進したが、還元ＩＬ－３３（ＩＬ－３３－０１）は促進しなかった。 図３Ｃは、ＩＬ－３３、ＥＧＦＲリガンド、又はＲＡＧＥリガンドの濃度を増加させて刺激されたＡ５４９細胞におけるｐＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）活性を示している。ｏｘＩＬ－３３は、ＥＧＦと同様にＥＧＦＲのリン酸化を促進したが、野生型（ＷＴ）ＩＬ－３３（ＩＬ－３３－０１）、Ｃ－＞Ｓ変異（ｍｕｔ）ＩＬ－３３（ＩＬ－３３－１６）、又はＲＡＧＥリガンドは促進しなかった。 図４は、ウェスタンブロットで分析した場合、酸化ＩＬ－３３がＥＧＦＲ経路に関与する複数の分子（ＥＧＦＲ、ＰＬＣ、ＡＫＴ、ＪＮＫ、ＥＲＫ １／２、ｐ３８）のリン酸化を誘導することを示している。 図５は、アイソタイプコントロールと比較して、抗ＥＧＦＲ抗体の用量を増やすことにより、ｏｘＩＬ－３３－０１によって誘導されるＳＴＡＴ５リン酸化が減少することを示している。 図６は、抗ＥＧＦＲによる免疫沈降と、それに続くウェスタンブロットによるＥＧＦＲ、ＲＡＧＥ、又はＩＬ－３３の検出を示している。ＩＬ－３３及びＲＡＧＥは、ｏｘＩＬ－３３によるＮＨＢＥ刺激後、ＥＧＦＲと共沈し、複合体を形成することを示唆している。ＲＡＧＥは、ＥＧＦと比較してｏｘＩＬ－３３シグナル伝達複合体に特有であるようにみえる。 図７Ａは、ｏｘＩＬ－３３がＲＡＧＥに直接結合することを示している。ＨＭＧＢ１は既知のＲＡＧＥリガンドであり、この研究ではポジティブコントロールとして機能する。 図７Ｂは、ｏｘＩＬ－３３がＥＧＦＲに直接結合しないことを示している（ただし、既知のＥＧＦＲリガンドＥＧＦは結合する）。しかしながら、ＲＡＧＥをｏｘＩＬ－３３と組み合わせてこのアッセイに添加すると、ＥＧＦＲ結合が見られる。 図８は、抗ＥＧＦＲ又は抗ＲＡＧＥによる免疫沈降と、それに続く、示された時点でのｏｘＩＬ－３３による活性化後の野生型及びＲＡＧＥ欠損Ａ５４９細胞におけるＥＧＦＲ、ＲＡＧＥ、及びＩＬ－３３のウェスタンブロットを示している。 図９は、ｏｘＩＬ－３３－０１によって誘導されるＳＴＡＴ５リン酸化が、抗ＲＡＧＥ抗体によって減少するが、抗ＳＴ２抗体によっては減少しないことを示している。 図１０は、ＥＧＦ及び酸化ＩＬ３３（ｏｘＩＬ３３）がＥＧＦＲ－ＧＦＰ Ａ５４９細胞でＥＧＦＲクラスター化及びインターナリゼーションを誘導することを示している。代表的な画像は、５分間の刺激後に表示される。ヒストグラムは、ＥＧＦ及びｏｘＩＬ－３３で処理された細胞の非クラスター化領域（ヒストグラムのベル形状のピークの左シフト）でのＥＧＦＲの枯渇、及びクラスター化によって引き起こされたこれらの細胞の飽和ピクセル数の増加（強度２５５）を示している。 図１１は、培地のみ（非刺激対照）、３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３－０１、３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３－１６、３０ｎｇ／ｍＬの酸化ＩＬ－３３、又は３０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦで２４時間刺激した後のＮＨＢＥＳ及びＤＨＢＥによるＩＬ－８分泌の倍増を示している。棒グラフは、４つのＮＨＢＥ及び３つのＤＨＢＥドナーからの平均及びＳＥＭを示している。 図１２Ａは、還元ＩＬ－３３、ｏｘＩＬ－３３、又はＥＧＦで処理した後のＡ５４９細胞の相対的な創傷治癒密度を示している。棒グラフは、条件ごとの６つの技術的複製からの平均及びＳＥＭを示している。 図１２Ｂは、還元ＩＬ－３３、ｏｘＩＬ－３３、又はＥＧＦで処理した後のＮＨＢＥ細胞の相対的な創傷治癒密度を示している。棒グラフは、条件ごとの６つの技術的複製からの平均及びＳＥＭを示している。 図１３は、培地のみ（非刺激対照）、還元ＩＬ－３３、酸化ＩＬ－３３、又は抗ＳＴ２、抗ＲＡＧＥ、若しくは抗ＥＧＦＲの存在下での酸化ＩＬ－３３で処理されたＮＨＢＥ細胞のスクラッチ創傷閉鎖率を示している。棒グラフは、条件ごとの６つの技術的複製からの平均及びＳＥＭを示している。 図１４は、酸化ＩＬ－３３による刺激がある場合とない場合の、健康な対象、喫煙者、及びＣＯＰＤからのヒト気管支上皮細胞における相対的な創傷治癒密度を示している。 図１５は、ＤＨＢＥ ＣＯＰＤ細胞（ｎ＝５ドナー）、並びにＩｇＧ１対照、抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）、抗ＲＡＧＥ（Ｍ４Ｆ４）、及び抗ＳＴ２で処理されたＤＨＢＥと比較したＮＨＢＥ細胞（ｎ＝５ドナー）の２４時間での創傷閉鎖（％）を示している。棒グラフは、ｎ＝５の個々のドナーからの平均及びＳＥＭを示している。 図１６Ａは、健康なドナーに由来するＡＬＩ培養物からの基底細胞（ｐ６３＋；青）、繊毛細胞（αチューブリン；紫）、及び杯細胞（ムチン５ａｃ＋ムチンＢ；黄色）の代表的な免疫組織化学染色を示している。 図１６Ｂは、抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）又はアイソタイプコントロール抗体で７日間処理した後、ＨＡＬＯソフトウェアを使用した様々な上皮細胞型の免疫組織化学の定量化を示している。示されているデータは、ｎ＝２～３の個々のドナーからの平均及びＳＥＭである。 図１６Ｃは、抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）又はアイソタイプコントロール抗体で７日間処理した後、ＨＡＬＯソフトウェアを使用した杯細胞の定量化を示している。示されているデータは、ｎ＝２～３の個々のドナーからの平均及びＳＥＭである。 図１７は、健康な（ｈｅａｔｈｙ）（１ドナー）又はＣＯＰＤ（１ドナー）由来のＡＬＩ培養物における個々のムチン（ムチン５ＡＣ及びムチン５Ｂ）の染色例、及び抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）による７日間の処理後のＣＯＰＤ培養物におけるムチン染色の減少を示している。 図１８は、非処理と比較した抗ＩＬ－３３で処理された個々のドナーからのＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物で見られる細胞サブタイプの異なる比率を示すｔＳＮＥプロットを示している。 図１９Ａは、正常なドナーからのＡＬＩ培養物中の杯細胞を検出する代表的なフローサイトメトリー輪郭プロットを示している。Ｍｕｃ５Ｂはｘ軸上にあり、Ｍｕｃ５ＡＣはｙ軸上にある。ＡＬＩ培養物をタンパク質で７日間処理した。還元ＩＬ－３３（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）による処理は、杯細胞をベースラインより上に増加させなかった。ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、ＩＬ－１３と同様に杯細胞の割合を増加させた。ＩＬ－１３は、ＡＬＩ培養物で杯細胞を増加させることが知られており、この研究ではポジティブコントロールとして使用される。象限の数字は、総個体数のパーセンテージを示している：左上の象限のＭｕｃ５ＡＣ単一陽性杯細胞、右下の象限のＭｕｃ５Ｂ単一陽性杯細胞、並びに右上の象限のＭｕｃ５ＡＣ及びＭｕｃ５Ｂ二重陽性杯細胞。 図１９Ｂは、全上皮個体数に対する杯細胞（Ｍｕｃ５ＡＣ単一陽性、Ｍｕｃ５Ｂ単一陽性、並びにＭｕｃ５ＡＣ及びＭｕｃ５Ｂ二重陽性杯細胞を合わせた）の割合を示す正常なドナー（ｎ＝６）からのＡＬＩ培養物由来の合わせたフローサイトメトリーデータを示している。還元ＩＬ－３３（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］））は、杯細胞をベースラインより上に増加させなかった。ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、ＩＬ－１３と同様に杯細胞の割合を増加させた。バイオリンプロットは、全てのデータポイントと中央値を示している。 図１９Ｃは、Ｍｕｃ５ＡＣ単一陽性杯細胞を示す正常なドナー（ｎ＝６）からのＡＬＩ培養物由来の合わせたフローサイトメトリーデータを示している。還元ＩＬ－３３（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）は、杯細胞をベースラインより上に増加させなかった。ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、ＩＬ－１３と同様に杯細胞の割合を増加させた。バイオリンプロットは、全てのデータポイントと中央値を示している。 図１９Ｄは、ＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡで倍率変化を示す正常なドナー（ｎ＝４）からのＡＬＩ培養物由来の合わせたＲＴ－ｑＰＣＲデータを示している。還元ＩＬ－３３（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）は、ＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡを増加させなかった。ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、ＩＬ－１３と同様にＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡを増加させた。バイオリンプロットは、全てのデータポイントと中央値を示している。 図２０Ａは、健康なドナーに由来するＡＬＩ培養物からの基底細胞（ｐ６３＋；紫）、繊毛細胞（αチューブリン；濃い灰色がかった青）、及び杯細胞（Ｍｕｃ５ａｃ＋Ｍｕｃ５Ｂ；黄色）の代表的な免疫組織化学染色を示している。還元ＩＬ－３３（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）は、杯細胞を視覚的に増加させなかった。ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、杯細胞の視覚的増加を引き起こした。 図２０Ｂは、ＨＡＬＯソフトウェアを使用した、免疫組織化学画像（条件ごとに最低ｎ＝３ドナー）からのムチン５ａｃ＋ムチン５ｂの面積の定量化（％総上皮組織面積）を示している。非処理及び還元ＩＬ－３３処理対照と比較して、ｏｘＩＬ－３３及びＩＬ－１３は、ムチン染色の領域を増加させる。 図２１Ａは、ＣＯＰＤドナーからのＡＬＩ培養物中の杯細胞を検出する代表的なフローサイトメトリー輪郭プロットを示している。Ｍｕｃ５Ｂはｘ軸上にあり、Ｍｕｃ５ＡＣはｙ軸上に描かれている。ＡＬＩ培養物を抗体で７日間処理した。抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）処理は、全杯細胞数を減少させた。象限の数字は、総個体数のパーセンテージを示している：左上の象限のＭｕｃ５ＡＣ単一陽性杯細胞、右下の象限のＭｕｃ５Ｂ単一陽性杯細胞、並びに右上の象限のＭｕｃ５ＡＣ及びＭｕｃ５Ｂ二重陽性杯細胞。 図２１Ｂは、全杯細胞（Ｍｕｃ５ＡＣ単一陽性、Ｍｕｃ５Ｂ単一陽性、並びにＭｕｃ５ＡＣ及びＭｕｃ５Ｂ二重陽性杯細胞を合わせた）を示すＣＯＰＤドナー（ｎ＝６）からのＡＬＩ培養物由来の合わせたフローサイトメトリーデータを示している。ＡＬＩ培養物を抗体で７日間処理した。抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）処理は、全杯細胞数を減少させた。バイオリンプロットは、全てのデータポイントと中央値を示している。 図２１Ｃは、Ｍｕｃ５ＡＣ単一陽性杯細胞を示すＣＯＰＤドナー（ｎ＝６）からのＡＬＩ培養物由来の合わせたフローサイトメトリーデータを示している。ＡＬＩ培養物を抗体で７日間処理した。抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）処理は、Ｍｕｃ５ＡＣ単一陽性杯細胞の数を減少させた。バイオリンプロットは、全てのデータポイントと中央値を示している。 図２１Ｄは、ＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡで倍率変化を示すＣＯＰＤドナー（ｎ＝５）からのＡＬＩ培養物由来の合わせたＲＴ－ｑＰＣＲデータを示している。抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）処理は、ＭＵＣ５ＡＣ発現を減少させた。バイオリンプロットは、全てのデータポイントと中央値を示している。 図２１Ｅは、ＬＤ陰性細胞染色によって判断されるように、処理条件全体にわたっての総生存率を示すＣＯＰＤドナー（ｎ＝６）からのＡＬＩ培養物由来の合わせたフローサイトメトリーデータを示している。 図２２Ａは、ＣＯＰＤドナーに由来するＡＬＩ培養物からの基底細胞（ｐ６３＋；紫）、繊毛細胞（αチューブリン；濃い灰色がかった青）、及び杯細胞（Ｍｕｃ５ａｃ＋ＭｕｃＢ；黄色）の代表的な免疫組織化学染色を示している。抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）の７日間の処理は、杯細胞の視覚的減少を引き起こした。 図２２Ｂは、ＨＡＬＯソフトウェアを使用した、免疫組織化学画像（ｎ＝４ドナー）からのＭｕｃ５ａｃ＋Ｍｕｃ５ｂの面積の定量化（％総上皮組織面積）を示している。非処理及びヒトＩｇＧ１処理対照と比較して、抗ＩＬ－３３（３３－６４００８７＿７Ｂ）は、ムチン染色の面積を減少させる。 図２３Ａは、ＣＯＰＤ及び健康なＡＬＩ培養物から得られた頂端洗浄液内のＭｕｃ５ＡＣの定量化を示している。Ｍｕｃ５ＡＣ ＥＬＩＳＡで判断すると、ＣＯＰＤ培養物ではＭｕｃ５ＡＣレベルが高くなる。 図２３Ｂは、健康なＡＬＩ培養物から得られた頂端洗浄液内のＭｕｃ５ＡＣの定量化を示している。ＡＬＩ培養物は、Ｍｕｃ５ＡＣ ＥＬＩＳＡで測定した場合、還元ＩＬ－３３ｍｕｔ１６（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）、ｏｘＩＬ－３３、及び野生型ＩＬ－３３で処理した。 図２３Ｃは、ＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物から得られた頂端洗浄液内のＭｕｃ５ＡＣの定量化を示している。細胞をヒト及びマウスＩｇＧ１対照（ｈＩｇＧ１及びｍＩｇＧ１）、３３－６４００８７＿７Ｂ又は抗ＳＴ２抗体で処理した。抗ＩＬ－３３（３３－６４００８７＿７Ｂ）による処理は、Ｍｕｃ５ＡＣ ＥＬＩＳＡで測定した場合、Ｍｕｃ５ＡＣレベルを減少させた。
実施例１－酸化ＩＬ－３３は、ＲＡＧＥとＥＧＦＲの間のシグナル伝達複合体の形成を促進する
Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：８３２７（２０１５）では、出願人は、ＩＬ－３３の酸化されたジスルフィド結合型（ＤＳＢ ＩＬ－３３）の発見について記載しており、この型がＳＴ２に結合せず、ＳＴ２依存シグナル伝達を活性化できないことを示した。続いて（国際公開第２０１６１５６４４０Ａ１号パンフレットを参照）、出願人は、ｏｘＩＬ－３３が終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）に結合し、ＲＡＧＥ依存的にシグナル伝達してＳＴＡＴ５を活性化し、上皮の移動に影響を与えることを示した。
ｏｘＩＬ－３３の機能を更に調査するために、上皮細胞を還元型又は酸化型のＩＬ－３３で刺激し、シグナル伝達経路を調べた。本明細書において、本発明者らは、ｏｘＩＬ－３３が終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ）と上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の複合体の新規リガンドであり、上皮機能に重大な影響を与えることを示す。
１．ＩＬ３３のヒト成熟及びシステイン変異バリアントのクローニング及び発現
ヒトＩＬ－３３（１１２～２７０）；受託番号（ＵｎｉＰｒｏｔ）０９５７６０（ＩＬ３３－０１又はＩＬ－３３とも称される）の成熟成分、及び４つのシステイン残基をセリンに突然変異させたバリアント（ＩＬ３３－１６又はＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）をコードするｃＤＮＡ分子をプライマー伸長ＰＣＲによって合成し、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１（ＤＮＡ２．０）にクローニングした。野生型（ＷＴ）及び突然変異体ＩＬ－３３コード配列は、タンパク質のＮ末端に１０ｘＨｉｓ、Ａｖｉｔａｇ、及び第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位（ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＡＡＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＡＡＩＥＧＲ 配列番号４３）を含有するように修飾した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換することにより、Ｎ末端タグ付加Ｈｉｓ１０／Ａｖｉｔａｇ ＩＬ３３－０１（ＷＴ、配列番号４４）、及びＮ末端タグ付加Ｈｉｓ１０／Ａｖｉｔａｇ ＩＬ３３－１６（ＷＴ、配列番号４５）を作成した。形質転換細胞を自己誘導培地（Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，７１３００－４）中３７℃で１８時間培養した後、細胞を遠心分離によって回収し、－２０℃で保存した。細胞を、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ，１１６９７４９８００１）及び５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，７０７４６－３）を含有する２×ＤＰＢＳ中に再懸濁させて、音波処理で溶解させた。細胞溶解物は、４℃で３０分間、５０，０００×ｇで遠心分離することにより清澄化した。ＩＬ－３３タンパク質は、固定化金属親和性クロマトグラフィーにより上清から精製し、２×ＤＰＢＳ、１ｍＭのＤＴＴで５ｍＬ／分で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７３７１２０５）にロードした。カラムを、２×ＤＰＢＳ、１ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄して不純物を除去し、次いで２×ＤＰＢＳ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１１４で洗浄してエンドトキシンの固定化タンパク質を除去した。２×ＤＰＢＳ、１ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で更に洗浄した後、サンプルを２×ＤＰＢＳ、１ｍＭのＤＴＴ、４００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出した。ＩＬ－３３は、２×ＤＰＢＳで２．５ｍＬ／分にてＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ２６／６００ ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８９８９３３４）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。ピーク画分をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。純粋ＩＬ－３３を含有する画分をプールし、２８０ｎｍの吸光度によって濃度を計測した。最終試料をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。
