JP2017514902A - 薬剤、産物および使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、腫瘍細胞播種、特に転移性癌細胞をモジュレートするための組成物に関する。特に、本発明は、転移性癌の治療および/または予防に使用する転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤に関し、薬剤は、ポリカーボネートポリウレタン基材上に保持された細胞外基質(ECM)タンパク質である。本発明は、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を含む産物、および癌の治療または予防の方法にも関する。【選択図】 図13
Description
本発明は、癌細胞、特に転移性癌細胞の播種をモジュレートする薬剤、および癌の治療または予防における薬剤の使用に関する。組成物は、癌細胞、特に転移性癌細胞を捕捉および/または誘引することができる。本発明は、癌の治療または予防の方法にも関する。
転移の過程は、癌関連死の90%以上と関連しており、腫瘍学における主要な課題の代表である。原発性疾患は、手術および/または放射線治療を適正に利用することができ、優れた予後をもたらす化学療法に対して許容可能な応答を示すが、転移性播種は手術および放射線治療の禁忌を伴っており、特に化学療法に抵抗性であり、非常に悪い予後をもたらす。
近年、転移の過程は、浸潤性腫瘍細胞が、周囲の間質および組織を浸潤し、血管内侵入して血流中で生存し、血管外遊出して離れた器官に微小転移巣を生成する能力を獲得する段階的過程と特徴付けられてきた。一般に、一次病巣からの腫瘍細胞播種には、血管およびリンパ管を通る転移性腫瘍細胞の全身的播種、ならびに環境中への転移性腫瘍細胞の放出または移動/浸潤による局所性播種という2つの主要な方法がある。原発性腫瘍から血流に播種する腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞(CTC)として公知であり、転移の主要な原因である。血管およびリンパ管を経由する播種の場合、腫瘍細胞は、周囲の間質の移動および浸潤(上皮間葉転換)を可能にする浸潤性の表現型を獲得し、内皮細胞を誘引し、腫瘍に栄養分を与える新たな血管を形成するだけでなく播種の経路も生成することによって血管新生を活性化しなければならず、次いで、腫瘍細胞は新たな血管に浸潤および合体し(血管内侵入)、血管に付着および離れる(溢出する)ことになる生物のそれらの部位に播種し、最終的に、これらの転移性腫瘍細胞はニッチを確立し、転移性病巣へ進行することになる微小転移巣を生成できるようになるという見解で一致している。全体の過程は極めて非効率的であるが、致死性が著しく高い。あるいは、播種は、細胞移動および周囲の間質および器官の浸潤によって、または腫瘍細胞が、腹膜腔へ曝露され、放出される卵巣癌と同様に、腹水液中への転移性細胞の取り込みならびに腹膜および腔に接近可能な器官における移植によって起きる可能性もある。
転移の過程を決定する分子および細胞基盤は、原発性腫瘍と環境との強い対話を示唆する(Sleeman,JPら、Semin Cancer Biol.2012;22(3):174〜86)。組織特異的転移(Nguyenら.Nat Rev Cancer.2009;9(4):274〜84)および前転移性ニッチ(Psaila&Lyden、Nat Rev Cancer.2009;9(4):285〜93)は、定着するのに最も適切な部位の決定における癌腫の能動的役割について例示し始めている概念であり:腫瘍および環境から発せられるシグナルは、一次病巣から播種される腫瘍細胞の受け入れに有利に働くように標的した組織の再形成を支配してもよい。
本発明の目的は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞と宿主との連絡に干渉して、転移性播種の様式をモジュレートできるようにすることである。特定の態様において、本発明は、そのような細胞を物理的に閉じ込めることによっておよび/またはそのような細胞のホーミングに優先的な部位を提供することによって作動してもよい。
第1の側面によると、本発明は、癌の治療および/または予防に使用するための腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤であって、細胞外基質タンパク質(ECM)または接着分子および網状エラストマー性基材を含む、薬剤を提供する。
本発明は、細胞外基質タンパク質(ECM)または接着分子および網状エラストマー性基材を含む、癌の治療および/または予防における腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の使用も提供する。
本発明は、癌の治療ならびに/または予防のための薬物もしくは医療用デバイスの調製における、細胞外基質タンパク質(ECM)または接着分子および網状エラストマー性基材を含む腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の使用もさらに提供する。医療用デバイスは、非薬理学的作用機序を有してもよい。
好ましくは、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートするものである。好ましくは、薬剤は、転移性癌の治療および/または予防に使用するものである。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、腫瘍細胞播種の天然の過程に干渉するように、好ましくは細胞を特定の部位、好ましくは腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の位置に誘引または捕捉する目的でそのような細胞の挙動をモジュレートするように作用してもよい。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞に対する化学誘引物質として作用してもよい。転移性腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞であってもよい。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞もしくは原発性腫瘍から播種される任意の細胞を捕捉または閉じ込めることを目的としてもよい。薬剤は、たとえば腫瘍細胞に付着することにより腫瘍細胞の捕捉を直接媒介してもよく、または宿主中の特定の部位において腫瘍細胞の接着を改善する間接的効果を有してもよい。
網状エラストマー性基材は、ポリカーボネートポリウレタン基材であってもよく、基材の重合体は、架橋されていてもよく;重合体は、分子構造内に尿素を含有していてもよい。
本発明に使用する薬剤は、腫瘍細胞を物理的に捕捉および閉じ込めることがさらにできてもよく、薬剤は、腫瘍細胞が付着する接着材料であってもよい。
薬剤は、転移性細胞を付着および固定するのに望ましい基質を提供することによって細胞を捕捉/閉じ込めてもよい。この基質は、細胞が接着構造、たとえば接着点、密着結合、固着結合、ギャップ結合等を形成できる場合、固体の2Dもしくは3D重合体表面、または化学修飾した表面、もしくは模様をつけた表面、もしくはゲル、もしくはヒドロゲル等であってもよい。
薬剤は、2Dまたは3D多孔質構造を含んでいてもよい。一態様において、捕捉薬剤は、3D多孔質性組織足場型材料であってもよい。薬剤は、3D多孔質網目状構造であってもよい。
2Dもしくは3D表面または構造は、網状エラストマー性基材、たとえばポリカーボネートポリウレタン基材により提供されてもよく、好ましくは1つ以上のECMタンパク質がその中に含有または保有される。ポリカーボネートポリウレタン構造は、尿素で架橋されていてもよい。
薬剤は、尿素部分および追加の架橋を持つポリカーボネートポリウレタン基材、たとえばSigma Aldrich、USAのBiomerix(商標)3D Scaffoldを含んでいてもよい。
1つ以上のECMタンパク質が、網状エラストマー性基材、たとえばポリカーボネートポリウレタン基材中に物理的および/もしくは化学的に含有または保有されていてもよい。ECMタンパク質は、基材の中に恒久的に含有されてもよく、または制御されたもしくは制御されない方式で放出されてもよい。
本発明の薬剤は、網状エラストマー性基材の2Dもしくは3D足場、たとえばポリカーボネートポリウレタン基材を含んでもよく、表面への腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞の付着を改善するために、その基材は、ECMタンパク質によってデコレーションされるまたはそれを中に封埋している。ECMタンパク質は、細胞−細胞接着または細胞−基質接着を媒介してもよい。加えて、薬剤は、移植の部位の細胞構造を再形成することによって本発明の移植の部位を再形成することにより、または細胞外基質を再形成することにより、異物反応もしくは炎症性反応によって部位を再形成する(Andersonら.Semin Immunol 2008)ことにより転移性細胞を捕捉/閉じ込めてもよい。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞もしくは原発性腫瘍から播種される任意の細胞に対する化学誘引物質をあるいは、またはさらに含んでもよい。
いくつかの態様において、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、したがって腫瘍細胞に対する捕捉薬剤と化学誘引物質の両方として作用してもよい。
有用な化学誘引物質は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞を誘引する能力があるどんな薬剤であってもよい。腫瘍細胞は、中間細胞(すなわち免疫細胞または幹細胞)の誘引力によって直接的または間接的に誘引されてもよい。たとえば、本発明の薬剤の移植は、転移性癌細胞に対する追加の化学走性効果を提供する炎症性反応を生成してもよい。さらに、本発明の薬剤により誘引される腫瘍細胞は、それ自体が、他の腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞に対してさらなる化学走性効果を提供してもよい。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、エクソソームを含めた細胞から得られる小胞をさらに含んでもよい。エクソソームは、血液、尿および腹水液を含めた多くの、おそらく全ての生体液に存在する細胞由来の微小胞である。それらは30〜100nmの直径を一般に有する。それらは、正常な生理的過程において多くの細胞型によって放出される;しかしながら、腫瘍は、大量のエクソソームを異常に分泌するように見える。本発明に使用するエクソソームは、体液、たとえば血液もしくは尿から得られてもよく、または生物中の多くの異なる細胞型から得られてもよい。エクソソームが精製される体液は、健康なドナー由来であってもよい。本発明に使用するエクソソームは、癌細胞、たとえば卵巣癌細胞によって分泌されていてもよく;あるいは、または加えて、エクソソームは非癌細胞、たとえば間葉系幹細胞によって分泌されていてもよい。非癌細胞由来エクソソームを使用することが、好ましくてもよい。
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、卵巣癌の対象由来の腹水液をさらに含んでいてもよい。腹水液は、エクソソームを含んでいてもよい。捕捉薬剤または化学誘引物質は、卵巣癌の対象の腹水液から得られるエクソソームであってもよい。
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、間葉系幹細胞自体、または実際に別の形態の幹細胞をさらに含んでもよく、好ましくはヒト胚性幹細胞でない。脂肪、臍帯または骨髄起源の間葉系幹細胞を、化学誘引物質として使用してもよい。
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、細胞接着分子、たとえばセレクチン、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーのメンバー、インテグリンもしくはカドヘリンをさらに含んでもよい。細胞接着分子は、エクソソーム、たとえばCD9および/またはCD81と関連して見出されてもよい。
あるいは、またはさらに、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、1つ以上のケモカインならびに/もしくは1つ以上の成長因子、たとえば1つ以上のSDF1、90K、オステオポンチン、EGF、TGFb1、FGFおよびIGFをさらに含んでもよい。一態様において、化学誘引物質はEGF、TGFb1およびFGFの組合せを含む。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、細胞接着分子、カルシウム非依存性IgSF、CAM、N−CAM(ミエリンタンパク0)、ICAM(1、5)、VCAM−1、PE−CAM、L1−CAM、ネクチン(PVRL1、PVRL2、PVRL3)、インテグリン、LFA−1(CD11a+CD18)、インテグリンαXβ2(CD11c+CD18)、マクロファージ−1抗原(CD11b+CD18)、VLA−4(CD49d+CD29)、糖タンパク質IIb/IIIa(ITGA2B+ITGB3)、カルシウム依存性カドヘリン、古典的なCDH1、CDH2、CDH3、接着斑デスモグレイン(DSG1、DSG2、DSG3、DSG4)、デスモコリン(DSC1、DSC2、DSC3)、プロトカドヘリン、PCDH1、PCDH15、非在来型/未分類のT−カドヘリン、CDH4、CDH5、CDH6、CDH8、CDH11、CDH12、CDH15、CDH16、CDH17、CDH9、CDH10、セレクチン、E−セレクチン、L−セレクチン、P−セレクチン、他のリンパ球ホーミング受容体、CD44、L−セレクチン、インテグリン(VLA−4、LFA−1)、癌胎児性抗原、CD22、CD24、CD44、CD146、CD164、細胞外基質(ECM)の成分としてのタンパク質およびグリコサミノグリカン:ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブリリン、フィブロネクチンならびにラミニンを含むリストから選択される1つ以上の接着分子または細胞外基質成分を好ましくは含む。
薬剤は、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブリリン、フィブロネクチンおよびラミニンの1つ以上を含む細胞外基質(ECM)の成分を含んでいてもよい。薬剤は、コラーゲンおよび/またはフィブロネクチンを含んでいてもよい。
含まれる場合、さらなる化学誘引物質は、本発明の薬剤の基材にもしくはその中に付着したままであってもよく、または基材から放出もしくは浸出されて基材の周囲に化学誘引物質の勾配が形成されてもよい。
薬剤は、ヒトまたはヒト以外の動物中に配置した際に容認できない免疫応答を引き起こさないように、生体適合性である。いくつかの態様において、薬剤は、留置部位においてわずかな免疫応答、たとえば炎症性免疫応答または異物反応を伴ってもよい。
薬剤は、上記の通り多孔性基材を含んでいてもよい。基材は、2Dまたは3D多孔性構造であってもよい。一態様において、基材は、3D多孔性組織足場型材料であってもよい。基材は、3D多孔性網目状構造であってもよい。
薬剤が、化学誘引物質を含み、その物質が1つ以上のECMタンパク質であってもまたはそうでなくてもよい場合、薬剤は、基本的に、経時的に化学誘引物質を放出することにより化学誘引物質の勾配を形成してもよい。化学誘引物質は、制御されたまたは制御されない方式で放出されてもよい。化学誘引物質の放出は、能動的もしくは受動的またはその両方であってもよい。化学誘引物質は、1つ以上のECMタンパク質であってもよい。
好ましくは、薬剤は、使用の際、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくはより多くの化学誘引物質およびもしくはECMタンパク質を少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間またはより長く保持する。好ましくは、薬剤は非常に安定であり、ECMタンパク質は有意に放出されず、使用する際に好ましくはECMタンパク質の80%超が基材中または上に少なくとも1週間保持される。別の態様において、使用する際にECMタンパク質の80%超は、基材中または上に少なくとも1ヵ月間保持される。別の態様において、使用する際にECMタンパク質の80%超は、基材中もしくは上に少なくとも3ヵ月間または6ヵ月間保持される。別の態様において、使用する際にECMタンパク質の80%超は、基材中または上に少なくとも12ヵ月間保持される。
薬剤は、使用の際、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくはより多くの化学誘引物質およびもしくはECMタンパク質を少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間またはより長い間放出してもよい。
薬剤は、使用の際、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間またはより長く化学誘引物質の勾配を形成してもよい。
好ましくは、本発明の薬剤は、対象における転移性播種を防止するのに十分な期間腫瘍細胞の播種をモジュレートするのに十分な化学誘引物質を放出して、局所性播種および/または全身性播種に対して有効な化学誘引物質の勾配を生成することができる。
