JP2022140046A - 脊髄性筋萎縮症に関する情報を取得するための方法、試薬キット及び装置 - Google Patents

脊髄性筋萎縮症に関する情報を取得するための方法、試薬キット及び装置 Download PDF

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Abstract

【課題】有核細胞の核内に局在するSMNタンパク質と所定の核内タンパク質との細胞内距離に基づいて、脊髄性筋萎縮症に関する情報を取得するための新たな手段を提供することを課題とする。【解決手段】被検者から得た血液検体由来の有核細胞内のSMNタンパク質を第１の蛍光色素で標識し、所定の核内タンパク質を第２の蛍光色素で標識した有核細胞の蛍光画像を取得し、蛍光画像において、第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得し、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得することを含み、取得された値が、脊髄性筋萎縮症の罹患の指標となる、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法により、上記の課題を解決する。【選択図】図７Ａ

Description

本発明は、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法に関する。本発明は、髄性筋萎縮症に関する情報を取得するための試薬キットに関する。本発明は、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得装置に関する。
脊髄性筋萎縮症(SMA)は、脊髄の運動ニューロンの変性及び消失によって生じる神経筋疾患であり、症状として筋萎縮及び進行性の筋力低下が見られる。SMAの原因遺伝子は、サバイバルモーターニューロン１(SMN1)遺伝子である。SMN1遺伝子から産生されるSMNタンパク質は、運動ニューロンの形成及び機能維持などに重要な役割を果たす。しかし、SMAでは、SMN1遺伝子の異常によりSMNタンパク質の発現量が著しく低下するので、運動ニューロンが変性及び消失する。
特許文献１には、SMAの診断及び治療効果の確認のためのバイオマーカーとして、SMNタンパク質を検出することが記載されている。具体的には、特許文献１には、血液試料中の有核細胞内のSMNタンパク質を蛍光色素で標識してフローサイトメータにより検出することにより、蛍光強度に基づくSMNタンパク質の発現量を測定することが記載されている。
米国特許出願公開第2017/0115297号明細書
特許文献１では、有核細胞におけるSMNタンパク質の発現量を指標としている。一方、本発明者らは、有核細胞におけるSMNタンパク質の局在に着目した。よって、本発明は、有核細胞の核内に局在するSMNタンパク質と所定の核内タンパク質との細胞内距離に基づいて、SMAに関する情報を取得するための新たな手段を提供することを目的とする。すなわち、本発明の課題は脊髄性筋萎縮症に関する情報を取得するための方法、試薬キット及び装置を提供することである。
本発明は、測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得する工程、ここで、測定試料が、被検者から得た血液検体から調製された試料であり、有核細胞内のSMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識されており、有核細胞内の所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識されており、蛍光画像において、第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得する工程、及び細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する工程を含み、この値が、脊髄性筋萎縮症の罹患の指標となる、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法を提供する。
本発明は、測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得する工程、ここで、測定試料が、脊髄性筋萎縮症に対する治療を受けた患者から得た血液検体から調製された試料であり、有核細胞内のSMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識されており、有核細胞内の所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識されており、蛍光画像において、第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得する工程、及び細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する工程を含み、この値が、脊髄性筋萎縮症に対する治療の奏効性の指標となる、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法を提供する。
本発明は、２つの測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得する工程、ここで、２つの測定試料が、脊髄性筋萎縮症に対する治療を受ける前の患者から得た血液検体と、治療を受けた後の患者から得た血液検体とのそれぞれから調製された試料であり、有核細胞内のSMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識されており、有核細胞内の所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識されており、蛍光画像において、第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得する工程、及び細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する工程を含み、この値が、脊髄性筋萎縮症に対する治療の奏効性の指標となる、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法を提供する。
本発明は、SMNタンパク質と特異的に結合できる物質と、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質と、第１の蛍光色素と、第２の蛍光色素とを含む、脊髄性筋萎縮症に関する情報を取得するための試薬キットを提供する。
本発明は、第１の蛍光色素で標識されたSMNタンパク質と、第２の蛍光色素で標識された所定の核内タンパク質とを含む有核細胞に光を照射する光源と、有核細胞の蛍光画像を取得する撮像部と、蛍光画像を画像解析する処理部とを備え、処理部は、蛍光画像において、第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得し、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得するように構成され、この値が、脊髄性筋萎縮症の罹患の指標となる、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得装置を提供する。
本発明は、第１の蛍光色素で標識されたSMNタンパク質と、第２の蛍光色素で標識された所定の核内タンパク質とを含む有核細胞に光を照射する光源と、有核細胞の蛍光画像を取得する撮像部と、蛍光画像を画像解析する処理部とを備え、処理部は、蛍光画像において、第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得し、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得するように構成され、この値が、脊髄性筋萎縮症に対する治療の奏効性の指標となる、脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得装置を提供する。
本発明によれば、被検者のSMAに関する情報を取得することができる。
第１の輝点及び第２の輝点が存在する有核細胞を撮像した蛍光画像を模式的に示す図である。 第１の輝点及び第２の輝点が存在する有核細胞を撮像した蛍光画像を模式的に示す図である。 本実施形態の試薬キットの一例を示す概略図である。 本実施形態の試薬キットの一例を示す概略図である。 本実施形態の取得装置の一例を示す概略図である。 第３の蛍光色素からの蛍光シグナルの強度と側方散乱光強度とに基づいて作成した2Dスキャッタグラムである。 蛍光画像における第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を測定する処理手順を示す模式図である。 第１の輝点の重心座標C1と第２の輝点の重心座標C2との間の重心間距離Ｄを示す模式図である。 本実施形態の取得装置による判定手順を示すフローチャートである。 本実施形態の取得装置による判定手順を示すフローチャートである。 本実施形態の取得装置による判定手順を示すフローチャートである。 Ｘ軸にPerCP/Cy5.5(商標)の蛍光強度をとり、Ｙ軸に側方散乱光強度をとった2Dスキャッタグラムである。 単球の分画における、個々の単球の蛍光画像及び透過光画像の一例である。 健常者及びSMA患者の単球の分画において、SMNタンパク質の輝点が１つ以上ある単球の比率を示すグラフである。 健常者及びSMA患者の単球の分画において、SMNタンパク質の輝点が２つ以上ある単球の比率を示すグラフである。 健常者及びSMA患者の単球の分画において、SMNタンパク質の輝点が３つ以上ある単球の比率を示すグラフである。 健常者及びSMA患者の単球の分画において、SMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点とが近接している箇所が１以上ある単球の比率を示すグラフである。 SMAの治療薬を投与した患者の分画において、SMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点とが近接している箇所が１以上ある単球の比率を示すグラフである。 SMAの治療薬を投与した患者の分画において、SMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点とが近接している箇所が１以上ある単球の比率と、当該患者の血清CK活性とを示すグラフである。
本実施形態のSMAに関する情報の取得方法(以下、「取得方法」ともいう)によると、SMAの罹患の指標となる値を取得できる。本実施形態の取得方法では、まず、測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得する。
測定試料は、被検者から得た血液検体から調製された試料である。一実施形態では、被検者から得た血液検体から有核細胞を含む分画を取得し、該分画中の有核細胞を第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素で染色することにより、測定試料として、SMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識され、所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識されている有核細胞を含む試料を得ることができる。
被検者は特に限定されず、例えばSMAの罹患が疑われる者、近親者がSMA患者である者などが挙げられる。具体的には、例えば、支えなしの起立及び歩行が困難などの運動機能の低下、筋萎縮、呼吸困難などのSMAの症状が見られる者、遺伝子検査や分子マーカー検査によってSMAが疑われる者などが挙げられる。被検者は、運動機能の異常が顕出していない者であってもよい。