非タグ化ＩＬ－３３を作成するため、Ｎ末端タグ付加Ｈｉｓ１０／Ａｖｉｔａｇ ＩＬ３３を２×ＤＰＢＳバッファー中タンパク質１ｍｇ当たり１０単位の第Ｘａ因子（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２７０８４９０１）と共に室温で１時間インキュベートした。ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８９８９３３３）で２×ＤＰＢＳ中ＳＥＣクロマトグラフィーを用いて、流量を１ｍＬ／分で、非タグ化ＩＬ－３３を精製した。
２．酸化ＩＬ－３３（ｏｘＩＬ－３３）の作成及び精製
還元ＩＬ３３－０１は、６０％ＩＭＤＭ培地（フェノールレッドを含まない）、４０％ＤＰＢＳ中で最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、３７℃で１８時間インキュベートすることにより酸化した。酸化プロセス中に生じた凝集物は、ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓアニオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７５４７０５５）にロードすることにより、サンプルから除去した。ロードする前に、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９．０をｐＨが８．３に達するまで添加し、最終濃度が１２５ｍＭになるように５ＭのＮａＣｌを添加することにより、サンプルを調整した－これらのロード条件下で、カラムに結合した凝集物とモノマーのｏｘＩＬ－３３が結合せずに流れ、回収された。タグは、２２℃で１２０分間、５０μｇのｏｘＩＬ－３３当たり１μｇの第Ｘａ因子の最終濃度で第Ｘａ因子（ＮＥＢ，Ｐ８０１０Ｌ）とインキュベートすることにより、ｏｘＩＬ－３３から切断した。残存する還元ＩＬ－３３をサンプルから除去するために、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－Ｈｉｓ６に融合した可溶性ヒトＳＴ２Ｓ細胞外ドメインを、サンプルとともに２２℃で３０分間インキュベートし、還元ＩＬ－３３に結合させた。サンプルを３，０００Ｄａカットオフの遠心濃縮器で濃縮し、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／６００ ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８９８９３３４）に２ｍＬ／分の流速でロードし、モノマーのｏｘＩＬ－３３を、他のサンプル成分から分離した。純粋なｏｘＩＬ－３３を含有する画分をプールして濃縮し、サンプルの最終濃度を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度分光法によって計測した。最終生成物の品質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰ－ＳＥＣ、及びＲＰ－ＨＰＬＣによって評価した。
３．ヒトＳＴ２ＥＣＤのクローニング、発現、及び精製
内因性シグナルペプチド（アミノ酸残基１９－３２８）を有さないＳＴ２（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションＱ０１６３８－２）の天然に存在するＳＴ２Ｓ可溶性アイソフォームをコードするｃＤＮＡを、ギブソンアセンブリと適合する伸長をコードするプライマー及びＳＴ２Ｓコード配列のＮ末端に融合したＣＤ３３シグナルペプチドを用いてＰＣＲで増幅した。Ｃ末端にＨｉｓ６タグを有するヒトＩｇＧ１Ｆｃのコード配列も同様に増幅した。ＳＴ２Ｓ ｃＤＮＡ及びＩｇＧ１ Ｆｃ－Ｈｉｓ６ ｃＤＮＡは、ギブソンアセンブリを使用して、ＥＢＶからのＯｒｉＰ複製起点を持つ哺乳類のＣＭＶプロモーター駆動型発現ベクターであるｐＤＥＳＴ１２．２ＯｒｉＰを使用してアセンブルし、ＥＢＮＡ－１タンパク質を発現する細胞株のエピソーム維持を可能にした。タンパク質発現のために、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを使用して、プラスミドを、ＥＢＮＡ－１を過剰発現するＣＨＯ細胞の懸濁培養液に一次的に形質転換した。分泌されたＳＴ２Ｓ－Ｆｃ－Ｈｉｓ６融合タンパク質を含む条件培地をトランスフェクションの７日後に回収し、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（プロテインＡ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１１－００３４－９５）親和性クロマトグラフィーカラムに２ｍＬ／分でロードした。カラムを２×ＤＰＢＳで洗浄し、タンパク質を２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．６で溶出した。ＳＴ２Ｓ－Ｆｃ－Ｈｉｓ６を含有する画分をプールし、２×ＤＰＢＳで２ｍＬ／分にて平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８９８９３３６）にロードした。純粋なＳＴ２Ｓ－Ｆｃ－Ｈｉｓ６タンパク質を含有する画分をプールし、２８０ｎｍの吸光度によって濃度を計測した。最終試料をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。
４．ヒトアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）ＥＣＤのクローニング、発現、及び精製
細胞質ドメイン及び膜貫通ドメイン（アミノ酸残基６２－２９１）を有さないアシアロ糖タンパク質受容体（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションＰ０７３０６）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡを、ＧｅｎｅａｒｔでＣＤ３３シグナルペプチドとそれに続くＥＣＤドメインのＮ末端に融合したＨｉｓ１０＿Ａｖｉタグ配列を用いて化学合成した。コンストラクトを、ＥＢＶからのＯｒｉＰ複製起点を持つ哺乳類のＣＭＶプロモーター駆動型発現ベクターであるｐＤＥＳＴ１２．２ＯｒｉＰに直接クローン化し、ＥＢＮＡ－１タンパク質を発現する細胞株のエピソーム維持を可能にした。タンパク質発現のために、トランスフェクション試薬として２９３フェクチンを使用して、プラスミドを、ＨＥＫ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞の懸濁培養液に一次的に形質転換した。分泌されたＨｉｓＡＶｉ＿ｈＡＳＧＰＲ ＥＣＤ融合タンパク質を含む条件培地を、固定化金属親和性クロマトグラフィーにより、トランスフェクションの７日後に回収し、２×ＤＰＢＳで４ｍＬ／分にて平衡化したＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７３７１２０５）にロードした。カラムを２×ＤＰＢＳ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄して不純物を除去し、サンプルを２×ＤＰＢＳ、４００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出した。ヒトＡＳＧＰＲ ＥＣＤは、２×ＤＰＢＳで１ｍＬ／分にてＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １６／６００ ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２８－９８９３－３３）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。ピーク画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。純粋なモノマーＡＳＧＰＲを含有する画分をプールし、２８０ｎｍの吸光度によって濃度を計測した。最終試料をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。
５．酸化型のＩＬ－３３はＭＡＰキナーゼ経路を活性化する
正常なヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞（ＣＣ－２５４０）をＬｏｎｚａから入手し、製造元のプロトコルに従い完全ＢＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）に維持した。ＮＨＢＥをアキュターゼ（ＰＡＡ，＃Ｌ１ １－００７）で回収し、培養培地［ＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）及び補充キット（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－４１７５）］の６ウェルディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，３５１６）に１×１０６／２ｍＬで播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。この時間経過後、培地をアスピレーションし、細胞を１ｍＬ ＰＢＳで２回洗浄した後、飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）を添加した。次いで、刺激の前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に１８～２４時間インキュベートした。
ＭＡＰキナーゼリン酸化抗体アレイキット（ａｂ２１１０６１）はＡｂｃａｍから購入し、製造元の指示に従って実験を実施した。１８～２４時間飢餓状態にした６ウェルディッシュのＮＨＢＥは、非処理のままにするか、又は３０ｎｇ／ｍＬの還元ＩＬ－３３、ＩＬ－３３－１６、又は酸化ＩＬ－３３のいずれかで処理した後、３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベータに戻した（このアッセイで使用した活性剤については、表２を参照されたい）。プレートをインキュベータから取り外し、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、キットに付属の１×溶解バッファーを１ウェル当たり１００μＬ添加した。タンパク質抽出物を１．５ｍＬチューブに移した後、４℃にて１４，０００ｒｐｍで清澄化した。タンパク質濃度はＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ，２３２２５）を使用して測定し、アレイメンブレン当たり２５０μｇの総タンパク質を使用した。その後の全ての工程は製造業者の指示に従って実施した。メンブレンをＬｉＣｏｒ Ｃ－ｄｉｇｉｔで視覚化し、Ｉｍａｇｅ Ｌｉｔｅスタジオを使用して定量化した。
Figure 2023500492000007
野生型（ＩＬ－３３）及びＣ－＞Ｓ（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）還元型のＩＬ－３３（それぞれ、ＩＬ３３－０１及びＩＬ３３－１６）とは対照的に、酸化ＩＬ３３－０１（ｏｘＩＬ－３３）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）が関与する経路と一致する複数の重要なシグナル伝達分子を活性化した（図１）。
６．酸化型のＩＬ－３３は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を活性化する
ｏｘＩＬ－３３によって活性化された受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を同定するために、７１ＲＴＫアレイを使用してスクリーニングを実施した。ＲＴＫリン酸化抗体アレイキット（ａｂ１９３６６２）はＡｂｃａｍから購入し、製造元の指示に従って実験を実施した。ＮＨＢＥを培養し、培養培地［ＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）及び補充キット（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－４１７５）］の６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，３５１６）に１×１０６／２ｍＬで播種した。細胞を３７℃で、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。この時間経過後、培地をアスピレーションし、細胞を１ｍＬ ＰＢＳで２回洗浄した後、飢餓培地（補充キットなしのＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）を添加した。次いで、刺激の前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に１８～２４時間インキュベートした。ＭＡＰキナーゼアレイについて前述したのと同じ手順に従って、細胞を活性化し（表２の活性化因子）、溶解し、アレイメンブレン当たり２５０μｇの総タンパク質を使用した。その後の全ての工程は製造業者の指示に従って実施した。メンブレンをＬｉＣｏｒ Ｃ－ｄｉｇｉｔで視覚化し、Ｉｍａｇｅ Ｌｉｔｅスタジオを使用して定量化した。還元野生型（ＩＬ－３３）又はＣ－＞Ｓ（ＩＬ－３３［Ｃ－＞Ｓ］）ＩＬ－３３（それぞれ、ＩＬ３３－０１及びＩＬ３３－１６）のいずれに対しても応答は検出されなかった。しかしながら、ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対応するＲＴＫアレイで正のシグナルを惹起した（図２）。
ＥＧＦＲシグナル伝達を刺激するｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）の能力を、更なる方法によって確認した。活性化後、ＥＧＦＲをＴｙｒ１０６８でリン酸化し、このホスホ－ＥＧＦＲを、均一ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）ＨＴＲＦ（登録商標）（均一時間分解蛍光、Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏキット ＃６４ＥＧ１ＰＥＨ）を用いて検出することができる。要約すると、ＮＨＢＥを、培養培地［ＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）及び補充キット（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－４１７５）］の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，３５９８）中で５×１０５／１００μＬでプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。この時間経過後、培地をアスピレーションし、細胞を０．２ｍＬ ＰＢＳで２回洗浄した後、飢餓培地（補充キットなしのＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）を添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に１８～２４時間インキュベートした後、ＩＬ－３３－０１、ＩＬ－３３－１６、及びｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）、並びにＥＧＦＲリガンド（表２及び３）の濃度を上げて刺激した後、３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベータに戻した。培地をアスピレーションし、ウェル当たり５０μＬの溶解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ，６４ＥＧ１ＰＥＨ）と交換した。次いで、アッセイは、製造元の指示（Ｃｉｓｂｉｏ，６４ＥＧ１ＰＥＨ）に従って実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して６２０ｎｍ及び６６５ｎｍ発光波長で時間分解蛍光を読み取った。データを、６６５／６２０ｎｍの比率を計算することによって分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を用いたカーブフィッティングによりＥＣ５０値を決定した。
Figure 2023500492000008