本発明の薬剤は、たとえば、重量で約10%〜約98%、好ましくは約80%、好ましくは重量で少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%またはより多くのECMタンパク質を含有してもよい。
本発明の薬剤は、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤、たとえば捕捉薬剤および/または化学誘引物質を0.1ng〜10mg含有してもよい。好ましくは腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤、たとえば捕捉薬剤および/または化学誘引物質を0.1ng〜1mgまたは0.1ng〜100μg含有する。捕捉薬剤がコラーゲンである場合、コラーゲンは、約0.1μg〜1mg、たとえば約25μg〜500μg、たとえば250μg存在してもよい。
本発明の薬剤は、化学療法剤、たとえば細胞増殖抑制剤をさらに含んでいてもよい。細胞増殖抑制剤は、細胞成長および増加を阻害または抑制する能力がある薬理活性化合物である。作用の機構および化合物の用量によって、それは細胞毒性剤を表してもよい。特に、細胞増殖抑制剤は、腫瘍細胞、好ましくは転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞を死滅させるもしくは成長を阻害する能力がある化合物であってもよい。
細胞増殖抑制剤は、たとえば:
(a)アントラサイクリンならびにその類似体、たとえばダウノマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、バルルビシン、アクラシノマイシンおよびミトキサントロン;
(b)代謝拮抗薬、たとえばゲムシタビン、シトシンアラビノシド、シタラビン、ビダラビン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン、メトトレキサート、フロクスウリジン、フルオロウラシルおよび他のフッ化ピリミジン、プリンまたはヌクレオシド;
(c)アルキル化剤、たとえばシクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドを含めたナイトロジェンマスタード;カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシンを含めたニトロソ尿素類;ブスルファンを含めたスルホン酸アルキル;チオテパ;シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチンおよび四硝酸トリプラチンを含めた白金化合物;プロカルバジン;ならびにアルトレタミン;
(d)植物アルカロイドならびにテルペノイド、たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンを含めたビンカアルカロイド;タキソール、パクリタキセル、ドセタクセルを含めたタキサン;およびポドフィロトキシン;
(e)トポイソメラーゼ阻害剤、たとえばアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシドおよびエピポドフィロトキシンの他の誘導体;イリノテカン、トポテカンおよび他のカンプトテシン;ならびに
(f)他の抗腫瘍薬、たとえばダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、エトポシド、ブレオマイシンおよびプリカマイシンから選択されてもよい。
(a)アントラサイクリンならびにその類似体、たとえばダウノマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、バルルビシン、アクラシノマイシンおよびミトキサントロン;
(b)代謝拮抗薬、たとえばゲムシタビン、シトシンアラビノシド、シタラビン、ビダラビン、チオグアニン、ペントスタチン、クラドリビン、メトトレキサート、フロクスウリジン、フルオロウラシルおよび他のフッ化ピリミジン、プリンまたはヌクレオシド;
(c)アルキル化剤、たとえばシクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドを含めたナイトロジェンマスタード;カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシンを含めたニトロソ尿素類;ブスルファンを含めたスルホン酸アルキル;チオテパ;シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチンおよび四硝酸トリプラチンを含めた白金化合物;プロカルバジン;ならびにアルトレタミン;
(d)植物アルカロイドならびにテルペノイド、たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンを含めたビンカアルカロイド;タキソール、パクリタキセル、ドセタクセルを含めたタキサン;およびポドフィロトキシン;
(e)トポイソメラーゼ阻害剤、たとえばアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシドおよびエピポドフィロトキシンの他の誘導体;イリノテカン、トポテカンおよび他のカンプトテシン;ならびに
(f)他の抗腫瘍薬、たとえばダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、エトポシド、ブレオマイシンおよびプリカマイシンから選択されてもよい。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、単独でまたは他の活性薬剤と併用して、たとえば1つ以上の細胞増殖抑制剤と併用して使用されてもよい。
本発明の腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、手術により使用の部位に配置されてもよい。同様に、使用後に薬剤は、手術により除去されてもよい。
本発明の腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、乳癌、結腸直腸癌、すい臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞性癌、中皮腫、カポジ肉腫、卵巣癌、軟部組織肉腫、膠腫、黒色腫、小細胞および非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、基底細胞癌、尿路上皮管の移行上皮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃癌、膀胱癌、子宮肉腫、多発性骨髄腫、軟部組織および骨肉腫、胆管癌ならびにそこから播種される癌を含むがそれだけには限らない多くの型の癌で使用することを目的としてもよい。
特に、本発明の腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、腹膜腔の癌、たとえば胃、胆嚢、肝臓、小腸、GIST、食道、腹部肉腫、軟部組織肉腫、中皮腫、卵巣、すい臓、大腸、直腸、子宮、頸部、腎臓癌およびそこから播種される癌で使用することを目的としてもよい。好ましい態様において、癌は卵巣癌またはそこから播種している癌である。癌が卵巣癌またはそこから播種している癌である場合、本発明の産物を対象の腹壁内に移植してもよい。あるいは、癌は大腸癌であってもよい。癌は、すい臓癌であってもよい。
本発明は、癌転移の予防、特に腹膜転移の予防における使用を目的としてもよい。
本発明の薬剤は、転移性腫瘍細胞の付着または移植に望ましいおよび好ましい部位を、たとえば薬剤が配置される場所である場合腹膜腔内に、提供してもよい。一態様において、薬剤は、腹膜腔に配置した場合に腹膜腔に存在するトランスコエロミック(trascoelomic)流によりさらに促進される非薬理学的作用機序を有し:すなわち、細胞は腹膜腔内で向きを変え、薬剤が医療用デバイスとして作用している本発明の薬剤の中に徐々に閉じ込められる。本発明の薬剤は、したがって化学誘引物質自体として作用する必要はなく、転移性腫瘍細胞を閉じ込めるために単に作用してもよい。
別の側面によると、本発明は、癌の治療または予防ための薬剤の調製における、転移性癌細胞を閉じ込めるもしくは捕捉する本発明の薬剤の使用を提供する。
別の側面による、本発明は、転移性癌細胞を閉じ込めるまたは捕捉する本発明の薬剤を含む医療用デバイスを提供する。デバイスは、癌の治療または予防に使用されてもよい。
好ましくは、癌の治療もしくは予防は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞の誘引および/もしくは閉じ込めを含む。
好ましくは、誘引された細胞は、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の作用により保持または閉じ込められ、存在する任意の化学誘引物質は、したがって細胞を特定の位置に限局させ、それが治療可能になる。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、ここで記載の基材に含有される、またはそれに付着しているECMタンパク質を好ましくは含む。いくつかの態様において、基材自体が、腫瘍細胞を誘引および/もしくは閉じ込める能力がある腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤であってもよく、さらなる捕捉薬剤ならびに/または化学誘引物質の供給は任意である。いくつかの態様において、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、3D重合体足場またはヒドロゲルを含む。そのような重合体が、接着性を有し、たとえば腫瘍細胞が接着できるニッチを提供するおよび/またはそのような細胞のホーミングに優先的な部位を提供することによりそのような細胞を閉じ込める能力があることが判明した。
いくつかの態様において、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、ECMタンパク質、たとえばコラーゲンおよび/またはフィブロネクチンでデコレーションした架橋されたポリカーボネートポリウレタン尿素基材(3D−Kube Biomerix足場)を含む。
好ましくは、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、重要でない臓器に投与される。したがって、腫瘍細胞は、この組織へ誘引され、それに保持されることになり、次いで手術により除去されてもよい。そのような位置は、存在するどんな化学誘引物質も身体中のどこからでも接近できてよく;たとえば、本発明の薬剤が血管新生し、血液循環に達することを可能にし得る。
あるいは、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、対象の脂肪に投与されてもよい。
さらに他の態様において、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を対象の腹膜に投与して、腹膜腔に播種している転移性細胞を誘引および/または捕捉してもよい。同様に、肺癌および中皮腫または肋膜に播種している腫瘍細胞を治療する場合、肋膜が、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を配置するのに優れた場所になってもよい。
腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、ヒトまたは非ヒト動物の脂肪への直接注射により投与されてもよい。たとえば、腹膜転移性腫瘍細胞を誘引する場合、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、腹膜または脂肪組織、たとえば性腺脂肪を含めた周囲の組織に注射されてもよい。あるいは、本発明の薬剤は、手術により投与されてもよい。
好ましくは、in situならば、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞をそれへ誘引し、集合させまたは「閉じ込める」。好ましい態様において、誘引された細胞は、細胞が治療されるまで腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の作用により保持または閉じ込められる。好ましくは少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%またはより多くの誘引された細胞が、本発明の産物により捕捉される。
誘引または閉じ込められた細胞は、次いで治療されてもよい。誘引もしくは閉じ込められた細胞は、たとえば手術により物理的にそれを除去する、またはたとえば化学療法もしくは放射線治療によって治療して細胞を破壊もしくは不活性化することにより治療されてもよい。薬剤が細胞増殖抑制性もしくは細胞毒性物質を含む、または腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤が細胞増殖抑制性もしくは細胞毒性物質と一緒に投与される場合、その後これが作用して、誘引された細胞の複製を根絶もしくは予防してもよい。
治療しようとする腫瘍細胞は、上記の癌のいずれか1つ以上であってもよく、特に腫瘍細胞は腹膜癌、たとえば卵巣癌から得られる/播種されてもよい。
好ましくは、本発明の薬剤は、転移性細胞に対する接着表面を提供し、この表面は、移植に関して天然の部位と競合して移植に好ましい部位を提供する。薬剤は、人工の前転移性ニッチとして作用してもよい。
別の側面によると、本発明は、対象において腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞もしくは原発性腫瘍から播種される任意の細胞を誘引する方法であって、対象に腫瘍細胞播種、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞をモジュレートする薬剤を投与することを含む方法を提供する。本発明のいずれかの側面を参照して記述される通り、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、基材の中に含有されるまたはそれに付着しているECMタンパク質を含んでもよい。好ましくは、誘引された細胞は、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の作用により保持または閉じ込められる。腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤によって一旦閉じ込められたら、癌細胞自体が他の癌細胞に対する捕捉薬剤および/または化学誘引物質として作用してもよい。
なおさらなる側面によると、本発明は、癌、特に転移性癌を治療または予防する方法であって、腫瘍細胞播種、特に転移性腫瘍細胞播種、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞もしくは原発性腫瘍から播種される任意の細胞をモジュレートする薬剤を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、ここで記載の基材の中に含有されるまたはそれに付着しているECMタンパク質を含んでもよい。好ましくは、治療を必要とする対象は、転移性または非転移性の両方の原発性癌とすでに診断されている。好ましくは、腫瘍細胞は、腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の作用により保持または閉じ込められる。好ましくは、方法は、閉じ込められた細胞を治療する工程をさらに含む。
薬剤は、尿素区分および追加の架橋を持つポリカーボネートポリウレタン足場を含んでいてもよい。
誘引もしくは閉じ込められた細胞は、たとえば手術により物理的にそれを除去する、またはたとえば化学療法もしくは放射線治療によって治療して細胞を破壊もしくは不活性化することにより治療されてもよい。薬剤が細胞増殖抑制性もしくは細胞毒性物質を含む場合、その後これが作用して、誘引された細胞の複製を根絶または予防してもよい。方法は、誘引された細胞を外科的に除去する工程ならびに/または化学療法および/もしくは放射線治療を行って、誘引もしくは閉じ込められた細胞を治療する工程を含んでもよい。
本発明の方法は、手術、放射線治療および化学療法の1つ以上との併用を含めた現在の臨床シナリオと併用して使用されてもよい。
癌は、任意の癌、特に腹膜癌、たとえば卵巣癌であってもよい。
なおさらなる側面によると、本発明は、対象において癌、好ましくは転移性癌を予防または治療するために使用する医療用デバイスもしくは移植可能なデバイスを提供し、デバイスはここで記載の通り腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を含む。
本発明の別の側面によると、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を製造する方法であって;
ECMタンパク質の懸濁溶液を調製する工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材を、ECMタンパク質の溶液中で飽和させることによりコーティングする工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材の中のECMタンパク質を凍結乾燥して、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を形成する工程と
を含む方法が提供される。