血液検体は、全血、又は、全血から調製され且つ有核細胞を含む分画であればよい。そのような分画としては、例えばバフィーコート、末梢血単核細胞(PBMC)を含む分画、赤血球を溶血させて遠心分離して得た有核細胞を含む分画などが挙げられる。全血としては、末梢血が好ましい。全血には、ヘパリン、EDTA塩、クエン酸ナトリウムなどの公知の抗凝固剤が含まれていてもよい。血液検体として全血を被検者から採取する場合、その量は約0.5 mL以上、好ましくは約１mL以上であり、且つ約３mL以下、好ましくは２mL以下である。
有核細胞としては、白血球系細胞、造血系幹細胞、血管内皮前駆細胞などが挙げられる。それらの中でも白血球系細胞が好ましく、例えば単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球などが挙げられる。リンパ球には、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。好ましい実施形態では、有核細胞は単球である。
血液検体が全血の場合は、測定試料の調製のために、全血から有核細胞を含む分画を取得することが好ましい。例えば、全血に公知の溶血剤を添加して赤血球を溶血させ、遠心分離により有核細胞を沈殿させることにより、有核細胞を含む分画を取得できる。全血をそのまま遠心分離して中間層を分取することにより、有核細胞を含む分画としてバフィーコートを取得できる。全血にフィコールなどの分離媒体を添加して、密度勾配遠心することにより、有核細胞を含む分画として、PBMCを含む分画を取得できる。
測定試料は、取得した有核細胞を含む分画を用いて、有核細胞を第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素で染色することにより調製できる。好ましい実施形態では、取得方法は、蛍光画像を取得する工程の前に、有核細胞を第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素で染色する工程を含む。染色により、有核細胞内のSMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識され、有核細胞内の所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識される。本実施形態では、第１の蛍光色素の励起波長は、第２の蛍光色素の励起波長と異なり、第１の蛍光色素の蛍光波長は、第２の蛍光色素の蛍光波長と異なる。
蛍光色素は特に限定されず、公知の蛍光色素から適宜選択できる。例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、クマリン、イミダゾール誘導体、インドール誘導体、アロフィコシアニン(APC)、フィコエリスリン(PE)、PerCP/Cy5.5(商標)、Alexa Fluor(登録商標)、Cy3(登録商標)、Cy5(登録商標)、Cy5.5(登録商標)、Cy7(登録商標)、DyLight(登録商標) Fluorなどが挙げられる。
SMNタンパク質は、細胞の核内に移行して核小体に局在することが知られていることから、所定の核内タンパク質は、核小体に局在するタンパク質であることが好ましい。核小体は特に限定されず、例えばカハール小体などが挙げられる。好ましい実施形態では、所定の核内タンパク質はコイリンである。コイリン自体は公知であり、そのアミノ酸配列は、例えばNCBI(National Center for Biotechnology Information)などの公知のデータベースから取得できる。コイリンは、カハール小体に局在するタンパク質として知られている。
本実施形態では、SMNタンパク質に特異的に結合できる物質を介して、有核細胞内のSMNタンパク質を第１の蛍光色素で標識することが好ましい。また、本実施形態では、所定の核内タンパク質に特異的に結合できる物質を介して、有核細胞内の所定の核内タンパク質を第２の蛍光色素で標識することが好ましい。各タンパク質に特異的に結合できる物質としては、抗体、アプタマーなどが挙げられる。それらの中でも抗体が特に好ましい。
本明細書において「抗体」との用語は、全長の抗体及びそのフラグメントを包含する。抗体のフラグメントとしては、例えば還元型IgG(rIgG)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、一本鎖抗体(scFv)、ダイアボディ、トリアボディなどが挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。例えば、SMNタンパク質と特異的に結合する抗体及びコイリンと特異的に結合する抗体は公知であり、一般に入手可能である。あるいは、Kohler G.及びMilstein C., Nature, vol.256, pp.495-497, 1975に記載の方法により、各タンパク質と特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを作製して、該抗体を取得してもよい。また、市販の抗体を用いてもよい。
抗体を用いてタンパク質を蛍光色素で標識する方法は、蛍光免疫染色法と呼ばれる。蛍光免疫染色法には直接法及び間接法があるが、本実施形態ではどちらを用いてもよい。例えば、SMNタンパク質を直接法で標識し、所定の核内タンパク質を間接法で標識してもよい。あるいは、SMNタンパク質を間接法で標識し、所定の核内タンパク質を直接法で標識してもよい。
例えば、直接蛍光免疫染色法により、SMNタンパク質を第１の蛍光色素で標識し、所定の核内タンパク質を第２の蛍光色素で標識する場合は、有核細胞と、第１の蛍光色素で標識された抗SMNタンパク質抗体と、第２の蛍光色素で標識された抗核内タンパク質抗体とを接触すればよい。具体的には、有核細胞を含む分画と、各標識抗体の溶液とを混合して、所定の条件下でインキュベーションする。抗体を蛍光色素で標識する方法自体は公知である。例えば、架橋剤などを用いて、共有結合により抗体と蛍光色素とを連結してもよい。接触における温度及び時間の条件は特に限定されないが、例えば、混合物を４℃～42℃にて、１分間～24時間インキュベーションすることができる。蛍光色素の退色を防ぐため、インキュベーションは暗所で行ってもよい。
例えば、間接蛍光免疫染色法により、SMNタンパク質を第１の蛍光色素で標識し、所定の核内タンパク質を第２の蛍光色素で標識する場合は、まず、有核細胞と、抗SMNタンパク質抗体と、抗核内タンパク質抗体とを接触する。具体的には、有核細胞を含む分画と、各抗体の溶液とを混合して、所定の条件下でインキュベーションする。間接法では二次抗体を用いるので、抗SMNタンパク質抗体及び抗核内タンパク質抗体は、互いに異なる動物種に由来する抗体であることが好ましい。そして、抗SMNタンパク質抗体及び抗核内タンパク質抗体と接触した有核細胞と、抗SMNタンパク質抗体に対する第１の蛍光色素で標識された二次抗体と、抗核内タンパク質抗体に対する第２の蛍光色素で標識された二次抗体とを接触する。具体的には、有核細胞を含む液と、各標識二次抗体の溶液とを混合して、所定の条件下でインキュベーションする。インキュベーションの条件は上記のとおりである。
さらなる実施形態では、抗SMNタンパク質抗体又は抗核内タンパク質抗体は、ビオチン類で標識されてもよい。この場合、免疫染色において、ビオチン修飾した抗SMNタンパク質抗体又は抗核内タンパク質抗体と、第１又は第２の蛍光色素を固定したアビジン類とを用いる。ビオチン類とアビジン類との特異的結合を介して、第１又は第２の蛍光色素が、SMNタンパク質又は所定の核内タンパク質と結合した抗体に間接的に結合できる。ビオチン類とは、ビオチンと、デスチオビオチン、オキシビオチンなどのビオチン類縁体とを含む。アビジン類とは、アビジンと、ストレプトアビジン、タマビジン(登録商標)などのアビジン類縁体とを含む。
本実施形態では、有核細胞と各抗体との接触後に、未反応の抗体を除去するために細胞の洗浄を行ってもよい。洗浄には、PBSなどの適切な水性媒体を用いることができる。また、市販の洗浄バッファーを用いてもよい。
本実施形態では、細胞内のSMNタンパク質及び所定の核内タンパク質を染色するので、染色の前に、有核細胞の膜透過処理を行ってもよい。この処理により、細胞膜及び核膜が、蛍光色素及び各タンパク質と特異的に結合できる物質が通過できる程度に損傷されて、蛍光色素及び各タンパク質と特異的に結合できる物質が有核細胞の核内に移行できる。膜透過処理は、例えば、有核細胞と、蛍光色素が通過できる程度の損傷を細胞膜及び核膜に与える処理液とを接触させることにより行うことができる。そのような処理液は、界面活性剤の溶液が好ましい。膜透過処理に慣用される界面活性剤は公知であり、例えばノニデット(登録商標)P-40、Triton(登録商標)X-100などが挙げられる。溶媒は、水、生理食塩水又は適当な緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液(PBS)、グッド緩衝液などが挙げられる。グッド緩衝液としては、例えばPIPES、MES、Bis-Tris、ADA、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPSなどが挙げられる。
必要に応じて、有核細胞の核を標識してもよい。有核細胞が膜透過処理されている場合、細胞の核は、核酸を染色可能な蛍光色素(以下、「核染色用色素」ともいう)により染色できる。そのような蛍光色素としては、例えばHoechst33342、Hoechst33258、4'，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール・ジヒドロクロリド(DAPI)などが挙げられる。
必要に応じて、有核細胞の膜透過処理の前に、有核細胞を固定してもよい。細胞を固定する方法自体は公知であり、例えば、有核細胞と固定液とを接触させることにより行うことができる。そのような固定液は、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アセトン、メタノール、エタノール及びそれらの組み合わせが挙げられる。また、市販の細胞固定液を用いてもよい。全血を検体に用いる場合、溶血剤を含む固定液を用いてもよい。
本実施形態では、有核細胞の固定又は膜透過処理の前に、有核細胞の表面にあるFc受容体のブロッキング処理を行ってもよい。ブロッキング処理は、蛍光免疫染色の際に、Fc受容体を介した細胞への抗体の非特異的反応を抑制するための処理である。ブロッキング処理は、有核細胞にブロッキング処理用の試薬を接触させることにより行うことができる。当該試薬自体は公知であり、例えば抗Fc受容体抗体、血清などが挙げられる。また、市販の試薬を用いてもよい。
上記のとおり、血液中の有核細胞には、様々な種類の細胞が含まれる。所定の有核細胞に対して本実施形態の取得方法を適用したい場合は、当該細胞の表面抗原マーカーを用いて、所定の有核細胞を選別してもよい。所定の有核細胞は、１個の細胞でもよいし、複数個の同種の有核細胞から実質的に構成される亜集団(サブセット)でもよい。具体的には、所定の有核細胞の表面抗原マーカーを第３の蛍光色素で標識し、第３の蛍光色素からの蛍光シグナルに基づいて、所定の有核細胞を選別する。表面抗原マーカーの第３の蛍光色素による標識は、表面抗原マーカーと特異的に結合できる物質(例えば抗体、アプタマーなど)を用いて行うことができる。このように、本実施形態の取得方法は、蛍光画像を取得する工程の前に、有核細胞を第３の蛍光色素で染色する工程を含み得る。また、本実施形態の取得方法は、第３の蛍光色素で標識された細胞から蛍光シグナルに基づいて、所定の有核細胞を選別する工程を含み得る。
必要に応じて、第３の蛍光色素からの蛍光シグナルと、側方散乱光強度とを組み合わせてもよい。例えば、Ｘ軸に第３の蛍光色素の蛍光強度をとり、Ｙ軸に側方散乱光強度をとった2Dスキャッタグラムを作成して、この2Dスキャッタグラムにおいて、所定の有核細胞のサブセットを選別してもよい。よって、本実施形態の取得方法は、第３の蛍光色素で標識された細胞から蛍光シグナル及び側方散乱光シグナルに基づいて、所定の有核細胞を選別する工程を含み得る。