同様に、ＥＧＦＲリン酸化を、このセクションで前述したように、ＨＴＲＦアッセイを利用して上皮細胞株Ａ５４９で評価した。要約すると、Ａ５４９をＡＴＣＣから入手し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地で培養した。細胞をアキュターゼ（ＰＡＡ，＃Ｌ１ １－００７）で回収し、５×１０５／１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。次いで、ウェルを１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、１００μＬの飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。細胞を、ＩＬ－３３－０１、ＩＬ－３３－１６、及びｏｘＩＬ－３３－０１（酸化ＩＬ－３３－０１の別名）、ＥＧＦＲリガンド、並びにＲＡＧＥリガンド（表２及び３）の濃度を上げて刺激した後、３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベータに戻した。培地をアスピレーションし、ウェル当たり５０μＬの溶解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ，６４ＥＧ１ＰＥＨ）と交換した。次いで、アッセイは、製造元の指示（Ｃｉｓｂｉｏ，６４ＥＧ１ＰＥＨ）に従って実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して６２０ｎｍ及び６６５ｎｍ発光波長で時間分解蛍光を読み取った。データを、６６５／６２０ｎｍの比率を計算することによって分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を用いたカーブフィッティングによりＥＣ５０値を決定した。
ＮＨＢＥ細胞とＡ５４９細胞の両方で、ｏｘＩＬ－３３は、真正アゴニストであるＥＧＦと同様にＥＧＦＲのリン酸化を促進した（図３）。これは、試験された他のＲＡＧＥリガンドでは再現されなかった。
７．シグナル伝達成分のウェスタンブロット
ウェスタンブロット実験を実施して、ＥＧＦＲシグナル伝達複合体のどの要素がｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ３３－０１）に応答して活性化されるかを更に調査した。ＮＨＢＥを培養し、上記のセクション５で説明したように６ウェルディッシュにプレーティングした。血清飢餓の後、細胞をｏｘＩＬ－３３（３０ｎｇ／ｍＬ）で５～２４０分間刺激した。次いで培地をアスピレーションし、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、１５０μＬの溶解バッファー［１×ＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮＰ０００８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（ＶＷＲ，７７８６－３０－３）、２．５％のβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｍ６２５０）、及び０．４μｇ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，７０７４６）］を添加した。細胞を氷上に１０分間置いた後、溶解物を１．５ｍＬチューブに移し、９０℃に５分間加熱した。溶液を新しい１．５ｍＬチューブに移し、１０μＬのサンプルと５μＬのタンパク質ラダー（ＢｉｏＲａｄ，１６１０３７４）を、ＭＥＳランニングバッファー（Ｂ０００２）中の４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮＷ０４１２７ＢＯＸ）で泳動した。Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ゲルをＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ，１７０４１５６）に転写した。ＰＶＤＦメンブレンを５％スキムミルクパウダー（Ｍａｒｖｅｌ）を含むＰＢＳ－ｔｗｅｅｎ溶液で１０分間ブロックした。次いで、メンブレンを、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ－ｔｗｅｅｎ中の一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、メンブレンを、ＰＢＳ－ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、５％スキムミルクパウダーを含むＰＢＳ－ｔｗｅｅｎ中の二次ＨＲＰタグ付き抗体とともに室温で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンをＰＢＳ－ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、ＥＣＬ（ＢｉｏＲａｄ，１７０５０６２）を添加し、Ｌｉｃｏｒ Ｃ－ｄｉｇｉｔを可視化した。
結果は、ｏｘＩＬ－３３－０１がいくつかのＥＧＦＲシグナル伝達成分を活性化したことを示している（図４）。
８．ｏｘ－ＩＬ－３３はＳＴＡＴ－５リン酸化を誘導し、これはＥＧＦＲ中和Ａｂによってブロックされる
次に、ＥＧＦＲへの結合を妨げることによってｏｘＩＬ３３媒介ＳＴＡＴ５活性化を阻害できるかどうかを確認することが求められた。要約すると、Ａ５４９細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地で培養した。細胞をアキュターゼで回収し、５×１０５／１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。次いで、ウェルを１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、１００μＬの飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。抗ＥＧＦＲ抗体（クローンＬＡ１（０５－１０１，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はアイソタイプコントロール（ＭＡＢ００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用量依存的にウェルに添加し、プレートを３０分間インキュベータに戻した。次いで、プレートを酸化ＩＬ－３３（３０ｎｇ／ｍＬ）で３０分間刺激した後、ｐｈｏｓｈｏ－ＳＴＡＴ５ ＥＬＩＳＡキット溶解バッファー（８５－８６１１２－１１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶解し、製造元の指示に従って展開して、４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。図５で示すように、ｏｘＩＬ－３３－０１で活性化された細胞は、ＳＴＡＴ５のリン酸化を示し、これは、抗ＥＧＦＲ抗体の存在下で減少する（図５）。
実施例２－酸化ＩＬ－３３は、ＥＧＦＲとＲＡＧＥの間の複合体形成を誘導する
９．ｏｘＩＬ－３３は、ＥＧＦＲとＲＡＧＥの間の複合体形成を誘導する
ＲＡＧＥ及びＥＧＦＲがｏｘＩＬ－３３のシグナル伝達の促進にどのように関与しているかを理解するために、免疫沈降実験を行ってシグナル伝達複合体を調べた。まず、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓに共有結合した。抗ＥＧＦＲ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ２３１）の２つの１００μｇバイアルを、４０ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ，１４３１１Ｄ）とインキュベートし、製造元の指示に従って共有結合させた。カップリングが成功した後、ビーズを３０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳに再懸濁させ、４℃に維持した。
ＮＨＢＥをＬｏｎｚａから入手し（ＣＣ－２５４０）、冷凍バイアルを１５ｃｍのディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ，１５７１５０）に１ディッシュ当たり１×１０６の細胞で直接播種した。ＮＨＢＥは、製造元のプロトコルに従って完全ＢＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）で１か月間維持され、細胞がコンフルエントに達するまで３日ごとに培地を交換した。この時間の間、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。刺激の前日、プレートを２０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、１５ｍＬの飢餓培地（補充キットなしのＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）を添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に１８～２４時間インキュベートした後、培地のみ（非刺激対照）、３０ｎｇ／ｍＬの還元ＩＬ－３３－０１、３０ｎｇ／ｍＬの酸化ＩＬ－３３－０１、又は３０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦで刺激し、３７℃、５％ＣＯ２に１０分間戻した。培地をアスピレーションし、プレートを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、１５ｃｍの１ディッシュ当たり、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ，７８４４０）を含有する１ｍＬの溶解バッファー（Ａｂｃａｍ，ａｂ１５２１６３）を添加した。細胞を溶解バッファーにこすり落とした後、２ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｚ６６６５１３）に移し、４℃にて１４，０００ｒｐｍで回転させて清澄化した。タンパク質濃度はＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ，２３２２５）を使用して決定し、全てのタンパク質抽出物を、溶解バッファーで３ｍｇ／ｍＬに正規化した。６ｍｇの総タンパク質抽出物を、１００μＬの抗ＥＧＦＲ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（上記）と透明な２ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブでインキュベートした。次いで、チューブを、４℃にて５時間、転倒式ミキサーに配置した。磁石（ＢｉｏＲａｄ，１６１４９１６）を使用して、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを固定化し、タンパク質抽出物をアスピレーションし、２ｍＬの洗浄バッファー１（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５（Ｔｈｅｒｍｏ，１５５６７０２７）、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ １００（Ｓｉｇｍａ，Ｘ１００）、０．３ＭのＮａＣｌで置換した。これを４回以上繰り返した。次いで、ビーズを同じ方法で洗浄バッファー２（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５）で更に１０回洗浄した。最後の洗浄ステップの後、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０中の１％Ｒａｐｉｇｅｓｔ（ｗ／ｖ）（Ｗａｔｅｒｓ，１８６００１８６１）５０μＬをビーズに添加し、６０℃で１０分間加熱した。次いで、上清を新しいＬｏＢｉｎｄ ２ｍＬチューブに移した。更に５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０ １００μＬを樹脂に添加し、混合した後、最初の溶出液と合わせた。次いで、ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ，６４６５４７）を最終濃度が５ｍＭになるように添加し、サンプルを６０℃で１０分間加熱した。次いで、溶出液を、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ，１６１２５）を暗所、室温で２０分間１０ｍＭまで添加することによりアルキル化した。アルキル化は、１０ｍＭまでＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ５５４５）を添加することによってクエンチした。次いで、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー５０ｍＭ ｐＨ８．０を添加して、最終サンプル量を５００μＬにした。チューブ当たり０．５μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｖ５１１１）を添加し、サンプルを４００ｒｐｍの振盪プラットフォームで３０℃で一晩消化した。次いで、サンプルをトリフルオロ酢酸（Ｓｉｇｍａ，３０２０３１）で最終濃度２．０％（ｖ／ｖ）に酸性化し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、サンプルを１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を新しい２ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブに移した。次いで、製造元の指示に従って、サンプルをＣ１８カラム（Ｔｈｅｒｍｏ，８７７８４）で処理した。次いで、サンプルをｓｐｅｅｄ－ｖａｃを使用して乾燥させた後、－２０℃で保存した。次いで、ペプチドマスフィンガープリンティング質量分析（ＰＭＦ－ＬＣ－ＭＳ）によってサンプルを分析した。Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェアを使用して結果を分析した。
ＥＧＦＲは、４つの条件全てで同様に検出され、免疫沈降が全てのサンプルでうまく機能したことを示唆していた。ＲＡＧＥ及びＩＬ－３３は、ＩＬ３３－０１（ＩＬ－３３）又はＥＧＦで処理されたサンプルとは対照的に、ｏｘＩＬ－３３で処理されたサンプルで検出され、これはｏｘＩＬ－３３とＲＡＧＥがシグナル伝達中にＥＧＦＲと関連していたことを示唆していた。ｏｘＩＬ－３３及びＥＧＦによるこれらの細胞におけるＥＧＦＲ活性化の以前の観察と一致して、ＥＧＦＲシグナル伝達及びエンドサイトーシスに関与すると以前に報告されたタンパク質は、これらのリガンドによる刺激後に検出されたが、還元ＩＬ３３－０１では検出されなかった（表４）。
表４は、還元ＩＬ－３３－０１（ＩＬ－３３）、ｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）、又はＥＧＦで刺激されたＮＨＢＥのＬＣＭＳ分析を示している。ＩＬ－３３及びＲＡＧＥは、ｏｘＩＬ－３３による刺激後、ＥＧＦＲと複合体を形成して検出されるが、還元ＩＬ３３－０１（ＩＬ－３３）又はＥＧＦによる刺激後は検出されない。括弧は、各タンパク質について同定された固有のペプチドの数を示す。
Figure 2023500492000009
これらの観察結果を確認するために、上記のプロトコルに従って調製した細胞溶解物に対して免疫沈降及びウェスタンブロットも実施した。ＮＨＢＥタンパク質抽出物濃度の測定後、３ｍｇの総タンパク質を６μｇの抗ＥＧＦＲ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ２３１）とともに１．５ｍＬチューブ内でインキュベートし、４℃で２．５時間、転倒式ミキサーに配置した。次いで、１．５ｍｇのプロテインＡ／Ｇ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ，８８８０２）を各チューブに添加し、次いでチューブを混合しながら更に１時間４℃に戻した。次いで、ビーズを磁石（ＢｉｏＲａｄ，１６１４９１６）で回収し、５００μＬの（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ及び０．２５Ｍ ＮａＣｌ）で３回、５００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）で１回洗浄した。次いで、還元剤（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮＰ０００４）を含む３５μＬのＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮＰ０００８）を使用し、９５℃で５分間加熱して、タンパク質を磁気ビーズから放出した。溶液を新しい１．５ｍＬチューブに移し、１０μＬのサンプルと５μＬのタンパク質ラダー（ＢｉｏＲａｄ，１６１０３７４）を、ＭＥＳランニングバッファー（Ｂ０００２）中の４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ，ＮＷ０４１２７ＢＯＸ）で泳動した。Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ゲルをＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ，１７０４１５６）に転写した。ＰＶＤＦメンブレンを５％スキムミルクパウダー（Ｍａｒｖｅｌ）を含むＰＢＳ－ｔｗｅｅｎ溶液で１０分間ブロックした。次いで、メンブレンを一次抗体（抗ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２３２）、抗ＲＡＧＥ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６９９６）、又は抗ＩＬ－３３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ３６２５）と、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ－ｔｗｅｅｎで４℃にて一晩インキュベートした。次いで、メンブレンをＰＢＳ－ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、次いで５％のスキムミルクパウダーを含むＰＢＳ－ｔｗｅｅｎで抗ウサギ二次ＨＲＰタグ付き抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７０７４）又は抗ヤギ二次ＨＲＰタグ付き抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＨＡＦ１０９）と、室温で１時間インキュベートした。次いで、メンブレンをＰＢＳ－ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、ＥＣＬ（ＢｉｏＲａｄ，１７０５０６２）を添加し、Ｌｉｃｏｒ Ｃ－ｄｉｇｉｔを可視化した。ウェスタンブロットにより、ＲＡＧＥはｏｘＩＬ－３３の存在下でＥＧＦＲと共沈することが確認されたが、ＥＧＦ刺激ではＲＡＧＥは検出されなかった（図６）。これらの発見は、ＲＡＧＥ及びＥＧＦＲが酸化ＩＬ－３３シグナル伝達複合体の機能的部分であることを明らかにしている。
