JP2021532838A - ドナー臓器における糖鎖抗原除去のための酵素組成物、それに関連する方法および使用 - Google Patents
ドナー臓器における糖鎖抗原除去のための酵素組成物、それに関連する方法および使用 Download PDFInfo
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Abstract
本明細書では、ドナー臓器からＡ抗原を酵素的に切断するための灌流流体、およびそれに関連する方法、使用が提供される。特に、灌流流体は、２つの酵素である、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼを含み、灌流流体は、さらに、緩衝細胞外溶液および／またはクラウディング剤を含んでもよい。さらに、本明細書に記載された組成物は、細胞生存性に適した温度およびｐＨレベルにおいて活性を有することが見出された。【選択図】図２
Description
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，２７２号「糖鎖抗原切断のための酵素組成物、それに関連する方法、使用、装置およびシステム」の利益を主張する。
本出願は、２０１８年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７１９，２７２号「糖鎖抗原切断のための酵素組成物、それに関連する方法、使用、装置およびシステム」の利益を主張する。
本発明は、酵素組成物の分野に関する。特に、本発明は、ドナー臓器において抗原を切断するための酵素組成物、ならびに当該組成物を用いて抗原を切断するための方法および使用に関する。
血液型Ａの人の血漿がＢ抗原に対する抗体を含み、逆もまた同様であり、それによって不適合な輸血により補体の活性化と赤血球（ＲＢＣ）溶解を生じ得る（Ｄａｎｉｅｌｓ ２０１０）ため、血液型の正確な適合は、輸血医学における中心的な要件である。これらの細胞表面抗原は、Ａ型血液およびＢ型血液それぞれに対して、α‐１，３‐結合‐Ｎ‐アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはガラクトース（Ｇａｌ）で終端する糖鎖構造である。一方、Ｏ型赤血球はこれらの末端糖を含まず、全般的に輸血され得る（Ｇａｒｒａｔｔｙ ２００８）。したがって、患者の血液型が不明または不明確な場合である緊急時に備えて、Ｏ型赤血球を血液バンクに十分に供給する必要がある。しかし、供給は限られていることが多い。
ＡまたはＢ ＲＢＣをＯに変換する手段としてＡまたはＢ ＲＢＣからＧａｌＮＡｃまたはＧａｌ構造を酵素により除去する概念がＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ １９８２；ＵＳ４６０９６２７およびＣＡ２２７２９２５）によって最初に提案され、実証された。グリーンコーヒー豆由来のα‐ガラクトシダーゼを用いて、Ｂ型ＲＢＣをＯ型に変換し、続いて輸血を行い、成功した（Ｋｒｕｓｋａｌｌ ２０００）。しかしながら、必要とされた酵素量から、このアプローチは非実用的なものであった。Ａ型の変換はより困難であるが、これは主にＡ型の血液型は内部結合が異なる多くのサブタイプが存在するためである（Ｃｌａｕｓｅｎ１９８９）。同様に、α‐ガラクトシダーゼはＢ型抗原の除去に用いられている（例えば、ＥＰ２２４３７９３参照）。Ａ型の変換を含む実用的な変換への大きな進歩は、四糖類基質を用いて、ＡおよびＢ変換活性の両方に関する細菌のライブラリのスクリーニングによってなされた。中性ｐＨ値で高い抗原切断活性を示すグリコシダーゼの二つの新しいファミリーが発見された（ＣＡＺｙ ＧＨ１０９ α‐Ｎ‐アセチルガラクトサミニダーゼおよびＧＨ１１０ α‐ガラクトシダーゼ（Ｌｉｕ２００７））。両酵素はそれぞれの抗原を完全に除去して対応するＲＢＣを変換した。しかしながら、特にＡ型の変換には相当量の酵素が必要であり（６０ｍｇ酵素／血液単位）、さらなる発展を制限している。細胞から糖鎖抗原をより効率的に除去する酵素は有用であろう。
本発明は、部分的には、本明細書中に記載されるような、ガラクトサミニダーゼおよびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの組合せが、以前に同定されたＡ抗原切断酵素よりも桁違いに効率的であるという驚くべき発見に基づく。例えば、ある条件下では、いくつかのＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼ酵素は、１μ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。さらに、酵素の組み合わせによる切断効率は、赤血球の生存能力を維持するのに適したｐＨ（すなわち、約６．５と約７．５との間のｐＨ）において維持される。さらに、酵素は、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度で活性を有することが見出され、これはまた、血液の採取、洗浄および保存プロトコルに適している。さらに、酵素の効率は、クラウディング剤（例えばデキストラン）の添加によってさらに向上する。また、同じ２段階除去プロセスがドナー臓器に適用され得ることも理解されている。
しかしながら、ドナー臓器がより長く灌流される場合、より多くの酵素を使用してドナー臓器が灌流され得る時間を短縮することができ、またはより少ない酵素を使用することができることが、当業者によって理解されるであろう。
ある実施形態によれば、（ａ）精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と、を含む、ドナー臓器からＡ抗原を酵素的に切断するための灌流流体が提供される。
さらなる実施形態によれば、灌流流体が提供され、当該灌流流体は、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５のうちの１つ以上から選択される精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３６および配列番号３７のうちの１つ以上から選択される精製ガラクトサミニダーゼタンパク質とを含む。
さらなる実施態様によれば、灌流流体が提供され、当該灌流流体は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１および３２〜３５のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６および３７のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む。
酵素は、（ａ）配列番号２、配列番号４および配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である、精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）配列番号７、配列番号９および配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質である、精製ガラクトサミニダーゼタンパク質との１つ以上から選択することができる。酵素は、（ａ）配列番号１７および配列番号３２の精製クロストリジウム・テルチウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、（ｂ）配列番号１９および配列番号３６の精製クロストリジウム・テルチウムガラクトサミニダーゼタンパク質である精製ガラクトサミニダーゼタンパク質との１つ以上から選択することができる。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、１μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有し得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有し得る。灌流流体は、緩衝細胞外溶液をさらに含み得る。緩衝細胞外溶液は、Ｓｔｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ Ｐｌｕｓ（商標）、ＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）溶液（ＵＷ）、Ｃｅｌｓｉｏｒ溶液、腎臓灌流溶液（ＫＰＳ−１）、京都大学（Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）溶液、ＩＧＬ−１溶液、およびクエン酸塩溶液から選択することができる。
