JP2022012466A - 尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
【課題】被検者から採取した試料を用いて検査することが可能であり、正診率の高い、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカー、尿路系上皮腫瘍関連病変の検出方法、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーを検出するための検査試薬、及び尿路系上皮腫瘍関連病変の検出装置を提供することを課題とする。【解決手段】被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を検出する工程を含む、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出方法により、課題を解決する。【選択図】なし
Description
本明細書には、尿路系上皮腫瘍関連病変の検出方法、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーを検出するための検査試薬、及び尿路系上皮腫瘍関連病変の検出装置が開示される。
無症候性肉眼的血尿患者において尿路上皮癌か否かを鑑別する事は、患者の予後に大きく関わり非常に重要である。尿路上皮癌は膀胱癌と上部尿路癌に分けられ、スクリーニングとして膀胱鏡、尿細胞診、ＣＴ検査などが推奨されている。
また、非特許文献１には、尿中のサイトケラチンＣＫ８及びＣＫ１８、並びに尿中核マトリックスプロテイン２２（ＮＭＰ２２）を膀胱癌の診断に用いることが記載されている。
モダンメディア 56巻，5号，2010年，p100-p106
しかし問題点として、一般開業医レベルにおいては、膀胱鏡、ＣＴ検査を用いたスクリーニング検査は利用できない。また、尿細胞診は感度が３０から５０％程度と低く、特に低悪性度の癌に関しては見落としの原因となる事があげられる。さらに、非特許文献１に記載のＣＫ８、ＣＫ１８、ＮＭＰ２２は、非癌病変である尿路感染症での擬陽性率が高い等の問題がある。
本発明は、上記課題に鑑み、被検者から採取した試料を用いて検査することが可能であり、正診率の高い、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカー、尿路系上皮腫瘍関連病変の検出方法、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーを検出するための検査試薬、及び尿路系上皮腫瘍関連病変の検出装置を提供することを課題とする。
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして使用できることを見出した。
本開示は、以下の態様を含む。
項１．被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を検出する工程を含む、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出方法。
項２．前記尿路系上皮細胞において、ＩＦＴ８８が検出されなかった場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変が存在すると決定する工程をさらに含む、項１に記載の検出方法。
項３．ＩＦＴ８８の検出が、前記尿路系上皮細胞を免疫染色することによって行われる、項１または２に記載の検出方法。
項４．前記試料が、尿、または尿路組織である、項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
項５．尿路系上皮腫瘍関連病変は、癌である、項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
項６．尿路系上皮腫瘍関連病変は、異形成を来した状態、または、扁平上皮分化を来した状態である、項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
項７．尿路系上皮細胞に存在するＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして使用する方法。
項８．被検者から採取された尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして検出するための検査試薬であって、前記検査試薬は、ＩＦＴ８８を検出するための抗体、又は核酸を含む、前記検査試薬。
項９．ＩＦＴ８８からなる、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカー。
項１０．処理部を備える、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出装置であって、前記処理部は、被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８の測定値を取得し、取得した測定値を、基準値と比較し、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変がないことを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変があることを示すラベルを出力する、前記検出装置。
項１．被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を検出する工程を含む、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出方法。
項２．前記尿路系上皮細胞において、ＩＦＴ８８が検出されなかった場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変が存在すると決定する工程をさらに含む、項１に記載の検出方法。
項３．ＩＦＴ８８の検出が、前記尿路系上皮細胞を免疫染色することによって行われる、項１または２に記載の検出方法。
項４．前記試料が、尿、または尿路組織である、項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
項５．尿路系上皮腫瘍関連病変は、癌である、項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
項６．尿路系上皮腫瘍関連病変は、異形成を来した状態、または、扁平上皮分化を来した状態である、項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
項７．尿路系上皮細胞に存在するＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして使用する方法。
項８．被検者から採取された尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして検出するための検査試薬であって、前記検査試薬は、ＩＦＴ８８を検出するための抗体、又は核酸を含む、前記検査試薬。
項９．ＩＦＴ８８からなる、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカー。
項１０．処理部を備える、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出装置であって、前記処理部は、被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８の測定値を取得し、取得した測定値を、基準値と比較し、取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変がないことを示すラベルを出力する、及び／又は取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変があることを示すラベルを出力する、前記検出装置。
