CN109414462A - 用于表征包含粪便来源的细菌群体的组合物的系统和方法 - Google Patents

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S·兰格
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Abstract

在一个实施方案中，本发明提供了表征包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的方法，其包括步骤：获得所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物，通过在含有培养基的恒化器中接种包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来提供因子，所述因子能选择性地将至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述阈值水平以上；将所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物添加到所述接种的恒化器中，并且将所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间，所述时间足以扩增所述至少一种细菌菌株；取出恒化器培养的样品；以及鉴定所述至少一种细菌菌株。

Description

用于表征包含粪便来源的细菌群体的组合物的系统和方法
相关申请
本申请要求2016年2月11日提交的标题为“用于表征包含粪便来源的细菌群体的组合物的系统和方法(SYSTEMS AND METHODS FOR CHARACTERIZING COMPOSITIONSCOMPRISING FECAL-DERIVED BACTERIAL POPULATIONS)”的美国专利申请号62/294,125的优先权，出于所有目的将该申请通过引用其整体并入本文。
技术领域
本发明的领域涉及用于治疗胃肠道病症的疗法。特别地，本发明提供了用于表征用作治疗胃肠道病症的治疗剂的包含粪便来源的细菌群体的组合物的系统和方法。
背景技术
包含粪便来源的细菌群体的组合物可用于治疗胃肠道病症。
附图说明
本文仅以示例的方式通过参考附图描述了本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所示的细节是以示例的方式并且是为了对本发明的实施方案进行说明性讨论的目的。就此而言，说明书连同附图使得本领域技术人员明白可如何实施本发明的实施方案。
图1A和图1B示出了在根据本发明的一些实施方案所述的方法中使用的单级恒化器容器。
图2示出了根据本发明的一个实施方案的代谢谱。
图3示出了根据本发明的一个实施方案的代谢谱。
图4示出了经由Sanger测序法的16S rRNA谱分析获得的序列数据。
图5示出了通过经由Sanger测序法的16S rRNA谱分析获得的序列数据。
图6示出了经由Sanger测序法的16S rRNA谱分析获得低于检测阈值水平的至少一种细菌菌株的序列数据，该至少一种细菌菌株通过根据本发明的一些实施方案的方法培养至可通过Sanger测序检测的水平。
图7示出了使用对阿克曼菌属(Akkermansia)特异性的引物进行MET-1+样品的PCR反应的琼脂糖凝胶结果。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了表征包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的方法，包括步骤：
a.获得包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物，其中包含粪便来源的细菌群体的第一组合物包含至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株；
b.通过在含有培养基的恒化器中接种包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来提供因子，所述因子能选择性地将至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上；
c.将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物添加到所述接种的恒化器中，并且将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间，所述时间足以将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上；
d.在所述足够的时间后取出恒化器培养物的样品；以及
e.鉴定所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物也可包含至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株；
在一个实施方案中，该方法进一步包括确定所鉴定的至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株是否来自包含粪便来源的细菌群体的第一组合物，或来自包含粪便来源的细菌群体的第二组合物。
在一个实施方案中，通过将在恒化器中培养之前获得的包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的细菌16S rRNA谱与在培养足够的时间后获得的恒化器培养基的细菌16SrRNA进行比较，来鉴定所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物包含健康患者(healthy patient)的生态系统。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物包含健康患者的生态系统。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物和第二组合物相同。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物来源于患有肠道生态失调的患者。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物来源于患有胃肠道疾病的患者。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来源于患有肠道生态失调的患者。
