JP2022012379A - ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤、およびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤、およびその利用を提供する。【解決手段】本発明の一態様に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩を有効成分として含有する。【化１】TIFF2022012379000007.tif54154式（１）中、Ｒ１は、各々独立して、ハロゲンであり、Ｒ２は、ハロゲンであり、Ｒ３は、ＮＯ２である。【選択図】なし

Description

本発明は、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤、およびその利用に関する。

生体が老化すると、様々な組織および臓器などの機能が低下する傾向を示す。例えば、生体の老化によって皮膚細胞の機能が低下すると、皺などが発生し易くなる。それ故に、従来から、皮膚細胞の老化を遅延させるための試みがなされている（例えば、特許文献１）。

生体の老化は、組織および臓器などの機能低下のみならず、場合によっては、様々な疾患を引き起こし得る。アルツハイマー病に代表される認知症の患者数は、世界的に増加の一途を辿っている。認知症は、患者本人のみならず、介護をする家族にも大きな負担を強いる疾患である。さらに、日本における認知症に対する治療費は、２０５０年には４０～５０兆円にも達するという予測もあり、患者数の増加は国家財政の破綻にも繋がり得る。認知症の治療薬として、様々な治療薬が知られているが、認知症を根本的に治療するものではなく、対症療法として用いられているにすぎない。

近年、中枢神経への異常タンパク質の蓄積が、認知症をはじめとした老化関連疾患の原因であることが知られてきており、異常タンパク質の蓄積に関与する機構、および、異常タンパク質の分解に関与する機構の解明が進められている。

生体内に存在するユビキチン－プロテアソーム系は、異常タンパク質の分解に関与する機構であることが知られている。老化に伴ってユビキチン－プロテアソーム系の活性が低下すると、異常タンパク質が分解されること無く生体内に蓄積される。そして、この異常タンパク質の蓄積により、老化関連疾患（例えば、アルツハイマー病）が誘発されると考えられている。

病態モデル動物を用いた実験では、細胞内のプロテアソーム量を増加させることによって、異常タンパク質が減少し、その結果、老化関連疾患の改善（例えば、寿命の延長、認知機能の改善）がみられるとの報告がある（例えば、非特許文献１）。このことから、ユビキチン－プロテアソーム系を人為的に活性化することができれば、異常タンパク質を減少させることができ、認知症をはじめとした老化関連疾患の予防および治療に有効であると考えられる。

特願２０１２－５２７９５９

Tonoki et al., Mol Cell Biol., Vol.29, No.4, page 1095～1106, 2009

上述した状況下にあって、現在、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤の開発が強く求められている。

本発明は上記問題点を鑑みなされたものであって、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤、およびその利用を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討した結果、本発明の低分子化合物が、ユビキチン－プロテアソーム系を活性化させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下の構成を含む。

＜１＞下記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩を有効成分として含有する、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤：

式（１）中、Ｒ^１は、各々独立して、ハロゲンであり、Ｒ^２は、ハロゲンであり、Ｒ^３は、ＮＯ_２である。
＜２＞下記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩を有効成分として含有する、老化関連疾患の予防剤または治療剤：

式（１）中、Ｒ^１は、各々独立して、ハロゲンであり、Ｒ^２は、ハロゲンであり、Ｒ^３は、ＮＯ_２である。
＜３＞上記老化関連疾患は、認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（プリオン病）、サンドホッフ病、ピック病、脊髄小脳失調症、シルダー病、アルパース病、びまん性レヴィー小体病、有棘赤血球舞踏病、原発性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、またはフリードライヒ失調症である、請求項２に記載の老化関連疾患の予防剤または治療剤。

本発明の一態様によれば、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤、およびその利用（例えば、老化関連疾患の予防剤または治療剤）を提供できる。