さらなる実施形態によれば、（ａ）Ａ型抗原を提示するドナー臓器を、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質を含む流体で、酵素がドナー臓器からＡ型抗原の切断を可能にするのに十分な時間灌流する工程、または、（ｂ）Ａ型抗原を提示するドナー臓器を、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質を含む流体と、酵素がドナー臓器からＡ抗原の切断を可能にするのに十分な時間インキュベートする工程を含む、ドナー臓器からｅｘ ｖｉｖｏでＡ型抗原を酵素的に切断する方法が提供される。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５の１つ以上から選択される精製タンパク質であり得る。ガラクトサミニダーゼは、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３６および配列番号３７の１つ以上から選択される精製タンパク質であり得る。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１および３２〜３５のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を本質的に含むことができ、ガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素は、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６および３７のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を本質的に含むことができる。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼは、配列番号４または配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質であってもよく、ガラクトサミニダーゼは、配列番号９または配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質であってもよい。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、緩衝細胞外溶液中に存在し得る。緩衝細胞外溶液は、Ｓｔｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ Ｐｌｕｓ（商標）、ＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）溶液（ＵＷ）、Ｃｅｌｓｉｏｒ溶液、腎臓灌流溶液（ＫＰＳ−１）、京都大学（Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）溶液、ＩＧＬ−１溶液、およびクエン酸塩溶液から選択することができる。ドナー臓器は固形臓器であり得る。固形臓器は、肺、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、および腸のうちの１つから選択することができる。固形臓器は肺であり得る。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏ緩衝細胞外肺溶液と混合され、肺を通って循環され得、それによって、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、肺の血管系からＡ抗原を実質的に除去するのに十分な時間、ドナー臓器の血管系と接触する。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏ緩衝細胞外腎臓溶液と混合され、腎臓を通して循環され得、それによって、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、腎臓の血管系からＡ抗原を実質的に除去するのに十分な時間、ドナー臓器の血管系と接触する。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏ緩衝細胞外肝臓溶液と混合され、肝臓を通って循環され得、それによって、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、肝臓の血管系からＡ抗原を実質的に除去するのに十分な時間、ドナー臓器の血管系と接触する。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏで緩衝細胞外心臓溶液と混合され、心臓を通って循環され得、それにより、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、心臓の血管系からＡ抗原を実質的に除去するのに十分な時間、ドナー臓器の血管系と接触する。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏで緩衝細胞外膵臓溶液と混合され、膵臓を通って循環され得、それにより、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、膵臓の血管系からＡ抗原を実質的に除去するのに十分な時間、ドナー臓器の血管系と接触する。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏ緩衝細胞外腸溶液と混合され、腸を通って循環され得、それによって、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質は、腸の血管系からＡ抗原を実質的に除去するのに十分な時間、ドナー臓器の血管系と接触する。
血管系からＡ抗原を除去する時間は、約１時間であり得る。血管からＡ抗原を除去する時間は、１時間未満であり得る。血管系からＡ抗原を除去する時間は約２時間である。
本方法は、ドナー臓器を洗浄して、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ、ガラクトサミニダーゼおよび切断されたＡ抗原を除去することをさらに含み得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、１μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断し得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有し得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有し得る。
さらなる実施態様によれば、組成物が提供され、当該組成物は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１および３２〜３５のうちの１つの配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６及び３７のうちの１つに記載の配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む。
さらなる実施態様によれば、組成物が提供され、当該組成物は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１および３２〜３５のうちの１つの配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６および３７のうちの１つの配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む。
さらなる実施態様によれば、組成物が提供され、当該組成物は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１および３２〜３５のうちの１つの配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６及び３７のうちの１つの配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む。
前記組成物は、（ａ）前記精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよび前記精製ガラクトサミニダーゼが固定化されていてもよいか、（ｂ）精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼが固定化されてもよいか、または（ｃ）精製ガラクトサミニダーゼが固定化されてもよい、ことを含んでもよい。
固定化酵素は、表面に結合されてもよく、当該表面は、以下の１つ以上から選択されてもよい：（ａ）ビーズまたはマイクロスフェア、（ｂ）容器、（ｃ）管、（ｄ）カラム、および（ｅ）マトリックス。組成物は、さらに、クラウディング剤を含めてもよい。クラウディング剤は、デキストラン、硫酸デキストラン、デキストリン、プルラン、ポリ（エチレングリコール）、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、および不活性タンパク質のうちの１つ以上から選択されてもよい。
さらなる実施態様によれば、配列番号２、配列番号４または配列番号５のフラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼを含む精製酵素が提供される。
さらなる実施態様によれば、配列番号７、配列番号９または配列番号１０のフラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼを含む精製酵素が提供される。
さらなる実施態様によれば、配列番号１７または配列番号３２のクロストリジウム・テルチウムＧａｌＮＡｃデアセチラーゼを含む精製酵素が提供される。
さらなる実施態様によれば、配列番号１９または配列番号３６のクロストリジウム・テルチウムガラクトサミニダーゼを含む精製酵素が提供される。
