JP2021535191A - 吸入用の呼吸可能なポリヌクレオチド粉末製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、吸入による肺系への送達用の、好ましくは噴霧乾燥によって調製されたポリヌクレオチドを含む呼吸可能な乾燥粉末粒子製剤を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１１月１３日に申請された米国仮特許出願第６２／７６０，２３２号の利益を主張する。上記仮出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

呼吸可能なポリヌクレオチド含有粉末粒子製剤、例えば、吸入による肺系への送達のための治療上適切なレベルのＲＮＡを含むＲＮＡ乾燥粉末粒子製剤の開発は、疾患の治療における非侵襲的かつ標的化されたアプローチ、ならびにネブライザー及び加圧式定量吸入器に対する改善を提供するであろう。

本発明は、吸入による肺系への送達用の、噴霧乾燥によって調製されたポリヌクレオチドを含む呼吸可能な乾燥粉末粒子製剤を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。好ましくは、本発明は、吸入による肺系への送達のための、噴霧乾燥によって調製された呼吸可能なポリヌクレオチド乾燥粉末粒子製剤を提供する。本発明は、肺送達、好ましくは患者によって作動される乾燥粉末吸入器を使用した送達に適した化学的、物理的及びエアロゾル特性を有する噴霧乾燥ポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ含有粉末などのＲＮＡ含有粉末において使用される製剤及びパラメータを含む。ｗｗｗ．ａｃｏｒｄａ．ｃｏｍに記載されている吸入薬については、例えば、ＡＲＣＵＳ（登録商標）プラットフォームを参照されたい。

好ましくは、肺送達用の呼吸可能なポリヌクレオチド乾燥粉末粒子製剤は、
ｉ）粒子の少なくとも約１重量％のポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ）；
ｉｉ）粒子の少なくとも約１０重量％のＤＰＰＣ；
ｉｉｉ）場合により、粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上であって、２つ以上のアミノ酸が選択される場合、各アミノ酸は、他の選択されたアミノ酸と同じ又は異なる重量パーセンテージのいずれかを有する、上記粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上；
ｉｖ）場合により、粒子の少なくとも約１重量％のＮａＣｌ；
ｖ）場合により、粒子の少なくとも約１０重量％のＴｒｉｓ；
ｖｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＥＤＴＡ；
ｖｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のトレハロース；
ｖｉｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＰＥＩ；及び
ｉｘ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のラクトースを含み、
ＲＮＡ乾燥粉末の全ての成分を合計して１００重量パーセントに達する。

好ましくは、製剤は、約１重量％〜約８０重量％、好ましくは約１重量％〜７０重量％、例えば約１重量％、１０重量％、２５重量％、５０重量％又は約６０重量％のポリヌクレオチドを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。「ＲＮＡ」という用語は、全ての形態及び全ての供給源からの全てのＲＮＡ及び修飾ＲＮＡを網羅することを意図している。好ましくは、ＲＮＡはｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、キャップされたｍＲＮＡ又はキャップされていないｍＲＮＡであり得る。好ましくは、ｍＲＮＡは、キャップされたＲＮＡである。酵母ＲＮＡを使用する例では、酵母ＲＮＡは、ｍＲＮＡのプレースホルダーである。

好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも約１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２５、１５０、２００核酸又はそれ以上の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約１０〜約１２，０００核酸又はそれ以上の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約２０〜約１２，０００又はそれ以上の核酸の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約５０〜約１２，０００又はそれ以上の核酸の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約１００〜約１２，０００又はそれ以上の核酸の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、長さが約２０〜約１２，０００モノマー、又は約２０〜約１０，０００モノマー、又は約２０〜８０００モノマー、又は約２０〜６０００モノマー、又は約２０〜約５０００モノマー、又は約２０〜約４０００モノマー、又は約２０〜約３６００モノマー、又は約２０〜約３２００モノマー、又は約２０〜約３０００モノマー、又は約２０〜約２８００モノマー、又は約２０〜約２６００モノマー、又は約２０〜２４００モノマー、又は約２０〜２２００モノマー、又は約５０〜３２００モノマー、又は約５０〜３０００モノマー、又は約５０〜２６００モノマーであり得る。

好ましくは、製剤は、約１０重量％〜約３０重量％、好ましくは約１５重量％〜２５重量％、例えば約１５重量％、１８重量％、２０重量％、２２重量％又は約２５重量％のＤＰＰＣを含む。

本発明は、約１％、好ましくは約１％〜約２０％、好ましくは約１％〜約１０％、好ましくは約１％〜約５％のカチオン性賦形剤を場合により含むことができる、呼吸可能なポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ）乾燥粉末製剤を提供する。カチオン性賦形剤は、少なくとも１つの正に帯電したアミノ酸又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり得る。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約９０重量％、好ましくは約５重量％〜８５重量％、例えば約５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、７０重量％、７４重量％、７９重量％、８０重量％、又は約８５重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン、又はバリンのうちの１つ以上を含み、２つ以上のアミノ酸が選択される場合、各アミノ酸は、他の選択されたアミノ酸と同じか又は異なる重量パーセンテージを有する。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約５重量％、好ましくは約１重量％〜３重量％、例えば約１重量％、２重量％、又は約３重量％のＮａＣｌを含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約２５重量％、好ましくは約５重量％〜２０重量％、例えば約５重量％、１０重量％、１５重量％又は約２０重量％のＴｒｉｓを含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約１０重量％、好ましくは約２重量％〜８重量％、例えば約２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％又は約７重量％のＥＤＴＡを含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約４０重量％〜約９０重量％、好ましくは約４５重量％〜８５重量％、例えば約４５重量％、５０重量％、５２重量％、５３重量％、５４重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７２重量％、７４重量％、７５重量％、７７重量％、７９重量％、８０重量％又は約８２重量％のトレハロースをさらに含んでいてもよい。

好ましくは、製剤は、場合により、約４０重量％〜約９０重量％、好ましくは約４５重量％〜８５重量％、例えば約４５重量％、５０重量％、５２重量％、５３重量％、５４重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７２重量％、７４重量％、７５重量％、７７重量％、７９重量％、８０重量％、又は約８２重量％のラクトースをさらに含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約１０重量％、好ましくは約１重量％〜８重量％、例えば約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、又は約７重量％のＰＥＩを含む。

好ましくは、製剤は、表１に列挙される以下の製剤の１つから選択される。

重量パーセントは、残留水、溶媒又は不純物に関係なく、乾燥粒子中の固体、脂質、及び／又は賦形剤の総量を反映することを意図している。好ましくは、乾燥粒子の全成分を合計して１００重量％になる。

ＲＮＡ粉末の開発に使用される噴霧乾燥機の設定を示す図である。

本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語は、文脈が不適切でない限り、「１つ以上」を意味し、複数を含むように定義される。

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、組成物又は方法工程の列挙されていない追加の要素を排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、他に特定されない要素、工程、又は成分を除外する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、組成物又は方法の範囲を、指定された材料又は工程、及び指定された組成物又は方法の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。

比率、濃度、量、及び他の数値データは、本明細書では範囲形式で表され得ることに留意されたい。そのような範囲形式は、利便性及び簡潔さのために使用され、したがって、範囲の限界として明示的に列挙された数値だけでなく、各数値及び部分範囲が明示的に列挙されているかのように、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲も含むように柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例示すると、「約０．１％〜約５％」の濃度範囲は、明示的に列挙された約０．１重量％〜約５重量％の濃度だけでなく、示された範囲内の個々の濃度（例えば、１％、２％、３％、及び４％）及び部分範囲（例えば、０．５％、１．１％、２．２％、３．３％、及び４．４％）も含むと解釈されるべきである。「約」という用語は、修正される数値の±１％、±２％、±３％、±４％、±５％、±６％、±７％、±８％、±９％、又は±１０％、又はそれ以上を含むことができる。さらに、「約「ｘ」〜「ｙ」」は、「約「ｘ」〜約「ｙ」」を含む。

本明細書で使用される「乾燥粉末」という用語は、吸入装置内に分散され、その後対象によって吸入されることができる、微細に分散された呼吸可能な乾燥粒子を含有する組成物を指す。そのような乾燥粉末又は乾燥粒子は、最大約１５％の水又は他の溶媒、好ましくは最大約１０％の水又は他の溶媒を含有してもよく、あるいは好ましくは水又は他の溶媒を実質的に含まなくてもよく、あるいは好ましくは無水であってもよい。

本明細書で使用される「乾燥粒子」及び「粒子」という用語は、最大約１５％の水又は他の溶媒、好ましくは最大１０％の水又は他の溶媒を含有してもよく、あるいは好ましくは水又は他の溶媒を実質的に含まなくてもよく、あるいは好ましくは無水であってもよい呼吸可能な粒子を指す。

本明細書で使用される「呼吸可能」という用語は、吸入による対象の気道への送達（例えば、肺送達）に適した乾燥粒子又は乾燥粉末を指す。呼吸可能な乾燥粉末又は乾燥粒子は、約１０ミクロン未満、好ましくは約５ミクロン、より好ましくは約３ミクロン以下の空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する。「空気動力学的質量中央径」（ＭＭＡＤ）は、本明細書では「空気動力学径」とも呼ばれる。実験的には、空気動力学径は、粉末粒子の集合体が特定の距離を沈降する時間を使用して粒子の空気動力学径を直接推測する、重力沈降法を利用することによって決定することができる。空気動力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を測定するための間接的な方法は、マルチステージリキッドインピンジャー（ＭＳＬＩ）である。空気動力学径ｄ_ａｅｒは、式、
ｄ_ａｅｒ＝ｄ_ｇ√ρ_ｔａｐ
から計算することができ、式中、ｄ_ｇは幾何学的直径、例えばＭＭＧＤであり、ρは粉末密度である。

本明細書で使用される場合、呼吸可能な乾燥粒子を「投与」又は「投与する」という用語は、呼吸可能な乾燥粒子を対象の気道に導入することを指す。

本明細書で使用される場合、「気道」という用語は、上気道（例えば、鼻腔、鼻腔、咽喉、咽頭）、呼吸気道（例えば、喉頭、気管、気管支、細気管支）及び肺（例えば、呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢、肺胞）を含む。肺深部又は肺胞は、典型的には、全身薬物送達用の吸入治療製剤の望ましい標的である。本発明の一実施形態では、粒子の質量の大部分が肺深部又は肺胞に堆積する。本発明の別の実施形態では、送達は、主に中央気道への送達である。他の実施形態では、送達は、上気道への送達である。

「肺送達」は、その用語が本明細書で使用される場合、気道への送達を指す。肺送達には、自立した吸入が可能な患者による吸入、又は機械換気（ＭＶ）システムなどの換気システム、もしくは持続性気道陽圧（ＣＰＡＰ）システムなどの非侵襲性機械換気システム（ＮＩＭＶ）を介した吸入が含まれる。

本明細書で使用される「ｇＰＳＤ_５０」という用語は、平均幾何学的粒径を指し、ここで粒子の５０％は列挙された値よりも大きい直径を有し、粒子の５０％は列挙された値よりも小さい直径を有する。

本明細書で使用される「ＦＰＦ（＜５．６）」、「ＦＰＦ（＜５．６ミクロン）」、「ＦＰＦ＜５．６μｍ」、及び「５．６ミクロン未満の微粒子画分」という用語は、５．６ミクロン未満の空気動力学径を有する乾燥粒子のサンプルの画分を指す。例えば、２ステージ又は３ステージ崩壊ＡＣＩを使用して、ＦＰＦ＜５．６ミクロンを測定することができる。２ステージ崩壊ＡＣＩは、８ステージＡＣＩの最上ステージ（Ｓ０）及びフィルターステージのみからなり、２つの別個の粉末画分の収集を可能にする。具体的には、２ステージ崩壊ＡＣＩは、Ｓ０上に収集される粉末の画分が５．６ミクロンを超える空気動力学径を有する、非呼吸可能な乾燥粒子で構成されるように較正される。したがって、Ｓ０を通過してフィルターステージ上に堆積する粉末の画分は、５．６ミクロン未満の空気動力学径を有する、呼吸可能な乾燥粒子から構成される。そのような較正時の空気流量は、約６０Ｌ／分である。このパラメータはまた、「ＦＰＦ ＴＤ（＜５．６）」として識別されてもよく、ここでＴＤは、総用量を意味する。同様の測定を、８ステージＡＣＩを使用して行うことができる。８ステージＡＣＩカットオフは、標準の６０Ｌ／分流量において異なるが、ＦＰＦ ＴＤ（＜５．６）は、８ステージ完全データセットから推定することができる。８ステージＡＣＩ結果は、ＡＣＩに収集された用量をカプセル内にあったものの代わりに使用してＦＰＦを決定する、ＵＳＰ法によって計算することもできる。