有核細胞の表面抗原マーカー自体は公知であり、有核細胞の種類に応じて適宜選択できる。例えば、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD22、CD33、CD34、CD45、CD56、CD66、CD125などが挙げられる。一般に、CD14は単球マーカー、CD3はＴ細胞マーカー、CD19はＢ細胞マーカー、CD56はNK細胞マーカー、CD66は好中球マーカー、CD125は好酸球マーカー、CD22は好塩基球マーカー、CD45は白血球全般のマーカーとして知られているが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、複数の表面抗原マーカーを用いて、有核細胞を複数のサブセットに分類してもよい。
本実施形態では、測定試料中の有核細胞の蛍光画像を、蛍光色素で染色した細胞に励起光を照射して発生する蛍光を画像として観察及び記録できる手段により取得することが好ましい。そのような手段は特に限定されないが、個々の細胞中の蛍光標識されたタンパク質の局在を観察可能な手段が好ましい。一実施形態では、測定試料中の有核細胞の蛍光画像を蛍光顕微鏡又はフローサイトメータにより取得する。フローサイトメータは、イメージングフローサイトメータ(IFC)を含む。
本実施形態では、一の蛍光画像において、複数の有核細胞が撮像されていてもよい。例えば蛍光顕微鏡を用いることにより、複数の有核細胞が撮像された一の蛍光画像を取得できる。複数の有核細胞が撮像された蛍光画像を複数取得してもよい。蛍光画像の倍率は特に限定されないが、個々の有核細胞において、蛍光標識されたSMNタンパク質及び所定の核内タンパク質の局在が観察可能な倍率であることが好ましい。
さらなる実施形態では、複数の蛍光画像を取得し、各蛍光画像において、互いに異なる１個の有核細胞が撮像されていてもよい。例えばIFCを用いることにより、個々の有核細胞の蛍光画像を取得できる。IFCは、撮像部を備えたフローサイトメータであり、液中を流れる細胞の画像を取得可能な装置である。より具体的には、IFCは、数秒から数分の短時間に、数千個から数百万個の細胞のそれぞれから蛍光シグナル、散乱光シグナル、蛍光画像及び透過光画像を取得し、定量測定できる。画像処理により、１つ１つの細胞の情報を抽出できる。
蛍光顕微鏡及びフローサイトメータは特に限定されず、市販の装置を用いてもよい。光源は特に限定されず、蛍光色素の励起に好適な波長の光源を適宜選択できる。光源としては、例えば青色半導体レーザー、赤色半導体レーザー、アルゴンレーザー、He-Neレーザー、水銀アークランプなどが用いられる。
本実施形態の取得方法では、蛍光画像において、第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得する。一般に、蛍光画像は、蛍光色素が発する蛍光のシグナル強度(蛍光強度)に応じた画素値を有する画素により構成される。本明細書において「輝点」とは、タンパク質を標識している蛍光色素が発する蛍光の点であって、当該点を構成する各画素の画素値が所定の値以上である点をいう。第１の蛍光色素に対応する第１の輝点(以下、「第１の輝点」と呼ぶ)は、第１の蛍光色素で標識された１分子以上のSMNタンパク質を表す。また、第２の蛍光色素に対応する第２の輝点(以下、「第２の輝点」と呼ぶ)は、第２の蛍光色素で標識された１分子以上の所定の核内タンパク質を表す。
蛍光画像において、少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む有核細胞の数を取得してもよい。第１の輝点及び第２の輝点の両方が存在する有核細胞は、目視により選別してもよいし、蛍光画像を取得した機器により選別してもよい。好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む単球の数を取得する。
蛍光画像において、少なくとも１個の有核細胞の第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。該細胞内距離を調べる有核細胞の数は特に限定されないが、多いほど、より正確な情報を取得し得る。好ましい実施形態では、蛍光画像において、複数の有核細胞のそれぞれの第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。
本実施形態において、「第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離」とは、１個の有核細胞における第１の輝点と第２の輝点との間の距離をいう。細胞内距離は、蛍光画像における平面上の距離であって奥行きは考慮されない。細胞内距離は、物理的距離又はそれを反映するパラメータであり得る。物理的距離は、例えばメートル系単位(例えばμm又はnm)で表される距離である。物理的距離としては、例えばマイクロスケール又は接眼ミクロメータなどを用いて実測した値、蛍光画像を取得した機器により測定された値などが挙げられる。物理的距離を反映するパラメータとしては、例えば、所定の倍率で撮像された蛍光画像における第１の輝点と第２の輝点との間の画素数などが挙げられる。細胞内距離は、物理的距離を反映するパラメータから換算された物理的距離であってもよい。
細胞内距離としては、例えば、第１の輝点及び第２の輝点の外周が最も近接している箇所の距離、第１の輝点及び第２の輝点の重心間距離、第１の輝点及び第２の輝点の中心点間距離などが挙げられる。蛍光画像において「輝点の重心」は、輝点を表す画像の幾何学的な重心の座標(以下、「重心座標」ともいう)に位置する画素をいう。蛍光画像において「輝点の中心点」は、輝点を表す画像を構成する画素のうち、最も高い画素値を有する画素をいう。
１個の有核細胞内に第１の輝点及び／又は第２の輝点が複数存在する場合、最も近接する第１の輝点と第２の輝点との距離を、細胞内距離として取得することが好ましい。図１を参照して、細胞内距離の取得について説明する。図中、破線は有核細胞の輪郭を表す。第１画像及び第２画像は、それぞれ第１及び第２の蛍光色素が発する蛍光シグナルに基づいて取得された蛍光画像である。合成画像は、第１画像及び第２画像を重ね合わせた画像である。図１Ａでは、第１画像に第１の輝点(x)が存在し、第２画像に第２の輝点(a)、(b)及び(c)が存在する。合成画像において、第１の輝点(x)と第２の輝点(a)との距離、第１の輝点(x)と第２の輝点(b)との距離、及び第１の輝点(x)と第２の輝点(c)との距離を算出し、これらを比較する。第１の輝点(x)に最も近接する第２の輝点は、第２の輝点(c)である。図１Ａの例では、第１の輝点(x)と第２の輝点(c)との細胞内距離を用いることができる。
図１Ｂでは、第１画像に第１の輝点(x)及び(y)が存在し、第２画像に第２の輝点(a)、(b)及び(c)が存在する。合成画像において、○で表される輝点は、第１の輝点(y)と第２の輝点(a)とが重なっている箇所を示す。これは、SMNタンパク質と核内タンパク質とが共局在していることを示す。蛍光画像において、第１の輝点と第２の輝点のすべての組み合わせについて第１の輝点と第２の輝点との距離を測定する。より具体的には、第１の輝点(x)と第２の輝点(a)との距離、第１の輝点(x)と第２の輝点(b)との距離、第１の輝点(x)と第２の輝点(c)との距離、第１の輝点(y)と第２の輝点(a)との距離、第１の輝点(y)と第２の輝点(b)との距離、及び第１の輝点(y)と第２の輝点(c)との距離を測定する。次に、これらの距離を比較し、最も近接する第１の輝点及び第２の輝点の組み合わせを特定する。図１Ｂの例では、第１の輝点(y)及び第２の輝点(a)が、最も近接する第１の輝点及び第２の輝点の組み合わせである。この例では、第１の輝点(y)と第２の輝点(a)との距離を、細胞内距離として用いることができる。
別の実施形態では、１個の有核細胞内に第１の輝点及び／又は第２の輝点が複数存在する場合、第１の輝点と第２の輝点との距離の平均値を、細胞内距離として取得することができる。平均値は、相加平均の値、相乗平均の値などであり得る。この実施形態では、図１Ａに示される蛍光画像が得られた場合、蛍光画像において第１の輝点と第２の輝点のすべての組み合わせについて第１の輝点と第２の輝点との距離を測定する。より具体的には、第１の輝点(x)と第２の輝点(a)との距離、第１の輝点(x)と第２の輝点(b)との距離、及び第１の輝点(x)と第２の輝点(c)との距離を測定する。次に、これらの距離の平均値を算出し、得られた平均値を細胞内距離として用いることができる。図１Ｂに示される蛍光画像が得られた場合、同様に、第１の輝点(x)と第２の輝点(a)との距離、第１の輝点(x)と第２の輝点(b)との距離、第１の輝点(x)と第２の輝点(c)との距離、第１の輝点(y)と第２の輝点(a)との距離、第１の輝点(y)と第２の輝点(b)との距離、及び第１の輝点(y)と第２の輝点(c)との距離の平均値を細胞内距離として用いることができる。
本実施形態の取得方法では、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する。後述の実施例に示されるように、本発明者らは、健常者の血液由来の有核細胞に比べて、SMA患者の血液由来の有核細胞には、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が短い細胞の比率が少ないことを見出した。そして、本発明者らは、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が、これに対応する所定の閾値(第１の閾値)以下である有核細胞の数に基づいて、SMA患者と健常者とを区別できることを見出した。よって、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値は、SMAの罹患の指標となり得る。
第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値は、SMA患者と健常者とを区別可能な値であれば、特に限定されない。そのような値の例を以下に挙げるが、これらに限定されない。以下、「条件を満たす」との用語は、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値以下であることをいう。また、「条件を満たさない」との用語は、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値より高いことをいう。
・測定試料に含まれる全ての有核細胞の数に対する、条件を満たす有核細胞の数の比率又は比の値
・測定試料に含まれる全ての単球の数に対する、条件を満たす有核細胞の数の比率又は比の値
・測定試料に含まれる全ての単球の数に対する、条件を満たす単球の数の比率又は比の値
・少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む有核細胞の数に対する、条件を満たす有核細胞の数の比率又は比の値条件を満たす有核細胞の数の比率又は比の値
・少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む有核細胞の数に対する、条件を満たす有核細胞の数の比率又は比の値条件を満たす単球の数の比率又は比の値
・少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む単球の数に対する、条件を満たす単球の数の比率又は比の値条件を満たす単球の数の比率又は比の値
・条件を満たさない有核細胞の数に対する、条件を満たす有核細胞の数の比率又は比の値
・条件を満たさない単球の数に対する、条件を満たす単球の数の比率又は比の値
細胞数の比率に関して、「細胞Ａの数に対する、細胞Ｂの数の比率」とは、[(細胞Ｂの数)/(細胞Ａの数)]x100で算出されるパーセンテージである。細胞数の比の値に関して、「細胞Ａの数に対する、細胞Ｂの数の比の値」とは、(細胞Ｂの数)/(細胞Ａの数)で算出される値である。測定試料に含まれる全ての有核細胞又は単球の数として、蛍光画像が取得された有核細胞又は単球の数を用いてもよい。