タンパク質タグは、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＡＵ１エピトープ、ＡＵ５エピトープ、ＡｖｉＴａｇ、バクテリオファージＴ７エピトープ（Ｔ７−タグ）、バクテリオファージＶ５エピトープ（Ｖ５−タグ）、ビオチン−カルボキシ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、ブルータングウイルスタグ（Ｂ−タグ）、単一ドメインのラクダ抗体（Ｃ−タグ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰまたはカルモジュリン−タグ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、コリン結合ドメイン（ＣＢＤ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ＤｏｇＴａｇ、Ｅ２エピトープ、Ｅ−タグ、ＦＬＡＧエピトープ（ＦＬＡＧ−タグ）、ガラクトース結合タンパク質（ＧＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ−タグ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、ＨａｌｏＴａｇ（商標）、交互ヒスチジンおよびグルタミンタグ（ＨＱタグ）、交互ヒスチジンおよびアスパラギンタグ（ＨＮタグ）、ヒスチジンアフィニティタグ（ＨＡＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＨＳＶエピトープ、イソペプタグ（Ｉｓｏｐｅｐ−タグ）、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、ＫＴ３エピトープ、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｍｙｃエピトープ（Ｍｙｃ−タグ）、ＮＥ−タグ、ＮｕｓＡ、ＰＤＺドメイン、ＰＤＺリガンド、ポリアルギニン（Ａｒｇ−タグ）、ポリアスパラギン酸（Ａｓｐ−タグ）、ポリシステイン（Ｃｙｓ−タグ）、ポリグルタミン酸（Ｇｌｕ−タグ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、ポリフェニルアラニン（Ｐｈｅ−タグ）、プロフィニティｅＸａｃｔ、プロテインＣ、Ｒｈｏ１Ｄ４タグ、Ｓ１−タグ、Ｓ−タグ、ソフタグ１、ソフタグ３、スヌープタグＪｒ、スヌープタグ、スポットタグ、ＳｐｙＴａｇ（Ｓｐｙ−タグ）、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）、ブドウ球菌タンパク質Ａ（プロテインＡ）、ブドウ球菌タンパク質Ｇ（プロテインＧ）、ストレプタグ、ストレプトアビジン（ＳＢＰ−タグ）、ストレプタグＩＩ、Ｓｄｙ−タグ、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）、Ｔ７エピトープ、テトラシステインタグ（ＴＣタグ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、ＴｒｐＥ、Ｔｙタグ、ユビキチン、ユニバーサル、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−ＧまたはＶＳＶ−タグおよびＸｐｒｅｓｓタグのうちの１つ以上から選択されてもよい。
さらなる実施態様によれば、ドナー臓器からＡ抗原を酵素的に切断する方法であって、（ａ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質と、Ａ型抗原を提示するドナー臓器とを混合する工程と、（ｂ）酵素がドナー臓器の血管内腔からＡ抗原を切断するのに十分な時間、酵素を、ドナー臓器血管に灌流する工程とを含む方法が提供される。
前記方法は、さらに、クラウディング剤を添加することを含み得る。クラウディング剤は、デキストラン、硫酸デキストラン、デキストリン、プルラン、ポリ（エチレングリコール）、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、超分岐グリセロール、および不活性タンパク質のうちの１つ以上から選択されてもよい。前記方法は、本明細書に記載の酵素組成物を含む臓器灌流溶液または臓器保存溶液でドナー臓器を灌流することを含み得る。
前記方法は、ドナー臓器を洗浄し、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ、ガラクトサミニダーゼおよび／またはクラウディング剤を除去することをさらに含んでもよい。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有してもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有してもよい。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１００μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、９０μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を８０μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、７０μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、６０μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を５０μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を４０μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を３０μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を２０μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１５μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１４μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１３μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１２μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１１μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１０μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を９μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、８μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を７μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、６μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を５μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を４μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を３μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を２μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を１μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．９μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．８μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．７μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．６μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．５μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．４μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．３μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．２μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．１μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．０９μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．０８μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．０７μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、０．０６μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．