JP2022095954A - 遺伝子伝達用細胞シート - Google Patents
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Abstract
Description
二つ以上の細胞層を含み、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムが導入されている、
細胞シートを提供する。
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に、
二つ以上の細胞層を含む細胞シートを形成し、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムを導入し、
温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離することを
含む、細胞シートの製造方法を提供する。
前記細胞シートを含む遺伝子治療剤を提供する。
癌除去手術部位または癌治療が必要な部位に前記細胞シートを移植することを含む癌再発防止方法または癌治療方法を提供する。
図2は、oAd-DCN/CFCSのウイルス生産および治療遺伝子発現プロファイルを示すものである[(a)CFCSに感染したoAd-DCNのウイルス生成。CFCSsは、0.5のMOIでnaked oAd-DCNに感染した。感染後、4、12、24、48、72および96時間にCFCSおよび上澄み液を回収した後、リアルタイム定量PCRによりウイルスゲノムコピーを測定した。(b)oAd-DCN/CFCSsでのDCN発現。平均±SDで示す1MOIデータでoAd-DCNで感染後、48時間に回収した細胞溶解液および上澄み液を使用するDCNの代表的なウェスタンブロット。*P<0.05、**P<0.01]。
図3は、肝内移植後、生体内oAd-DCN/CFCSsのウイルス持続性に対する分解プロファイルおよび評価を示すものである[(a)細胞シートの分解プロファイル。CFCSsは、線維芽細胞とホタルルシフェラーゼ発現癌細胞(CFCSs/Fluc)で作った。引き続いて、CFCS/FlucにoAd-DCNを感染させた後、同所HCC腫瘍があるヌードマウスの左側肝葉に移植した。(b)oAd-DCN/CFCSの移植後、ウイルス持続性の評価。CFCSをホタルルシフェラーゼ発現oAd-DCN(oAd-DCN/Fluc/CFCSs)に感染させた後、腫瘍保有マウスの左側肝葉の表面に移植した。生物発光(Bioluminescence)イメージングは、移植後に毎日モニタリングされた]。
図4は、多病巣性肝細胞癌腫(HCC)の組織学結果を示すものである[PBSで処理した群において腫瘍細胞の注射後21日目に多病巣性肝癌組織の断面を得、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。本来倍率:×40、白色点線:腫瘍]。
図5は、oAd-DCN/CFCSの強力な抗腫瘍効能を示したものであり、
図5aは、Hep3B同所腫瘍モデルでoAd-DCN/CFCSの抗腫瘍効能を示すものである[同所肝腫瘍は、マウスの左側肝葉に1×106個のホタルルシフェラーゼを発現するHep3B細胞を注入することによって確立された。細胞注射の直後に細胞注入部位をPBSまたはスプレーにより3×108VP oAd-DCN(スプレー)処理されたりPBS処理されたCFCSまたはoAd-DCN/CFCS(n=6)に移植して処理した。また、6匹のマウスにHep3B細胞注射後、尻尾静脈を通じて3×108VPを全身的に注射した。腫瘍成長は、処理後、2、5、7、14および21日にモニタリングした]。
図5bは、バックグラウンド除去法(background subtraction)後の各治療群からHCCからの生物発光信号を示すものである[データは平均±標準偏差で示した。*P<0.05]。
図6は、PBS、oAd-DCN血管内注射、oAd-DCN腹腔内注射、CFCS単独またはoAd-DCN/CFCSで処理したマウスの腫瘍組織の組織学的分析結果である[処理された多病巣性肝細胞癌の断面は、PBS、oAd-DCN血管内注射、oAd-DCN腹腔内注射、CFCS単独またはoAd-DCN/CFCSで治療後14日目に得られた。本来倍率:×50、黒色点線:腫瘍]。
図7は、oAd-DCN/CFCSを形成する過程を図式化したものである。
図8は、腫瘍選択的殺傷アデノウイルスを搭載した細胞シートから複製されたアデノウイルスの生物学的活性を確認したものである。
図9は、腫瘍除去手術後、腫瘍選択的殺傷アデノウイルスが搭載された細胞シートを付着後、腫瘍の再発の有無を確認したものである。
図10は、ワクシニアウイルスが搭載された細胞シートの形成を確認したものである。
図11は、ワクシニアウイルスが搭載された細胞シートのワクシニアウイルス複製能を確認したものである。
図12は、ワクシニアウイルスが搭載された細胞シートのワクシニアウイルス細胞死滅を確認したものである。