ECMタンパク質の懸濁溶液を調製する工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材を、ECMタンパク質の溶液中で飽和させることによりコーティングする工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材の中のECMタンパク質を凍結乾燥して、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を形成する工程と
を含む方法が提供される。
当業者は、本発明の態様および/もしくは側面ならびに/または請求項のいずれか1つの好ましい特徴が、本発明の他の全ての態様および/もしくは側面および/もしくは請求項に適用されてもよいことを認識できる。
ポリカーボネートポリウレタン足場
本発明の薬剤は、三次元空間的構造を形成するセルのネットワークを含む網状エラストマー性基材を含んでもよい。セルは、セル内またはセルの壁内に含有されている解放セル孔(open-celled pores)を介して互いに連絡し、接続している。このネットワークにより、連続的な、相互接続および相互連絡しているセルならびに連続的な空隙を形成する細孔で構成される固有の形態を持つ基材が得られる。網状エラストマー性基材は、移植片内への細胞および組織の内部への成長ならびに増殖を可能にする。好ましくは、網状エラストマー性基材は、生物耐久性(biodurable)であり、弾性があって圧縮でき、好ましくはポリカーボネートポリウレタンまたはポリカーボネートポリウレタン尿素を含む。適切な基材には、米国特許第7,803,395号および第8,337,487号に記述されるものがあるがこれに限定されない;その開示を参照により本明細書に組み込む。
本発明の薬剤は、三次元空間的構造を形成するセルのネットワークを含む網状エラストマー性基材を含んでもよい。セルは、セル内またはセルの壁内に含有されている解放セル孔(open-celled pores)を介して互いに連絡し、接続している。このネットワークにより、連続的な、相互接続および相互連絡しているセルならびに連続的な空隙を形成する細孔で構成される固有の形態を持つ基材が得られる。網状エラストマー性基材は、移植片内への細胞および組織の内部への成長ならびに増殖を可能にする。好ましくは、網状エラストマー性基材は、生物耐久性(biodurable)であり、弾性があって圧縮でき、好ましくはポリカーボネートポリウレタンまたはポリカーボネートポリウレタン尿素を含む。適切な基材には、米国特許第7,803,395号および第8,337,487号に記述されるものがあるがこれに限定されない;その開示を参照により本明細書に組み込む。
本発明の特定の態様は、適用に多様性が有り、例として、生体移植、特にヒトにおいて身体に恒久的にとどめることができるまたは特定の期間の後に身体から除去することができる長期間の移植に利用できる生物に耐久性の網状エラストマー産物を含み、その産物も圧縮可能でありその回復において弾力性を呈する。in vivoでの細胞捕捉、成長もしくは繁殖を支援するための足場、組織工学足場、細胞成長足場または他の同等の基質としての使用に適する移植可能なデバイスを形成することが望ましくなり得る。
別の態様において、in vivoでの細胞捕捉および繁殖を支援するための、足場、組織操作足場、細胞成長足場または他の同等の基質としての使用に適する移植可能なデバイス。一態様において、本発明の網状エラストマー性基材は、新たな組織、細胞外基質、上皮組織結合組織、疎性結合組織、密性規則性および不規則性組織、細網組織、脂肪組織、軟骨および骨組織、骨格、平滑および心筋組織、血管結合組織またはその任意の組合せの細胞付着、移動、増殖および/または堆積のための表面を提供することにより細胞捕捉ならびに繁殖を促進する。どんな具体的な理論にも束縛されることなく、高い空隙含有量ならびに相互接続および相互連絡している高い空隙含有量への自由な接近が有る網状の移植可能なデバイスは、その移植可能なデバイスが、細胞により少なくとも部分的に内部に成長および/または増殖され、いくつかの場合において実質的に内部に成長および増殖され、いくつかの場合において完全に内部に成長および増殖されることを可能にし、播種もしくは循環腫瘍細胞を捕捉するのに優先的な部位を形成すると考えられる。別の態様において、本発明の移植可能なデバイスの網状基材の生体組み込み型の三次元に相互接続および相互連絡している構造の特質のため、本発明の薬剤は、天然の転移の部位と比較して潜在的に優れた、より速い播種または循環腫瘍細胞の優位性を有する。
別の態様において、生物耐久性網状エラストマー産物は、満足に移植できる、そうでない場合長期間、たとえば少なくとも29日間生体組織および液体に曝露することができる。一態様において、移植可能なデバイスは、少なくとも2ヵ月間生物耐久性である。別の態様において、移植可能なデバイスは、少なくとも6ヵ月間生物耐久性である。別の態様において、移植可能なデバイスは、少なくとも12ヵ月間生物耐久性である。別の態様において、移植可能なデバイスは、少なくとも24ヵ月間生物耐久性である。別の態様において、移植可能なデバイスは、少なくとも5年間生物耐久性である。別の態様において、移植可能なデバイスは、5年超生物耐久性である。
本発明の薬剤に使用される生物耐久性網状エラストマー性産物は、「マクロ構造」および「ミクロ構造」を有すると記述されてもよく、その用語は、以下の段落において記述される一般的な意味で、ここで使用される。
「マクロ構造」とは、本発明の生物耐久性エラストマー性産物の形状をなす物または物体の全体としての物理的特質、たとえば:細孔もしくは空隙を無視して、物もしくは物体の幾何学的範囲により記述される外面;細孔の中の表面積を無視して、その上のどの細孔も充填されているかのように最外部の表面積について言及する「マクロ構造の表面積」;マクロ構造もしくは単に「マクロ」の表面積により囲まれている体積であり、物もしくは物体により占有されている「マクロ構造の体積」もしくは単に「体積」;および構造材料の密度は除いて、物もしくは物体自体の単位体積当たりの重量である「容積密度」のことを指す。
「ミクロ構造」とは、本発明の産物が構成される生物耐久性エラストマー性材料の内部構造の特徴、たとえばセルおよび細孔の寸法;細孔内の材料表面の総面積である細孔表面積;ならびに本発明のエラストマー性産物の特定の態様の固体構造を構成する支柱および交差の形状のことを指す。一般に記述すると、固有の形状もしくは拡張された、連続する実体を有する多孔性生物耐久性エラストマー性基材のミクロ構造は、適切な生物耐久性エラストマー性材料の形状をなし、その内部に点在する固相、またはそれによって定義される連続的に相互接続している空隙相を含み、後者は、網状構造の原理特徴であり、セルおよび細孔から構成される。
網状エラストマー性基材を形成している個々のセルは、平均セル直径により、または非球面セルの場合、最大の横断寸法により特徴付けられる。網状エラストマー性基材は、三次元空間的構造を形成するセルまたはその中の開孔によって相互接続される空隙相のネットワークを含む。一態様において、セルは三次元高次構造を形成する。細孔は、個々のセル同士、またはセルを形成する細孔の集合体または群同士の連結性をもたらす。エラストマー性基材のセルは、細孔の集合体もしくは群から形成され、そのセルは、細網化により大部分の細孔のセル壁が存在しないまたは実質的に存在しないことを除いてセルの壁を形成することになる。特に、少数の細孔は、「ウインドウ」または「ウインドウペイン」、たとえばセル壁とも呼ばれる構造材料のセル壁を有してもよい。細孔を通る液体の通過ならびに/または組織の繁殖および増殖を妨げる限り、そのようなセル壁は望ましくない。細孔を通る液体の通過ならびに/または組織の繁殖および増殖を妨げるそのようなセル壁は、一態様において、適切な工程段階、たとえば熱、爆発もしくは化学的細網化であり得る細網化において除去されてもよい。
一態様において、エラストマー性基材が、in vivoで適切な位置に一定期間ある場合、エラストマー性基材のミクロ構造は、基材の表面への細胞接着および空隙相の細孔内への細胞増殖を可能にするまたは促すように構築される。別の態様において、そのような細胞の内部への成長ならびに増殖が、細孔の外面層だけでなくエラストマー性基材の最も深い内部および全体において起こるまたは促されることがあり得る。これは相互接続および相互連絡しているセルおよび細孔ならびに空隙の存在により可能となり、その全ては細胞の内部への成長および増殖に利用できる。したがって、この態様において、エラストマー性基材により占有される空間は、エラストマー性固相により占有される空間を除いて、細胞の内部への成長および増殖によって完全に充填される。
空隙相は、エラストマー性基材の間質空間により形成される体積に関してわずか5容量%のエラストマー性基材を含んでもよい。別の態様において、空隙相は、わずか25容量%のエラストマー性基材を含んでもよい。別の態様において、空隙相は、わずか50容量%のエラストマー性基材を含んでもよい。別の態様において、空隙相は、わずか75容量%のエラストマー性基材を含んでもよい。別の実施形態において、空隙相は、少なくとも90容量%のエラストマー性基材を含んでもよい。別の実施形態において、空隙相は、少なくとも95容量%のエラストマー性基材を含んでもよい。
別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約800μmを超えない。別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約600μmを超えない。別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約500μmを超えない。別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約400μmを超えない。別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約385μmを超えない。別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約200μmを超えない。別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約100μmを超えない。別の態様において、細孔の平均直径または他の最大横断寸法は、約20μmを超えない。
細胞の内部への成長および増殖を促し、適切な液体透過性を提供するための一態様において、エラストマー性基材のセルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約50μmである。別の態様において、セルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約200μmである。別の態様において、セルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約350μmである。別の態様において、セルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約500μmである。別の態様において、セルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約700μmである。別の態様において、セルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約900μmである。別の態様において、セルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約1500μmである。別の態様において、セルの平均直径または他の最大横断寸法は、少なくとも約1800μmである。
一態様において、エラストマー性基材は、250ダーシーより大きい透過性を有してもよい。あるいは、エラストマー性基材は、200ダーシーより大きい透過性を有してもよい。エラストマー性基材は、500ダーシー未満の透過性を有してもよい。あるいは、エラストマー性基材は、400ダーシー未満の透過性を有してもよい。あるいは、エラストマー性基材は、300ダーシー未満の透過性を有してもよい。一態様において、エラストマー性基材は、約200ダーシー〜約500ダーシーの透過性を有してもよい。
一態様において、エラストマー性基材は、約3.5〜約3.9lb/ft3の密度を有していてもよい。別の態様において、エラストマー性基材は、約2〜約10lb/ft3の密度を有していてもよい。
本発明のエラストマー性基材の構造、形態ならびに特性は、機能上もしくは治療上の異なる使用に対して出発材料および/もしくは加工および/もしくは加工後条件を変えることによって広い性能範囲にわたって操作または調整することができる。別の態様において、エラストマー性基材ならびに少なくとも1つの機能的要素、たとえばコーティングを含むデバイスの構造、形態および特性は、出発材料および/もしくは加工および/もしくは加工後条件を変えることによって広い性能範囲にわたって操作または調整することができる。
一態様において、本発明の生物耐久性網状エラストマー性基材は、合成重合体、特に生分解抵抗性のエラストマー性重合体、たとえば、ポリカーボネートポリウレタン尿素、ポリカーボネートポリ尿素−ウレタン、ポリカーボネートポリウレタンである。そのようなエラストマーは、一般に疎水性であるが、本発明により、あまり疎水性でないまたはやや親水性である表面を有するように処理されてもよい。別の態様において、そのようなエラストマーは、あまり疎水性でないまたはやや親水性である表面で作製されてもよい。別の態様において、そのようなエラストマーは、著しくまたは主に疎水性である表面で作製されてもよい。
さらなる態様において、本発明は、多孔性生物耐久性エラストマー、ならびにここで記載の通り生物耐久性網状エラストマー性基材を作製するために使用できるエラストマーを重合、架橋および発泡させる過程を提供する。別の態様において、細網化が次に起こる。
とりわけ、別の態様において、本発明は、ポリカーボネートポリオール成分および芳香族ジイソシアネート、たとえばp−フェニレンジイソシアネート、4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネート(「4,4’−MDI」)、2,4’−ジフェニルメタンジイソシアネート(「2,4’−MDI」)またはその混合物から基材を合成することを含む生物耐久性エラストマー性ポリウレタン基材を提供する。生物耐久性エラストマー性ポリウレタン基材は、重合、架橋および発泡により作製され、それによって細孔を形成し、続いて網状産物を得るために気泡を細網化する。細網化とは、セル壁を、単に破裂させるまたは引き裂くだけでなく粉砕過程により少なくとも部分的に除去する過程のことを一般に指す。さらに、望ましくない粉砕は、さらなる加工により除去されなければならない破片を形成する。別の態様において、細網化過程は、少なくとも一部のセル壁を実質的に完全に除去する。細網化は、たとえば「溶媒細網化」もしくは「化学的細網化」として様々に公知である、セル壁を少なくとも部分的に溶かし出すことにより;または「燃焼細網化」、「熱細網化」または「爆発細網化」として様々に公知である、セル壁を少なくとも部分的に融解、焼却および/もしくは爆発させることにより実施されてもよい。産物は、ポリカーボネートポリウレタンまたはポリカーボネートポリウレタン尿素と指定され、たとえば、ポリカーボネートポリオール成分の水酸基およびイソシアネート成分のイソシアネート基から形成されるウレタン基を含む重合体である。この態様において、過程は、制御された化学を利用して、優れた生物耐久性特徴を持つ網状エラストマー産物を生成する。本発明によると、気泡産物中の生物学的に望ましくないまたは有毒な構成要素を防止する化学を利用して重合を行い、それにより産物を得る。
一態様において、本発明は、ポリカーボネートポリオール成分およびイソシアネート成分出発材料に基づいて網状になることでできる柔軟なポリウレタン生物耐久性基材を調製する過程を提供する。別の態様において、気泡はイソシアヌレート連結を実質的に含まない。別の態様において、気泡はイソシアヌレート連結を全く有さない。別の態様において、気泡はビウレット連結を実質的に含まない。別の態様において、気泡はビウレット連結を全く有さない。別の態様において、気泡はアロファネート連結を実質的に含まない。別の態様において、気泡はアロファネート連結を全く有さない。別の態様において、気泡はイソシアヌレートおよびビウレット連結を実質的に含まない。別の態様において、気泡はイソシアヌレートおよびビウレット連結を全く有さない。別の態様において、気泡はイソシアヌレートおよびアロファネート連結を実質的に含まない。別の態様において、気泡はイソシアヌレートおよびアロファネート連結を全く有さない。別の態様において、気泡はアロファネートおよびビウレット連結を実質的に含まない。別の態様において、気泡はアロファネートおよびビウレット連結を全く有さない。別の態様において、気泡はアロファネート、ビウレットおよびイソシアヌレート連結を実質的に含まない。別の態様において、気泡はアロファネート、ビウレットおよびイソシアヌレート連結を全く有さない。
エラストマー性基材のコラーゲンコーティング