ＣＧＫ７３３およびＭＧ１３２がＣｙｃｌｉｎタンパク質の量に及ぼす影響を示す、ウェスタンブロッティングの像である。 アミロイドβおよびＣＧＫ７３３で処理したマウス神経細胞における、ＣＧＫ７３３の濃度に対する軸索密度を示したグラフである。 ＣＧＫ７３３を投与したアルツハイマー病モデルマウスの物体認知記憶試験の結果を示したグラフである。 図３に示した各マウスの運動量を比較したグラフである。 図３に示した各マウスの体重を比較したグラフである。

本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ～Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。

〔１．ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤〕
本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、下記式（１）で表される化合物ＣＧＫ７３３（ＩＵＰＡＣ名：2,2-diphenyl-n-(2,2,2-trichloro-1-[3-(4-fluoro-3-nitrophenyl)thioureide] ethyl) acetamide）若しくはその誘導体、またはそれらの塩を有効成分として含有する。

ＣＧＫ７３３は、低分子化合物である。それ故に、本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、（ｉ）生体への投与が容易であり、（ｉｉ）生体内における標的組織への拡散が容易であり、（ｉｉｉ）長期にわたる保存が可能であり、（ｉｖ）標的細胞への導入が容易であり、および、（ｖ）安価であるという利点を有する。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、有効成分を１種類のみ含有していてもよいし、２種類以上を含有していてもよい。例えば、上記ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、（ｉ）ＣＧＫ７３３、（ｉｉ）ＣＧＫ７３３の誘導体、（ｉｉｉ）ＣＧＫ７３３の塩、（ｉｖ）ＣＧＫ７３３の誘導体の塩、または、（ｖ）上記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される２つ以上、を含有していてもよい。

式（１）中、Ｒ^１は、各々独立して、ハロゲンであり、Ｒ^２は、ハロゲンであり、Ｒ^３は、ＮＯ_２である。

体内にて生成された異常タンパク質（例えば、ミスフォールドタンパク質）は、通常ユビキチンによって標識され、ユビキチン化タンパク質となる。ユビキチン化タンパク質は、プロテアソームによって認識され、アミノ酸へと分解される。

「ユビキチン－プロテアソーム系」には、ユビキチン化タンパク質がプロテアソームによって分解される過程に関与する、様々なタンパク質（酵素）が包含される。本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、ユビキチン化タンパク質がプロテアソームによって分解される反応のどの段階を活性化させてもよい。例えば、本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、異常タンパク質がユビキチンによって標識される反応を活性化するものであってもよいし、プロテアソーム（例えば、２６Ｓプロテアソーム、２０Ｓプロテアソーム、１９Ｓプロテアソーム）を活性化させるものであってもよいし、プロテアソーム活性化因子（例えば、ＰＡ７００、ＰＡ２８）を活性化させるものであってもよく、その作用機序は限定されない。

上記化合物ＣＧＫ７３３若しくはその誘導体、またはそれらの塩は、公知の手法にしたがって製造してもよく、市販品を用いてもよい。

本明細書において、「誘導体」とは、式（１）で表される化合物の分子内の一部が、他の官能基または他の原子と置換されることにより生じる化合物を意図する。好ましくは、「誘導体」とは、式（１）で表される化合物の分子内の一部が、他の官能基または他の原子と置換されることにより生じる化合物であって、かつ、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化能を有する化合物を意図する。式（１）で表される化合物内の置換される部分は、限定されない。式（１）で表される化合物内の置換される部分は、例えば、当該化合物内の任意の部分であってもよいし、当該化合物内のＲ^１、Ｒ^２およびＲ^３にて示される部分以外の部分であってもよい。また、当該誘導体がユビキチン－プロテアソーム系の活性化能を有するか否かは、後述する実施例に記載の方法によって確認することができる。

上記他の官能基の例としては、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールチオ基、アリールアルキル基、アリールアルコキシ基、アリールアルキルチオ基、アリールアルケニル基、アリールアルキニル基、アリル基、アミノ基、置換アミノ基、シリル基、置換シリル基、シリルオキシ基、置換シリルオキシ基、アリールスルフォニルオキシ基、アルキルスルフォニルオキシ基、ニトロ基等が挙げられる。上記他の原子の例としては、炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、リン原子、ハロゲン原子等が挙げられる。