図13は、放射線を照射した癌細胞の細胞生存能を確認したものである。
図14は、放射線照射された癌細胞を含む細胞シートにおけるアデノウイルス複製能を確認したものである。
二つ以上の細胞層を含み、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムが導入されている、
細胞シートを提供する。
アデノウイルスは、中間程度のゲノムサイズ、操作の便宜性、高いタイター、広範囲なターゲット細胞および優れた感染性に起因して遺伝子伝達ベクターとして多く用いられている。ゲノムの両末端は、100~200bpのITR(inverted terminal repeat)を含み、これは、DNA複製およびパッケージングに必須のシスエレメントである。ゲノムのE1領域(E1AおよびE1B)は、転写および宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。E2領域(E2AおよびE2B)は、ウイルスDNA複製に関与するタンパク質をコードする。
レトロウイルスは、自分の遺伝子を宿主のゲノムに挿入させ、大量の外来遺伝物質を運搬することができ、感染させることができる細胞のスペクトルが広いので、遺伝子伝達ベクターとして多く用いられている。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、非分裂細胞を感染させることができ、多様な種類の細胞に感染できる能力を有しているので、本発明の遺伝子伝達システムに適している。AAVベクターの製造および用途に関する詳細な説明は、米国特許第5,139,941号および第4,797,368号に詳細に開示されている。
他のウイルスベクターも、本発明の遺伝子伝達システムに用いることができる。ワクシニアウイルス(Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy 10:649-657(1999);Ridgeway,“ Mammalian expression vectors,” In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses.Rodriguez and Denhardt,eds.Stoneham:Butterworth、467-492(1988);Baichwal and Sugden,“ Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses:Transient and stable expression of transferred genes,” In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:Plenum Press,117-148(1986)およびCoupar et al.,Gene,68:1-10(1988))、レンチウイルス(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))または単純ヘルペスウイルス(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))に由来したベクターも、目的ヌクレオチド配列を細胞内に運搬できる運搬システムに用いることができる。
リポソームは、水相に分散したリン脂質により自動的に形成される。外来DNA分子をリポソームで成功裏に細胞内に運搬した例は、NicolauおよびSene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)およびNicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987)に開示されている。一方、リポソームを用いた動物細胞の形質転換に最も多く用いられる試薬としては、リポフェクタミン(Lipofectamine,Gibco BRL)がある。運搬しようとする目的ヌクレオチド配列を内包したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着またはプラズマ細胞膜との融合などの機序を通じて細胞と相互作用して細胞内に目的ヌクレオチド配列を運搬する。
遺伝子伝達システムが導入される細胞層は、癌細胞または幹細胞を含むことができる。
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に、
二つ以上の細胞層を含む細胞シートを形成し、
そのうちの一つ以上の細胞層に遺伝子伝達システムを導入し、
温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離することを
含む細胞シートの製造方法を提供する。
温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に体細胞を培養して、体細胞を含む第1細胞層を形成させる段階;