本明細書で使用される「ＦＰＦ（＜３．４）」、「ＦＰＦ（＜３．４ミクロン）」、「ＦＰＦ＜３．４μｍ」、及び「３．４ミクロン未満の微粒子画分」という用語は、３．４ミクロン未満の空気動力学径を有する、呼吸可能な乾燥粒子の質量の画分を指す。例えば、３ステージ崩壊ＡＣＩを使用して、５．６ミクロン未満及び３．４ミクロン未満のＦＰＦの両方を測定することができる。３ステージ崩壊ＡＣＩは、収集ステージＳ０、Ｓ２及びフィルターステージからなり、５．６ミクロン超、５．６ミクロン未満及び３．４ミクロン未満の空気動力学径の粉末の画分を提供する。このパラメータはまた、「ＦＰＦ ＴＤ（＜３．４）」として識別されてもよく、ここでＴＤは、総用量を意味する。同様の測定は、８ステージＡＣＩを使用して実行することができる。８ステージＡＣＩ結果はまた、ＡＣＩに収集された用量をカプセル内にあったものの代わりに使用してＦＰＦを決定する、ＵＳＰ方法によって計算することもできる。ＦＰＦの他のカットオフ値（すなわち、＜５．０ミクロンなど）は、ＡＣＩの異なるステージ構成を利用するか、又はステージとカットオフ直径の特定のセットについて得られた結果から推定することによって、同様に利用することができる。

好ましい「賦形剤」は、その用語が本明細書で使用される場合、肺に取り込まれ得る賦形剤である。そのような賦形剤は、米国食品医薬品局によって一般的に安全（ＧＲＡＳ）と見なされ得る。このような賦形剤には、水が含まれる。

本明細書で互換的に使用される「患者」又は「対象」という用語は、本発明の組成物が投与され得る個体である。そのような個体の例には、高齢ヒト、成人ヒト及び小児ヒトが含まれる。小児ヒトには、出生から１８歳までの個体が含まれる。小児年齢児童には、これらに限定されないが、以下の下位集団、すなわち約２８日齢又は１ヶ月齢までの新生個体を含む新生児；新生児期から１２ヶ月齢までの個体を含む乳児；１〜３歳の個体を含む幼児；３歳〜５歳の個体を含む未就学児、６歳〜１０歳の個体を含む学齢児童、及び１１歳〜１４歳の個体を含む青年、が含まれる。小児児童は、約６〜約１１歳、約１２〜約１７歳、又は約６〜約１７歳の年齢範囲を有することに引用されてもよい。未熟ヒト小児（未熟児）には、在胎期間が約３７週未満の個体が含まれる。高齢ヒトは、少なくとも５０歳、例えば少なくとも６５歳、例えば７０歳以上であり得る。

本発明はさらに、呼吸可能な乾燥粉末を、乾燥剤、例えばシリカゲル乾燥剤；ゼオライト；アルミナ；ボーキサイト；無水硫酸カルシウム；吸水性粘土；モレキュラーシーブ；及びそれらの任意の混合物などの存在下で包装することを提供する。乾燥剤は、サッシェ、パウチ又はパックに包装され、カプセルと共に包装内に配置され得る。乾燥剤は、コーティング、吸収又は吸着などによって包装自体に組み込むこともできる。例えば、カプセルを含有するブリスターパックを密封するフィルムは、組み込み、吸収又は吸着などによって乾燥剤を含むことができる。包装は、ホイルシール付きのボトル又はブリスターなどの湿気バリアでさらに密封することができる。

乾燥剤は、貯蔵中に包装内の水分を減少させるのに有効な量で添加されてもよく、容器のサイズ、及び湿度に対する内部曝露条件に依存する。例えば、１ｇのシリカゲルは、４つの００号カプセル（ＨＰＭＣカプセル）を含むパッケージを保護するのに十分である。包装内の湿度又は揮発性物質の含有量は、５重量％未満、好ましくは３重量％未満、例えば１重量％未満に減少することが好ましい。好ましくは、乾燥剤は、４０℃かつ７５％相対湿度での２週間、例えば４週間の貯蔵後にＦＰＦ値を維持するか又は増加させる量で添加される。

「サイズ００ ＦＰＦ＜５．６μｍ（％）」という用語は、試験したカプセル内の、５．６ミクロン未満の空気動力学径を有する粒子のパーセントを意味することを意図している。好ましくは、「サイズ００ ＦＰＦ＜５．６μｍ（％）」は、少なくとも約５０％、好ましくは５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は１００％である。好ましくは、貯蔵後の「サイズ００ ＦＰＦ＜５．６μｍ（％）」は、少なくとも約５０％、好ましくは５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は１００％である。

「サイズ００ ＦＰＦ＜３．４μｍ（％）」という用語は、試験したカプセル内の、３．４ミクロン未満の空気動力学径を有する粒子のパーセントを意味することを意図している。好ましくは、「サイズ００ ＦＰＦ＜３．４μｍ（％）」は、少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも５０％、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は１００％である好ましくは、貯蔵後の「サイズ００ ＦＰＦ＜３．４μｍ（％）」は、少なくとも約５０％、好ましくは５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は１００％である。

「核酸」という用語は、その最も広い意味で、ヌクレオチドのポリマーを含むあらゆる化合物及び／又は物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれることが多い。本明細書に記載される例示的な核酸又はポリヌクレオチドには、リボ核酸（ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、例えばβ−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指すために使用される。ｍＲＮＡなどのＲＮＡが具体的に言及される場合、ポリリボヌクレオチドという用語が使用され得る。ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、核酸、リボ核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの用語は、標準又は非修飾残基；非標準又は修飾残基（例えば、類似体）；ならびに標準及び非標準（例えば、類似体）残基の混合物から構成され得るような分子を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドは、修飾ポリヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドである。本開示の文脈では、本明細書に列挙される各ＲＮＡ（ポリリボヌクレオチド）配列について、対応するＤＮＡ（ポリデオキシリボヌクレオチド又はポリヌクレオチド）配列が考察され、逆もまた同様である。「ポリヌクレオチド」は、「オリゴマー」と互換的に使用され得る。

本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードし、翻訳されて、目的のコードされたタンパク質又はポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュ又はエクスビボで生成することができる任意のポリヌクレオチドを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用され、タンパク質及びその断片を含むことが意図される。

本明細書中で使用される場合、用語「翻訳」は、リボソームがポリペプチドを作製するプロセスである。翻訳において、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、リボソーム複合体中の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）によってデコードされて、特定のアミノ酸鎖又はポリペプチドを生成する。コード配列又はＣＤＳとしても知られるポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のコード領域は、翻訳のプロセスによってタンパク質又はその断片に変換することができる。

本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」という用語は、コードされたタンパク質アミノ酸配列を変更することなく異なるコドンを選択することによって再設計された天然コード配列（又は意図的に設計された天然コード配列の変異体）を意味する。コドン最適化配列は、他の利点の中でもとりわけ、コードされたタンパク質のタンパク質発現レベルを増加させることができる（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３４６−５３）。可変要素、例えば高いコドン適応指数（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＣＡＩ）、ＬｏｗＵ法、ｍＲＮＡ二次構造、シス調節配列、ＧＣ含有量及びその他多くの同様の可変要素は、タンパク質発現レベルといくらか相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．２００６，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：２８５）。高いＣＡＩ（コドン適応指数（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ））法は、タンパク質コード配列全体に対して最も頻繁に使用される同義コドンを選ぶ。各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンは、ヒトゲノムからの７４，２１８個のタンパク質コード遺伝子から推測される。Ｌｏｗ Ｕ法は、より少ないＵ部分を有する同義コドンで置換され得るＵ含有コドンのみを標的とする。置換にいくつかの選択肢がある場合、より頻繁に使用されるコドンが選択される。配列中の残りのコドンは、Ｌｏｗ Ｕ法によって変更されない。この方法を開示されたｍＲＮＡと併せて使用して、例えば、５−メトキシウリジン又はＮ^１−メチルプソイドウリジンと合成されるコード配列を設計することができる。

本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、本明細書に開示される分子の状態又は構造の変化を指す。分子は、多くの方法で、例えば化学的、構造的又は機能的に変更することができる。好ましくは、本開示のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然型のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと比較して、又は基準ポリペプチド配列もしくはポリヌクレオチド配列と比較して修飾されている。例えば、本明細書中に開示されるｍＲＮＡは、コドン最適化によって、又は非天然のヌクレオシドもしくはヌクレオチドの挿入によって修飾され得る。ポリペプチドは、例えば、部位特異的アミノ酸欠失又は置換によって修飾されて、ポリペプチドの特性を変化させることができる。

本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一又は類似している場合、互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列）間の比較を指す。本開示によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続きにわたって、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はさらには９９％である場合、相同であると見なされる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、独自に指定された少なくとも４〜５アミノ酸の一続きをコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、独自に指定された少なくとも４〜５アミノ酸の一続きをコードする能力によって決定される。本開示によれば、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続きにわたって少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％同一である場合、２つのタンパク質配列は相同であると見なされる。

本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えばオリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列をアライメントすることによって実行することができる。特定の実施形態では、比較目的のためにアライメントする配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法は、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技術は、公に利用できるコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアには、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）が含まれる。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列又はその対応する組成物の「有効量」は、細胞内でＯＲＦタンパク質生成をもたらすｍＲＮＡの量であり得る。好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡ組成物を使用したタンパク質生成は、ＯＲＦタンパク質をコードする対応する野生型ｍＲＮＡを含有する組成物よりも効率的である。効率の上昇は、細胞トランスフェクション（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）の増加、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾された核酸からのタンパク質翻訳の継続時間の増加によって実証されるように）、又は宿主細胞の自然免疫応答の減少によって実証され得る。本明細書に記載のＯＲＦタンパク質に言及する場合、有効量は、細胞内のＯＲＦタンパク質欠乏を克服するＯＲＦタンパク質の量である。ｍＲＮＡがｍＲＮＡワクチンである場合、有効量は、インフルエンザウイルスもしくは呼吸器合胞体ウイルスなどの感染、又は癌等に対する免疫を誘導する量を含む。

本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物又は微生物）内ではなく、人工環境、例えば試験管又は反応容器内、細胞培養中、ペトリ皿内などで起こる事象を指す。

本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、その細胞又は組織）内で起こる事象を指す。

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、それが会合された成分の少なくともいくつかから分離された（自然界又は実験環境にかかわらず）物質又は実体を指す。単離された物質は、それらが会合された物質を基準として様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／又は実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又はそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超又は約９９％超の純度である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が、それが形成又は検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分分離は、例えば、本明細書に記載の化合物が濃縮された組成物を含み得る。実質的な分離は、本明細書に記載の化合物又はその塩を少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、又は少なくとも約９９重量％ 含有する組成物を含み得る。化合物及びその塩を単離するための方法は、当技術分野において慣例である。

本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害及び／又は状態の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状、特徴、又は臨床症状の発症を部分的又は完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状、特徴、又は症状の発症を部分的又は完全に遅延させること；感染、特定の疾患、障害及び／又は状態からの進行を部分的又は完全に遅延させること；ならびに／又は感染、疾患、障害及び／又は状態に関連する病変を発症するリスクを低下させることを指す。

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴又は特性の全体又はほぼ全体の範囲又は程度を示す定性的条件を指す。生物学的技術分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が完了すること及び／又は完全に進行すること、又は絶対的な結果を達成もしくは回避することは、たとえあっても稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の、完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／又は状態に罹患している、又は罹患する可能性がある対象に投与された場合に、感染、疾患、障害、及び／又は状態の症状を治療、改善し、それらを診断、予防し、かつ／又はそれらの発症を遅延させるのに十分な、送達される薬剤（例えば、核酸、タンパク質又はペプチド、薬物、治療薬、診断用薬、予防薬など）の量を意味する。

本明細書で使用される場合、「１日総用量」は、２４時間の期間に与えられるか又は処方される量である。それは、単回単位用量として投与され得る。

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、タンパク質欠乏症の１つ以上の症状又は特徴の部分的又は完全な軽減、寛解、改善、緩和、発症の遅延、進行の阻害、重症度の低下、及び／又は発生率の低下を指す。治療は、疾患、障害及び／又は状態に関連する病変を発症するリスクを低下させる目的で、前記タンパク質欠乏症の徴候を示さない対象及び／又はタンパク質欠乏症の初期の徴候のみを示す対象に投与され得る。

本明細書で使用される場合、「トランスフェクト」又は「トランスフェクション」という用語は、細胞、又は好ましくは標的細胞への核酸の細胞内導入を意味する。導入された核酸は、標的細胞内で安定的に、又は一時的に維持され得る。「トランスフェクション効率」という用語は、トランスフェクションの対象となる標的細胞によって取り込まれる核酸の相対量を指す。実際には、トランスフェクション効率は、トランスフェクション後に標的細胞によって発現されるレポーター核酸産物の量によって推定される。高いトランスフェクション効率を有する組成物、特に非標的細胞及び組織のトランスフェクションによってもたらされる有害作用を最小限に抑える組成物が好ましい。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、本開示の組成物が向けられるか又は標的とされる細胞又は組織を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、目的のタンパク質又は酵素を欠いている。例えば、核酸を上皮細胞又は肺細胞に送達することが望ましい場合、上皮細胞又は肺細胞は標的細胞を意味する。いくつかの実施形態では、本開示の核酸及び組成物は、識別ベースで標的細胞にトランスフェクトする（すなわち、非標的細胞にトランスフェクトしない）。