被検者から採取した試料を用いて、高い正診率で、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出することができる。
１．用語の説明
ＩＦＴ８８（ｉｎｔｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ８８：鞭毛内輸送タンパク質８８）は、一次線毛の構造を形成及び維持する、鞭毛内輸送 （ｉｎｔｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ： ＩＦＴ） 構成タンパク群の１つである。ＩＦＴ８８はＩＦＴ－Ｂ複合体の一部を構成する。本明細書において、ヒトＩＦＴ８８は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）に、Ｇｅｎｅ ＩＤ：８１００で登録されている遺伝子にコードされている転写産物及びその翻訳産物を意図する。Ｇｅｎｅ ＩＤ：８１００で登録されている遺伝子の転写産物及びその翻訳産物は、以下のリストに列挙される転写産物及びその翻訳産物を意図する。また、下記リストの矢印は、“ＮＭ＿”から始まるＩＤで表されるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｏ．にて登録されたｍＲＮＡが、“ＮＰ＿”から始まるＩＤで表されるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｏ．にて登録されたポリペプチドに翻訳されることを意図する。
(1) NM_001318491.2 → NP_001305420.1 [isoform 3]
(2) NM_001318493.2 → NP_001305422.1 [isoform 1]
(3) NM_001353565.2 → NP_001340494.1 [isoform 1]
(4) NM_001353566.2 → NP_001340495.1 [isoform 1]
(5) NM_001353567.2 → NP_001340496.1 [isoform 1]
(6) NM_001353568.2 → NP_001340497.1 [isoform 2]
(7) NM_001353569.2 → NP_001340498.1 [isoform 5]
(8) NM_001353570.2 → NP_001340499.1 [isoform 5]
(9) NM_001353571.2 → NP_001340500.1 [isoform 6]
(10) NM_001353572.2 → NP_001340501.1 [isoform 7]
(11) NM_001353573.2 → NP_001340502.1 [isoform 8]
(12) NM_001353574.2 → NP_001340503.1 [isoform 9]
(13) NM_001353575.2 → NP_001340504.1 [isoform 10]
(14) NM_001353576.2 → NP_001340505.1 [isoform 11]
(15) NM_001353577.2 → NP_001340506.1 [isoform 11]
(16) NM_001353578.2 → NP_001340507.1 [isoform 12]
(17) NM_001353579.2 → NP_001340508.1 [isoform 13]
(18) NM_006531.5 → NP_006522.2 [isoform 2]
(19) NM_175605.5 → NP_783195.2 [isoform 1]
ＩＦＴ８８（ｉｎｔｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ８８：鞭毛内輸送タンパク質８８）は、一次線毛の構造を形成及び維持する、鞭毛内輸送 （ｉｎｔｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ： ＩＦＴ） 構成タンパク群の１つである。ＩＦＴ８８はＩＦＴ－Ｂ複合体の一部を構成する。本明細書において、ヒトＩＦＴ８８は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）に、Ｇｅｎｅ ＩＤ：８１００で登録されている遺伝子にコードされている転写産物及びその翻訳産物を意図する。Ｇｅｎｅ ＩＤ：８１００で登録されている遺伝子の転写産物及びその翻訳産物は、以下のリストに列挙される転写産物及びその翻訳産物を意図する。また、下記リストの矢印は、“ＮＭ＿”から始まるＩＤで表されるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｏ．にて登録されたｍＲＮＡが、“ＮＰ＿”から始まるＩＤで表されるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｏ．にて登録されたポリペプチドに翻訳されることを意図する。
(1) NM_001318491.2 → NP_001305420.1 [isoform 3]
(2) NM_001318493.2 → NP_001305422.1 [isoform 1]
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(18) NM_006531.5 → NP_006522.2 [isoform 2]
(19) NM_175605.5 → NP_783195.2 [isoform 1]
本明細書において、尿路系上皮腫瘍関連病変は、尿路系上皮細胞に由来する腫瘍に関連する病変である限り制限されない。尿路系上皮には、上部尿路上皮及び膀胱上皮を含む。尿路系上皮腫瘍関連病変には、腫瘍性の病変及び腫瘍性病変に進展する可能性のある前病変を含む。腫瘍性病変には、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含み得る。腫瘍性病変は、好ましくは悪性腫瘍、すなわち癌である。尿路系上皮に由来する悪性腫瘍には、上部尿路癌、及び膀胱癌と、これらの転移癌、及び浸潤癌とを含み得る。腫瘍性病変に進展する可能性のある前病変には、尿路系上皮が異形成を来した状態、又は尿路系上皮が化生、例えば扁平上皮分化を来した状態を含み得る。
本明細書において、被検者は、検査の対象となるヒトを意図する。
本明細書において、被検者は、検査の対象となるヒトを意図する。
本明細書において、試料は、被検者から採取された検体である限り制限されない。例えば、試料として、尿、血液、精液、髄液、リンパ液、腹水、胸水、細胞間質液等の体液試料、組織を採取した生検試料又は手術切除試料等を挙げることができる。
体液試料は、組織からの剥離細胞、浸潤細胞等を含み得る。
体液試料は、組織からの剥離細胞、浸潤細胞等を含み得る。
組織は、原発巣である尿路系組織を含む。また、組織は、転移巣、浸潤巣、又は播種巣である尿路、リンパ節、肝臓、肺、骨、副腎、脳、乳腺、腹膜、子宮、卵巣、膣、膵臓、腸の組織を含み得る。
２．尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカー及びその検出方法
本開示のある態様は、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカー及びその検出方法に関する。前記検出方法は、尿路系上皮細胞内のＩＦＴ８８を検出することを含む。すなわち、尿路系上皮細胞に存在するＩＦＴ８８は、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして使用することができる。