Ｒ^１としては、より高いユビキチン－プロテアソーム系の活性化能を得られる観点から、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ａｔ）であることが好ましい。また、ハロゲンの中でもＣｌであることが最も好ましい。３つのＲ^１は、全てが同じ官能基であってもよいし、いずれかの２つが同じ官能基であってもよいし、全てが異なる官能基であってもよい。

Ｒ^２としては、より高いユビキチン－プロテアソーム系の活性化能を得られる観点から、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ａｔ）であることが好ましい。また、ハロゲンの中でも、Ｆであることが最も好ましい。

Ｒ^３としては、より高いユビキチン－プロテアソーム系の活性化能を得られる観点から、ＮＯ_２であることが好ましい。

本明細書において、「塩」とは、生体に投与することが生理学的に許容されうる、式（１）で表される化合物の塩を意図する。好ましくは、「塩」とは、生体に投与することが生理学的に許容されうる、式（１）で表される化合物の塩であって、かつ、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化能を有する塩を意図する。塩の種類は、限定されない。また、当該塩がユビキチン－プロテアソーム系の活性化能を有するか否かは、後述する実施例に記載の方法によって確認することができる。

上記塩の例としては、アルカリ金属塩（カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩、有機塩基塩（トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩等）、有機酸塩（酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、蟻酸塩、トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等）、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）が挙げられる。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる有効成分の濃度は、有効成分の種類、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤の投与経路、および、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤の剤型等によって異なり得る。

一例において、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる上記有効成分の濃度の下限は、０．００１μＭ以上、０．０１μＭ以上、０．１μＭ以上、１μＭ以上、１０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、５００μＭ以上、または、１０００μＭ以上である。

一例において、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる上記有効成分の濃度の上限は、０．０１μＭ以下、０．１μＭ以下、１μＭ以下、１０μＭ以下、５０μＭ以下、１００μＭ以下、５００μＭ以下、１０００μＭ以下、または、５０００μＭ以下である。

一例において、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる上記有効成分の濃度は、０．００１μＭ～５０００μＭ、０．００１μＭ～１０００μＭ、０．００１μＭ～５００μＭ、０．００１μＭ～１００μＭ、０．００１μＭ～５０μＭ、０．００１μＭ～１０μＭ、０．００１μＭ～１μＭ、０．００１μＭ～０．１μＭ、または、０．００１μＭ～０．０１μＭである。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、上記有効成分以外の成分を含有していてもよい。

上記有効成分以外の成分としては、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、および、安定化剤等を挙げることができる。

上記緩衝剤の例としては、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、クエン酸、クエン酸塩、酢酸、酢酸塩、炭酸、炭酸塩、酒石酸、酒石酸塩、ε－アミノカプロン酸、および、トロメタモール等が挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等が挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、および、ホウ酸カリウム等が挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、および、クエン酸三ナトリウム等が挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、および、酢酸カリウム等が挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、および、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、および、酒石酸カリウム等が挙げられる。

ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、および、水酸化カリウム等が挙げられる。

上記等張化剤の例としては、イオン性等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および、塩化マグネシウム等）、および、非イオン性等張化剤（グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、および、マンニトール等）が挙げられる。

上記防腐剤の例としては、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、および、クロロブタノール等が挙げられる。

上記抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、および、亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。

上記高分子量重合体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、および、アテロコラーゲン等が挙げられる。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる上記有効成分以外の成分の濃度は、特に限定されない。

一例において、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる上記有効成分以外の成分の濃度の下限は、０μＭ以上、０．００１μＭ以上、０．０１μＭ以上、０．１μＭ以上、１μＭ以上、１０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、５００μＭ以上、または、１０００μＭ以上である。

一例において、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる上記有効成分以外の成分の濃度の上限は、０．０１μＭ以下、０．１μＭ以下、１μＭ以下、１０μＭ以下、５０μＭ以下、１００μＭ以下、５００μＭ以下、１０００μＭ以下、または、５０００μＭ以下である。

