JP2022033880A - 糞便由来の細菌集団を含む組成物を特徴付けるためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】胃腸障害治療法として使用される、糞便由来の細菌集団を含む組成物を特徴付けるための方法を提供する。【解決手段】以下のステップを含む方法:糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ること、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物をケモスタットに含まれる培地に播種することによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、閾値レベルを上回るように選択的に増殖させるファクターを供給すること;糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を、該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、少なくとも1つの細菌株を増殖させること;ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および、少なくとも1つの細菌株を同定すること。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、2016年2月11日に出願された、「SYSTEMS AND METHODS FOR CHARACTERIZING COMPOSITIONS COMPRISING FECAL-DERIVED BACTERIAL POPULATIONS」という名称の、米国特許出願第62/294,125号の優先権を主張するものであり、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2016年2月11日に出願された、「SYSTEMS AND METHODS FOR CHARACTERIZING COMPOSITIONS COMPRISING FECAL-DERIVED BACTERIAL POPULATIONS」という名称の、米国特許出願第62/294,125号の優先権を主張するものであり、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の技術分野
本発明の技術分野は、胃腸障害を治療するための治療法に関する。特に、本発明は、胃腸障害を治療するための治療法として使用される、糞便由来の細菌集団を含む組成物を特徴付けるためのシステムおよび方法を提供する。
本発明の技術分野は、胃腸障害を治療するための治療法に関する。特に、本発明は、胃腸障害を治療するための治療法として使用される、糞便由来の細菌集団を含む組成物を特徴付けるためのシステムおよび方法を提供する。
本発明の背景技術
糞便由来の細菌集団を含む組成物を、胃腸障害を治療するために用いることができる。
糞便由来の細菌集団を含む組成物を、胃腸障害を治療するために用いることができる。
本発明のいくつかの実施形態は、単なる例として、添付の図面を参照して、本明細書に記載されている。ここで図面を詳細に参照すると、示された特徴は、一例として挙げられているのであり、本発明の実施形態の例示的な議論を目的とすることが強調される。この点に関して、図面を用いた記述により、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。
ある実施形態において、本発明は、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を特徴付けるための方法であって、以下のステップを含む方法を提供する:
a.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ることであって、ここで、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む;
b.糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物をケモスタットに含まれる培地に播種することによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように選択的に増殖させるファクターを供給すること;
c.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させること;
d.十分な時間の後、ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および
e.検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を同定すること。
a.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ることであって、ここで、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む;
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c.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させること;
d.十分な時間の後、ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および
e.検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を同定すること。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物はまた、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含み得る。
ある実施形態において、本方法はさらに、同定された検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかどうかを決定することを含む。
ある実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、ケモスタットでの培養に先立ち得られる糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の細菌16S rRNAプロファイルと、十分な時間培養した後に得られるケモスタット培地の細菌16S rRNAとを比較することによって同定される。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、健常患者の生態系を含む。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、健常患者の生態系を含む。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物と、第2の組成物とが同一である。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、腸内ディスバイオシス(dysbiosis)を有する患者に由来する。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、胃腸疾患を有する患者に由来する。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、腸内ディスバイオシスを有する患者に由来する。
ある実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、胃腸疾患を有する患者に由来する。
ある実施形態において、胃腸疾患は、ディスバイオシス、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile (Clostridioides difficile))感染症、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患および憩室性疾患からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、新たに同定された細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかを決定することは、新たに同定された細菌株に特異的なプライマーを用いた、第1の培養物または第2の培養物のいずれかのサンプルに対するPCRによって実施される。
本発明の詳細な説明
開示された利益および改善点の中で、本発明の他の目的および利点は、添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。本発明の詳細な実施形態が、本明細書に開示されている。しかしながら、開示された実施形態は、様々な形で具体化され得る本発明の単なる例示にすぎないことは、理解されるべきである。さらに、本発明の様々な実施形態に関連して与えられた各実施例は、例示を意図したものであり、限定を意図してはいない。