好ましくは、条件を満たす有核細胞の数に関する値は、少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む単球の数に対する、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値以下である単球の数の比率又は比の値である。
第１の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、複数のSMA患者及び健常者から得た有核細胞中の第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。そして、細胞内距離について、患者群と健常者群とを最も精度よく区別可能な値を求め、その値を第１の閾値として設定する。閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することができる。
第１の閾値は、例えば1.2μm以下、好ましくは1.0μm以下、より好ましくは0.9μm以下の値に設定され得る。第１の閾値は、例えば0.5μm以上、好ましくは0.6μm以上、より好ましくは0.7μm以上の値に設定され得る。第１の閾値は、例えば0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1又は1.2μmであり得る。好ましい実施形態では、第１の閾値は0.8μmである。
本実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値と、これに対応する所定の閾値(第２の閾値)とを比較することにより、条件を満たす有核細胞の数に関する値を、SMAの罹患の指標として利用してもよい。一実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値未満である場合、被検者がSMAに罹患していることが示唆される。一実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値以上である場合、被検者がSMAに罹患していないことが示唆される。
第２の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、複数のSMA患者及び健常者から得た有核細胞中の第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。そして、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する。当該値について、患者群と健常者群とを最も精度よく区別可能な値を求め、その値を第２の閾値として設定する。閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することができる。
条件を満たす有核細胞の数に関する値が、少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む単球の数に対する、条件を満たす単球の数の比率又は比の値条件を満たす単球の数の比率である場合、第２の閾値は、例えば10%以上18%以下、好ましくは11%以上15%以下の範囲から設定される。
医師などの医療従事者は、条件を満たす有核細胞の数に関する値による示唆と他の情報とを組み合わせて、被検者がSMAに罹患しているか否かを判定してもよい。ここで、「他の情報」とは、運動機能の評価、遺伝子検査の結果、その他の医学的所見を含む。
条件を満たす有核細胞の数に関する値により、被検者がSMAに罹患していると示唆された場合、該被検者には、SMAに対する医学的介入を行うことができる。医学的介入の例は、薬剤の投与、外科手術、運動訓練、理学療法などが含まれる。薬剤は、SMAに対する公知の治療薬又はその候補となる医薬から適宜選択できる。SMAの治療薬又はその候補としては、例えばヌシネルセン(製品名スピンラザ(商標))、オナセムノゲン アベパルボベク(製品名ゾルゲンスマ(商標))、リスジプラム(製品名エブリスディ(商標))などが挙げられる。
別の実施形態は、被検者のSMAの罹患の判定を補助する方法である。この方法では、条件を満たす有核細胞の数に関する値に基づいて、被検者がSMAに罹患しているか否かを判定する。一実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値未満である場合、被検者がSMAに罹患していると判定する。一実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値以上である場合、被検者がSMAに罹患していないと判定する。条件を満たす有核細胞の数に関する値により、被検者がSMAに罹患していると判定された場合、該被検者には、SMAに対する医学的介入を行うことができる。医学的介入の詳細は、上記のとおりである。
さらなる実施形態は、SMAに関する情報として、SMAに対する治療の奏効性の指標となる値を取得する方法に関する。この実施形態では、被検者は、SMAに対する治療を受けたSMA患者である。SMAに対する治療は特に限定されず、例えば、上記の医学的介入から適宜選択できる。好ましい治療は薬剤の投与である。薬剤としては、例えば、上記のヌシネルセン、オナセムノゲン アベパルボベク、リスジプラムなどが挙げられる。SMAに対する治療は、被検者にとって初回の治療であってもよいし、二回目以降の治療であってもよい。
この実施形態では、測定試料として、SMAに対する治療を受けたSMA患者から得た血液検体から調製された試料を用いる。当該患者からの血液の採取時期は、SMAに対する治療を受けた後であれば特に限定されないが、例えば、SMAに対する治療を受けた時点から0.5時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、10時間、12時間、15時間、18時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、10日、11日、12日、13日、２週間、３週間、４週間又は１ヶ月が経過した時点である。この実施形態では、SMAに対する治療を受けたSMA患者から得た血液検体を用いること以外は、上記の本実施形態の取得方法と同様にして、測定試料を得ることができる。
この実施形態では、SMAに対する治療を受けたSMA患者由来の測定試料を用いること以外は、上記の本実施形態の取得方法と同様にして、該測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得し、蛍光画像において、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得し、該細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得することができる。第１及び第２の輝点、細胞内距離、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値については、上記のとおりである。
この実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値と、第２の閾値とを比較することにより、条件を満たす有核細胞の数に関する値を、SMAに対する治療の奏効性の指標として利用できる。第２の閾値については上記のとおりである。後述の実施例に示されるように、本発明者らは、SMAに対する治療が奏効している場合、治療前に採取した血液由来の有核細胞に比べて、治療後に採取した血液由来の有核細胞には、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が短い細胞の比率が増加することを見出した。そして、本発明者らは、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に基づいて、SMAに対する治療の奏効性を評価できることを見出した。よって、条件を満たす有核細胞の数に関する値は、SMに対する治療の奏効性の指標となり得る。
条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値未満である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していないことが示唆される。一実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値以上である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していることが示唆される。第２の閾値については上記のとおりである。
さらなる実施形態では、条件を満たす有核細胞の数に関する値に基づいて、患者のSMAに対する治療が奏効しているか否かを判定する。条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値未満である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していないと判定することができる。条件を満たす有核細胞の数に関する値が第２の閾値以上である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していると判定することができる。
さらなる実施形態は、同一のSMA患者について、SMAに対する治療を受ける前の測定試料と、当該治療を受けた後の測定試料との解析結果を比較することにより、SMAに関する情報として、SMAに対する治療の奏効性の指標となる値を取得する方法に関する。この実施形態では、被検者はSMA患者である。測定試料として、SMAに対する治療を受ける前の患者から得た血液検体由来の測定試料(以下、「治療前の測定試料」ともいう)と、SMAに対する治療を受けた後の当該患者から得た血液検体由来の測定試料(以下、「治療後の測定試料」ともいう)とを用いる。
SMAに対する治療は特に限定されず、例えば、上記の医学的介入から適宜選択できる。また、SMAに対する治療は、１回の治療であってもよいし、一定期間中に複数回行われる治療であってもよい。１回の治療としては、例えば、薬剤の単回投与、手術などが挙げられる。一定期間中に複数回行われる治療としては、例えば、薬剤の継続的投与、理学療法、運動訓練などが挙げられる。好ましい治療は薬剤の投与である。薬剤としては、例えば、上記のヌシネルセン、オナセムノゲン アベパルボベク、リスジプラムなどが挙げられる。
この実施形態において「SMAに対する治療を受ける前の患者」には、治療を一度も受けたことのないSMA患者だけでなく、過去に治療を受けたことのあるSMA患者も含まれる。例えば、異なる時期に薬剤を２回投与する治療を行う場合、１回目の薬剤投与を受けた時点では、当該患者は、２回目の薬剤投与による治療を受ける前の患者に該当する。
SMAに対する治療を受ける前の患者からの血液の採取時期は、当該治療を受ける前であれば特に限定されない。好ましくは、SMAに対する治療を受ける日の前日又は同日である。SMAに対する治療を受ける後の患者からの血液の採取時期については、上記のとおりである。この実施形態では、血液検体を採取する度に測定試料を調製して解析してもよい。あるいは、採取した各血液検体を保存しておき、後日、各血液検体から治療前及び治療後の測定試料を調製し、それらを逐次に解析してもよい。
この実施形態では、上記の本実施形態の取得方法と同様にして、治療前の測定試料及び治療後の測定試料のそれぞれに含まれる有核細胞の蛍光画像を取得し、蛍光画像において、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得し、該細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する。第１及び第２の輝点、細胞内距離、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値については、上記のとおりである。
この実施形態では、治療前の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値と、治療後の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値とが得られる。この実施形態では、これらの２つの値を、SMAに対する治療の奏効性の指標として利用できる。