０５μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．０４μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．０３μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．０２μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、Ａ抗原を０．０１μｇ／ｍｌ以下で切断でき得る。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有してもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．０と約８．０との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有してもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．８と約７．８との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有してもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．９と約７．９との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有してもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、約６．４と約７．８との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有してもよい。
ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有していてもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、３°Ｃと３８°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有していてもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、４°Ｃと４０°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有していてもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有していてもよい。ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼは、５°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有していてもよい。
別の実施形態によれば、配列番号２、配列番号４または配列番号５のフラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼを含む精製酵素が提供される。
別の実施形態によれば、配列番号７、配列番号９または配列番号１０のフラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼを含む精製酵素が提供される。
別の実施形態によれば、精製クロストリジウム・テルチウムＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよび配列番号１４のガラクトサミニダーゼ融合タンパク質を含む精製酵素が提供される。
別の実施形態によれば、本願明細書に記載される核酸と異種核酸配列とを含むベクターが提供される。
別の実施形態によれば、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施してもよい。本明細書で使用されるｅｘ ｖｉｖｏは、この方法が生物の外部で実施されることを意味する。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏは、ｅｘ ｖｉｖｏ肺灌流（ＥＶＬＰ）および提供された血液の処置を包含する。本明細書中で使用される場合、ｅｘ ｖｉｖｏとは、組織または細胞（例えば赤血球やドナー臓器）がｉｎ ｖｉｖｏであったときにその組織または細胞が置かれていた状態から最小のまたはいくらかの変化を伴う外部環境における、生物からの組織または細胞の中または上で行われる実験または測定または処置を指す。
以下の詳細な説明は、添付の図と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を説明するために、図面は本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、示される正確な構成、実施例、および手段に限定されない。
本明細書において直接定義されない用語は、本発明の技術分野において理解されるように、それらに一般的に関連する意味を有するものと理解されるものとする。
本明細書で使用される「固定化酵素」は、不活性の不溶性物質であってもよい表面に付着した酵素である。酵素の固定化は、ｐＨ、温度などの条件の変化に対する抵抗性を増大させ、使用後および酵素再使用のためのそれらの除去を補助することができる。
酵素の固定化は、種々の方法（例えば、アフィニティタグ結合、ガラス上の表面吸着、樹脂、アルギン酸塩ビーズまたはマトリックス、ビーズ、繊維またはマイクロスフェアの捕捉、表面または他の酵素への架橋結合および表面への共有結合）によって達成されてもよい。
本明細書中で使用する場合、「アフィニティタグ結合」とは、酵素の表面への固定化（例えば、非共有結合性または共有結合性のタンパク質タグを用いる多孔質材料）を指す。アフィニティタグ結合は、タンパク質精製に使用されており、より最近では、ＥｚｉＧ（商標） （スウェーデンのＥＮＧＩＮＺＹＭＥ ＡＢ（商標）（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ １９９２／０１０１１３）、およびＰＣＴ／ＳＥ ２０１５／０５０１０８）によって生物触媒用途に使用されている。活性酵素を表面に付着させるための代替システムが当該技術分野で公知である（例えば、ＵＳ４０８８５３８、ＵＳ４１４１８５７、ＵＳ４２０６２５９、ＵＳ４２１８３６３、ＵＳ４２２９５３６、ＵＳ４２３９８５４、ＵＳ４６１９８９７、ＵＳ ４７４８１２１、ＵＳ４７４９６５３、ＵＳ４８９７３５２、ＵＳ４９５４４４４、ＵＳ４９７８６１９、ＵＳ５１５４８０８、ＵＳ５９１４３６７、ＵＳ５９６２２７９、ＵＳ６０３０９３３、ＵＳ６２９１５８２、ＵＳ６２５４６４５、ＵＳ１０，０１６，４９０、およびＵＳ１０，０４１，０５５を参照）。
タンパク質タグは、組換えタンパク質上に遺伝的にグラフトされたペプチド配列であり、化学剤または酵素的手段によって除去可能であることが多く、種々の目的のためにタンパク質に結合される。表Ａに記載されているタンパク質タグは、実施例であることを意図しており、決して限定することを意図していない。ある種類のタンパク質タグはアフィニティタグであり、アフィニティ技術を用いて粗生物学的供給源から（例えば、発現系生物から）精製することができるように、または表面への 「タグ付けされた」 タンパク質の固定化を容易にするために、タンパク質またはペプチド配列に付加される。アフィニティタグの例としては、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ストレプ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、および金属マトリックスに結合するポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）が挙げられる。別のタイプのタンパク質タグはエピトープタグ（例えば、Ｖ５−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、スポット−タグ、ＮＥ−タグ）であり、これは高親和性抗体の産生を容易にするために選択される短いペプチド配列であり、免疫反応性を改善するためのウイルス遺伝子配列に由来することが多い。エピトープタグは、タンパク質の精製および表面への固定にも使用されるが、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫沈降実験に特に有用である。さらに別の種類のタンパク質タグは、クロマトグラフィタグ（例えば、ＦＬＡＧタグのようなポリアニオン性アミノ酸）であり、これは、タンパク質のクロマトグラフィ特性を変更して、分離および精製または固定化を補助するために使用され得る。さらに別のタンパク質タグは、可溶化タグ（例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ））および蛍光タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））である。タンパク質タグは、特定の酵素的修飾、化学的修飾、またはタンパク質を他の成分に結合することを可能にする。しかしながら、タンパク質配列に付加されるタグの種類または数によっては、タンパク質本来の機能、この場合は、酵素機能は、タグによって損なわれ得る。従って、酵素の活性が損なわれないことを確実にするためにタンパク質タグを選択する必要があり、あるいは、使用前にタンパク質タグをタンパク質から切断してもよい。
表Ａ：代表的なタンパク質タグ