開示された利益および改善点の中で、本発明の他の目的および利点は、添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。本発明の詳細な実施形態が、本明細書に開示されている。しかしながら、開示された実施形態は、様々な形で具体化され得る本発明の単なる例示にすぎないことは、理解されるべきである。さらに、本発明の様々な実施形態に関連して与えられた各実施例は、例示を意図したものであり、限定を意図してはいない。
本明細書および特許請求の範囲を通して、以下の用語は、文脈上他に明確に指示されない限り、本明細書に明示的に関連する意味をとる。本明細書で使用される「ある実施形態において」および「いくつかの実施形態において」という言い回しは、必ずしも同じ実施形態を指しているとは限らないが、同じ実施形態を指してもよい。さらには、本明細書で使用される「別の実施形態において」および「いくつかの他の実施形態において」という言い回しは、必ずしも異なる実施形態を指しているとは限らないが、異なる実施形態を指しても良い。従って、以下に記載されるように、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明の様々な実施形態を容易に組み合わせることができる。
さらに、本明細書で使用される、「または」という用語は、包括的な「または」演算子であり、文脈上他に明確に指示されない限り、「および/または」という用語と同義である。「に基づいて」という用語は排他的ではなく、文脈上他に明確に指示されない限り、記載されていないさらなる要素に基づくことが可能である。さらに、本明細書を通して、「a」、「an」および「the」の意味は、複数の指示対象を含む。「in」の意味は、「in」および「on」を含む。
本明細書で使用される、「OTU」という用語は、核酸配列における類似性によって、種または種群を定義する操作上の分類単位を指し、該核酸配列には16S rRNA遺伝子配列が含まれるが、これに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明は、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を特徴付けるための方法であって、以下のステップを含む方法を提供する:
a.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ることであって、ここで、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む;
b.糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物をケモスタットに含まれる培地に播種することによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように選択的に増殖させるファクターを供給すること;
c.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を、該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させること;
d.十分な時間の後、ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および
e.検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を同定すること。
a.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ることであって、ここで、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む;
b.糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物をケモスタットに含まれる培地に播種することによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように選択的に増殖させるファクターを供給すること;
c.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を、該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させること;
d.十分な時間の後、ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および
e.検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を同定すること。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物はまた、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含み得る。
糞便由来の細菌集団
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、健常患者の生態系を含む。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、健常患者の生態系を含む。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、健常患者の生態系を含む。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物と、第2の組成物とが同一である。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、米国特許出願公開第20150044173号に開示される細菌組成物である。あるいは、いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、米国特許出願公開第20140363397号に開示される細菌組成物である。あるいは、いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、米国特許出願公開第20140086877号に開示される細菌組成物である。あるいは、いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、米国特許第8,906,668号に開示される細菌組成物である。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、米国特許出願公開第20150044173号に開示される細菌組成物である。あるいは、いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、米国特許出願公開第20140363397号に開示される細菌組成物である。あるいは、いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、米国特許出願公開第20140086877号に開示される細菌組成物である。あるいは、いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、米国特許第8,906,668号に開示される細菌組成物である。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、胃腸疾患を有する患者に由来する。いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、米国特許出願公開第20140342438号に開示される方法に従い、胃腸疾患を有する患者に由来する。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、胃腸疾患を有する患者に由来する。いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、米国特許出願公開第20140342438号に開示される方法に従い、胃腸疾患を有する患者に由来する。
いくつかの実施形態において、胃腸疾患は、ディスバイオシス、クロストリジウム・ディフィシル感染症、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患および憩室性疾患からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、以下を含む方法によって、患者から得られる:
a.新たに排泄された便サンプルを獲得し、嫌気性チャンバー内に(90%窒素、5%二酸化炭素、および5%水素の雰囲気下に)サンプルを置くこと;
b.便サンプルをバッファーに浸漬することにより、糞便スラリーを生成すること;および
c.遠心分離によって食品粒子を除去して、上清を保持すること。