本明細書に記載の組成物及び核酸による１つ以上の標的細胞のトランスフェクション後、そのような核酸によってコードされるタンパク質の発現は、好ましくは刺激されて、そのような標的細胞が目的のタンパク質を発現する能力が増強される。例えば、ｍＲＮＡによる標的細胞へのトランスフェクションにより、核酸の翻訳後に修飾タンパク質産物の発現が可能になるであろう。本明細書で提供される組成物及び／又は方法の核酸は、好ましくは生成物（例えば、タンパク質、酵素、ポリペプチド、ペプチド、機能性ＲＮＡ、及び／又はアンチセンス分子）をコードし、好ましくはインビボ生成が望ましい生成物をコードする。

呼吸可能なポリヌクレオチド乾燥粉末粒子製剤
本発明は、吸入による肺系への送達用の、噴霧乾燥によって調製されたポリヌクレオチドを含む呼吸可能な乾燥粉末粒子製剤を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。好ましくは、本発明は、吸入による肺系への送達のための、噴霧乾燥によって調製された呼吸可能なＲＮＡ乾燥粉末粒子製剤を提供する。本発明は、吸入による肺系への送達用の、噴霧乾燥によって調製された呼吸可能なＲＮＡ乾燥粉末粒子製剤を提供する。本発明は、製剤、及び好ましくは乾燥粉末吸入器システム、好ましくは患者によって作動される乾燥粉末吸入器システム、例えばｗｗｗ．ｃｉｖｉｔｉｓ．ｃｏｍに記載されているＡＲＣＵＳ（登録商標）プラットフォームを使用して送達するための適切な化学的、物理的及びエアロゾル特性を有する、ｍＲＮＡ含有粉末などのＲＮＡ含有粉末を噴霧乾燥するためのパラメータを含む。例では、ｍＲＮＡのプレースホルダーとして酵母ＲＮＡを使用した。

好ましくは、肺送達用の呼吸可能なＲＮＡ乾燥粉末粒子製剤は、
ｉ）粒子の少なくとも約１重量％のＲＮＡ；
ｉｉ）粒子の少なくとも約１０重量％のＤＰＰＣ；
ｉｉｉ）場合により、粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上であって、２つ以上のアミノ酸が選択される場合、各アミノ酸は、他の選択されたアミノ酸と同じ又は異なる重量パーセンテージのいずれかを有する、上記粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上；
ｉｖ）場合により、粒子の少なくとも約１重量％のＮａＣｌ；
ｖ）場合により、粒子の少なくとも約１０重量％のＴｒｉｓ；
ｖｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＥＤＴＡ；
ｖｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のトレハロース；
ｖｉｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＰＥＩ；及び
ｉｘ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のラクトースを含み、
ＲＮＡ乾燥粉末の全ての成分を合計して１００重量パーセントに達する。

好ましくは、製剤は、約１重量％〜約８０重量％、好ましくは約１重量％〜７０重量％、例えば約１重量％、１０重量％、２５重量％、５０重量％又は約６０重量％のＲＮＡを含む。

好ましくは、ＲＮＡは、少なくとも約１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２５、１５０、２００又はそれ以上の核酸の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約１０〜約１２，０００核酸又はそれ以上の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約２０〜約１２，０００又はそれ以上の核酸の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約５０〜約１２，０００又はそれ以上の核酸の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、約１００〜約１２，０００又はそれ以上の核酸の長さであり得る。好ましくは、ＲＮＡは、長さが約２０〜約１２，０００モノマー、又は約２０〜約１０，０００モノマー、又は約２０〜８０００モノマー、又は約２０〜６０００モノマー、又は約２０〜約５０００モノマー、又は約２０〜約４０００モノマー、又は約２０〜約３６００モノマー、又は約２０〜約３２００モノマー、又は約２０〜約３０００モノマー、又は約２０〜約２８００モノマー、又は約２０〜約２６００モノマー、又は約２０〜２４００モノマー、又は約２０〜２２００モノマー、又は約５０〜３２００モノマー、又は約５０〜３０００モノマー、又は約５０〜２６００モノマーであり得る。

好ましくは、製剤は、約１０重量％〜約３０重量％、好ましくは約１５重量％〜２５重量％、例えば約１５重量％、１８重量％、２０重量％、２２重量％又は約２５重量％のＤＰＰＣを含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約９０重量％、好ましくは約５重量％〜８５重量％、例えば約５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、７０重量％、７４重量％、７９重量％、８０重量％、又は約８５重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン、又はバリンのうちの１つ以上を含み、２つ以上のアミノ酸が選択される場合、各アミノ酸は、他の選択されたアミノ酸と同じか又は異なる重量パーセンテージを有する。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約５重量％、好ましくは約１重量％〜３重量％、例えば約１重量％、２重量％、又は約３重量％のＮａＣｌを含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約２５重量％、好ましくは約５重量％〜２０重量％、例えば約５重量％、１０重量％、１５重量％又は約２０重量％のＴｒｉｓを含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約１０重量％、好ましくは約２重量％〜８重量％、例えば約２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％又は約７重量％のＥＤＴＡを含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約４０重量％〜約９０重量％、好ましくは約４５重量％〜８５重量％、例えば約４５重量％、５０重量％、５２重量％、５３重量％、５４重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７２重量％、７４重量％、７５重量％、７７重量％、７９重量％、８０重量％又は約８２重量％のトレハロースをさらに含んでいてもよい。

好ましくは、製剤は、場合により、約４０重量％〜約９０重量％、好ましくは約４５重量％〜８５重量％、例えば約４５重量％、５０重量％、５２重量％、５３重量％、５４重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７２重量％、７４重量％、７５重量％、７７重量％、７９重量％、８０重量％、又は約８２重量％のラクトースをさらに含む。

好ましくは、製剤は、場合により、約１重量％〜約１０重量％、好ましくは約１重量％〜８重量％、例えば約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、又は約７重量％のＰＥＩを含む。

好ましくは、製剤は、表１に列挙された製剤から選択される。

重量パーセントは、残留水、溶媒又は不純物に関係なく、乾燥粒子中の固体、脂質、及び／又は賦形剤の総量を反映することを意図している。好ましくは、乾燥粒子の全成分を合計して１００重量％になる。

本発明の呼吸可能な乾燥粒子は、好ましくは約１０ミクロン以下のＭＭＡＤ、例えば約０．５ミクロン〜約１０ミクロンのＭＭＡＤを有する。好ましくは、本発明の乾燥粒子は、約７ミクロン以下（例えば、約０．５ミクロン〜約７ミクロン）、好ましくは約１ミクロン〜約７ミクロン、又は約２ミクロン〜約７ミクロン、又は約３ミクロン〜約７ミクロン、又は約４ミクロン〜約７ミクロン、又は約５ミクロン〜約７ミクロン、又は約１ミクロン〜約６ミクロン、又は約１ミクロン〜約５ミクロン、又は約２ミクロン〜約５ミクロン、又は約２ミクロン〜約４ミクロン、又は約３ミクロンのＭＭＡＤを有する。

本発明の呼吸可能な乾燥粒子は、好ましくは約１０ミクロン以下のｇＰＳＤ_５０、例えば約１ミクロン〜約７ミクロンのｇＰＳＤ_５０を有する。好ましくは、本発明の乾燥粒子は、約６ミクロン以下、例えば約１ミクロン〜約６ミクロン、好ましくは約１ミクロン〜約５ミクロン、又は約１ミクロン〜約４ミクロン、又は約１ミクロン〜約３ミクロン、又は約１ミクロン〜約２ミクロン、又は約２ミクロン〜約５ミクロン、又は約２ミクロン〜約４ミクロン、又は約３ミクロンのｇＰＳＤ_５０を有する。

粉末の５．６ミクロン未満の微粒子画分、又は粉末のＦＰＦ＜５．６μｍは、粉末中の５．６μｍ未満の空気動力学径を有する粒子のパーセンテージに対応する。本発明の粉末のＦＰＦ＜５．６μｍは、好ましくは約４０％以上である。特定の実施形態では、粉末のＦＰＦ＜５．６μｍは、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又はそれ以上である。一実施形態では、ＦＰＦ＜５．６μｍは、約４０％〜約８０％である。一実施形態では、ＦＰＦ＜５．６μｍは、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％である。

粉末の３．４ミクロン未満の微粒子画分、又は粉末のＦＰＦ＜３．４μｍは、粉末中の３．４μｍ未満の空気動力学径を有する粒子のパーセンテージに対応する。一実施形態では、本発明の粉末のＦＰＦ＜３．４μｍは、約３０％以上である。一実施形態では、粉末のＦＰＦ＜３．４μｍは、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、又はそれ以上である。一実施形態では、ＦＰＦ＜３．４μｍは、約４０％〜約８０％である。一実施形態では、ＦＰＦ＜３．４μｍは、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％である。

好ましくは、本発明の粉末は、約０．４ｇ／ｃｍ^３未満のタップ密度を有する。例えば、粉末は、０．０２〜０．２０ｇ／ｃｍ^３、０．０２〜０．１５ｇ／ｃｍ^３の間、０．０３〜０．１２ｇ／ｃｍ^３の間、０．０５〜０．１５ｇ／ｃｍ^３、又は約０．１５ｇ／ｃｍ^３未満のタップ密度、又は約０．１０ｇ／ｃｍ^３未満のタップ密度、約０．１５ｇ／ｃｍ^３未満のタップ密度を有する。一実施形態では、本発明の粉末は、約０．２ｇ／ｃｍ^３未満のタップ密度を有する。好ましくは、タップ密度は、約０．０２〜０．１７５ｇ／ｃｍ^３である。好ましくは、タップ密度は、約０．０６〜０．１７５ｇ／ｃｍ^３である。

タップ密度は、デュアルプラットフォームマイクロプロセッサ制御タップ密度テスター（Ｖａｎｋｅｌ，Ｎ．Ｃ．）又はＧＥＯＰＹＣ（商標）機器（Ｍｉｃｒｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，３００９３）など、当業者に公知の機器を使用して測定することができる。タップ密度は、エンベロープ質量密度の標準的な尺度である。タップ密度は、米国薬局方規則、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，第１０追補、４９５０−４９５１、１９９９による、ＵＳＰバルク密度及びタップ密度の方法を使用して決定することができる。低いタップ密度の原因となり得る特徴としては、不規則な表面テクスチャ及び多孔質構造が挙げられる。等方性粒子のエンベロープ質量密度は、粒子の質量を、中に粒子を封入できる最小球エンベロープ体積で割ったものとして定義される。本発明の一実施形態では、粒子は、約０．４ｇ／ｃｍ^３未満のエンベロープ質量密度を有する。

好ましくは、本発明の呼吸可能な乾燥粉末及び乾燥粒子製剤は、水又は溶媒の含有量が約１５重量％未満、約１３重量％未満、約１１．５重量％未満、約１０重量％未満、約９重量％未満、約８重量％未満、約７重量％未満、約６重量％未満、約５重量％未満、約４重量％未満、約３重量％未満、約２重量％未満、約１重量％未満であるか、又は無水である。

好ましくは、本発明の乾燥粒子製剤は、水又は溶媒を約６％未満かつ約１％超、約５．５％未満かつ約１．５％超、約５％未満かつ約２％超、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、又は約５％含有することができる。

治療適応
本明細書に記載の呼吸可能なポリヌクレオチド製剤（例えばｍＲＮＡ製剤）は、治療に使用することができる。例えば、本明細書に記載の呼吸可能なポリヌクレオチド製剤は、肺投与を介して動物又はヒト患者へ投与することができ、ポリヌクレオチドはインビボで翻訳されて、動物又は対象において治療用ペプチドを生成する。したがって、本発明の呼吸可能なｍＲＮＡ製剤は、ヒト及び他の哺乳動物における疾患又は状態の治療又は予防に使用され得る。

本発明の呼吸可能なｍＲＮＡ製剤は、合成又は組換えポリヌクレオチドの翻訳を誘導して細胞集団（例えば、肺の上皮細胞）中でポリペプチドを生成するために使用され得る。本発明の製剤の有効量は、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特性（例えば、代替ヌクレオシドのサイズ及び程度）、及び他の決定因子に、少なくとも部分的に基づく。

したがって、本発明は、それを必要とする哺乳動物対象において組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法で使用するための、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）を含む呼吸可能な製剤を提供する。ここで、呼吸可能な製剤中の有効量のＲＮＡは、所望のポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能領域を有し、本明細書に記載の送達方法を使用して対象に投与される。ｍＲＮＡは、核酸が対象の１つ又は複数の細胞に局在し、組換えポリペプチドが核酸から細胞内で翻訳されるような量及び他の条件下で製剤中に提供される。核酸が局在する細胞又は細胞が存在する組織は、１回又は複数回の核酸投与で標的化され得る。

治療剤が投与される対象は、疾患、障害、又は有害な状態に罹患しているか、又はそれらを発症するリスクがある。臨床診断、バイオマーカーレベル、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）、及び当技術分野で公知の他の方法などを含み得る根拠に基づいて対象を特定、診断、及び分類する方法が提供される。

好ましくは、投与された呼吸可能なポリヌクレオチド製剤（例えばｍＲＮＡ製剤）は、組換えポリペプチドが翻訳される細胞に実質的に存在しない機能活性を提供する１つ以上の組換えポリペプチドの生成をもたらす。例えば、欠落している機能活性は、本質的に酵素的、構造的、又は遺伝子調節的であり得る。