本開示のある態様は、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカー及びその検出方法に関する。前記検出方法は、尿路系上皮細胞内のＩＦＴ８８を検出することを含む。すなわち、尿路系上皮細胞に存在するＩＦＴ８８は、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして使用することができる。
尿路系上皮細胞内のＩＦＴ８８の検出は、被検者から採取された試料を用いて行う限り制限されない。被検者から採取された試料は、ＩＦＴ８８の検出方法に応じて後述する前処理を施される場合がある。
ＩＦＴ８８は、タンパク質として、又はｍＲＮＡとして検出することができる。
ＩＦＴ８８は、タンパク質として、又はｍＲＮＡとして検出することができる。
ＩＦＴ８８をタンパク質として検出する方法は、免疫染色、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法を挙げることができる。また、ＩＦＴ８８をｍＲＮＡとして検出する方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ（定量的ＲＴ－ＰＣＲを含む）、マイクロアレイ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、ナノポアシークエンス等の公知の方法を挙げることができる。
組織試料を使って、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、組織をホルマリン、又はパラホルムアルデヒド等の公知の固定液で固定してから、パラフィン包埋ブロックを作製する。あるいは、組織を固定してから、若しくは固定せずに、ＯＣＴコンパウンド（登録商標）等の凍結ブロック作製用の樹脂に包埋し、凍結ブロックを作製する。次に、作製したパラフィン包埋ブロック、又は凍結ブロックを薄切して組織切片を作製し、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションに供する。ここで、ブロックに包埋されている組織は、腫瘍部のみであってもよいが例えば正常部位等を含んでいてもよい。
体液試料を使って、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、細胞をスライドグラスに塗抹又は収集し、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、又はエタノール等で固定する。
ＩＦＴ８８をタンパク質としてウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等で検出する場合には、前処理として、体液試料から回収した細胞又は組織を所定の溶解バッファーで溶解する。溶解バッファーで溶解されたサンプルを検査サンプルとする。
ＩＦＴ８８をｍＲＮＡとしてＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、ナノポアシークエンス等で検出する場合には、前処理として、体液試料から遠心分離等で回収した又は組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。また、必要に応じて、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として逆転写を行い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成してもよい。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡを検査サンプルとする。
免疫染色又はウエスタンブロッティングによってＩＦＴ８８を検出するための一次抗体は、ＩＦＴ８８を検出できる限り制限されない。例えば、ヒトＩＦＴ８８のペプチドを抗原として調製した抗体を一次抗体として使用することができる。一次抗体としてより具体的には、ＩＦＴ８８ 抗体（マウスモノクローナル抗体、カタログ番号： ６０２２７－１－Ｉｇ、クローン番号： ４Ａ４Ｇ５、ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ社）、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ＩＦＴ８８ （Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社：ＮＢ１００－２４７５）、Ａｎｔｉ－ＩＦＴ８８ 抗体 ［ＥＰＲ１４８５０］ － Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ （ａｂ１８４５６６）（アブカム社）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ＩＦＴ８８ （ＬＳ－Ｂ９６１０）（ＬＳＢｉｏ社）等を挙げることができる。ＩＦＴ８８と結合した一次抗体は、一次抗体と結合する酵素標識二次抗体と、前記酵素と基質の反応により検出することができる。または、一次抗体を一次抗体と結合する蛍光標識二次抗体と、その蛍光により検出することができる。免疫染色を行う場合には、脱パラフィン及び浸水処理を行った後に、組織切片をトリプシン等のタンパク質分解酵素で処理してから、免疫染色を行ってもよい。
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションに使用するプローブの作製方法は公知である。また、市販のプローブを使用してもよい。例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）のＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－ Ｈｓ－ＩＦＴ８８（Ｃａｔ Ｎｏ． ４５６５４１、４５６５４９、４５６５４８）を用いることができる。
ＲＴ－ＰＣＲに使用するプライマー（定量的ＲＴ－ＰＣＲの場合にはプローブを含んでいても良い）はＩＦＴ８８配列（ＮＭ＿１７５６０５．５）を元に設計、または市販されているものを使用することができる。また、マイクロアレイも市販されているものを使用することができる。
ＲＮＡ－Ｓｅｑは、次世代シーケンサー（例えば、イルミナ社製）等を使用して、ＩＦＴ８８ ｍＲＮＡのリード数を得ることができる。ナノポアシークエンスもＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の技術を利用して、ＩＦＴ８８ ｍＲＮＡのリード数を得ることができる。
免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによってＩＦＴ８８を検出する場合、免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションが施された細胞標本又は組織標本を顕微鏡、又はスライドスキャナ等を使ってヒトが観察することにより、ＩＦＴ８８の有無を検出することができる。組織標本内の腫瘍細胞内に免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションのシグナルが確認された場合に、ＩＦＴ８８が検出されたと判定（決定）することができる。例えば、顕微鏡、又はスライドスキャナの所定の区画、例えば上皮組織の１００μｍ２あたりに存在しているＩＦＴ８８陽性細胞数をカウントし、そのカウントが、正常組織におけるＩＦＴ８８陽性細胞数を下回った場合に、「ＩＦＴ８８が検出されなかった」又は、「ＩＦＴ８８の発現が陰性である」と判定してもよい。あるいは、カウントが、正常組織におけるＩＦＴ８８陽性細胞数を同等であった場合に、「ＩＦＴ８８が検出された」又は、「ＩＦＴ８８の発現が陽性である」と判定してもよい。
ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、ナノポアシークエンスによって、ＩＦＴ８８を検出する場合、体液試料から回収した細胞又は組織から抽出されたサンプルにおいてＩＦＴ８８が検出された場合に、「ＩＦＴ８８が検出された」又は、「ＩＦＴ８８の発現が陽性である」と決定してもよい。あるいは、体液試料から回収した細胞又は組織に由来する検査サンプルと正常細胞又は正常組織に由来するＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量を比較して、体液試料から回収した細胞又は組織に由来する検査サンプルにおけるＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量が、正常細胞又は正常組織由来するＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量よりも低値を示す場合に、「ＩＦＴ８８が検出されなかった」、又は「ＩＦＴ８８の発現が陰性である」と決定してもよい。また、体液試料から回収した細胞又は組織に由来する検査サンプルにおけるＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量が正常細胞又は正常組織由来するＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量と同程度である場合に、「ＩＦＴ８８が検出された」、又は「ＩＦＴ８８の発現が陽性である」と決定してもよい。
また、ＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量を比較する前に、各検査サンプル中のタンパク質量、又はＲＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ、β２－ミクログロブリン、β－アクチン等のハウスキーピング遺伝子由来のタンパク質量又はｍＲＮＡ量で正規化してもよい。タンパク質量は質量、又は濃度で表されても良いが、基質の発光強度等で表されてもよい。ｍＲＮＡ量は、ｍＲＮＡのコピー数又はリード数であってもよいが、蛍光強度等で表されてもよい。
ここで、「下回る」または「低値を示す」とは、正常細胞又は正常組織由来するＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量の０．９倍以下、好ましくは０．８倍以下、より好ましくは０．７倍以下、さらに好ましくは０．５倍以下の値を示す場合を例示できる。「同程度」とは、０．９倍を超える値から１．１倍程度を例示できる。
別の態様として、ＩＦＴ８８タンパク質量又はＲＮＡ量の基準値をあらかじめ決定しておき、体液試料から回収した細胞又は組織に由来する検査サンプル中のＩＦＴ８８タンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも高い場合に、「ＩＦＴ８８が検出された」、又は「ＩＦＴ８８の発現が陽性である」と決定してもよい。また、体液試料から回収した細胞又は組織に由来する検査サンプル中のＩＦＴ８８タンパク質量又はＲＮＡ量が基準値よりも低い場合に、「ＩＦＴ８８が検出されない」又は、「ＩＦＴ８８の発現が陰性である」と決定してもよい。基準値は、ＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値である限り制限されず、公知の方法により決定することができる。ＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量が検出されているか、又は発現が陽性であるかを判別できる値は、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）曲線、判別分析法、モード法、Ｋｉｔｔｌｅｒ法、３σ法、ｐ‐ｔｉｌｅ法等により決定することもできる。また、基準値として、感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、第一四分位数等を例示できる。
尿路系上皮腫瘍関連病変の検出方法は、前記尿路系上皮細胞において、ＩＦＴ８８が検出されなかった場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変が存在すると決定する工程を含んでいてもよい。
３．検査試薬
本開示の別の態様は、尿路系上皮細胞に存在するＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして検出するための検査試薬に関する。
検査試薬は、ＩＦＴ８８タンパク質検出用試薬及び／又はＩＦＴ８８ ｍＲＮＡ検出用試薬を含み得る。
本開示の別の態様は、尿路系上皮細胞に存在するＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして検出するための検査試薬に関する。
検査試薬は、ＩＦＴ８８タンパク質検出用試薬及び／又はＩＦＴ８８ ｍＲＮＡ検出用試薬を含み得る。
ＩＦＴ８８タンパク質検出用試薬は、少なくともＩＦＴ８８タンパク質の一部に結合可能な一種又は複数の抗体（例えば、一次抗体）を含む。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２等）のいずれも用いることができる。免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、ｓｃＦｖ等であってもよい。
また、抗体は必ずしも精製されている必要はなく、抗体を含む抗血清、腹水、これらから画分された免疫グロブリン画分等であってもよい。
また、抗体は必ずしも精製されている必要はなく、抗体を含む抗血清、腹水、これらから画分された免疫グロブリン画分等であってもよい。
検査試薬に含まれる抗体は、乾燥状態であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファーに溶解されていてもよい。さらに、検査試薬は、β－メルカプトエタノール、ＤＴＴ等の安定化剤；アルブミン等の保護剤；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤等の少なくとも一つを含んでいてもよい。
ＩＦＴ８８と結合する抗体は、酵素や蛍光色素で標識されていてもよい。ＩＦＴ８８と結合する抗体はマイクロプレート、磁性ビーズ等に固定されていてもよい。
ＩＦＴ８８タンパク質検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、ＩＦＴ８８と結合する抗体が未標識の一次抗体である場合には、検査キットに酵素又は蛍光色素で標識された二次抗体が含まれていてもよい。さらに、検査キットには前記酵素と反応する基質が含まれていてもよい。
ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ検出用試薬は、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡの全体又は一部とハイブリダイズする核酸を含む。核酸は、プライマー、及び／又はプローブとしての機能を有する検出用の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であることが好ましい。検出用核酸の長さは、特に制限されない。