１０．ｏｘＩＬ－３３がＥＧＦＲと複合体を形成するにはＲＡＧＥが必要である
上記の実験は、ｏｘＩＬ－３３がＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の複合体のリガンドであり、下流のシグナル伝達をもたらすことを示している。このセクションの実験は、ｏｘＩＬ－３３がＲＡＧＥ又はＥＧＦＲのいずれかの直接結合リガンドであるかどうかを判断するために設計されている。シグナル伝達複合体の形成について更に理解し、ｏｘＩＬ－３３がＥＧＦＲと直接相互作用するかどうかを評価するために、ＥＬＩＳＡ形式を使用してｏｘＩＬ－３３のＲＡＧＥ、ＳＴ２－Ｆｃ、及びＥＧＦＲへの結合を調べた。
タンパク質及び修飾：ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）酵素（Ａｖｉｄｔｙ，Ｂｕｌｋ ＢｉｒＡ）を製造者のプロトコルに従い使用して、Ａｖｉｔａｇ配列モチーフ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ 配列番号４６）を含有するタンパク質をビオチン化した。本明細書で使用されるＡｖｉｔａｇを有しない全ての修飾タンパク質は、ＥＺ ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ，２１３３５）を使用して製造元のプロトコルに従って遊離アミンを介してビオチン化した。表５は、使用したビオチン化タンパク質のリストである。
Figure 2023500492000010
ストレプトアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＡＢ－１２２６）を、室温で１時間、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗原（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。プレートを２００μＬのＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、３００μＬ／ウェルのブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ａ９５７６））で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ＲＡＧＥ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃１１４５－ＲＧ）又はＳＴ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃５２３－ＳＴ）をブロッキングバッファー中のＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈し、関連するウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。あるいは、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬの非タグ化ＲＡＧＥ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１１６２９－ＨＣＣＨ）の存在下又は非存在下で、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬのＥＧＦＲ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃３４４－ＥＲ－０５０）１００μＬを１時間添加した。プレートを２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。次いで、ブロッキングバッファー中１：１００００希釈した抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ ＡＯ１７０，５．１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ／ウェルでＲＡＧＥ－Ｆｃ、ＳＴ２－Ｆｃ、及びＥＧＦＲ－Ｆｃを室温で１時間検出した。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ、１００μＬ／ウェル（Ｓｉｇｍａ，Ｔ０４４０）で発色させた。反応物を５０μＬ／ウェルの０．１Ｍ Ｈ２ＳＯ４でクエンチした。ＣｙｔａｔｉｏｎＧｅｎ５又は同様の装置で４５０ｎｍの吸光度を読み取った。結果は、ｏｘＩＬ－３３がＲＡＧＥとの明確な相互作用を示したのに対し（図７Ａ）、ｏｘＩＬ－３３のＥＧＦＲへの直接結合はごくわずかであることを示した（図７Ｂ）。ｏｘＩＬ－３３へのＥＧＦＲ結合は、このアッセイにｓＲＡＧＥを添加することによってのみ観察された（図７Ｂ）。ｏｘＩＬ－３３が真正ＲＡＧＥアゴニストであるＨＭＧＢ１の代わりに使用された場合、これを再現することはできなかった（図７Ｂ）。
ｏｘＩＬ－３３によって惹起されるＥＧＦＲシグナル伝達におけるＲＡＧＥの必要性は、ＲＡＧＥ欠損細胞株を利用して更に確認した。ＲＡＧＥノックアウトＡ５４９細胞株は次のように生成した。
赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の発現ベクター、ＡＧＥＲのエクソン３を標的とするガイドＲＮＡ（ＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＴＧＣ配列番号４７）及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む哺乳動物プラスミドを作成した。Ａ５４９条件培地は、Ｔ－１７５フラスコ内でＦ１２Ｋ ｎｕｔ ｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ，１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充）で２日間Ａ５４９細胞を成長させることにより作成した。使用済み培地をＡ５４９から取り出し、濾過し、新鮮なＧｉｂｃｏ Ｆ１２Ｋ ｎｕｔ ｍｉｘ（２０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充）で５倍希釈した。Ａ５４９を３つのＴ－７５フラスコに２×１０５細胞／ｍＬで合計１５ｍＬで播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに一晩配置した。トランスフェクション混合物は、８μｇのＡＧＥＲガイドＲＮＡプラスミド及び２２．５μｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，２３９６６－２）が入った１．６ｍＬのＦ１２Ｋ ｎｕｔ ｍｉｘ（１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充）を使用して調製した。次いで、混合物を１０秒間ボルテックスし、室温で１５分間放置した。次いで、０．７５ｍＬのトランスフェクション混合物を各Ｔ－７５フラスコに添加した。フラスコをインキュベータに２日間戻した。次いで、アキュターゼを使用してＡ５４９細胞を剥離し、１％ＦＢＳを含むＰＢＳに移し、ＲＦＰの発現に基づいてＡｒｉａセルソーター（ＢＤ）で９６ウェルディッシュに単一細胞を選別した。細胞には、３～５日ごとに条件培地を供給した。細胞が５０％以上コンフルエントになったら、２４ウェルプレートに移して増殖させた。このアップスケーリングのプロセスは、成功した各クローンがＴ１５フラスコに分割されるまで続けた。次いで、細胞を１２ウェルプレートに分割し、５０％超のコンフルエントになるまで成長させた後、ノックアウトを成功させるためのゲノムＰＣＲを分析した。細胞をウェルあたり１００μＬのＤＮＡ溶解バッファー（Ｖｉａｇｅｎ Ｂｉｔｏｅｃｈ，３０１－Ｃ，０．３μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを補充）で溶解した。これらのサンプルを５５℃で４時間インキュベートした後、８５℃で１５分間インキュベートした。ＲＡＧＥのＰＣＲは、以下の配列を有するフォワード及びリバースプライマーを使用して実行した：フォワード－ｇｔｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｃｔｔｃ（配列番号４８）、リバース－ａａｔｇａｇｇｃｃａｇｔｇｇａａｇｔｃａ（配列番号４９）。反応及びサイクルは次のように設定した；５０μＬの反応容量［２５μＬのＱ５ポリメラーゼミックス、２．５μＬのフォワードプライマー（１０μＭストック）、２．５μＬのリバースプライマー（１０μＭストック）、２μＬの鋳型ＤＮＡライセート、１８μＬのヌクレアーゼフリーの水］。ＰＣＲ反応は、９８℃で３０秒間の初期変性、続いて９８℃で５秒間、５７℃で１０秒間、７２℃で２０秒間の３５サイクルを行った後、７２℃で２分間の最終ステップで実行した。４μＬのＰＣＲ産物を６μＬのヌクレアーゼフリーの水及び２μＬの６×ＤＮＡローディングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒ０６１１）と混合した。サンプルを１％アガロースゲル（１：１００００ ＳＹＢＲセーフ）で９０Ｖで１時間泳動した後、Ｖｅｒｓａｄｏｃ Ｉｍａｇｅｒで可視化した。次いで、ＰＣＲ産物の残部を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，２８１０４）を使用して、製造元のプロトコルに従ってクリーンアップした。ＤＮＡ－５０濃度はｎａｎｏｄｒｏｐを使用して測定した。いくつかのクローン（結果から選択される）を社内シーケンスに送信した。結果は、クローンＲＡＧＥ０９及びＲＡＧＥ１０に終止コドンの挿入が成功したことを示した。
ｏｘＩＬ－３３媒介ＥＧＦＲシグナル伝達に対するＲＡＧＥの必須性を確認するために、次いで、Ａ５４９細胞及びＲＡＧＥ欠損Ａ５４９細胞で免疫沈降及びウェスタンブロットを実施した。要約すると、細胞株は、ｏｘＩＬ－３３－０１を使用して様々な時点（０～１５分）で活性化された。その後のＥＧＦＲ又はＲＡＧＥの免疫沈降に続いて、セクション９に詳述されている関連する実験プロトコルに従って、抗ＲＡＧＥ、抗ＥＧＦＲ、及び抗ＩＬ－３３を用いたウェスタンブロットを実施した。結果は、ｏｘＩＬ－３３及びＥＧＦＲとの複合体の形成におけるＲＡＧＥの重要な役割を示している（図８）。
１１．酸化ＩＬ－３３はＳＴＡＴ５リン酸化を誘導し、これはＲＡＧＥによってブロックされるが、ＳＴ２中和抗体ではブロックされない
ｏｘＩＬ－３３シグナル伝達においてＳＴ２よりもＲＡＧＥの重要性を確認するために、ブロッキング抗体を試験した。要約すると、Ａ５４９を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地で培養した。細胞をアキュターゼで回収し、５×１０５／１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。次いで、ウェルを１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、１００μＬの飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。抗ＲＡＧＥ（Ｍ４Ｆ４；国際公開第２００８１３７５５２号パンフレット）；抗ＳＴ２（ＡＦ５３２；ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又は アイソタイプコントロール（ＭＡＢ００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用量依存的にウェルに添加し、プレートを３０分間インキュベータに戻した。次いで、プレートを酸化ＩＬ－３３（３０ｎｇ／ｍＬ）で３０分間刺激した後、ｐｈｏｓｈｏ－ＳＴＡＴ５ ＥＬＩＳＡキット溶解バッファー（８５－８６１１２－１１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶解し、メーカーの指示に従って展開し、４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。図９で示すように、ｏｘＩＬ－３３－０１で活性化された細胞は、ＳＴＡＴ５のリン酸化を示し、これは、抗ＲＡＧＥ抗体の存在下では減少したが、抗ＳＴ２抗体の存在下では減少しなかった（図９）。
実施例３－ｏｘＩＬ－３３は上皮細胞におけるＥＧＦＲのインターナリゼーションを惹起する
次に、ｏｘＩＬ－３３がＥＧＦと比較してＥＧＦＲの動態の変化を誘発するかどうかを調べた。
１２．ＥＧＦインターナリゼーションの共焦点実験
この実験は、共焦点イメージングを利用して、ＥＧＦ、還元型又は酸化型のＩＬ－３３で刺激した後の上皮細胞におけるＥＧＦＲの動態を調査することを目的としている。ＥＧＦＲ－ＧＦＰ Ａ５４９上皮細胞株（Ｓｉｇｍａ，ＣＬＬ１１４１－１ＶＬ）を、２００００細胞／ｍＬ（ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＣＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン）の濃度で、２４ウェルガラス底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，６６２８９２）当たり１ｍＬプレーティングした。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に連結したＥＧＦ受容体により、ＥＧＦＲ膜の動態及びインターナリゼーションを追跡することができる。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＲＰＭＩ培地（ＦＣＳ無し）でインキュベートした。飢餓状態の２４時間後、細胞をＲＰＭＩで洗浄し、１：５０００希釈で、ＣｅｌｌＭａｓｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃ１００４６）ディープレッドを含む０．５ｍＬのＲＰＭＩ培地とインキュベートした。細胞は、膜マーキングの処理前にＣｅｌｌＭａｓｋで簡単に染色し、共焦点での処理の直後に１フレーム／分でライブ画像化し、ＥＧＦＲ－ＧＦＰの動態を記録した。細胞を３７℃で５分間染色し、ＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍＬの無血清ＲＰＭＩ／ウェル中の２００ｎｇ／ｍＬの濃度でｏｘＩＬ－３３（酸化ＩＬ－３３－０１）又はＩＬ－３３－１６により刺激した。共焦点画像をすぐに撮影した。４０倍のオイル対物レンズ、１分／フレーム、５スタック間隔２μｍで２５分間（タンパク質を添加してから約３０分後）。ＧＦＰシグナルの乱れた（点線の）パターンは、膜上の受容体のクラスター化及びインターナリゼーションを示している。膜領域（ＣｅｌｌＭａｓｋでマスク）及び細胞内領域（逆ＣｅｌｌＭａｓｋでマスク、図示せず）のピクセル強度ヒストグラムは、ライブ画像化とは異なる時点で作成され、非クラスター領域でのＥＧＦＲの枯渇を示しており（ヒストグラムのベル形状ピークの左シフト）、クラスター化によって引き起こされる飽和ピクセルの数は増加した（強度２５５）。ｏｘＩＬ－３３は、ＥＧＦ受容体のクラスター化及びインターナリゼーションを誘導したが、ＥＧＦ刺激は最も明白なＥＧＦＲクラスター化をもたらした。対照的に、還元型のＩＬ－３３（ＩＬ－３３－１６）は、ＥＧＦＲ細胞分布に大きな変化を示さなかった（図１０）。
実施例４－ｏｘＩＬ－３３は、ＥＧＦと同様に、上皮細胞によってＩＬ－８の分泌を誘導する
１３．ｏｘＩＬ－３３によるＩＬ－８の選択的分泌
健康な対象からのヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ；Ｌｏｎｚａ ＣＣ－２５４０）及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からのヒト気管支上皮細胞（ＤＨＢＥ；Ｌｏｎｚａ ００１９５２７５）は、製造元のプロトコルに従って完全ＢＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）で１か月間維持され、細胞がコンフルエントに達するまで３日ごとに培地を交換した。細胞をアキュターゼで回収し、培養培地中の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５９６）に５×１０５／１００μＬで播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。この時間経過後、培地をアスピレーションし、細胞を１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した補充キットなしのＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）を添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に１８～２４時間インキュベートした後、培地のみ（非刺激対照）、３０ｎｇ／ｍＬの還元ＩＬ－３３－０１、３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３３－１６、３０ｎｇ／ｍＬの酸化ＩＬ－３３－０１、又は３０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦで刺激し、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。刺激の２４時間後、上清を回収し、多重アッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｋ１５０４７Ｄ－２）を使用してケモカイン産生を評価した。図１１にて示すように、ＮＨＢＥ及びＤＨＢＥは、非刺激細胞（培地のみ）と比較して、ｏｘＩＬ－３３で活性化するとＩＬ－８の分泌が４倍増加を示す。他のケモカイン（ＴＡＲＣ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ４、ＭＣＰ１、ＩＰ１０、エオタキシン、エオタキシン－３、ＭＤＣ－データは示さず）では大きな違いは観察されなかった。