a.新たに排泄された便サンプルを獲得し、嫌気性チャンバー内に(90%窒素、5%二酸化炭素、および5%水素の雰囲気下に)サンプルを置くこと;
b.便サンプルをバッファーに浸漬することにより、糞便スラリーを生成すること;および
c.遠心分離によって食品粒子を除去して、上清を保持すること。
いくつかの実施形態において、上清は、ケモスタットに播種するために用いられる。
本発明のいくつかの実施形態に従う培養方法
細菌集団を特徴付ける方法の有効性は、例えば、方法の感度などのファクターによって制限され得る(すなわち、細菌株が閾値レベルを超えて存在する場合にのみ、その方法が、特定の細菌株を検出することができる)。
細菌集団を特徴付ける方法の有効性は、例えば、方法の感度などのファクターによって制限され得る(すなわち、細菌株が閾値レベルを超えて存在する場合にのみ、その方法が、特定の細菌株を検出することができる)。
いくつかの実施形態において、閾値レベルは検出方法の感度に依存する。従って、いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を検出するには、検出方法の感度に応じて、より多くの量のサンプル物質が必要である。いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、ケモスタット中の糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物とより長い時間培養することにより、より多くの量の出発物質が得られる。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む。いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と一緒に培養される。
特定の理論に限定されることを意図するものではないが、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、インビトロでの培養に無反応であり得、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株がインビトロで増殖することを可能にするために、増殖因子、栄養補助剤、代謝産物、およびそれらの任意の組み合わせを提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値を超えるレベルまで培養し、それによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、検出され、同定されることを可能にする。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物および第2の組成物は、ケモスタット容器で培養される。いくつかの実施形態において、ケモスタット容器は、米国特許出願公開第20140342438号に開示される容器である。いくつかの実施形態において、ケモスタット容器は、図1Aおよび図1Bに記載される容器である。
いくつかの実施形態において、冷却器を停止し、培養液に窒素ガスを通気させることによって、ケモスタット容器を発酵システムからケモスタットに変換した。いくつかの実施形態において、圧力は、金属チューブ(元はサンプリングチューブ)から所定の圧力の高さで廃液を押し出し、ケモスタット培養物の所与の有効容積(working volume)の維持を可能にする。
いくつかの実施形態において、ケモスタット容器は、ろ過した窒素ガスをケモスタット容器に通気することによって嫌気性に保たれる。いくつかの実施形態では、温度および圧力は自動的に制御され維持される。
いくつかの実施形態において、ケモスタット培養物の培養pHは、5%(v/v)HCl(Sigma)および5%(w/v)NaOH(Sigma)を用いて維持される。
いくつかの実施形態において、ケモスタット容器の培地は、連続的に置換される。いくつかの実施形態において、置換は、遠位腸の滞留時間に等しい期間に渡って起こる。その結果、いくつかの実施形態では、培地は、400mL/日(16.7mL/時間)の速度でケモスタット容器に連続的に供給されて、24時間の保持時間を与え、これは、遠位腸の滞留時間を模倣するように設定された値である。別の滞留時間は、65時間(約148mL/日、6.2mL/時間)であることができる。いくつかの実施形態において、滞留時間は12時間と短くてよい。
いくつかの実施形態において、培地は、米国特許出願公開第20140342438号に開示される培地である。
いくつかの実施形態において、ケモスタットに、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が播種され、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物は、便由来の細菌集団を含む第1の組成物の添加に先立ち、24時間培養される。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、生きた培養物である。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の第1の培養物は、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間、ケモスタット中で、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共に培養される。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、14日を超える。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、14日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、13日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、12日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、11日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、10日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、9日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、8日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、7日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、6日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、5日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、4日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、3日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、2日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、1日である。
本発明のいくつかの実施形態に従う、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株の同定
いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、米国特許出願第20140342438号に開示される方法を用いて同定される。あるいは、いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、米国特許出願第20140363397号に開示される方法を用いて同定される。
いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、米国特許出願第20140342438号に開示される方法を用いて同定される。あるいは、いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、米国特許出願第20140363397号に開示される方法を用いて同定される。
いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、米国特許出願第20140342438号に開示される、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法と、それに続く、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE)による解析を用いて同定される。
いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、次世代シーケンシング法を用いて同定される。いくつかの実施形態において、次世代シーケンシング法の高感度化が、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、他の検出方法と比較してより短い培養時間で同定することを可能にする。いくつかの実施形態において、次世代シーケンシング法の高感度化が、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、他の検出方法と比較して少量のサンプル物質で同定することを可能にする。
いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、16S rRNA遺伝子の系統発生解析を用いて同定される。いくつかの実施形態において、16S rRNA遺伝子は、TACGG[AG]AGGCAGCAG(V31kプライマー、大腸菌(E.coli)16S rRNA遺伝子の343-357番目の位置)、およびAC[AG]ACACGAGCTGACGAC(V6rプライマー、大腸菌(E.coli)16S rRNA遺伝子の1078-1061番目の位置)からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
いくつかの実施形態において、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株は、国際特許出願公開第W02012045150号に記載される方法に従い、16S rRNA遺伝子の系統発生解析を用いて同定される。
いくつかの実施形態において、16S rRNA遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、続いて、増幅させた遺伝子配列を配列決定する。いくつかの実施形態において、16S rRNA遺伝子のV3k1 V6r領域を配列決定する。
いくつかの実施形態において、第1の系統発生プロファイルが得られる。いくつかの実施形態において、第1の系統発生プロファイルは、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させることに先立ち、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物中の細菌株の16S rRNA遺伝子を系統発生解析することにより得られる。
いくつかの実施形態において、第1の系統発生プロファイルは既知である。
いくつかの実施形態において、第2の系統発生プロファイルが得られる。いくつかの実施形態において、第2の系統発生プロファイルは、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させることに先立ち、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物中の細菌株の16S rRNA遺伝子を系統発生解析することにより得られる。
いくつかの実施形態において、第2の系統発生プロファイルは既知である。
いくつかの実施形態において、第3の系統発生プロファイルが得られる。いくつかの実施形態において、第3の系統発生プロファイルは、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させた後に、ケモスタット培地中の細菌株の16S rRNA遺伝子を解析することにより得られる。
いくつかの実施形態において、第3の系統発生プロファイルは、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の第1の培養物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と、ケモスタット中で、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間培養させた後に、ケモスタットから取り出したケモスタット培地を含むサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、14日を超える。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、14日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、13日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、12日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、11日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、10日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、9日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、8日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、7日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、6日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、5日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、4日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、3日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、2日である。いくつかの実施形態において、検出可能な量までさらに増殖させなければ存在を決定することができない少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間は、1日である。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物内の操作上の分類単位を決定するために、第1の系統発生プロファイルを解析する。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物内の操作上の分類単位を決定するために、第2の系統発生プロファイルを解析する。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させた後に、ケモスタット培地内の操作上の分類単位を決定するために、第3の系統発生プロファイルを解析する。
いくつかの実施形態において、決定された操作上の分類単位における細菌株の相対的存在量を計算する。
いくつかの実施形態において、第3の系統発生プロファイルは、第1の系統発生プロファイルもしくは第2の系統発生プロファイルのいずれか、または、第1の系統発生プロファイルおよび第2の系統発生プロファイルの両方と比較される。第3の系統発生プロファイルに存在し、第1の系統発生プロファイルもしくは第2の系統発生プロファイルのいずれか、または、第1の系統発生プロファイルおよび第2の系統発生プロファイルの両方に存在しない、任意の16S rRNA配列を選択して、検出閾値を超えるレベルまで増殖した細菌株を同定するために用いる。
いくつかの実施形態において、検出閾値を超えるレベルまで増殖した、同定された細菌株は、続いて単離され、精製される。いくつかの実施形態において、純粋な培養物は、検出閾値を超えるレベルまで増殖した、同定された細菌株から生成される。
いくつかの実施形態において、純粋な培養物は、米国特許出願公開第20140342438号に開示される方法に従い得られる。
いくつかの実施形態において、純粋な培養物は、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の第1の培養物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と、ケモスタット中で、少なくとも1つの細菌株を増殖させるのに十分な時間培養させた後に、検出閾値を超えるレベルまで増殖した同定された細菌株にとって選択的な条件で、ケモスタットから取り出したケモスタット培地を含むサンプルを培養することにより得られる。いくつかの実施形態において、選択条件は特定の酸素源である。いくつかの実施形態において、選択条件は抗生物質耐性である。
いくつかの実施形態において、本発明は、糞便由来の細菌集団の系統発生プロファイルを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、糞便由来の細菌集団の代謝プロファイルを提供する。いくつかの実施形態において、代謝プロファイルは、糞便由来の細菌集団を培養した培地中に存在する化学成分を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、糞便由来の細菌集団のゲノムプロファイルを提供する。