検出用核酸が、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーであれば、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは５０ ｍｅｒ以下であり、より好ましくは３０ ｍｅｒ以下であり、さらに好ましくは、１５～２５ ｍｅｒ程度である。プライマーには、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。また、プライマーは、蛍光色素等で標識されていてもよい。
また、ＲＴ－ＰＣＲには、プライマーの他にＰＣＲ産物のリアルタイムの定量のために使用される、ＰＣＲ反応中に分解される定量用プローブを使用することもできる。定量用プローブもＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡとハイブリダイズする限り、制限されない。定量用プローブは、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列を含む、５～２０ ｍｅｒ程度の核酸であることが好ましい。さらに定量用プローブの一端には、蛍光色素が標識され、定量用プローブのもう一端には、当該蛍光色素のクエンチャーが標識されていることが好ましい。
検出用核酸が、マイクロアレイ等においてキャプチャープローブとして使用されるものであれば、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列が、好ましくは１００ ｍｅｒ程度であり、より好ましくは６０ ｍｅｒ程度であり、さらに好ましくは、２０～３０ ｍｅｒ程度である。キャプチャープローブには、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。さらにキャプチャープローブは、チップに固定化されていることが好ましい。
検出用核酸が、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブである場合、検出用核酸は、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡとハイブリダイズする配列が、１５～１００ ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドであってもよく、１００ ｍｅｒを超えるポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブには、ジゴキシゲニン、蛍光色素等の標識物質が結合されうる。プローブには、ＩＦＴ８８ｍＲＮＡとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。
ＩＦＴ８８ｍＲＮＡ検出用試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのＵＲＬが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲによりＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットに核酸増幅試薬（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ等を含む）、逆転写酵素等を含んでいてもよい。核酸増幅試薬には、必要に応じてＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ（登録商標）等の色素が含まれていてもよい。マイクロアレイによりＩＦＴ８８ｍＲＮＡ又はＩＦＴ８８ｃＤＮＡを検出する場合には、検査キットにハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＩＦＴ８８ｍＲＮＡを検出する場合には、検査キットに、プロティナーゼＫ等のタンパク質分解酵素、ハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。
４．尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出装置
４－１．尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出装置の構成
本開示の一実施形態は尿路系上皮腫瘍関連病変の検出システム１０００及び尿路系上皮腫瘍関連病変の検出装置１０に関する。
４－１．尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出装置の構成
本開示の一実施形態は尿路系上皮腫瘍関連病変の検出システム１０００及び尿路系上皮腫瘍関連病変の検出装置１０に関する。
図１は、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出システム１０００(以下、単に検出システム１０００という)の概観図であり、検出システム１０００は一態様として、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出装置１０(以下、単に検出装置１０という)の他、分析装置５ａ又は分析装置５ｂとを備えていてもよい。
図２に、検出装置１０のハードウェアを示す。検出装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。
図２に、検出装置１０のハードウェアを示す。検出装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。
検出装置１０において、処理部１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８は、バス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。主記憶部１０２と補助記憶部１０４とを合わせて、単に記憶部と呼ぶこともある。記憶部は、前記測定値や基準値を揮発性に、又は不揮発性に記憶する。
処理部１０１は、検出装置１０のＣＰＵである。処理部１０１は、ＧＰＵと協働してもよい。処理部１０１が、補助記憶部１０４又はＲＯＭ１０３に記憶されているオペレーションシステム（ＯＳ）１０４ａと協働して検出プログラム１０４ｂを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、コンピュータが検出装置１０として機能する。
ＲＯＭ１０３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、処理部１０１により実行される検出プログラム１０４ｂ及びこれに用いるデータが記録されている。処理部１０１はＭＰＵ１０１としてもよい。ＲＯＭ１０３は、検出装置１０の起動時に、処理部１０１によって実行されるブートプログラムや検出装置１０のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
主記憶部１０２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部１０２は、ＲＯＭ１０３及び補助記憶部１０４に記録されている検出プログラム１０４ｂの読み出しに用いられる。また、主記憶部１０２は、処理部１０１がこれらの検出プログラム１０４ｂを実行するときの作業領域として利用される。
補助記憶部１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部１０４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、処理部１０１に実行させるための種々の検出プログラム１０４ｂ及び検出プログラム１０４ｂの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、基準値等を不揮発性に記憶する。