実施例５－ｏｘＩＬ－３３は、深部単層上皮培養におけるスクラッチ創傷の修復反応を損なう
１４．ｏｘＩＬ－３３は、ＥＧＦとは対照的に、Ａ５４９及びＮＨＢＥ細胞のスクラッチ創傷の閉鎖を損なう
Ａ５４９をＡＴＣＣから入手し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地で培養した。細胞をアキュターゼ（ＰＡＡ，＃Ｌ１ １－００７）で回収し、５×１０５／１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。次いで、ウェルを１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、１００μＬの飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（商標）（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞をスクラッチし、次いでウェルを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、示された刺激；培地のみ（非刺激対照）、３０ｎｇ／ｍＬの還元ＩＬ－３３－０１、３０ｎｇ／ｍＬの酸化ＩＬ－３３－０１、又は３０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦを含有する、０．１％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭａｘ培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。プレートを創傷治癒のイメージング及び分析のためのＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍに４８時間入れた。相対的な創傷密度は、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍソフトウェア内の創傷治癒アルゴリズムを介して計算した。
ＮＨＢＥ（ＣＣ－２５４０）はＬｏｎｚａから入手し、製造元のプロトコルに従って完全ＢＥＧＭ培地［ＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）及び補充キット（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－４１７５）］に維持した。細胞をアキュターゼで回収し、培養培地中の９６ウェルＩｍａｇｅＬｏｃｋプレート（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，４３７９）に５×１０５／１００μＬで播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。この時間経過後、培地をアスピレーションし、細胞を１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を補充した補充キットなしのＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）を添加した。次いで、スクラッチ創傷の前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に１８～２４時間インキュベートした。ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（商標）（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞をスクラッチし、次いでウェルを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、示された刺激；培地のみ（非刺激対照）、３０ｎｇ／ｍＬの還元ＩＬ－３３－０１、３０ｎｇ／ｍＬの酸化ＩＬ－３３－０１、又は３０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦを含有する、０．１％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＢＥＢＭ培地（Ｌｏｎｚａ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。プレートを創傷治癒のイメージング及び分析のためのＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍに４８時間入れた。相対的な創傷密度は、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍソフトウェア内の創傷治癒アルゴリズムを介して計算した。図１２に示すように、ｏｘＩＬ－３３は、Ａ５４９細胞（図１２Ａ）及びＮＨＢＥ細胞（図１２Ｂ）の深部培養で創傷治癒を阻害し、創傷細胞密度の増加が観察されるＥＧＦとは逆の効果があった。
１５．酸化ＩＬ－３３によるスクラッチ創傷閉鎖の障害は、ＲＡＧＥ又はＥＧＦＲを中和する抗体によって妨げられ得るが、ＳＴ２では妨げられない
ｏｘＩＬ－３３のこれらの機能的効果がＲＡＧＥ／ＥＧＦＲを介して媒介されるかどうかを理解するために、セクション１４で説明したように、ただし異なる受容体成分を中和する抗体の存在下で、ＮＨＢＥ細胞でスクラッチアッセイを実施した。ＮＨＢＥ細胞は、１０μｇ／ｍＬの抗ＳＴ２（ＡＦ５３２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＲＡＧＥ（Ｍ４Ｆ４、国際公開第２００８１３７５５２号パンフレット）又は抗ＥＧＦＲ（クローンＬＡ１、０５－１０１ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下で、培地のみ（非刺激対照）、還元ＩＬ－３３、又は酸化型ＩＬ－３３で処理した。ｏｘＩＬ－３３はスクラッチ閉鎖を阻害するが、還元ＩＬ－３３は阻害しなかった。ｏｘＩＬ－３３のこの効果は、抗ＲＡＧＥ及び抗ＥＧＦＲによって逆転するが、抗ＳＴ２によっては逆転せず、これも、ＲＡＧＥ及びＥＧＦＲが酸化ＩＬ－３３シグナル伝達経路に関与する必須受容体であることを示している（図１３）。
実施例６－抗ＩＬ－３３は、深部培養におけるＣＯＰＤ細胞の表現型を改善する
１６．ｏｘＩＬ－３３は、スクラッチ創傷閉鎖アッセイにおいて、健康なＮＨＢＥでＣＯＰＤのような反応を引き起こし得る
次に、健康な人、喫煙者、及びＣＯＰＤ気管支上皮細胞における酸化ＩＬ－３３の影響を調べた。ＮＨＢＥ（ＣＣ－２５４０）、喫煙者からのＮＨＢＥ（ＣＣ－２５４０）、及びＤＨＢＥ（ＣＯＰＤ、００１９５２７５）をＬｏｎｚａから入手し、製造元のプロトコルに従い完全ＢＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）に維持した。スクラッチアッセイは、セクション１４に記載したように実施した。細胞を、培地のみ（非刺激対照）、又は３０ｎｇ／ｍＬの酸化ＩＬ－３３で処理した。喫煙者又はＣＯＰＤ由来の気管支上皮細胞は、健康な対象由来の細胞と比較して、ｏｘＩＬ－３３で健康な細胞を処理した後に観察された障害と同様のスクラッチ閉鎖能力の障害を示した（図１４）。健康な細胞とは対照的に、喫煙者及びＣＯＰＤ ＨＢＥ細胞では、ｏｘＩＬ－３３によってスクラッチ創傷の閉鎖反応が更に損なわれることはなかった（図１４）。
１７．ＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ経路を介した内因性ＩＬ－３３の遮断は、ＣＯＰＤ基底細胞のスクラッチ創傷修復表現型の障害を改善し得る
上皮細胞はＩＬ－３３を産生することが知られているため、オートクリンＩＬ－３３分泌が、ＣＯＰＤ細胞で観察されるスクラッチ創傷修復表現型の障害の原因となる可能性がある。調査するために、ＩＬ－３３中和の存在下でＣＯＰＤ由来の気管支上皮細胞でスクラッチ閉鎖アッセイを実施した。ＮＨＢＥ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－２５４０）及びＤＨＢＥ（Ｌｏｎｚａ，ＣＯＰＤ ００１９５２７５）は、製造元のプロトコルに従って完全ＢＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）に維持した。細胞をアキュターゼで回収し、培養培地中の９６ウェルＩｍａｇｅＬｏｃｋプレート（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，４３７９）に５×１０５／１００μＬで播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベートした。この時間経過後、培地をアスピレーションし、細胞を１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、飢餓培地（１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を補充した補充キットなしのＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ ＣＣ－３１７１）を添加した。次いで、スクラッチ創傷の前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で更に１８～２４時間インキュベートした。ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（商標）（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞をスクラッチし、次いでウェルを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、１０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ、国際公開第２０１６／１５６４４０号パンフレットに記載されている）、抗ＳＴ２（ＡＦ５３２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＲＡＧＥ（Ｍ４Ｆ４、国際公開第２００８１３７５５２号パンフレット）、又はＮＩＰ２２８（ＩｇＧ１アイソタイプコントロール）を含有する、０．１％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＢＥＢＭ培地（Ｌｏｎｚａ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２に戻した。プレートを創傷治癒のイメージング及び分析のためのＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍに４８時間入れた。相対的な創傷密度は、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍソフトウェア内の創傷治癒アルゴリズムを介して計算した。以前に観察されたように、ＣＯＰＤ細胞は、健康な対象に由来する細胞と比較して、スクラッチ閉鎖反応が損なわれていた。抗ＩＬ－３３及び抗ＲＡＧＥは、ＣＯＰＤ細胞のスクラッチ閉鎖反応を健康な細胞と同様のレベルに改善することができ（図１５）、上皮細胞がＲＡＧＥ／ＥＧＦＲ経路を介してシグナル伝達するオートクリンＩＬ－３３を産生することを示している（図１５）が、抗ＳＴ２は、そうではなかった。
実施例７－抗ＩＬ－３３は３Ｄ上皮培養の杯細胞を減少させる
１８．気道基底細胞の気液界面（ＡＬＩ）培養
次に、本発明者らは、気液界面細胞培養（「ＡＬＩ培養」）におけるＩＬ－３３シグナル伝達の関連性を判断しようとした。ＡＬＩ培養は、基底細胞を、培地と接触させた基底表面と空気にさらされた上部（頂端）細胞層で成長させる方法である。ＡＬＩ培養により、気管上皮と同様に、偽重層上皮の粘膜毛様体表現型を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの３次元細胞構造の発達が可能になる。したがって、ＡＬＩ培養は、細胞間シグナル伝達、疾患モデリング、及び呼吸再生など、呼吸上皮の基本的な側面を研究するために使用することができる。
健康な対照からの又はＣＯＰＤ患者からの凍結肺基底細胞のクライオバイアルは、ノースカロライナ大学及びピッツバーグ大学から受け取った。細胞を解凍し、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で１：７０に希釈したＰｕｒｅｃｏｌ Ｔｙｐｅ Ｉウシコラーゲン（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でコーティングしたＴ－７５フラスコにプレーティングし、Ｅｐｉｘ培地（２７６－２０１，Ｐｒｏｐａｇｅｎｉｘ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で増殖させた。コンフルエントに達した後、これらの細胞を適切な数のＴ－７５フラスコに一度分割した後、ＡＬＩ培養用に回収した。１２ｍｍ、０．４μＭのポリエステルメンブレンインサート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を入れたＡＬＩ培養用のトランスウェルは、インサートを１：７０ Ｐｕｒｅｃｏｌ溶液でコーティングし、３７℃で１～１６時間インキュベートすることによって調製した。Ｐｕｒｅｃｏｌ溶液を除去し、トランスウェルをＵＶ光下に３０分間置いた後、ＰＢＳで洗浄した。Ｔ－７５フラスコの基底細胞を４ｍＬのトリプシン溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１５４０００５４）を使用して剥離した。細胞懸濁液を５ｍＬのＦＢＳが入った５０ｍＬチューブに添加し、次いでＶｉＣｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）でカウントし、１，０００ＲＰＭで５分間スピンダウンした。次に、細胞をＰｎｅｕｍａｃｕｌｔ ＡＬＩ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）に３．５７×１０５／ｍＬの密度で再懸濁し、７００μＬを各トランスウェルに分注した。インサートの下のスペースに１ｍＬのＡＬＩ培地を添加した。コンフルエントでタイトジャンクションが形成されるまで（典型的には７日間）、細胞をＡＬＩ培地に浸したままにし、その時点で培地を頂端側から取り除き、細胞を２週間分化させ、基底側で１日おきに培地を交換した。完全に分化した培養物を、培養物の基底側に供給される培地で、処理剤を用いることによって、抗体なし、１μｇ／ｍＬの抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）、又は１μｇ／ｍＬのＮＩＰ２２８（ＩｇＧ１アイソタイプコントロール）で７日間処理した。１日おきに培地交換を実施した（関連する処理を含む）。
１９．ＩＨＣ三重染色（基底、杯、及び繊毛）及び定量化
ＣＯＰＤドナーからのＡＬＩ培養物は、セクション１８で説明されているように作成及び処理した。ＡＬＩ上皮培養物を１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィン包埋した。パラフィン切片（４ｕｍ）を正に帯電したスライド上にマウントし、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａで連続３プレックス発色アッセイで染色した。抗原の回収はセルコンディショナー１（ＣＣ１）（カタログ番号５４２４５６９００１，Ｒｏｃｈｅ）で行い、内因性ペルオキシダーゼはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（カタログ番号７０１７９４４００１，Ｒｏｃｈｅ）で１２分間ブロックした。抗ｐ６３（クローン４Ａ４）（カタログ番号７９０－４５０９，Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を３６℃で２４分間適用し、マウス抗ＨＱ（１２分）（カタログ番号７０１７７８２００１，Ｒｏｃｈｅ）及び抗ＨＱ ＨＲＰ（１２分）（カタログ番号７０１７９３６００１，Ｒｏｃｈｅ）で可視化し、Ｔｅａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（カタログ番号８２５４３３８００１，Ｒｏｃｈｅ）で１２分間インキュベートした。スライドを、セルコンディショナー２（ＣＣ２）（カタログ番号５４２４５４２００１，Ｒｏｃｈｅ）を用いた抗体変性ステップ（１００℃で２４分間）で処理し、次いで抗チューブリン（カタログ番号ａｂ２４６１０，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を、Ｄａｋｏ抗体希釈液（カタログ番号Ｓ３０２２）で１６分間０．０１μｇ／ｍＬに希釈し、マウスＯｍｎｉＭａｐ－ＨＲＰ（８分）（カタログ番号５２６９６５２００１，Ｒｏｃｈｅ）で検出し、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｕｒｐｌｅ基質（カタログ番号７０５３９８３００１，Ｒｏｃｈｅ）で１６分間可視化した。スライドをＣＣ２で追加の抗体変性にかけ、次いでウサギ抗ムチン５ＡＣ１．１μｇ／ｍＬとウサギ抗ムチン５Ｂ７μｇ／ｍＬ（それぞれカタログ番号ａｂ１９８２９４とカタログ番号ａｂ８７３７６，Ａｂｃａｍ）のカクテルを、２０分間適用し、抗ウサギＮＰ（４分）（カタログ番号７４２５３１７００１，Ｒｏｃｈｅ）、抗ＮＰ－ＡＰ（８分）（カタログ番号７４２５３２５００１，Ｒｏｃｈｅ）で、次いでＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｙｅｌｌｏｗ（カタログ番号７６９８４４５００１，Ｒｏｃｈｅ）で２０分間可視化した。染色されたスライドをＤａｗｎ洗剤ですすぎ、ヘマトキシリン（カタログ番号５２７７９６５００１，Ｒｏｃｈｅ）で対比染色し、すすぎ、段階的な一連のエタノールとキシレンで脱水し、永久マウント培地でマウントした。ＨＡＬＯソフトウェアを使用した定量化では、抗ＩＬ－３３で処理された健康なドナーに由来するＡＬＩ培養物の杯細胞の減少が示された（図１６）。
