JP2022086456A - 癌細胞捕集用多孔質体 - Google Patents

Abstract

【課題】生体適合性を有し、かつ生体内での安定性を有する癌細胞捕集用多孔質体を提供する。【解決手段】生体適合性無機材料を含む、癌細胞捕集用多孔質体。【選択図】なし

Description

本発明は、癌細胞捕集用多孔質体に関する。

日本人の死亡原因の第１位は、１９８１年以降、悪性腫瘍、いわゆる「癌」であり、現在、年間３０万人以上のヒトが癌でなくなっており、年間６０万人以上のヒトが新たに癌になっている。今後、日本は高齢化が進むにつれ、癌患者の人数はますます増えていくことが予測されている。

癌細胞の早期発見は、最適な治療および診断のための目標の一つである。しかし、転移や拡散が生じる前に癌細胞を検出することは、困難な場合もあり、また、転移や拡散が生じた後でさえ、癌細胞が検出されないこともある。よって、癌細胞の発見および診断が遅れ、癌細胞が全身に転移していて、手術ができない、また手術しても治せない場合は、抗がん剤による化学療法や特殊な放射線療法などの治療となる。

癌の転移のメカニズムとしては、原発巣から癌細胞の遊離、血流、リンパの流れ、また組織内の遊走に乗り標的臓器に漂着、組織への侵入、癌組織の増殖のプロセスを踏むことが知られている。癌の治療において、これらのプロセスのいずれかを阻害することが試みられている。例えば、特許文献１には、ポリカプロラクトンを含む多孔質体を用いて、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を捕集することで、癌の標的臓器への転移を抑制する技術が開示されている。

米国特許出願公開第２０１９／０００８９７１号明細書

しかしながら、特許文献１に記載の多孔質体は、生分解性の材料であるポリカプロラクトンで作製されている。そのため、長期にわたり埋植すると、転移性の癌細胞を捕集した多孔質体が生分解され、生体内に捕集した癌細胞を放出してしまうおそれがある。

本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、生体適合性を有し、かつ生体内での安定性を有する癌細胞捕集用多孔質体を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、生体適合性無機材料を含む、癌細胞捕集用多孔質体によって、上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。

本発明では、生体適合性を有し、かつ生体内での安定性を有する癌細胞捕集用多孔質体が提供される。

図１は、実施例の試験例１において、細胞接着試験の結果を示す光学顕微鏡写真である。 図２は、実施例の試験例１において、細胞接着試験の結果を示す走査型電子顕微鏡写真である。 図３は、実施例の試験例２において、細胞接着試験の結果を示す光学顕微鏡写真である（左側：癌細胞捕集用多孔質体、右側：平滑・緻密質スキャフォールド）。 図４は、実施例の試験例２において、細胞接着試験の結果を示す走査型電子顕微鏡写真である（左側：癌細胞捕集用多孔質体、右側：平滑・緻密質スキャフォールド）。 図５は、癌細胞捕集用多孔質体（上部左側）および平滑・緻密質スキャフォールド（上部右側）の光学顕微鏡写真、ならびに癌細胞捕集用多孔質体（下部左側）および平滑・緻密質スキャフォールド（下部右側）の表面粗さの測定結果を示す。 図６は、実施例の試験例３における手順の概略図（上側）および癌細胞捕集用多孔質体を埋設したマウスの写真（下側）である。 図７は、実施例の試験例４における癌細胞捕集用多孔質体を埋植した担癌マウスでの延命効果の評価結果を示すグラフである。

以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。

本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。

＜癌細胞捕集用多孔質体＞
本発明の一形態は、生体適合性無機材料を含む、癌細胞捕集用多孔質体に関する。本明細書中、「癌細胞捕集用多孔質体」を単に「本形態の多孔質体」とも称する。

本明細書において、「癌細胞捕集」とは、癌細胞が多孔質体の側面または気孔内部に癌細胞が接着することを意味する。

本明細書において、「多孔質体」とは、多数の気孔を含む固体物質または構造体を意味する。

本明細書において、「生体適合性」とは、長期間にわたって生体に悪影響も強い刺激も与えず、本来の機能を果たしながら生体と共存できる材料の属性を意味する。

本形態に係る生体適合性無機材料としては、上記生体適合性を有する無機材料であれば、特に制限されない。また、結晶性、非晶質であってもよく、無機ガラスであってもよい。生体適合性無機材料を用いることにより、有害事象を抑制でき、かつ生体内での分解を抑制し、安定性を確保することができる。

