CN111867636A - 基因传递用细胞片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于基因传递的细胞片，根据本发明的细胞片不同于以往用于组织再生的细胞片，可使用为局小部基因传递系统。特别是，当作为基因传递系统而使用病毒时，可在细胞片内增殖病毒，病毒仅在治疗部位局小部发挥作用。因此，相比于病毒的全身给药或肿瘤内给药，即使显著降低病毒给药量，也对癌症预防或治疗、防止癌症复发或癌症转移，尤其是对多灶性肿瘤治疗有明显效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因传递用细胞片。
背景技术
虽然癌症治疗剂取得了飞速发展，癌症仍是全世界死亡率最高的疾病之一。以往在临床使用的主要癌症疗法是外科性手术、放射治疗、抗癌治疗或并用这些的疗法，是尽可能从患者身上将癌细胞去除的方法。然而，这些疗法的问题在于，只在患者处于癌症初期且癌细胞未转移的状态下完全去除癌细胞才能得到疗效。
尤其，肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)作为世界上第五个最常发生的癌症，在与癌症相关的死亡原因中位居第三。诸如乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染等的慢性肝病或由此引起的肝硬化占所有肝癌发生的80-90％。HCC的核心特征之一是多灶性肿瘤病变(多发性/多核性/肝内转移性)往往同时发病，且这一多灶性肝细胞促进高复发率、药物内科性特征及发病率。重要的是，长期的队列研究显示了肝硬变和多发性/多灶性肝细胞癌肿之间的强大的相互关系。慢性病毒感染与反复的干细胞坏死有密切的关联，之后发生再生。这些加速的细胞周期可能与在很多肝部位引起肿瘤的肝内遗传性错误的积累有关，这些患者可归类为多灶性肝细胞癌肿。
HCC的目前标准疗法包括选择性内部放射疗法及利用化学疗法剂的全身疗法。但是，缺乏癌特异性的这些治疗方式对肝具有非常大的毒性，这对有肝功能障碍的大多数肝细胞癌患者引起严重的问题，因此很难使用消除肿瘤的足够量的药物。因上述理由，外科切除仍是目前的优先疗法，但因为多发性硬化症和肝硬化等多种原因，无法对大部分患者(低于70％)进行切除[El-Serag,H.B.,et al.,Diagnosis and treatment ofhepatocellularcarcinoma.Gastroenterology,2008.134(6):p.1752-63；Belghiti,J.and R.Kianmanesh,Surgical treatment of hepatocellular carcinoma.HPB(Oxford),2005.7(1):p.42-9；Ziser,A.,et al.,Morbidity and mortality in cirrhotic patients undergoinganesthesia and surgery.Anesthesiology,1999.90(1):p.42-53]。
即使进行治疗性切除，患者的高复发率仍是肝细胞癌治疗的重要课题。
在各种临床试验中证明了其强有力且癌特异性细胞杀灭功效的肿瘤杀灭疗法，有望成为克服与小分子化学疗法相关的靶细胞毒性的候选。
在各种肿瘤杀灭载体中，腺病毒(Ad)没有诱发插入突变的风险，并且具有多种有益特性，例如以高滴度易于生产和高转移基因表达水平，有利于癌症的基因治疗。即使在有望的前临床结果，必须克服一些障碍，例如不当地传递和不充分水准的治疗基因传递或病毒复制，才能在临床试验中获得最佳的抗肿瘤功效。重要的是，由于安全性问题和全身施用的病毒体功效有限，多灶性肿瘤可能无法将病毒体肿瘤内接种作为临床试验中的首选给药途径。当前，作为杀瘤病毒缺乏有效且标准化的方案来杀瘤同时治疗多个肿瘤。虽然全身给药避免了其他标准疗法的这些局限性，但如果杀瘤病毒具有很强的免疫原性并且患者对Ad具有很高的免疫力，这种方法在临床上是不切实际的。
为了克服对多灶性肝细胞癌肿的标准疗法和杀瘤疗法的内在局限性，研究了细胞片，作为能够在多灶性肝细胞癌肿里提高杀瘤Ad功效的有望候选。
传统上，细胞片主要为了替代或恢复受损组织的功能而用于组织工学领域。细胞片的主要优点为生物相容性、持久的植入能力以及降低高于合成抗体的炎症反应风险。但是，目前没有已发表的研究使用这些细胞片进行基因传递。
发明内容
技术问题
本发明的发明人为了解决基因传递系统中全身给药的问题，开发了细胞片作为局部基因传递平台，以此完成了本发明。
技术方案
本发明提供一种细胞片，其包括两个或以上的细胞层，且对其中一个或以上的细胞层导入基因传递系统。
另外，本发明提供一种细胞片制备方法，该方法包括：在包括温敏性聚合物的温度反应性培养皿中形成包括两个或以上细胞层的细胞片；对其中一个或以上的细胞层导入基因传递系统，且从温度反应性培养皿分离所述细胞片。
另外，本发明提供一种包括所述细胞片的基因治疗剂。
另外，本发明提供癌症复发防止方法或者癌症治疗方法，其包括在去除癌症的手术部位或需要癌症治疗的部位移植所述细胞片。
有益效果
根据本发明的细胞片不同于以往用于组织再生用途的细胞片，可使用为局小部基因传递系统。特别是，当作为基因传递系统而使用病毒时，可在细胞片内增殖病毒，病毒仅在治疗部位局小部发挥作用。因此，相比于病毒全身给药或肿瘤内给药，即使显著降低病毒给药量，也对癌症预防或治疗、防止癌症复发或癌症转移，尤其是对多灶性肿瘤治疗有明显效果。
附图说明
图1示出从温度反应性培养皿分离的oAd-DCN/CFCS外观(a)，通过苏木精和曙红染色的oAd-DCN/CFCS组织学分析结果(b)以及PBS处理的对照CFCSs(c)和在oAd-DCN/CFCS s(d)中，由Ad E1A蛋白质的免疫染色的检测[比例尺:1cm(a)及2μm(b-d)]。
图2示出oAd-DCN/CFCS病毒产生和治疗基因表达特性[(a)被CFCS感染的oAd-DCN病毒生成。CFCSs以0.5MOI被裸oAd-DCN感染。感染后在4、12、24、48、72及96小时收获CFCS和上清液后，根据实时定量PCR测量了病毒基因组复制。(b)在oAd-DCN/CFCSs的DCN表达。使用以平均±SD显示的1MOI数据中由oAd-DCN感染后在48小时收获的细胞溶解液及上清液的DCN代表性蛋白质印迹。*P<0.05,**P<0.01]。
图3示出肝内移植后对活体内oAd-DCN/CFCSs的病毒持续性的分解特性及评估[(a)细胞片的分解特性。CFCSs由表达成纤维细胞和萤火虫荧光素酶的癌细胞(CFCS/Fluc)制成。之后在CFCS/Fluc感染oAd-DCN后，移植到具有原位HCC肿瘤的裸鼠的左肝叶上。(b)oAd-DCN/CFCS移植后的病毒持续性评估。将CFCS在萤火虫荧光素酶表达
oAd-DCN(oAd-DCN/Fluc/CFCSs)进行感染后，移植到保有肿瘤的鼠的左肝叶表面上。在移植后每天监控生物发光(Bioluminescence)成像]。
图4示出多灶性肝细胞癌(HCC)的组织学结果[在用PBS处理的组中注射肿瘤细胞后，在第21天获得多灶性肝癌组织的横断面，用苏木精和曙红染色。原倍率：×40。白色点线：肿瘤]。
图5示出oAd-DCN/CFCS强力的抗肿瘤功效。
图5a示出了在Hep3B原位肿瘤模型中的oAd-DCN/CFCS抗肿瘤功效[通过在小鼠的左肝叶上注入1x 106个表达萤火虫荧光素酶的Hep3B细胞来确定了原位肝癌。在注入细胞后，将细胞注入部位由PBS或喷雾处理3×108VP oAd-DCN(喷雾)或用被PBS处理的CFCS或oAd-DCN/CFCS(n＝6)移植并处理。并且对6只小鼠注射Hep3B细胞后，通过尾部静脉在全身注射了3×108VP。在处理后的2、5、7、14及21天监控肿瘤生长]。
图5b是从背景扣除(background subtraction)后的各治疗组示出的从HCC的生物发光信号[数据用平均±标准偏差显示。*P<0.05]。
图6是用PBS、oAd-DCN血管内注射、oAd-DCN腹腔内注射、CFCS单独或由oAd-DCN/CFCS处理的小鼠肿瘤组织的组织学分析结果[用PBS、oAd-DCN血管内注射、oAd-DCN腹腔内注射、CFCS单独或oAd-DCN/CFCS治疗后，在第14天获得被处理的多灶性肝细胞癌的横断面。原倍率:x50,黑色点线：肿瘤]。