治療後の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値が、治療前の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値未満である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していないことが示唆される。治療後の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値が、治療前の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値以上であるか、又は上記の第２の閾値以上である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していることが示唆される。
さらなる実施形態では、２つの測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値に基づいて、患者のSMAに対する治療が奏効しているか否かを判定する。治療後の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値が、治療前の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値未満である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していないと判定する。治療後の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値が、治療前の測定試料から取得した、条件を満たす有核細胞の数に関する値以上であるか、又は上記の第２の閾値以上である場合、患者のSMAに対する治療が奏効していると判定することができる。
患者のSMAに対する治療が奏効していると示唆又は判定された場合、該患者への治療を継続することができる。一方、患者のSMAに対する治療が奏効していないと示唆又は判定された場合、医師などは、例えば、薬剤の投与量又は種類の変更、治療の種類の変更又は追加などを検討することができる。
さらなる実施形態は、SMAに関する情報を取得するための試薬キットである。本実施形態の試薬キットは、SMNタンパク質と特異的に結合できる物質と、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質と、第１の蛍光色素と、第２の蛍光色素とを含む。本実施形態の試薬キットは、SMAの罹患の指標となる値又はSMAに対する治療の奏効性の指標となる値を取得する上記の本実施形態の方法に用いることができる。各タンパク質に特異的に結合できる物質、第１及び第２の蛍光色素については、上記のとおりである。
試薬キットは、各試薬を収容した容器が箱に梱包されて、ユーザーに提供されてもよい。箱には、添付文書を同梱していてもよい。添付文書には、試薬キットの構成、各試薬の組成、使用方法などが記載されていてもよい。本実施形態の試薬キットの一例を、図２Ａに示す。図２Ａにおいて、１０１は、試薬キットを示し、１０２は、SMNタンパク質と特異的に結合できる物質を含む試薬を収容した容器を示し、１０３は、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質を含む試薬を収容した容器を示し、１０４は、第１の蛍光色素を含む試薬を収容した容器を示し、１０５は、第２の蛍光色素を含む試薬を収容した容器を示し、１０６は、梱包箱を示し、１０７は、添付文書を示す。この例において、SMNタンパク質と特異的に結合できる物質が抗体である場合、第１の蛍光色素を含む試薬は、第１の蛍光色素で標識された二次抗体であってもよい。また、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質が抗体である場合、第２の蛍光色素を含む試薬は、第２の蛍光色素で標識された二次抗体であってもよい。
一実施形態では、SMNタンパク質と特異的に結合できる物質は、第１の蛍光色素で標識されてもよい。また、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質は、第２の蛍光色素で標識されてもよい。この実施形態の試薬キットの一例を、図２Ｂに示す。図２Ｂにおいて、２０１は、試薬キットを示し、２０２は、第１の蛍光色素で標識された、SMNタンパク質と特異的に結合できる物質を含む試薬を収容した容器を示し、２０３は、第２の蛍光色素で標識された、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質を含む試薬を収容した容器を示し、２０４は、梱包箱を示し、２０５は、添付文書を示す。
本実施形態の試薬キットは、表面抗原マーカーと特異的に結合できる物質を含む試薬と、第３の蛍光色素を含む試薬をさらに含んでもよい。表面抗原マーカーと特異的に結合できる物質が抗体である場合、第３の蛍光色素を含む試薬は、第３の蛍光色素で標識された二次抗体であってもよい。あるいは、表面抗原マーカーと特異的に結合できる物質は、第３の蛍光色素で標識されてもよい。さらなる実施形態では、試薬キットは、核染色用色素を含む試薬をさらに含んでもよい。
さらなる実施形態は、SMAに関する情報を取得するための試薬キットの製造のための試薬の使用であって、前記試薬が、SMNタンパク質と特異的に結合する物質を含む試薬と、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合する物質を含む試薬と、第１の蛍光色素を含む試薬と、第２の蛍光色素を含む試薬である。別の実施形態は、SMAに関する情報を取得するための試薬キットの製造のための試薬の使用であって、前記試薬が、第１の蛍光色素で標識された、SMNタンパク質と特異的に結合する物質を含む試薬と、第２の蛍光色素で標識された、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合する物質を含む試薬である。
一実施形態は、SMAに関する情報の取得装置である。
本実施形態の取得装置の一例を、図面を参照して説明する。図３に示される取得装置１０は、カメラ及びフローセルを備えるIFCの構成を有する装置であるが、本実施形態の取得装置は、図３に例示される形態のみに限定されない。本実施形態の取得装置は、接眼レンズ及び対物レンズを備え、スライド上の細胞を観察し、該細胞の蛍光画像を取得する蛍光顕微鏡の構成を有する装置であってもよい。
図３に示される取得装置１０は、撮像ユニット１００と、処理部１１とを備える。撮像ユニット１００は、第１の蛍光色素で標識されたSMNタンパク質と、第２の蛍光色素で標識された所定の核内タンパク質とを含む有核細胞の蛍光画像を取得する。処理部１１は、取得した蛍光画像を画像解析する。図３に示される取得装置１０は、処理部１１と接続された記憶部１２、表示部１３及び入力部１４を備える。
図３の例では、撮像ユニット１００は、光源１２１～１２４と、撮像部１５４とを備える。光源１２１～１２４は、蛍光色素で染色された有核細胞に光を照射する。撮像部１５４は、CCD(Charge-Coupled Device)カメラ、TDI(Time Delay Integration)カメラなどのカメラが用いられる。また、撮像ユニット１００は、集光レンズ１３１～１３４、１５１及び１５３と、ダイクロイックミラー１４１及び１４２と、光学ユニット１５２とを備える。撮像ユニット１００に設けられた４種類の光源１２１～１２４によって、３種類の蛍光色素のそれぞれに応じた蛍光画像と、透過光画像とが取得される。３種類の蛍光色素は、上記の第１、第２及び第３の蛍光色素であってもよい。あるいは、上記の第１及び第２の蛍光色素、及び上記の核染色用色素であってもよい。透過光画像は、明視野画像とも呼ばれる。
図３に示される取得装置１０は、試料調製部２０により調製された測定試料２０ａ中の有核細胞の蛍光画像を取得する。試料調製部２０は、被検者の血液検体から測定試料２０ａを調製し、撮像ユニット１００に測定試料２０ａを供給する。試料調製部２０は、血液検体と試薬とを混合するための混合容器、血液検体及び試薬を混合容器に分注するための分注ユニット、混合容器を加温するための加温部などを備える。試料調製部２０は、取得装置１０とは別個の装置であってもよいし、取得装置１０内に備えられてもよい。取得装置１０が試料調製部２０を備える場合、試料調製部２０は処理部１１と接続され、処理部１１によって制御可能に構成される。
図３に示される取得装置１０は、測定試料２０ａを流すためのフローセル１１０を備える。フローセル１１０は、透光性の樹脂又はガラスで構成され、測定試料２０ａを流すための流路１１１を有する。フローセル１１０は、撮像ユニット１００に設けられている。撮像ユニット１００において、光源１２１～１２４はフローセル１１０に光を照射するように構成されている。また、撮像部１５４は、フローセル１１０の流路１１１を流れる細胞の蛍光画像を取得するように構成されている。
撮像ユニット１００は、上記のとおり、光源１２１～１２４から出射された光がフローセル１１０の流路１１１を流れる測定試料２０ａに照射されるように構成されている。光源１２１～１２３は、例えば半導体レーザー光源であり得、光源１２４は、例えば白色LEDであり得る。光源１２１は、第１の蛍光色素を励起するための光源であって、波長λ１１の光を含むレーザー光を出射する。光源１２２は、第２の蛍光色素を励起するための光源であって、波長λ１２の光を含むレーザー光を出射する。光源１２３は、第３の蛍光色素又は核染色用色素を励起するための光源であって、波長λ１３の光を含むレーザー光を出射する。光源１２４は、細胞を透過する波長λ１４の白色光を出射する。
図３の例では、集光レンズ１３１～１３４は、それぞれ光源１２１～１２４とフローセル１１０の間に配置され、光源１２１～１２４から出射された光をフローセル１１０に集光する。ダイクロイックミラー１４１は、波長λ１１の光を透過させ、波長λ１２の光を反射する。ダイクロイックミラー１４２は、波長λ１１及びλ１２の光を透過させ、波長λ１３の光を反射する。このような光学系により、光源１２１～１２４の光は、フローセル１１０の流路１１１に照射される。そして、流路１１１を流れる測定試料２０ａに波長λ１１～λ１３の光が照射されると、細胞を標識している蛍光色素が蛍光を発する。
具体的には、波長λ１１の光が、SMNタンパク質を標識する第１の蛍光色素に照射されると、第１の蛍光色素から波長λ２１の第１の蛍光が生じる。波長λ１２の光が、所定の核内タンパク質(例えばコイリン)を標識する第２の蛍光色素に照射されると、第２の蛍光色素から波長λ２２の第２の蛍光が生じる。波長λ１３の光が、表面抗原マーカーを標識する第３の蛍光色素又は細胞核を標識する核染色用色素に照射されると、第３の蛍光色素又は核染色用色素から波長λ２３の第３の蛍光が生じる。試料２０ａに光源１２４の白色光が照射されると、白色光は細胞を透過して、明視野画像が得られる。
図３の例では、フローセル１１０と撮像部１５４の間には、フローセル１１０側から、レーザー光の光路に沿って、集光レンズ１５１、光学ユニット１５２、集光レンズ１５３が順に配置される。集光レンズ１５１は、測定試料２０ａから生じた第１～第３の蛍光及び測定試料２０ａを透過した透過光を光学ユニット１５２に集光する。光学ユニット１５２は、例えば４枚のダイクロイックミラーを積層して構成される。４枚のダイクロイックミラーは、第１～第３の蛍光を互いに異なる角度で反射し、撮像部１５４の受光面上において分離させる。集光レンズ１５３は、光学ユニット１５２で反射された光を撮像部１５４の受光面に集光する。
撮像部１５４は、第１～第３の蛍光及び透過光によって形成される像を撮像して、第１～第３の蛍光にそれぞれ対応した３種類の蛍光画像と、透過光に対応した明視野画像とを取得し、取得した画像を処理部１１に送信する。第１～第３蛍光に対応する蛍光画像を、それぞれ「第１画像」、「第２画像」、「第３画像」とも呼ぶ。処理部１１は、撮像部１５４から送られた第１～第３画像及び明視野画像の間で、被写体と画素の位置関係が一致するようソフトウェアによって各画像を補正する。第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を分析するため、第１画像及び第２画像は同じ大きさである。