タンパク質タグの使用は、本出願において、配列番号５、１０、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１に示されるようなポリヒスチジンプロテインタグ（Ｈｉｓ−タグ）の使用を介して例示されているが、当業者であれば、使用される精製方法および／または酵素が結合される表面に応じて、任意の数の他のタンパク質タグを使用して酵素を精製し、および／または本明細書に記載されるように酵素を表面に結合することができることを容易に理解するであろう。そのようなタンパク質タグは、表Ａに列挙されたタンパク質タグのいずれか１つ以上から選択され得るが、他のそのようなタンパク質タグは、当該技術分野において公知である。
さらに、一つ以上の切断部位（例えば、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１で使用されるトロンビン切断部位）は、酵素からタンパク質タグを分離するために、またはそうでなければ酵素を切断するために使用され得る。切断部位は、Ｎ末端メチオニン、シグナルペプチドの除去、および／または不活性もしくは非機能性タンパク質の活性タンパク質への変換（すなわち、チモーゲンまたはプロ酵素）に使用され得る。あるいは、切断部位を用いて、同じ読み枠で発現された２つ以上の酵素を分離してもよい。タンパク質またはペプチドを切断することができ、配列特異的切断部位を有するであろう酵素の例は、以下の１つ以上から選択され得る：Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ ＢＮＰＳ−スカトール、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、キモトリプシン高特異性（Ｐの前ではなく、［ＦＹＷ］のＣ末端）、キモトリプシン低特異性（Ｐの前ではなく、［ＦＹＷＭＬ］のＣ末端）、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨード安息香酸、ＬｖｓＣ、ＬｖｓＮ、ＮＴＣＢ（２−ニトロ−５−チオシアン安息香酸）、好中球エラスターゼ、ペプシン（ｐＨ１．３）、ペプシン（ｐＨ＞２）、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、トリプシン。
当業者は、Ａ抗原を効率的に切断することができる、本明細書に記載される活性ガラクトサミニダーゼ酵素および活性ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ酵素の組み合わせが重要であることを理解し、当業者はまた、１つ以上の切断部位および／または１つ以上のタンパク質タグの付加が任意であり、そのような改変が特定の発現系、精製系および可能な表面付着戦略に基づいて選択され得ることを理解するであろう。さらに、ガラクトサミニダーゼ配列およびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ配列に対する他の修飾も、Ａ抗原の切断活性が有意に損なわれない限り可能である。さらに、Ａ抗原切断活性が有意に損なわれない限り、ガラクトサミニダーゼおよびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの修飾が可能である。ガラクトサミニダーゼおよびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ配列に対する修飾は、欠失、挿入および／または置換であり得る。置換は、保存的置換または中立的置換であり得る。例えば、ガラクトサミニダーゼ配列およびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ配列は、成熟酵素と９０％以上の配列同一性を共有し得る。例えば、ガラクトサミニダーゼ配列およびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ配列は、成熟酵素と８５％以上の配列同一性を共有し得る。例えば、ガラクトサミニダーゼ配列およびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ配列は、成熟酵素と７５％以上の配列同一性を共有し得る。あるいは、ガラクトサミニダーゼおよびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ配列は、アミノ酸の５、１０、１３、１５、２０、または２５％までの改変を有し得る。
本明細書中で使用される場合、「ガラス、アルギン酸ビーズまたはマトリックスへの吸着」とは、不活性物質の外側への酵素の付着を指す。一般的に、このタイプの固定化は化学反応によっては生じず、固定化された酵素の活性部位はそれが吸着された表面によってブロックされ得、これは吸着される酵素の活性を低下させ得る。
本明細書中で使用される場合、「捕捉」とは、不溶性ビーズまたはマイクロスフェア内での酵素の捕捉を指す。しかしながら、捕捉は、基質の到達および生成物の流出を妨げることがある。一例としては、アルギン酸ナトリウム溶液および酵素溶液の混合物を塩化カルシウムと反応させることによって製造することができるアルギン酸カルシウムビーズとしての使用が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「架橋」とは、ほぼ酵素のみからなるマトリックスを作製するための、酵素の相互への共有結合を指す。架橋酵素反応を設計する場合、理想的には、酵素の活性は酵素の活性部位の閉塞ではなく固定化によってのみ影響されるように結合部位は酵素の活性部位をカバーしない。それにもかかわらず、ポリ（エチレングリコール）のようなスペーサ分子は、基質による立体障害を低減するために使用され得る。
本明細書中で使用される場合、「共有結合」とは、共有結合を介した不溶性支持体または表面（例えばシリカゲル）への酵素の結合を指す。酵素と支持体または表面との間の共有結合の強度のために、酵素が支持体または表面から剥離する可能性は非常に低い。
本明細書中で使用される場合、「クラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」とは、酵素の活性を改善するために酵素を細胞表面上に集結させることによって高分子の凝集を促進する任意のポリマーまたはタンパク質を指す。クラウディング剤は、例えば、デキストラン、デキストラン硫酸、デキストリン、プルラン、ポリ（エチレングリコール）、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、超分岐グリセロールおよび不活性タンパク質であり得る（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ，Ｉ．Ｍ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ.（２０１４）「Ｗｈａｔ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｏｗｄｉｎｇ Ｃａｎ Ｄｏ ｔｏ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ」１５（１２）：２３０９０−２３１４０）。
本明細書中で使用される場合、「デキストラン」とは、１，０００ダルトン以上の分子量を有し、α−結合ｄ−グルコピラノシル反復単位の直鎖骨格を有する多糖類を指す。デキストランは、五つの炭素原子と一つの酸素原子を含むピラノース環構造に基づいて３つの構造クラス（つまり、クラス１〜３）に分けられる。クラス１のデキストランはα（１→２）、α（１→３）及びα（１→４）結合を持つｄ−グルコース分枝の小さな側鎖で修飾されたα （１→６）−結合ｄ−グルコピラノシル骨格を含む。クラス１のデキストランは、その分子量、空間配置、分岐のタイプと程度、および分枝鎖の長さが微生物産生株と培養条件に依存して３〜５変化する。イソマルトースおよびイソマルトトリオースは、クラス１のデキストラン骨格構造を有するオリゴ糖である。クラス２のデキストラン（オルタナンス（ａｌｔｅｒｎａｎｓ））はα（１→３）及びα（１→６）結合ｄ‐グルコピラノシル単位とα（１→３）結合分枝の交互骨格構造を含む。クラス３のデキストラン（ムタンス（ｍｕｔａｎｓ））はα（１→６）結合分枝を有する連続α（１→３）結合ｄ‐グルコピラノシル単位の骨格構造を有する。
本明細書で使用される場合、「プルランス（ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）」は、真菌アウレオバシジウム プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）によってデンプンから主に産生される構造多糖であり、α（１→６）結合マルトトリオース（Ｄ−グルコピラノシル−α（１→４）−Ｄ−グルコピラノシル−α（１→４）−Ｄ−グルコース）単位の繰り返しからなり、時折マルトテトラオース単位を含む。
本明細書で使用される場合、「デキストリン」とは、単一のα（１→６）結合で始まり、α（１→４）結合Ｄ−グルコピラノシル単位で直線的に続く、デキストランより短い鎖長を有するＤ−グルコピラノシル単位を指す。
本明細書中で使用される場合、「Ｆｉｃｏｌｌ（商標）」は、中性で、高度に分岐し、高質量の親水性多糖であり、水溶液中で容易に溶解する。