好ましくは、投与された代替核酸は、組換えポリペプチドが翻訳される細胞に実質的に存在しないポリペプチド（又は複数のポリペプチド）に取って代わる、１つ以上の組換えポリペプチドの生成を指示する。そのような欠如は、コード遺伝子又はその調節経路の遺伝子変異に起因する可能性がある。

好ましくは、投与された製剤は、細胞の表面に存在するか又は細胞から分泌される生物学的部分の活性を、直接的又は間接的に調節するのに有用な抗体、例えば中和抗体の生成を指示する。

本発明の製剤はまた、タンパク質欠乏症に関連する疾患を治療するための、例えば、修飾タンパク質を発現させるためのｍＲＮＡ療法を使用する、改善された方法及び組成物を提供する。本発明は、タンパク質欠乏症を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、例えば、安定化された修飾ヒトタンパク質又はこのような安定化された修飾ヒトタンパク質の活性断片をコードする本明細書に記載されるｍＲＮＡ配列を含む本発明の製剤を、タンパク質欠乏症の少なくとも１つの症状又は特徴の強度、重症度、もしくは頻度が低下するか、又は発症が遅延するような有効用量及び投与間隔で投与することを含む方法を提供する。本発明の製剤はまた、ｍＲＮＡ配列によってコードされる修飾タンパク質であって、安定性及びタンパク質分解に対する耐性の向上、ならびに半減期の延長など、野生型ヒトタンパク質と比較して改善された特性を有する修飾タンパク質を提供する。

好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡ組成物の肺投与によって、対象の治療用タンパク質発現又は活性が、対照レベルと比較して増加する。好ましくは、対照レベルは、治療前の対象におけるベースライン血清治療用タンパク質発現もしくは活性レベルであり、かつ／又は対照レベルは、治療を受けていない患者における平均血清タンパク質発現もしくは活性レベルを示す。

好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡ製剤によってコードされるタンパク質は、治療用タンパク質をコードする、本明細書で「コード配列」（ＣＤＳ）とも呼ばれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む非同相ｍＲＮＡ構築物から生成される。好ましくは、コード配列はコドン最適化されている。好ましくは、コード配列は、治療用タンパク質をコードすることができるウリジンの理論的最小値を有するように最適化される。好ましくは、本明細書に記載されるｍＲＮＡ構築物は、以下の特徴、すなわち５’キャップ、５’ＵＴＲ、５’ＵＴＲエンハンサー配列、コザック配列又は部分コザック配列、３’ＵＴＲ、治療用タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム及びポリＡテール、の１つ又は複数を含む。好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡ構築物は、修飾タンパク質の高効率発現を提供することができる。発現は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボであり得る。

好ましくは、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、コザック配列及び／又は３’ＵＴＲを含む。当技術分野で理解されているように、コザック配列は、ｍＲＮＡの翻訳の効率的な開始を可能にする真核生物ｍＲＮＡの翻訳開始部位を中心とする、短いコンセンサス配列である。リボソーム翻訳機構は、コザック配列との関連においてＡＵＧ開始コドンを認識する。コザック配列は、目的の治療用タンパク質のコード配列の上流、５’ＵＴＲの下流に挿入されるか、又は目的の治療用タンパク質のコード配列の上流及び５’ＵＴＲの下流に挿入され得る。好ましくは、本明細書に記載のｍＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立ち得る３’テール領域を含む。テール領域は、３’ポリ（Ａ）及び／又は３’ポリ（Ｃ）領域であり得る。好ましくは、テール領域は、３’ポリ（Ａ）テールである。本明細書で使用される場合、「３’ポリ（Ａ）テール」は、サイズが、例えば１０個以上のアデノシンから変動し得る連続したアデニンヌクレオチドのポリマーである。

３’ポリ（Ａ）テールは、当技術分野で公知の様々な方法を使用して、例えばポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して合成又はインビトロ転写ＲＮＡにテールを付加することによって付加することができる。他の方法としては、ポリＡテールをコードする転写ベクターの使用又はリガーゼの使用（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ及び／又はＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いたスプリントライゲーションを介する）が挙げられ、ここでポリ（Ａ）は、センスＲＮＡの３’末端にライゲーションされ得る。好ましくは、上記の方法のいずれかの組み合わせが利用される。

好ましくは、本明細書中に記載されるｍＲＮＡ製剤は、５’キャップを含む。様々な基でキャップされた５’末端及びそれらの類似体は、当技術分野で公知である。５’キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２、７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称性キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、又は抗逆キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ，ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ，ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ，ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ及びそれらのテトラホスフェート誘導体）から選択することができる（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ９：１１０８−１１２２（２００３）を参照されたい）。５’キャップは、ＡＲＣＡキャップ（３’−ＯＭｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ）であり得る。５’キャップは、ｍＣＡＰ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ ５’）Ｇ、Ｎ^７−メチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン）であり得る。５’キャップは、加水分解に耐性であり得る。

好ましくは、本明細書中に記載されるｍＲＮＡ製剤は、１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。核酸モノマーの例としては、非天然、修飾及び化学修飾ヌクレオチド、例えば当技術分野で知られている任意のそのようなヌクレオチドが挙げられる。化学修飾ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡ発現、発現速度、半減期及び／又は発現タンパク質濃度を改善することが示されている。化学修飾ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ配列はまた、タンパク質局在化を最適化するのに有用であり、それによって免疫応答及び／又は分解経路などの有害な生体応答を回避する。

修飾又は化学修飾ヌクレオチドの例としては、５−ヒドロキシシチジン、５−アルキルシチジン、５−ヒドロキシアルキルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−アルコキシシチジン、５−アルキニルシチジン、５−ハロシチジン、２−チオシチジン、Ｎ^４−アルキルシチジン、Ｎ^４−アミノシチジン、Ｎ^４−アセチルシチジン及びＮ^４，Ｎ^４−ジアルキルシチジンが挙げられる。

修飾又は化学修飾ヌクレオチドの例としては、５−ヒドロキシシチジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−メトキシシチジン、５−プロピニルシチジン、５−ブロモシチジン、５−ヨードシチジン、２−チオシチジン、Ｎ^４−メチルシチジン、Ｎ^４−アミノシチジン、Ｎ^４−アセチルシチジン、及びＮ^４，Ｎ^４−ジメチルシチジンが挙げられる。

修飾又は化学修飾されたヌクレオチドの例としては、５−ヒドロキシウリジン、５−アルキルウリジン、５−ヒドロキシアルキルウリジン、５−カルボキシウリジン、５−カルボキシアルキルエステルウリジン、５−ホルミルウリジン、５−アルコキシウリジン、５−アルキニルウリジン、５−ハロウリジン、２−チオウリジン及び６−アルキルウリジンが挙げられる。

修飾又は化学修飾ヌクレオチドの例としては、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、５−カルボキシメチルエステルウリジン、５−ホルミルウリジン、５−メトキシウリジン（本明細書では「５ＭｅＯＵ」とも呼ばれる）、５−プロピニルウリジン、５−ブロモウリジン、５−フルオロウリジン、５−ヨードウリジン、２−チオウリジン及び６−メチルウリジンが挙げられる。

修飾又は化学修飾ヌクレオチドの例としては、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−タウリノメチルウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２−チオ−２’Ｏ−メチルウリジン及び３，２’−Ｏ−ジメチルウリジンが挙げられる。

修飾又は化学修飾されたヌクレオチドの例には、Ｎ^６−メチルアデノシン、２−アミノアデノシン、３−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、７−デアザアデノシン、８−オキソアデノシン、８−ブロモアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−メチルアデノシン、Ｎ^６−イソペンテニルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ^６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ^６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ^６−スレオニルカルバモイル−アデノシン、Ｎ^６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−スレオニルカルバモイル−アデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６−ジメチルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ^６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン、Ｎ^６−アセチル−アデノシン、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、Ｎ^６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン、２’−Ｏ−リボシルアデノシン、２−アミノ−Ｎ^６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、及びＮ^６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが含まれる。

修飾又は化学修飾ヌクレオチドの例としては、Ｎ^１−アルキルグアノシン、Ｎ^２−アルキルグアノシン、チエノグアノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソグアノシン、８−ブロモグアノシン、Ｏ^６−アルキルグアノシン、キサントシン、イノシン及びＮ^１−アルキルイノシンが挙げられる。

修飾又は化学修飾されたヌクレオチドの例としては、Ｎ^１−メチルグアノシン、Ｎ^２−メチルグアノシン、チエノグアノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソグアノシン、８−ブロモグアノシン、Ｏ^６−メチルグアノシン、キサントシン、イノシン及びＮ^１−メチルイノシンが挙げられる。

修飾又は化学修飾ヌクレオチドの例としては、プソイドウリジンが挙げられる。プソイドウリジンの例としては、Ｎ^１−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^１−シクロアルキルプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシアルキルプソイドウリジン、Ｎ^１−フェニルプソイドウリジン、Ｎ^１−フェニルアルキルプソイドウリジン、Ｎ^１−アミノアルキルプソイドウリジン、Ｎ^３−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^６−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^６−アルコキシプソイドウリジン、Ｎ^６−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^６−ヒドロキシアルキルプソイドウリジン、Ｎ^６−モルホリノプソイドウリジン、Ｎ^６−フェニルプソイドウリジン及びＮ^６−ハロプソイドウリジンが挙げられる。プソイドウリジンの例としては、Ｎ^１−アルキル−Ｎ^６−アルキルプソイドウリジン、Ｎ^１−アルキル−Ｎ^６−アルコキシプソイドウリジン、Ｎ^１−アルキル−Ｎ^６−ヒドロキシプソイドウリジン、Ｎ^１−アルキル−Ｎ^６−ヒドロキシアルキルプソイドウリジン、Ｎ^１−アルキル−Ｎ^６−モルホリノプソイドウリジン、Ｎ^１−アルキル−Ｎ^６−フェニルプソイドウリジン及びＮ^１−アルキル−Ｎ^６−ハロプソイドウリジンが挙げられる。これらの例において、アルキル、シクロアルキル及びフェニル置換基は、非置換であってもよく、又はアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノもしくはニトロ置換基でさらに置換されていてもよい。

プソイドウリジンの例には、Ｎ^１−メチルプソイドウリジン（本明細書では「Ｎ１ＭＰＵ」とも呼ばれる）、Ｎ^１−エチルプソイドウリジン、Ｎ^１−プロピルプソイドウリジン、Ｎ^１−シクロプロピルプソイドウリジン、Ｎ^１−フェニルプソイドウリジン、Ｎ^１−アミノメチルプソイドウリジン、Ｎ^３−メチルプソイドウリジン、Ｎ^１−ヒドロキシプソイドウリジン及びＮ^１−ヒドロキシメチルプソイドウリジンが含まれる。

核酸モノマーの例としては、修飾及び化学修飾ヌクレオチドが挙げられ、当技術分野で公知のそのような任意のヌクレオチドを含む。

修飾及び化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、当技術分野で公知のそのような何らかのヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び逆位デオキシ脱塩基性モノマー残基が挙げられる。

修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、３’末端安定化ヌクレオチド、３’−グリセリルヌクレオチド、３’−逆位脱塩基性ヌクレオチド及び３’−逆位チミジンが挙げられる。

修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。例示的な実施形態では、修飾モノマーは、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）である。

修飾及び化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、２’，４’−拘束２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）及び２’−Ｏ−エチル（ｃＥｔ）修飾ＤＮＡが挙げられる。

修飾及び化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、２’−アミノヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノヌクレオチド、２’−Ｃ−アリルヌクレオチド及び２’−Ｏ−アリルヌクレオチドが挙げられる。

修飾及び化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、Ｎ^６−メチルアデノシンヌクレオチドが挙げられる。

修飾及び化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、修飾塩基５−（３−アミノ）プロピルウリジン、５−（２−メルカプト）エチルウリジン、５−ブロモウリジンを有するヌクレオチドモノマー；８−ブロモグアノシン、又は７−デアザアデノシンが挙げられる。

修飾及び化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、２’−Ｏ−アミノプロピル置換ヌクレオチドが挙げられる。

修飾及び化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、ヌクレオチドの２’−ＯＨ基を２’−Ｒ、２’−ＯＲ、２’−ハロゲン、２’−ＳＲ又は２’−アミノで置換することが含まれ、ここで、ＲはＨ、アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり得る。

上記の塩基修飾の例は、糖修飾及び結合修飾を含む、ヌクレオシド又はヌクレオチド構造のさらなる修飾と組み合わせることができる。特定の修飾又は化学修飾ヌクレオチドモノマーは、自然界に見出され得る。

好ましいヌクレオチド修飾には、Ｎ^１−メチルプソイドウリジン及び５−メトキシウリジンが含まれる。

本発明の製剤はまた、ベクター又はプラスミドなどの発現構築物中の１つ以上の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る、目的の修飾ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ）を含み得る。特定の実施形態では、そのような構築物は、ＤＮＡ構築物である。調節性ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適している。様々な宿主細胞のための、多数の種類の適切な発現ベクター及び適切な調節性配列が当技術分野で公知である。

典型的には、前記１つ以上の調節性ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終了配列、翻訳開始及び終了配列、ならびにエンハンサー又は活性化因子配列を含み得るが、これらに限定されない。当技術分野で公知の構成的プロモーター又は誘導性プロモーターが、本開示の実施形態によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、又は２つ以上のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。