在一个实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来源于患有胃肠道疾病的患者。
在一个实施方案中，胃肠道疾病选自下组，该组由以下项组成：生态失调、艰难梭菌(Clostridioides difficile)感染、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、炎性肠病和憩室病。
在一些实施方案中，通过使用对新鉴定的细菌菌株特异性的引物对第一或第二培养物的样品进行PCR，来确定新鉴定的细菌菌株是否来自包含粪便来源的细菌群体的第一组合物或来自包含粪便来源的细菌群体的第二组合物。
具体实施方案
在已经公开的那些益处和改进中，本发明的其他目的和优点将从以下结合附图的描述中变得显而易见。本文公开了本发明的详细实施方案；然而，应该理解，所公开的实施方案仅仅是对可以以各种形式实施的本发明的说明。此外，结合本发明的各种实施方案给出的每个实施例旨在是说明性的而非限制性的。
在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有明确规定，否则以下术语采用与本文明确相关的含义。尽管有可能，但如在本文使用的短语“在一个实施方案中”和“在一些实施方案中”不一定指相同的实施方案。此外，尽管有可能，如在本文使用的短语“在另一个实施方案中”和“在一些其他实施方案中”不一定指不同的实施方案。因此，如下所述，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以容易地组合本发明的各种实施方案。
此外，如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则术语“或”是包含性的“或”运算符，并且等同于术语“和/或”。除非上下文另有明确规定，否则术语“基于”并非排他性的，并且允许基于未描述的附加因素。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述”的含义包括复数引用。“在...中”的含义包括“在...中”和“在...上”。
如本文所用，术语“OTU”是指操作分类单元(operational taxonmic unit)，其通过核酸序列(包括但不限于16S rRNA基因序列)中的相似性定义物种或物种组。
在一些实施方案中，本发明提供了表征包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的方法，包括步骤：
a.获得包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物，其中包含粪便来源的细菌群体的第一组合物包含至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株；
b.通过在含有培养基的恒化器中接种包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来提供因子，所述因子能选择性地将至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上；
c.将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物添加到所述接种的恒化器中，并且将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间，所述时间足以将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上；
d.在所述足够的时间后取出恒化器培养物的样品；以及
e.鉴定所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物也包含至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
粪便来源的细菌群体
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物包含健康患者的生态系统。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物包含健康患者的生态系统。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物和第二组合物相同。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物是在美国专利申请公开号20150044173中公开的细菌组合物。或者，在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物是在美国专利申请公开号20140363397中公开的细菌组合物。或者，在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物是在美国专利申请公开号20140086877中公开的细菌组合物。或者，在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物是在美国专利号8,906,668中公开的细菌组合物。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物是在美国专利申请公开号20150044173中公开的细菌组合物。或者，在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物是在美国专利申请公开号20140363397中公开的细菌组合物。或者，在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物是在美国专利申请公开号20140086877中公开的细菌组合物。或者，在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物是在美国专利号8,906,668中公开的细菌组合物。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物来源于患有胃肠道疾病的患者。在一些实施方案中，根据美国专利申请公开号20140342438中公开的方法，从患有胃肠道疾病的患者得到包含粪便来源的细菌群体的第一组合物。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来源于患有胃肠道疾病的患者。在一些实施方案中，根据美国专利申请公开号20140342438中公开的方法，从患有胃肠道疾病的患者得到包含粪便来源的细菌群体的第二组合物。