一例において、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤に含まれる上記有効成分以外の成分の濃度は、０μＭ～５０００μＭ、０μＭ～１０００μＭ、０μＭ～５００μＭ、０μＭ～１００μＭ、０μＭ～５０μＭ、０μＭ～１０μＭ、０μＭ～１μＭ、０μＭ～０．１μＭ、または、０μＭ～０．０１μＭである。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、被験体に対して投与され得る。上記被験体は、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。上記ヒト以外の動物の例としては、ヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット等）が挙げられる。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、任意の投与経路によって被験体に投与され得る。上記投与経路の例としては、経口投与、非経口投与、経皮投与、経粘膜投与、経静脈投与が挙げられる。したがって、上記ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤の剤型は、内服薬、外用薬、注射剤、坐剤、吸入剤、点眼剤等であり得る。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤は、中枢神経系（例えば、脳、脊髄）へ直接投与されてもよく、より具体的に脳室へ直接投与されてもよい。中枢神経系への直接投与の方法としては、ポンプを用いて投与する方法、注射器によって投与する方法が挙げられる。

本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤を投与する場合、所望の効果が得られるならば、投与間隔に制限はない。上記投与間隔は、例えば、１時間～６ヶ月に１回、１時間～１ヶ月に１回、１時間～１０日に１回、１時間～５日に１回、１時間～１日に１回、１時間～１２時間に１回、１時間～６時間に１回、または、１時間～２時間に１回である。

また、投与間隔を設けずに、継続的に投与してもよい。投与期間は、例えば、１時間～６ヶ月、１時間～１ヶ月、１時間～１０日、１時間～５日、１時間～１日、１時間～１２時間、１時間～６時間、または、１時間～２時間である。

〔２．老化関連疾患の予防剤および治療剤〕
本発明の一実施形態に係る老化関連疾患の予防剤または治療剤は、下記式（１）で表される化合物ＣＧＫ７３３（ＩＵＰＡＣ名：2,2-diphenyl-n-(2,2,2-trichloro-1-[3-(4-fluoro-3-nitrophenyl)thioureide] ethyl) acetamide）若しくはその誘導体またはそれらの塩を有効成分として含有する。

本発明の一実施形態に係る老化関連疾患の予防剤または治療剤は、有効成分を１種類のみ含有していてもよいし、２種類以上を含有していてもよい。例えば、上記老化関連疾患の予防剤または治療剤は、（ｉ）ＣＧＫ７３３、（ｉｉ）ＣＧＫ７３３の誘導体、（ｉｉｉ）ＣＧＫ７３３の塩、（ｉｖ）ＣＧＫ７３３の誘導体の塩、または、（ｖ）上記（ｉ）～（ｉｖ）からなる群から選択される２つ以上、を含有していてもよい。以下では、〔１．ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤〕で既に説明した事項については、説明を省略する。

式（１）中、Ｒ^１は、各々独立して、ハロゲンであり、Ｒ^２は、ハロゲンであり、Ｒ^３は、ＮＯ_２である。

本明細書において「老化関連疾患」とは、ユビキチン－プロテアソーム系の標的である異常タンパク質が生体内（例えば、中枢神経）へ蓄積されることによって発症する疾患を意図する。老化関連疾患としては、例えば、認知症（例えば、アルツハイマー病）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（プリオン病）、サンドホッフ病、ピック病、脊髄小脳失調症、シルダー病、アルパース病、びまん性レヴィー小体病、有棘赤血球舞踏病、原発性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、またはフリードライヒ失調症を挙げることができる。また、アルツハイマー病としては、例えば、家族性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病を挙げることができる。

本明細書中、「異常タンパク質」とは、体内で正常に作用しないタンパク質を意図する。異常タンパク質としては、例えば、ミスフォールドタンパク質、および、変性タンパク質が挙げられ、より具体的にアミロイドβが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「予防剤」とは、予防効果をもたらす薬剤を意図する。当該予防効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。

（１）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、または、発症のリスクを低減する。

（２）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、または、再発のリスクを低減する。

（３）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、または、兆候が生じるリスクを低減する。

なお、疾患に係る１つ以上の症状は、全身的なものであってもよいし、局所的なものであってもよい。

本明細書において「治療剤」とは、治療効果をもたらす薬剤を意図する。当該治療効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。