好ましくは、本明細書に記載の修飾治療用タンパク質をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドは、免疫応答を引き起こすことができるか、又は遺伝子療法に使用することができる。遺伝子治療は、遺伝子を使用して疾患を治療又は予防する技術であり、対象の細胞に遺伝子を挿入することによって障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される修飾治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、疾患を引き起こす変異遺伝子を置換する。他の実施形態では、本明細書に記載される修飾治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、不適切に機能している変異遺伝子を不活性化又は「ノックアウト」する。さらに他の実施形態では、本明細書に記載される修飾治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、対象に新しい遺伝子を導入して、疾患との闘いを援助する。

ｍＲＮＡ製剤の有効量は、細胞及び／又は患者のタンパク質欠乏症を治療するのに十分な量であり得る。治療有効用量は、治療効果を引き起こすのに十分な薬剤又は製剤の量であり得る。治療有効用量は、１回以上の別個の投与で、異なる経路によって投与することができる。一般に、治療有効量は、対象に有意な利益を達成するのに十分である（例えば、フェニルケトン尿症の治療、調節、治癒、予防及び／又は改善）。例えば、治療有効量は、所望の治療効果及び／又は予防効果を達成するのに十分な量であり得る。一般に、治療薬の投与を必要とする対象に投与される治療薬の量は、対象の特徴に依存するであろう。そのような特徴としては、対象の状態、疾患重症度、全般的な健康状態、年齢、性別及び体重が挙げられる。当業者は、これら及び他の関連因子に応じて適切な投与量を容易に決定することができるであろう。さらに、場合により客観的及び主観的アッセイの両方を使用して、最適な投与量範囲を特定してもよい。

本明細書で提供される方法は、本明細書に記載の治療有効量の呼吸可能なｍＲＮＡ製剤の単回投与及び複数回投与を企図する。本明細書に記載のＯＲＦタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む呼吸可能な製剤は、対象の状態の性質、重症度及び程度に応じて、一定の間隔で投与することができる。好ましくは、治療有効量の呼吸可能なｍＲＮＡ製剤を、一定の間隔（例えば、１年毎、６ヶ月毎、４ヶ月毎、３ヶ月毎、２ヶ月毎、１ヶ月毎）で、隔週、毎週、毎日、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回定期的に、又は連続的に投与することができる。

本発明の呼吸可能なポリヌクレオチド製剤はまた、例えば抗体の細胞内発現に使用することができ、ここでＲＮＡ（配列）は、抗体をコードするか、又は少なくとも１つの抗体をそれぞれコードする少なくとも１つのコード領域を含む。本発明による抗体コードＲＮＡは、抗体をコードする任意のＲＮＡを含む。より一般的には、本発明のＲＮＡ（細胞内発現に関する）は、少なくとも１つのコード領域を含み、ここで少なくとも１つのコード領域は、少なくとも１つの抗体をコードする。本発明のＲＮＡ分子に２つ以上のコード領域が含まれる場合、第２、第３その他のコード領域は、第１の抗体コード領域と同じであっても異なっていてもよい抗体もコードし得る。好ましくは、本発明の製剤を含むＲＮＡは、少なくとも２つのコード領域を含み、それらの全てが同一又は異なる抗体をコードする。好ましくは、製剤のＲＮＡは、同じコード領域内の２つ以上の抗体をコードし得る。

本発明の製剤の抗体コードＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖、直鎖もしくは環状、又は最も好ましくはｍＲＮＡの形態であり得る。抗体コードＲＮＡは、好ましくは一本鎖ＲＮＡの形態であり、さらにより好ましくはｍＲＮＡの形態である。

本発明による抗体コードＲＮＡは、好ましくは５０〜１５，０００ヌクレオチド長、より好ましくは５０〜１０，０００ヌクレオチド長、さらにより好ましくは５００〜１０，０００ヌクレオチド長、最も好ましくは５００〜７，０００、５００〜５，０００又は７００〜３，０００ヌクレオチド長を有する。

本発明による呼吸可能なＲＮＡ製剤によってコードされる抗体は、全ての抗体から、例えば組換え方法によって生成されるか又は天然に存在し、先行技術から当業者に知られている全ての抗体から、特に治療目的もしくは診断目的もしくは研究目的のために使用される（され得る）か、又は特定の疾患、例えば癌疾患、感染症で見出された抗体から選択することができる。

本発明のＲＮＡ製剤によってコードされる抗体には、典型的には、当業者に公知の全ての抗体（上記）、例えば、天然に存在する抗体又は免疫化によって宿主生物で生成された抗体、天然に存在する抗体又は（従来の）免疫化によって宿主生物で生成された抗体から単離及び同定された、又は分子生物学的方法の助けを借りて生成された、組換え方法によって調製された抗体、ならびにキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、イントラボディ、すなわち、細胞内で発現され、おそらくは特定の細胞区画に局在する抗体、及び上記の抗体の断片が含まれる。その限りにおいて、抗体という用語は、その最も広い意味で理解されるべきである。これに関連して、抗体は一般に、軽鎖及び重鎖を含み、これらは両方とも可変ドメイン及び定常ドメインを有する。軽鎖は、Ｎ末端可変ドメインＶ_Ｌ及びＣ末端定常ドメインＣ_Ｌを含む。対照的に、ＩｇＧ抗体の重鎖は、Ｎ末端可変ドメインＶ_Ｈと、３つの定常ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３とに分けることができる。

本発明によるＲＮＡによってコードされる抗体は、特に好ましくは、いわゆる全長抗体、すなわち上記のように完全な重鎖及び完全な軽鎖の両方を含む抗体を含む。対応する全長抗体の代わりに、上記の抗体の１つ以上の抗体断片を択一的にコードするＲＮＡを、本発明の文脈においてさらに提供することができる。そのような抗体断片の例は、当業者に公知の任意の抗体断片、例えば上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃ、Ｆａｃｂ、ｐＦｃ’、Ｆｄ及びＦｖ断片などである。

限定されるものではないが、抗体をコードするＲＮＡを含む呼吸可能な製剤は、とりわけ、抗原又は特異的核酸に結合する抗体をコードする。抗原は、典型的には、免疫系によって外因性として認識され、従来、それらに対して特異的に向けられた抗体の形成を伴う免疫反応又は免疫応答を引き起こす分子である。しかしながら、抗原には、特に自己免疫疾患の場合、免疫系によって外因性であると誤って認識され、それによって免疫反応を引き起こす内因性の分子又は構造も含まれ得る。

抗原は、典型的には、これらのタンパク質、ペプチド、又はこれらのタンパク質もしくはペプチドのエピトープを含む。この文脈において、エピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）は、典型的には、そのようなタンパク質又はペプチド構造の表面上にある、５〜１５、まれに２５、好ましくは６〜９アミノ酸長を有する小領域（分子切片）である。抗原はさらに、脂質、炭水化物なども含み得る。本発明の文脈では、抗原には、例えば、いわゆる免疫原、すなわちそれをトランスフェクトされた生物の免疫をもたらす抗原も含まれる。抗原の例としては、限定されないが、細胞の表面抗原、腫瘍抗原などが挙げられる。例えば、本発明によれば、抗体は、以下の抗原（典型的には脊椎動物に存在する）、例えば腫瘍特異的表面抗原（ＴＳＳＡ）、例えば５Ｔ４、α５β１−インテグリン、７０７−ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＭＮ／Ｃ ＩＸ−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤ ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＰＡＰ、プロテイナーゼ−３、ｐ１９０ ｍｉｎｏｒ ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１もしくはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１もしくはＳＡＲＴ−３、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦβ、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦ及びＷＴ１、又は例えばＮＹ−Ｅｓｏ−１もしくはＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂなどの配列に結合することができる。他の抗原は、ＣＴＬＡ４及びＰＤ−１又はＰＤ１リガンドを含む免疫チェックポイント阻害剤タンパク質を標的とする。

腫瘍抗原は、例えば、典型的には転移の原因となり得る。これに関連して、天然状態と比較して修飾された細胞間相互作用を引き起こすそのような腫瘍抗原は、特に興味深い。

タンパク質補充療法に関して前述したように、本発明のＲＮＡ呼吸可能製剤をコードする抗体は、発現の増加、必要に応じて二次構造の安定化の改善、分解に対するＲＮＡの安定化、及び呼吸可能ＲＮＡの免疫原性の低減などの任意の目的のために修飾ＲＮＡを含み得る。

好ましくは、本発明の製剤を使用して治療できる呼吸器系の疾患には、喘息、肺動脈高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、慢性気管支炎、急性気管支炎、気腫、嚢胞性線維症、肺炎、結核、肺癌、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、塵肺症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば、サルコイドーシス、特発性肺線維症及び自己免疫疾患）、肺塞栓症、胸水及び中皮腫が含まれるが、これらに限定されない。

例
本発明は、以下の例に関連してよりよく理解されるであろう。しかしながら、これらの例は例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。様々な変更及び修正が当業者には明らかであり、本発明の製剤及び／又は方法に関するものを含むがこれらに限定されないそのような変更及び修正は、本発明の精神及び添付の特許請求の範囲から逸脱することなく行うことができる。

初期開発
調査Ｒ１（バッチ番号４４９０４３）、Ｒ２（バッチ番号４８３０１６）、及びＲ３（バッチ番号４８３０２２）を、ＲＮＡ送達粉末を製造するための初期開発作業の一部として行った。これらの３つの調査は、送達に適した物理的特性及びエアロゾル特性を有する酵母ＲＮＡ（ｍＲＮＡのプレースホルダーとして）を含む粉末を噴霧乾燥することが可能であるかどうかを調べることを目的とした。ＲＮＡ粉末を噴霧乾燥するために使用される製剤及びパラメータを変えることによって、予め乾燥した１５％ ＲＨ環境に調整された生成物フィルタバッグを使用すると、適切な粉末を製造できることが分かった。

調査Ｒ２では、賦形剤の組み合わせによってＲ１の粉末粒子が生成物フィルタバッグに付着するかどうかを評価するために、賦形剤をＲ１から変更した。糖であるトレハロースを、先のアミノ酸に代えて使用した。さらに、ＥＤＴＡ及びＴｒｉｓ緩衝液は、水性相へのＲＮＡのより迅速な溶解を助けると考えられていたので、ＮａＣｌを置き換えた。ＲＮＡ充填量を１０％で一定に保った。これらの成分の噴霧乾燥中、生成物フィルタバッグを振動させると粉末が部分的に放出された。約１００分の噴霧乾燥後、十分な粉末がバッグに付着してシステム圧力が正になった。そのため、早めに作動を終了した。収集された粉末は、ＦＰＦ＜５．６μｍが６１％、ｇＰＳＤ_５０（ミクロン単位の平均幾何学的粒径（ｄ５０））が３．３μｍであり、乾燥粉末吸入器システムでの使用、特にＡＲＣＵＳ（登録商標）プラットフォームでの使用に適したエアロゾル特性及び物理的特性を有することが分かった。

調査Ｒ３では、Ｒ２の製剤と類似の製剤で実行した。前の調査からの主な変更は、作動直前に、生成物フィルタバッグを乾燥した１５％ ＲＨ環境の条件にすることであった。バッグの条件付けによって、粉末粒子はより良好にバッグから放出され、その結果、粉末は生成物として首尾よく収集される。これにより、収率が大幅に上昇した。得られた粉末は、ＦＰＦ＜５．６μｍが６１％、ｇＰＳＤ_５０が２．０μｍであり、Ｒ２のものと類似の特性を有した。

トレハロース及びロイシンを含むＲＮＡの噴霧
調査Ｒ４（バッチ番号４８３０２８）及びＲ５（バッチ番号４８３０４５）は、それぞれアミノ酸ロイシン又は糖トレハロースのいずれかを主な賦形剤として使用して製剤化された。これらの賦形剤の両方は、噴霧乾燥作動で過去に広く使用されており、適切な物理的及びエアロゾル特性を有する粉末を生成する傾向がある。Ｒ４及びＲ５調査を行って、ＲＮＡをこれらの賦形剤と共に噴霧乾燥して、望ましい特性を有する粉末を生成できることも最初に確認した。

調査Ｒ４及びＲ５により、望ましい特性を有する粉末が得られ、したがって、ＲＮＡがこれらの賦形剤と共に十分に噴霧乾燥されたことを確認した。Ｒ４では、７５％のＦＰＦ＜５．６μｍ及び２．５μｍのｇＰＳＤ_５０を有する粉末が生成された。Ｒ５では、７１％のＦＰＦ＜５．６μｍ及び３．８μｍのｇＰＳＤ_５０を有する粉末が生成された。さらなる粉末特性を以下の例４及び例５に示す。

ＲＮＡ充填量の増加
調査Ｒ５（バッチ番号４８３０４５）及びＲ９（バッチ番号４８３０８５）は、主な賦形剤としてトレハロースを使用して製剤化され、それぞれ１％及び２５％のＲＮＡを含んだ。調査Ｒ１１（バッチ番号４８３１０９）及びＲ１４（バッチ番号４８３１３２）は、主な賦形剤としてイソロイシンを使用して製剤化され、それぞれ５０％及び２５％のＲＮＡを含んだ。どちらの場合も、粒子中のＲＮＡ充填量を増加させると、残留溶媒含有量が増加した。調査Ｒ５及びＲ９では、ＴＧＡ−１２０℃（ＴＧＡ−１２０：２０℃／分の加熱勾配でサンプルを１２０℃まで加熱することによる総重量減少又は揮発性）が２．９３％から３．５０％に増加し、Ｒ１４及びＲ１１では、残留溶媒含有量が１．７３％から３．５５％に増加した。より多いＲＮＡ充填量を含む製剤では、重量はＴＧＡで１２０℃後も減少し続けた。これは、純粋な酵母ＲＮＡでＴＧＡを実行した場合にも観察された。