撮像ユニット１００は、測定試料２０ａ中の個々の粒子から発せられる前方散乱光を検出できるように配置された受光部と、測定試料２０ａ中の個々の粒子から発せられる側方散乱光を検出できるように配置された受光部とをさらに備える。側方散乱光は、光源の光軸方向に対して90°の方向に散乱する光に限定されず、例えば、光軸方向に対して80°以上100°以下の方向に散乱する光である。前方散乱光は、光源の光軸方向に散乱する光に限定されず、例えば、光軸方向に対して-10°以上10°以下の方向に散乱する光であってもよい。各受光部は、受光レベルに応じた前方散乱光信号及び側方散乱光信号を処理部１１に送信する。
処理部１１は、測定試料２０a中の個々の粒子から発せられる散乱光信号等の光学的情報に基づいて撮像した蛍光画像から有核細胞の蛍光画像を抽出する。後述する記憶部１２に格納されたソフトウェアを実行することにより撮像ユニット１００により有核細胞の蛍光画像を画像解析して、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得し、該細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する。処理部１１は、ＣＰＵで構成され、蛍光画像の処理及び解析に係る演算処理を実行する。処理部１１は、記憶部１２に記憶されたコンピュータプログラムに基づいて、蛍光画像の画像解析を含む種々の処理を実行する。処理部１１は、撮像ユニット１００、記憶部１２、表示部１３及び入力部１４に接続されており、各部から信号を受信して種々の情報を取得し、各部に制御信号を出力して各部を制御する。
記憶部１２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ソリッドステートドライブ(ＳＳＤ)、ハードディスクなどで構成されている。記憶部１２には、蛍光画像の画像解析のために処理部１１が実行するコンピュータプログラムが格納されている。表示部１３は、ディスプレイにより構成され、細胞の蛍光画像、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値、目視解析を補助する補助情報などを表示する。入力部１４は、マウス及びキーボードにより構成され、検体IDなどの情報の入力、表示画面の切り替え、蛍光画像の選択などに使用される。記憶部１２、表示部１３及び入力部１４の構成は特に限定されない。本実施形態では、表示部１３及び入力部１４に替えて、表示入力部として、表示部の表面に入力部が配置されたタッチパネルを備えてもよい。タッチパネルとしては、例えば静電容量方式などの周知の方式のタッチパネルが挙げられる。
処理部１１は、記憶部１２に格納されたソフトウェアを実行することにより、撮像部１５４により撮像された第１及び第２画像を処理して、第１及び第２画像のそれぞれから第１及び第２の輝点を抽出する。有核細胞が核染色用色素で標識されている場合、処理部１１は、第３画像から核領域を抽出する。処理部１１は、表示部１３に蛍光画像を細胞ごとに表示してもよい。
有核細胞が第３の蛍光色素で標識されている場合、処理部１１は、第３の蛍光のシグナル強度のデータと、前方散乱光強度又は側方散乱光強度のデータとを用いて、2Dスキャッタグラムを作成する。例えば、蛍光強度をＸ軸にとり、側方散乱光強度をＹ軸にとった2Dスキャッタグラムを作成した場合、図４に示すにように、第３の蛍光色素で標識された有核細胞が亜集団を形成して分布する。該有核細胞の亜集団における細胞数は、例えば、記憶部１２に格納された解析ソフトによって、2Dスキャッタグラム上の亜集団中の細胞を計数することにより取得できる。なお、図４は2Dスキャッタグラムの一例であり、本発明はこれに限定されない。処理部１１は、第３の蛍光色素で標識された有核細胞の第１及び第２画像を抽出し、それらの蛍光画像から第１及び第２の輝点を抽出する。
処理部１１による第１及び第２の輝点の抽出は、例えば次のようにして行われる。処理部１１は、第１画像を構成する各画素の画素値に基づいて、輝点とバックグランドとの境界となる画素値の閾値を設定する。画像の二値化処理のための閾値を設定する方法自体は公知であり、例えばモード法、P-タイル法などが挙げられる。処理部１１は、第１画像を構成する各画素の画素値が当該閾値より高いか否かに基づいて、第１画像を二値化処理する。そして、処理部１１は、当該閾値よりも高い画素値を有する画素が分布する範囲を第１の輝点として抽出する。処理部１１は、第２画像についても同様に二値化処理して、第２の輝点として抽出する。
さらなる実施形態では、処理部１１は、二値化処理の前に、蛍光画像のノイズ除去処理を行う。画像のノイズ除去処理は、例えばトップハットフィルタなどのノイズ除去手段を用いて実行する。
有核細胞が核染色用色素で標識されている場合、処理部１１は、第３画像についても同様に二値化処理して、閾値よりも高い画素値を有する画素が分布する範囲を核領域として抽出する。第１及び第２画像から抽出した第１及び第２の輝点が、核領域の外に存在した場合、その有核細胞は解析の対象から除外される。
処理部１１は、二値化処理により抽出された第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。１個の有核細胞内に第１の輝点及び／又は第２の輝点が複数存在する場合、処理部１１は、それらの輝点の中から、最も近接する第１の輝点及び第２の輝点を抽出し、抽出した第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。最も近接する第１の輝点及び第２の輝点は、例えば、各輝点の重心座標に基づいて抽出される。あるいは、全ての組み合わせの第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を測定して、当該距離が最も短い第１の輝点及び第２の輝点の組み合わせを、最も近接する第１の輝点及び第２の輝点として抽出する。
一例として、図５を参照して、第１の輝点と第２の輝点との重心間距離Ｄの取得について説明する。図５の(Ａ)は、撮像部１５４によって得られた第１画像及び第２画像を示す。処理部１１は、各画像を上記のようにして二値化処理して、図５の(Ｂ)に示されるように、第１の輝点及び第２の輝点を抽出する。処理部１１は、抽出された第１の輝点及び第２の輝点の重心座標を算出して、図５の(Ｃ)に示されるように、第１の輝点の重心及び第２の輝点の重心を決定する。画像における所定領域の重心の座標を算出する方法自体は公知であり、所定の公式などにより算出できる。処理部１１は、最も近接する第１の輝点と第２の輝点との重心間距離を取得する。図５の(Ｄ)は、第１画像及び第２画像の重ね合わせ画像を示し、この例では、処理部１１は、矢印で示される第１の輝点及び第２の輝点を、最も近接する第１の輝点及び第２の輝点として抽出して、その重心間距離Ｄを取得する。具体的には、処理部１１は第１の輝点と第２の輝点との組み合わせのすべてについて重心間距離を取得する。例えば、第１画像に第１の輝点(1)、(2)及び(3)、第２画像に第２の輝点(i)、(ii)及び(iii)がある場合、第１の輝点(1)と第２の輝点(i)との重心間距離、第１の輝点(1)と第２の輝点(ii)との重心間距離、第１の輝点(1)と第２の輝点(iii)との重心間距離、第１の輝点(2)と第２の輝点(i)との重心間距離、第１の輝点(2)と第２の輝点(ii)との重心間距離、第１の輝点(2)と第２の輝点(iii)との重心間距離、第１の輝点(3)と第２の輝点(i)との重心間距離、第１の輝点(3)と第２の輝点(ii)との重心間距離、及び第１の輝点(3)と第２の輝点(iii)との重心間距離を取得する。次に、処理部１１は、これらの重心間距離を比較し、最も短い重心間距離を重心間距離Ｄとする。ここで、重心間距離は、図６に示されるように、第１の輝点の重心座標Ｃ１と第２の輝点の重心座標Ｃ２との距離であり得る。そして、処理部１１は、重心間距離Ｄと、第１の閾値とを比較する。なお、図５の(Ｄ)では、説明の便宜上、重ね合わせ画像において重心間距離の取得を行っているように図示したが、処理部１１による処理には、第１及び第２画像における各輝点の重心座標のデータがあれば、重ね合わせ画像の作成は必須ではない。
本実施形態の取得装置１０より実行される処理手順について、図面を参照して説明する。図７Ａを参照して、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得して出力する場合の処理手順を説明する。ステップＳ１０１において、処理部１１は、取得装置１０の流体回路を制御してフローセル１１０に測定試料２０ａを流す。処理部１１は、光源１２１～１２４を発光させる。これによってフローセル１１０を流れる測定試料２０ａ中の個々の細胞に光が照射される。処理部１１は、撮像部１５４に細胞の蛍光画像及び明視野画像を撮像させる。これにより、細胞ごとに蛍光画像及び明視野画像が取得される。蛍光画像として、第１の蛍光色素に対応する第１画像、及び第２の蛍光色素に対応する第２画像が取得される。処理部１１は、細胞ごとの蛍光画像及び明視野画像を記憶部１２に記憶する。記憶部１２に記憶される蛍光画像及び明視野画像に、有核細胞の蛍光画像及び明視野画像が含まれる。
ステップＳ１０２において、処理部１１は、上記のとおり、第１画像及び第２画像を二値化処理して画像解析し、蛍光画像における有核細胞内の第１の輝点及び第２の輝点を抽出する。そして、処理部１１は、第１の輝点及び第２の輝点の重心座標を決定し、重心間の距離を細胞内距離として取得する。有核細胞内に第１の輝点及び／又は第２の輝点が複数存在する場合は、処理部１１は、それぞれの輝点の重心座標を決定し、重心間距離を算出し、各重心間距離のうち最も近接する重心間距離を細胞内距離として取得する。処理部１１は、細胞ごとの細胞内距離を記憶部１２に記憶する。ステップＳ１０３において、処理部１１は、個々の有核細胞について、細胞内距離と第１の閾値と比較する。そして、処理部１１は、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数をカウントし、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得し、記憶部１２に記憶する。細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値については、上で述べたとおりである。
ステップＳ１０４において、処理部１１は、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を出力する。例えば、処理部１１は、当該値を表示部１３に表示したり、プリンタで印刷したり、モバイルデバイスに送信したりする。当該値を出力する際に、参照情報として、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数自体も出力する。また、参考情報として、上記の第２の閾値を出力する。このように、本実施形態の取得装置は、SMAに関する情報として、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を医師などに提供できる。上記のとおり、当該値は、SMAの罹患の指標又はSMAに対する治療の奏効性の指標となる。
図７Ｂを参照して、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値に基づいて、被検者がSMAに罹患しているか否かを判定する場合のフローについて説明する。ステップＳ２０１において、処理部１１は、ステップＳ１０１と同様の方法により、測定試料２０ａ中の有核細胞の蛍光画像を取得装置１０で撮像し、第１画像及び第２画像を取得する。処理部１１は、細胞ごとの蛍光画像及び明視野画像を記憶部１２に記憶する。ステップＳ２０２において、処理部１１は、ステップＳ１０２と同様の方法により、蛍光画像のおける有核細胞内の第１の輝点及び第２の輝点を抽出し、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。処理部１１は、細胞ごとの細胞内距離を記憶部１２に記憶する。ステップＳ２０３において、処理部１１は、ステップＳ１０３と同様の方法により、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得し、記憶部１２に記憶する。