いくつかの実施形態において、系統発生プロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物内の細菌株の同一性を決定する。いくつかの実施形態において、系統発生プロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物内の細菌株が時間とともに変化するかどうかを決定する。
いくつかの実施形態において、系統発生プロファイを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物内の細菌株の同一性を決定する。いくつかの実施形態において、系統発生プロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物内の細菌株が時間とともに変化するかどうかを決定する。
いくつかの実施形態において、培地の代謝プロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物内の細菌株の同一性を決定する。いくつかの実施形態において、培地の代謝プロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物内の細菌株が時間とともに変化するかどうかを決定する。
いくつかの実施形態において、培地の代謝プロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物内の細菌株の同一性を決定する。いくつかの実施形態において、培地の代謝プロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物内の細菌株が時間とともに変化するかどうかを決定する。
いくつかの実施形態において、代謝プロファイルは、ケモスタット容器中の糞便由来の細菌集団を、規定の培地(すなわち、既知の成分の培地)で培養することにより得られる。いくつかの実施形態において、規定の培地の成分は変化し、その程度および変化する特定の成分は、特定の糞便由来の細菌集団に依存する。このようにして、糞便由来の細菌集団内に存在する同一性、純度または夾雑菌は、規定培地中の代謝産物の変化をアッセイすることによって、または馴化培地での培養後の培地の代謝産物プロファイルを調べることによって、決定することができる。
いくつかの実施形態において、糞便由来の細菌集団を意図的に改変して、特定の代謝産物を培地に追加すること、または、培地から除去することができる。この変更は、糞便由来の細菌集団での、特定の微生物株の追加または除去であり得る。例えば、例示を目的として、培地中の酪酸のレベルを増加させる必要がある場合に、酪酸を生産することが知られている微生物株を、糞便由来の細菌集団に追加することができる。別の例では、有害な代謝産物を産生する微生物株を、糞便由来の細菌集団から除去することができる。
別の例として、いくつかの実施形態において、代謝産物プロファイルは、特定の糞便由来の細菌集団に対する特定の食餌、薬剤の影響を決定するためのアッセイとして使用することができる。
いくつかの実施形態において、代謝プロファイルは、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に開示される、少なくとも1つの代謝産物を含む。
いくつかの実施形態において、代謝プロファイルは、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に開示される方法に従い、核磁気共鳴によって決定する。
いくつかの実施形態において、無細胞上清は、糞便由来の細菌集団の培養物から得られ、スペクトルは1H核磁気共鳴(NMR)分光法を用いて得られる。いくつかの実施形態において、スペクトルは糞便由来の細菌集団の代謝活性を表す。
いくつかの実施形態において、スペクトルを分析し、特定の代謝産物を特定して定量する。いくつかの実施形態において、特定された代謝産物は、糞便由来の細菌集団の代謝プロファイルを作製するために使用される。本発明のいくつかの実施形態に従う代謝プロファイルの例を、図2および図3に示す。
いくつかの実施形態において、代謝プロファイルは、Garner et al., FASEB J 21: 1675-1688 (2007)に開示される方法に従い、GC-MS(ガスクロマトグラフィー質量分析)により決定する。
いくつかの実施形態において、無細胞上清は、糞便由来の細菌集団の培養物から得られ、スペクトルはGC-MSを用いて得られる。いくつかの実施形態において、スペクトルは糞便由来の細菌集団の代謝活性を表す。
いくつかの実施形態において、スペクトルを分析し、特定の代謝産物を特定して定量する。いくつかの実施形態において、特定された代謝産物は、糞便由来の細菌集団の代謝プロファイルを作製するために使用される。
いくつかの実施形態において、培地のゲノムプロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物内の細菌株の同一性を決定する。いくつかの実施形態において、培地のゲノムプロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物内の細菌株が時間とともに変化するかどうかを決定する。
いくつかの実施形態において、培地のゲノムプロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物内の細菌株の同一性を決定する。いくつかの実施形態において、培地のゲノムプロファイルを使用して、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物内の細菌株が時間とともに変化するかどうかを決定する。
本発明の実施形態は数多く記載されているが、これらの実施形態が例示的であるにすぎず限定的ではないこと、および、多くの変更が当業者には明らかであり得ることは理解される。さらに、様々なステップは、任意の所望の順序で実行されてもよい(また、任意の所望のステップが追加されてもよく、および/または任意の所望のステップが除外されてもよい)。
以下の実施例に言及するが、これらの実施例は上記の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例示するものである。
実施例1:糞便由来の細菌集団の純度の決定
糞便由来の細菌集団(以下、MET-1+と称する)を得た。厳密に嫌気的に増殖させたFastidious Anaerobe Agar(FAA)上の株の単一のコロニー形態に基づく解析、および、純粋な16S全長サンガー配列を得ることに基づく解析は、最初に、16S rRNA配列16-6-S 14 LGにより同定された細菌株が、アシダミノコッカス・インテスティニ(Acidaminococcus intestini)の純粋株であること、すなわち、相対的存在量が100%であることを示した。図4は、サンガーシーケンシング法による16S rRNAプロファイリングで得られた配列データを示す。トレースは最小限のノイズを示し、これは純粋な株であることを示すとされている。比較のために、図5は、コンタミした株から、サンガーシーケンシング法による16S rRNAプロファイリングで得られた配列データを示す。図5は大量のノイズを示し、ソフトウエアは個々のピークを分離することができず、従って、ピークに対応するヌクレオチドを規定することができない。
糞便由来の細菌集団(以下、MET-1+と称する)を得た。厳密に嫌気的に増殖させたFastidious Anaerobe Agar(FAA)上の株の単一のコロニー形態に基づく解析、および、純粋な16S全長サンガー配列を得ることに基づく解析は、最初に、16S rRNA配列16-6-S 14 LGにより同定された細菌株が、アシダミノコッカス・インテスティニ(Acidaminococcus intestini)の純粋株であること、すなわち、相対的存在量が100%であることを示した。図4は、サンガーシーケンシング法による16S rRNAプロファイリングで得られた配列データを示す。トレースは最小限のノイズを示し、これは純粋な株であることを示すとされている。比較のために、図5は、コンタミした株から、サンガーシーケンシング法による16S rRNAプロファイリングで得られた配列データを示す。図5は大量のノイズを示し、ソフトウエアは個々のピークを分離することができず、従って、ピークに対応するヌクレオチドを規定することができない。
MET-1+の生きた培養物を、潰瘍性大腸炎(UC)患者(UC-3と呼ばれる)の糞便サンプル由来の規定の微生物群を播種したケモスタットに添加した。これらの実験の目的は、MET-1+配合物がUC患者の共生バランスが崩れた状態(dysbiotic)の微生物群を変えるかどうかを調べることであった。ケモスタット容器の内容物のサンプルを、処理前、MET-1+処理中、および処理後7日目および14日目に、それぞれ採取した。これらのサンプルを、Illumina Miseqプラットフォームによる16S rRNAプロファイリングに供し、続いて、Mothurプログラムを用いて解析した。