本明細書で使用される場合、 「灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）」 または 「灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｎｇ）」 とは、血管を通して流体を循環させることによって流体を臓器に浸透させることを指す。
臓器保存における重要な目標は、利用できる移植可能な臓器の数を増やすことである。典型的には、臓器は冷蔵保存されていたが、これには拡散限界の可能性があり、したがって低温灌流システムが開発されている。さらに、正常体温に近いシステムは、肝臓、肺、心臓および腎臓を含む固形臓器の機能的保存を強化するためにも使用されている。多数の緩衝細胞外溶液が灌流溶液または保存溶液として使用される。多くの緩衝細胞外溶液が知られている。例えば、Ｓｔｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ Ｐｌｕｓ（商標）、ＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）溶液（ＵＷ）、Ｃｅｌｓｉｏｒ溶液、腎臓灌流溶液（ＫＰＳ−１）、京都大学（Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）溶液、ＩＧＬ−１溶液、およびクエン酸塩溶液（Ｇｕｉｂｅｒｔ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１１））。これらの多くは市販されており、これらの溶液の変形は当業者には明らかであろう。
様々な代替実施形態および実施例が本明細書に記載される。これらの実施形態および実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
（材料および方法）
本試験で使用した化学物質および市販の酵素は、特に断りのない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）から購入した。単糖メチルウンベリフェリルグリコシドはＨｏｎｇｍｉｎｇ Ｃｈｅｎ博士からの寛大な贈り物であり、Ａ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵはＤａｖｉｄ Ｋｗａｎ博士（Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）からの寛大な贈り物であった。
本試験で使用した化学物質および市販の酵素は、特に断りのない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）から購入した。単糖メチルウンベリフェリルグリコシドはＨｏｎｇｍｉｎｇ Ｃｈｅｎ博士からの寛大な贈り物であり、Ａ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵはＤａｖｉｄ Ｋｗａｎ博士（Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）からの寛大な贈り物であった。
ヒト糞便メタゲノムライブラリ
ヒトメタゲノミクスフォスミドライブラリの生成のために、血液型ＡＢ＋を有する健康なアジア人男性ボランティアからヒト新鮮糞便試料を採取した。ＭｏＥプロトコル（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７）に記述された手順に従って、直接ＤＮＡ抽出とフォスミドライブラリ作成を行った。
フォスミドライブラリスクリーニング
５１×３８４ウェルのＡＢ＋血液フォスミドライブラリプレートを室温で解凍し、５０μｌのスクリーニング用ＬＢ培地（１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬアラビノース、０．２％（ｖ／ｖ）マルトース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４）を含有する３８４ウェルプレート中に複製した。プレートを、過剰な蒸発を防ぐために、水のリザーバを含む密閉容器中で３７°Ｃで１８時間インキュベートした。４５μｌの反応混合物（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，１００μＭ ＧａｌＮＡｃ−α−ＭＵ、１００μＭ Ｇａｌ−α−ＭＵ）を、ＱＦｉｌｌ（商標）装置［Ｇｅｎｅｔｉｘ（商標）］を用いて、成長したスクリーニングプレート上に添加した。次いで、プレートを密封容器中で３７°Ｃで２４時間インキュベートし、各プレートの蛍光（例：３６５ｎｍ Ｅｍ：４３５ｎｍ、ｓｗｅｅｐモード、ｇａｉｎ８０）を、ＳｙｎｅｒｇｙＨ１プレートリーダ［ＢｉｏＴｅｋ（商標）］を介して１、２、４、８および２４時間で測定した。全てのウェルについて、Ｚスコアを計算し、これは式：Ｚスコア＝（蛍光中央値）／標準偏差によって与えられる。
ある閾値を超えるすべてのポジティブヒットを、新しい３８４ウェルプレートに再配列し、「単純基質ヒット」プレートと命名し、−７０°Ｃで保存した。二つのスクリーニングプレートを「単純基質ヒット」プレートから複製し、ＧａｌＮＡｃ−α−ＭＵまたはＧａｌ−α−ＭＵ活性のいずれかについて再スクリーニングして、以前に検出された活性を確認し、デコンボリュートした。
ヒットのどれがＡ抗原またはＢ抗原構造を切断し得るかを決定するために、結合酵素アッセイを用いて、５０μＭのＡ抗原サブタイプ１ｔｅｔｒａ−ＭＵまたは５０μＭのＢ抗原サブタイプ１ｔｅｔｒａ−ＭＵに対するそれらの活性を測定した。この結合アッセイのバージョンは、Ｋｗａｎ（Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）によって以前に記載された。結合酵素としてＢｇａＡ（Ｓｉｎｇｈ ２０１４）の代わりにＢｇａＣ（Ｊｅｏｎｇ ２００９）を用いて、サブタイプ１Ａ抗原の切断も検出できるようにアッセイを改良した。α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼやα−ガラクトシダーゼは末端の糖を切断し、Ｈ抗原サブタイプＩｔｒｉ−ＭＵを遊離させる。その後、α−フコシダーゼ（ＡｆｃＡ（Ｋａｔａｙａｒｎａ ２００４））、β−ガラクトシダーゼ（ＢｇａＣ（Ｊｅｏｎｇ ２００９））、β−ヘキソサミニダーゼ（ＳｐＨｅｘ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ２００２））は、４−メチルウンベリフェリルアルコールが遊離するまで、残存する糖をエキソ型で切断する。これは、蛍光の増加として検出できる。これを達成するために、各酵素５０μｇ／ｍＬを反応混合物に添加した。ある閾値を超えるすべてのポジティブヒットを３回再スクリーニングし、挿入物を欠くベクターを含む宿主細胞株をネガティブコントロールとして使用した。全ての確認されたヒットは、−７０°ＣでＬＢ培地（１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．２％（ｖ／ｖ）マルトース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４）中に別々に保存した。
フォスミドヒットシークエンシング
配列決定のためのフォスミドＤＮＡを単離するために、ポジティブヒットフォスミドグリセロールストックを用いて、５ｍＬのＴＢ培地（１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬアラビノース、０．２％（ｖ／ｖ）マルトース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４）に接種し、３７°Ｃ、２２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。フォスミド単離は、ＧｅｎｅＪｅｔ（商標）プラスミドミニプレップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（商標））を用いて行った。Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｓａｆｅ（商標）ＡＴＰ−依存性ＤＮアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（商標））を用いて、単離したプラスミドをコンタミネーション線状大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡから精製し、続いてＧｅｎｅＪｅｔ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（商標））を用いて別の精製を行った。濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ｄｓＤＮＡＨＳアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて、Ｑｂｉｔ（商標）蛍光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（商標））上で計算した。予想されるＤＮＡサイズを１％アガロースゲルで確認した。完全なフォスミドシークエンシングのために、各フォスミド２ｎｇをＵＢＣシークエンシングセンタ（バンクーバー、ＢＣ、カナダ）に送った。