图7示出图示化oAd-DCN/CFCS的形成过程。
图8示出确认从加载选择性杀瘤腺病毒的细胞片中复制的腺病毒的生物学活性。
图9示出在进行去除肿瘤手术后，确认粘贴了包括肿瘤选择性杀瘤腺病毒的细胞片后肿瘤的复发与否。
图10示出确认加载牛痘病毒的细胞片的形成。
图11示出确认加载牛痘病毒的细胞片的牛痘病毒复制能力。
图12示出确认包括牛痘病毒的细胞片的牛痘病毒细胞杀灭。
图13示出确认照射了放射线的癌细胞的细胞生存能力。
图14示出确认包括被反射线照射的癌细胞的细胞片中的腺病毒复制能力。
具体实施方式
本发明提供一种细胞片，其包括两个或以上的细胞层，其中一个或以上的细胞层导入有基因传递系统。
在本发明中，细胞片用于局小部基因传递。也就是说，细胞片的作用是能够将基因传递系统局小传递到需要基因治疗的体内各部位的搬运作用。
优选的，所述细胞片在制备及体内移植过程中具有符合使用者操作的机械物性。
为此，所述细胞片包括作为细胞层中的一部分作用为支撑体的细胞层。
在一个具体示例中，所述细胞片包括细胞层，所述细胞层作为支撑体包括体细胞。
包括体细胞的细胞层作为导入基因传递系统的细胞层的支撑体，与体内环境相似，可提供各种细胞能够粘附、增殖、分化及培养的环境。
如果适合发挥以上作用的体细胞，则可以使用任何体细胞，且不特别限定其种类。具体上，所述体细胞可以是选自成纤维细胞、软骨细胞、上皮细胞、肌上皮细胞(myoepithelial,cell)、真皮细胞(dermal cell)、上皮角质形成细胞(epithelialkeratinocyte)、施万细胞(schwann cell)、神经胶质细胞(glial cell)、成骨细胞(osteobalst)、心肌细胞(cardiomyocyte)、巨核细胞(megakaratyocyte)、脂肪细胞、干细胞(例如,间充质干细胞)和癌细胞中的一种或以上细胞，但不限于此。
在本发明中，已知可用于基因治疗的任何基因传递系统都可以使用。
例如，本发明的基因传递系统可以是包括(i)裸重组DNA分子，(ii)质粒，(iii)病毒载体和(iv)所述裸重组DNA分子或质粒的脂质体或类脂囊泡的形式。
通常用于基因治疗的所有基因传递系统可用于根据本发明的细胞片，优选使用质粒、腺病毒(Lockett LJ,et al.,Clin.Cancer Res.3:2075-2080(1997))、腺病毒相关病毒(Adeno-associated viruses:AAV,Lashford LS.,et al.,Gene Therapy Technologies,Applications and Regulations Ed.A.Meager,1999)、逆转录病毒(Gunzburg WH,et al.,Retroviral vectors.Gene Therapy Technologies,Applications and RegulationsEd.A.Meager,1999)、慢病毒(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))、单纯疱疹病毒(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))、牛痘病毒(Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy
10:649-657(1999))、脂质体(Methods in Moecular Biology,Vol 199,S.C.Basuand M.Basu
(Eds.),Human Press 2002)或类脂囊泡。
i.腺病毒
腺病毒由于其基因组大小适中、易于操作、滴度高、靶细胞范围广以及感染力出色而被广泛用作为基因传递载体。基因组的两端均包括100-200bp的ITR(inverted terminalrepeat，反向末端重复)序列，这是DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的E1区(E1A和E1B)编码蛋白质，所述蛋白质调节转录及宿主细胞基因转录。E2区(E2A和E2B)编码参与病毒DNA复制的蛋白质。
目前开发的腺病毒载体中，缺乏E1区的不可复制腺病毒被广泛使用。同时，E3区从通常的腺病毒载体中被去除，提供外来基因插入的空间(Thimmappaya,B.et al.,Cell,
31:543-551(1982)；及Riordan,J.R.et al.,Science,245:1066-1073(1989))。因此，要转运到细胞中的靶核苷酸序列优选插入到缺失的E1区(E1A区及/或E1B区,优选是E1B区)或E3区，更优选是插入到缺失的E1区。在本说明书中，与病毒基因组序列有关的术语“缺失”不仅指该序列完全缺失，也包括部分缺失。
腺病毒具有42种不同的血清型和A-F亚型。其中，属于C亚型的腺病毒2型和5型是优选获得本发明的腺病毒载体的起始原料。关于腺病毒2型及5型的生物化学性及遗传信息已众所周知。
通过腺病毒搬运的外来基因以与附加体同一个方式复制，所以对宿主细胞的基因毒性非常低。因此认为使用本发明的腺病毒基因传递系统的基因治疗非常安全。
ii.逆转录病毒
逆转录病毒因为可将自身基因插入到宿主基因组中，转运大量的外来基因物质且可以感染的细胞的频谱广泛，所以被广泛用作基因传递载体。
为建立逆转录病毒载体，将要转运至细胞中的靶核苷酸序列替代逆转录病毒序列被插入到逆转录基因组，生产不可复制的病毒。为了生产病毒粒子，建立虽包括gag、pol和env基因，但不包括LTR(long terminal repeat，长末端重复)和Ψ序列的包装细胞系(Mannz et al.,Cell,33:153-159(1983))。将包括将要转运的靶核苷酸序列、LTR及Ψ序列的重组质粒输入到所述细胞系，则Ψ序列使重组质粒能够生产RNA转录组，该转录组被包装成病毒，病毒释放到介质中(Nicolas and Rubinstein"Retroviral vectors,"In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez andDenhardt(eds.),Stoneham:Butterworth,494-513(1988))。收集包括重组逆转录病毒的介质并浓缩，用作基因传递系统。
利用2代逆转录载体的基因传递已被发表。(Kasahara et al.Science,266:1373-1376(1994))制作了莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)变异体，在这里将促红细胞生成素(EPO，erythropoietin)序列插入到包膜区域，生产了具有新的结合特性的嵌合蛋白。本发明的基因传递系统也可根据这一2代逆转录病毒载体的建立战略来制作。
iii.AAV载体
腺相关病毒(AAV)可感染非分裂细胞，具有能够感染到不同种类细胞的能力，适合作为本发明的基因传递系统。关于AAV载体的制备及用途的详细说明可见美国专利第5,139,941号及第4,797,368号。
关于作为基因传递系统的AAV的研究，可见LaFace et al,Viology,162:483486(1988),Zhou et al.,Exp.Hematol.(NY),21:928-933(1993),Walsh et al,J.Clin.Invest.,
94:1440-1448(1994)及Flotte et al.,Gene Therapy,2:29-37(1995)。
典型的是，AAV病毒通过共转化包括具有两个AAV末端重复序列侧翼的目的基因序列(待转运到细胞中的靶核苷酸序列)的质粒(McLaughlin et al.,J.Virol.,62:1963-1973(1988)；及Samulski et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989))和包括无末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒(McCarty et al.,J.Virol.,65:2936-2945(1991))来制作。
iv.其他病毒载体