一態様において、ここで「内部細孔(endopore)」と称されるエラストマー性基材は、そのミクロ構造の一部としての特徴、すなわち「細孔の中に」位置するエラストマー性基材の特徴を有してもよい。一態様において、細孔の内面は、「内部細孔的に(endoporously)コーティングされ」、すなわちコーティングまたは処理されて、その表面にある程度の所望の特徴、たとえば親水性もしくは細胞接着が与えられてもよい。一態様において、支柱の内面は、「内部細孔的にコーティングされ」、すなわちコーティングまたは処理されて、その表面にある程度の所望の特徴、たとえば親水性もしくは細胞接着が与えられてもよい。一態様において、内部の空隙空間もしくは細胞間の空間は、「内部細孔的にコーティングされ」、すなわちコーティングまたは処理されて、その表面にある程度の所望の特徴、たとえば親水性もしくは細胞接着が与えられてもよい。コーティングまたは処理媒体は、後に細孔へ優先的に送達できる有効成分もしくは細胞に輸送または結合するための付加的な容量を持つことができる。一態様において、このコーティング媒体または処理を使用して、内部細孔表面への細胞の付着、成長および増殖を促進することができる。一態様において、このコーティング媒体または処理を使用して、内部細孔表面への細胞の成長および増殖を促進することができる。一態様において、このコーティング媒体または処理を使用して、内部細孔表面への材料の共有結合形成を促進することができる。別の態様において、コーティングは、生分解性重合体、天然重合体、細胞の内部への成長促進因子または無機成分を含む。さらに、1つ以上のコーティングは、生体適合性コーティング、生体適合性フィルムコーティングもしくは生体適合性凍結乾燥コーティングの形成を可能にするのに適した条件下で液体コーティング媒体中または融解状態のいずれかにおいて、生体適合性合成重合体、生体適合性合成再吸収性重合体、天然重合体もしくは細胞の内部への成長促進因子と接触させることにより内部細孔的に塗布されてもよい。液体コーティング媒体は、溶液もしくはスラリーまたはその混合物であることができる。一態様において、そのようなコーティングに使用される重合体または細胞の内部への成長促進因子は、好ましくは固相に付着すべき膜形成生体適合性重合体もしくは材料である。別の態様において、そのようなコーティングに使用される重合体または細胞の内部への成長促進因子は、好ましくは固相に付着するべきである凍結乾燥可能な生体適合性重合体である。別の態様において、結合力は、フィルムコーティングもしくは凍結乾燥されたコーティングが、取扱いもしくは配備の間または網状エラストマー性基材を身体に配置する間ひび割れせず剥がれ落ちないようなものである。
一態様において、ここで「内部細孔(endopore)」と称されるエラストマー性基材は、そのミクロ構造の一部としての特徴、すなわち「細孔の中に」位置するエラストマー性基材の特徴を有してもよい。一態様において、細孔の内面は、「内部細孔的に(endoporously)コーティングされ」、すなわちコーティングまたは処理されて、その表面にある程度の所望の特徴、たとえば親水性もしくは細胞接着が与えられてもよい。一態様において、支柱の内面は、「内部細孔的にコーティングされ」、すなわちコーティングまたは処理されて、その表面にある程度の所望の特徴、たとえば親水性もしくは細胞接着が与えられてもよい。一態様において、内部の空隙空間もしくは細胞間の空間は、「内部細孔的にコーティングされ」、すなわちコーティングまたは処理されて、その表面にある程度の所望の特徴、たとえば親水性もしくは細胞接着が与えられてもよい。コーティングまたは処理媒体は、後に細孔へ優先的に送達できる有効成分もしくは細胞に輸送または結合するための付加的な容量を持つことができる。一態様において、このコーティング媒体または処理を使用して、内部細孔表面への細胞の付着、成長および増殖を促進することができる。一態様において、このコーティング媒体または処理を使用して、内部細孔表面への細胞の成長および増殖を促進することができる。一態様において、このコーティング媒体または処理を使用して、内部細孔表面への材料の共有結合形成を促進することができる。別の態様において、コーティングは、生分解性重合体、天然重合体、細胞の内部への成長促進因子または無機成分を含む。さらに、1つ以上のコーティングは、生体適合性コーティング、生体適合性フィルムコーティングもしくは生体適合性凍結乾燥コーティングの形成を可能にするのに適した条件下で液体コーティング媒体中または融解状態のいずれかにおいて、生体適合性合成重合体、生体適合性合成再吸収性重合体、天然重合体もしくは細胞の内部への成長促進因子と接触させることにより内部細孔的に塗布されてもよい。液体コーティング媒体は、溶液もしくはスラリーまたはその混合物であることができる。一態様において、そのようなコーティングに使用される重合体または細胞の内部への成長促進因子は、好ましくは固相に付着すべき膜形成生体適合性重合体もしくは材料である。別の態様において、そのようなコーティングに使用される重合体または細胞の内部への成長促進因子は、好ましくは固相に付着するべきである凍結乾燥可能な生体適合性重合体である。別の態様において、結合力は、フィルムコーティングもしくは凍結乾燥されたコーティングが、取扱いもしくは配備の間または網状エラストマー性基材を身体に配置する間ひび割れせず剥がれ落ちないようなものである。
一態様において、コーティングはエラストマー性基材の全外表面にわたって連続的でない。他方、コーティングは、透過性ひいてはエラストマー性基材内面への細胞浸潤が影響を受けないようにエラストマー性基材の全外表面にわたって連続的でない。他方、コーティングは、透過性が中等度に影響を受けるが、エラストマー性基材内への細胞浸潤がなお可能であるようにエラストマー性基材の全外表面にわたって連続的でない。コーティングが分解するにつれて、透過性が影響を受けてもよい場合、それは回復し、循環している細胞は、自由な方法で網状エラストマー性基材に侵入および浸潤することができるとさらに考えられる。
適切な生体適合性重合体は、生体再吸収性脂肪族ポリエステルを含み、ラクチド(乳酸d−、l−およびメソラクチドを含む)、ε−カプロラクトン、グリコリド(グリコール酸を含む)、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、p−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート(およびそのアルキル誘導体)またはその混合物の重合体および共重合体を含むがこれに限定されない。適切な生体適合性重合体は、親水性重合体を含み、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニルまたはその混合物を含むがこれに限定されない。
本発明のさらなる態様において、下に詳述するとおり、エラストマー性基材の細孔もしく空隙相の一部もしくは全部は、コーティングされるまたは少なくとも部分的に細胞の内部への成長促進因子で充填される。別の態様において、促進因子は発泡させることができる。別の態様において、促進因子は凍結乾燥することができる。別の態様において、促進因子はフィルムとして存在することができる。促進因子は、in vivoでのエラストマー性基材の細胞浸潤を促進する生分解性材料であり得る。促進因子は、人体において酵素的に分解され得るまたは人体において加水分解的に不安定である天然に存在する材料、たとえばコラーゲン、フィブリン、フィブリノゲン、エラスチン、ヒアルロン酸ならびに吸収性の生体適合性多糖、たとえばキトサン、澱粉、脂肪酸(およびそのエステル)、グルコース−グリカンおよびヒアルロン酸を含む。いくつかの態様において、促進因子を生体適合性重合体と置換するまたは生体適合性重合体に促進因子を添加することを除いて前節に記載の通り、エラストマー性基材の細孔表面をコーティングもしくは含浸して、細胞の内部への成長および増殖が促される。好ましい態様において、コーティングはコラーゲンから構成される。
コーティングの前に、コラーゲンを、水性コラーゲンスラリー、水性コラーゲン懸濁液もしくは水性コラーゲン溶液またはその混合物の形態でエラストマー性基材の空隙相もしくはエラストマー性基材の細孔内に浸透させてもよい。コラーゲンは、I、IIもしくはIII型またはその混合物であってもよい。一態様において、コラーゲン型は、I型コラーゲンを少なくとも70%含む。一態様において、コラーゲン型は、I型コラーゲンを少なくとも80%含む。一態様において、コラーゲン型は、I型コラーゲンを少なくとも90%含む。コラーゲンは、様々なヒトまたはブタ、ウシ、馬およびヒトへの使用に適切な他の動物源を含めた動物源から得ることができるまたは、組換え供給源由来であってもよい。一態様において、コラーゲンは、ウシの海綿状脳症を含まないウシ腱から得ることができる。一態様において、コラーゲンは繊維状I型ウシコラーゲンを含むまたはそれからなる。コラーゲンは、部分的に変性される、実質的に変性される、中等度に変性されるまたはわずかに変性されてもよい。別の態様において、コラーゲンは変性させることができない。
コラーゲンスラリー、コラーゲン懸濁液または水性コラーゲン溶液におけるコラーゲンの濃度は、約0.05%〜約4.0重量%の範囲であってもよい。別の態様において、コラーゲンスラリー、コラーゲン懸濁液または水性コラーゲン溶液におけるコラーゲンの濃度は、約0.1%〜約2.0重量%の範囲である。別の態様において、コラーゲンスラリー、コラーゲン懸濁液または水性コラーゲン溶液におけるコラーゲンの濃度は、約0.2%〜約1.0重量%の範囲である。あるいは、コラーゲンスラリー、コラーゲン懸濁液または水性コラーゲン溶液におけるコラーゲンの濃度は、約1%〜約10重量%の範囲であってもよい。別の態様において、コラーゲンスラリー、コラーゲン懸濁液または水性コラーゲン溶液におけるコラーゲンの濃度は、約3〜約8重量%の範囲であってもよい。別の態様において、コラーゲンスラリー、コラーゲン懸濁液または水性コラーゲン溶液におけるコラーゲンの濃度は、約4%〜約5重量%の範囲であってもよい。
一態様において、コラーゲンコーティングは、エラストマー性基材をコラーゲンスラリーまたはコラーゲン懸濁液に浸漬し、加熱および/または真空下で乾燥させてフィルムコーティングを形成することにより得ることができる。一態様において、コラーゲンコーティングは、エラストマー性基材をコラーゲン溶液に浸漬し、加熱および/または真空下で乾燥させてフィルムコーティングを形成することにより得ることができる。一態様において、コラーゲンコーティングは、エラストマー性基材をコラーゲンスラリーおよび溶液の混合物に浸漬し、加熱および/または真空下で乾燥させてフィルムコーティングを形成することにより得ることができる。
一態様において、コラーゲンコーティングは、エラストマー性基材をコラーゲンスラリーまたはコラーゲン懸濁液に浸漬し、凍結乾燥条件下で乾燥させて凍結乾燥されたコーティングを形成することにより得ることができる。一態様において、コラーゲンコーティングは、エラストマー性基材をコラーゲン溶液に浸漬し、凍結乾燥条件下で乾燥させて凍結乾燥されたコーティングを形成することにより得ることができる。一態様において、コラーゲンコーティングは、エラストマー性基材をコラーゲン懸濁液と溶液の混合物に浸漬し、凍結乾燥状態下で乾燥させて凍結乾燥されたコーティングを形成することにより得ることができる。
任意に、フィルムもしくは凍結乾燥されたコラーゲンコーティングを架橋して、コラーゲンコーティングのin vivoにおける酵素的分解の速度を制御するおよび/またはエラストマー性基材に結合するコラーゲンコーティングの能力を制御することができる。コラーゲンは、当業者に公知の方法、たとえば排気チャンバ内での加熱により、実質的に絶対乾燥の不活性ガス雰囲気中での加熱により、コラーゲンをホルムアルデヒド蒸気と接触させることにより、またはグルタルアルデヒドの使用により架橋することができる。架橋は、共有結合による架橋を含んでもよい。一態様において、フィルムまたは凍結乾燥されたコラーゲンコーティングは、コラーゲンをカルボジイミド化合物、たとえば、EDC(1−エチル−3−(−3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、およびDCC(N’,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド)を含めたカルボキシル反応性化学基と接触させることにより架橋することができる。
コラーゲンピックアップ重量は、0.5μg/mm3〜約100μg/mm3の範囲である。一態様において、コラーゲン投与レベルは、約5μg/mm3〜約10μg/mm3の範囲である。
一態様において、足場中の全ECMタンパク質、たとえば全コラーゲンの含量は、足場1mm3当たり約0.01〜約0.2mgのECMタンパク質である。あるいは、足場中の全ECMタンパク質、たとえば全コラーゲンの含量は、足場1mm3当たり約0.01〜約0.1mgのECMタンパク質である。あるいは、足場中の全ECMタンパク質、たとえば全コラーゲンの含量は、足場1mm3当たり約0.02〜約0.08mgのECMタンパク質である。あるいは、足場中の全ECMタンパク質、たとえば全コラーゲンの含量は、足場1mm3当たり約0.02〜約0.05mgのECMタンパク質である。一態様において、足場中の全ECMタンパク質、たとえば全コラーゲンの含量は、約0.04mgのECMタンパク質/mm3である。
足場上に充分なコラーゲンコーティングを提供するために、コラーゲンをたとえば摩砕によってさらに小さい粒度に粉砕してもよい。摩砕は、極低温での粉砕を含んでもよい。一態様において、コラーゲンは約5〜約100μmの平均粒度であってもよい。コラーゲンは、約10〜20μmの平均粒度であってもよい。あるいは、コラーゲンは50μm未満の平均粒度を有してもよい。別の態様において、コラーゲンは20μm未満の平均粒度を有してもよい。
本発明の薬剤/デバイスの設計構成
コラーゲンコーティングがある網状エラストマー性基材を含む本発明の薬剤またはデバイスは、任意の所望のサイズおよび形状で容易に製造することができる。そのような薬剤/デバイスは、移植片としての設計構造に関してここで言及される。適切なデザインは、米国特許出願第12/699,012号(米国特許出願公開第2010/0318108号A1)に記述されるがこれに限定されない、その開示を参照により本明細書に組み込む。エラストマー性基材の形状および構造は幅広く変化してもよく、所望の解剖学的形態に容易に適合させ得ることは、本発明の利益である。
コラーゲンコーティングがある網状エラストマー性基材を含む本発明の薬剤またはデバイスは、任意の所望のサイズおよび形状で容易に製造することができる。そのような薬剤/デバイスは、移植片としての設計構造に関してここで言及される。適切なデザインは、米国特許出願第12/699,012号(米国特許出願公開第2010/0318108号A1)に記述されるがこれに限定されない、その開示を参照により本明細書に組み込む。エラストマー性基材の形状および構造は幅広く変化してもよく、所望の解剖学的形態に容易に適合させ得ることは、本発明の利益である。
移植片の最小寸法は、0.5mm、最大寸法は500mmまたはそれ以上であってもよい。特定の態様において、移植片は任意の二次元のまたは三次元形状であってもよい。二次元の形状の典型的な態様には、規則的および不規則な形状、たとえば三角形、長方形、円形、卵形、楕円形、台形、五角形、六角形、および異常な形状に対応するものを含めた不規則な構造、ならびに他の形状であってもよい。三次元形状の典型的な態様には、栓子、円柱、管状構造、ステント様構造、および異常な輪郭に対応するものを含めた他の構造、ならびに他の構造であってもよい。デバイスは、約2cm〜約50cmの長さを有する長軸を有してもよい。デバイスは、約2cm〜約50cmの長さを有する辺を持つ正方形の形状であってもよい。好ましい態様において、移植片は、腹膜腔に最適な輪郭の卵形構造を持つ湾曲したシートの形状を有すると考えられる。別の態様において、移植片は、卵形構造を持つ平板の形状を有する。湾曲したまたは平らな網目状構造の横径もしくは横断切片寸法は、0.5mm〜10mmの範囲であってもよい。移植片の長さおよび幅寸法は、10mm〜500mmの範囲であってもよい。最適には、そのような移植片は、そのような移植片を巻く、折りたたむまたは圧縮することにより腹腔鏡下の送達方法を使用する送達を可能にするために必要な大きさにされる。
別の態様において、移植片は、細長い形状、たとえば円柱、棒状、管もしくは細長い角柱形態の形状、または折りたたまれた、コイル状、らせん状もしくは他のより小型の構造を有する。代わりの態様において、本発明の移植片は、球体、立方体、四面体、ドーナツ型、カップ様または他の任意の寸法と比較した場合に実質的に延長され、約0.5mm〜約500mmの直径もしくは他の最大寸法を持つ寸法がない他の形態を有してもよい。
転移性細胞捕捉用途の場合、移植片を、しばしば複雑であり、設計が困難な場合がある適用部位の構造に密接に適合させるのにどんな必要性もなく効果的に利用されてもよいことが本発明の長所である。したがって一態様において、移植片は著しく異なり、標的部位に共形的に適合するより単純な構造を有する。どんな具体的な理論にも束縛されることなく、そのような共形的適合をもたらす反発力および回復可能な挙動により、移植可能なデバイスの壁同士の隙間のない境界の形成ならびに実質的に隙間が無い欠陥が得られ、それにより転移性腫瘍細胞の捕捉に役立つ界面が得られる。
さらに、一態様において、本発明の移植可能なデバイス、1つ以上が使用される場合には移植可能なデバイス(複数)は、in situで完全に膨張した場合であっても適用部位を完全に満たすべきでない。一態様において、本発明の完全に膨張した移植可能なデバイスは、寸法において適用部位より小さく、適用部位の中に充分な空間を提供して血管新生、腫瘍細胞の捕捉および増殖、ならびに移植可能なデバイスへの血液の流れを確実にする。別の態様において、本発明の完全に膨張した移植可能なデバイスは、寸法において適用部位と実質的に同一である。別の態様において、本発明の完全に膨張した移植可能なデバイスは、寸法において適用部位より大きい。別の態様において、本発明の完全に膨張した移植可能なデバイスは、体積において適用部位より小さい。別の態様において、本発明の完全に膨張した移植可能なデバイスは、適用部位と実質的に同じ体積である。別の態様において、本発明の完全に膨張した移植可能なデバイスは、体積において適用部位より大きい。