ＦＰＦ＜５．６ｕｍ及び＜３．４ｕｍは、ＲＮＡ充填量の増加と共に減少した。この変化は、イソロイシンが主な賦形剤である場合ではさらに劇的であり、ＦＰＦ＜５．６ｕｍでは６０％から４９％に減少し、ＦＰＦ＜３．４ｕｍでは４８％から３８％に減少した。ＲＮＡ充填量を１％から２５％に増加させた場合、トレハロースでのＦＰＦに大幅な減少はなかった。

製剤への荷電化合物の添加
Ｒ１（バッチ番号４４９０４３）、Ｒ６（バッチ番号４８３０７１）及びＲ１２（バッチ番号４８３１１９）を含むいくつかの調査が、正に帯電した賦形剤を用いて行われた。

ＰＥＩによるＲＮＡの最大溶解度の低下
調査Ｒ６（バッチ番号４８３０７１）を実行するための準備において、１％のＲＮＡ、７４％のトレハロース、及び２％のＮａＣｌを水に溶解した。３つの化合物を溶解した後、５％ ＰＥＩを水性相に添加した。ＰＥＩは正常に溶解し、調査Ｒ６が進行した。１０％のＲＮＡ、７４％のトレハロース、及び２％のＮａＣｌからなる調査Ｒ８（バッチ番号４８３０８４）の水性相に５％のＰＥＩを添加すると、ＲＮＡが沈殿した。これは、ＰＥＩの存在がＲＮＡの最大溶解度を低下させることを示している。これを後の調査で使用して、霧化後にＲＮＡを溶液から沈殿させることによって、より大きい、より多孔質の粒子を生成することができる。

種々の生成物収集方法
調査Ｒ６（バッチ番号４８３０７１）、Ｒ７（バッチ番号４８３０７２）及びＲ１０（バッチ番号４８３１０７）の製剤及びプロセスパラメータは、生成物の収集方法を除いてほぼ同一である。（下記の例１及び３を参照）Ｒ６は、以下例２（装置設定）及び例３（プロセスパラメータ）に記載されるフィルタバッグハウス設定を使用した。Ｒ７及びＲ１０は、サイクロンを使用して最終生成物を収集した。これは、粉末の収集を開始するのに必要な時間を短縮できるかどうかを判定するために行った。

サイクロンを使用したバッチでは、粉末が収集容器に蓄積し始める前にフィルタバッグハウス及び生成物フィルタを被覆する必要がもはやないため、システムを準備するのに必要な時間が短縮された。Ｒ７及びＲ１０では、粉末が収集され始めるのにそれぞれ７分及び１２分しかかからなかった。バッチＲ６では、粉末が収集され始めるまでに、システムを約３０分間作動しなければならなかった。

Ｒ７及びＲ１０では、より小さい粒子の大部分は、収集容器内に堆積しなかった。代わりに、より小さい粒子はサイクロンの上部から出て、フィルタバッグハウスに流れた。これにより収率は、Ｒ６の２３．８％からＲ７の１２．８％へ、Ｒ１０の１５．２％へそれぞれ低下した。（以下の例５の表６参照）これはまた、Ｒ７及びＲ１０におけるＲ６と比較したｇＰＳＤ_５０の増加及びＦＰＦの減少を説明する。

フィルタバッグハウスとは対照的に、サイクロンで回収された粉末の固体特性に大きな変化はなかった。

例１−材料及び方法
ＲＮＡの送達用乾燥粉末の製剤を調査する研究において使用された製剤は、表１９に列挙されている。

ＲＮＡの送達用乾燥粉末の製剤を調査する研究において使用された材料は、表２に列挙されている。

研究に使用した試薬の製造業者を以下に列挙する。

試薬
１．ＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ））
２．ＤＰＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈａｕｓｅｎ、スイス）
３．ＮａＣｌ（ＢＤＨ、ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、米国）
４．トレハロース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
５．アルギニン（Ａｍｒｅｓｃｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、米国）
６．イソロイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
７．ロイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
８．バリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
９．トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）
１０．エチレンジアミン四酢酸（ＢＤＨ、ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、米国）
１１．ポリエチレンイミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）

例２−装置設定
この評価に使用した噴霧乾燥機は、単一バッグ生成物フィルタバッグハウスを備えたサイズ１噴霧乾燥機（ＧＥＡ、ＮＩＲＯ ＰＳＤ１、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツ）で構成された。この単一バッグ生成物フィルタバッグハウスを備えた生成物フィルタバッグは、型番Ｐ０３４５８２−０１６−２１０（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）であり、ポリエステル製でＰＴＦＥバッグ（直径５．８７インチ×長さ３７．５０インチ）を備え、９．２３インチの平坦な幅を有する。この評価に用いたエアキャップは、型番６７１４７（Ｓｐｒａｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏ．，Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ）であり、この評価に用いた流体キャップは、型番２８５０（Ｓｐｒａｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏ．，Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ）であった。

例３−噴霧乾燥プロセスパラメータ
粉末は、サイズ１の噴霧乾燥機（ＧＥＡ、ＮＩＲＯ ＰＳＤ１、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツ）を使用して作製した。表３は、ＲＮＡ含有粉末の製造に使用される典型的なプロセスパラメータ値を列挙している。個々の特定の実行のプロセスパラメータを表４に列挙している。

例４−ＲＮＡを含む噴霧乾燥粉末の安定性データ
ＲＮＡを含む噴霧乾燥粉末の安定性データを表５に示す。

例５−ＲＮＡを含む噴霧乾燥粉末の結果
表６は、ＲＮＡを含む噴霧乾燥粉末について得られた結果を示す。

例６−例１〜５のデータ及び結果の考察及び観察
・上記の噴霧乾燥の結果は、光／分散性粉末を形成することができることを示している。
・十分なＦＰＦ＜５．６μｍかつ少ない残留溶媒で高充填量が達成可能である。
・ＲＮＡ粉末は、正に荷電したカチオン性賦形剤と共に製剤化することができる。
・Ｒ１及びＲ２は、フィルタバッグ上に粉末が蓄積したため、中断しなければならなかった。
・Ｒ１及びＲ２のフィルタバッグに付着した粉末は、一旦大気に曝されると急速に水分を吸収した。
・Ｒ３については、使用前にフィルタバッグを１５％ ＲＨ未満の部屋に２日間置いた。
・Ｒ２及びＲ３の両方において、ｔ＝０で観察されたＦＰＦを維持するためにシリカゲルが必要である。
・高いｍＲＮＡ及び塩含有量は、乾燥剤なしでＦＰＦが低下する理由である可能性が最も高い。
・シリカゲルの存在は、生成物中の水分量を経時的に減少させる。
・Ｒ５の霧化ガス速度の低下により、乾燥シリンダの出口でパイプ内に水分の薄層が付着した。
・これは、Ｒ４とＲ５との間で収率が大幅に低下した理由であり得る。
・水分の層はまた、ＴＧＡによって検出される残留水分の増加の理由であり得る。
・Ｒ４及びＲ５の両方において、ｔ＝０で観察されたＦＰＦを維持するためにシリカゲルが必要である。
・ｍＲＮＡ及び塩含有量が低下すると、乾燥剤を含まない生成物の安定性が増加する。
・Ｒ７では、フィルタバッグを２０分毎に２回パルスして、システムの圧力の上昇を抑えた。
・Ｒ７では、より小さい粒子はサイクロンによって収集されず、結果としてｇＰＳＤ（５０）が上昇し、ＦＰＦが小さくなった。
・サイズ分布が全体的に増加した場合、サイクロンの収率は、より類似する。
・Ｒ６及びＲ７の固体状態データは非常に類似している。
・サイクロン及びフィルタバッグハウスの使用は、固体状態の特性よりも主にサイズ分布及び収率に影響を与える。
・製剤８の水性相にカチオン性賦形剤を添加すると、１０％ ｍＲＮＡで溶液からｍＲＮＡが沈殿した。
・これは、１％ ｍＲＮＡ（Ｒ６）又はカチオン性賦形剤の非存在下（Ｒ５及びＲ９）では起こらなかった。
・Ｒ７では、システム圧力が増加しないように、システムを２０分毎に２回パルスした（これは、Ｒ１０では１０分毎に１回行った）。
・Ｒ１０、Ｒ７及びＲ１０では、より小さい粒子はサイクロンで収集されず、結果としてｇＰＳＤ（５０）が上昇し、ＦＰＦが小さくなった。
・サイズ分布が全体的に増加した場合、サイクロンの収率は、より類似する。
・Ｒ６、Ｒ７及びＲ１０は、類似の固体状態データを有する。
・サイクロン及びフィルタバッグハウスの使用は、固体状態の特性よりも主にサイズ分布及び収率に影響を与える。
・Ｒ１１からの粉末の密度は、Ｒ５及びＲ９よりも著しく高密度であった。
・同様のプロセス条件で、酵母ＲＮＡ充填量を２５から５０％へ増加すると、ＦＰＦが低下した。
・Ｒ１２では、第１のカチオン性賦形剤が酵母ＲＮＡを沈殿させた後、代替の正に帯電した賦形剤を使用した。酵母ＲＮＡは高ＭＷであり、分布が可変であるので、これはＧＴ ｍＲＮＡにとっては問題ではない可能性がある。
・Ｒ１２は、アミノ酸賦形剤の１つの結晶化に起因し得る二峰性ｇＰＳＤを有していた。
・Ｒ１３では、新しいフィルタバッグの直径が大きすぎて、作動中にバッグが落下した。新しいバッグのサイズを変更するための接触コアフィルトレーション（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ ｃｏｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって、口の直径が増大するか、又はバッグの上部にスナップバンドが追加されるだろう。
・ＲＮＡは、１％〜５０％まで正常に充填した。
・酵母ＲＮＡは水に十分に溶け、賦形剤と適合する。
・多数のアミノ酸及び糖を含む様々な賦形剤を試験した。
・薬物取り込みを最適化するために、粉末はカチオン性賦形剤を用いて生成した。
・最大６０〜８０％の微粒子画分（ＦＰＦ＜５．６μｍ）が生成された。
・加速貯蔵条件での非晶質相の物理的安定性試験が進行中である。
・化学的安定性（４０℃／７５％ ＲＨで１〜６ヶ月で評価）。
・乾燥剤を含む構成及び含まない構成が、長期安定性試験に使用されている。

例７−ＲＮＡ及びｍＲＮＡの送達用の噴霧乾燥粉末製剤を用いた調査
目的−この調査の目的は、乾燥粉末吸入器システムを使用した送達、具体的にはＡＲＣＵＳ（登録商標）プラットフォームでの使用に適した化学的、物理的及びエアロゾル特性を有するｍＲＮＡ含有粉末を噴霧乾燥するために、例１〜５に記載されたものと同様の材料及び手順を使用して、本明細書で調査Ｒ１６〜Ｒ４３と呼ばれる調査における様々なパラメータ及び製剤を調査することであった。いくつかのバッチでは、酵母ＲＮＡをｍＲＮＡのプレースホルダーとして使用した。

試験した特定の乾燥粉末の製剤を表７に列挙する。

材料及び方法
表８は、ＲＮＡ及びｍＲＮＡの送達のための、この例７で調査した製剤の噴霧乾燥粉末の製造に使用される材料を列挙している。

表９は、この例７で使用される略称を列挙している。

機器設定及びプロセスパラメータ
表１０に列挙した調査に使用した噴霧乾燥機は、サイズ１噴霧乾燥機（ＧＥＡ，ＮＩＲＯ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツ）で構成され、単一バッグ生成物フィルタバッグハウスが装備された。表１０に列挙された調査で使用された生成物フィルタバッグは、Ｒ２６を除いて、型番Ｐ０３４５８２−０１６−２１０（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）であり、ポリエステル製でＰＴＦＥバッグ（直径５．８７インチ×長さ３７．５０インチ）を備え、９．２３インチの平坦な幅を有する。Ｒ２６で使用したフィルタバッグは、型番１８−９０８８（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｈａｗ Ｒｉｖｅｒ，ＮＣ）であり、ＰＴＦＥ製である（横９．３１３インチ×縦３７．５インチ）。この評価に用いたエアキャップは、型番６７１４７（Ｓｐｒａｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏ．，Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ）であり、この評価に用いた流体キャップは、型番２８５０（Ｓｐｒａｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏ．，Ｗｈｅａｔｏｎ，ＩＬ）であった。表１０に、ＲＮＡ含有粉末の製造に使用される目標プロセスパラメータ値を列挙する。

表１１に列挙した調査に使用した噴霧乾燥機は、Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ Ｂ−２９０（Ｂｕｃｈｉ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）である。製剤Ｒ２７〜Ｒ２９、Ｒ３５、Ｒ３７、Ｒ３９及びＲ４０の目標プロセスパラメータを表１１に列挙する。