其他病毒载体也可以用作本发明的基因传递系统。牛痘病毒(Puhlmann M.etal.,Human Gene Therapy 10:649-657(1999)；Ridgeway,"Mammalian expressionvectors,"In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and theiruses.Rodriguez and Denhardt,eds.Stoneham:
Butterworth,467-492(1988)；Baichwal and Sugden,"Vectors for genetransfer derived from animal DNA viruses:Transient and stable expression oftransferred genes,"In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:Plenum Press,117-148(1986)及Coupar et al.,Gene,68:1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))或单纯疱疹病毒(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))衍生的载体也可用作能够将靶核苷酸序列转运到细胞中的转运系统。
另外，病毒载体还包括呼肠孤病毒、痘病毒、塞姆利基森林病毒和麻疹病毒(Measles virus)等。
v.脂质体
脂质体由分散在水相中的磷脂自动形成。将外来基因分子成功搬运至细胞中的示例公开在Nicolau及Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)和Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987)。同时，使用脂质体转化动物细胞最常用的试剂是阳离子脂质体(Lipofectamine，Gibco BRL)。包括要搬运的靶核苷酸序列的脂质体通过诸如内吞、吸附到细胞表面或与浆细胞膜融合的机制与细胞相互作用，将靶核苷酸序列运输到细胞中。
在一个或以上细胞层导入基因传递系统的方法由接触形成细胞层的细胞和所述基因传递系统来进行。
在本发明中，当基因传递系统基于病毒载体而制作，所述接触步骤根据该领域公认的病毒感染方法来进行。利用病毒载体的宿主细胞的感染记载在所述引用文献中。
在本发明中，当基因传递系统为裸(naked)重组基因分子或质粒，可通过微注射(Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980)；及Harland与Weintraub,J.Cell Biol.101:1094-1099(1985))、磷酸钙沉淀法(Graham,F.L.et al.,Virology,52:456(1973)；及Chen与Okayama,Mol.Cell.Biol.7:2745-2752(1987))、电穿孔(Neumann,E.et al.,EMBO J.,1:841(1982)；及Tur-Kaspa et al.,Mol.Cell Biol.,6:716-718(1986))、脂质体-介导的感染法(Wong,T.K.et al.,Gene,10:87(1980)；Nicolau及Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)；及Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987))、DEAE-葡聚糖处理(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985))及基因轰击(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572(1990))方法，将基因注入到细胞中。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的细胞片被用作可复制病毒的局部传递平台。杀瘤病毒覆盖靶肿瘤部位，并使用杀瘤病毒来表达有利于肿瘤去除的特定基因(例如，核心蛋白聚糖等)并使杀瘤病毒及治疗基因可被有效复制。另外，直到细胞层在体内完全分解，在细胞片和肿瘤组织中均可活性复制病毒粒子，以此使杀瘤病毒在肿瘤组织中长期维持。
因此，细胞片比注入到肿瘤内的已有杀瘤病毒引出更强力的抗肿瘤效果，并预防多灶性癌肿的形成。另外，杀瘤病毒的细胞层-介导传递局小化在肿瘤部位，因此防止病毒粒子向正常组织排出。细胞片包括的杀瘤病毒的给药同时提高肿瘤内的局小化并防止病毒的非特异性放出，从而不仅提高安全特性，而且能够延长、扩大或强化病毒的治疗功效。
在本发明的一个实施方案中，所述基因传递系统可能为重组腺病毒。
随着作为基因传递载体的重组腺病毒的多个优点被强调，重组腺病毒在癌症基因治疗的使用率呈现稳步增长趋势。特别是，想用基因治疗剂治疗癌症的时候，不需要长期和持续的治疗基因表达是其优点。另外，因为由用作载体的病毒诱导的宿主的免疫反应不成大问题或反而可以作用为优点，所以重组腺病毒作为用于癌症治疗的基因传递系统备受关注。
所述重组腺病毒可能为不可复制腺病毒或杀瘤腺病毒。
不可复制腺病毒是插入用于治疗的基因来替代对腺病毒复制所必需的E1基因(全部或一部分)并重组，这样可以防止腺病毒在导入的细胞中被复制。
杀瘤腺病毒作为E1B 55kDa基因部分缺失的腺病毒，只能p53在功能非活性化的细胞中增殖。在p53的功能被抑制的癌细胞中，病毒增殖活跃地发生，而在正常细胞中，病毒的增殖被抑制。因此，杀瘤腺病毒不影响正常细胞，而只能选择性地杀灭癌细胞，在治疗癌症中尤为有利。
在本发明的一个具体示例中，重组腺病毒具有非活性化的E1B 19kDa基因、E1B55kDa基因或E1B 19kDa/E1B 55kDa基因，优选具有非活性化的E1B 19kDa及E1B 55kDa基因。
在本说明书中，有关基因使用的术语“非活性化”，是指该基因的转录和/或翻译没有正常进行，因此该基因编码的正常蛋白质的功能没有出现。例如，非活性化的E1B 19kDa基因是由于该基因的突变(取代、添加、部分缺失或全部缺失)而不会产生活性E1B 19kDa蛋白的基因。在缺乏E1B 19kDa基因的情况下，可增加细胞凋亡能力，而在没有E1B 55kDa基因的情况下，它具有肿瘤细胞特异性(参考：韩国专利申请第2002-0023760号)。
根据本发明的一个具体示例，本发明的重组腺病毒可包括活性E1A基因。包括E1A基因的重组腺病毒具有可复制特性。根据本发明的更优选的具体示例，本发明的重组腺病毒包括非活性化的E1B 19kDa/E1B 55kDa基因及活性E1A基因。根据本发明的一个具体示例，本发明的重组腺病毒缺失E1B 19kDa/E1B 55kDa基因，包括活性E1A基因，核心蛋白聚糖-编码核苷酸序列为被插入到缺失的E1区。
在本发明的一个具体示例中，导入基因传递系统的细胞层可包括癌细胞或干细胞。
当作为基因传递系统使用杀瘤腺病毒时，导入基因传递系统的细胞层可包括癌细胞。如上所述，杀瘤腺病毒仅在癌细胞中增殖，并且在除了包括癌细胞的细胞层以外的正常细胞中，其复制被抑制。因此，即使长时间培养细胞片，也不必担心由于用作载体的细胞层的死亡而导致的机械性能的弱化。另外，由于在将细胞片移植到体内后癌细胞本身被杀瘤腺病毒杀灭，无需担心癌细胞的体内残留。
即使使用除杀瘤腺病毒以外的基因传递系统，因为癌细胞可以通过照射放射线使癌细胞丧失复制能力，将其用作导入基因传递系统的细胞层完全没有问题。在本发明的一个实施方案中，所述细胞片包括导入了基因传递系统的包括癌细胞的细胞层，并且所述癌细胞可能是被照射放射线的。
具体而言，所述癌细胞可以是选自胶质母细胞瘤、喉癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、卵巢癌、子宫癌、直肠癌、胃癌、近端癌、大肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或泌尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤中的任何一种或以上的癌导致的癌细胞，但不限于此。