ステップＳ２０４において、処理部１１は、取得した値と第２の閾値とを比較する。ステップＳ２０４において、取得した値が第２の閾値未満であるとき、処理はステップＳ２０５に進行する。ステップＳ２０５において、処理部１１は、被検者がSMAに罹患しているとの判定結果を記憶部に記憶する。ステップＳ２０４において、取得した値が第２の閾値以上であるとき、処理はステップＳ２０６に進行する。ステップＳ２０６において、処理部１１は、被検者がSMAに罹患していないとの判定結果を記憶部に記憶する。ステップＳ２０７において、処理部１１は、判定結果を出力する。例えば、処理部１１は、判定結果を表示部１３に表示したり、プリンタで印刷したり、モバイルデバイスに送信したりする。このように、本実施形態の取得装置は、被検者がSMAに罹患しているか否かの判定結果を医師などに提供できる。
図７Ｃを参照して、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値に基づいて、SMA患者のSMAに対する治療が奏効しているか否かを判定する場合のフローについて説明する。ステップＳ３０１において、処理部１１は、ステップＳ１０１と同様の方法により、測定試料２０ａ中の有核細胞の蛍光画像を取得装置１０で撮像し、第１画像及び第２画像を取得する。処理部１１は、細胞ごとの蛍光画像及び明視野画像を記憶部１２に記憶する。ステップＳ３０２において、処理部１１は、ステップＳ１０２と同様の方法により、蛍光画像のおける有核細胞内の第１の輝点及び第２の輝点を抽出し、第１の輝点と第２の輝点との細胞内距離を取得する。処理部１１は、細胞ごとの細胞内距離を記憶部１２に記憶する。ステップＳ３０３において、処理部１１は、ステップＳ１０３と同様の方法により、細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得し、記憶部１２に記憶する。
ステップＳ３０４において、処理部１１は、取得した値と第２の閾値とを比較する。ステップＳ３０４において、取得した値が第２の閾値未満であるとき、処理はステップＳ３０５に進行する。ステップＳ３０５において、処理部１１は、患者のSMAに対する治療は奏効していないとの判定結果を記憶部に記憶する。ステップＳ３０４において、取得した値が第２の閾値以上であるとき、処理はステップＳ３０６に進行する。ステップＳ３０６において、処理部１１は、患者のSMAに対する治療は奏効しているとの判定結果を記憶部に記憶する。ステップＳ３０７において、処理部１１は、判定結果を出力する。例えば、処理部１１は、判定結果を表示部１３に表示したり、プリンタで印刷したり、モバイルデバイスに送信したりする。このように、本実施形態の取得装置は、SMA患者のSMAに対する治療が奏効しているか否かの判定結果を医師などに提供できる。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１： 健常者とSMA患者との判別
(１) 測定試料の調製
(1.1) 単球の標識、溶血処理及び有核細胞の固定
健常者２名及びSMA患者10名のそれぞれから、ヘパリン入り採血管で採取した末梢血を検体として用いた。1.5 mLの末梢血を15 mLコニカルチューブに移し、ヒトFc受容体ブロッキング試薬のClear Back(MTG-001、MBL社)を30μL添加して、暗所にて15分間インキュベーションした。ここに、PerCP/Cy5.5(商標)標識抗ヒトCD33モノクローナル抗体(WM53、BioLegend社)の溶液を10μL添加して、暗所にて30分間インキュベーションした。CD33は、単球の表面抗原マーカーである。さらに、あらかじめ37℃に加温したBD Phosflow(商標)Lyse/Fix Buffer(BD Biosciences社)を10 mL添加し、37℃で10分間インキュベーションした。これにより、末梢血中の赤血球を溶血させ、有核細胞を固定した。チューブを300×gで５分間遠心して上清を除き、細胞を15 mLのPBS(-)で洗浄した。
(1.2) 有核細胞中のSMNタンパク質及びコイリンの免疫染色
上記(1.1)で固定された細胞に0.2% Triton(商標)X-100/1% BSA/PBS(－)を1 mL添加して懸濁し、暗所にて室温で５分間インキュベーションした。ここに、1% BSA/Perm I(BD Biosciences社)を3 mL添加し、暗所にて室温で60分間インキュベーションした。チューブを200×gで10分間遠心して上清を除き、細胞を1.5 mLの1% BSA/Perm Iで２回洗浄した。細胞に0.05% Tween(商標)20/1% BSA/Perm I(以下、「染色・洗浄バッファー」とも呼ぶ)を100μL添加して懸濁し、細胞の懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移した。細胞の懸濁液を5μL取り、195μLのPBS(-)で希釈して細胞を計数した。２本のマイクロチューブのそれぞれに、細胞の懸濁液(1×106 cells/50μL)を入れた。一方のマイクロチューブに1μgのAlexa Fluor(登録商標)488標識抗SMNモノクローナル抗体(2B1、Novus Biologicals社)及び0.2μgのウサギ抗ヒトコイリン抗体(10967-1-AP、Proteintech社)を添加し、もう一方のマイクロチューブに1μgのAlexa Fluor(登録商標)488標識マウスアイソタイプコントロール(MOPC21、IgG1、BioLBioLegend社)及び0.2μgのウサギアイソタイプコントロール(10967-1-AP、ウサギIgG、Proteintech社)を添加して、暗所にて４℃で45分間インキュベーションした。ここに、600μLの染色・洗浄バッファーを添加して、500×gで５分間遠心して上清を除いた。同様の操作をさらに２回行って、細胞を洗浄した。各マイクロチューブにAlexa Fluor(登録商標)405標識抗ウサギIgG抗体を添加して、暗所にて４℃で15分間インキュベーションした。上記と同様にして、細胞を染色・洗浄バッファーで２回洗浄した。さらに細胞を500μLのPBS(-)で洗浄した後、50μLのPBS(-)で懸濁した。これにより、SMNタンパク質及びコイリンが免疫染色された有核細胞を含む測定試料を得た。
(２) 細胞の測定及び画像解析
(2.1) 単球の分画の抽出
上記(1.2)で得た細胞を、イメージングフローサイトメータMI-1000(シスメックス株式会社)を用いて測定及び撮像して、個々の有核細胞の光学シグナル、蛍光画像及び透過光画像を取得した。取得した蛍光画像及び透過光画像のそれぞれには、１個の有核細胞が撮像された。まず、個々の細胞の光学シグナルに基づいて、Ｘ軸にPerCP/Cy5.5(商標)の蛍光強度(CD33標識)をとり、Ｙ軸に側方散乱光強度をとった2Dスキャッタグラムを作成した。作成した2Dスキャッタグラムの一例を、図８に示す。作成した2Dスキャッタグラムにおいて、蛍光強度及び側方散乱光強度のそれぞれが所定の範囲内にある細胞を選択し、それらを単球の分画として抽出した。図８では、楕円で囲んだ領域内にある各細胞が単球を示す。
(2.2) 単球の画像解析
上記(2.1)で抽出した単球の分画における、個々の単球の蛍光画像及び透過光画像を確認した。画像の一例を、図９に示す。図中、「BF」は明視野像(透過光画像)であり、「Merge」はコイリンの蛍光画像とSMNタンパク質の蛍光画像との重ね合わせである。図９より、コイリン及びSMNタンパク質はいずれも、１つの輝点として撮像されることが分かった。図９では、１個の単球に存在するSMNタンパク質の輝点は１つであるが、２つ以上の輝点を有する細胞もあった。また、図９のMergeを参照して、(a)の細胞のように、SMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点との細胞内距離が離れている細胞と、(b)の細胞のように、コイリンの輝点とSMNタンパク質の輝点との細胞内距離が近接している細胞とが存在していた。
表１に示される４つの指標に基づいて、測定試料中の単球について健常者とSMA患者とを比較した。各指標の比率は、抽出した分画中の単球の数に対する、表１に記載の所定の単球の数の比率である。SMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点とが近接している箇所は、次のように判定した。蛍光画像において、１個の単球内のSMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点との重心間距離を算出し、当該距離が0.8μm以下であるとき、両輝点は近接していると判定した。
Figure 2022140046000002
(３) 結果
上記の各指標に基づく比較結果を図１０Ａ～Ｄに示す。図１０Ａ～Ｃから分かるように、単球中のSMNタンパク質の輝点の数については、健常者とSMA患者との間で有意差は認められなかった。一方、図１０Ｄに示されるように、SMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点とが近接している箇所が１以上ある単球の比率については、健常者とSMA患者との間で差異が認められた。当該比率について、SMA患者の平均値及び標準偏差(SD)を算出した。平均値に3SDを加えた値(12.1%)をカットオフ値として用いて、被検者がSMA患者であるか否かを判定した場合、p値が0.01未満で健常者とSMA患者とを判別できた。これらの結果より、単球の核内に局在するSMNタンパク質とコイリンとの細胞内距離を指標として用いることにより、被検者がSMAに罹患していることに関する情報を取得できることが示唆された。
実施例２： SMAに対する治療の奏効性の判定
(１) 測定試料の調製
１名のSMA患者にスピンラザ(商標)(一般名：ヌシネルセン、Biogen社)を４回投与した。投与スケジュールは、添付文書に従って、計４回投与した。この患者から、投与前、１回目投与の前日、及び４回目投与の前日に末梢血をヘパリン入り採血管で採取した。採取した末梢血から、実施例１と同様にして測定試料を調製した。また、投与前、２回目投与の直前、３回目投与の直前及び４回目投与の直前に採取した末梢血から血清を取得した。
(２) 細胞の測定及び画像解析
実施例１と同様にして、各測定試料をMI-1000(シスメックス株式会社)で測定及び撮像し、画像解析を行った。各測定試料について、抽出した分画中の単球の数に対する、SMNタンパク質の輝点とコイリンの輝点とが近接している箇所が１以上ある単球の比率を算出した。
(３) 血清クレアチニンキナーゼ活性の測定
上記の血清におけるクレアチンキナーゼ(CK)活性を測定した。測定は、Labospect008又はLabospect008α(株式会社日立ハイテク)と、シグナスオートCK(株式会社シノテスト)とを用い、添付文書に従い行った。CK活性は、SMAの進行の程度を示すバイオマーカーであり、SMAが進行するにつれてCK活性が減少することが知られている。
画像解析の結果を図１１に示す。図中、カットオフ値として、実施例１で算出した値(12.1%)を示した。また、図１２において、図１１のグラフに、血清CK活性測定の結果も示した。図１１から分かるように、スピンラザ(商標)の１回目の投与で、カットオフ値を超えた値を示した。４回目の投与後では、さらに値が上昇した。よって、当該患者にスピンラザ(商標)による治療が奏効している可能性が高いことが示された。また、図１２より、スピンラザ(商標)の２回目投与以降、血清CK活性が上昇した。CK活性は、筋肉を動かした際に上昇することから、スピンラザ(商標)投与により、患者が筋肉をより動せるようになり、運動機能が改善している可能性が高いことがわかる。これらの結果より、単球の核内に局在するSMNタンパク質とコイリンとの細胞内距離を指標として用いることにより、SMAに対する治療の奏効性に関する情報を取得できることが示唆された。