在一些实施方案中，胃肠道疾病选自下组，该组由以下项组成：生态失调、艰难梭菌感染、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、炎性肠病和憩室病。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第二组合物通过以下方法从患者获得，该方法包括：
a.获得新鲜排泄的粪便样品，并将样品置于厌氧室中(在90％N2、5％CO2和5％H2的气氛中)；
b.通过将粪便样品在缓冲液中浸软来产生粪便浆体；以及
c.通过离心除去食物颗粒，并保留上清液。
在一些实施方案中，上清液用于接种恒化器。
根据本发明的一些实施方案的培养方法
表征细菌群体的方法的有效性可受到因素例如方法的灵敏度的限制(即该方法仅能够检测特定的细菌菌株，条件是该菌株高于阈值水平存在)。
在一些实施方案中，阈值水平依赖于检测方法的灵敏度。因此，在一些实施方案中，依赖于检测方法的灵敏度，需要更多量的样品材料来检测所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。在一些实施方案中，通过在恒化器中培养包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物更长的时间段来获得更多量的起始材料。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物包含至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。在一些实施方案中，将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物一起培养。
不旨在受限于特定理论，所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株可能难以在体外培养，并且包含粪便来源的细菌群体的第二组合物提供生长因子、补充剂、代谢物及其任何组合，使得所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株能够在体外生长。在一些实施方案中，本发明的方法将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株培养至高于检测阈值的水平，从而使得所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株能够被检测到且鉴定。
在一些实施方案中，将包含粪便来源的细菌群体的第一和第二组合物在恒化器容器中进行培养。在一些实施方案中，恒化器容器是在美国专利申请公开号20140342438中公开的容器。在一些实施方案中，恒化器容器是图1A和图1B中描述的容器。
在一些实施方案中，通过阻断冷凝器并使氮气鼓泡通过培养物，将恒化器容器由发酵系统转化为恒化器。在一些实施方案中，压力迫使废物在设定高度从金属管(以前称为采样管)中排出并且允许维持恒化器培养物的给定工作体积。
在一些实施方案中，通过使过滤的氮气鼓泡通过恒化器容器来使恒化器容器保持厌氧。在一些实施方案中，自动控制和维持温度和压力。
在一些实施方案中，使用5％(v/v)HCl(Sigma)和5％(w/v)NaOH(Sigma)维持恒化器培养物的培养pH。
在一些实施方案中，恒化器容器的培养基被不断更换。在一些实施方案中，在与远端肠的停留时间相同的时间段内进行更换。因此，在一些实施方案中，将培养基以400mL/天(16.7mL/小时)的速率连续进料至恒化器容器中，以得到24小时的停留时间，该值是被设定为模拟远端肠的停留时间的值。备选的停留时间可以为65小时(约148mL/天、6.2mL/小时)。在一些实施方案中，停留时间可以短至12小时。
在一些实施方案中，培养基是在美国专利申请公开号20140342438中公开的培养基。
在一些实施方案中，用包含粪便来源的细菌群体的第二组合物接种恒化器，并且在添加包含粪便来源的细菌群体的第一组合物之前，将包含粪便来源的细菌群体的第二组合物培养24小时。
在一些实施方案中，包含粪便来源的细菌群体的第一组合物是活培养物。
在一些实施方案中，将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的第一培养物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在恒化器中培养一定的时间，所述时间足以使所述至少一种细菌菌株扩增，在没有进一步扩增至可以检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间大于14天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为14天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为13天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为12天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为11天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为10天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为9天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为8天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为7天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为6天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为5天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为4天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为3天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为2天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为1天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。