予想外にも、処理後のサンプルに生じたが、MET-1+配合物またはUC-3微生物群のいずれにも存在しなかった属に属する微生物の有意な増殖があった。これらの属は、アッカーマンシア(Akkermansia)、フラボニフラクター(Flavonifractor)およびサテレラ(Sutterella)と同定された。この増殖は、MET-1+配合物単離菌を、添加前に純度について慎重に精査したにもかかわらず、別々の2回の実験で生じた。
表1は、Mothurパイプラインを利用して作製した、分類されたOTUの相対的存在量プロファイルを示す。以下に示すのは、処理前サンプル(Before R#)の3つの反復試験データ、処理後14日目のサンプル(After R#)の3つの反復試験データ、およびすべてのサンプルにわたるOTUの存在量の合計%である。0.01%未満の合計%は有意でないとみなす(シーケンシングエラーを除去するために使用するカットオフ)。興味深い3つのOTUは太字で示す。これらのOTUは、処理後サンプルにのみ存在し、また0.01%の存在量のカットオフを上回っている。
予想外の最大の増殖は、MET-1+配合物が由来するドナーの規定の微生物群内に、存在することが当時知られていなかったアッカーマンシア(Akkermansia)の増殖であった。図6は、増殖したアッカーマンシア(Akkermansia)株の、サンガーシーケンシング法による16S rRNAプロファイリングで得られた配列データを示す。トレースは、純粋な培養物を示している。
MET-1+配合物の全てのストックに対し、一連のアッカーマンシア(Akkermansia)特異的プライマーを用いて、PCRによりアッカーマンシア(Akkermansia)の存在についてスクリーニングした。エチジウムブロマイドで染色した、結果として得られたアガロースゲルを以下に示し、図7においてポジティブコントロールはDNAラダーによる100のサンプルの後に、最初の3つのサンプルを含む。
図7を参照すると、可視バンドは、ストック16-6-S 14 LGに対応していた。同定された時点で、アッカーマンシア(Akkermansia)の単離を試みた。アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)は、炭素源としてムチンを利用することが知られており、3つのタイプの培地を、該種を単離する試みにおいて用いた。3つのタイプの培地は、Derrien et al. (2004)により記載された、ビタミン追加ありの基本培地およびビタミン追加無しの基本培地の両方、並びに、0.4%ムチンが追加されたFAA(Fmuと呼ばれる)である。
これらの最初の試みは成功しなかったため、栄養強化に加えて、相対的な抗生物質耐性を利用した。Allen-Vercoe研究室の別のドナー糞便サンプルから単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)株の抗生物質耐性プロファイルに基づき、継代培養後直ちに、51.tg モキシフロキサシンBBLセンシ・ディスク(Sensi Disc)を、Fmu培地に配置した。注意深い再ストリーキング(re-streaking)技術により、アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)と疑われる単離菌の純粋な培養物のみならず、特有のコロニー形態である3つの他の単離菌もまた得られた。これらの単離菌を、6S V3k1 V6r領域の16S rRNAサンガーシーケンシングに供した。本方法を通して、アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)が単離され、3つの他の単離菌は、ユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum)(既にMET-1+配合物に存在する)、フラボニフラクター・プラウティ(Flavonifractor plautii)およびサテレラ・ステルコリカニス(Sutterella stercoricanis)であることを決定した。フラボニフラクター(Flavonifractor)およびサテレラ(Sutterella)は、MET-1+配合物が由来するドナーの規定の微生物群に存在することが既に知られていた。
表2は、本発明のいくつかの実施形態の方法による培養の後に、V3k1 V6r領域の16S rRNAサンガーシーケンシングにより同定した、MET-1+配合物の16-6-S 14 LGストックからの単離菌を示す。
結論として、当初はアシダミノコッカス・インテスティニ(Acidaminococcus intestini)の純粋な培養物と考えられていた、MET-1+配合物の16-6-S 14 LGには、4つの異なる微生物株が混入していることを見出し、これらの単離に成功した:ユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum)、フラボニフラクター・プラウティ(Flavonifractor plautii)、サテレラ・ステルコリカニス(Sutterella stercoricanis)および、アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)。ユーバクテリウム・リモサム(Eubacterium limosum)は、MET-1+配合物の一部である。フラボニフラクター・プラウティ(フラボニフラクター(Flavonifractor plautii)およびサテレラ・ステルコリカニス(Sutterella stercoricanis)は、MET-1+配合物が由来するドナーの規定の群に存在することが知られていた。アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)は、いずれの群にも存在することが知られていなかった。後者の3つの株が単離されたことは、一連のケモスタットシステム実験で得られた予期せぬ結果に一致する。
実施例2:糞便由来の細菌集団の代謝産物プロファイルの決定
2つの糞便由来の細菌集団(以下、MET-1およびMET-2と称する)を得て、米国特許出願公開第20140342438号に記載される方法に従い、別々に培養した。MET-1集団は、米国特許出願第20140363397号に記載されている。MET-2集団は、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に記載されている。培養に先立ち、代謝産物プロファイルをNMRにより決定した。2つの糞便由来の細菌集団を10日間培養し、代謝産物プロファイルを、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に開示された方法に従い、NMRにより決定した。結果を表3に示す。表3より、細菌集団に由来する糞便は両方とも、培地に代謝産物が追加されていた。さらに、いくつかの代謝産物は、培地で枯渇していた。これらのデータは、例えばケモスタット容器などの規定された条件下で、米国特許出願公開第20140342438号に記載される方法に従い培養した後に得られる「代謝産物の特徴」を、特定の細菌集団を同定するために用いることができることを示唆する。あるいは、例えばケモスタット容器などの規定された条件下で、米国特許出願公開第20140342438号に記載の方法に従い培養した後に得られる「代謝産物の特徴」を、細菌集団の完全性を決定するために用いることができる。
2つの糞便由来の細菌集団(以下、MET-1およびMET-2と称する)を得て、米国特許出願公開第20140342438号に記載される方法に従い、別々に培養した。MET-1集団は、米国特許出願第20140363397号に記載されている。MET-2集団は、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に記載されている。培養に先立ち、代謝産物プロファイルをNMRにより決定した。2つの糞便由来の細菌集団を10日間培養し、代謝産物プロファイルを、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に開示された方法に従い、NMRにより決定した。結果を表3に示す。表3より、細菌集団に由来する糞便は両方とも、培地に代謝産物が追加されていた。さらに、いくつかの代謝産物は、培地で枯渇していた。これらのデータは、例えばケモスタット容器などの規定された条件下で、米国特許出願公開第20140342438号に記載される方法に従い培養した後に得られる「代謝産物の特徴」を、特定の細菌集団を同定するために用いることができることを示唆する。あるいは、例えばケモスタット容器などの規定された条件下で、米国特許出願公開第20140342438号に記載の方法に従い培養した後に得られる「代謝産物の特徴」を、細菌集団の完全性を決定するために用いることができる。
実施例3:糞便由来の細菌集団の代謝産物プロファイルの決定