１０ SMAに関する情報の取得装置
１１ 処理部
１２ 記憶部
１３ 表示部
１４ 入力部
２０ 試料調製部
２０ａ 測定試料
１００ 撮像ユニット
１０１、２０１ 試薬キット
１０２、２０２ 第１容器
１０３、２０３ 第２容器
１０４ 第３容器
１０５ 第４容器
１０６、２０４ 梱包箱
１０７、２０５ 添付文書
１１０ フローセル
１１１ 流路
１２１～１２４ 光源
１３１～１３４、１５１、１５３ 集光レンズ
１４１、１４２ ダイクロイックミラー
１５２ 光学ユニット
１５４ 撮像部

Claims (31)

  1. 測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得する工程、ここで、前記測定試料が、被検者から得た血液検体から調製された試料であり、前記有核細胞内のSMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識されており、前記有核細胞内の所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識されており、
    前記蛍光画像において、前記第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、前記第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得する工程、及び
    前記細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する工程
    を含み、前記値が、脊髄性筋萎縮症の罹患の指標となる、
    脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法。
  2. 前記値が第２の閾値未満である場合、前記被検者が脊髄性筋萎縮症に罹患していることが示唆される請求項１に記載の方法。
  3. 前記値が第２の閾値以上である場合、前記被検者が脊髄性筋萎縮症に罹患していないことが示唆される請求項１に記載の方法。
  4. 測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得する工程、ここで、前記測定試料が、脊髄性筋萎縮症に対する治療を受けた患者から得た血液検体から調製された試料であり、前記有核細胞内のSMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識されており、前記有核細胞内の所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識されており、
    前記蛍光画像において、前記第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、前記第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得する工程、及び
    前記細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する工程
    を含み、前記値が、脊髄性筋萎縮症に対する治療の奏効性の指標となる、
    脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法。
  5. 前記値が第２の閾値未満である場合、前記患者の脊髄性筋萎縮症に対する治療が奏効していないことが示唆される請求項４に記載の方法。
  6. 前記値が第２の閾値以上である場合、前記患者の脊髄性筋萎縮症に対する治療が奏効していることが示唆される請求項４に記載の方法。
  7. ２つの測定試料中の有核細胞の蛍光画像を取得する工程、ここで、前記２つの測定試料が、脊髄性筋萎縮症に対する治療を受ける前の患者から得た血液検体と、前記治療を受けた後の前記患者から得た血液検体とのそれぞれから調製された試料であり、前記有核細胞内のSMNタンパク質が第１の蛍光色素で標識されており、前記有核細胞内の所定の核内タンパク質が第２の蛍光色素で標識されており、
    前記蛍光画像において、前記第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、前記第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得する工程、及び
    前記細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得する工程
    を含み、前記値が、脊髄性筋萎縮症に対する治療の奏効性の指標となる、
    脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得方法。
  8. 前記治療を受けた後の血液検体由来の測定試料から取得した前記値が、前記治療を受ける前の血液検体由来の測定試料から取得した前記値未満である場合、前記患者の脊髄性筋萎縮症に対する治療が奏効していないことが示唆される請求項７に記載の方法。
  9. 前記治療を受けた後の血液検体由来の測定試料から取得した前記値が、前記治療を受ける前の血液検体由来の測定試料から取得した前記値以上であるか、又は第２の閾値以上である場合、前記患者の脊髄性筋萎縮症に対する治療が奏効していることが示唆される請求項７に記載の方法。
  10. 前記脊髄性筋萎縮症に対する治療が、ヌシネルセン、オナセムノゲン アベパルボベク及びリスジプラムからなる群より選択される少なくとも１つの薬剤の投与を含む請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記核内タンパク質が、核小体に局在するタンパク質である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記核内タンパク質が、コイリンである請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 一の蛍光画像において、複数の有核細胞が撮像されている請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記蛍光画像を取得する工程において複数の蛍光画像が取得され、各蛍光画像において、互いに異なる１個の有核細胞が撮像されている請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記細胞内距離が、前記蛍光画像における前記第１の輝点の重心と前記第２の輝点の重心との重心間距離である請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記細胞内距離を取得する工程において、１個の有核細胞内に前記第１の輝点及び／又は前記第２の輝点が複数存在する場合、最も近接する第１の輝点と第２の輝点との距離を、前記細胞内距離として取得する請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記細胞内距離を取得する工程において、１個の有核細胞内に前記第１の輝点及び／又は前記第２の輝点が複数存在する場合、第１の輝点と第２の輝点のすべての組み合わせについて第１の輝点と第２の輝点との距離を取得し、前記距離を比較し、前記距離のうち最も短い距離を前記細胞内距離として取得する請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記有核細胞が、単球である請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記蛍光画像において、少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む単球の数を取得する工程をさらに含み、
    前記値が、取得した前記単球の数に対する、前記細胞内距離が第１の閾値以下である単球の数の比率又は比の値である請求項１８に記載の方法。
  20. 前記蛍光画像が、蛍光顕微鏡又はフローサイトメータにより取得される請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記蛍光画像を取得する工程の前に、前記有核細胞を前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素で染色する工程を含む請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記第１の閾値が、0.5μm以上1.2μm以下の範囲から設定される請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. SMNタンパク質と特異的に結合できる物質と、有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質と、第１の蛍光色素と、第２の蛍光色素とを含む、脊髄性筋萎縮症に関する情報を取得するための試薬キット。
  24. 前記SMNタンパク質と特異的に結合できる物質が、前記第１の蛍光色素で標識されている請求項２３に記載の試薬キット。
  25. 前記有核細胞内の所定の核内タンパク質と特異的に結合できる物質が、前記第２の蛍光色素で標識されている請求項２３又は２４に記載の試薬キット。
  26. 前記核内タンパク質が、核小体に局在するタンパク質である請求項２３～２５のいずれか１項に記載の試薬キット。
  27. 前記核内タンパク質が、コイリンである請求項２３～２６のいずれか１項に記載の試薬キット。
  28. 第１の蛍光色素で標識されたSMNタンパク質と、第２の蛍光色素で標識された所定の核内タンパク質とを含む有核細胞に光を照射する光源と、
    前記有核細胞の蛍光画像を取得する撮像部と、
    前記蛍光画像を画像解析する処理部と、
    を備え、
    前記処理部は、前記蛍光画像において、前記第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、前記第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得し、前記細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得するように構成され、
    前記値が、脊髄性筋萎縮症の罹患の指標となる、
    脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得装置。
  29. 第１の蛍光色素で標識されたSMNタンパク質と、第２の蛍光色素で標識された所定の核内タンパク質とを含む有核細胞に光を照射する光源と、
    前記有核細胞の蛍光画像を取得する撮像部と、
    前記蛍光画像を画像解析する処理部と、
    を備え、
    前記処理部は、前記蛍光画像において、前記第１の蛍光色素に対応する第１の輝点と、前記第２の蛍光色素に対応する第２の輝点との細胞内距離を取得し、前記細胞内距離が第１の閾値以下である有核細胞の数に関する値を取得するように構成され、
    前記値が、脊髄性筋萎縮症に対する治療の奏効性の指標となる、
    脊髄性筋萎縮症に関する情報の取得装置。
  30. 前記有核細胞が、単球であり、
    前記処理部は、
    前記蛍光画像において、少なくとも１つの第１の輝点及び少なくとも１つの第２の輝点を含む単球の数を取得し、
    前記値として、取得した前記単球の数に対する、前記細胞内距離が第１の閾値以下である単球の数の割合を取得するように構成されている請求項２８又は２９に記載の装置。
  31. 表示部をさらに備え、
    前記処理部は、前記値を表示部に表示するように構成されている請求項２８～３０のいずれか１項に記載の装置。
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