（１）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。

（２）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または、重症度の進行を防止する。

（３）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または、重症度の進行速度を低減する。

なお、疾患に係る１つ以上の症状は、全身的なものであってもよいし、局所的なものであってもよい。

一例において、老化関連疾患の予防剤または治療剤に含まれる上記有効成分の濃度の下限は、０．００１μＭ以上、０．０１μＭ以上、０．１μＭ以上、１μＭ以上、１０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、５００μＭ以上、または、１０００μＭ以上である。

一例において、老化関連疾患の予防剤または治療剤に含まれる上記有効成分の濃度の上限は、０．０１μＭ以下、０．１μＭ以下、１μＭ以下、１０μＭ以下、５０μＭ以下、１００μＭ以下、５００μＭ以下、１０００μＭ以下、または、５０００μＭ以下である。

一例において、老化関連疾患の予防剤または治療剤に含まれる上記有効成分の濃度は、０．００１μＭ～５０００μＭ、０．００１μＭ～１０００μＭ、０．００１μＭ～５００μＭ、０．００１μＭ～１００μＭ、０．００１μＭ～５０μＭ、０．００１μＭ～１０μＭ、０．００１μＭ～１μＭ、０．００１μＭ～０．１μＭ、または、０．００１μＭ～０．０１μＭである。

上記老化関連疾患の予防剤または治療剤は、〔１．ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤〕にて記載した有効成分以外の成分を含有してもよく、〔１．ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤〕にて記載した有効成分以外の成分を〔１．ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤〕にて記載した濃度にて含有してもよい。また、上記老化関連疾患の予防剤または治療剤は、上記ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤そのものを含有してもよい。

本発明の一実施形態に係る老化関連疾患の予防剤または治療剤の投与対象（被験体）、投与経路、および、投与間隔は、上述した本発明の一実施形態に係るユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤の投与対象（被験体）、投与経路、および、投与間隔と同じであり得る。これらについては既に説明したので、ここではその説明を省略する。

〔３．その他〕
本発明は、以下のように構成してもよい。

＜１＞上記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩を有効成分として含有するユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤を、被検体または非ヒト被検体（例えば、哺乳類、非ヒト哺乳類、霊長類、偶蹄類、奇蹄類、齧歯類、または、ウサギ目）に投与する工程を有する、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化方法。

＜２＞上記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩を有効成分として含有する老化関連疾患の予防剤または治療剤を、被検体または非ヒト被検体（例えば、哺乳類、非ヒト哺乳類、霊長類、偶蹄類、奇蹄類、齧歯類、または、ウサギ目）に投与する工程を有する、老化関連疾患の予防方法または治療方法。

＜３＞上記老化関連疾患は、認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（プリオン病）、サンドホッフ病、ピック病、脊髄小脳失調症、シルダー病、アルパース病、びまん性レヴィー小体病、有棘赤血球舞踏病、原発性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、またはフリードライヒ失調症である、＜２＞に記載の老化関連疾患の予防方法または治療方法。

＜４＞ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤を製造するための、上記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩の使用。

＜５＞老化関連疾患の予防剤または治療剤を製造するための、上記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩の使用。

＜試験１．ＣＧＫ７３３のユビキチン－プロテアソーム系における作用＞
ユビキチン－プロテアソーム系の標的分子であるＣｙｃｌｉｎタンパク質群に対するＣＧＫ７３３の影響を調べた。

ＨｅＬａＳ３細胞をＤ－ＭＥＭ培地中で培養した。当該培地に対して、ＣＧＫ７３３（Sigma-Aldrich社製）、および／または、プロテアソームの阻害剤であるＭＧ１３２（Sigma-Aldrich社製）を添加して、６時間培養した。なお、培地中におけるＣＧＫ７３３の濃度は５μＭとし、培地中におけるＭＧ１３２の濃度は、２０μＭとした。