2つの糞便由来の細菌集団(以下、MET-1およびMET-2と称する)を得て、米国特許出願公開第20140342438号に記載される方法に従い、別々に培養した。MET-1集団は、米国特許出願第20140363397号に記載されている。MET-2集団は、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に記載されている。培養に先立ち、代謝産物プロファイルをNMRにより決定した。2つの糞便由来の細菌集団を、表4に示した時間培養し、代謝産物プロファイルを、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に開示された方法に従いNMRにより決定した。代謝産物の濃度(mM)を表4に示す。
2つの糞便由来の細菌集団(以下、MET-1およびMET-2と称する)を得て、米国特許出願公開第20140342438号に記載される方法に従い、別々に培養した。MET-1集団は、米国特許出願第20140363397号に記載されている。MET-2集団は、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に記載されている。培養に先立ち、代謝産物プロファイルをNMRにより決定した。2つの糞便由来の細菌集団を、表4に示した時間培養し、代謝産物プロファイルを、Yen et al., J. Proteome Res. 2015, 14, 1472-1482に開示された方法に従いNMRにより決定した。代謝産物の濃度(mM)を表4に示す。
表4を参照すると、所与の糞便由来の細菌集団および所与の培養期間について、検出された代謝産物の観察された濃度にはほとんど変化がない。しかしながら、検出された代謝産物およびそれらの濃度(すなわち、代謝産物プロファイル)は、試験した2つの糞便由来の細菌集団の間で異なった。例えば、アラニンは、MET-1については1.1~1.15の範囲であるが、MET-2についてはわずか0.20~0.21の範囲である。別の例では、ピログルタミン酸は、MET-1では検出されないが、MET-2では0.8~1.3の範囲で検出される。これらのデータは、糞便由来の細菌集団の代謝プロファイルが、糞便由来の細菌集団を同定するか、定量化するか、または純度の決定をするのに有用であり得ることを示唆する。
個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個別に、参照により本明細書に組み込まれると示されているのと同程度に、本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、それらの参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されてはならない。セクションの見出しは、それらが使用される範囲において、必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
本発明の実施形態は数多く記載されているが、これらの実施形態が例示的であるにすぎず限定的ではないこと、および、多くの変更が当業者には明らかであり得ることは理解される。さらに、様々なステップは、任意の所望の順序で実行されてもよい(また、任意の所望のステップが追加されてもよく、および/または任意の所望のステップが除外されてもよい)。
本開示は、例えば、以下に関する。
[1]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を特徴付けるための方法であって、以下のステップを含む方法:
a.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ることであって、ここで、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む;
b.糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物をケモスタットに含まれる培地に播種することによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように選択的に増殖させるファクターを供給すること;
c.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させること;
d.十分な時間の後、ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および
e.検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を同定すること。
[2]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物もまた、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含み得る、前記[1]に記載の方法。
[3]
同定された検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかどうかを決定することをさらに含む、前記[1]に記載の方法。
[4]
検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、ケモスタットでの培養に先立ち得られる糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の細菌16S rRNAプロファイルと、十分な時間培養した後に得られるケモスタット培地の細菌16S rRNAとを比較することによって同定される、前記[1]に記載の方法。
[5]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、健常患者の生態系を含む、前記[1]に記載の方法。
[6]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、健常患者の生態系を含む、前記[1]に記載の方法。
[7]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物と、第2の組成物とが同一である、前記[1]に記載の方法。
[8]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、腸内ディスバイオシスを有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[9]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、胃腸疾患を有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[10]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、腸内ディスバイオシスを有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[11]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、胃腸疾患を有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[12]
胃腸疾患が、ディスバイオシス、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile(Clostridioides difficile))感染症、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患および憩室性疾患からなる群から選択される、前記[1]に記載の方法。
[13]
新たに同定された細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかを決定することが、新たに同定された細菌株に特異的なプライマーを用いた、第1の培養物または第2の培養物のいずれかのサンプルに対するPCRによって実施される、前記[1]に記載の方法。
本開示は、例えば、以下に関する。
[1]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を特徴付けるための方法であって、以下のステップを含む方法:
a.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ることであって、ここで、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む;
b.糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物をケモスタットに含まれる培地に播種することによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように選択的に増殖させるファクターを供給すること;