前記第1細胞層に癌細胞を培養して、癌細胞を含む第2細胞層を形成させて細胞シートを製造する段階;
前記第2細胞層に腫瘍殺傷ウイルスを接種させる段階;および
温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離する段階。
まず、温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿にシリコンリングを載置し、シリコンリングの内側に支持体の役割をする体細胞を分注して、恒温装置で培養して、体細胞を含む第1細胞層を形成させる。
温度反応性培養皿で形成したウイルスを感染させた細胞シートに培養液を除去し、PBSで洗浄する。メンブレインを細胞シート上に載置したまま、温度を下げて、細胞シートを引き剥がすと、メンブレインに細胞シートが付着したまま、細胞シートを得ることができる。細胞シートが付着したメンブレインを標的(病変)部位に載置し、用心深くメンブレインを引き剥がすと、細胞シートは、標的部位に付着し、メンブレインを除去することによって、細胞シートを標的部位に移植可能である。
実験方法
細胞株および細胞培養
すべての細胞株は、10%ウシ胎児血清(FBS,Gibco BRL)とペニシリン-ストレプトマイシン(100IU/mL,Gibco BRL)が添加されたDulbecco’s modified Eagle’s培地(DMEM,Gibco BRL,Grand Island,NY USA)で培養した。
pCA14/DCNをBgl II制限酵素で切ってDCN発現カセットを得、これとBamHI制限酵素で切断したpdE1sp1B(p)-HRE-mTERT-Rd19をライゲーションして、pdE1sp1B(p)-HRE-mTERT-Rd19/DCN E1 shuttle vectorを製作した。
線維芽細胞第1細胞層と癌細胞第2細胞層から構成された細胞シート(CFCS)は、温度反応性培養皿(TRCD;UpCell;NUNC,Tokyo,Japan)を使用して製作した。
oAd-DCN CFCSは、oAd-DCNの5MOIを使用して前記記述されたように生成され、対照群CFCSは、細胞シートをリン酸緩衝食塩水(PBS)で処理することによって生成された。
細胞シートで腫瘍殺傷Adのウイルス生産を評価するために、CFCSを12-ウェルプレートに入れて、oAd-DCNで0.5MOIで感染させた。感染4時間後、ウェルをPBSで洗浄し、5%FBSを含有する新鮮なDMEMに交換した。
oAd-DCN/CFCSsで腫瘍殺傷Ad-媒介DCN発現の水準を評価するために、シートをMOIが1であるoAd-DCNで感染させ、48時間の間培養した。引き続いて、シートをプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma,MO,USA)が入っている氷冷RIPAバッファー(Elipis Biotech,Taejeon,Korea)で均質化し、生成された均質液を13,200rpmで10分間遠心分離した。
試験管内でCFCSのウイルス複製媒介分解を評価するために、CFCSを48-ウェルプレートに載置した後、MOIが5であるoAd-DCNで感染させた。
生体内でCFCSsの分解およびウイルス持続性を評価するために、二つの異なる類型の細胞シートを製作した。
oAd-DCNの抗腫瘍効果を評価するために、CFCSs、oAd-DCN/CFCSsを同所(orthotopic)HCC異種移植モデルで6~7週齢の胸腺ヌードマウス(OrientBioInc.,Seongnam,Korea)で肝葉の最も大きい葉に1×106fluc-発現Hep3B細胞(Hep3B/fluc)を注入した。
Hep3B-HCC腫瘍組織をHCC細胞注射後21日目に回収し、10%ホルマリンに固定させ、パラフィン包埋処理し、5μm断面で切断した。切片をH&Eで染色し、光学顕微鏡で検査した。腫瘍組織でAd粒子を検出するために、腫瘍切片をウサギ抗-Ad E1Aポリクロナール抗体(Santa Cruz Biotechnology)で免疫染色した。
データは、平均±標準偏差(SD)で表示された。統計的有意性は、two-tailed Student T-testまたはOne-way Anova test(SPSS 13.0ソフトウェア,SPSS,Chicago,IL)により測定された。0.05未満のP値は、統計的に有意なものと見なされた。
U343細胞株に多様な強さの放射線を照射(1、5、10、15、30、50Gy)した後、放射線照射癌細胞の細胞生存能(cell viability)を確認するために、放射線を照射したU343細胞株を96ウェルプレートに播種(seeding)し、9日目までMTTアッセイを行った。
線維芽細胞第1細胞層と癌細胞第2細胞層から構成された細胞シート(CFCS)は、温度反応性培養皿(TRCD;UpCell;NUNC,Tokyo,Japan)を使用して製作した。