根据本发明的一些实施方案鉴定所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株
在一些实施方案中，使用美国专利申请号20140342438中公开的方法鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。或者，在一些实施方案中，使用美国专利申请号20140363397中公开的方法鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
在一些实施方案中，使用在美国专利申请号20140342438中公开的基于聚合酶链反应的方法以及随后变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析来鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
在一些实施方案中，使用下一代测序法鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。在一些实施方案中，与其他检测方法相比，下一代测序法的提高的灵敏度使得能够在较短的培养时间内鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。在一些实施方案中，与其他检测方法相比，下一代测序法的提高的灵敏度使得能够用较少量的样品材料鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
在一些实施方案中，使用16S rRNA基因的系统发育分析鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。在一些实施方案中，使用具有选自下组的核苷酸序列的核酸引物通过聚合酶链反应扩增16S rRNA基因，该组由以下项组成：TACGG[AG]AGGCAGCAG(V31k引物，大肠杆菌16S rRNA基因的位置343-357)和AC[AG]ACACGAGCTGACGAC(V6r引物，大肠杆菌16SrRNA基因的位置1078-1061)。
在一些实施方案中，根据国际专利申请公开号W02012045150中所述的方法，使用16S rRNA基因的系统发育分析鉴定至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
在一些实施方案中，通过聚合酶链反应扩增16S rRNA基因，并随后对扩增的基因的序列进行测序。在一些实施方案中，对16S rRNA基因的V3k1 V6r区域进行测序。
在一些实施方案中，获得第一系统发育谱。在一些实施方案中，在将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间(所述时间足以将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上)之前，通过对包含粪便来源的细菌群体的第一组合物中的细菌菌株的16S rRNA基因进行系统发育分析获得第一系统发育谱。
在一些实施方案中，所述第一系统发育谱是已知的。
在一些实施方案中，获得第二系统发育谱。在一些实施方案中，在将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间(所述时间足以将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上)之前，通过对包含粪便来源的细菌群体的第二组合物中的细菌菌株的16S rRNA基因进行系统发育分析获得第二系统发育谱。
在一些实施方案中，所述第二系统发育谱是已知的。
在一些实施方案中，获得第三系统发育谱。在一些实施方案中，在将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间(所述时间足以将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上)之后，通过在恒化器培养基中的细菌菌株的16S rRNA基因的系统发育分析获得第三系统发育谱。
在一些实施方案中，在已将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的第一培养物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在恒化器中培养一定的时间(所述时间足以使所述至少一种细菌菌株扩增，在没有进一步扩增至可以检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在)之后，由从恒化器取出的包含恒化器培养基的样品获得第三系统发育谱。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间大于14天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为14天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为13天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为12天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为11天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为10天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为9天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为8天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为7天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为6天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为5天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为4天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为3天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为2天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。在一些实施方案中，足以扩增至少一种细菌菌株的时间为1天，在没有进一步扩增至可检测的量的情况下无法确定该至少一种细菌菌株的存在。