通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ－２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ１０５は、処理部１０１の制御下で、分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて検出装置１０が保存又は生成する情報を、分析装置５ａ，５ｂ又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ネットワークを介して分析装置５ａ，５ｂ又は他の外部機器と通信を行ってもよい。
入力Ｉ／Ｆ１０６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ－２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ１０６は、入力部１１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。
入力部１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、検出装置１０に文字入力又は音声入力を行う。入力部１１１は、検出装置１０の外部から接続されても、検出装置１０と一体となっていてもよい。
出力Ｉ／Ｆ１０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ１０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成した情報を出力部１１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ１０７は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、出力部１１２に出力する。
出力部１１２は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、分析装置５ａ，５ｂから送信される測定結果及び検出装置１０における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。
メディアＩ／Ｆ１０８は、記憶媒体１１３に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成した情報を記憶媒体１１３に書き込む。メディアＩ／Ｆ１０８は、処理部１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、記憶媒体１１３に書き込む。
記憶媒体１１３は、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、又はＤＶＤ－ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体１１３は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ－ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ－ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ１０８と接続される。記憶媒体１１３には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
処理部１０１は、検出装置１０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに検出装置１０がアクセスして、検出プログラム１０４ｂをダウンロードし、これをＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４に記憶することも可能である。
また、ＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第２の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、検出装置１０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。
検出システム１０００は一カ所に設置されている必要はなく、検出装置１０と分析装置５ａ，５ｂが別所に配置され、これらがネットワークで接続されていてもよい。また、検出装置１０は、入力部１１１や出力部１１２を省略した操作者を必要としない装置であってもよい。
分析装置５ａは、タンパク質の量又は濃度を測定するための装置であり、試料置き場５１と、反応部５２と、検出部５３とを備える。試料置き場５１にセットされた細胞溶解液は、反応部５２に設置された抗原捕捉用抗体が固相されたマイクロプレートに分注されインキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出用抗体がマイクロプレートに分注され、インキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出用抗体を検出するための基質がマイクロプレートに分注され、マイクロプレートが検出部５３に移動され、基質が反応して発生したシグナルが測定される。
また、分析装置５ａの別態様は、マイクロアレイ解析によるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロアレイチップ上に分注し、ハイブリダイゼーションを行い、洗浄した後、検出部５３に移動させシグナルを検出する。
さらに、分析装置５ａの別態様は、ＲＴ－ＰＣＲ、又はナノポアシークエンスによるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロチューブ内に分注し、続いて定量的ＰＣＲ用試薬をマイクロチューブ内に分注する。反応部５２でＰＣＲ反応を行いながら、検出部５３でチューブ内のシグナルを検出する。
分析装置５ｂは、ＲＮＡ－Ｓｅｑ法によってｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、配列解析部５４を備える。ＲＮＡ－Ｓｅｑ用の反応を行ったサンプルを配列解析部５４にセットし、配列解析部５４内で、塩基配列の解析をおこなう。
分析装置５ｂは、ウエスタンブロッティングによりタンパク質量を測定するための全自動ウエスタンブロッティング装置であり、化学発光シグナル検出部５４を備える。溶解バッファーで溶解された細胞又は組織のサンプルを自動ウエスタンブロッティング装置の所定の位置にセットし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、メンブレンへのブロッティング、抗体反応、化学発光を行い、化学発光シグナル検出部５４にて解析をおこないシグナル強度を定量化する。
また、分析装置５ｂは、細胞標本あるいは組織標本を顕微鏡相当の拡大機能を有する撮像機能、及びシグナル検出能を備えるスライドスキャナであってもよい。スライドスキャナにより、標本上の目的とするシグナル強度を半定量化あるいは、定量化することができる。
分析装置５ａ、及び５ｂは、有線又は無線によって検出装置１０に接続されている。分析装置５ａは、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして検出装置１０に送信する。同様に、分析装置５ｂは、ｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして検出装置１０に送信する。これにより、検出装置１０は、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値を、演算処理可能なデジタルデータとして取得することができる。