培養終了後、各細胞を、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）にて洗浄した後、1x Sample Buffer溶液にて溶解し、細胞中のタンパク質を抽出した。得られた細胞抽出液に含まれるタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離した後、分離されたタンパク質をメンブレンに転写し、当該メンブレンをウエスタンブロット法に供して、Ｃｙｃｌｉｎ Ａ２、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ３、Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ１、および、α－Ｔｕｂｕｌｉｎの各々のタンパク質量を確認した。なお、各タンパク質の検出には、市販の一次抗体および二次抗体を用いた。

図１に結果を示す。図１に示すように、ＣＧＫ７３３で処理された細胞抽出液では、ユビキチン－プロテアソーム系の標的分子である各Ｃｙｃｌｉｎのタンパク質量が減少した。一方、ＣＧＫ７３３、および、プロテアソームの阻害剤であるＭＧ１３２で処理された細胞抽出液では、ＣＧＫ７３３によって得られる各Ｃｙｃｌｉｎのタンパク質量の減少効果がキャンセルされた。なお、いずれの細胞抽出液においても、ユビキチン－プロテアソーム系の標的分子ではないα－Ｔｕｂｌｉｎのタンパク質量には変化がなかった。以上のことから、ＣＧＫ７３３はユビキチン－プロテアソーム系によるタンパク質分解を促進する作用があることがわかった。

＜試験２．マウス神経細胞に対するＣＧＫ７３３の影響＞
公知の方法にしたがって、胎生１４．５日齢のマウス胎児（ＳＬＣ社から購入）から大脳皮質を取り出し、当該脳から神経細胞由来の初代培養細胞を作製した。当該初代培養細胞を培養している培地に対して、（ｉ）１０μＭのアミロイドβ（２５－３５）を加え３日間処置した後、（ｉｉ）０μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭまたは１μＭのＣＧＫ７３３が入った培地に交換し、さらに４日間培養した。なお、アミロイドβは、初代培養細胞に対して、アルツハイマー病様の軸索の萎縮、樹状突起の萎縮を誘導する。当該試験によれば、アルツハイマー病様の神経突起の萎縮に対する、ＣＧＫ７３３の効果を確認することができる。

培養後、軸索のマーカータンパク質であるリン酸化ニューロフィラメントＨに対する蛍光免疫染色法によって初代培養細胞の軸索密度を測定した。

図２に結果を示す。図２より、培地にアミロイドβのみが添加された場合、初代培養細胞の軸索密度が減少し、アルツハイマー病様の軸索の萎縮が観察された。一方、培地にアミロイドβおよびＣＧＫ７３３が添加された場合、初代培養細胞の軸索密度が増加し、アミロイドβによって引き起こされる神経細胞の萎縮効果がキャンセルされた。なお、図２に示すように、ＣＧＫ７３３の濃度依存的に、初代培養細胞の軸索密度が増加した。以上のことから、ＣＧＫ７３３は、アミロイドβによって引き起こされる神経細胞の萎縮を改善することが示された。

＜試験３．病態に対するＣＧＫ７３３の影響＞
家族性アルツハイマー病のモデルマウスである５ｘＦＡＤモデルマウス（３０－３７週齢、Jackson Laboratory社から購入）、および、野生型マウス（３０－３７週齢、Jackson Laboratory社から購入）の脳室に、浸透圧ポンプ（商品名:アルゼット浸透圧ミニポンプ、Alzet社製）によって、人工脳脊髄液のみを、または、脳脊髄液中に注入後のＣＧＫ７３３の最終濃度が１μＭとなるように、当該人工脳脊髄液にＣＧＫ７３３を溶解させた溶液を、脳注入カニューレを介して注入した。注入量は０．１１μＬ／ｈｒで、２８日間の連続注入を行った。