実施例８－抗ＩＬ－３３は、ＣＯＰＤからの３Ｄ上皮培養におけるムチンを調節し、粘液の動きを改善する
２０．ＩＨＣ二重ＩＦ染色（ムチン５Ｂ＋ムチン５ＡＣ）
ＣＯＰＤドナーからのＡＬＩ培養物は、セクション１８で説明されているように作成及び処理した。ＡＬＩ上皮培養物を１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィン包埋した。パラフィン切片（４ｕｍ）を正に帯電したスライド上にマウントし、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａで連続二重免疫蛍光アッセイで染色した。抗原の回収はセルコンディショナー１（Ｕｌｔｒａ ＣＣ１）で行い、内因性ペルオキシダーゼはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒで１２分間ブロックし、そのブロックの８分間は、Ｓ Ｂｌｏｃｋ（ＲＵＯ）Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（カタログ番号７６０－４２１２）でブロックし、Ｄａｋｏ Ａｂ Ｄｉｌｕｅｎｔ，Ｓ３０２２で希釈した７μｇ／ｍＬで使用した抗ムチン５Ｂで、３６Ｃで２４分間インキュベートし、抗ウサギＨＱ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号７６０－４８１５）で４分間、及び抗ＨＱ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号７６０－４８２０）で８分間検出した。次いで、サンプルをチラミドコンジュゲートであるＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＦＩＴＣ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログ番号７６０－２３２）と８分間インキュベートした。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａプログラムでデュアルシーケンスが選択され、サンプルをセルコンディショナー２（ＣＣ２）を使用して抗体変性ステップ（１００℃で２４分間）で処理し、次いでＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｃ、２４分）で中和した後、抗ムチン５ＡＣ、１．１μｇ／ｍＬを２０分間３６℃で添加した。ムチン５ＡＣは、抗ウサギＨＱ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号７６０－４８１５）で４分間、抗ＨＱ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号７６０－４８２０）で８分間検出し、チラミドコンジュゲートであるＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｄ６１０で８分間可視化した。このステップの完了後、染色したスライドをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒから取り出し、Ｄａｗｎ洗剤、次いで脱イオン水ですすいだ。サンプルを、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、ジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ核酸染色）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ｄ１３０６でインキュベートし、脱イオン水で１μｇ／ｍＬに２分間希釈した。サンプルを脱イオン水ですすぎ、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅマウント培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号Ｐ３６９３０）でカバースリップをのせ、遮光スライドボックスに保存した。染色したスライドは、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＬＬＣ，Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ）で画像化された。図１７は、ＡＬＩ培養物の抗ＩＬ－３３処理が、ＣＯＰＤ培養物中の様々なムチンの下方制御につながる可能性があることを示している。
２１．抗ＩＬ－３３は、ＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物で観察された粘液毛様体クリアランスの障害を逆転させる
ＣＯＰＤドナーからのＡＬＩ培養物は、セクション１８で説明されているように作成及び処理した。次いで、ＰＢＳで１：３３に希釈した０．２μＭ ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｆ８８１１）３０μＬを頂端表面に添加し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００顕微鏡を使用して、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅの動きの短いビデオがキャプチャされ、抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）での処理後に粘液毛様体運動が増加するが、対照抗体では増加しないことが示された。
実施例９－ＡＬＩ培養物の単一細胞ＲＮＡ分析は、抗ＩＬ－３３で処理した後の杯細胞の変化を示している
ＣＯＰＤドナーからのＡＬＩ培養物は、セクション１８で説明されているように作成及び処理した。単一細胞懸濁液を得るために、フィルタインサートを０．２５％トリプシンと３７℃で５分間インキュベートした。上皮細胞を、ＰＢＳピペッティングで上下に洗浄することによりフィルターから穏やかに剥離し、次いで１５ｍＬのファルコンチューブに移した。細胞を１０００ＲＰＭで５分間４℃で遠心分離にかけた。上清を除去した後、細胞をＰＢＳ中の０．４％ＢＳＡに再懸濁し、細胞濃度をシーケンス用に１０００細胞／μＬに調整した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍシングルセル３’キットの標準プロトコルに従って細胞懸濁液をロードし、５０００～１０．０００細胞／チャネルを捕捉した。バージョン２の化学的性質を使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンス用のシングルセル３’ライブラリは、製造元のプロトコル（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標）シングルセル３’試薬キット、ｖ２ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に従って取得した。ライブラリの品質を評価し（ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ４２００，Ａｇｉｌｅｎｔ）、次いでＮｅｘｔＳｅｑ５００又はＮｏｖａＳｅｑ６０００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。最初のデータ処理は、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒバージョン２．０パイプライン（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して実行した。後処理は、低セル品質の排除及び正規化するためにＳｅｕｒａｔパッケージを使用して実行した。各サンプルは、サンプル内の不均一性（セルのサブタイピング）を捕捉するために独立したデータとして分析された。クラスター化及び可視化は、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）で実現された。ＣＯＰＤの細胞クラスターの同定は、マーカー遺伝子によって導いた。他のサンプルでは、最初のクラスターを手動で検査してから、サブタイプの同定にＳｅｕｒａｔのラベル転送アルゴリズムを適用した。ＭＵＣ５ＡＣ及びＭＵＣ５Ｂ遺伝子発現分析は、セクション１８で述べたように、抗ＩＬ－３３処理の有無にかかわらずＣＯＰＤ ＡＬＩ培養からの細胞間の各クラスターに対して実施した。ヒートマップ及びｔＳＮＥプロットは、Ｓｅｕｒａｔを使用して作成した。図１８は、非処理と比較した抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）で処理されたＡＬＩ培養物で見られる細胞サブタイプの異なる比率を示すｔＳＮＥプロットを示している。図１８にて示すように、抗ＩＬ－３３処理後、ＭＵＣ５Ｂ高細胞の減少が認められた。
実施例１０－抗ＩＬ－３３はＣＯＰＤ ３Ｄ上皮培養において杯細胞を減少させる
２２．気道基底細胞の気液界面（ＡＬＩ）培養
生理学的に関連する気液界面（ＡＬＩ）培養システムにおけるｏｘＩＬ－３３の効果を定量化及び調査するために、杯細胞型（ＭＵＣ５ａｃ対ＭＵＣ５ｂ）と残りの上皮個体数（ムチン陰性）とを区別することを目的としたフローサイトメトリーアッセイを展開した。
健康な（ＣＣ－２５４０）対照又はＣＯＰＤ（１９５２７５）患者からの凍結肺基底細胞のクライオバイアルをＬｏｎｚａから受け取った。ドナーごとに１つのバイアルを解凍し、Ｅｐｉｘ培地（２７６－２０１，Ｐｒｏｐａｇｅｎｉｘ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の４ｘＴ－１７５フラスコにプレーティングした。コンフルエントに達した後、これらの細胞をＰ２で１バイアルあたり１ｅ６細胞で凍結した。Ｐ２の細胞をＥｐｉｘ培地の２ｘＴ－７５フラスコに入れ、８０％コンフルエントになるまで成長させた。１２ｍｍ又は６．５ｍｍ、０．４μＭのポリエステルメンブレンインサート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を入れたＡＬＩ培養用のトランスウェルは、インサートを１×コラーゲンＩ溶液（Ｃｅｌｌａｄｈｅｒｅ（商標）Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ－Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＃０７００１、ｄＨ２Ｏで調製）でコーティングし、３７℃で１～１６時間インキュベートすることによって調製した。コラーゲンＩ溶液を除去して、トランスウェルをＰＢＳで洗浄した。Ｔ－７５フラスコの基底細胞をＰＢＳで洗浄し、６ｍＬのトリプシン溶液（Ｌｏｎｚａ トリプシン継代培養パック－＃ＣＣ－５０３４）を使用して剥離した。トリプシンを６ｍＬのトリプシン中和溶液（Ｌｏｎｚａ トリプシン継代培養パック－＃ＣＣ－５０３４）で中和し、細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに添加し、カウントし、チューブを１，２００ＲＰＭで５分間スピンダウンした。次いで、細胞をＰｎｅｕｍａｃｕｌｔ ＡＬＩ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）に８×１０５／ｍＬの密度で再懸濁し、０．５ｍＬを各１２ｍｍのトランスウェルに、０．２５ｍＬを各６．５ｍｍのトランスウェルに分注した。１２ｍＬインサートの下のスペース、及び６．５ｍｍインサートの下の０．５ｍＬに１ｍＬのＡＬＩ培地を添加した。コンフルエントでタイトジャンクションが形成されるまで（典型的には７日間）、細胞をＡＬＩ培地に浸したままにし、その時点で培地を頂端側から取り除き、細胞を３週間分化させ、基底側で毎週月曜日、水曜日、及び金曜日に培地を交換した。完全に分化した正常培養物を、非処理のままにするか、又は培養物の基底側に供給される培地で、処理剤を用いることによって、還元又は酸化された非タグ化ＩＬ３３－０１（３０ｎｇ／ｍＬ）、非タグ化ＩＬ３３－１６（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１３（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）、又はＨＭＧＢ１（３０ｎｇ／ｍＬ）で７日間処理した（７日間処理）。完全に分化したＣＯＰＤ培養物を、非処理のままにするか、又は培養物の基底側に供給される培地で、処理剤を用いることによって、抗体なし、１μｇ／ｍＬの抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７－７Ｂ）、１μｇ／ｍＬのＮＩＰ２２８（ＩｇＧ１アイソタイプコントロール）、１０μｇ／ｍＬのｍＮＩＰ２２８、１０μｇ／ｍＬの抗ＳＴ２、１μｇ／ｍＬの抗ＲＡＧＥ、又は１μｇ／ｍＬの抗ＥＧＦＲで７日間処理した。毎週月曜日、水曜日、及び金曜日に培地交換を実施した（関連する処理を含む）。
Figure 2023500492000011
２３．ＡＬＩ培養における杯細胞のＦＡＣＳ分析
７日間の処理（表６）に続いて、６．５ｍｍインサートでの４週齢の正常対照又はＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物をフローサイトメトリーで分析した。２００μＬの３７℃ＰＢＳを各トランスウェルの頂端表面（トランスウェル表面）に添加し、３０分間インキュベータ内に置いた。ムチン分析のために、頂端洗浄液を－８０℃で保存した。１５０μＬのトリプシン（Ｌｏｎｚａ トリプシン継代培養パック－＃ＣＣ－５０３４）を、頂端と基底外側（トランスウェルの下）の両方の区画に添加した。トランスウェルを３０分間インキュベータに戻した。トリプシンを上下に静かにピペッティングすることにより、ＡＬＩを分離させた。１５０μＬのトリプシン中和溶液（Ｌｏｎｚａトリプシン継代培養パック－＃ＣＣ－５０３４）を、各頂端チャンバに添加し、混合した。細胞懸濁液をＵ字型の９０ウェルプレートに移し、細胞をカウントし、１２００ＲＰＭ、４℃で５分間遠心分離した。トリプシン／ＴＮＳを除去し、２００μＬの生死（ｌｉｖｅ ｄｅａｄ）染料（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０ Ｔｈｅｒｍｏ ６５－０８６５－１４、ＰＢＳ中で１：２０００の希釈）を各ウェルに添加した。細胞を再懸濁させ、暗所の氷上にて１０分間インキュベートした。プレートを１２００ＲＰＭ、４℃で５分間遠心分離し、生死染料を除去し、２００μＬのＰＢＳを各ウェルに添加した。プレートを１２００ＲＰＭ、４℃で５分間遠心分離し、ＰＢＳを除去し、２００μＬの固定／透過処理溶液（Ｔｈｅｒｍｏ ００－５１２３及び００－５２２３）に置き換えた。プレートを暗所の氷上にて４０分間インキュベートした。プレートを１２００ＲＰＭ、４℃で５分間遠心分離し、溶液を除去した。細胞を、３００μＬの１×透過処理溶液（Ｔｈｅｒｍｏ ００－８３３３）中に再懸濁させた。各ウェルの５ｅ４細胞を新しい９６ウェルＵ底プレートに添加し、１２００ＲＰＭ、４℃で５分間遠心分離し、細胞を５０μＬの１×透過処理溶液に再懸濁させた。５０μＬの抗体染色カクテル（１：４００の抗Ｍｕｃ５ＡＣ及び１：８００の抗Ｍｕｃ５Ｂ）又は同じ希釈のアイソタイプ染色カクテル。プレートを暗所の氷上にて３０分間インキュベートした。プレートを１２００ＲＰＭ、４℃で５分間遠心分離し、溶液を除去した。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、次いで１５０μＬのＰＢＳに再懸濁させた。次いでＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
Figure 2023500492000012
２４．ＡＬＩ培養物のｑＰＣＲ／バルクＲＮＡシーケンス分析
７日間の処理（表６）に続いて、６．５ｍｍインサートでの４週齢の正常対照又はＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物をＲＮＡ分析用に溶解させた。最初に２００μＬの３７℃ＰＢＳを各ＡＬＩの頂端表面に添加し、プレートを３０分間インキュベータ内に戻した。ムチン分析のために、頂端洗浄液を－８０℃で保存した。ＭａｇＭＡＸ（商標）－９６全ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ，ＡＭ１８３０）を使用して、ＡＬＩ培養物を溶解し、ＲＮＡを抽出した。次いで、ＲＮＡを使用して、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ（商標）キット（Ｔｈｅｒｍｏ，４３８８９５０）を使用してｃＤＮＡを合成した。これにより、９μＬの各ＲＮＡサンプルを１０μＬの２ＸＲＴバッファーミックス及び１μＬの２０ＸＲＴ酵素ミックスとＰＣＲチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＡＭ１２２３０）でインキュベートし、サーモサイクラーに置き、３７℃で６０分間インキュベートした。９５℃に５分間加熱し、４℃に保持することにより反応を停止させた。６０μＬのヌクレアーゼフリーの水（Ｔｈｅｒｍｏ，７５００２４）を、２０μＬのｃＤＮＡが入った各チューブに添加した。ＲＴ－ｑＰＣＲの場合、４μＬのｃＤＮＡを、バーコードがついたＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅ（商標）オプティカル３８４ウェルクリアリアクションプレート（Ｔｈｅｒｍｏ．４４８３２７３）に、５μＬのＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ，４４４４５５７）、並びに０．５μＬのＭｕｃ５ＡＣ ＦＡＭプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｈｓ０１３６５６１６＿ｍ１）、及び０．５μＬのＧＡＰＤＨ ＶＩＣプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）とともに添加した。プレートを密封し、簡単に遠心分離した後、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して分析した。次いで、データを非処理の正常な対照に正規化することにより、デルタ－デルタ－ｃｔを計算した。