各フォスミドは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）システムを用いて個別にバーコード化し、配列決定した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）の未加工のシークエンスデータはすべてトリミングされ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈａｌｌａｍｌａｂ／ＦａｂＦｏｓにおいてＧｉｔＨｕｂ（商標）で入手できるＰｙｔｈｏｎスクリプトを使ってアセンブルされた。簡単に述べれば、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを用いて、リード（ｒｅａｄｓ）からアダプタ（ａｄａｐｔｅｒｓ）および低品質の配列を除去した（Ｂｏｌｇｅｒ ２０１４）。これらのリードを、ＢＷＡ（Ｌｉ ２０１３）を用いてベクターおよび宿主配列についてスクリーニングし、次いでＳａｍｔｏｏｌｓ（商標）およびｂａｍ２ｆａｓｔｑスクリプトを用いて濾過して汚染物質を除去した。これらの高品質で精製されたリードは、１０の増分によって増加する、７１と２４１との間の範囲のｋ−ｍｅｒ値を有するＭＥＧＡＨＩＴによってアセンブルされた（Ｌｉ ２０１５）。これらのライブラリは、２万倍を超えるカバー率（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を有することが多く、適切な配列アセンブリを妨害する配列決定エラーの蓄積を防ぐため、最小ｋ−ｍｅｒ多重度は、フォスミドの推定カバー率の１％によって計算された。複数のコンティグを生成するＰｙｔｈｏｎスクリプトアセンブリの外部で、ｍｉｎｉｍｕｓ２を使ってスキャフォールドを行った（Ｔｒｅａｎｇｅｎ ２０１１）。パラメータ化されたコマンドは、ＧｉｔＨｕｂ（商標）ページのドキュメントとＰｙｔｈｏｎスクリプト自体の両方に見出し得る。
フォスミドＯＲＦ予測とヒット検証
フォスミドＯＲＦをＰｒｏｄｉｇａｌ（商標）（Ｈｙａｔｔ ２０１０）のメタゲノム版を用いて同定し、ＭｅｔａＰａｔｈｗａｙｓ（商標）ｖ２．５ソフトウェアパッケージの一部としてＢＬＡＳＴＰ（商標）を用いたＣＡＺｙ（商標）データベースと比較した（Ｋｏｎｗａｒ ２０１５）。ＭｅｔａＰａｔｈｗａｙｓ（商標）パラメータは、長さ（ｌｅｎｇｔｈ）＞６０，ＢＬＡＳＴスコア＞２０，ｂｌａｓｔスコア比＞０．４，ＥＶａｌｕｅ＜１×１０−６である。
ＧＨまたはＣＢＭファミリー（既知または疑われるα−ガラクトシダーゼおよび／またはα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性とともに）のメンバーに対する注釈を有するすべての予測ＯＲＦを、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ（商標）クローニング戦略（Ｅｎｇｌｅｒ ２００８）を用いてｐＥＴ１６ｂプラスミドにクローニングし、プライマー配列を表Ｂに設定した。タンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、１０ｍＬのＺＹ５０５２自動誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ ２００５）中で３７°Ｃ、２２０ｒｐｍで２０時間培養した。細胞を遠心分離（４０００×ｇ、４°Ｃ、１０分）によって回収し、１ｍＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（商標）１００、１ｘプロテアーゼインヒビターＥＤＴＡフリー（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）［Ｐｉｅｒｃｅ（商標）］）に再懸濁した。連結アッセイ（Ｋｗａｎ ２０１５）を、候補からの粗細胞溶解物５０μｌを用いて行い、アッセイ緩衝液５０μｌ（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５０μｇ／ｍＬ ＳｐＨｅｘ、５０μｇ／ｍＬ ＡｆｃＡ、５０μｇ／ｍＬ ＢｇａＣ、１００μＭ Ａ抗原サブタイプ１ｔｅｔｒａ−ＭＵ又は１００μＭ Ｂ抗原サブタイプ１ｔｅｔｒａ−ＭＵ）と混合し、３７°Ｃでインキュベートした。すべての反応を、黒色の９６ウェルプレート中で３通りに行った。蛍光（３６５／４３５ｎｍ）をＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１プレートリーダ［ＢｉｏＴｅｋ（商標）］を用いて４時間連続的にモニタした。ＡまたはＢ抗原に対する切断活性を示す粗抽出物からのアッセイを、今回は結合酵素なしで繰り返し、反応生成物をＨＦ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムを介して単離し、ＬＣ−ＭＳおよび／またはＴＬＣで分析した。ＴＬＣは、ＴＬＣシリカゲル６０ Ｆ２５４ ＴＬＣプレート［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．（商標）、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ］を用いて実施した。
表Ｂ：プライマー配列
ＨＰＡＥ−ＰＡＤアッセイ
ガラクトサミンの酵素的放出の分析をＨＰＡＥ−ＰＡＤ（Ｄｉｏｎｅｘ（商標））ＨＰＬＣシステムで行った。以下の基質について、種々のタンパク質の切断活性を試験した：７．５μｇ／μＬのブタ胃タイプＩＩ由来ムチンを１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４に溶解したもの、５ｍＭ Ａ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵを１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４中に存在させたもの、および、Ａ＋、Ｂ＋およびＯ−型ドナーからのＲＢＣ（ヘマトクリット５０％）を１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４中に存在させたもの。１０μｇ／ｍＬの酵素を含む試料を、３７°Ｃで二時間インキュベートし、その後、さらなる分析のために−８０°Ｃで保存した。少量の反応物（１０μｌ）をＨ２Ｏ（１００μｌ）中に希釈し、ＨＰＡＥ−ＰＡＤ装置で分析した。ガードカラムを有するＣａｒｂｏＰＡＣＰＡ２００（商標）（１５０ｍｍ）カラムで分離を行い、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）電極上の使い捨て金及び四電位波形を用いて検出を行った。分離条件は次の通りであった：１００ｍＭ水酸化ナトリウムおよび７０から３００ｍＭまでの酢酸ナトリウム勾配を分離の最初の１０分間にわたって与えた。溶離液を最終勾配条件で１分間保持し、次の１分間にわたって初期条件に戻した。流速は１．０ｍｌ／分で、インジェクションは２７分毎に行った。遊離糖ＧａｌＮＡｃ、ＧａｌおよびＧａｌＮ（１０μＭ）の基準をＨＰＡＥ‐ＰＡＤに適用し、参照のためピーク溶出時間を決定した。
動態アッセイ
脱離基として４−メチルウンベリフェロンを用いた全ての動態アッセイを蛍光の測定により行った。内部フィルタ効果（Ｐａｌｍｉｅｒ ２００７）に基づく測定誤差を避けるために、標準曲線を用いて蛍光色素の線形範囲を検証した。
Ｆｐガラクトサミニダーゼ
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−ＭｅｎｔｅｎパラメータをＧａｌＮ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵおよびＡ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵについて１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４， ３７°Ｃで測定した。１００μｌ中で３．４ｎＭのＦｐガラクトサミニダーゼ（５．３１ｎＭ ＦｐＧａｌＮａｓｅ＿ｔｒｕｎｃＡ）および０．１ｍｇ／ｍＬのＳｐＨｅｘ，ＡｆｃＡ，０．２ｍｇ／ｍＬのＢｇａＣおよび種々の濃度の基質（５μＭ〜２ｍＭ）と反応させた。複製物としてコントロール（Ｆｐガラクトサミニダーゼなし）を伴う一連の四つの反応を行った。加水分解によるＭＵ放出から生じる蛍光シグナル（３６５／４３５ｎｍ）を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ［ＢｉｏＴｅｋ（商標）］によってモニタし、同一の反応条件下で測定したＭＵ標準濃度曲線を用いて濃度に変換した。初期速度（μＭ／ｓ）を測定し、Ｇｒａｆｉｔ７．０（商標）でプロットして動態パラメータを決定した。
ｋｃａｔ／ＫＭパラメータを、ＧａｌＮ抗原サブタイプ１／２／４ｔｅｔｒａ−ＭＵおよびＢ抗原サブタイプ１ｔｅｔｒａ−ＭＵについて、ｐＨ７．４および３７°Ｃで測定した。反応（全容量１００μＬ）を、黒色の９６プレートウェル中で行い、結合アッセイとして、８．６３ｎＭ Ｆｐガラクトサミニダーゼ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＳｐＨｅｘ、ＢｇａＣ（サブタイプ２に対してＢｇａＡ）、ＡｆｃＡ、様々な濃度の基質（２５μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ）を伴う１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）において実施した。複製物としてコントロール（Ｆｐガラクトサミニダーゼなし）を伴う一連の四つの反応を行った。加水分解によるＭＵ放出から生じる蛍光シグナル（３６５／４３５ｎｍ）を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ［ＢｉｏＴｅｋ（商標）］によってモニタし、同一の反応条件下で測定したＭＵ標準濃度曲線を用いて濃度に変換した。初期速度（μＭ／ｓ）を決定し、Ｇｒａｆｉｔ７．０（商標）でプロットして、ｋｃａｔ／ＫＭ（ｓ−１＊ｍＭ−１）パラメータを決定した。