イソロイシン、バリン及びロイシンを含むＲＮＡの噴霧−
Ｒ１４、Ｒ１６、及びＲ１７は、２５％ ＲＮＡを用いて製剤化され、主な賦形剤としてそれぞれイソロイシン、バリン、及びロイシンを含んだ。３つのアミノ酸は異なる粒径分布を有していた。イソロイシンが主な賦形剤である場合、粒径分布は右に尾を引き、わずかに二峰性であった。バリンが主な賦形剤である場合、粒径分布は二峰性であった。ロイシンが主賦形剤である場合、分布は単峰性であり、右に長く尾を引いた。３つの粉末のＦＰＦ＜５．６μｍは類似しており、ＦＰＦ＜３．４μｍは比較的類似していた。ＦＰＦ＜５．６μｍは、Ｒ１４が６０％、Ｒ１６が５７％、Ｒ１７が５７％であり、ＦＰＦ＜３．４μｍは、Ｒ１４が４８％、Ｒ１６が４２％、Ｒ１７が４５％であった。生成された３つの粉末は全て結晶性であったが、それらは異なる結晶構造を有していた。生成された３つの粉末の残留溶媒含有量は比較的低く、較差は０．８０％である。残留溶媒含有量は、Ｒ１４では１．７３％、Ｒ１６では２．５３％、Ｒ１７では２．３５％である。全体として、主賦形剤としてアミノ酸を用いて作製された粉末は、比較的互いに類似している。

正に帯電した賦形剤含有、及び非含有アミノ酸の噴霧乾燥−
Ｒ２４及びＲ１７は、２５％ ＲＮＡ、主な賦形剤としてのロイシンを用いて、アルギニンを含めて、含めずにそれぞれ製剤化した。調査Ｒ１２及びＲ１６は、２５％ ＲＮＡ、主な賦形剤としてのバリンを用いて、アルギニンを含めて、含めずにそれぞれ製剤化した。バリンが主な賦形剤であった場合、アルギニンの添加により、ｇＰＳＤ_５０がＲ１６の３．７μｍからＲ１２の３．４μｍへと０．３μｍ低下した。ロイシンが主な賦形剤であった場合、ｇＰＳＤ_５０がＲ１７の１．６μｍからＲ２４の２．０μｍまで０．４μｍ上昇した。バリン及びロイシンが主な賦形剤である場合、アルギニンの添加により、ＦＰＦ＜５．６μｍ及びＦＰＦ＜３．４μｍが低下した。ＦＰＦ＜５．６μｍは、バリンが主な賦形剤である場合に３％、ロイシンが主な賦形剤である場合に１２％低下した。ＦＰＦ＜３．４μｍは、バリンが主な賦形剤である場合に３％、ロイシンが主な賦形剤である場合に９％低下した。アルギニンをバリン及びロイシンに添加すると、残留溶媒含有量が増加した。バリンが主な賦形剤である場合、残留溶媒含有量は０．６１％増加し、ロイシンが主な賦形剤である場合、残留溶媒含有量は０．１５％増加した。主な賦形剤としてロイシン及びバリンを含む粉末は、アルギニンを添加した場合に結晶性のままであったが、結晶構造は変化した。ここで詳述した４つの調査から傾向を引き出すことができる可能性は低い。プロセスパラメータの変更、又は賦形剤の量の増加とは異なり、新しい賦形剤の添加によって、混合、霧化、及び乾燥時に製剤が相互作用する方法の多くを変更することができる。

トレハロース、ラクトース及びＳＤ−３０を含むＲＮＡの噴霧乾燥
Ｒ９、Ｒ２２、及びＲ２３は、２５％ ＲＮＡを用いて製剤化され、それぞれトレハロース、ラクトース、及びＳＤ−３０を主な賦形剤として含んだ。トレハロース及びラクトースを含む両方の粉末は、正規分布の粒径を有していた。トレハロースの粒径分布は、ラクトースの分布よりもわずかに長い尾を有する。ＳＤ−３０の粒径分布は二峰性であった。３つの粉末のＦＰＦ＜５．６μｍ及びＦＰＦ＜３．４μｍは、比較的類似していた。ＦＰＦ＜５．６μｍは、Ｒ９が６８％、Ｒ２２が６７％、Ｒ２３が６４％であり、ＦＰＦ＜３．４μｍは、Ｒ９が５４％、Ｒ２２が４９％、Ｒ２３が５３％であった。生成された３つの粉末は全て非晶質であり、２１（２Θ）に単一のピークを有していた。生成された３つの粉末の残留溶媒含有量は比較的高く、較差は０．４３％である。残留溶媒含有量は、Ｒ９では３．５０％、Ｒ２２では３．９３％、Ｒ２３では３．９２％である。全体として、主な賦形剤として糖を用いて生成された粉末は、比較的互いに類似している。

主な賦形剤としてのアミノ酸と糖との比較
Ｒ１４、Ｒ１６及びＲ１７は、２５％ ＲＮＡ及び主な賦形剤としてのアミノ酸を用いて製剤化した。調査Ｒ９、Ｒ２２及びＲ２３も２５％ ＲＮＡを用いて製剤されたが、主な賦形剤として糖を含んだ。主な賦形剤として糖を配合した調査では、主な賦形剤としてアミノ酸を配合した調査よりも高いＦＰＦ＜５．６μｍ及び高いＦＰＦ＜３．４μｍを有した。糖を配合した粉末のＦＰＦ＜５．６μｍは６４％〜６８％の範囲であり、アミノ酸を配合した粉末は５７％〜６０％の範囲であった。ＦＰＦ＜３．４μｍは、糖を配合した粉末では４９％〜５４％の範囲であり、アミノ酸を配合した粉末では４２％〜４８％の範囲であった。糖を含む粉末はまた、アミノ酸を含む粉末よりも高い残留溶媒含有量を有していた。糖を含む粉末の残留溶媒含有量は、３．５０％〜３．９３％の範囲であり、アミノ酸を含む粉末の残留溶媒含有量は、１．７３％〜２．５３％の範囲であった。糖を配合した粉末は非晶質であり、アミノ酸を配合した粉末は結晶性であった。

出口温度の上昇
Ｒ５、Ｒ２５及びＲ３０は、２５％ ＲＮＡ、主な賦形剤としてのトレハロース、ならびにそれぞれ４０℃、４５℃及び６０℃の出口温度を用いて製剤化された。調査Ｒ１７及びＲ３４は、２５％ ＲＮＡ、主な賦形剤としてのロイシン、ならびにそれぞれ４０℃及び６０℃の出口温度を用いて製剤化された。調査Ｒ２２及びＲ３６は、２５％ ＲＮＡ、主な賦形剤としてのラクトース、ならびに４０℃及び６０℃の出口温度をそれぞれ用いて製剤化された。３つ全ての場合において、噴霧乾燥機の出口温度を上昇させると、生成された粉末のｇＰＳＤ_５０が上昇した。出口温度の５℃の上昇でｇＰＳＤ_５０はＲ９の２．７μｍからＲ２５の３．１μｍまで０．４μｍ上昇した一方で、出口温度の２０℃の上昇でｇＰＳＤ_５０はＲ９の２．７μｍからＲ３０の６．０μｍまで３．３μｍ上昇したので、この傾向は線形ではない。出口温度の上昇はまた、主賦形剤としてアミノ酸を含む粉末と比較して、主賦形剤として糖を含む粉末への効果が大きい。ラクトースが主な賦形剤である場合、出口温度を２０℃上昇させると、ｇＰＳＤ_５０は、Ｒ２２の３．７μｍからＲ３６の６．０μｍへと２．３μｍ上昇した。ロイシンが主な賦形剤である場合、出口温度を２０℃上昇させると、ｇＰＳＤ_５０は、Ｒ１７の１．６μｍからＲ３４の１．９μｍへと０．３μｍ上昇した。

主な賦形剤としてロイシンを含む粉末は、４０℃で正規分布した粒径分布を有していた。出口温度を６０℃に上げると、粒径分布の幅が拡大した。主な賦形剤として糖を含む粉末も、４０℃で正規分布した粒径分布を有していた。出口温度を６０℃に上げると、粒径分布は左に尾を有し、わずかに二峰性であった。出口温度の５℃の上昇で粒径分布の幅が拡大するだけなので、この傾向は線形ではない。

出口温度を上げると、ＦＰＦ＜５．６μｍ及びＦＰＦ＜３．４μｍも上昇した。トレハロースが主な賦形剤である場合、出口温度を５℃上げると、ＦＰＦはわずかに上昇した。これにより、ＦＰＦ＜５．６μｍが６８％から６９％に上昇し、ＦＰＦ＜３．４μｍが５４％から５７％に上昇した。出口温度を４０℃から６０℃に上げると、ＦＰＦの変化はより顕著になった。ＦＰＦ＜５．６μｍは６８％から７８％に上昇し、ＦＰＦ＜３．４μｍは５４％から６８％に上昇した。ロイシン及びラクトースが主な賦形剤である場合、出口温度の上昇によるＦＰＦへの影響は減少する。ロイシンが主な賦形剤である場合、出口温度を２０℃上げると、ＦＰＦ＜５．６μｍが５７％から６３％に上昇し、ＦＰＦ＜３．４μｍが４５％から５０％に上昇した。ラクトースが主な賦形剤である場合、ＦＰＦ＜５．６μｍは６７％から６８％に上昇し、ＦＰＦ＜３．４μｍは４９％から５６％に上昇した。

出口温度の上昇により、粉末の残留溶媒含有量が減少した。トレハロースが主な賦形剤であり、かつ出口温度を２０℃上げた場合、残留溶媒含有量は、Ｒ９の３．５０％からＲ３０の２．９９％まで０．５１％減少した。ラクトースが主な賦形剤である場合、残留溶媒含有量は、Ｒ２２の３．９３％からＲ３６の２．５３％まで１．４０％減少した。ロイシンが主な賦形剤である場合、残留溶媒含有量は、Ｒ１７の２．３５％からＲ３４の２．０１％まで０．３４％減少した。トレハロースが主な賦形剤であり、かつ出口温度を５℃上げた場合、残留溶媒含有量は、Ｒ９の３．５０％からＲ２５の３．６３％まで０．１３％増加した。噴霧乾燥機の温度を上げると噴霧乾燥機内の溶媒の蒸発速度が上昇するはずなので、この結果は予想されるものとは反対である。実験誤差の結果である可能性がある。

霧化ガス速度の上昇
Ｒ３０及びＲ３２は、２５％のＲＮＡ、主な賦形剤としてのトレハロースを用いて、それぞれ３０ｇ／分及び４０ｇ／分の霧化ガス速度で製剤化された。霧化ガス速度を上げると、ｇＰＳＤ_５０は、Ｒ３０の５．９９μｍからＲ３２の４．３３μｍに１．６６μｍ低下した。霧化ガス速度が３０ｇ／分の場合、粒子分布は左に尾を有し、わずかに二峰性であった。霧化ガス速度を４０ｇ／分に上げると、粒子分布はより二峰性になった。噴霧ガス速度を上げると、粉末のＦＰＦも低下した。ＦＰＦ＜５．６μｍは、Ｒ３０の７８％からＲ３２の６８％まで１０％低下した。ＦＰＦ＜３．４μｍは、Ｒ３０の６８％からＲ３２の６０％まで８％低下した。霧化ガス速度を上げた場合、残留溶媒含有量もわずかに減少した。残留溶媒含有量は、Ｒ３０の２．９９％からＲ３２の２．８１％まで０．１８％減少した。

加熱しない液体供給流
Ｒ１８及びＲ２４は、２５％ ＲＮＡ、主な賦形剤としてのロイシン、及び正に荷電した賦形剤としてのアルギニンを用いて製剤化した。調査Ｒ１８では、液体スキッド循環浴及び霧化タワー循環浴を作動しなかった。有機溶液と水溶液をスタティックミキサーで混合すると、溶液から白色粉末が沈殿した。白色粉末は、おそらくロイシン又はアルギニンであった。調査Ｒ２４では、液体スキッド循環浴及び霧化タワー循環浴を６０℃に設定した場合、溶液から何も沈殿しなかった。いくつかの製剤では、液体供給流がスタティックミキサーに入る前に加熱されることを必要とする。

ポリエステル生成物フィルタバッグとＰＴＦＥ生成物フィルタバッグとの比較
Ｒ１２及びＲ２６は、２５％ ＲＮＡ、主な賦形剤としてのバリン、及び正に荷電した賦形剤としてのアルギニンを用いて製剤化された。調査Ｒ１２では、ＰＴＦＥ膜を有するポリエステルフェルト製のフィルタバッグを使用した。これは、調査Ｒ１〜Ｒ２５、Ｒ２７〜Ｒ２８、Ｒ３０〜Ｒ３４及びＲ３６で使用したものと同じフィルタバッグである。調査Ｒ２６では、完全にＰＴＦＥで作られたフィルタバッグを使用した。これらの調査で製造された粉末は、類似の固体状態データを有していた。残留溶媒含有量は、Ｒ１２の３．１４％からＲ２６の３．２４％に、０．１％のみ増加した。ＤＳＣから得られたデータも同様であった。Ｌｏｗ Ｔ１は、Ｒ１２において５０．２１℃であり、Ｒ２６において４８．５８℃であった。Ｒ１２のＬｏｗ Ｔ２は、Ｒ１２では６６．８７℃、Ｒ２６では６５．０６であった。２つの粉末間のエアロゾルデータは一貫性が低い。ｇＰＳＤ_５０は、Ｒ１２の３．４μｍからＲ２６の４．６μｍまで１．２μｍ上昇した。粒径分布は、Ｒ１２及びＲ２６の両方で二峰性であるが、Ｒ１２では第１のピークがわずかに大きく、Ｒ２６では第２のピークがわずかに大きい。これは、特定のサイズのより多くの粒子がポリエステルフィルタバッグに付着することが原因である可能性がある。ＦＰＦもまた、Ｒ２６ではＲ１２から上昇した。ＦＰＦ＜５．６μｍは、Ｒ１２の５４％からＲ２６の５５％まで１％上昇し、ＦＰＦ＜３．４μｍは、Ｒ１２の３９％からＲ２６の４６％まで７％上昇した。