図7のように、温度反応性培養皿にNIH3T3を分注して第1層を形成し、3日後にU343細胞株を分注して第2層を形成し、48時間後に腫瘍選択的殺傷アデノウイルスを感染させ、24時間後に温度反応性培養皿の温度を20℃に下げて、細胞シートを引き剥がした。
細胞シートで複製された腫瘍殺傷アデノウイルスの生物学的活性を評価するために、CFCSを12-ウェルプレートに入れて、0.5MOIのoAd-DCNで感染させた。感染4時間後、ウェルを1XPBSで洗浄し、5%FBSを含有する新鮮なDMEMに交換した。感染4、12、24、48および72時間後、上澄み液と細胞シートの全部を収集した。
ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスを複製または伝達するための細胞シートを製作するために、温度反応性培養皿(TRCD)に内側直径が1.8mmであるシリコンリングを載置し、シリコンリングの内側にNIH3T3細胞株を3×105個分注し、48時間後、U343細胞株3×105個を分注して細胞シートを製作した。
oAd-DCN/CFCSの生成および特性糾明
Ad複製を許容できるCFCSを製作するために、ヒト脳膠芽細胞腫細胞株(U343)およびマウス線維芽細胞細胞株(NIH3T3)から構成された二重層細胞シートを用いた。
シートの癌細胞層が腫瘍殺傷Ad感染に対して許容可能であるかを評価するために、ウイルス複製および治療遺伝子発現プロファイルをそれぞれQ-PCRおよびウェスタン ブロッティングで分析した。
CFCSで細胞シートの分解および搭載された腫瘍殺傷Adの持続性をモニタリングし視覚化するために、HCC異種移植マウスにoAd-DCN-loaded fluc-発現CFCSs(oAd-DCN/CFCSs/Fluc)(図3a)またはfluc-発現oAd-DCN(oAd-DCN-Fluc/CFCSs)に感染したCFCSs(レポータ遺伝子なし)を移植した(図4b)。
同所(orthotopic)腫瘍モデルは、臨床関連性のため、重要な癌研究モデルの一つとして浮上している。HCCの多病巣性は、クリニックで成功的な治療に向かった重要な挑戦であるから、ルシフェラーゼを発現するHep3B細胞に肝で最も大きい葉に多重注射をして、多病巣性肝細胞同所腫瘍モデルを確立した。
さらに治療効果を調査するために、各群(PBS,oAd-DCN血管内注射、oAd-DCN腹腔内注射、CFCS単独またはoAd-DCN/CFCS)で処理した後、2週に腫瘍組織を回収し、組織学的および免疫組織学的分析を通じて分析した。
図8は、腫瘍選択的殺傷アデノウイルスを搭載した細胞シートから複製されたアデノウイルスの生物学的活性を確認したものであって、複製されたウイルスの量が多いlate timeのサンプルであるほど、細胞殺傷能が増加することを確認することによって、細胞シートから複製されたアデノウイルスの生物学的活性があることを立証した。
ウイルスの感染有無と関係なく、細胞シートがよく形成されることを確認した。
細胞シートの癌細胞層でワクシニアウイルスの複製能を評価するために、図11aに示されたように、線維芽細胞第1細胞層と癌細胞第2細胞層から構成された細胞シートを形成し、ワクシニアウイルスを0.1MOIで感染させた後、4時間目に感染しないワクシニアウイルスを全部洗浄して除去した後、24時間、48時間、72時間目に細胞培養液と細胞シートからQ-PCRを通じてワクシニアウイルスを確認した。
ウイルス感染による細胞シートの細胞死滅を確認するために、図11aに示されたように、線維芽細胞第1細胞層と癌細胞第2細胞層から構成された細胞シートを形成し、ワクシニアウイルスを2または5MOIで感染させた後、死滅した細胞を赤色で染色できる7-AAD dyeを添加して、時間による細胞死滅を確認した。
多様な強さの放射線を照射(1、5、10、15、30、50Gy)したU343細胞の細胞生存能をMTTアッセイを通じて確認した。1Gyの放射線を照射したU343細胞株は、放射線を照射しない細胞(対照群)と類似した程度に細胞が分裂し、5Gyの放射線を照射した場合、細胞の分裂速度が対照群に比べて遅れ、7日目以後には、細胞が死滅し始めた。10~50Gyの放射線を照射したU343の場合、細胞の分裂がほとんど起こらなく、6日目に全部死滅した(図13)。
細胞シートの放射線が照射された癌細胞層でウイルスの複製能を評価するために、図11aに示されたように、線維芽細胞第1細胞層と癌細胞第2細胞層から構成された細胞シートを形成し、アデノウイルスを0.5MOIで感染させた後、4時間目に感染しないアデノウイルスを全部洗浄して除去した後、24時間、48時間、72時間目に細胞培養液と細胞シートからQ-PCRを通じてアデノウイルスを確認した。その結果、放射線が照射された癌細胞でもアデノウイルスの複製が起こることを確認した(図14)。