在一些实施方案中，分析第一系统发育谱以确定所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物内的操作分类单元。
在一些实施方案中，分析第二系统发育谱以确定所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物内的操作分类单元。
在一些实施方案中，在将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间(所述时间足以将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上)之后，分析第三系统发育谱以确定所述恒化器培养基内的操作分类单元。
在一些实施方案中，计算所述确定的操作分类单元中的细菌菌株的相对丰度。
在一些实施方案中，将第三系统发育谱与第一系统发育谱或第二系统发育谱，或第一系统发育谱和第二系统发育谱二者进行比较。选择存在于第三系统发育谱中而不存在于第一系统发育谱或第二系统发育谱中，或在第一系统发育谱和第二系统发育谱中都不存在的任何16S rRNA序列，并用来鉴定已扩增至高于检测阈值水平的细菌菌株。
在一些实施方案中，随后分离和纯化所述已经扩增至高于检测阈值水平的经鉴定的细菌菌株。在一些实施方案中，产生了已经扩增至高于检测阈值水平的经鉴定的细菌菌株的纯培养物。
在一些实施方案中，根据美国专利申请公开号20140342438中公开的方法获得纯培养物。
在一些实施方案中，在已将包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的第一培养物与包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在恒化器中培养一定的时间(所述时间足以使所述至少一种细菌菌株扩增)之后，在对于已扩增至检测阈值以上的水平的经鉴定的细菌菌株选择性的条件下通过培养从恒化器取出的包含恒化器培养基的样品获得纯培养物。在一些实施方案中，选择性条件是特定的碳源。在一些实施方案中，选择性条件是抗生素抗性。
在一些实施方案中，本发明提供了粪便来源的细菌群体的系统发育谱。在一些实施方案中，本发明提供了粪便来源的细菌群体的代谢谱。在一些实施方案中，代谢谱包含培养基中存在的化学成分，在该培养基中已培养了粪便来源的细菌群体。在一些实施方案中，本发明提供了粪便来源的细菌群体的基因组谱。
在一些实施方案中，系统发育谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第一组合物内的细菌菌株的身份。在一些实施方案中，系统发育谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第一组合物中的细菌菌株是否随时间变化。
在一些实施方案中，系统发育谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第二组合物内的细菌菌株的身份。在一些实施方案中，系统发育谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第二组合物中的细菌菌株是否随时间变化。
在一些实施方案中，培养基的代谢谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第一组合物内的细菌菌株的身份。在一些实施方案中，培养基的代谢谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第一组合物中的细菌菌株是否随时间变化。
在一些实施方案中，培养基的代谢谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第二组合物内的细菌菌株的身份。在一些实施方案中，培养基的代谢谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第二组合物中的细菌菌株是否随时间变化。
在一些实施方案中，通过在恒化器容器中在经定义的培养基(即，具有已知成分的培养基)中培养粪便来源的细菌群体来获得代谢谱。在一些实施方案中，经定义的培养基的成分将改变，并且改变的程度和改变的具体成分依赖于具体的粪便来源的细菌群体。以这种方式，可以通过测定经定义的培养基中代谢物的变化，或通过检测在条件培养基中培养后培养基的代谢物谱来确定粪便来源的细菌群体内的身份、纯度或存在的污染物。
在一些实施方案中，可以有意地改变粪便来源的细菌群体，以添加或从培养基中除去特定的代谢物。所述改变可以是添加某些微生物菌株或从粪便来源的细菌群体中除去某些微生物菌株。例如，以说明的方式，如果需要培养基中丁酸盐的水平增加，则可以将已知产生丁酸盐的微生物菌株添加至粪便来源的细菌群体中。在另一个实施例中，可以从粪便来源的细菌群体中除去产生有害代谢物的微生物菌株。
在另一个实施例中，在一些实施方案中，代谢物谱可以用作一种测定以确定特定饮食、药物对特定的粪便来源的细菌群体的影响。
在一些实施方案中，代谢谱包含Yen等人,J.Proteome Res.2015,14,1472-1482中公开的至少一种代谢物。
在一些实施方案中，根据Yen等人,J.Proteome Res.2015,14,1472-1482中公开的方法，通过核磁共振测定代谢谱。
在一些实施方案中，从粪便来源的细菌群体的培养物获得无细胞上清液，并使用1H核磁共振(NMR)光谱法获得光谱。在一些实施方案中，光谱代表粪便来源的细菌群体的代谢活动。
在一些实施方案中，分析光谱并鉴定和量化特定的代谢物。在一些实施方案中，鉴定的代谢物用于生成粪便来源的细菌群体的代谢谱。根据本发明的一些实施方案的代谢谱的实施例显示在图2和图3中。
在一些实施方案中，根据Garner等人,FASEB J 21:1675-1688(2007)中公开的方法，通过GC-MS(气相色谱-质谱法)测定代谢谱。
在一些实施方案中，从粪便来源的细菌群体的培养物获得无细胞上清液，并使用GC-MS获得光谱。在一些实施方案中，光谱代表粪便来源的细菌群体的代谢活动。