本発明の態様において、任意の抗接着コーティングを、加えることができる。コーティングは、生分解性または生物耐久性重合体材料からなっていてもよい。本発明の一態様は、生物学的接着に対する潜在性を減少させるために使用する恒久的重合体もしくは生分解性重合体の薄層、コーティングまたはフィルムを組み込む。好ましい態様において、生分解性または生体吸収性コーティングは、乳酸、グリコール酸、酸性d−、l−およびメソラクチドならびにp−ジオキサノンを持つカプロラクトンの共重合体から作製される。抗接着特性に有利であるとみなされる組成物には、40/60、30/70または、20/80のポリカプロラクトン対ポリ乳酸の比の乳酸を含むカプロラクトンの共重合体がある。この抗接着フィルムは、接着結合、溶融加工、圧縮成形、縫合および他の技術を含めた当業者に公知の様々な加工技術を使用して網状エラストマー性基材と一体化されてもよい。
他の態様は、カテーテル、内視鏡、関節鏡、腹腔鏡、膀胱鏡、注射器もしくは非内視鏡的な開腹手順または他の適切な送達デバイスによるin vivo送達用の移植片を含む。一態様において、本発明のエラストマー性基材は、たとえば、人体に移植するために圧縮した後に少なくとも一次元において弛緩した構造のサイズの少なくとも約30%まで実質的に回復することを可能にするのに充分な反発力を有する。別の態様において、本発明のエラストマー性基材は、人体に移植するために圧縮した後に少なくとも一次元において弛緩した構造のサイズの少なくとも約60%まで回復することを可能にするのに充分な反発力を有する。別の態様において、本発明のエラストマー性基材は、人体に移植するために圧縮した後に少なくとも一次元において弛緩した構造のサイズの少なくとも約90%まで回復することを可能にするのに充分な反発力を有する。別の態様において、本発明のエラストマー性基材は、人体に移植するために圧縮した後に少なくとも一次元において弛緩した構造のサイズの少なくとも約95%まで回復することを可能にするのに充分な反発力を有する。
in vivoでの移植片の送達後に、デバイスを、任意の手段により標的領域に固定されてもよい。一態様において、移植片を、標的領域に縫合されてもよい。別の態様において、移植片を適当な位置にステープルで留められてもよい。デバイスの固定のための他の方法には、縫合しない技術、たとえば接着剤(たとえば、ヒトフィブリン糊)によるデバイスの固定がある。
転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を製造する方法であって、
ECMタンパク質の懸濁溶液を調製する工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材を、ECMタンパク質の溶液中で飽和させることによりコーティングする工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材の中のECMタンパク質を凍結乾燥して、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を形成する工程と
を含む方法が提供される。
ECMタンパク質の懸濁溶液を調製する工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材を、ECMタンパク質の溶液中で飽和させることによりコーティングする工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材の中のECMタンパク質を凍結乾燥して、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を形成する工程と
を含む方法が提供される。
ECMタンパク質は、コーティングの前にさらに小さい粒度に粉砕され(または、それで提供され)てもよい。粉砕は、極低温での粉砕であってもよい。ECMタンパク質は、約1〜100μmの平均粒度に粉砕されてもよい。別の態様において、ECMタンパク質は、約5〜50μmの平均粒度に粉砕されてもよい。あるいは、ECMタンパク質は、約20〜30μmの平均粒度に粉砕されてもよい。ECMタンパク質は、100μm未満の平均粒度に粉砕されてもよい。ECMタンパク質は、50μm未満の平均粒度に粉砕されてもよい。ECMタンパク質は、20μm未満の平均粒度に粉砕されてもよい。
有利なことに、より大きい粒度と比較して、より小さい平均粒度は、より多量のECMタンパク質、たとえばコラーゲンのコーティングを容易にする。特に原線維コラーゲンの様な大径粒子は、基材細孔を詰まらせることがあり得、粒度を減少させることによりこの問題は軽減される。ECMタンパク質の極低温での粉砕は、変性を予防するのに役立ち得る。
ECMタンパク質の溶液は、ECMタンパク質および脱イオン水の溶液であってもよい。溶液中のECMタンパク質の量は、水1g当たり約30〜約80mgのECMタンパク質であってもよい。あるいは、溶液中のECMタンパク質の量は、水1g当たり約35〜約60mgのECMタンパク質であってもよい。溶液中のECMタンパク質の量は、水1g当たり約40〜約50mgのECMタンパク質であってもよい。溶液中のコラーゲンの濃度は、約0.05%〜約4.0重量%の範囲であってもよい。別の態様において、コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は、約0.1%〜約2.0重量%の範囲であってもよい。別の態様において、コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は、約0.2%〜約1.0重量%の範囲であってもよい。あるいは、コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は、約1%〜約10重量%の範囲であってもよい。別の態様において、コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は、約3%〜約8重量%の範囲であってもよい。別の態様において、コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は、約4%〜約5重量%の範囲であってもよい。
ポリカーボネートポリウレタン基材は、ECMタンパク質溶液流体の表面の下で繰り返し機械的に加圧することにより飽和されてもよい。
凍結乾燥過程は、たとえば−20℃未満または−40℃未満で材料を凍結させた後の真空下での昇華を利用してもよい。
本方法は、ECMタンパク質を架橋すること、たとえば共有結合により架橋することをさらに含んでもよい。架橋は、ECMタンパク質を共有結合で架橋することができる分子、たとえばカルボキシル反応性化学基、たとえば1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)を含む分子の溶液中でECMタンパク質を飽和させることにより達成されてもよい。凍結乾燥過程は、架橋後に繰り返されてもよい。
本方法のECMタンパク質は、コラーゲンを含むまたはそれからなってもよい。コラーゲンは、I型ウシコラーゲンを含むまたはそれからなってもよい。
本発明は、例によってのみ、以下の図を参照してより詳細にさらに記述されることになる:
[実施例]
Trapデバイス
転移性癌の治療および/または予防に使用する転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を含む本発明のTrapデバイスであって、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、網状エラストマー性基材、好ましくはポリカーボネートポリウレタン尿素基材に保有されている細胞外基質(ECM)タンパク質であり、ECMタンパク質で基材をコーティングすることにより製造される。基材を産生する方法は、当業者に公知であり、たとえば発行された米国特許第7,803,395号および第8,337,487号に記述される(その内容は参照によりその全体を組み込む)。
Trapデバイス
転移性癌の治療および/または予防に使用する転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を含む本発明のTrapデバイスであって、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤は、網状エラストマー性基材、好ましくはポリカーボネートポリウレタン尿素基材に保有されている細胞外基質(ECM)タンパク質であり、ECMタンパク質で基材をコーティングすることにより製造される。基材を産生する方法は、当業者に公知であり、たとえば発行された米国特許第7,803,395号および第8,337,487号に記述される(その内容は参照によりその全体を組み込む)。
例のポリカーボネートポリウレタン尿素基材(Biomerix足場と呼ばれる場合もある)は、90〜95%超の空隙含有量を持つ十分に相互接続し、透過性が高いマクロ多孔性形態を提供する非再吸収性、網状、架橋、ポリカーボネートポリウレタン尿素基材(Biomerix、Fremont、CA、USA)である材料の仕様を、表1に提供する。足場をコラーゲン250μgでコーティングし、電子顕微鏡により撮像した。結果を、図1に示す。
表1 Biomerix HF3製剤、材料仕様
Biomerix足場は、重合体足場の体積への宿主細胞および組織の内部への成長ならびに増殖を可能にする。重合体足場は、高い空隙体積および表面積を持つ三次元空間的構造を形成するポリカーボネートポリウレタンの開口し、相互接続したネットワークとして特徴付けることができる。材料は、圧縮性、弾力性であり得るエラストマー性の性質を有するとしてさらに特徴付けることができ、加圧または操作後の優れた回復特性を実証する。網状エラストマー性基材は、移植後のデバイスの有効期間中に体内で分解せずまたは特性が変化することがない生物耐久性および生体適合性の重合体から構成される。図2は、材料の体積を通して存在するポリカーボネート足場および解放セル相互連絡ネットワークを示す。
コラーゲンで足場をコーティングする方法は上述する。
コラーゲンコーティングしたポリカーボネートポリウレタン尿素基材は、ここではM−trapとも称する。
M−trapデバイスのコラーゲン成分は、コラーゲンネットワークが重合体足場の全体に浸透することを確実にする製造過程で網状エラストマー性ポリカーボネートポリウレタン足場上に凍結乾燥された繊維状I型ウシコラーゲンから構成される。ウシ繊維状コラーゲンは、Maquet/Datascopeから供給される。コラーゲンは、デバイスの意図した寿命の間完全かつ有効であり続けるように、凍結乾燥後に架橋されてコラーゲンの耐久性を改善する。凍結乾燥コラーゲンネットワークは、重合体足場と同程度の高い透過性および表面積を有し、したがって体積への宿主細胞および組織の内部への成長ならびに増殖を制限しない。重合体足場中のコラーゲンは、腔内に播種している腫瘍細胞に対する誘引剤として作用する。図3および4は、異なる倍率でのポリカーボネート重合体足場の中に分布した凍結乾燥コラーゲンネットワークを示す。
M−trapデバイス構造および最適化されたコラーゲンコーティング濃度
臨床M−Trapデバイスは、厚さ5mmならびに長径50mmおよび短径15mmの卵形形状を持つ複合材料の平板として構成された。臨床デバイス用の足場中の全コラーゲンの含量は、デバイス1つ当たりおよそ120mgのI型ウシコラーゲンのうち送達されたコラーゲンの全量ではおよそ0.04mg/mm3のコラーゲンであった。等量のコラーゲン量を適切に拡大・縮小することができる場合、様々なサイズのM−Trapデバイスを得られてもよい。
臨床M−Trapデバイスは、厚さ5mmならびに長径50mmおよび短径15mmの卵形形状を持つ複合材料の平板として構成された。臨床デバイス用の足場中の全コラーゲンの含量は、デバイス1つ当たりおよそ120mgのI型ウシコラーゲンのうち送達されたコラーゲンの全量ではおよそ0.04mg/mm3のコラーゲンであった。等量のコラーゲン量を適切に拡大・縮小することができる場合、様々なサイズのM−Trapデバイスを得られてもよい。
初期コラーゲン濃度の最適化実験
M−trapデバイスの初期の概念的開発は、6.36μg/mm3の足場の投与レベルで癌細胞誘引剤としてラット尾部コラーゲンの可溶形を利用した。臨床デバイスに対する初期開発作業は、さらなる細胞捕捉のための誘引剤としてコラーゲンの投与レベルを増加させることが可能かどうかを調査した。可溶性コラーゲン材料の利用は、コラーゲン溶液の飽和濃度が制限因子になるので、足場に適用することができるコラーゲンの量を制限することが判明した。この問題を解決するために、繊維状ウシI型コラーゲンは医療用デバイスの中に複数の調節性の間隔を有するので、この生体材料を利用した。原繊維の長さが重合体足場の開口部より長く、コラーゲンが足場の内部を通して均一に分布することができないので、繊維状材料による足場のコーティングは、最初は効果がないことが判明した。コラーゲンを、平均粒度およそ10〜20μmに減少させるために振動ボールミル中で極低温で粉砕した。コラーゲンのタンパク質が変性しないことを確実にするために、コラーゲンの標準的ボールミル粉砕よりも低湿粉砕を選択した。
M−trapデバイスの初期の概念的開発は、6.36μg/mm3の足場の投与レベルで癌細胞誘引剤としてラット尾部コラーゲンの可溶形を利用した。臨床デバイスに対する初期開発作業は、さらなる細胞捕捉のための誘引剤としてコラーゲンの投与レベルを増加させることが可能かどうかを調査した。可溶性コラーゲン材料の利用は、コラーゲン溶液の飽和濃度が制限因子になるので、足場に適用することができるコラーゲンの量を制限することが判明した。この問題を解決するために、繊維状ウシI型コラーゲンは医療用デバイスの中に複数の調節性の間隔を有するので、この生体材料を利用した。原繊維の長さが重合体足場の開口部より長く、コラーゲンが足場の内部を通して均一に分布することができないので、繊維状材料による足場のコーティングは、最初は効果がないことが判明した。コラーゲンを、平均粒度およそ10〜20μmに減少させるために振動ボールミル中で極低温で粉砕した。コラーゲンのタンパク質が変性しないことを確実にするために、コラーゲンの標準的ボールミル粉砕よりも低湿粉砕を選択した。
ウシコラーゲンを極低温で粉砕した微粒子を利用して、様々な濃度の溶液を作製し、フィルムコーティング、さらに凍結乾燥過程により足場にコーティングした。凍結乾燥される過程は、顕微鏡レベルで足場内部における細胞接着のための表面積が追加される有利な形態を有し、足場とコラーゲンとを組み合わせる好ましい方法であると決定した。足場内に配置され、デバイスの機能性をなお維持できるコラーゲンの最大量を決定するために、実験を実行して、臨床サイズのデバイスにおける得られた複合材料の透過性対コラーゲンの全コーティング重量を調べた。これらの実験の結果を、図5に示す。0.0400mg/mm3の高用量レベルおよび0.0067mg/mm3の低用量レベルを前臨床モデルにおいてさらに調査すると決定した。M−Trapデバイスの前臨床サイズは、6mm×3mm×2mmであった。前臨床試験は、M−trapに対して最適化したコラーゲン濃度が0.0400のmg/mm3の高用量レベルのコラーゲンであることを実証した。
M−Trap製造過程
重合体足場内部の均質なコラーゲンコーティングは、およその粒子サイズ10〜20μmを持つ極低温で粉砕したコラーゲンの懸濁液の飽和、および足場内の脱イオン水により達成した。足場の表面に残ったコラーゲンの量の主要な制御は、懸濁液中のコラーゲンの初期濃度およびその後の乾燥過程の前にスポンジを完全に飽和することである。溶液中に必要なコラーゲンの量を決定するには、足場中に保持できる懸濁液の量をまず認識する必要がある。重合体足場は、材料の表面上に水を容易に吸着しない疎水性ポリカーボネートポリウレタン多孔質重合体である。しかしながら、それは、一旦回飽和させれば、表面張力により材料の微細な開口構造内に水を容易に吸収および保持するようになる。複数の実験に基づいて、飽和時に足場中に含有される全溶液は、足場1mm3当たり0.00086gである。
重合体足場内部の均質なコラーゲンコーティングは、およその粒子サイズ10〜20μmを持つ極低温で粉砕したコラーゲンの懸濁液の飽和、および足場内の脱イオン水により達成した。足場の表面に残ったコラーゲンの量の主要な制御は、懸濁液中のコラーゲンの初期濃度およびその後の乾燥過程の前にスポンジを完全に飽和することである。溶液中に必要なコラーゲンの量を決定するには、足場中に保持できる懸濁液の量をまず認識する必要がある。重合体足場は、材料の表面上に水を容易に吸着しない疎水性ポリカーボネートポリウレタン多孔質重合体である。しかしながら、それは、一旦回飽和させれば、表面張力により材料の微細な開口構造内に水を容易に吸収および保持するようになる。複数の実験に基づいて、飽和時に足場中に含有される全溶液は、足場1mm3当たり0.00086gである。
コラーゲンの所望の最適化した量(高用量)に基づいて、水1g当たり46.5mgのコラーゲンの溶液濃度を作製し、足場をコーティングする前に一定の攪拌下で維持した。足場の飽和を達成するために、材料を、液体の表面で繰り返し機械的に圧縮して、あらゆる混入空気を除去し、懸濁液で充填した。乾燥前に平らな液体境界層が足場の表面に形成されないように、コーティングした後に飽和した足場を多孔性基質上に配置した。材料を−45℃に凍結した後に真空下で昇華を利用する凍結乾燥過程によって、水を足場中の溶液から除去した。