c.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させること;
d.十分な時間の後、ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および
e.検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を同定すること。
[2]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物もまた、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含み得る、前記[1]に記載の方法。
[3]
同定された検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかどうかを決定することをさらに含む、前記[1]に記載の方法。
[4]
検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、ケモスタットでの培養に先立ち得られる糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の細菌16S rRNAプロファイルと、十分な時間培養した後に得られるケモスタット培地の細菌16S rRNAとを比較することによって同定される、前記[1]に記載の方法。
[5]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、健常患者の生態系を含む、前記[1]に記載の方法。
[6]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、健常患者の生態系を含む、前記[1]に記載の方法。
[7]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物と、第2の組成物とが同一である、前記[1]に記載の方法。
[8]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、腸内ディスバイオシスを有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[9]
糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、胃腸疾患を有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[10]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、腸内ディスバイオシスを有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[11]
糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、胃腸疾患を有する患者に由来する、前記[1]に記載の方法。
[12]
胃腸疾患が、ディスバイオシス、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile(Clostridioides difficile))感染症、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患および憩室性疾患からなる群から選択される、前記[1]に記載の方法。
[13]
新たに同定された細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかを決定することが、新たに同定された細菌株に特異的なプライマーを用いた、第1の培養物または第2の培養物のいずれかのサンプルに対するPCRによって実施される、前記[1]に記載の方法。
Claims (13)
- 糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を特徴付けるための方法であって、以下のステップを含む方法:
a.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を得ることであって、ここで、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物は、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含む;
b.糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物をケモスタットに含まれる培地に播種することによって、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように選択的に増殖させるファクターを供給すること;
c.糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の生きた培養物を該播種したケモスタットに添加し、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物を、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物と共にケモスタットで十分な時間培養して、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を、検出閾値レベルを上回るように増殖させること;
d.十分な時間の後、ケモスタット培養物のサンプルを取り出すこと;および
e.検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を同定すること。 - 糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物もまた、検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株を含み得る、請求項1に記載の方法。
- 同定された検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかどうかを決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 検出閾値未満のレベルの少なくとも1つの細菌株が、ケモスタットでの培養に先立ち得られる糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物の細菌16S rRNAプロファイルと、十分な時間培養した後に得られるケモスタット培地の細菌16S rRNAとを比較することによって同定される、請求項1に記載の方法。
- 糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、健常患者の生態系を含む、請求項1に記載の方法。
- 糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、健常患者の生態系を含む、請求項1に記載の方法。
- 糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物と、第2の組成物とが同一である、請求項1に記載の方法。
- 糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、腸内ディスバイオシスを有する患者に由来する、請求項1に記載の方法。
- 糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物が、胃腸疾患を有する患者に由来する、請求項1に記載の方法。
- 糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、腸内ディスバイオシスを有する患者に由来する、請求項1に記載の方法。
- 糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物が、胃腸疾患を有する患者に由来する、請求項1に記載の方法。
- 胃腸疾患が、ディスバイオシス、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile(Clostridioides difficile))感染症、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患および憩室性疾患からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 新たに同定された細菌株が、糞便由来の細菌集団を含む第1の組成物に由来するか、または、糞便由来の細菌集団を含む第2の組成物に由来するかを決定することが、新たに同定された細菌株に特異的なプライマーを用いた、第1の培養物または第2の培養物のいずれかのサンプルに対するPCRによって実施される、請求項1に記載の方法。
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