在其他实施方案中，导入基因传递系统的细胞层可包括干细胞。由于干细胞具有肿瘤靶向能力，因此当将本发明的细胞片用于癌症患者中时，可能特别有利。但是，由于通常已知干细胞对腺病毒的感染率低，因此可能优选使用具有改善的干细胞导入能力的重组腺病毒。虽不限于此，当将干细胞包括在导入基因传递系统的细胞层中时，优选使用包括血清型35的纤维(fiber)瘤(knob)的具有改善的干细胞导入能力的重组腺病毒。包括血清型35纤维(fiber)瘤(knob)的重组腺病毒，导入中叶干细胞的效率非常优异，并且在低病毒浓度下也可以良好地被导入。
虽不限于此，在本发明的一个实施方案中，本发明的重组腺病毒具有非活性化的E1B19kDa基因、E1B 55kDa基因或E1B 19kDa/E1B 55kDa基因，优选具有非活性化的E1B19kDa及E1B 55kDa基因。
在本说明书中，有关基因使用的术语“非活性化”，是指该基因的转录和/或翻译没有正常进行，因此该基因编码的正常蛋白质的性能没有出现。例如，非活性化的E1B 19kDa基因是由于该基因的突变(取代、添加、部分缺失或全部缺失)而不会产生活性E1B 19kDa蛋白的基因。在缺乏E1B 19kDa基因的情况下，可增加细胞凋亡能力，而在没有E1B 55kDa基因的情况下，它具有肿瘤细胞特异性(参考：韩国专利申请第2002-0023760号)。
根据本发明的一个优选具体示例，本发明的重组腺病毒包括活性E1A基因。包括E1A基因的重组腺病毒具有可复制特性。根据本发明的更优选体现方案，本发明的重组腺病毒包括非活性化的E1B 19kDa/E1B 55kDa基因及活性E1A基因。根据本发明的最优选体现方案，本发明的重组腺病毒缺失E1B 19kDa/E1B 55kDa基因，包括活性E1A基因，核心蛋白聚糖-编码核苷酸序列被插入到缺失的E1区。
在本发明中使用的重组腺病毒包括动物细胞，优选包括在哺乳动物细胞中可以运作的助催化剂。适合本发明的助催化剂包括源于哺乳动物病毒的催化剂及源自哺乳动物细胞基因组的催化剂，例如，CMV(Cytomegalovirus，巨细胞病毒)催化剂、U6催化剂及H1催化剂、MLV(Murine Leukemia Virus，鼠白血病病毒)LTR(Long terminal repeat，长终端重复)催化剂、腺病毒初期催化剂、腺病毒后期催化剂、牛痘病毒7.5K催化剂、SV40催化剂、HSV的tk催化剂、RSV催化剂、EF1α-催化剂、金属硫氨酸催化剂、β-肌动蛋白催化剂、人IL-2基因催化剂、人IFN基因催化剂、人IL-4基因催化剂、人淋巴毒素基因催化剂、人GM-CSF基因催化剂、可诱导催化剂、癌细胞特异催化剂(例如，TERT催化剂、调节的TERT催化剂、PSA催化剂、PSMA催化剂、CEA催化剂、Survivin催化剂、E2F催化剂、调节的E2F催化剂、AFP催化剂、调节的AFP催化剂、E2F-AFP混合催化剂以及E2F-TERT混合催化剂与组织特异性催化剂(例如，白蛋白催化剂)、人磷酸甘油酸激酶催化剂和小鼠磷酸甘油酸激酶催化剂，但不限于此。最优选是CMV催化剂。优选的情况为，在表达反式基因的表达构建体中，将聚腺苷酸化序列结合在反式基因的下游。所述聚腺苷酸化序列，包括小生长激素终止剂(Gimmi,E.R.,et al.,NucleicAcids Res.17:6983-6998(1989))、源自SV40的聚腺苷酸化序列(Schek,N,et al.,Mol.Cell Biol.12:5386-5393(1992))、HIV-1polyA(Klasens,B.I.F.,et al.,NucleicAcids Res.26:1870-1876(1998))、β珠蛋白polyA(Gil,A.,et al,Cell 49:399-406(1987))、HSV TK polyA(Cole,C.N.and T.P.Stacy,Mol.Cell.Biol.5:2104-2113(1985))或多瘤病毒polyA(Batt,D.B and G.G.Carmichael,Mol.Cell.Biol.15:4783-4790(1995))，但不限于此。
本发明的重组腺病毒作为选择标志，可附加包括抗生素耐药基因及引子基因(例如,GFP(green fluorescence protein，绿色荧光蛋白)、萤光素酶和β-葡萄糖醛酸苷酶)。所述抗生素耐药基因包括该领域通常使用的抗生素耐药基因,例如,对氨基霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素的耐药基因，优选是新霉素耐药基因。
根据本发明的细胞片内包括的病毒载体(例如，重组腺病毒)在0.1至500MOI(Multiplicity of infection，感染复数)的量为优选。更为优选的是，可在0.1至200MOI、0.1至100MOI、0.1至50MOI、0.1至10MOI、0.1至5MOI、0.5至200MOI、0.5至100MOI、0.5至50MOI、0.5至10MOI或0.5至5MOI加载。这表明，使用比以往肿瘤疗法中使用的杀瘤病毒量1×1010VP至5×1010VP显著更少的量，也可以在癌细胞中增殖，因此与使用以往杀瘤病毒的肿瘤疗法相比，能够显著降低病毒加载量，减少医生的压力。
另外，本发明提供包括在包括温敏性聚合物的温度反应性培养皿，形成包括两个或以上细胞层的细胞片，其中一个或以上的细胞层导入有基因传递系统，从温度反应性培养皿分离所述细胞片的细胞片制备方法。
关于所述细胞片记述的所有内容可直接适用或准用于细胞片制备方法。
虽不限于此，根据本发明的细胞片制备方法可包括例如以下的步骤进行。
在包括温敏性聚合物的温度反应性培养皿中培养体细胞以形成包括体细胞的第一细胞层的步骤；在所述第一细胞层培养癌细胞，形成包括癌细胞的第二细胞层并制备细胞片的步骤；在所述第二细胞层接种杀瘤病毒的步骤；以及从温度反应性培养皿分离所述细胞片的步骤。
对所述例子的具体说明如下，首先，在包括温敏性聚合物的温度反应性培养皿中放置硅胶环，在硅胶环内侧分配充当支撑体作用的体细胞，在恒温设备里培养，形成包括体细胞的第一细胞层。
所述温度感应性培养皿在表面的下限温度(lower critical solutiontemperature,LCST)以上，细胞粘附以形成细胞片，在下限温度以下，聚合物溶胀，细胞可以片状回收。
所述温敏性聚合物，可以是选自聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚己内酯(PCL)和聚乳酸-共-乙醇酸酯(PLGA)中的一种或以上，但如果是具有温度感应性的聚合物，可无限制使用。
然后，在所述第一细胞层上分配癌细胞，在恒温设备里培养，形成包括癌细胞的第二细胞层以制作细胞片。
尤其，为了去除因为构成细胞片的癌细胞而引起的致癌可能性，可在所述第二细胞层附加包括照射放射线的步骤。
之后，在所述第二细胞层接种杀瘤病毒，在细胞片中加载病毒。
此时，用0.1至500MOI的量(更优选是0.1至200MOI、0.1至100MOI、0.1至50MOI、0.1至10MOI、0.1至5MOI、0.5至200MOI、0.5至100MOI、0.5至50MOI、0.5至10MOI或0.5至5MOI的量)的杀瘤病毒形成所述细胞片后，在12小时至1天内接种。仅在以固定时间间隔接种细胞才能形成薄片，并且还可以计算每个细胞加载的病毒量。通过接种这种杀瘤病毒，癌细胞在一定时期(接种后12小时至7天)后自然消失。另外，由于癌细胞可以扩增杀瘤病毒，因此可以通过少量给药来治疗癌细胞。
最后，从温度反应性培养皿分离所述细胞片。
所述温度感应性培养皿，因为在表面的下线温度以下聚合物溶胀，细胞片可从培养皿脱落。这时，病毒接种后6小时至1天内从培养皿分离细胞片，才能不发生因加载病毒的复制导致的细胞片分解，也能够以坚固的细胞片形态分离细胞片，因此是优选的。
另外，本发明提供将本发明的细胞片作为有效成分包括的基因治疗剂。
本发明的术语“基因治疗剂”，是指以治疗疾病等目的将基因物质或导入基因物质的转运体注射到受试体的细胞或药物。另外，指通过将正常基因或具有治疗作用的基因注射到受试体的受损基因中而用于治疗或预防遗传性缺陷的药物。