肝臓で慢性ストレスによって頻繁に発生する多発性肝細胞癌腫は、突然変異が大きく、多くの肝臓を覆って、多くの患者で治癒切除手術を施行し難い。
本発明の一部実施例は、腫瘍殺傷ウイルスと細胞シートを結合して、多病巣性腫瘍治療のための効率的な伝達システムを作り、このようなシステムは、効率的な増幅と持続的な放出を示し、許容細胞シートによるoAdの非特異的排出を防止した。
Claims (15)
- 体細胞を含む細胞層と;
癌細胞または幹細胞を含み、ウイルスが導入されている細胞層と;を含む、
癌の予防もしくは治療のための、または、癌の再発もしくは癌の転移予防用細胞シート。 - 前記体細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、筋上皮細胞(myoepithelial cell)、真皮細胞(dermal cell)、上皮ケラチン細胞(epithelial keratinocyte)、シュワン細胞(schwann cell)、神経膠細胞(glial cell)、骨芽細胞(osteoblast)、心筋細胞(cardiomyocyte)、巨大細胞(megakaratyocyte)、脂肪細胞、幹細胞および癌細胞よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項1に記載の細胞シート。
- 癌の生成部位または癌の除去部位移植のための請求項1に記載の細胞シート。
- 前記ウイルスは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(Adenoassociated viruses:AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、セムリキフォレストウイルスおよび麻疹ウイルス(Measles virus)よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項1に記載の細胞シート。
- 前記ウイルスは、組換えアデノウイルスである、請求項1に記載の細胞シート。
- 前記組換えアデノウイルスは、複製不能アデノウイルスまたは腫瘍殺傷アデノウイルスである、請求項5に記載の細胞シート。
- 支持体として体細胞を含む細胞層と;
癌細胞または幹細胞を含み、ウイルスが導入されている細胞層と;を含む、
請求項1に記載の細胞シート。 - 前記癌細胞は、放射線が照射されたものである、請求項1に記載の細胞シート。
- 前記ウイルスは、0.1~500MOI(Multiplicity of infection)の量で搭載される、請求項1に記載の細胞シート。
- 温度感応性ポリマーを含む温度反応性培養皿に、
支持体として体細胞を含む細胞層を形成し、
前記細胞層上に癌細胞または幹細胞を含む細胞層を形成し、
ウイルスを癌細胞または幹細胞を含む細胞層に導入し、
温度反応性培養皿から前記細胞シートを分離することを含む、
請求項1に記載の癌の予防もしくは治療のための、または、癌の再発もしくは癌の転移予防用細胞シートの製造方法。 - 前記温度感応性ポリマーは、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルカプロラクタム)、ポリカプロラクトン(PCL)およびポリラクテート-co-グリコレート(PLGA)よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項10に記載の方法。
- 請求項1に記載の細胞シートを含む遺伝子治療剤。
- 癌の生成部位または癌の除去部位移植のための、請求項12に記載の遺伝子治療剤。
- 前記癌は、多病巣性肝細胞癌腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、喉頭癌、すい臓癌、肺癌、非小細胞性肺癌、結腸癌、骨癌、すい臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、卵巣癌、子宮癌、直腸癌、胃癌、肛門付近癌、大腸癌、乳癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病(Hodgkin’s disease)、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、中枢神経系(central nervous system,CNS)腫瘍、1次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、脳幹部神経膠腫および脳下垂体腺腫よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項13に記載の遺伝子治療剤。
- 体細胞を含む細胞層は、支持体として形成する、請求項10に記載の方法。
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