従来のフィルタバッグでは、通常、ＩＢＣに粉末が蓄積し始めるまでに約３０分かかる。新しいフィルタバッグを使用すると、ＩＢＣに粉末が蓄積し始めるまでに約１０分しかかからなかった。新しいフィルタバッグでは収率も著しく上昇した。収率は、Ｒ１２の２２．３％からＲ２６の３７．８％まで１５．５％上昇した。

酵母ＲＮＡとｍＲＮＡとの比較−
Ｒ２９、Ｒ３５及びＲ３７は、１％ ｍＲＮＡを用いて製剤化され、主な賦形剤としてそれぞれトレハロース、ロイシン及びラクトースを含んだ。Ｒ２８、Ｒ３９、及びＲ４０は１％ ＲＮＡを用いて製剤化され、それぞれトレハロース、ロイシン、及びラクトースを主な賦形剤として含んだ。

ＲＮＡをｍＲＮＡに置き換えると、ｇＰＳＤ_５０にわずかな変化があった。トレハロースが主な賦形剤である場合、ｇＰＳＤ_５０は、Ｒ２８の１．３μｍからＲ２９の１．４μｍに０．１μｍ上昇した。ロイシンが主な賦形剤である場合、ｇＰＳＤ_５０は、Ｒ３９の１．７μｍからＲ３５の１．３μｍに０．４μｍ低下した。ラクトースが主な賦形剤である場合、ｇＰＳＤ_５０は、Ｒ４０の２．２μｍからＲ３７の１．２μｍに１．０μｍ上昇した。ｇＰＳＤ_５０の変化は、水性供給流及び有機供給流の流量の変動に起因する可能性が最も高い。水性供給流及び有機供給流の両方の流量を、Ｂｕｃｈｉで行われた全ての調査について５ｍＬ／分に設定した。実行中、流量は、長期間にわたって設定値から０．５ｍＬ／分、頻繁にそれた。このオフセットが、ｇＰＳＤ_５０の変化を引き起こす。

ＦＰＦ＜５．６μｍ及びＦＰＦ＜３．４μｍの変化は、ｇＰＳＤ_５０の変化と相関させることができる。トレハロースが主な賦形剤であり、１％のＲＮＡを使用した場合、ＡＣＩ−３を実施したときにカプセルは回転しなかった。トレハロースが主な賦形剤であり、１％のｍＲＮＡを使用した場合、ＡＣＩ−３を実施したときにカプセルは回転した。そのため、Ｒ２８及びＲ２９についてＦＰＦデータを比較する場合、２週間の安定性データを使用する方がよい。なぜなら、カプセルがＲＮＡ及びｍＲＮＡで回転したからである。乾燥剤の有無にかかわらず安定しているため、平均ＦＰＦ値をＲ２８及びＲ２９に使用する。トレハロースが主な賦形剤である場合、ＦＰＦ＜５．６μｍはＲ２８の５８％からＲ２９の５６％に２％低下し、ＦＰＦ＜３．４μｍはＲ２８の４９％からＲ２９の４３％に６％低下した。ロイシンが主な賦形剤である場合、ＦＰＦ＜５．６μｍはＲ３９の６０％からＲ３５の７９％に１９％上昇し、ＦＰＦ＜３．４μｍはＲ３９の５０％からＲ３５の６９％に１９％上昇した。ラクトースが主な賦形剤である場合、ＦＰＦ＜５．６μｍはＲ４０の３７％からＲ３７の６５％に２８％増加し、ＦＰＦ＜３．４μｍはＲ４０の２４％からＲ３７の５７％に３３％上昇した。ｇＰＳＤ_５０の変化がＦＰＦ＜５．６μｍの変化と相関する場合、線形傾向が観察される。傾向線は、式（ΔＦＰＦ＜５．６μｍ）＝−２６．９＊（ｇＰＳＤ_５０）＋３．４及びＲ^２＝０．９２を有する。ｇＰＳＤ_５０の変化がＦＰＦ＜３．４μｍの変化と相関する場合もまた、線形傾向が観察される。傾向線は、式（ΔＦＰＦ＜３．４μｍ）＝−３５．１＊（ｇＰＳＤ_５０）＋０．１及びＲ^２＝０．９５を有する。これらの傾向を使用して、ＲＮＡをｍＲＮＡで置き換えたときにｇＰＳＤ_５０に変化がなかった場合、ＦＰＦ＜５．６μｍの３．４％の上昇及びＦＰＦ＜３．４μｍの０．１％の上昇が予想される。

ＲＮＡをｍＲＮＡで置き換えた場合、主な賦形剤として糖を用いて生成された粉末は、残留溶媒含有量が増加した。トレハロースが主な賦形剤である場合、残留溶媒含有量は、Ｒ２８の２．２１％からＲ２９の２．６０％まで０．３９％増加した。ラクトースが主な賦形剤である場合、残留溶媒含有量は、Ｒ４０の２．３６％からＲ３７の２．４９％まで０．１３％増加した。残留溶媒含有量の増加は、トレハロースが主な賦形剤である場合により大きかった。これは、ｇＰＳＤ_５０が、ＲＮＡをｍＲＮＡに置き換えた場合に上昇し、ラクトースが主な賦形剤である場合に低下したためである。ｇＰＳＤ_５０の上昇は、霧化ガス速度に対する全液体流量の比が上昇していることを意味する。霧化ガス速度に対する全液体流量の比が高くなると、残留溶媒含有量が増加する。ｇＰＳＤ_５０が低下すると、残留溶媒含有量が増加し、これは、ｍＲＮＡを用いて生成された粉末がＲＮＡを用いて生成された粉末よりも高い残留溶媒含有量を有することを意味する。ロイシンが主な賦形剤である場合、残留溶媒含有量は、Ｒ３９の０．５００％からＲ３５の０．４６２％まで０．０３８％減少した。この変化は、ノイズと見なされるほど小さい。

３つの賦形剤全てについてＲＮＡをｍＲＮＡで置き換えた場合、生成された粉末の結晶構造は変化しなかった。トレハロース及びラクトースを主な賦形剤として使用した場合、ＤＳＣデータは非常に類似していた。ラクトースが主な賦形剤である場合、ＤＳＣデータは９０℃前では非常に類似していたが、それ以降はわずかにずれた。これに基づいて、ＲＮＡを用いて生成された粉末は、ｍＲＮＡを用いて生成された粉末と類似する可能性が高い。

粒子特性評価及び安定性データ
表１３は、上記に列挙された製剤の粒子特性評価を提供する。表１４は、上に列挙及び記載した製剤についてのＴ＝０からＴ＝６ヶ月までの安定性データ及び粒子特性評価を提供する。

例８−ＲＮＡ及びｍＲＮＡを含む噴霧乾燥粉末の粒径分布−
表１５は、例１〜７に記載の製剤１〜１４及び１７〜４０の噴霧乾燥粉末の粒径分布を提供する。

例９−自動対手動噴霧乾燥機作動
表１６は、作動における自動噴霧乾燥機対手動噴霧乾燥機の結果を示す。

例１０−追加賦形剤試験
表１７は、製剤１２、１６及び１７の追加の賦形剤試験の結果を示す。

例１１−ラクトースを含むキャップされたｍＲＮＡ
表１８は、Ｂｕｃｈｉ噴霧乾燥機及びサイズ１噴霧乾燥機における、ラクトースを含むキャップされたｍＲＮＡの噴霧乾燥の結果を示す。

表２０は、Ｒ４４−Ｒ４６からの、ラクトースを含むキャップされたｍＲＮＡ製剤の粒子特性評価結果を示す。

表２１は、Ｒ４４〜Ｒ４６の噴霧乾燥粉末の粒径分布を提供する。

本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される全ての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用される全ての公開された外国特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される他の全ての公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され説明されてきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更がなされ得ることが当業者によって理解されるであろう。本明細書に記載された実施形態のいずれも相互に排他的ではなく、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な方法で組み合わせることができることも理解されよう。

Claims (15)

1. 肺送達用の呼吸可能な乾燥粉末粒子製剤であって、
   ｉ）粒子の少なくとも約１重量％のＲＮＡ；
   ｉｉ）粒子の少なくとも約１０重量％のＤＰＰＣ；
   ｉｉｉ）場合により、粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上であって、２つ以上のアミノ酸が選択される場合、各アミノ酸は、他の選択されたアミノ酸と同じ又は異なる重量パーセンテージのいずれかを有する、上記粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上；
   ｉｖ）場合により、粒子の少なくとも約１重量％のＮａＣｌ；
   ｖ）場合により、粒子の少なくとも約１０重量％のＴｒｉｓ；
   ｖｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＥＤＴＡ；
   ｖｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のトレハロース；
   ｉｘ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のラクトース；及び
   ｖｉｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＰＥＩを含み、
   ＲＮＡ乾燥粉末の全ての成分を合計して１００重量％になる、上記乾燥粉末粒子製剤。
2. 粉末が、少なくとも約４０％以上のＦＰＦ＜５．６μｍを有する、請求項１に記載の製剤。
3. 粉末が、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又はそれ以上のＦＰＦ＜５．６μｍを有する、請求項１又は２に記載の製剤。
4. 粉末が、少なくとも約３０％以上のＦＰＦ＜３．４μｍを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
5. 粉末が、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又はそれ以上のＦＰＦ＜３．４μｍを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
6. ｇＰＳＤ_５０が約１ミクロン〜約１０ミクロンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製剤。
7. 表１から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製剤。
   

   
8. 呼吸器系の疾患に罹患している患者を治療する方法であって、肺送達によって請求項１に記載の少なくとも１つの製剤を投与することを含む、上記方法。
9. 患者が成人ヒト又は小児ヒトである、請求項８に記載の方法。
10. 疾患が、喘息、肺動脈高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、慢性気管支炎、急性気管支炎、気腫、嚢胞性線維症、肺炎、結核、肺癌、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、塵肺症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば、サルコイドーシス、特発性肺線維症及び自己免疫疾患）、肺塞栓症、胸水及び中皮腫から選択される、請求項８に記載の方法。
11. 肺送達用の呼吸可能な乾燥粉末粒子製剤であって、
    ｉ）粒子の少なくとも約１重量％のＲＮＡ；
    ｉｉ）粒子の少なくとも約１０重量％のＤＰＰＣ；
    ｉｉｉ）場合により、粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上であって、２つ以上のアミノ酸が選択される場合、各アミノ酸は、他の選択されたアミノ酸と同じ又は異なる重量パーセンテージのいずれかを有する、上記粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上；
    ｉｖ）場合により、粒子の少なくとも約１重量％のＮａＣｌ；
    ｖ）場合により、粒子の少なくとも約１０重量％のＴｒｉｓ；
    ｖｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＥＤＴＡ；
    ｖｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のトレハロース；
    ｖｉｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＰＥＩ；及び
    ｉｘ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のラクトースを含み、
    ＲＮＡ乾燥粉末の全ての成分を合計して１００重量％になる、上記乾燥粉末粒子製剤。
12. 肺送達用の呼吸可能な乾燥粉末粒子製剤であって、
    ｉ）粒子の少なくとも約１重量％のポリヌクレオチド；
    ｉｉ）粒子の少なくとも約１０重量％のＤＰＰＣ；
    ｉｉｉ）場合により、粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上であって、２つ以上のアミノ酸が選択される場合、各アミノ酸は、他の選択されたアミノ酸と同じ又は異なる重量パーセンテージのいずれかを有する、上記粒子のそれぞれ少なくとも約１重量％のアルギニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンのうちの１つ以上；
    ｉｖ）場合により、粒子の少なくとも約１重量％のＮａＣｌ；
    ｖ）場合により、粒子の少なくとも約１０重量％のＴｒｉｓ；
    ｖｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＥＤＴＡ；
    ｖｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のトレハロース；
    ｉｘ）場合により、粒子の少なくとも約４０重量％のラクトース；及び
    ｖｉｉｉ）場合により、粒子の少なくとも約２重量％のＰＥＩを含み、
    ＲＮＡ乾燥粉末の全ての成分を合計して１００重量％になる、上記乾燥粉末粒子製剤。
13. ポリヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はロックド核酸（ＬＮＡ）である、請求項１２に記載の方法。
14. ＲＮＡが約１０〜約１２，０００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
15. ポリヌクレオチドが約１０〜約１２，０００ヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。
    

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