作为基因治疗剂，在药学上可适用的转运体是适合杀菌及活体的，如食盐水、灭菌水、输液、缓冲食盐水、蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及以上成分中的一个或以上的混合，根据需要，可添加抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等其他普通添加剂。另外，可附加添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，可以配制成例如水溶液、悬浮液、乳剂等可注射的制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，靶器官特异性抗体或其他配体可以与所述转运体结合使用以特异性地作用于靶器官。
优选的是，本发明的基因治疗剂可用于癌症预防或治疗、癌症复发或癌症转移。
所述癌细胞可能为选自多灶性肝细胞癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、喉癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、卵巢癌、子宫癌、直肠癌、胃癌、近端癌、大肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin's disease)、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或泌尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤中的的任何一种或以上。
通过将本发明的细胞片给药于已经去除了癌(肿瘤)的手术部位或已经发生癌症的部位，可以治疗癌症或者可以预防癌症转移或复发。本发明的细胞治疗剂的优选剂量根据个体的状态和体重、疾病的程度、药物形式、给药途径和持续时间而不同，但是可以由本领域技术人员适当选择。给药可以每天一次，也可以分成数次，并且所述剂量不以任何方式限制本发明的范围。
本发明中使用的术语“预防”，是指通过根据本发明的细胞片的给药抑制癌(肿瘤)或延迟发病的所有行为。
本发明中使用的术语“治疗”，是指通过指根据本发明的细胞片的给药，癌(肿瘤)症状发生好转或改善的所有行为。
本发明中使用的术语“转移”，是指恶性肿瘤从发病的器官转移到其他组织的状态。
本发明中使用的术语“复发”，是指肿瘤通过手术性切除或放射线照射先消失后，同样的肿瘤再次发育、剩余肿瘤细胞增殖或肿瘤细胞完全消失后发生新的肿瘤。
另外，本发明包括癌症复发预防方法，包括在受试体的癌去除手术部位移植根据本发明的细胞片的步骤。
另外，本发明包括癌症治疗方法，包括在受试体的需要癌症治疗的部位移植根据本发明的细胞片的步骤。
在本发明中，“受试体”是指需要治疗疾病的受试对象，具体为人或非人类灵长类、啮齿动物(大鼠、老鼠、豚鼠等)、狗、猫、马、牛、羊、猪、山羊、骆驼、羚养等哺乳类。
根据本发明的细胞片在移植后一定时间(6天至10天)后，因癌细胞被病毒的复制而破坏，细胞片自然消灭。
虽不限于此，将本发明的细胞片移植到靶部位的方法，可包括例如一下步骤。
从感染了在温度反应性培养皿中形成的病毒的细胞片中除去培养基，并用PBS洗涤。当将膜放置在细胞片上并且降低温度以除去细胞片时，可以将细胞片附着在膜上的状态下获得细胞片。将细胞片附着的膜放在靶(病变)部位，小心地除去膜，细胞片附着于靶部位，通过除去膜，可将细胞片移植到靶部位。
实施例
以下为了帮助对本发明的理解，提示实施例。但以下实施例仅是为了更容易理解本发明，本发明的内容并不局限于以下实施例。
[实施例]
实验方法
细胞系和细胞培养
所有细胞系均在添加了10％胎牛血清(FBS，Gibco BRL)和青霉素链霉素(100IU/mL,Gibco BRL)的Dulbecco's modified Eagle's介质(DMEM，Gibco BRL，美国纽约州格兰德岛)培养。
HEK293(表达Ad E1区的人胚肾细胞系)、A549(肺癌细胞系)、Hep3B(肝细胞癌细胞系)、U343(胶质母细胞瘤细胞系)及NIH3T3(成纤维细胞细胞系)细胞系购于ATCC(ATCC,Manassas,VA)。
将所有细胞系在5％CO2加湿状态下维持在37℃。
制作oAd-DCN(核心蛋白聚糖-表达杀瘤腺病毒)
将pCA14/DCN用Bgl II限制酶切割并获得DCN表达盒，将其与用BamHI限制酶切割的pdE1sp1B(p)-HRE-mTERT-Rd19结合，制作了pdE1sp1B(p)-HRE-mTERT-Rd19/DCN E1穿梭载体。
将所述载体，处理XmnI限制酶，形成单一条，将腺病毒瘤用Ad35替换的载体dl324-k35做BstBI限制酶处理，形成单一条，将两个载体同时转型至大肠菌BJ5183，诱导同源重组，制作了DCN表达oAd载体(HmT-Rd19-k35/DCN,oAd-DCN)。
Ad-加载癌细胞/成纤维细胞片(oAd/CFCSs)
用温度反应性培养皿(TRCD；UpCell；NUNC,Tokyo,Japan)制作了以成纤维细胞第一细胞层和癌细胞第二细胞层构成的细胞层。
为了制作双层细胞片，将NIH3T3细胞(3Х105)在35mm TRCD放进空心硅胶环(半径1.8cm)内层后在37℃培养。培养48小时后，将U343细胞(3Х105)添加至硅胶环限定区，形成细胞片第二层后培养24小时。将各皿中的介质换成包括5％FBS的新鲜DMEM后，将细胞以0.5或5的多重感染用核心蛋白聚糖-表达杀灭肿瘤感染。将培养温度降低至室温30分钟，将Ad-DCN-感染癌细胞/成纤维细胞片(oAd-DCN/CFCSs)感染4个小时后从皿分离。
组织学
oAd-DCN CFCS是使用oAd-DCN的5MOI如上所述被生成，对照组CFCS是用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理细胞片而生成。
将培养温度降低至室温30分钟，并用4％多聚甲醛固定24小时，并在处理后12小时收集加载杀瘤腺病毒或PBS处理的CFCS。将固定的样品插入石蜡中，切成5um的切片，并去除石蜡进行苏木精和曙红(H&E)染色。
病毒产生分析
为了评估细胞片中杀瘤腺病毒的病毒产生，将CFCS置于12孔板中，并用oAd-DCN以0.5MOI感染。感染后4小时，用PBS洗涤孔，并换成含5％FBS的新鲜DMEM。
感染4、12、24、48、72和96小时后，收集上清液和细胞片，并通过实时定量PCR(Q-PCR，TaqMan PCR检测，Applied Biosystems，CA，USA)评估腺病毒颗粒的数量。
蛋白质印记分析
为了评估oAd-DCN/CFCS中杀瘤腺病毒-介导的DCN表达水平，将细胞片用MOI为1的oAd-DCN感染并培养48小时。随后，将细胞片在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，MO，USA)的冰冷RIPA缓冲液(Elipis Biotech，Taejeon，Korea)中均质化，并将所得匀浆以13,200rpm离心10分钟。
通过BCA蛋白质分析法(Pierce，Rockford，IL，USA)测量总蛋白质浓度，并将等效蛋白质量(每个样品200μg)置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel)上进行电泳。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并与山羊抗-DCN抗体(Ab，R&D Systems，MN，USA)或兔抗-β-肌动蛋白抗体(Cell SignalingTechnology，Beverly，MA，USA)一起培养。
将膜用2次抗体与辣根过氧化物酶偶联的小鼠抗山羊IgG抗体或山羊抗-兔IgG(细胞信号)一起培养，通过增强的化学发光使免疫反应带可视化(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)。
使用ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院，National Institutesof Health,Bethesda,MD,USA)对DCN的表达水平进行半定量分析。