４－２．尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出プログラムの処理
図３に尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出プログラム（以下、単に検出プログラムと呼ぶ）の処理のフローチャートの一例を示す。
図３に尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出プログラム（以下、単に検出プログラムと呼ぶ）の処理のフローチャートの一例を示す。
検出装置１０の処理部１０１は、オペレータが入力部１１１から処理開始の入力を行うことにより、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーを検出するための処理を開始する。ステップＳ１１において、処理部１０１は、分析装置５ａ又は分析装置５ｂから、被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８のタンパク質量、又はＩＦＴ８８のｍＲＮＡ量若しくはこれらを反映する値をＩＦＴ８８の測定値として取得する。あるいは、オペレータが免疫染色又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＩＦＴ８８の発現が陽性であるか陰性であるか（あるいは、ＩＦＴ８８が検出されたか否か）を入力部１１１から入力し、処理部１０１がこの入力をＩＦＴ８８の測定値として取得してもよい。
次に処理部１０１は、ステップＳ１２において、記憶部に記憶されているＩＦＴ８８の基準値と、ステップＳ１１で取得した測定値とを比較する。
次に処理部１０１は、ステップＳ１２において、記憶部に記憶されているＩＦＴ８８の基準値と、ステップＳ１１で取得した測定値とを比較する。
処理部１０１は、ステップＳ１３において、取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合には、ステップＳ１４（ＹＥＳ）に進み、尿路系上皮腫瘍関連病変があると決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。また、ステップＳ１３において、取得した測定値が基準値よりも同等であるか高い場合に、ステップＳ１５（ＮＯ）に進み、尿路系上皮腫瘍関連病変がないと決定し、決定結果を示すラベルを出力部１１２に出力する（ステップＳ１６）。尿路系上皮腫瘍関連病変があると決定した場合におけるラベルには、「尿路系上皮腫瘍関連病変が有る」、又は「尿路系上皮腫瘍関連病変を示唆する」ことを示す情報が含まれる。尿路系上皮腫瘍関連病変がないと決定した場合におけるラベルには、「尿路系上皮腫瘍関連病変がない」、又は「尿路系上皮腫瘍関連病変を示唆しない」ことを示す情報が含まれる。前記情報は、×、〇、感嘆符等のマークであってもよい。
基準値、比較方法、測定値が基準値よりも高いか低いかの判定方法等の詳細は、上記２．の説明をここに援用する。
基準値、比較方法、測定値が基準値よりも高いか低いかの判定方法等の詳細は、上記２．の説明をここに援用する。
４－３．検出プログラムを格納する記憶媒体
本実施形態は、ステップＳ１１～Ｓ１６の処理をコンピュータに実行させる、検出プログラム１０４ｂを含む。
さらに、本実施形態のある実施形態は、前記検出プログラム１０４ｂを記憶した、記憶媒体等のプログラム製品に関する。すなわち、前記検出プログラム１０４ｂは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に格納され得る。また、記憶媒体はサーバ装置等のコンピュータであってもよい。記憶媒体へのプログラムの記録形式は、訓練装置２００Ａがプログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記録は、不揮発性であることが好ましい。
本実施形態は、ステップＳ１１～Ｓ１６の処理をコンピュータに実行させる、検出プログラム１０４ｂを含む。
さらに、本実施形態のある実施形態は、前記検出プログラム１０４ｂを記憶した、記憶媒体等のプログラム製品に関する。すなわち、前記検出プログラム１０４ｂは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に格納され得る。また、記憶媒体はサーバ装置等のコンピュータであってもよい。記憶媒体へのプログラムの記録形式は、訓練装置２００Ａがプログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記録は、不揮発性であることが好ましい。
５．尿路系上皮腫瘍の治療方法
本開示において、尿路系上皮腫瘍が陽性であるか陰性であるかに応じて治療方法を決定することができる。例えば、被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞においてＩＦＴ８８が陰性である場合には、公知の治療を行うことを提示することができる。
本開示において、尿路系上皮腫瘍が陽性であるか陰性であるかに応じて治療方法を決定することができる。例えば、被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞においてＩＦＴ８８が陰性である場合には、公知の治療を行うことを提示することができる。
被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞においてＩＦＴ８８が陰性である場合、外科的切除、放射線治療、BCG（ウシ型弱毒結核菌）投与、抗がん剤の投与等を提示することができる。外科的切除には、膀胱全摘、経尿道的膀胱腫瘍切除術を含み得る。抗がん剤には、ゲムシタビン、シスプラチン、シスプラチン、メソトレキセート、ビンブラスチン、アドリアマイシン等を含み得る。また、抗がん剤の投与には、GC療法（ゲムシタビンとシスプラチン）、MVAC療法（シスプラチン、メソトレキセート、ビンブラスチン、アドリアマイシン）等の多剤併用投与を含み得る。
以下に、実施例を示して本発明についてより詳細に説明する。しかし、本発明の実施形態は実施例に限定して解釈されるものではない。
１．実施例１：組織試料におけるIFT88タンパク質の検出
１－１．免疫染色
関西医科大学附属病院を受診した被検者から採取した膀胱組織を用いてパラフィン包埋組織を作製した。
パラフィン包埋組織を薄切し、スライドグラスにとり、スライド標本を作製した。
１－１．免疫染色
関西医科大学附属病院を受診した被検者から採取した膀胱組織を用いてパラフィン包埋組織を作製した。
パラフィン包埋組織を薄切し、スライドグラスにとり、スライド標本を作製した。
スライド標本に対して、キシレンで脱パラフィンを行い、エタノールで親水処理し、その後一旦乾燥させた。乾燥後のスライド標本をPBSで、5分間、３回洗浄した。抗原の賦活化及びブロッキングを行わずに、0.3% Triton X-100加PBSで50倍希釈したMouse Anti-IFT88（ProteinTech社, 60227-1-Ig）を洗浄後のスライド標本にのせ、室温で90分間インキュベートした。
インキュベート終了後のスライド標本を0.3% Triton X-100加PBSで、5分間、３回洗浄した。
インキュベート終了後のスライド標本を0.3% Triton X-100加PBSで、5分間、３回洗浄した。