足場中のコラーゲンの有効性をin vivoで経時的により大きくできるように、足場中のコラーゲンを、100mM 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)溶液中で、凍結乾燥した複合足場を飽和させ、凍結乾燥過程をさらなる回数繰り返すことにより架橋した。
M−Trap技術は、移植に対する優先的なニッチとして作用し、効率的に腹膜転移性細胞を捕捉する。
非分解性3D足場の表面にコラーゲン線維を持つM−Trapデバイスの作用機序を分析するために、重力によりその最も依存する部位へ送られる腹腔内の腹腔液の天然の流れを模倣することを意図し、分離した腫瘍細胞のトランスコエロミック(transcoelomic)播種の経路を提供するin vitroアッセイを開発した(Tanら.2006)。このために、90rpmの軌道運動に供したP6細胞培養プレート(直径3.5cm)に位置するM−Trapデバイスに2mL体積に再懸濁した250000個のカルセイン標識SKOV3細胞の捕捉を、評価した。コラーゲンがないBiomerix足場の繊維(Scaffold)と比較したコラーゲンでデコレーションしたM−Trapデバイスの線維(M−Trap)に対する蛍光標識SKOV3細胞の付着は、腹膜腔内の転移性播種の臨床シナリオに近く、腫瘍細胞の軌道循環によりさらに促進された(図6、パネルA)。これらの動的条件下で、コラーゲンの存在下における3D足場(M−Trap)へのSKOV3細胞の捕捉は、コラーゲン25〜250μgの用量依存的な方式と37℃で24、48および72時間の時間依存的な方式の両方においてコラーゲンなしの3D足場(Scaffold)への接着と比較して増強され(p<0.001;図6パネルB)、捕捉薬剤としてのコラーゲンの接着能力によるM−Trapに対するSKOV3細胞付着の特異性をさらに表す。これらのin vitro結果は、コラーゲンでコーティングされたBiomerix足場(尿素で架橋されたポリカーボネートポリウレタン)で構成されるM−Trapデバイスが、3D容器内で軌道循環している腫瘍細胞の接着に有利な表面を提供することにより非薬理学的作用機序で作用する可能性があることを実証し;臨床に置き換えると、M−Trapデバイスは、腹膜移植の天然の部位と競合し、転移性腫瘍細胞の付着および捕捉ための優先的なニッチを支持してもよい。
コラーゲンでコーティングされたBiomerix足場により構成されるM−Trapデバイスの非薬理学的作用機序をさらに確認するために、M−Trapデバイスの増加させた表面に37℃で24時間曝露した場合のカルセイン標識SKOV3細胞の動的捕捉を評価した。このために、コラーゲンなし(Scaffold)またはコラーゲンあり(M−Trap)の1もしくは2単位のBiomerix足場が、腹膜播種を模倣している動的アッセイにおいてSKOV3細胞を補足する能力を比較した。図7パネルAに示すとおり、増強した接着表面に細胞を曝露した場合にSKOV3細胞の捕捉が増加したことが証明された。同様に、蛍光標識SKOV3細胞をコラーゲンでコーティングしたBiomerix足場(M−Trap)または足場だけ(Scaffold)に曝露した場合、段階的に増加させた3D容器(直径3.5cmの細胞培養プレートに対応するP6;直径8.5cmの細胞培養プレートに対応するP100;および直径13.5cmの細胞培養プレートに対応するP150)において、SKOV3細胞捕捉の効率に有意差が観察されなかった(図7、パネルB)ことは、本発明のM−Trap技術の非薬理学的作用機序をさらに示す。最終的に、蛍光標識SKOV3細胞を、容器の中央(Scaffold1)もしくは外側(Scaffold3)、またはそれらの中間の位置(Scaffold2)に位置するコラーゲンでコーティングしたBiomerix足場(M−Trap)に曝露した場合、SKOV3細胞を捕捉する能力の増加が、24時間の軌道運動に供した溶液におけるSKOV3細胞の不均質な分布に対応して観察された(図7、パネルC)。コラーゲンでコーティングしたBiomerix足場で構成されるM−Trap中のSKOV3細胞の捕捉を、蛍光顕微鏡検査によりさらに確認した。画像はコラーゲンでコーティングした網状足場(図7、左パネルD)および足場の中に捕捉された蛍光SKOV3細胞(図7、右パネルD)を示す。コラーゲンでコーティングしたBiomerix網状足場(ポリカーボネートポリウレタン尿素基材)で構成されるM−Trapの非薬理学的作用機序を増強することに加えて、これらの結果は、臨床へのM−Trapデバイスの置き換えが、腹膜腔に対するM−Trap寸法の拡大縮小による制限を受けず、デバイスの最大表面と腹膜における最小の影響(すなわち、腸癒着を回避する)とを両立させ得る最適サイズへのM−Trapの再寸法を伴わなければならないことも実証する。
コラーゲンでコーティングしたBiomerix足場で構成されるM−Trapデバイスの安定性を、短期接着アッセイと組み合わせた放出実験によって評価した。簡潔には、M−Trapデバイスを、PBS 100μl中で0時間、48時間、5日間および7日間インキュベートした。指示した時間に、上清は、足場から放出された潜在的なコラーゲン痕跡と共に回収された。記述の通り短期接着アッセイを、足場(M−Trap)と対応する上清(SN)の両方で次いで実施した。観察できる(図8)ように、PBS条件においてインキュベート時間にしたがって足場の間または上清の間で、ならびに上清と対照基底接着の間に差異は見出せなかった。これらの結果は、M−Trapデバイスのインキュベーションの間にコラーゲンの放出が全く起こらないことを示し、少なくとも指示した時間でM−Trap技術の安定性を実証する。
M−trap技術は、腹膜腔に播種する接着能力を持つさらなる細胞型を効率的に捕捉する。
腹膜腔に播種する接着能力を持つさらなる型の細胞を捕捉するためのM−Trap技術の一般性は、臨床的により関連性があるニッチを生成して腹膜に播種する腫瘍細胞の天然の移植の部位と競合させることにより、M−Trapの有効性に有益に影響を与えてもよい。コラーゲンコーティングしたM−Trap原型を持つポリカーボネートポリウレタン足場が異なる型の細胞を捕捉する効率を、P6ウェルプレートに配置したM−Trap原型ならびに懸濁液に添加し軌道運動下で24時間インキュベートした蛍光標識細胞を用いる動的in vitro捕捉アッセイで評価した。図9に示すような実験終了時における懸濁液中の細胞と比較したM−Trapに捕捉された細胞のパーセンテージの定量化。評価した細胞型には、卵巣癌細胞系SKOV3、HUVEC内皮細胞、JURKATリンパ球、繊維芽細胞ならびに脂肪、骨髄(BM MSC)および臍帯(UC MSC)由来の間葉系幹細胞がある。これらの細胞型は、移植したM−Trapデバイスと相互作用できた腹膜腔に存在する細胞型を代表する。観察できるように、細胞捕捉の効率は、固体表面に付着するこれら細胞の容量と相関し、腫瘍細胞、繊維芽細胞、MSCおよび内皮細胞は速やかに接着表面に付着するので、効率的に捕捉される。それに対し、リンパ球は固体表面に効率的に接着せず、実際懸濁液中で成長する。これらの結果は、M−Trapの非薬理学的作用機序を補強し、腹膜腔に播種する細胞の捕捉に対して細胞のどんな能動的選択もないが受動的な接着性の影響がある。
M−Trapデバイスの有効性に対する化学療法の影響
卵巣癌に使用する標準的治療のありまたはなしで(パクリタキセル+カルボプラチン)SKOV3細胞の接着を評価した。
卵巣癌に使用する標準的治療のありまたはなしで(パクリタキセル+カルボプラチン)SKOV3細胞の接着を評価した。
コラーゲンでコーティングした重合体表面の接着性に対する化学療法の影響ならびに両方の薬物のIC50濃度へ個別におよび組み合わせて曝露した腫瘍細胞の接着性に対する影響を、別々に評価した。材料の接着性に対する化学療法の影響ために、ポリスチレンウェルプレートの底面を、5μg/μlコラーゲンで、37℃で終夜コーティングした。コーティングした表面を、IC50である7nMパクリタキセルおよびIC50/2である3.5nMパクリタキセルへ、IC50である10μMカルボプラチンおよびIC50/2である5μMカルボプラチンへ、ならびにそれぞれのIC50(0.7nMパクリタキセル、1μMカルボプラチン)およびIC50/2(0.35nMパクリタキセル;0.5μMカルボプラチン)でパクリタキセル+カルボプラチンの両方の組合せへ37℃で終夜曝露した。最終的に、短期接着アッセイを、洗浄および照度計による接着した細胞の定量化の前に、1時間異なる処理をしたウェルプレートに播種したカルセインで標識した50×104個のSKOV3細胞で実施した。図10に示すとおり、コラーゲンでコーティングした重合体表面を異なる化学療法条件に曝露した場合、SKOV3細胞接着に有意差は全く観察されなかった。
図12を参照して、SKOV3細胞の接着能力に対する化学療法の影響も評価した。このために、SKOV3細胞は、IC50である7nMパクリタキセルおよびIC50/2である3.5nMパクリタキセル、IC50である10μMカルボプラチンおよびIC50/2である5μMカルボプラチンで、ならびにそれぞれのIC50(0.7nMパクリタキセル、1μMカルボプラチン)およびIC50/2(0.35nMパクリタキセル;0.5μMカルボプラチン)でパクリタキセル+カルボプラチンの両方の組合せで、37℃で終夜処理された。短期接着アッセイを、記述のとおり無処理のコラーゲンコーティングしたウェルプレートに次いで実施し、統計的に有意でなかったが、両方の薬物の組合せで処理したSKOV3細胞のわずかに減弱した容量が観察された。
これらの結果から、化学療法が、材料およびM−Trap技術の接着性に影響を与えるべきでないと結論できる。腫瘍細胞が接着する容量に対する化学療法の効果が期待される可能性があるが、この効果は、腹膜壁に接着し、転移を生成する腫瘍細胞の能力に対して同様に影響を与えるべきである。
時間およびコラーゲン濃度依存的な方式でのM−Trap腫瘍細胞捕捉の定量化
in vitro試験は、in vitro系におけるデバイスの腫瘍細胞捕捉有効性に対するM−Trapデバイスの各要素(すなわち、ポリウレタン足場およびI型コラーゲンコーティング)の付加的寄与を評価することによってM−Trapの作用機序を決定した。腫瘍細胞捕捉有効性を、卵巣癌における腹膜播種を模倣する軌道接着アッセイにおいて評価した。M−Trapデバイスを、細胞培養皿に固定した。蛍光マーカーカルセインで標識したSKOV3細胞をプレートに添加し、90rpmのオービタルシェイカー上に5%CO2、37℃で24、48および72時間配置した。インキュベーション後に、M−Trapデバイスに捕捉されたSKOV3細胞を、照度計で定量化した。
in vitro試験は、in vitro系におけるデバイスの腫瘍細胞捕捉有効性に対するM−Trapデバイスの各要素(すなわち、ポリウレタン足場およびI型コラーゲンコーティング)の付加的寄与を評価することによってM−Trapの作用機序を決定した。腫瘍細胞捕捉有効性を、卵巣癌における腹膜播種を模倣する軌道接着アッセイにおいて評価した。M−Trapデバイスを、細胞培養皿に固定した。蛍光マーカーカルセインで標識したSKOV3細胞をプレートに添加し、90rpmのオービタルシェイカー上に5%CO2、37℃で24、48および72時間配置した。インキュベーション後に、M−Trapデバイスに捕捉されたSKOV3細胞を、照度計で定量化した。
使用した実験群は、以下の通りである:
・空の群:むきだしのM−Trap足場(ポリカーボネートポリウレタン足場、コラーゲンコーティングなし)。
・空の群:むきだしのM−Trap足場(ポリカーボネートポリウレタン足場、コラーゲンコーティングなし)。
・M−Trap低用量群:最小のコラーゲンコーティングで特別に製造したM−Trapデバイス。
・M−Trap高用量群:臨床用途ために設計した目標とするコラーゲンコーティングレベルを持つM−Trapデバイス。
図11に示すとおり、主要な捕捉作用はむきだしの足場により提供され、コラーゲンの濃度を増加させるにつれて接着有効性が補助的に改善された。加えて、インキュベーション時間の関数としての捕捉有効性の直線的増加により、デバイスの非薬理学的作用機序がさらに確認された。
M−Trap腫瘍細胞捕捉容量のin vitro評価
軌道接着アッセイにおけるM−Trapの腫瘍細胞飽和容量を評価した。増殖中のカルセインで標識した卵巣癌細胞(SKOV3)をプレートに添加し、24時間デバイスによりそのまま捕捉させ、その後、照度計で定量化した。6つの異なる量の卵巣癌細胞(1000000、5000000、10000000、15000000、20000000および25000000個)を捕捉するデバイスの容量を定量化した。研究結果を、図13に要約する。本研究は、単一のM−Trapデバイス(前臨床サイズ)の腫瘍細胞飽和容量が、およそ10000000個細胞であることを実証した。前臨床デバイスサイズを臨床サイズのデバイスに拡大縮小すると、患者において期待されるM−Trapの飽和容量は、1000×106個の転移性細胞に達し得る。2つのM−Trapデバイスが、患者において腫瘍細胞が一般的に播種する位置に移植されることになるので、臨床用途におけるM−Trapの飽和容量は2000×106個の転移性細胞に達する。
軌道接着アッセイにおけるM−Trapの腫瘍細胞飽和容量を評価した。増殖中のカルセインで標識した卵巣癌細胞(SKOV3)をプレートに添加し、24時間デバイスによりそのまま捕捉させ、その後、照度計で定量化した。6つの異なる量の卵巣癌細胞(1000000、5000000、10000000、15000000、20000000および25000000個)を捕捉するデバイスの容量を定量化した。研究結果を、図13に要約する。本研究は、単一のM−Trapデバイス(前臨床サイズ)の腫瘍細胞飽和容量が、およそ10000000個細胞であることを実証した。前臨床デバイスサイズを臨床サイズのデバイスに拡大縮小すると、患者において期待されるM−Trapの飽和容量は、1000×106個の転移性細胞に達し得る。2つのM−Trapデバイスが、患者において腫瘍細胞が一般的に播種する位置に移植されることになるので、臨床用途におけるM−Trapの飽和容量は2000×106個の転移性細胞に達する。
卵巣癌腹膜播種のマウスモデル
M−Trapの非薬理学的作用機序を、in vivoモデルにおけるデバイスの腫瘍細胞捕捉有効性に対するM−Trapデバイスの各要素(すなわち、ポリウレタン足場およびI型コラーゲンコーティング)の付加的寄与の評価により実証した。腫瘍細胞捕捉有効性を、卵巣癌腹膜播種のマウスモデル(SCIDマウス)において1週間の時点で評価した。このモデルにおいて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現するSKOV3卵巣癌細胞1×106個を腹膜内に注射した。注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光により転移の様式を分析してこのモデル系における天然の転移の様式を決定した。試験は、すい臓および性腺脂肪パッドがSKOV3細胞移植に対する天然の部位であることを実証した(図14A)。あるいは、M−Trapの影響を評価するために、SKOV3細胞注射の1週間前にデバイスを天然の転移部位と反対側の腹膜の内壁に外科的に移植した(図14B)。
M−Trapの非薬理学的作用機序を、in vivoモデルにおけるデバイスの腫瘍細胞捕捉有効性に対するM−Trapデバイスの各要素(すなわち、ポリウレタン足場およびI型コラーゲンコーティング)の付加的寄与の評価により実証した。腫瘍細胞捕捉有効性を、卵巣癌腹膜播種のマウスモデル(SCIDマウス)において1週間の時点で評価した。このモデルにおいて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現するSKOV3卵巣癌細胞1×106個を腹膜内に注射した。注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光により転移の様式を分析してこのモデル系における天然の転移の様式を決定した。試験は、すい臓および性腺脂肪パッドがSKOV3細胞移植に対する天然の部位であることを実証した(図14A)。あるいは、M−Trapの影響を評価するために、SKOV3細胞注射の1週間前にデバイスを天然の転移部位と反対側の腹膜の内壁に外科的に移植した(図14B)。
合計32匹のマウスを使用して、このモデルにおけるM−Trap作用機序および有効性を評価した。実験群の説明は、以下の通りである:
・対照群(n=8):ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光により腫瘍細胞播種の正常な様式を評価した。
・対照群(n=8):ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光により腫瘍細胞播種の正常な様式を評価した。
・空の群(n=8):むきだしのM−Trap足場(ポリカーボネートポリウレタン足場、コラーゲンコーティングなし)を、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1週間後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、動物を屠殺し、腫瘍細胞播種の様式を評価した。
・M−Trap低用量群(n=8):最小のコラーゲンコーティングで特別に製造したM−Trapデバイスをマウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1週間後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、動物を屠殺し、腫瘍細胞播種の様式を評価した。