MTT分析
在试验管内为了评估CFCS的病毒复制介导降解，将CFCS置于48孔板中，然后用MOI为5的oAd-DCN感染。
感染4、12、24、48、72和96小时后，除去介质，并将用500μL3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT,Sigma,MO,USA)处理CFCSs。然后用酶标仪在540nm下读取板。PBS处理组的吸光度设置为100％生存能力。
oAd-DCN/CFCS的体内降解特性和病毒持久性
为评估体内CFCS的降解和病毒持久性，制作了两种不同类型的细胞片。
使用由成纤维细胞和萤火虫荧光素酶(fluc)表达的癌细胞(CFCSs/fluc)组成的CFCS评估CFCS的分解特性，然后用MOI为5的oAd-DCN感染以生成oAd-DCN/CFCSs/fluc并被评估。
为了评估细胞片的病毒持久性，使用成纤维细胞和不表达fluc基因的癌细胞感染MOI为5的萤火虫荧光素酶表达的oAd-DCN(oAd-DCN-fluc)来制作CFCS。oAd-DCN-fluc/CFCS、Oad-DCN/CFCS/fluc和oAd-DCN-fluc/CFCS均被感染后4小时被植入到具有HCC的小鼠最大的间质叶中。移植后2、4、6、8和10天，通过IVIS成像系统(Xenogen，阿拉米达，加利福尼亚州，美国)，为评估oAd-DCN/CFCS/fluc降解以及oAd-DCN-fluc/CFCS杀瘤腺病毒的持久性，在充满氧气的2％异氟烷的室内进行麻醉，然后在腹膜内注射D-荧光素(150mg/kg，Caliper，Hopkinton，MA)。
体内抗肿瘤功效
为了评估oAd-DCN的抗肿瘤作用，在CFCS和oAd-DCN/CFCSs原位(orthotopic)HCC异种移植模型中，将1x106个表达fluc的Hep3B细胞(Hep3B/fluc)注射进6-7周龄胸腺裸鼠(OrientBioInc.，Seongnam，Korea)的间质的最大叶。
注射肿瘤细胞后，立即用胰蛋白酶处理肝脏注射部位5分钟，然后移植CFCS组(CFCS或oAd-DCN/CFCS)或喷PBS或oAd-DCN(5MOI)。最后，一个治疗组通过尾静脉(与另一个含溶瘤性Ad的组给药相同量的病毒)用oAd-DCN全身性给药。
细胞注射后两天，在充满2％异氟烷的氧气和D-荧光素(150mg/kg)的小室内麻醉小鼠，以确认通过IVIS成像系统(Xenogen)成功移植了Hep3B/fluc细胞，在腹膜内注射D-萤光素(150mg/kg；马萨诸塞州卡利珀，马萨诸塞州霍普金顿)。
在治疗后第2、5、7、14和21天，在关注的受试体身体部位(肿瘤)以每秒光子/秒(photons/second[p/s])的速度获得体内生物发光信号强度。
组织学及免疫组织化学分析
注射HCC细胞后第21天收获Hep3B-HCC肿瘤组织，固定在10％福尔马林中，包埋在石蜡中，切成5μm切片。用H&E对切片染色，并用光学显微镜检查。为了检测肿瘤组织中的Ad颗粒，用兔抗-Ad E1A多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)对肿瘤切片进行免疫染色。
另外，肿瘤切片用增殖细胞核抗原(PCNA)特异性抗体(Dako，Glstrup，丹麦)或末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色，以评估肿瘤细胞增殖或治疗后细胞死亡的诱导。然后用2次抗体用辣根过氧化物酶结合的山羊抗大鼠IgG(BD BiosciencesPharmingen)或辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech，Birmingham，AL，USA)处理。
二氨基联苯胺/过氧化氢酶(DAKO)被用作发色底物。所有切片均用Mayer苏木精复染。
统计分析
数据用平均值±标准差(SD)标示。统计学意义通过两尾学生T检验或单向Anova检验(SPSS 13.0软件，SPSS，Chicago，IL)进行测量。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
确认照射放射线的癌细胞的细胞生存能力
在向U343细胞系照射各种强度(强度分别为1、5、10、15、15、30、50Gy)的放射线后，为了确认放射线照射的癌细胞的细胞生存能力，照射的U343细胞系在96孔板进行接种并进行MTT测定直到第9天。
使用放射线照射癌细胞从细胞片中确认病毒复制能力
使用温度反应性培养皿(TRCD；UpCell；NUNC，东京，日本)制作了由成纤维细胞第一细胞层和癌细胞第二细胞层组成的细胞片(CFCS)。
为了制作双层细胞片，将NIH3T3细胞(3Х105)在35mm TRCD放进空心硅胶环(半径1.8cm)内层后在37℃培养。培养48小时后，将未照射放射线的U343细胞(对照组)或用5Gy照射放射线的U343细胞(3Х105)添加至硅胶环限定区，形成细胞片第二层后培养24小时。将各皿中的介质换成包括5％FBS的新鲜DMEM后，将细胞以0.5多重感染用核心蛋白聚糖-表达杀瘤腺病毒感染。随后，为了在4小时除去未感染的病毒，将培养基更换为新鲜的，并且在4、24和48小时，收集培养基和细胞，并通过Q-PCR确认其中存在的病毒。
将细胞片移植到肿瘤切除手术(目标)部位后确认生物学活性和肿瘤发生与否
如图7所示，将NIH3T3分配到温度反应性培养皿中以形成第一层，并且在3天后，分配U343细胞系以形成第二层，并且在48小时后，感染选择性杀瘤腺病毒并且在24小时后，通过将温度反应性培养皿的温度降低至20℃除去细胞片。
从感染了在温度反应性培养皿中形成的病毒的细胞片中除去培养基，并用1XPBS洗涤3次。将膜放置在细胞片上的同时，将温度降低至20℃以获得粘有细胞片状态的膜。
通过外科手术切除具有H460肺癌皮下肿瘤的小鼠模型的肿瘤，将粘有细胞片的膜放置在肿瘤切除手术部位上，然后小心地去除膜以将细胞片附着到肿瘤切除手术部位上。此后，缝合手术部位并观察肿瘤复发与否直至第30天。
细胞片产生的病毒的生物学活性分析
为了评估从细胞片中复制的杀瘤腺病毒的生物学活性，将CFCS置于12孔板中，并用0.5MOI的oAd-DCN感染。感染后4小时，将孔用1XPBS洗涤，并换成包括5％FBS的新鲜DMEM。在感染后4、12、24、48和72小时，收集上清液和细胞片。
将A549细胞系以1x104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，然后分别将25、50和100μL收集的样品处理到细胞中，然后进行MTT分析48小时，以确认从细胞片中产生的病毒癌细胞杀灭能力。
制作加载病毒的细胞片
为了准备用于复制或传递牛痘病毒或腺病毒的细胞片，将内径为1.8mm的硅胶环放在温度反应性培养皿(TRCD)上，并将3x105个NIH3T3细胞系分配到硅胶环内部。48小时后，分配3×105个U343细胞系以制作细胞片。
24小时后，细胞片被牛痘病毒或腺病毒感染。一段时间后，将病毒感染的细胞片的培养基和硅胶环从温度反应性培养皿中去除，用1XPBS洗涤3次，然后加入2mL新鲜的1XPBS，并在20℃下分离以确认细胞片的形成。
实验结果
阐明oAd-DCN/CFCS的生成及特性
为了制作允许腺病毒复制的CFCS，使用了由人脑胶质母细胞瘤细胞系(U343)和小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)组成的双层细胞片。
CFCS是在温度反应性培养皿(TRCD)中生成的，并以MOI为5的oAd-DCN感染，产生了被杀瘤腺病毒感染的CFCS(oAd-DCN/CFCSs)。感染12小时后，将平板温度降低至室温30分钟，从TRCD中分离出oAd-DCN/CFCS。如图1a所示，均匀尺寸的圆形片容易地从TRCD分离。细胞片的H&E染色表明在薄片层中存在癌细胞和正常的成纤维细胞组分(图1b)。
重要的是，细胞片的Ad E1A染色显示在红色斑点中看到的广泛的杀瘤腺病毒的分布(图1d)。相反，经PBS处理的对照片没有可检测到的斑点(图1c)。需注意的是，感染后12小时，PBS和加载杀瘤病毒的CFCS表现出相似的结构和形状。总之，这些结果表明，杀瘤腺病毒可以固定在细胞片上而不损害细胞片的整体结构完整性。