ｏｘＩＬ－３３は、杯細胞数、特にＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞のサブセットの増加につながるが、還元ＩＬ－３３は、それにはつながらなかった（図１９Ａ～Ｃ）。したがって、ＭＵＣ５ＡＣ ｍＲＮＡのコピーは、ｑＰＣＲによって判断されるように、ｏｘＩＬ－３３での処理時に増加した（図１９Ｄ）。
２５．ＩＨＣ三重染色（基底、杯、及び繊毛）及び定量化
次に、ＡＬＩ免疫組織化学からの定量的画像分析を評価した。ＣＯＰＤドナーからのＡＬＩ培養物は、セクション２２；気道基底細胞の気液界面（ＡＬＩ）培養で説明されているように作成及び処理した：ＡＬＩ上皮培養物を１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、パラフィン包埋した。パラフィン切片（４ｕｍ）を正に帯電したスライド上にマウントし、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａで連続三重発色アッセイで染色した。抗原の回収はセルコンディショナー１（Ｕｌｔｒａ ＣＣ１）（カタログ番号５４２４５６９００１，Ｒｏｃｈｅ）で行い、内因性ペルオキシダーゼはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（カタログ番号７０１７９４４００１，Ｒｏｃｈｅ）で１２分間ブロックした。抗ｐ６３（クローン４Ａ４）（カタログ番号７９０－４５０９，Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を２４分間適用し、抗マウスＨＱ（１２分）（カタログ番号７０１７７８２００１，Ｒｏｃｈｅ）及び抗ＨＱ ＨＲＰ（１２分）（カタログ番号７０１７９３６００１，Ｒｏｃｈｅ）で可視化し、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｕｒｐｌｅ ｋｉｔ（カタログ番号０７０５３９８３００１，Ｒｏｃｈｅ）で１２分間インキュベートした。スライドを、セルコンディショナー２（Ｕｌｔｒａ ＣＣ２）（カタログ番号５４２４５４２００１，Ｒｏｃｈｅ）を用いた抗体変性ステップ（９２℃で２４分間）で処理し、次いで抗チューブリン（カタログ番号ａｂ２４６１０，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を、Ｄａｋｏ抗体希釈液（カタログ番号Ｓ３０２２）で１６分間希釈し（スライド上の濃度０．００３μｇ／ｍＬ）、マウスＯｍｎｉＭａｐ－ＨＲＰ（８分）（カタログ番号５２６９６５２００１，Ｒｏｃｈｅ）で検出し、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｅａｌ ＨＲＰ ｋｉｔ（カタログ番号８２５４４３３８００１，Ｒｏｃｈｅ）で可視化した。スライドをＣＣ２で追加の抗体変性にかけ、次いでウサギ抗ムチン５ＡＣ１．１μｇ／ｍＬ（ディスペンサ濃度）とウサギ抗ムチン５Ｂ７μｇ／ｍＬ（ディスペンサ濃度）（それぞれカタログ番号ａｂ１９８２９４とカタログ番号ａｂ８７３７６，Ａｂｃａｍ）のカクテルを、２０分間適用し、抗ウサギＮＰ（４分）（カタログ番号７４２５３１７００１，Ｒｏｃｈｅ）、抗ＮＰ－ＡＰ（８分）（カタログ番号７４２５３２５００１，Ｒｏｃｈｅ）で、次いでＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｙｅｌｌｏｗ（カタログ番号７６９８４４５００１，Ｒｏｃｈｅ）で２０分間可視化した。染色されたスライドを、ヘマトキシリンＩＩ（８分）（カタログ番号５２７７９６５００１，Ｒｏｃｈｅ）及びＢｌｕｉｎｇ試薬（４分）（カタログ番号５２６６７６９００１，Ｒｏｃｈｅ）で対比染色し、食器洗剤ですすぎ、段階的な一連のエタノールとキシレンで脱水し、永久マウント培地でマウントした。
ＩＨＣ画像はＨＡＬＯ ｖ３．１（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）で分析し、焦点が合っていない領域及び組織の損傷領域を除外するために、最初に手動で注釈を付けた。ランダムフォレスト分類子は、上皮を認識し、膜貫通及びスライドガラスの背景から上皮を分離するようにトレーニングした。繊毛面積の定量化のために、チューブリン染色の粗い検出、それに続くアルゴリズムＡｒｅａ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖ２．１．７を使用した細かい検出のために、別のランダムフォレスト分類子をトレーニングした。ムチン面積の定量化では、Ａｒｅａ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖ２．１．７を直接使用して染色を検出した。基底（ｐ６３＋）細胞のカウントでは、アルゴリズムＣｙｔｏＮｕｃｌｅａｒ ２．０．９を使用して核染色に基づいて細胞をセグメント化し、ｐ６３陽性核をカウントすることで基底細胞を更に検出した。全ての定量法は、人間の認識に対して検証されており、９０％以上の精度を有した。
以前の発見と一致して、ｏｘＩＬ－３３は杯細胞（ＭＵＣ５ａｃ＋ｂ）の数に大きく影響した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。
一緒に、これらの研究は、肺上皮内の杯細胞の分化を促進することにおけるｏｘＩＬ－３３の役割を示した。これは、ｏｘ－ＩＬ３３に慢性的に曝露された上皮が、肺機能に悪影響を与える杯細胞過形成表現型に向かって進化することを示唆している。
２６．ブロック剤によるＣＯＰＤ杯細胞表現型の逆転
ＣＯＰＤの重要な特徴は、杯細胞及び粘液分泌の増加による過剰な粘液である（Ｇｏｈｙ ｅｔ ａｌ ２０１９ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９：１７９６３）。酸化ＩＬ－３３が杯細胞ＣＯＰＤ表現型に直接的な役割を果たすことができるかどうかを調査するために、セクション２２～２５で説明されているように、ＣＯＰＤドナーからのＡＬＩ培養物を読み取った情報で確立した。
ＣＯＰＤ ＡＬＩは、抗ＩＬ－３３（３３－６４００８７＿７Ｂ）、抗ＲＡＧＥ、又は抗ＥＧＦＲ中和抗体の存在下で培養した。３つの処理すべてで、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞数が減少した（図２１Ａ～Ｄ）。ＡＬＩ培養の生存率に影響を与える処理はなく（図２１Ｅ）、処理現象が人工物又は抗体毒性の結果ではないことを確認した。以前の結果と一致して、抗ＳＴ２処理は杯細胞数の減少をもたらさず、これが、ｏｘＩＬ－３３－ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ経路を介してＩＬ－３３、主にｏｘ－ＩＬ－３３によって直接媒介される疾患表現型であるというさらなる証拠を提供する。ＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物に対する抗ＩＬ－３３抗体（３３－６４００８７＿７Ｂ）の効果が免疫組織化学分析で更に確認され、ＩＬ－３３の遮断により、ペアワイズ分析で杯細胞数の減少がもたらされた（図２２Ａ及び２２Ｂ）。抗ＩＬ－３３抗体（３３－６４００８７＿７Ｂ）で処理した後、ＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物の上皮は、図２０Ａに示されるように健康な上皮に類似していた。
最後に、健康な培養物とＣＯＰＤ ＡＬＩ培養物の両方から頂端粘液に放出されたＭＵＣ５ＡＣとＭＵＣ５Ｂを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＡＬＩ培養物から放出されたムチンを定量化するために、製造元のプロトコルに従って、イムノアッセイ（Ｎｏｖｕｓ ＮＢＰ２－７６７０３）によってＭＵＣ５ＡＣのレベルについて頂端上清を分析した。サンプルをサンプル希釈液で１：２０００に希釈し、組換えＭＵＣ５ＡＣタンパク質標準曲線から濃度を推定した。図２３にて示すように、ＣＯＰＤ患者からのＡＬＩ培養物は、健康なドナーからのＡＬＩと比較してＭＵＣ５ＡＣの放出レベルが増加した（図２３Ａ）。外因性ｏｘＩＬ－３３による処理は、健康なＡＬＩ培養物からのムチン分泌の増加をもたらした（図２３Ｂ）。ＣＯＰＤ ＡＬＩドナーでは、ムチンのレベルの上昇は、ＡＬＩ培養物から放出されるＭＵＣ５ＡＣタンパク質レベルを阻害する抗ＩＬ－３３（３３＿６４００８７＿７Ｂ）による遮断によって減少したが、抗ＳＴ２又はアイソタイプｍＡｂコントロールでは減少しなかった（図２３Ｃ）。
全体として、この実施例は、肺の上皮細胞分化の調節不全における酸化ＩＬ－３３の役割を強調する。結果は、制御されていない場合、酸化ＩＬ－３３が杯細胞過形成及びＣＯＰＤのいくつかの表現型で見られる過剰な粘液産生の原因である可能性があることを意味する。したがって、抗ＩＬ－３３、抗ＲＡＧＥ、又は抗ＥＧＦＲ結合分子などのｏｘＩＬ－３３シグナル伝達軸アンタゴニストによる処理は、例えば、杯細胞数を減少させる及び過剰な粘液産生を減少させるなどによって正常な上皮生理機能を回復させることにより、ＣＯＰＤ患者に大きな治療効果をもたらす可能性がある。
追加の配列
表１にリストされている配列に加えて、次の追加のＣＤＲ配列を提供する：
配列番号３７：ＳＹＡＭＳ
配列番号３８：ＧＩＳＡＩＤＱＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号３９：ＱＫＦＭＱＬＷＧＧＧＬＲＹＰＦＧＹ
配列番号４０：ＳＧＥＧＭＧＤＫＹＡＡ
配列番号４１：ＲＤＴＫＲＰＳ
配列番号４２：ＧＶＩＱＤＮＴＧＶ
Ｎ末端Ｈｉｓ１０／Ａｖｉｔａｇ／第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位
配列番号４３：ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＡＡＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＡＡＩＥＧＲ
ＩＬ－３３－０１
配列番号４４：
Figure 2023500492000013
 ＩＬ－３３－１６
配列番号４５：
Figure 2023500492000014
 Ａｖｉｔａｇ配列モチーフ
配列番号４６：ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
ＲＡＧＥエクソン３を標的とするｇＲＮＡベクター
配列番号４７：ＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＴＧＣ
ＲＡＧＥフォワードプライマー
配列番号４８：ｇｔｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｃｔｔｃ
ＲＡＧＥリバースプライマー
配列番号４９：ａａｔｇａｇｇｃｃａｇｔｇｇａａｇｔｃａ
ヒトＳＴ２Ｓ（シグナルペプチドは下線が引かれている）
配列番号５０：
Figure 2023500492000015
 ヒトＳＴ２Ｓ－ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ－Ｈｉｓ６（シグナルペプチドは下線が引かれている）
配列番号５１：
Figure 2023500492000016
 配列番号５２：
Ｈｉｓ１０／ＡｖｉｔａｇヒトＡＳＧＰＲ ＥＣＤ（シグナルペプチドは下線が引かれており、タグは二重下線が引かれている）
Figure 2023500492000017

Claims (89)

  1. ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を調節又は阻害することによる異常な上皮生理機能の予防又は治療で使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  2. 前記異常な上皮生理機能が、異常な粘膜毛様体生理機能、好ましくは、呼吸上皮の異常な粘膜毛様体生理機能である、請求項１に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  3. 異常な粘膜毛様体生理機能が：異常な粘液産生；異常な杯細胞分化；異常な杯細胞増殖；異常な上皮厚さ；異常な粘液クリアランス；及び／又は異常な粘液組成から選択される、請求項２に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  4. 異常な粘液産生が、異常なＭＵＣ５ＡＣ産生を含み；及び／又は異常な杯細胞分化が、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化を含み；及び／又は異常な杯細胞増殖が、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞増殖を含み；及び／又は異常な前記上皮厚さが、前記上皮の全組織領域で異常な量のＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞を含む、請求項３の記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  5. 異常な粘膜毛様体生理機能が：粘液産生の増加；杯細胞分化の増加；杯細胞増殖の増加；前記上皮の厚さの増加；及び／又は粘液クリアランスの減少を含む、請求項２、３、又は４の記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  6. 粘液産生の増加が、ＭＵＣ５ＡＣ産生の増加を含み；及び／又は杯細胞分化の増加が、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化の増加を含み；及び／又は杯細胞増殖の増加が、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞増殖の増加を含み；及び／又は前記上皮の厚さの増加が、前記上皮の全組織領域で増加した量のＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞を含む、請求項５の記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  7. 異常な粘液組成が、粘液に含有される様々な粘液化合物の比率の増加若しくは減少；１つ以上の粘液化合物の増加若しくは減少；及び／又は粘液の濃度若しくは濃さの増加若しくは減少を含む、請求項３の記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  8. 異常な粘液組成が、ＭＵＣ５ＡＣ：ＭＵＣ５Ｂの比率の増加を含み；及び／又は異常な粘液組成が、粘液に含有されるＭＵＣ５ＡＣの増加を含み；及び／又は異常な粘液組成が、粘液の濃さの増加を含む、請求項７の記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  9. 前記異常な上皮生理機能が、異常な上皮リモデリングである、請求項１に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  10. 前記異常な上皮生理機能が、気道、好ましくは、前記気道の異常な粘膜毛様体生理機能である、請求項１～９のいずれか一項に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  11. 前記気道が、下気道、好ましくは、気管支である、請求項１０に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  12. ＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  13. 前記ＥＧＦＲ媒介疾患が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患である、請求項１２に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  14. 前記ＥＧＦＲ媒介疾患が、異常なＥＧＦＲ活性を特徴とする、請求項１２又は１３に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  15. 前記ＥＧＦＲ媒介疾患が、異常な上皮生理機能を特徴とする、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  16. 上皮生理機能を改善することによる疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  17. ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる疾患の予防又は治療で使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  18. 前記ＥＧＦＲ媒介効果が、ＥＧＦＲシグナル伝達である、請求項１７に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  19. 前記ＥＧＦＲ媒介効果が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果である、請求項１７又は１８に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  20. 前記ＥＧＦＲ媒介効果が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  21. 