・M−Trap高用量群(n=8):臨床用途のために設計した目標とするコラーゲンコーティングレベルを持つM−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1週間後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、動物を屠殺し、腫瘍細胞播種の様式を評価した。
図15Aに示すとおり、結果は、M−Trapの存在下における転移性卵巣腫瘍細胞の播種の様式が、転移の天然の病巣の根絶およびM−Trapデバイス内の固有の位置における転移の局在化を伴って完全に再形成されることを実証した。さらに、生物発光シグナルの定量化は、主要な捕捉薬剤として作用し、腫瘍細胞の65%がEmpty足場によって捕捉されるむきだしの足場による非薬理学的作用機序を確認させた(図15B)。M−Trap低用量群において腫瘍細胞のおよそ80%がM−Trapにより捕捉されたことは、接着容量の改善を実証した。最後に、M−Trap高用量群(臨床設計)において、注射した腫瘍細胞の100%がM−Trapにより捕捉されたことは、最適な補助的接着容量が臨床デザインによって達成されたことを例示した。
生物活性タンパク質として上皮成長因子(EGF)を含有する生分解性足場で構成される2つの比較デバイスのin vivo有効性
図16を参照して、生物活性タンパク質として上皮成長因子(EGF)を含有する生分解性足場で構成される2つの比較デバイスの有効性を、図14に記述されるin vivoモデルで評価した。足場からの制御されたEGFの放出は、足場において腫瘍細胞を薬理学的に捕捉するための化学誘因の勾配を生成した。ヒドロゲル技術の例として、足場の1つを、プルロニックF127 750mgの添加の前に、Xantana 25mgおよびEGF溶液(40mg/mL) 0.5mLを溶解することにより製造した。ナノパーティクルに基づく技術の例として、第2の足場を、ポロキサミンT1107 2.5mg+ヘパリン20μg+EGF 20μgを水300μLに溶解した後凍結乾燥し、アセトニトリル400μl+PLGA20mgに再懸濁し、綿実油4ml+0.5重量/体積%レクチンをさらに添加し、その後アセトニトリルの除去、濾過および凍結乾燥のために石油エーテル2mlを添加することにより製作した。図14に記載の通り、両方の技術の有効性を、腹膜腔における外科的移植の後に評価した。図16に示すとおり、プルロニック+EGF(図16A;n=2)とPLGA+EGF(図16B;n=4)デバイスの両方によって捕捉された腫瘍細胞の代表的な画像および定量化から、腹膜腔に転移している卵巣腫瘍細胞の部分的な捕捉が得られた。これは、腹膜腔における腫瘍細胞の完全な捕捉に対するポリウレタン足場+I型コラーゲンコーティングに基づくM−Trap技術の競合的優位性および結果として生じる転移性疾患の局在化を実証した。本研究は、M−Trap技術の接着非薬理学的作用機序が、腹膜腔における転移性腫瘍細胞の捕捉について化学走性薬理学技術を上回る改善を示すことも実証した。
図16を参照して、生物活性タンパク質として上皮成長因子(EGF)を含有する生分解性足場で構成される2つの比較デバイスの有効性を、図14に記述されるin vivoモデルで評価した。足場からの制御されたEGFの放出は、足場において腫瘍細胞を薬理学的に捕捉するための化学誘因の勾配を生成した。ヒドロゲル技術の例として、足場の1つを、プルロニックF127 750mgの添加の前に、Xantana 25mgおよびEGF溶液(40mg/mL) 0.5mLを溶解することにより製造した。ナノパーティクルに基づく技術の例として、第2の足場を、ポロキサミンT1107 2.5mg+ヘパリン20μg+EGF 20μgを水300μLに溶解した後凍結乾燥し、アセトニトリル400μl+PLGA20mgに再懸濁し、綿実油4ml+0.5重量/体積%レクチンをさらに添加し、その後アセトニトリルの除去、濾過および凍結乾燥のために石油エーテル2mlを添加することにより製作した。図14に記載の通り、両方の技術の有効性を、腹膜腔における外科的移植の後に評価した。図16に示すとおり、プルロニック+EGF(図16A;n=2)とPLGA+EGF(図16B;n=4)デバイスの両方によって捕捉された腫瘍細胞の代表的な画像および定量化から、腹膜腔に転移している卵巣腫瘍細胞の部分的な捕捉が得られた。これは、腹膜腔における腫瘍細胞の完全な捕捉に対するポリウレタン足場+I型コラーゲンコーティングに基づくM−Trap技術の競合的優位性および結果として生じる転移性疾患の局在化を実証した。本研究は、M−Trap技術の接着非薬理学的作用機序が、腹膜腔における転移性腫瘍細胞の捕捉について化学走性薬理学技術を上回る改善を示すことも実証した。
M−Trap腫瘍細胞捕捉有効性の持続性
M−Trapの差動的作用機序とも関係して、効果の継続時間および薬理学的競合デバイスの捕捉能力は、化学誘引物質の放出の動力学と関係している。理論的には、足場からのこれら因子の放出が減少するにつれて、化学誘因の勾配は減少し、捕捉有効性は徐々に失われる。M−Trapは、変化しない非薬理学的接着作用機序によって差動的にふるまうので、その有効性は経時的に完全であり続ける。腫瘍細胞を捕捉するデバイスのこの長期耐久性(持続性)は、移植の1、3および6ヵ月後に卵巣癌のマウスモデル(SCIDマウス)において腹膜腔に播種する卵巣癌細胞(SKOV3)を捕捉するM−Trapの有効性を評価することによって実証された。
M−Trapの差動的作用機序とも関係して、効果の継続時間および薬理学的競合デバイスの捕捉能力は、化学誘引物質の放出の動力学と関係している。理論的には、足場からのこれら因子の放出が減少するにつれて、化学誘因の勾配は減少し、捕捉有効性は徐々に失われる。M−Trapは、変化しない非薬理学的接着作用機序によって差動的にふるまうので、その有効性は経時的に完全であり続ける。腫瘍細胞を捕捉するデバイスのこの長期耐久性(持続性)は、移植の1、3および6ヵ月後に卵巣癌のマウスモデル(SCIDマウス)において腹膜腔に播種する卵巣癌細胞(SKOV3)を捕捉するM−Trapの有効性を評価することによって実証された。
実験群の説明は、以下の通りである:
・M−Trap群、1ヵ月(n=4):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1ヵ月後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、動物を屠殺し、生物発光により腫瘍細胞播種の様式を評価した。
・M−Trap群、1ヵ月(n=4):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1ヵ月後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、動物を屠殺し、生物発光により腫瘍細胞播種の様式を評価した。
・M−Trap群、3ヵ月(n=4):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。3ヵ月後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、動物を屠殺し、生物発光により腫瘍細胞播種の様式を評価した。
・M−Trap群、6ヵ月(n=4):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。6ヵ月後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、動物を屠殺し、生物発光により腫瘍細胞播種の様式を評価した。
図17に示すとおり、M−Trapデバイスが、各時点において4匹(4)全ての動物において全ての転移性細胞を捕捉したことから、転移性卵巣腹膜播種のin vivoモデルにおいて移植1、3および6ヵ月後でのデバイスの有効性が確認された。
腹膜疾患を局在化し、その特定の作用機序と関連するどんな新たな腹膜転移も根絶するM−Trapの能力を、徐放性モデルにおいて実証した(図18A〜Bの注射後M−Trapモデル)。さらに、疾患の局在化は、デバイスの目的とする臨床用途を模擬実験する卵巣癌のマウスモデルにおいて以下の前臨床試験において実証するとおり、生存における有益性をもたらした。外見、身体機能、環境、挙動、手順に特有の指標および自由観察に関する実験動物保護指令2010/63/EU指針により、研究の終了点をマウスのパフォーマンスステイタスの低下と定義した。一旦研究終了点に達したら、検体を屠殺し、生存期間を記録した。加えて、腫瘍細胞播種の様式を生物発光により評価し組織学的評価を実施した。
実験群の説明を、図によって図18Aに表し、以下の通りである:
対照群(n=5):M−Trap処置なしで、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞2500000個を腹膜内に注射して、癌細胞播種の天然の様式および広範囲の腹膜癌症に対する生存期間を決定した。
対照群(n=5):M−Trap処置なしで、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞2500000個を腹膜内に注射して、癌細胞播種の天然の様式および広範囲の腹膜癌症に対する生存期間を決定した。
M−Trap群(n=5):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。外科的移植の1週間後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞2500000個を、腹膜内に注射した。この群は、M−Trap処置に起因すると考えられる延命効果および腹膜疾患の局在化を表す。
再手術群(n=5):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。外科的移植の1週間後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞2500000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1ヵ月後に、M−Trapデバイスを、外科的に除去した。この群は、デバイスの目的とする臨床用途であるM−Trap処置および外科的除去に起因すると考えられる延命効果を表す。
注射後M−Trap群(n=5):ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞2500000個を、腹膜内に注射し、天然の部位に播種させた。1ヵ月後に、M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。この群は、原発腫瘍から放出される腫瘍細胞を捕捉し、それによって癌細胞播種の通常の様式および広範囲の腹膜癌症を緩和するデバイスの能力を評価する。
図18Bの代表的なin vivoで生物発光画像は、4つの研究群における3ヵ月の追跡調査での腹膜播種の異なる様式を例示する。この暫定的な概観は、疾患を効果的に局在化させる(M−Trap群)M−Trapの能力の証拠を提供し、さらに腹膜疾患の根絶が、転移性細胞捕捉後のデバイスの外科的除去(再手術群)によって達成可能であることを例示する。M−Trapは、一次病巣から播種する細胞を捕捉し(注射後M−Trap群)、それにより対照群に見られる広範囲な腹膜癌症を緩和することもできる。図18Cおよび表2に示すとおり、M−Trapは、生存転帰に対して有意な影響を有し;カプラン−マイヤー生存曲線は、対照群マウスが101日間(およそ3.2ヵ月)で終了点に再現性よく到達したことを例示する。注射後M−Trap群の動物が平均129日(およそ4.3ヵ月)後に研究終了点に到達したことから、追加のいかなる処置(すなわち、再手術)もなしに対照群に見られる腹膜癌症を緩和するM−Trapの能力が実証された。M−Trap群の動物が平均161.5日(およそ5.4ヵ月)後に研究終了点に到達したことから、さらに疾患の局在化の有益な効果が実証された。最終的に、再手術群のマウスが5ヵ月の時点で研究終了点に到達しなかったことから、目的とするM−Trap臨床用途に関係する有意な延命効果が実証された。図18Dにおける組織検査は、M−Trap技術による転移性腫瘍細胞の捕捉および疾患の局在化と関連した腹膜癌症の根絶を確認させた。
化学療法の存在下におけるM−Trap腫瘍細胞捕捉有効性
卵巣癌のマウスモデル(SCIDマウス)において腹膜腔に播種する卵巣癌細胞(SKOV3)を捕捉するM−Trapの有効性が、腹膜疾患の局在化をもたらすその差動作用機序のため、腹膜内投与された標準的化学療法(カルボタキソール、パクリタキセル+カルボプラチンの組合せ)のIC50用量の存在下で実証された。デバイスは、患者が腹腔内(IP)化学療法を受けている間に移植されることになるので、本研究は、標準IP化学療法レジメンの存在におけるデバイス有効性を検証するのに重大であった。
卵巣癌のマウスモデル(SCIDマウス)において腹膜腔に播種する卵巣癌細胞(SKOV3)を捕捉するM−Trapの有効性が、腹膜疾患の局在化をもたらすその差動作用機序のため、腹膜内投与された標準的化学療法(カルボタキソール、パクリタキセル+カルボプラチンの組合せ)のIC50用量の存在下で実証された。デバイスは、患者が腹腔内(IP)化学療法を受けている間に移植されることになるので、本研究は、標準IP化学療法レジメンの存在におけるデバイス有効性を検証するのに重大であった。
合計16匹のマウスを、本研究に使用した。実験群の説明は、以下の通りであった:
対照群(n=3):ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を腹膜内に注射して、癌細胞播種の正常な様式を評価した。腫瘍細胞注射の1週間後に、in vivo撮像系を使用して生物発光により腫瘍細胞播種の様式を評価した。
対照群(n=3):ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を腹膜内に注射して、癌細胞播種の正常な様式を評価した。腫瘍細胞注射の1週間後に、in vivo撮像系を使用して生物発光により腫瘍細胞播種の様式を評価した。
対照IC50群(n=3):ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。24時間後に、カルボタキソールのIC50用量を投与した。腫瘍細胞注射および化学療法の1週間後に、腫瘍細胞播種の様式を評価した。
M−Trap群(n=5):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。外科的移植の1週間後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、腫瘍細胞播種の様式を評価した。
M−Trap IC50群(n=5):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。外科的移植の1週間後に、ルシフェラーゼ発現SKOV3細胞1000000個を、腹膜内に注射した。24時間後に、カルボタキソールのIC50用量を投与した。腫瘍細胞注射および化学療法の1週間後に、腫瘍細胞播種の様式を評価した。
示したとおり、研究結果は、転移の様式(図19A)と生存腫瘍細胞のパーセンテージ(図19B)のいずれも、進行した卵巣癌の治療に使用する標準腹腔内化学療法(パクリタキセル+カルボプラチン)の存在下でM−Trap有効性を示す化学療法の存在下で改変されなかったことを実証した。
異なる卵巣癌細胞を捕捉するM−Trapのin vivo有効性
移植1週間後に、SKOV3腺癌細胞系に加えて:TOV112(漿液由来);OV90(類内膜由来);および卵巣癌患者の腹水液から単離した初代癌細胞の3つのさらなる卵巣癌細胞型を捕捉するM−Trapの有効性を、卵巣癌腹膜播種のマウスモデルにおいて評価した。
移植1週間後に、SKOV3腺癌細胞系に加えて:TOV112(漿液由来);OV90(類内膜由来);および卵巣癌患者の腹水液から単離した初代癌細胞の3つのさらなる卵巣癌細胞型を捕捉するM−Trapの有効性を、卵巣癌腹膜播種のマウスモデルにおいて評価した。
実験群の説明は、以下の通りである:
TOV112対照群(n=3):ルシフェラーゼ発現TOV112細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光によりTOV112細胞播種の正常な様式を評価した。
TOV112対照群(n=3):ルシフェラーゼ発現TOV112細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光によりTOV112細胞播種の正常な様式を評価した。
TOV112 M−Trap群(n=3):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1週間後に、ルシフェラーゼ発現TOV112細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光によりTOV112細胞播種の様式を評価した。
OV90対照群(n=3):ルシフェラーゼ発現OV90細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光によりOV90細胞播種の正常な様式を評価した。
OV90 M−Trap群(n=3):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1週間後に、ルシフェラーゼ発現OV90細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、生物発光によりOV90細胞播種の様式を評価した。