oAd-DCN/CFCS内病毒复制及基因表达特性
为了评估该细胞片的癌细胞层是否允许杀瘤腺病毒感染，分别通过Q-PCR和蛋白质印迹分析了病毒复制和治疗性基因表达特性。
如图2a所示，在感染后直至72小时的时间内，杀瘤腺病毒有效地在细胞片内复制，表明细胞片允许杀瘤腺病毒复制。(第四小时用于检测感染到细胞片中的病毒数量。由于使用了较小的MOI，因此未分析低于Q-PCR检测极限的值)。
在处理后96小时，由于oAd-DCN的肿瘤杀灭活性，观察到Ad量略有减少，并且在处理后96小时诱导细胞片明显降解。根据这些结果，通过蛋白质印迹分析发现，oAd-DCN可以在oAd-DCN/CFCS中有效地产生DCN(图2b)。
总的来说，这些结果证明细胞片对杀瘤腺病毒的感染敏感，并且最终证明该细胞片可以用作传递支架，从而允许病毒复制和治疗性基因表达。
活体内oAd-DCN/CFCSs分解特性及病毒持续性
为了监控和可视化CFCS中细胞片的降解及已安装的杀瘤腺病毒的持久性，在HCC异种移植小鼠移植了感染oAd-DCN-loaded fluc-表达CFCSs(oAd-DCN/CFCSs/Fluc)(图3a)或fluc-表达oAd-DCN(oAd-DCN-Fluc/CFCSs)的CFCSs(无报告基因)(图4b)。
如图3a所示，细胞片的萤光素酶信号随时间而减少，并直至移植后10天完全消失。
另外，在移植后第10天处死小鼠，并且目视确认所有移植的CFCS在肝脏中完全降解。
相似地，杀瘤腺病毒的信号也随着时间降低，如细胞片，10天中萤光素酶表达模式显示随着时间的降低(图3b)。
oAd-DCN/CFCS对多灶性肝细胞癌肿的强力抗肿瘤功效
由于其临床相关性，原位(orthotopic)肿瘤模型已经成为重要的癌症研究模型之一。由于HCC的多灶性是临床上成功治疗的重要挑战，因此我们通过多次向表达肝脏荧光素酶的Hep3B细胞的最大叶中注射，建立了多灶性肝细胞原位肿瘤模型。
如图4所示，在经PBS处理的小鼠的肝中检测到HCC病变，并且确认了成功建立了原位性多灶性HCC。
如图5a所示，oAd-DCN/CFCS处理在治疗后第21天显示出比任何其他治疗组明显更高的抗肿瘤活性，比PBS(7.2×108±4.5×108)，被PBS处理CFCS(1.7×108±9.3×107)或oAd-DCN(sprayed，喷雾)(1.2×108±1.3×108)分别显示出20.4倍、4.7倍或3.5倍大的肿瘤生长抑制作用(图5b)。
此外，所有经oAd-DCN/CFCS处理的小鼠均未显示出多灶性肝细胞癌，这表明CFCS介导的杀瘤腺病毒的传递能够预防多灶性肿瘤的形成(图6)。
总之，这些结果表明，安装在细胞片上的oAd-DCN能够有效地传递至肿瘤组织，以产生有效的抗肿瘤功效并防止多灶性肝细胞癌的形成。
关于多灶性肝细胞癌的oAd-DCN/CFCS的组织学分析
为了进一步研究治疗效果，在由各组(PBS，oAd-DCN血管内注射，oAd-DCN腹膜内注射，单独CFCS或oAd-DCN/CFCS)处理后两周收集肿瘤组织，通过组织学和免疫组织学对其进行分析。
如图6所示，H&E染色显示了在PBS处理、oAd-DCN的血管内注射、oAd-DCN的腹膜内注射、CFCS单独处理的组织或巨噬细胞中的增殖性肿瘤细胞的大的多灶区域。
在oAd-DCN/CFCS中未观察到小面积的肿瘤细胞和多个肿瘤。综上所述，将CFCS用于oAd局部传递的用途证明了抗肿瘤功效的改善并预防多灶性肿瘤的生长。
将细胞片移植到肿瘤切除手术(目标)部位后，确认生物学活性及肿瘤发生与否
图8确认了从加载选择性杀瘤腺病毒的细胞片中复制的腺病毒的生物学活性，通过确认越是复制病毒量大的后期样品，其细胞杀灭能力就越增加，证实了从细胞片中复制的腺病毒具有生物学活性。
图9是切除肿瘤后，贴上装有选择性杀瘤腺病毒的细胞片后，确认肿瘤是否复发。肿瘤切除手术后，在无细胞片的对照组中，术后30天观察到肿瘤复发，相反地，在附着细胞片并密封的实验组中未发生肿瘤复发。
确认感染了牛痘病毒的细胞片的形成
确认了不管病毒是否被感染，细胞片都形成良好。
图10是在温度反应性培养皿的细胞片以0.5MOI感染牛痘病毒后6小时后的细胞片的照片(a)，为了从温度反应性培养皿上分离细胞片，除去硅胶环，用1X PBS洗涤3次后的细胞片的照片(b)，将温度反应性培养皿在20℃下反应15分钟后，剥离细胞片并为感染病毒的细胞片的照片(c)，用0.5MOI感染牛痘病毒的细胞片的照片(d)。
确认牛痘病毒在细胞片上的复制能力
为了评估牛痘病毒在细胞片的癌细胞层中的复制能力，如图11a所示，形成了由成纤维细胞第一细胞层和癌细胞第二细胞层组成的细胞片，并将牛痘病毒用0.1MOI感染后，在4小时洗涤并除去所有未感染的牛痘病毒后，在24、48和72小时通过Q-PCR从细胞培养物和细胞片中确认牛痘病毒。
如图11b所示，牛痘病毒在感染后直至72小时内随时间有效地在细胞片内复制，表明该细胞片允许牛痘病毒复制。
确认因牛痘病毒的细胞片细胞死亡
为了确认由于病毒感染引起的细胞片死亡，如图11a所示，形成了由成纤维细胞的第一细胞层和癌细胞的第二细胞层组成的细胞片，然后用2或5MOI的牛痘病毒感染。通过添加能够使死亡细胞染成红色的7-AAD染料，证实了随着时间的推移的细胞死亡。
如图12a所示，证实了在感染了2或5MOI牛痘病毒的两个细胞片中，死亡细胞的数量均随时间增加，并且量化了图像中具有红色的区域(图12b)。
当将图11和图12的结果放在一起时，证实了细胞片不仅能够感染腺病毒，而且还能够感染牛痘病毒，并使其可复制，并且该细胞片根据病毒的复制具有生物可降解性。
确认照射放射线的癌细胞的细胞生存能力
通过MTT分析证实了用各种强度(1、5、10、15、30、50Gy)的放射线照射的U343细胞的细胞活力。用1Gy照射的U343细胞系的细胞分裂与未照射细胞(对照组)相似，并且当照射5Gy放射线时，细胞分裂速率比对照组慢，并且在7天后细胞开始死亡。用10-50Gy放射线照射的U343，所有细胞在第6天死亡，几乎没有细胞分裂(图13)。
确认腺病毒在包括照射放射线的癌细胞的细胞片的复制能力
为了评估病毒在照射放射线的癌细胞层中的细胞片的复制能力，如图11a所示形成由成纤维细胞第一细胞层和癌细胞第二细胞层组成的细胞片，并用0.5MOI感染腺病毒后，4小时后将所有未感染的腺病毒洗涤并去除，并在24小时、48小时和72小时通过Q-PCR从细胞培养基和细胞片中确认腺病毒。结果，证实了在用放射线照射的癌细胞中也发生了腺病毒复制(图14)。
讨论
多发性肝细胞癌通常是由肝脏中的慢性应激引起的，具有很大的致突变性，并覆盖大量的肝脏，这使大多数患者难以进行切除手术。
由于复发率高，即使在接受切除手术的患者中，5年生存率为50％，预后不理想。
另外，由于这些药物引起严重的肝毒性，这些患者的广泛肝损害阻止了全身给予适量的化学疗法。
为了解决传统肝细胞癌治疗选择的局限性，产生了可生物降解和腺病毒复制耐受的细胞片，以将杀瘤腺病毒有效地传递到肝细胞癌的多灶性原位。
细胞片传递平台的病毒复制耐受特性与其他常规治疗途径(大多数溶瘤性Ad的大多数区域和全身给药需要1-5x1010 VP)比较，使病毒剂量较低的多灶性肝细胞癌能够得到有效治疗。
在相等的病毒剂量下，oc-DCN/CFCS治疗可导致长期的杀瘤腺病毒的释放，与全身或局小施用裸oAd-DCN相比，显示出更好的肿瘤生长抑制和预防多种肝细胞癌的形成(图6)。
对此的一种解释是，病毒复制介导的细胞溶解和大多数到达CFCS释放的肿瘤的病毒粒子都可以感染大面积的多灶性肿瘤部位。