在一些实施方案中，分析光谱并鉴定和量化特定的代谢物。在一些实施方案中，鉴定的代谢物用于生成粪便来源的细菌群体的代谢谱。
在一些实施方案中，培养基的基因组谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第一组合物内的细菌菌株的身份。在一些实施方案中，培养基的基因组谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第一组合物中的细菌菌株是否随时间变化。
在一些实施方案中，培养基的基因组谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第二组合物内的细菌菌株的身份。在一些实施方案中，培养基的基因组谱用于确定包含粪便来源的细菌群体的第二组合物中的细菌菌株是否随时间变化。
虽然已经描述了本发明的许多实施方案，但是应该理解，这些实施方案仅是说明性的而非限制性的，并且许多改变对于本领域普通技术人员而言可以说是显而易见的。此外，各种步骤可以以任何所需的顺序执行(并且可以添加任何所需的步骤和/或可以去掉任何所需的步骤)。
现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性的方式说明本发明的一些实施方案。
实施例
实施例1：粪便来源的细菌群体的纯度测定
获得粪便来源的细菌群体，下文称为MET-1+。基于严格厌氧生长的苛化厌氧菌琼脂(Fastidious Anaerobe Agar，FAA)菌株的均一菌落形态，和基于获得干净的16S全长Sanger序列的分析，最初表明由16S rRNA序列16-6-S 14LG鉴定的细菌菌株是一种纯菌株氨基酸肠球菌(Acidaminococcus intestini)，即相对丰度为100％。图4示出了经由Sanger测序法的16S rRNA谱分析获得的序列数据。迹线显示最小的噪音，据称表示纯的菌株。以比较的方式，图5示出了来自受污染菌株的通过经由Sanger测序法的16S rRNA谱分析获得的序列数据。迹线显示大量噪音，其中软件无法分辨单个峰，因此无法确定与峰相对应的核苷酸。
将MET-1+的活培养物添加至接种有来源于溃疡性结肠炎(UC)患者的粪便样品(称为UC-3)的确定的微生物群落的恒化器中。这些实验的目的是观察MET-1+制剂是否会改变UC患者的生态失调微生物群落。在处理前、MET-1+处理期间以及处理后第7天和第14天分别取恒化器容器内容物的样品。通过Illumina Miseq平台对这些样品进行16S rRNA谱分析，并随后使用Mothur程序进行分析。
出乎意料地，存在微生物显著扩增，该微生物属于MET-1+制剂或UC-3微生物群落(这发生在处理后的样品中)中不存在的属。这些属被鉴定为阿克曼菌属、Flavonifractor和萨特氏菌属(Sutterella)。尽管在添加之前仔细检查了MET-1+制剂分离株的纯度，但这种扩增发生在两个单独的实验运行中。
表1示出了利用Mothur途径产生的分类OTU的相对丰度谱。如下所示是处理前样品的三次重复(R#之前)、处理后第14天样品的三次重复(R#之后)以及所有样品的OTU丰度的总百分比。小于0.01％的总百分比被认为是无关紧要的(用于消除测序错误的截止值)。感兴趣的三个OTU为粗体。请注意，这些OTU仅存在于处理后的样品中，并且它们还高于0.01％丰度截止值。
最大的出乎意料的扩增是阿克曼菌属的扩增，当时不知道它存在于MET-1+制剂所来源的供体的确定的微生物群落中。图6示出了扩增的阿克曼菌属菌株的经由Sanger测序法的16S rRNA谱分析获得的序列数据。迹线表示纯的培养物。
使用一组阿克曼菌属特异性引物，通过PCR针对阿克曼菌属的存在筛选MET-1+制剂的所有原液。用溴化乙锭染色的所得琼脂糖凝胶如下图7所示，其中阳性对照包括DNA梯状条带的100之后的前三个样品。
参见图7，可见条带对应于原液16-6-S 14 LG。一旦被鉴定，就开始尝试分离阿克曼菌属。由于已知嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)使用粘蛋白作为碳源，因此试图使用三种类型的培养基分离该物种，即Derrien等人(2004)描述的有和没有维生素补充的基础培养基，以及补充有0.4％粘蛋白的FAA(称为Fmu)。
这些最初的尝试是不成功的，因此除了富集之外，还利用了相对抗生素抗性。基于在Allen-Vercoe实验室中从另一供体粪便样品中分离的嗜粘蛋白阿克曼菌菌株的抗生素抗性谱，在传代培养后立即将51.tg莫西沙星BBL Sensi圆片置于Fmu培养基上。精细的再划线技术不仅产生了怀疑是嗜粘蛋白阿克曼菌的分离株的纯培养物，而且还产生了独特菌落形态的三种其他的分离株。对这些分离株进行16S V3k1 V6r区域的16S rRNA Sanger测序。通过该方法，分离出嗜粘蛋白阿克曼菌，并且确定所述其他三种分离株是粘液真杆菌(已经存在于MET-1+制剂中)、Flavonifractor plautii和Sutterella stercoricanis。已知Flavonifractor和Sutterella存在于MET-1+制剂所来源的供体的确定的微生物群落中。
表2示出了根据本发明的一些实施方案的方法培养后，通过V3k1 V6r区域的16SrRNA Sanger测序鉴定的来自MET-1+制剂的16-6-S 14 LG原液的分离株。
总之，发现最初被认为是氨基酸肠球菌的纯培养物的MET-1+制剂的16-6-S 14 LG受到四种不同的微生物菌株污染，这些菌株被成功分离出来：粘液真杆菌、Flavonifractorplautii、Sutterella stercoricanis和嗜粘蛋白阿克曼菌。粘液真杆菌是MET-1+制剂的一部分。已知Flavonifractor plautii和Sutterella stercoricanis存在于MET-1+制剂所来源的供体的确定的群落中。不知道嗜粘蛋白阿克曼菌是否存在于任何菌落中。后三种菌株的分离对应于所述恒化器系统实验组中获得的意外结果。
实施例2：粪便来源的细菌群体的代谢物谱的测定
根据美国专利申请公开号20140342438中描述的方法获得并单独培养在下文中称为MET-1和MET-2的两种粪便来源的细菌群体。MET-1种群描述于美国专利申请号20140363397中。MET-2种群描述于Yen等人,J.Proteome Res.2015,14,1472-1482。在培养之前通过NMR测定代谢物谱。根据Yen等人,J.Proteome Res.2015,14,1472-1482中公开的方法，将两个粪便来源的细菌群体培养10天，并通过NMR测定代谢物谱。结果显示在表3中。从表3可见，两种粪便来源的细菌群体将代谢物添加至培养基中。此外，一些代谢物在培养基中耗尽。这些数据表明，在限定条件下，例如根据美国专利申请公开号20140342438中描述的方法在恒化器容器中培养后获得的“代谢物特征”可用于鉴定特定的细菌群体。或者，在限定条件下，例如根据美国专利申请公开号20140342438中描述的方法在恒化器容器中培养后获得的“代谢物特征”可用于确定细菌群体是否完整。