生体適合性無機材料としては、例えば、イットリア安定化ジルコニア、チタン、チタン合金、Ｎｉ－Ｔｉ等の形状記憶合金、シリカ、ケイ酸塩化合物、リン酸塩化合物（例えば、リン酸カルシウム化合物）、アルミナ、アルミニウム合金、コバルトクロム合金、ステンレス、ムライトなどが挙げられる。

一実施形態において、生体適合性無機材料は、好ましくはイットリア安定化ジルコニアである。イットリア安定化ジルコニアは、イットリアおよびジルコニアの合計に対して、好ましくは１～２０ｍｏｌ％のイットリアを含み、より好ましくは３～１０ｍｏｌ％のイットリアを含む。

一実施形態において、生体適合性無機材料は、好ましくはチタン、シリカ、アルミナ、コバルトクロム合金、ステンレスおよびムライトからなる群から選択される。当該コバルトクロム合金は、コバルトを主成分とし、クロム２５％以上、モリブデン４％以上、並びにコバルト、ニッケル及びクロムの合計が８５％以上その他添加物を主体とした金属である。

一実施形態において、癌細胞捕集用多孔質体は、癌細胞捕集用多孔質体表面に連通気孔を有する。連通気孔は、隣接する気孔同士がお互いに連結している気孔である。そのため、癌細胞が多孔質体の気孔内部へ入り込むことにより、より多くの癌細胞が接着することができる。すなわち、より多くの癌細胞を捕集することができる。

本形態の多孔質体の気孔内壁の表面性状は、特に制限されないが、凹凸を持ち、多孔質体の表面積を大きくする形態を有しているものが望ましい。

本形態の多孔質体の気孔率は、特に制限されないが、例えば４０～９５％であり、好ましくは６０～９５％であり、より好ましくは８０～９５％である。多孔質体の気孔率は、実施例に記載の方法によって測定した値を採用する。

本形態の多孔質体の平均気孔径は、転移性の癌細胞が入り込むことができれば、特に制限されない。多孔質体の平均気孔径は、例えば２０～１０００μｍであり、好ましくは１００～８００μｍであり、より好ましくは３００～５００μｍである。多孔質体の平均気孔径は、実施例に記載の方法によって測定した値を採用する。

本形態の多孔質体の開孔率は、特に制限されないが、例えば２０～９０％であり、好ましくは３０～８０％であり、より好ましくは３５～５０％である。多孔質体の開孔率は、実施例に記載の方法によって算出した値を採用する。

本形態の多孔質体において、捕集の対象となる癌の種類は、特に制限されない。例えば、神経系の癌（例えば、脳腫瘍、頚癌）；消化器系の癌（例えば、口腔癌、咽頭癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆道癌、脾臓癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、結腸癌、結腸腺癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌）；筋骨格系の癌（例えば、肉腫、骨肉種、骨髄腫）；泌尿器系の癌（例えば、膀胱癌、腎癌）；生殖器系の癌（例えば、乳癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌）；呼吸器系の癌（例えば、肺癌）；造血器系の癌（例えば、急性または慢性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性または慢性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫（リンパ肉腫）、血管肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、原発性骨髄線維症、血管外膜細胞腫）；甲状腺癌、副甲状腺癌、舌癌、悪性黒色腫（メラノーマ）、肥満細胞腫、皮膚組織球腫、脂肪腫、毛包腫瘍、皮膚乳頭腫、皮脂腺腫、基底細胞癌などが挙げられる。

一実施形態において、癌細胞は、転移性の癌細胞である。転移性の癌細胞は、特に限定されず、例えば上記癌由来の転移性の癌細胞であり、好ましくは乳癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌および脳腫瘍由来の転移性の癌細胞である。

本形態の多孔質体の形状および大きさは、特に制限されず、使用用途、使用目的、使用部位などに応じて適宜選択することができる。多孔質体の形状としては、例えば球状、円柱状、板状、棒状、筒状、格子状（例えば、ラティス構造）などが挙げられる。