最终，长时间保持治疗性病毒的感染性仍然是临床试验中的主要障碍。还有其他几种局部传递平台，例如肿瘤内注射，目前正在开发中，以改善水凝胶、贴剂和治疗剂的局部化和治疗功效[Pesonen,S.,L.Kangasniemi,and A.Hemminki,Oncolytic adenovirusesfor the treatment of human cancer:focus on translational and clinicaldata.Mol Pharm,2011.8(1):p.12-28；Wang,C.,et al.,Enhanced Cancer Immunotherapyby Microneedle Patch-Assisted Delivery of Anti-PD1 Antibody.Nano Lett,2016.16(4):p.2334-40；Kasala,D.,et al.,Evolving lessons on nanomaterial-coated viralvectors for local and systemic gene therapy.Nanomedicine(Lond),2016.11(13):p.1689-713]。这些平台的主要问题之一是频繁使用合成成分，例如聚合物、脂质体和纳米颗粒，降解产物会引起炎症和其他副作用。然而，加载本发明的杀瘤病毒(例如，oAd-DCN/CFCS)的细胞片具有优异的生物相容性和可降解性，因为与其他现有的局部传递平台不同，其不包括任何合成成分。临床上CFCS方法的重要关注和障碍之一是使用癌细胞层来支持病毒复制，因为它可以产生不同的肿瘤。为了解决这一问题，使用照射放射线的癌细胞以生成CFCS，诱导初始移植后癌细胞层的根除，从而支持病毒复制(图13)。另外，放射线照射用细胞片曾增强了病毒复制(图14)。
这些结果表明，通过放射线引起的DNA损伤和辅助放射疗法，可以改善杀灭肿瘤Ad的复制，并且通过加速DNA修复，可以进一步增加游离型腺病毒DNA的复制。
另外，放射线照射的癌细胞目前被认为是癌症疫苗的有前途候选。因为它可以向宿主免疫系统提供与肿瘤相关的抗原，该抗原识别并诱导肿瘤特异性免疫反应，其有潜力成为有希望的免疫疗法平台，可同时传递肿瘤疫苗和杀瘤腺病毒。
杀瘤腺病毒(oncolytic Ads)的CFCS介导的潜在的免疫学调节目前被评价为未来研究。
结论
本发明的一些实施例已经将杀瘤病毒与细胞片相结合以制作用于治疗多灶性肿瘤的有效传递系统，该系统已经显示了有效扩增和持续释放，并预防了可允许的细胞片对oAd的非特异性释放。
总之，本发明的一些实施例表明，通过克服现有癌症基因疗法的局限性，使用杀瘤病毒/细胞片系统可以使杀瘤病毒的治疗效果最大化。
本发明的以上描述仅用于例示，并且本发明所属领域的技术人员可以理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将其修改为其他具体形式。因此，应理解所述实施例在所有方面都是例示性的，而不是限制性的。尤其，本文描述的实施例仅例示了某些病毒的使用，并且可以变更为其他病毒系统。
Claims (29)
1.一种细胞片，包括两个或以上的细胞层，其中一个或以上细胞层导入有基因传递系统。
2.根据权利要求1所述的细胞片，其特征在于，所述细胞片包括细胞层，所述细胞层作为支撑体包括体细胞。
3.根据权利要求2所述的细胞片，其特征在于，所述体细胞是由成纤维细胞、软骨细胞、上皮细胞、肌上皮细胞、真皮细胞、上皮角质形成细胞、施万细胞、神经胶质细胞、成骨细胞、心肌细胞、巨核细胞、脂肪细胞、干细胞和癌细胞组成的组中选择的一个或以上。
4.根据权利要求1所述的细胞片，其特征在于，所述基因传递系统是包括(i)裸重组DNA分子(ii)质粒，(iii)病毒载体和(iv)所述裸重组DNA分子或质粒的脂质体或类脂囊泡形式。
5.根据权利要求4所述的细胞片，其特征在于，所述病毒载体是由重组腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、呼肠孤病毒、痘病毒、塞姆利基森林病毒和麻疹病毒组成的组中选择的一个或以上。
6.根据权利要求1所述的细胞片，其特征在于，所述基因传递系统为重组腺病毒。
7.根据权利要求6所述的细胞片，其特征在于，所述重组腺病毒为不可复制腺病毒或杀瘤腺病毒。
8.根据权利要求1所述的细胞片，其特征在于，导入基因传递系统的细胞层包括癌细胞或干细胞。
9.根据权利要求1所述的细胞片，其特征在于，所述细胞片包括：作为支撑体的细胞层，其包括体细胞；及细胞层，其包括癌细胞或干细胞，并且重组腺病毒被导入包括癌细胞或干细胞的细胞层。
10.根据权利要求1所述的细胞片，其特征在于，所述细胞片包括细胞层，所述细胞层包括导入有基因传递系统的包括癌细胞，所述癌细胞被放射线照射。
11.根据权利要求4所述的细胞片，其特征在于，所述病毒载体以0.1至500MOI的量被加载。
12.一种细胞片制备方法，该方法包括：
在包括温敏性聚合物的温度反应性培养皿中，形成包括两个或以上细胞层的细胞片；
在其中一个或以上的细胞层导入基因传递系统，且从温度反应性培养皿分离所述细胞片。
13.根据权利要求12所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述温敏性聚合物是由聚N-异丙基丙烯酰胺、聚N-乙烯基己内酰胺，聚己内酯和聚乳酸-共-乙醇酸酯组成的组里选择的一个或以上聚合物。
14.根据权利要求1所述的细胞片制备方法，其特征在于，形成细胞片，所述细胞片包括细胞层，所述细胞层作为支撑体包括包括体细胞。
15.根据权利要求14所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述体细胞是选自成纤维细胞、软骨细胞、上皮细胞、肌上皮细胞、真皮细胞、上皮角质形成细胞、施万细胞、神经胶质细胞、成骨细胞、心肌细胞、巨核细胞、脂肪细胞、干细胞和癌细胞中的一个或以上细胞。
16.根据权利要求12所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述基因传递系统是包括(i)裸重组DNA分子、(ii)质粒、(iii)病毒载体和(iv)所述裸重组DNA分子或质粒的脂质体或类脂囊泡形式。
17.根据权利要求16所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述病毒载体是选自重组腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、呼肠孤病毒、痘病毒、塞姆利基森林病毒和麻疹病毒中的一个或以上病毒载体。
18.根据权利要求12所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述基因传递系统为重组腺病毒。
19.根据权利要求18所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述重组腺病毒为不可复制腺病毒或杀瘤腺病毒。
20.根据权利要求12所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述基因传递系统导入的细胞层为包括癌细胞或干细胞。
21.根据权利要求12所述的细胞片制备方法，其特征在于，形成细胞层，所述细胞层作为支撑体包括体细胞，在所述细胞层形成包括癌细胞或干细胞的细胞层，将重组腺病毒导入到包括癌细胞或干细胞的细胞层。
22.根据权利要求20或21所述的细胞片制备方法，其特征在于，所述癌细胞被放射线照射。
23.根据权利要求16所述的细胞片制备方法，其特征在于，将所述病毒载体以0.1至500MOI的病毒量进行接种。
24.一种基因治疗剂，其包括根据权利要求1所述的细胞片。
25.根据权利要求24所述的基因治疗剂，其特征在于，其用于预防或治疗癌症。
26.根据权利要求24所述的基因治疗剂，其特征在于，其用于预防癌症复发或癌症转移。
27.根据权利要求25或26所述的基因治疗剂，其特征在于，所述癌选自多灶性肝细胞癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、喉癌、胰腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、卵巢癌、子宫癌、直肠癌、胃癌、近端癌、大肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或泌尿道癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤中的一种或以上。
28.一种癌症复发预防方法，其包括在去除癌症的手术部位移植根据权利要求1所述的细胞片的步骤。
29.一种癌症治疗方法，其包括在需要癌症治疗的部位移植根据权利要求1所述的细胞片的步骤。
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