洗浄後のスライド標本に、0.3% Triton X-100加PBSで2000倍希釈したGoat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594（Invitrogen, A-11005）をのせ、室温で60分間インキュベートした。
インキュベート終了後のスライド標本を0.3% Triton X-100加PBSで5分間、2回洗浄後、蒸留水で5分間、2回洗浄した。
インキュベート終了後のスライド標本を0.3% Triton X-100加PBSで5分間、2回洗浄後、蒸留水で5分間、2回洗浄した。
洗浄後のスライド標本を、Dapi-Fluoromount-G（商標）（SouthernBiotech, 0100-20）を使用しカバーガラスをかけ封入した。
１－２．結果
正常の膀胱組織、炎症を来した膀胱組織、異形成を来した膀胱組織、低異形乳頭癌組織、上皮内癌、浸潤癌、扁平上皮分化を来した膀胱組織について免疫染色を行った。その結果を図４に示す。図４上段はHE染色画像であり、下段はIFT88の免疫染色画像である。IFT88の存在を示す蛍光シグナルは、正常膀胱組織、及び炎症性膀胱組織において検出されたが、前癌病変である異形成膀胱組織、及び扁平上皮分化膀胱組織では、検出されなかった。また、癌組織においても、IFT88の存在を示す蛍光シグナルは検出されなかった。
正常の膀胱組織、炎症を来した膀胱組織、異形成を来した膀胱組織、低異形乳頭癌組織、上皮内癌、浸潤癌、扁平上皮分化を来した膀胱組織について免疫染色を行った。その結果を図４に示す。図４上段はHE染色画像であり、下段はIFT88の免疫染色画像である。IFT88の存在を示す蛍光シグナルは、正常膀胱組織、及び炎症性膀胱組織において検出されたが、前癌病変である異形成膀胱組織、及び扁平上皮分化膀胱組織では、検出されなかった。また、癌組織においても、IFT88の存在を示す蛍光シグナルは検出されなかった。
これらの結果から、IFT88の存在は、正常組織及び炎症性病変のグループと、前癌病変及び癌病変のグループを識別する際のマーカーとして使用できることが示された。
さらに、正常膀胱組織6例、炎症性膀胱組織6例について検討を行った。いずれもIFT88は陽性であった。このことから、CK8、CK18、NMP22のような炎症性疾患における擬陽性は少ないものと考えられた。
２．実施例２：尿試料中の尿路上皮の剥離片の免疫染色
被検者から採取した尿試料中の尿路上皮の剥離片に対して、免疫染色を行った。
尿試料を遠心して細胞を回収し、細胞標本を作製した。細胞標本に対して、１－１．と同じ抗体と試薬を用いて免疫染色を行った。
被検者から採取した尿試料中の尿路上皮の剥離片に対して、免疫染色を行った。
尿試料を遠心して細胞を回収し、細胞標本を作製した。細胞標本に対して、１－１．と同じ抗体と試薬を用いて免疫染色を行った。
結果を図５に示す。正常尿路上皮は、細胞全体にIFT88の存在を示す蛍光シグナルが検出された。一方、尿路上皮癌の細胞では、IFT88の存在を示す蛍光シグナルは検出されなかった。
この結果から、尿試料中の細胞を用いても、正常組織及び炎症性病変のグループと、前癌病変及び癌病変のグループを識別することが可能であると考えられた。
この結果から、尿試料中の細胞を用いても、正常組織及び炎症性病変のグループと、前癌病変及び癌病変のグループを識別することが可能であると考えられた。
３．実施例３： IFT88 mRNAの検出
RNAscope（商標）（Advanced Cell Diagnostics社）を用いてIFT88のin situ ハイブリダイゼーションを行い、正常膀胱組織、炎症性膀胱組織、異形成膀胱組織、上皮内癌組織、筋層浸潤癌組織のIFT88 mRNAの検出を行った。有意差は、ボンフェローニ補正をかけた上で、ステューデントｔ検定を行い検定した。
RNAscope（商標）（Advanced Cell Diagnostics社）を用いてIFT88のin situ ハイブリダイゼーションを行い、正常膀胱組織、炎症性膀胱組織、異形成膀胱組織、上皮内癌組織、筋層浸潤癌組織のIFT88 mRNAの検出を行った。有意差は、ボンフェローニ補正をかけた上で、ステューデントｔ検定を行い検定した。
結果を図６に示す。図６は、各組織の3視野について100μm2あたりのIFT88 mRNAのドット状のシグナルをカウントし、平均値を求めた結果である。異形成膀胱組織、上皮内癌組織、筋層浸潤癌組織では、正常膀胱組織よりも著しくシグナル数が減少していた。また、炎症性膀胱組織では、正常膀胱組織よりもシグナル数が有意に増加していた。
このことから、IFT88 mRNAも、正常組織及び炎症性病変のグループと、前癌病変及び癌病変のグループを識別する際のマーカーとして使用できることが示された。
また、炎症性病変でシグナル数が正常組織よりも増加することから、炎症性病変でIFT88が陰性となるリスクは少ないものと考えられた。
また、炎症性病変でシグナル数が正常組織よりも増加することから、炎症性病変でIFT88が陰性となるリスクは少ないものと考えられた。
Claims (10)
- 被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を検出する工程を含む、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出方法。
- 前記尿路系上皮細胞において、ＩＦＴ８８が検出されなかった場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変が存在すると決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の検出方法。
- ＩＦＴ８８の検出が、前記尿路系上皮細胞を免疫染色することによって行われる、請求項１または２に記載の検出方法。
- 前記試料が、尿、または尿路組織である、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
- 尿路系上皮腫瘍関連病変は、癌である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
- 尿路系上皮腫瘍関連病変は、異形成を来した状態、または、扁平上皮分化を来した状態である、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法。
- 尿路系上皮細胞に存在するＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして使用する方法。
- 被検者から採取された尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８を、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカーとして検出するための検査試薬であって、前記検査試薬は、ＩＦＴ８８を検出するための抗体、又は核酸を含む、前記検査試薬。
- ＩＦＴ８８からなる、尿路系上皮腫瘍関連病変を検出するためのバイオマーカー。
- 処理部を備える、尿路系上皮腫瘍関連病変のバイオマーカーの検出装置であって、
前記処理部は、
被検者から採取された試料中の尿路系上皮細胞におけるＩＦＴ８８の測定値を取得し、
取得した測定値を、基準値と比較し、
取得した測定値が、前記基準値よりも高い場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変がないことを示すラベルを出力する、及び／又は
取得した測定値が、前記基準値よりも低い場合に、尿路系上皮腫瘍関連病変があることを示すラベルを出力する、
前記検出装置。
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