３０日間の投与の後、これらのマウスに対して、物体認知記憶試験を行った。物体認知記憶試験は、文献（Yang X, Tohda C. Front Pharmacol. (2018)9:48.）に記載の方法にしたがって行った。具体的には、物体認知記憶試験は、マウスが初めて目にする２つの陶器製の置物を試験物体として、１０分間のトレーニングと、１０分間のテストとからなり、トレーニングとテストとのインターバルを３０分間に設定した。トレーニング時に用いた物体のうちの１つを、テスト時には別の形状の新規物体に置き換えた。物体認知の記憶率としては、（ｉ）２つの物体に対する全探索行動数を分母とし、置き換える前の物体に対する探索行動を分子として１００分率で表した数値をトレーニングの記憶率とし、（ｉｉ）２つの物体に対する全探索行動数を分母とし、置き換えた後の物体に対する探索行動を分子として１００分率で表した数値をテストの記憶率とした。

図３に結果を示す。なお、図３中、「トレーニング」での値が５０％を上回っているほど、物体に対する記憶が正常であることを示す。図３より、溶媒である人工脳脊髄液のみを投与した５ｘＦＡＤモデルマウスと比較して、ＣＧＫ７３３を投与した５ｘＦＡＤモデルマウスは有意に物体認知の記憶能力が向上していた。したがって、ＣＧＫ７３３の投与は、家族性アルツハイマー病を改善できることが示された。検定は、対応のあるｔ検定によって行った。なお、サンプル数は４～５とした。

＜試験４．運動量に対するＣＧＫ７３３の影響＞
上述した試験３にて用いたマウスについて、溶媒またはＣＧＫ７３３の投与開始から２７日目の時点での運動量を測定した。運動量の測定は、文献（Yang X, Tohda C. Front Pharmacol. (2018)9:48.）に記載の方法にしたがって行った。具体的に、運動量の測定は、オープン箱（３３ｃｍ×２９ｃｍ；高さ２６．５ｃｍ）内にマウスを入れ、１０分間の自由行動をビデオで撮影した。リアルタイムに行動解析を行うEthoVision 3.0システム（Noldus社製）を用いて、１０分間での移動距離（ｃｍ）を測定した。検定は一元配置分散分析(post hoc Bonferroni's multiple comparisons test)によって行った。なお、サンプル数は４～５とした。

図４に結果を示す。図４より、ＣＧＫ７３３を投与した５ｘＦＡＤモデルマウスは、溶媒を投与した５ｘＦＡＤモデルマウス、および、溶媒を投与した野生型マウスと比較して、移動距離に有意な差は見られなかった。したがって、ＣＧＫ７３３は、運動量に関して異常行動は生じないことが示された。

＜試験５．体重に対するＣＧＫ７３３の影響＞
上述した試験３にて用いたマウスについて、試験期間中の体重を、経時的に測定した。体重の測定は、上皿電子天秤を用いて行った。なお、サンプル数は４～５とした。

図５に結果を示す。図５より、ＣＧＫ７３３を投与した５ｘＦＡＤモデルマウスは、溶媒を投与した５ｘＦＡＤモデルマウス、および、溶媒を投与した野生型マウスと比較して、体重に有意な差は見られなかった。したがって、ＣＧＫ７３３は、体重に影響を与えず、摂食および代謝に関して副作用は生じないことが示された。

本発明は、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤、老化関連疾患の予防剤、および、老化関連疾患の治療剤として好適に利用することができる。

Claims (3)

1. 下記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩を有効成分として含有する、ユビキチン－プロテアソーム系の活性化剤：
   

   

   式（１）中、Ｒ^１は、各々独立して、ハロゲンであり、Ｒ^２は、ハロゲンであり、Ｒ^３は、ＮＯ_２である。
2. 下記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体、または、それらの塩を有効成分として含有する、老化関連疾患の予防剤または治療剤：
   

   

   式（１）中、Ｒ^１は、各々独立して、ハロゲンであり、Ｒ^２は、ハロゲンであり、Ｒ^３は、ＮＯ_２である。
3. 上記老化関連疾患は、認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病（プリオン病）、サンドホッフ病、ピック病、脊髄小脳失調症、シルダー病、アルパース病、びまん性レヴィー小体病、有棘赤血球舞踏病、原発性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、またはフリードライヒ失調症である、請求項２に記載の老化関連疾患の予防剤または治療剤。

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