实施例3：粪便来源的细菌群体的代谢物谱的测定
根据美国专利申请公开号20140342438中描述的方法获得并单独培养在下文中称为MET-1和MET-2的两种粪便来源的细菌群体。MET-1种群描述于美国专利申请号20140363397中。MET-2种群描述于Yen等人,J.Proteome Res.2015,14,1472-1482。在培养之前通过NMR测定代谢物谱。根据Yen等人,J.Proteome Res.2015,14,1472-1482中公开的方法，将两个粪便来源的细菌群体培养表4中所示的时间，并通过NMR测定代谢物谱。代谢物的浓度以mM显示在表4中。
参见表4，对于给定的粪便来源的细菌群体，以及对于给定的培养时间，检测的代谢物的观测的浓度的变化很小。然而，检测的代谢物及其浓度(即代谢物谱)在测试的两种粪便来源的细菌群体之间不同。例如，对于MET-1，丙氨酸的范围为1.1-1.15，但对于MET-2，范围仅为0.20-0.21。另一个例子是在MET-1中未检测到焦谷氨酸盐，但在MET-2中检测到0.8-1.3范围的焦谷氨酸盐。这些数据表明，粪便来源的细菌群体的代谢谱可用于鉴定、量化或确定粪便来源的细菌群体的纯度。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用其整体并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地且单独地指出通过引用并入本文。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。就使用章节标题来说，它们不应被解释为必然限制。

Claims (13)

1.一种用于表征包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的方法，其包括步骤：
a.获得所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物包含至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株；
b.通过在含有培养基的恒化器中接种包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来提供因子，所述因子能选择性地将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上；
c.将所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的活培养物添加到所述接种的恒化器中，并且将所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物与所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物在所述恒化器中一起培养一定的时间，所述时间足以将所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株扩增至所述检测阈值水平以上；
d.在所述足够的时间后取出恒化器培养物的样品；以及
e.鉴定所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物也可包含至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所鉴定的至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株是否来自所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物，或来自所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物。
4.如权利要求1所述的方法，其中通过比较在所述恒化器中培养之前获得的所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物的细菌16S rRNA谱与在培养足够的时间后获得的所述恒化器培养基的细菌16S rRNA，来鉴定所述至少一种低于检测阈值水平的细菌菌株。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物包含健康患者的生态系统。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物包含健康患者的生态系统。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物和第二组合物相同。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物来源于患有肠道生态失调的患者。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物来源于患有胃肠道疾病的患者。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来源于患有肠道生态失调的患者。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物来源于患有胃肠道疾病的患者。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述胃肠道疾病选自下组，该组由以下项组成：生态失调、艰难梭菌(Clostridioides difficile)感染、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、炎性肠病和憩室病。
13.如权利要求1所述的方法，其中通过使用对新鉴定的细菌菌株特异性的引物对所述第一或第二培养物的样品进行PCR，来确定新鉴定的细菌菌株是否来自所述包含粪便来源的细菌群体的第一组合物或来自所述包含粪便来源的细菌群体的第二组合物。
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