前記疾患が呼吸器疾患である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  22. 前記呼吸器疾患が、異常な上皮生理機能及び／又は異常ＥＧＦＲ活性を特徴とする、請求項２１に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  23. 前記呼吸器疾患が、下呼吸器疾患、好ましくは、気管支の呼吸器疾患である、請求項２１又は２２に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  24. 前記呼吸器疾患が：ＣＯＰＤ、気管支炎、肺気腫、ＣＦ－気管支拡張症若しくは－ＣＦ－気管支拡張症などの気管支拡張症、喘息、又は喘息とＣＯＰＤのオーバーラップ（ＡＣＯ）から選択される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  25. 前記呼吸器疾患が、ＣＯＰＤ、好ましくは、気管支炎性ＣＯＰＤである、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  26. 前記呼吸器疾患が、喘息、好ましくは、気管支喘息である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  27. 前記予防又は治療が、粘液クリアランスを改善する、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の使用のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  28. 前記予防又は治療が、異常な粘液産生を阻害又は低減する、請求項１６～２７のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  29. 前記予防又は治療が、ＭＵＣ５ＡＣ産生を阻害又は低減する、請求項２８に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  30. 前記予防又は治療が、異常な粘液組成を阻害する、請求項１６～２９のいずれか一項に記載の使用のためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  31. 前記予防若しくは治療が、ＭＵＣ５ＡＣ：ＭＵＣ５Ｂの比率を阻害又は低減する；及び／又は前記予防若しくは治療が、粘液中のＭＵＣ５ＡＣを阻害又は低減する；及び／又は前記予防若しくは治療が、粘液の濃さを低減する、請求項３０に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  32. 前記予防又は治療が、異常な上皮リモデリングを阻害する、請求項１６～３１のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  33. 前記予防又は治療が、異常な杯細胞分化又は増殖を阻害する、請求項１６～３２のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  34. 前記異常な杯細胞分化又は増殖が、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化又は増殖である、請求項３３に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  35. 前記予防又は治療が、呼吸器上皮の厚さを低減する、請求項１６～３４のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  36. 前記予防若しくは治療が、前記上皮の全組織領域でＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞の量を低減する、請求項３５に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  37. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、酸化ＩＬ－３３の活性を阻害する、請求項１～３６のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  38. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、酸化ＩＬ－３３のＲＡＧＥとの結合を妨げ、それによりＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する、請求項１～３７のいずれか一項に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  39. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ依存シグナル伝達及び／又はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を下方制御又は阻害する、請求項１～３８のいずれか一項に記載のとおり使用するための、ＩＬ－３３アンタゴニスト。
  40. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、ＩＬ－３３、好ましくは、還元ＩＬ－３３又は酸化ＩＬ－３３、好ましくは、還元ＩＬ－３３に結合する、結合分子又はその断片である、請求項１～３９のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  41. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、抗体又はその抗原結合断片、好ましくは、抗ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片、好ましくは、抗還元ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～４０のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  42. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、結合分子である、請求項１～４１のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  43. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアを含む、結合分子である、請求項１～４２のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
  44. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号３７の配列を有するＶＨＣＤＲ１、配列番号３８の配列を有するＶＨＣＤＲ２、配列番号３９の配列を有するＶＨＣＤＲ３、配列番号４０の配列を有するＶＬＣＤＲ１、配列番号４１の配列を有するＶＬＣＤＲ２、及び配列番号４２の配列を有するＶＬＣＤＲ３を含む結合分子である、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＩＬ－３３アンタゴニスト。
  45. 治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを投与して、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を調節又は阻害することによる、対象における異常な上皮生理機能の予防又は治療のための方法。
  46. 前記異常な上皮生理機能が、異常な粘膜毛様体生理機能、好ましくは、呼吸上皮の異常な粘膜毛様体生理機能である、請求項４５に記載の方法。
  47. 異常な粘膜毛様体生理機能が：異常な粘液産生；異常な杯細胞分化；異常な杯細胞増殖；異常な上皮厚さ；異常な粘液クリアランス；及び／又は異常な粘液組成から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 異常な粘液産生が、異常なＭＵＣ５ＡＣ産生を含み；及び／又は異常な杯細胞分化が、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化を含み；及び／又は異常な杯細胞増殖が、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞増殖を含み；及び／又は異常な前記上皮厚さが、前記上皮の全組織領域で異常な量のＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 異常な粘膜毛様体生理機能が：粘液産生の増加；杯細胞分化の増加；杯細胞増殖の増加；前記上皮の厚さの増加；及び／又は粘液クリアランスの減少を含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
  50. 粘液産生の増加が、ＭＵＣ５ＡＣ産生の増加を含み；及び／又は杯細胞分化の増加が、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化の増加を含み；及び／又は杯細胞増殖の増加が、ＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞増殖の増加を含み；及び／又は前記上皮の厚さの増加が、前記上皮の全組織領域で増加した量のＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 異常な粘液組成が、粘液に含有される様々な粘液化合物の比率の増加若しくは減少；１つ以上の粘液化合物の増加若しくは減少；及び／又は粘液の濃度若しくは濃さの増加若しくは減少を含む、請求項４７に記載の方法。
  52. 異常な粘液組成が、ＭＵＣ５ＡＣ：ＭＵＣ５Ｂの比率の増加を含み；及び／又は異常な粘液組成が、粘液に含有されるＭＵＣ５ＡＣの増加を含み；及び／又は異常な粘液組成が、粘液の濃さの増加を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記異常な上皮生理機能が、異常な上皮リモデリングである、請求項４５に記載の方法。
  54. 前記異常な上皮生理機能が、気道、好ましくは、前記気道の異常な粘膜毛様体生理機能である、請求項４５～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記気道が、下気道、好ましくは、気管支である、請求項５４に記載の方法。
  56. 治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを投与することによる、ＥＧＦＲ媒介疾患の予防又は治療のための方法。
  57. 前記ＥＧＦＲ媒介疾患が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介疾患である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＥＧＦＲ媒介疾患が、異常なＥＧＦＲ活性を特徴とする、請求項５６又は５７に記載の方法。
  59. 前記ＥＧＦＲ媒介疾患が、異常な上皮生理機能を特徴とする、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを投与して、上皮生理機能を改善することによる、疾患の予防又は治療のための方法。
  61. 治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを投与して、ＥＧＦＲ媒介効果を阻害することによる、疾患の予防又は治療のための方法。
  62. 前記ＥＧＦＲ媒介効果が、ＥＧＦＲシグナル伝達である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ＥＧＦＲ媒介効果が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果である、請求項６１又は６２に記載の方法。
  64. 前記ＥＧＦＲ媒介効果が、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達である、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記疾患が呼吸器疾患である、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記呼吸器疾患が、異常な上皮生理機能及び／又は異常ＥＧＦＲ活性を特徴とする、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記呼吸器疾患が、下呼吸器疾患、好ましくは、気管支の呼吸器疾患である、請求項６５又は６６に記載の方法。
  68. 前記呼吸器疾患が：ＣＯＰＤ、気管支炎、肺気腫、ＣＦ－気管支拡張症又は－ＣＦ－気管支拡張症などの気管支拡張症、喘息、又は喘息とＣＯＰＤのオーバーラップ（ＡＣＯ）から選択される、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記呼吸器疾患が、ＣＯＰＤ、好ましくは、気管支炎性ＣＯＰＤである、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記呼吸器疾患が、喘息、好ましくは、気管支喘息である、請求項６５～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記方法が、粘液クリアランスを改善する、請求項４５～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記方法が、異常な粘液産生を阻害又は低減する、請求項４５～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記異常な粘液産生が、ＭＵＣ５ＡＣ産生の増加である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記方法が、異常な粘液組成を阻害する、請求項４５～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記方法が、ＭＵＣ５ＡＣ：ＭＵＣ５Ｂの比率を阻害若しくは低減し；及び／又は前記方法が、粘液中のＭＵＣ５ＡＣを阻害若しくは低減し；及び／又は前記方法が、粘液の濃さを阻害若しくは低減する、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記方法が、異常な上皮リモデリングを阻害する、請求項４５～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記方法が、異常な杯細胞分化又は増殖を阻害又は低減する、請求項４５～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記方法が、異常なＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞分化又は増殖を阻害又は低減する、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記方法が、呼吸器上皮の厚さを低減する、請求項４５～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記方法が、前記呼吸器上皮の全組織領域でＭＵＣ５ＡＣ＋杯細胞の量を低減する、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、酸化ＩＬ－３３の活性を阻害する、請求項４５～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、酸化ＩＬ－３３のＲＡＧＥとの結合を妨げ、それによりＲＡＧＥ－ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する、請求項４５～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、ＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ依存シグナル伝達及び／又はＲＡＧＥ－ＥＧＦＲ媒介効果を下方制御又は阻害する、請求項４５～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、ＩＬ－３３、好ましくは、還元ＩＬ－３３又は酸化ＩＬ－３３、好ましくは、還元ＩＬ－３３に結合する、結合分子又はその断片である、請求項４５～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、抗体又はその抗原結合断片、好ましくは、抗ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片、好ましくは、抗還元ＩＬ－３３抗体又はその抗原結合断片である、請求項４５～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、結合分子である、請求項４５～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、表１から選択される可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のペアを含む、結合分子である、請求項４５～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号３７の配列を有するＶＨＣＤＲ１、配列番号３８の配列を有するＶＨＣＤＲ２、配列番号３９の配列を有するＶＨＣＤＲ３、配列番号４０の配列を有するＶＬＣＤＲ１、配列番号４１の配列を有するＶＬＣＤＲ２、及び配列番号４２の配列を有するＶＬＣＤＲ３を含む結合分子である、請求項４５～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記ＩＬ－３３アンタゴニストが、配列番号１の配列のＶＨドメインと、配列番号１９の配列のＶＬドメインとを含む、抗ＩＬ３３抗体又はその抗原結合断片である、請求項４５～８８のいずれか一項の記載の方法、又は請求項１～４４のいずれか一項に記載のとおり使用するためのＩＬ－３３アンタゴニスト。
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