［製造方法］
本形態の癌細胞捕集用多孔質体の製造方法は、特に制限されず、公知の多孔質セラミックスの製造方法を適宜参照することができる。

一実施形態において、本形態の癌細胞捕集用多孔質体の製造方法は、以下の工程を含む：
（１）生体適合性無機材料、分散剤、造孔剤および分散媒を混合して、分散体を調製する工程；
（２）前記分散体を型に充填し、凍結して、凍結体を得る工程；
（３）前記凍結体を乾燥して、乾燥体を得る工程；
（４）前記乾燥体を脱脂する工程；および
（５）脱脂した乾燥体を焼結する工程。

工程（１）では、生体適合性無機材料、分散剤、造孔剤および分散媒を混合して、分散体を調製する。

生体適合性無機材料としては、上記生体適合性無機材料の粉末を使用することができる。生体適合性無機材料の含有量は、分散体の全質量に対して、例えば２０～５０質量％であり、好ましくは３０～４０質量％である。

生体適合性無機材料の粉末の平均粒径は、例えば０．０１～５μｍであり、好ましくは０．０１～０．１μｍである。平均粒径は、レーザー回折式粒子径分布測定装置を用いて測定することができる。

分散剤は、生体適合性無機材料の分散に寄与するだけではなく、連通気孔を形成するためにも用いられる。分散剤としては、水溶性高分子を使用することができる。このような水溶性高分子としては、例えば多糖類およびその誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸のナトリウム塩、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。水溶性ポリマーは、本発明の効果をより発揮するとの観点から、多糖類であることが好ましい。

多糖類の例としては、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、メチルセルロース、セルロースエーテル、ヒドロキシエチルセルロース、変性デンプン、デキストラン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。多糖類は、より好ましくはヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、メチルセルロース、セルロースエーテルおよびヒドロキシエチルセルロースから選択され、特に好ましくはヒドロキシプロピルセルロースである。

分散剤の含有量は、分散体の全質量に対して、例えば０．５～５質量％であり、より好ましく１～３質量％である。

造孔剤は、気孔を生成させる機能を有する。造孔剤としては、例えば樹脂ビーズを使用することができる。樹脂ビーズとしては、アクリル製、ウレタン製などの樹脂ビーズが挙げられる。

造孔剤の形状は、特に制限されないが、好ましくは球状である。

造孔剤の大きさは、特に制限されず、所望の気孔が得られるように、適宜選択することができる。

造孔剤の含有量は、分散体の全質量に対して、例えば３０～６０質量％であり、好ましくは３５～５０質量％である。

分散媒は、好ましくは水である。水としては、例えば水道水、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水などを使用することができる。なかでも、不純物が少ないとの観点から、分散媒は、好ましくは純水または超純水である。また、分散媒として水に無機塩を含有したものであってもよい。

分散媒の含有量は、分散体の全質量に対して、例えば１５～４０質量％であり、好ましくは２０～３０質量％である。

生体適合性無機材料、分散剤、造孔剤および分散媒を混合する方法は、特に制限されず、分散体中で生体適合性無機材料および造孔剤がよく分散するように、従来公知の知見を適宜参照することができる。例えば、生体適合性無機材料、分散剤および分散媒を撹拌混合して、生体適合性無機材料が均一に分散されたスラリーを調製する。撹拌混合の際、必要に応じて加熱してもよい。その後、調製したスラリーに造孔剤を添加し、混和することにより分散体を調製することができる。

生体適合性無機材料、分散剤、造孔剤および分散媒の混合比（質量比）を調整することにより、気孔率、開孔率、平均気孔径などを制御することができる。

工程（２）では、工程（１）で調製した分散体を型に充填し、凍結して、凍結体を得る。

型の形状、大きさなどは、特に制限されず、多孔質体の用途に応じて、適宜選択することができる。

型の材質は、特に制限されず、アルミナ、ステンレス鋼、鉄、銅、アルミニウム、プラスチック、紙などを使用できる。

型に充填した分散体を凍結することで、氷の結晶が成長し、氷の結晶による組織構造が形成される。これにより、生体適合性無機材料と分散剤溶液の部分と氷の結晶の部分とからなる凍結体を得ることができる。

凍結温度は、使用する分散媒に応じて、適宜選択することができる。凍結温度は、例えば－１０℃以下であり、好ましくは－３０℃以下である。

工程（３）では、工程（２）で得られた凍結体を乾燥して、乾燥体を得る。凍結体を乾燥（例えば、凍結乾燥、真空乾燥）させることにより、氷の結晶が昇華して消失し、代わりに気孔が形成される。