初代細胞対照群(n=3):蛍光マーカーDidで標識した卵巣癌患者の腹水液から単離した初代培養細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、蛍光により腫瘍細胞播種の正常な様式を評価した。
初代細胞M−Trap群(n=3):M−Trapデバイスを、マウスの腹膜内壁に外科的に移植した。1週間後に、蛍光マーカーDidで標識した卵巣癌患者の腹水液から単離した初代培養細胞1000000個を、腹膜内に注射した。腫瘍細胞注射の1週間後に、マウスを屠殺し、蛍光により腫瘍細胞播種の様式を評価した。
図20に示した代表的な画像は、臨床的に関連する異なる卵巣癌細胞を捕捉するM−Trap技術の一般性を実証した。M−Trapデバイス(右パネル)は、TOV112、OV90および初代卵巣癌細胞(左パネル)について対照群において示される腹膜播種の様式を完全に再形成した。各群からの生物発光/蛍光シグナルの定量化は、腹膜腔に播種する全ての転移性卵巣細胞を捕捉するM−Trapの能力を確認させた。
M−Trap腫瘍増殖リスク
M−Trapデバイスの使用による腫瘍成長および増殖のリスクを、マウス皮下腫瘍モデルにおいて評価した。本研究は、マウスにおいて3つの異なる条件下で皮下SKOV3細胞腫瘍を生成させるin vivo比較アッセイであり、2週および4週目に生物発光シグナルを定量化して腫瘍成長ならびに増殖を評価する。各動物に生成される3つの異なる腫瘍条件は、図21Aに示され、以下の通りに記述した:
陰性対照腫瘍(PBS):各検体の右下背側領域へのリン酸緩衝食塩水(PBS)50μLに再懸濁したSKOV3細胞2500000個の注射。PBS群は、天然の基底の環境および本来の腫瘍形成潜在性を表す。
M−Trapデバイスの使用による腫瘍成長および増殖のリスクを、マウス皮下腫瘍モデルにおいて評価した。本研究は、マウスにおいて3つの異なる条件下で皮下SKOV3細胞腫瘍を生成させるin vivo比較アッセイであり、2週および4週目に生物発光シグナルを定量化して腫瘍成長ならびに増殖を評価する。各動物に生成される3つの異なる腫瘍条件は、図21Aに示され、以下の通りに記述した:
陰性対照腫瘍(PBS):各検体の右下背側領域へのリン酸緩衝食塩水(PBS)50μLに再懸濁したSKOV3細胞2500000個の注射。PBS群は、天然の基底の環境および本来の腫瘍形成潜在性を表す。
陽性対照腫瘍(マトリゲル):各検体の上部背側領域(頸部)へのマトリゲル50μLに再懸濁したSKOV3細胞2500000個の注射。マトリゲルは、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に似ている標準的なタンパク質混合物である。マトリゲル群は、腫瘍成長の促進ために最も好ましい条件を表す。
試験デバイス腫瘍(M−Trap):M−TrapデバイスにおけるSKOV3細胞2500000個の播種、その後各検体の左下背側領域への播種したM−Trapデバイスの移植。
図21Bに示すとおり、マウス皮下腫瘍モデルにおいてM−Trapは、細胞捕捉に際して腫瘍成長に寄与しない。2および4週間後に、腫瘍成長の定量化は、陰性対照(PBS群)と類似の、陽性対照(マトリゲル群)より有意に低い増殖を示した。
M−Trap技術は、卵巣癌播種のin vivoモデルにおいて転移性腫瘍細胞を効率的に捕捉する
これらの証拠を卵巣癌播種および腹膜転移移植を模倣しているin vivoマウスモデルに置き換えるために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現しているSKOV3細胞(Steinkampら.2013 Front Oncol 3、97)1×106個を腹膜内に注射した。1週間後に、生物発光により評価した天然の腹膜播種の主要な様式は、SKOV3細胞移植の優先部位としてすい臓および性腺脂肪パッドを示した。M−Trapが、腹膜転移の天然の病巣と競合し、腹膜腔の中に播種する細胞を捕捉する可能性を評価するために、天然の腹膜移植片の様式を、Biomerix 3D足場または捕捉薬剤としてコラーゲンでコーティングしたBiomerix 3D足場の移植に対して生成したそれと比較した。このために、デバイス(足場単独またはM−trap)を、天然の転移部位であるすい臓および性腺脂肪パッドと反対側の腹膜の内壁に挿入した。1週間後に、SKOV3細胞を腹膜内に注射し、転移の局在化を注射の7日後に評価した。注目すべきことに、250μgコラーゲンでデコレーションしたBiomerix足場により構成されるM−Trapデバイスの存在下における転移性卵巣腫瘍細胞の播種の様式は、転移の規則的な場所の根絶およびコラーゲンがある足場内の固有の病巣における転移の局在化を伴って完全に再形成された。SKOV3細胞腹膜移植片の天然の様式(対照)、ならびにコラーゲンがないBiomerix足場(Scaffold)およびコラーゲンがあるM−Trapデバイス(M−Trap)により生成された様式に対する一連の群当たり3匹のマウスにおける生物発光シグナルの定量化により、腹膜腔の中に播種する腫瘍細胞を捕捉し、卵巣癌播種のマウスモデルにおいて転移の様式を完全に再形成するM−Trapの容量を確認した(p<0.0001)。
これらの証拠を卵巣癌播種および腹膜転移移植を模倣しているin vivoマウスモデルに置き換えるために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現しているSKOV3細胞(Steinkampら.2013 Front Oncol 3、97)1×106個を腹膜内に注射した。1週間後に、生物発光により評価した天然の腹膜播種の主要な様式は、SKOV3細胞移植の優先部位としてすい臓および性腺脂肪パッドを示した。M−Trapが、腹膜転移の天然の病巣と競合し、腹膜腔の中に播種する細胞を捕捉する可能性を評価するために、天然の腹膜移植片の様式を、Biomerix 3D足場または捕捉薬剤としてコラーゲンでコーティングしたBiomerix 3D足場の移植に対して生成したそれと比較した。このために、デバイス(足場単独またはM−trap)を、天然の転移部位であるすい臓および性腺脂肪パッドと反対側の腹膜の内壁に挿入した。1週間後に、SKOV3細胞を腹膜内に注射し、転移の局在化を注射の7日後に評価した。注目すべきことに、250μgコラーゲンでデコレーションしたBiomerix足場により構成されるM−Trapデバイスの存在下における転移性卵巣腫瘍細胞の播種の様式は、転移の規則的な場所の根絶およびコラーゲンがある足場内の固有の病巣における転移の局在化を伴って完全に再形成された。SKOV3細胞腹膜移植片の天然の様式(対照)、ならびにコラーゲンがないBiomerix足場(Scaffold)およびコラーゲンがあるM−Trapデバイス(M−Trap)により生成された様式に対する一連の群当たり3匹のマウスにおける生物発光シグナルの定量化により、腹膜腔の中に播種する腫瘍細胞を捕捉し、卵巣癌播種のマウスモデルにおいて転移の様式を完全に再形成するM−Trapの容量を確認した(p<0.0001)。
類似の結果が、細胞接着フィブロネクチンに含まれる細胞外基質タンパク質でコーティングしたBiomerix足場で構成されるM−Trapデバイスでin vitroとin vivoの両方で得られた。トランスコエロミック(transcoelomic)腹膜流を模倣しているin vitro動的軌道アッセイにおいて足場をデコレーションしているフィブロネクチンの濃度増加は、用量依存的な方式でSKOV3細胞を捕捉できた(図22、パネルA)。M−Trapデバイスのコラーゲン接着性と同様に、Biomerix足場のフィブロネクチンコーティングにより、卵巣播種のin vivoモデルにおいてほとんど全ての転移性腫瘍細胞がM−Trapデバイスの中に捕捉されている腹膜移植片の完全に再形成された様式が得られ(M−TrapデバイスにおけるSKOV3細胞移植片の生物発光画像;図22パネルB)、パネル図22Cにおいて定量化した。
Claims (37)
- 転移性癌の治療および/または予防に使用するための転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤であって、前記腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤が、細胞外基質(ECM)タンパク質または接着分子およびポリカーボネートポリウレタン基材を含む、薬剤。
- 転移性癌の治療および/または予防における転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の使用であって、前記腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤が、細胞外基質タンパク質または接着分子およびポリカーボネートポリウレタン基材である、使用。
- 転移性癌の治療および/または予防のためのデバイスまたは薬剤の調製における、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤の使用であって、前記転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤が、細胞外基質タンパク質または接着分子およびポリカーボネートポリウレタン基材である、使用。
- 前記細胞外基質(ECM)タンパク質または接着分子が、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンおよびフィブリリンを含む群から選択される、請求項1から3のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記細胞外基質(ECM)タンパク質または接着分子がコラーゲンである、請求項4に記載の薬剤または使用。
- 前記コラーゲンが繊維状I型ウシコラーゲンである、請求項5に記載の薬剤または使用。
- 足場中の全コラーゲンの含量が、足場1mm3当たり約0.01〜約0.2mgのコラーゲンである、請求項6または7に記載の薬剤または使用。
- 足場中の全コラーゲンの含量が、足場1mm3当たり少なくとも0.03mgのコラーゲンである、請求項6または7に記載の薬剤または使用。
- 前記細胞外基質タンパク質または接着分子が凍結乾燥される、請求項1から8のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記細胞外基質タンパク質または接着分子が、前記分子の共有結合で架橋された粒子を含む、請求項1から9のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記細胞外基質タンパク質または接着分子が、約5〜約100μmの平均粒度を有する、請求項1から10のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤が、細胞接着分子、または細胞接着を促進するかまたは転移性腫瘍細胞の移植に好ましい部位を生成する任意の分子を含む、請求項1から11のいずれかに記載の薬剤もしくは使用。
- 前記ポリカーボネートポリウレタン基材が、多孔性および/または3D足場である、請求項1から12のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 1つ以上の化学療法剤をさらに含む、請求項1から13のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記腫瘍細胞が、転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞である、請求項1から14のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記薬剤または使用が、癌転移の治療および/または予防用である、請求項1から15のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、すい臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞性癌、中皮腫、カポジ肉腫、卵巣癌、軟部組織肉腫、膠腫、黒色腫、小細胞および非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、基底細胞癌、尿路上皮管の移行上皮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃癌、膀胱癌、子宮肉腫、多発性骨髄腫、軟部組織および骨肉腫、ならびに胆管癌を含む群から選択される、請求項1から16のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 腹膜腔の癌の治療および/または予防に使用するためである、請求項1から17のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 腹膜癌の治療および/または予防に使用するためであり、前記薬剤または産物が対象の腹部における移植用である、請求項1から18のいずれかに記載の薬剤もしくは使用。
- 前記薬剤が、腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞もしくは原発性腫瘍から播種される任意の細胞を誘引する、請求項1から19のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 前記腫瘍細胞が、前記薬剤により一旦誘引および/もしくは捕捉されたら、除去または不活性化される、請求項1から20のいずれかに記載の薬剤または使用。
- 対象において腫瘍細胞、特に転移性腫瘍細胞、たとえば循環腫瘍細胞、播種性腫瘍細胞または原発性腫瘍から播種される任意の細胞を誘引および/または捕捉する方法であって、対象に請求項1から21のいずれかに記載の腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を投与することを含む、方法。
- 癌、特に転移性癌を治療および/または予防する方法であって、請求項1から21のいずれかに記載の腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
- 前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、すい臓癌、腎臓癌、前立腺癌、尿路上皮癌、食道癌、頭頸部癌、肝細胞性癌、中皮腫、カポジ肉腫、卵巣癌、軟部組織肉腫、膠腫、黒色腫、小細胞および非小細胞性肺癌、子宮内膜癌、基底細胞癌、尿路上皮管の移行上皮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、胃癌、膀胱癌、子宮肉腫、多発性骨髄腫、軟部組織および骨肉腫、胆管癌ならびにそこから播種した癌を含む群から選択される、請求項22または23に記載の方法。
- 前記癌が、腹膜腔の癌または腹膜腔に播種した癌である、請求項22から24のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が腹膜癌であり、前記薬剤が対象の腹部に移植される、請求項22から25のいずれかに記載の方法。
- 誘引および/または捕捉された腫瘍細胞を除去もしくは不活性化する工程をさらに含む、請求項22から26のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリカーボネートポリウレタン基材が尿素で架橋されている、請求項1から27のいずれかに記載の発明。
- 転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を製造する方法であって:
ECMタンパク質の懸濁溶液を調製する工程と;
ポリカーボネートポリウレタン基材を、前記ECMタンパク質の溶液中で飽和させることによりコーティングする工程と;
前記ポリカーボネートポリウレタン基材の中の前記ECMタンパク質を凍結乾燥して、転移性腫瘍細胞播種をモジュレートする薬剤を形成する工程と
を含む、方法。 - 前記ECMタンパク質が、コーティング前に、極低温でより小さい粒度に粉砕される、請求項29に記載の方法。
- 前記ECMタンパク質が、約10〜20μmの平均粒度に粉砕される、請求項29または30に記載の方法。
- 前記ECMタンパク質の溶液がECMタンパク質および脱イオン水の溶液であり、溶液中のECMタンパク質の量が、水1g当たり約30〜約80mgのECMタンパク質である、請求項29から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリカーボネートポリウレタン基材が、前記ECMタンパク質溶液流体の表面の下で繰り返し機械的に加圧することにより飽和されている、請求項29から32のいずれか一項に記載の方法。
- 材料を凍結させた後の真空下での昇華を利用する凍結乾燥過程によって乾燥が行われる、請求項29から33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ECMタンパク質を架橋することをさらに含む、請求項29から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ECMタンパク質がコラーゲンである、請求項29から35のいずれか一項に記載の方法。
- 任意に添付の図面を参照して明細書で実質的に記述されている、薬剤、使用または方法。
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