工程（４）では、工程（３）で得られた乾燥体を脱脂する。本工程により、乾燥体から分散媒、造孔剤などの有機成分を除去する。具体的には、使用する生体適合性無機材料の種類に応じて、あらかじめ定められた温度条件下で有機成分を分解して除去する。脱脂温度としては、例えば３００～９００℃である。脱脂時間は、有機成分を分解により除去できるように、適宜調整することができる。

工程（５）では、脱脂した乾燥体を焼結する。焼結温度、焼結時間、焼結雰囲気などは、使用する生体適合性無機材料、気孔率などに応じて、適宜調整することができる。焼結温度は、例えば生体適合性無機材料としてイットリア安定化ジルコニアを使用する場合、１０００～１７００℃であり、生体適合性無機材料としてアルミナを使用する場合、１０００～１７００℃である。

このようにして、本発明に係る多孔質体を製造することができる。

［用途］
本形態の癌細胞捕集用多孔質体は、治療、治療補助、検査、診断などの癌に関する用途に使用することができる。特に、本形態の癌細胞捕集用多孔質体は、治療または治療の補助用途に好適である。具体的には、本形態の癌細胞捕集用多孔質体を被験体の体内に埋め込み、転移性の癌細胞を捕集するために使用することができる。

本発明者らは、本形態の多孔質体に癌細胞が接着することを見出した（後述の試験例１および２）。そして、本形態の多孔質体をマウスに移植する実験により、多孔質体に起因する有害事象が生じないことを確認した（後述の試験例３）。さらに、本形態の多孔質体を埋植した担癌マウスにおいて、原発巣を摘出した後、延命効果が得られることを確認した（後述の試験例４）。

本発明の一実施形態は、生体適合性無機材料を含み、被験体に移植するための癌捕集用多孔質体に関する。

また、本発明の一実施形態は、癌細胞を捕集するため、好ましくは被験体に移植して癌細胞を捕集するための多孔質体の使用であって、前記多孔質体は、生体適合性無機材料を含む、使用に関する。

本明細書において、「被験体」としては、例えば哺乳類、鳥類などであり、好ましく癌に罹患したまたは癌の罹患が疑われる哺乳類および鳥類である。ここで、哺乳類は、ヒト、サル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン等の霊長類、ならびにマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラクダ、ヤギなどの非ヒト哺乳動物双方を包含する。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、ハトなどが挙げられる。これらのうち、好ましくはヒト、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタであり、より好ましくはヒト、またはイヌ、ネコ、ウサギ等のペット動物である。

本形態の癌捕集用多孔質体を移植（埋設）する部位は、特に制限されないが、好ましくは皮下、筋肉内、腹腔内、または腫瘤摘出部位である。また、癌捕集用多孔質体は、被験体の１以上の部位に移植することができる。

＜癌細胞捕集用インプラント＞
上述のとおり、本形態の癌細胞捕集用多孔質体は、被験体に移植して使用することができる。よって、本発明の一実施形態は、上述の癌細胞捕集用多孔質体を含む、癌細胞捕集用インプラントに関する。

癌細胞捕集用インプラントは、好ましくは被験体に移植して、前記被験体内で転移性の癌細胞を捕集するために用いられる。

本明細書において、「インプラント」とは、外科的方法または低侵襲性の方法によって被験体に移植される器具、より具体的には完全にまたは部分的に被験体の体内に埋め込まれる器具を意味する。

一実施形態において、癌細胞捕集用インプラントは上述の癌細胞捕集用多孔質体からなる。

本実施形態の癌細胞捕集用インプラントを移植する部位は、特に制限されないが、好ましくは皮下、筋肉内、腹腔内、または腫瘤摘出部位である。また、癌捕集用インプラントは、被験体の１以上の部位に移植することができる。

癌細胞捕集用インプラントは、癌細胞捕集用多孔質体に加えて、薬剤をさらに含んでもよい。本明細書において、「薬剤」とは、治療目的で使用可能な任意の化合物を意味する。

薬剤としては、例えばタンパク質医薬品、アルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗剤、ホルモン剤、プラチナ製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、血管新生阻害剤などが挙げられる。

タンパク質医薬品としては、例えばペプチド、酵素、構造タンパク質、レセプター、サイトカイン、ケモカイン、造血因子、成長因子などが挙げられる。具体例としては、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７／ＣＣＬ２１、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２／ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α／ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ－１α、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、肝細胞増殖因子アクチベーター（ＨＧＦＡ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）、ＣＸＣＬ１４、プロスタグランジンＥ２、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などが挙げられる。

アルキル化剤としては、例えば、マスタード類、ニトロソ尿素類、トリアゼン類、およびエチレンイミンなどが挙げられる。より具体的には、シクロホスファミド、イホスファミド、ブスルファン、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、グルフォスファミド、マフォスファミド、エストラムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、トラベクテジン、アパジコン、アルトレタミン、ベンダムスチン、ミトラクトールなどが挙げられる。

抗生物質としては、例えばアントラサイクリン系抗生物質（例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、アムルビシン、ゾルビシン、バルルビシン、リポソーマルドキソルビシン、ピクサントロン、およびミトキサントロンなど）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、アクチノマイシンＤ、ジノスタチンスチマラマーなどが挙げられる。

代謝拮抗剤としては、例えば、ピリミジン類似体、プリン類似体、葉酸類似体、リボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤、およびＤＮＡポリメラーゼ阻害剤などが挙げられる。より具体的には、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、テガフール、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、アザシチジン、デシタビン、フロクスウリジン、エチニルシチジン、６－メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、ネララビン、６－チオグアニン、クラドリビン、クロファラビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、ノラトレキセド、プララトレキサート、トリメトレキサート、イダトレキサート、ヒドロキシカルバミドなどが挙げられる。

ホルモン剤としては、例えば抗エストロゲン薬、アロマターゼ阻害剤、プロゲステロン誘導体、抗アンドロゲン薬、副腎皮質ホルモン剤、ＬＨＲＨ（黄体ホルモン放出ホルモン）アゴニストなどが挙げられる。より具体的には、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、アミノグルテチミド、ホルメスタン、ボロゾール、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、ゲストノロン、メピチオスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、クロルマジノン、エストラムスチン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、リン酸ポリエストラジオール、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ミトタン、ゴセレリン、リュープロレリン、ブセレリン、トリプトレリンなどが挙げられる。

プラチナ製剤としては、例えばシスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン（Ｏｘ）、サトラプラチン、ミリプラチン、ロバプラチン、スピロプラチン、テトラプラチン、オルマプラチン、イプロプラチンなどが挙げられる。

トポイソメラーゼ阻害剤としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などが挙げられる。より具体的には、トポテカン、イリノテカン、エキサテカン、ノギテカン、上記のアントラサイクリン系抗生物質、エトポシド、テニポシド、ゾブゾキサンなどが挙げられる。

微小管阻害剤としては、例えばビンカアルカロイドおよびタキサン化合物などが挙げられる。より具体的には、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンフルニン、モノメチルアウリスタチンＥ、エポチロンＢ、エリブリン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセルなどが挙げられる。

血管新生阻害剤としては、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体などのＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤等の血管新生シグナル阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤などが挙げられる。より具体的には、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ＭＶ８３３、セツキシマブ、ペガプタニブ、パゾパニブ、ＣＢＯ－Ｐ１１、スニチニブ、ソラフェニブ、ラニビズマブ、バタラニブ、アキシチニブ、ザクティマ、ＮＸ１８３８、アンジオザイム、セマキサニブ、レスタウルチニブ、ＴＳＵ－６８、ＺＤ４１９０、テムシロリムス、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＮＰ－４７０、ＣＰ－５４７６３２、ＣＰＥ－７０５５、ＫＲＮ６３３、ＡＥＥ７８８、ＩＭＣ－１２１１Ｂ、ＰＴＣ－２９９、Ｅ７８２０、レンバチニブ、マリマスタット、ネオバスタット、プリノマスタット、メタスタット、ＢＭＳ－２７５２９１、ＭＭＩ２７０、Ｓ－３３０４、ビタキシン、オロチン酸カルボキシアミドトリアゾール、サリドマイド、ゲニステイン、インターフェロンα、およびインターロイキン１２などが挙げられる。

＜転移性の癌細胞を捕集する方法＞
本発明の一形態は、上述の癌細胞捕集用インプラントを被験体の体内に埋め込むことを含む、転移性の癌細胞を捕集する方法に関する。

本形態に関する各要件は、上述の癌細胞捕集用多孔質体および癌細胞捕集用インプラントと同様であるため、説明を省略する。

以下、実施例を用いて本発明の実施形態をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に限定されるわけではない。

＜癌細胞捕集用多孔質体の作製：実施例＞
超純水５ｇとヒドロキシプロピルセルロース０．５ｇとの混合液に、イットリア安定化ジルコニア粉末（ＴＺ３Ｙ、東ソー株式会社）１２．１ｇを添加して、ホットプレートスターラーを用いて加熱撹拌した（６０～７０℃）。撹拌後、樹脂ビーズ（Ｓ－４０、積水化成品工業株式会社）１５ｇを添加して、混和した。この混和物をアルミナ環（管）（直径９．０ｍｍ、厚さ２．７ｍｍ）に充填し、－３０℃で凍結した後、凍結乾燥装置で２４時間乾燥した。大気雰囲気下の電気炉にて８００℃で２時間脱脂（１℃／ｍｉｎ昇温）した後、電気炉にて１４００℃で６時間焼成（５℃／ｍｉｎ昇温）して、癌細胞捕集用多孔質体（多孔質スキャフォールド、直径６．７ｍｍ、厚さ２．１ｍｍ）を作製した。

（気孔率の測定）
作製した癌細胞捕集用多孔質体の体積（直径および厚さの実測より計算）と重量とを求め、癌細胞捕集用多孔質体の重量とイットリア安定化ジルコニアの比重から算出される同体積の緻密体の重量との比から気孔率を算出した。

作製した癌細胞捕集用多孔質体の気孔率は、８５％であった。

（平均気孔径の算出）
電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＭ）画像から観察される気孔の直径を測定し、これらの測定値から平均気孔径を算出した。

作製した癌細胞捕集用多孔質体の平均気孔径は、４００μｍであった。

（開孔率の算出）
電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＭ）画像から開口部の面積を測定し、単位面積当たりの開口部の面積割合を開孔率とした。

作製した癌細胞捕集用多孔質体の開孔率は、５０％であった。

＜平滑・緻密質スキャフォールドの作製：比較例＞
イットリア安定化ジルコニア粉末（ＴＺ３Ｙ、東ソー株式会社）０．８ｇを直径１７．５ｍｍΦのプレス治具に詰めて一軸加圧成形（２００Ｍｐａ、１ｍｉｎ）した後、冷間等方圧加圧（２００Ｍｐａ、１ｍｉｎ）を行った。大気雰囲気下の電気炉にて１４００℃で１時間焼成（５℃／ｍｉｎ昇温）して、平滑・緻密質スキャフォールド（直径１３．５ｍｍ、厚さ１．２±０．２ｍｍ）を作製した。

＜細胞懸濁液の調製＞
マウス乳腺癌由来４Ｔ１細胞を培養培地（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０）で培養して、細胞懸濁液を調製した。

＜試験例＞
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける癌細胞捕集用多孔質体への細胞接着の評価
１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液をΦ３５ｍｍの培養皿に２ｍＬ播種した。滅菌済みの癌細胞捕集用多孔質体を細胞懸濁液中に浸漬した。その後、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２環境で２時間インキュベートした後、癌細胞捕集用多孔質体を別の培養皿に移し、培養培地（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０）を２ｍＬ添加した。３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２環境で１週間培養した。培養後、光学顕微鏡（倍率：１００倍）にて細胞接着の様子を観察した。また、培養後の癌細胞捕集用多孔質体を固定・凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡（倍率：１０００倍）にて観察した。結果を図１および２に示す。

図１に示すように、癌細胞捕集用多孔質体の側面に癌細胞が多量に接着することが分かる。また、図２に示すように、癌細胞捕集用多孔質体の断面（内部）に癌細胞が仮足を延ばして接着することが分かる。

２．細胞接着における多孔質面の必要性の評価
滅菌済みの癌細胞捕集用多孔質体または平滑・緻密質スキャフォールドの上に１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を５００μＬ滴下した。その後、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２環境で２時間インキュベートした後、癌細胞捕集用多孔質体または平滑・緻密質スキャフォールドを別の培養皿に移し、培養培地（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０）を２ｍＬ添加した。３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２環境で１週間培養した。培養後、光学顕微鏡（倍率：１００倍）にて細胞接着の様子を観察した。また、培養後の癌細胞捕集用多孔質体または平滑・緻密質スキャフォールドを固定・凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡（倍率：１０００倍）にて観察した。結果を図３および４に示す。

また、試験前の癌細胞捕集用多孔質体および平滑・緻密質スキャフォールドの表面を光学顕微鏡（倍率：１００倍）にて観察し、さらに表面粗さを実体顕微鏡（キーエンス株式会社製）を用いて測定した。結果を図５に示す。

図３に示すように、癌細胞捕集用多孔質体の側面に癌細胞が多量に接着することが分かる。一方、平滑・緻密質スキャフォールドの側面には、癌細胞がほぼ接着しないことが分かる。

また、図４に示すように、癌細胞捕集用多孔質体の断面（内部）に癌細胞が多量に接着することが分かる。一方、平滑・緻密質スキャフォールドの側面には、癌細胞がほぼ接着しないことが分かる。

図５に示すように、癌細胞捕集用多孔質体は多孔を有するため表面が粗面であり、一方平滑・緻密質スキャフォールドは緻密および平滑面を有することが分かる。よって、図３～５より、細胞接着には、多孔および粗面を有することが有効であることが分かる。

３．Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるマウスへの埋植安全性評価
全身麻酔した８週齢のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、日本エスエルシー株式会社より購入）の背面を図６に従い剃毛した。メスを用いて最後肋骨縁より頭側１ｃｍ部分を短軸に沿って１．５ｃｍ切開した。切開線より尾側へ皮下を剥離し、スキャフォールドを切開部から挿入し留置した後、切開部を縫合。反対側についても同様に実施した。最長２か月埋植状態を観察し、マウスの健康状態に異常がないこと、および埋植部位に異常がないことを目視にて確認した。

なお、マウスを用いた動物実験に関しては、大阪府立大学動物実験規程第８条、第９条および第１１条の規定に基づき実施した（承認番号：動物実験１９－１６５号）。

４．癌細胞捕集用多孔質体を埋植した担癌マウスでの延命効果の評価
上記３と同様にして、マウスに癌細胞捕集用多孔質体を埋植した。埋植１か月後に以下の手順で癌細胞を移植した。

（１）全身麻酔をしたマウスの腹部を剃毛した；
（２）右後肢付け根から体軸側に約５ｃｍ移動した部分を長軸に沿って１ｃｍ切開した；
（３）切開部から第４乳腺脂肪組織を露出した；
（４）乳腺脂肪部にツベルクリンシリンジに充填したマウス乳腺癌由来４Ｔ１細胞懸濁液を注入した；
（５）乳腺脂肪を皮下に戻し縫合した。

がん細胞移植１０日後に手順（２）同様に全身麻酔したマウス乳腺部を切開し原発巣を摘出した後、縫合した。

マウスの健康状態を観察しながら飼育し、コントロール（非スキャフォールド埋植）群との生存期間を比較した（各群ｎ＝２０、原発巣摘出日＝０日）。ただし、原発巣での再増殖が見られたマウスについて、分析から除外した。

結果を図７に示す。図７中、Ｚｒ群は、癌細胞捕集用多孔質体を埋植したマウス群であり、Ｍｏｃｋ群は、コントロール群である。

図７に示すように、実施例の癌細胞捕集用多孔質体を埋植することにより、担癌マウスでの延命効果を得られることが分かる。

Claims (11)

1. 生体適合性無機材料を含む、癌細胞捕集用多孔質体。
2. 前記生体適合性無機材料がイットリア安定化ジルコニアである、請求項１に記載の癌細胞捕集用多孔質体。
3. 前記生体適合性無機材料がチタン、シリカ、アルミナ、コバルトクロム合金、ステンレスおよびムライトからなる群から選択される、請求項１に記載の癌細胞捕集用多孔質体。
4. 連通気孔を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の癌細胞捕集用多孔質体。
5. 気孔率が４０～９５％である、請求項１～４のいずれか１項に記載の癌細胞捕集用多孔質体。
6. 平均気孔径が２０～１０００μｍである、請求項１～５のいずれか１項に記載の癌細胞捕集用多孔質体。
7. 開孔率が２０～９０％である、請求項１～６のいずれか１項に記載の癌細胞捕集用多孔質体。
8. 前記癌細胞が転移性の癌細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の癌細胞捕集用多孔質体。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の癌細胞捕集用多孔質体を含む、癌細胞捕集用インプラント。
10. 被験体に移植して、前記被験体内で転移性の癌細胞を捕集するために用いられる、請求項９に記載の癌細胞捕集用インプラント。
11. 請求項９または１０に記載の癌細胞捕集用インプラントを被験体の体内に埋め込むことを含む、転移性の癌細胞を捕集する方法。

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