８６３．２ｎＭのＦｐガラクトサミニダーゼ（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４において）または体積１００μｌにおいて様々な基質濃度（１０μＭ〜５ｍＭ）を有する３６９．９ｎＭのＦｐＧＨ４（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００μＭ ＮＡＤ＋、１ｍＭ ＭｎＣｌ２において）を伴う透明な９６プレート中のＧａｌＮ−α−ｐＮＰについて、３７°ＣでＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎパラメータを測定した。反応は、二つのコントロール（無酵素）を伴う一連の３つの反応として行った。加水分解によるｐＮＰ放出から生じる吸収（４０５ｎｍで）を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ［ＢｉｏＴｅｋ（商標）］によってモニタし、同一の反応条件下で測定したｐ−ニトロフェノール標準濃度曲線を用いて濃度に変換した。初期速度（μＭ／ｓ）を測定し、Ｇｒａｆｉｔ７．０（商標）でプロットして動態パラメータを決定した。
ＦｐＧａｌＮａｃデアセチラーゼ
１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、３７°ＣにおけるＡ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵについて、前述の結合アッセイ（Ｋｗａｎ ２０１５）を用いて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎパラメータを測定した。サブタイプ１（後に４）の切断を検出できるように、β−ガラクトシダーゼとして、ＢｇａＡ（Ｓｉｎｇｈ ２０１４）の代わりにＢｇａＣ（Ｊｅｏｎｇ ２００９）を用いた。また、Ａ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵはガラクトースをさらに含むため、Ｇａｌ−β−１，３−β−ＧｌｃＮＡｃ−β−１，３−Ｇａｌ−β−ＭＵおよびＧａｌ−β−ＭＵの両方を切断する必要性を補うために、ＢｇａＣの濃度を０．２ｍｇ／ｍＬに上昇させた。さらに、ガラクトサミン含有中間体の切断を可能にするために、Ｆｐガラクトサミニダーゼを含めた。１００μｌでの反応セットアップは、３ｎＭのＦｐGalNAcデアセチラーゼ（４．５２ｎＭ ＦｐＧａｌＮａｃＤｅＡｃ＿Ｄ１ｅｘｔ、３．５５ｎＭ ＦｐＧａｌＮａｃＤｅＡｃ＿Ｄ１＋２）および０．０１ｍｇ／ｍＬのＦｐガラクトサミニダーゼ、０．１ｍｇ／ｍＬのＳｐＨｅｘ、ＡｆｃＡ、０．２ｍｇ／ｍＬのＢｇａＣおよび種々の濃度の基質（５μＭ〜２．５ｍＭ）であった。複製物としてコントロール（ＦｐＧａｌＮａｃデアセチラーゼなし）を伴う一連の四つの反応を行った。加水分解によるＭＵ放出から生じる蛍光シグナル（３６５／４３５ｎｍ）をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ（商標））でモニタし、同一の反応条件下で測定したＭＵ標準濃度曲線を用いて濃度に変換した。初期速度（μＭ／ｓ）を決定し、Ｇｒａｆｉｔ７．０でプロットして、動態パラメータを決定した。
ｋｃａｔ／ＫＭパラメータを、Ａ抗原サブタイプ１／２／４ｔｅｔｒａ−ＭＵについて、ｐＨ７．４、３７°Ｃで決定した。反応（全容量１００μＬ）を、黒色の９６プレートウェル中で行い、結合アッセイとして、１２ｎＭ ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ ０．１ｍｇ／ｍＬ ＳｐＨｅｘ、ＢｇａＣ（サブタイプＩＩに対してＢｇａＡ）、ＡｆｃＡとの、様々な濃度の基質（２５μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ）を伴う１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ ７．４）において実施した。複製物としてコントロール（ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼなし）を伴う一連の四つの反応を行った。加水分解によるＭＵ放出から生じる蛍光シグナル（３６５／４３５ｎｍ）をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ（商標））でモニタし、同一の反応条件下で測定したＭＵ標準濃度曲線を用いて濃度に変換した。初期速度（μＭ／ｓ）を決定し、そしてＧｒａｆｉｔ（商標）７．０でプロットして、ｋｃａｔ／ＫＭ（ｓ−１＊ｍＭ−１）パラメータを決定した。
ＧＨ１０９サブタイプ動態
Ａ抗原サブタイプ１／２／４ｔｅｔｒａ−ＭＵについて、ｐＨ７．４および３７°Ｃでｋｃａｔ／ＫＭパラメータを測定した。反応（全容量１００μＬ）を黒色９６プレートウェルで実施し、結合アッセイとして、８６．０２ｎＭ ＢｖＧＨ１０９＿１／１００．４９ｎＭ ＥｍＧＨ１０９／８０．５２ｎＭ ＢｖＧＨ１０９＿２／８７．４ｎＭ ＢｓＧＨ１０９および５μＭ ＮＡＤ＋、各ＳｐＨｅｘ、ＢｇａＣ （サブタイプ２に対してＢｇａＡ）、ＡｆｃＡについて０．１ｍｇ／ｍＬ、種々の濃度の基質（２５μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ）を伴う１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４で実施した。複製物としてコントロール（α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼなし）を伴う一連の四つの反応を行った。加水分解によるＭＵ放出から生じる蛍光シグナル（３６５／４３５ｎｍ）を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ［ＢｉｏＴｅｋ（商標）］によってモニタし、同一の反応条件下で測定したＭＵ標準濃度曲線を用いて濃度に変換した。初期速度（μＭ／ｓ）を決定し、ｋｃａｔ／ＫＭ（ｓ−１＊ｍＭ−１）パラメータを決定するためにＧｒａｆｉｔ７．０（商標）でプロットした。
結晶解析
結晶化の前に、ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＿Ｄ１ｅｘｔをトロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ（商標））で１ｍｇ／ｍＬの濃度で一晩、製造業者の提案プロトコルを用いて消化した。次いで、タンパク質をＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムによって精製し、流出分を回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０＋７５ｍＭ ＮａＣｌに緩衝液交換し、１２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
結晶化
ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＿Ｄ１ｅｘｔ（１２ｍｇ／ｍＬ）を、０．２Ｍ ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６、１８％ＰＥＧ４０００、および２０ｍＭ ＭｎＣｌ２からなるリザーバ溶液を用いた懸滴拡散蒸着法を用いて、１：１のタンパク質：リザーバ比で結晶化した。フェージングのために結晶を誘導体化するために迅速な臭化物浸漬を使用し、１Ｍ ＮａＢｒ、２５％グリセロール、１８％ＰＥＧ４０００、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、および０．１Ｍ Ｍｅｓ ｐＨの溶液に３０秒間結晶を移し、液体窒素中で瞬間凍結することによって調製した。血液型Ｂ抗原三糖類（Ｂ＿ｔｒｉ）との結晶複合体を、タンパク質（１２ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＭ Ｂ＿ｔｒｉと２時間プレインキュベーションすることによって調製し、その後、上記と同じ条件下で滴を設定したが、ＭｎＣｌ２は省いた。結晶を、２５％グリセロールを補充したリザーバ溶液で凍結保護した。
データ収集、フェージング（ｐｈａｓｉｎｇ）、構造決定
データセットはＣａｎａｄｉａｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（商標）で収集した。データはＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ ２０１０）を用いて統合し、Ａｉｍｌｅｓｓ（商標）（Ｅｖａｎｓ ２０１３）でスケール化した。フェージングおよび自動化構造ソリューションは、ＣＲＡＮＫ２（商標）（Ｓｋｕｂａｋ ２０１３）をＣＣＰ４Ｉ２（商標）プログラムスイート（Ｐｏｔｔｅｒｔｏｎ ２０１８）で使用して実施した。Ｃｏｏｔ（商標）（Ｅｍｓｌｅｙ ２００４）とＲｅｆｍａｃ（商標）（Ｖａｇｉｎ ２００４）の交互サイクルを用いて構造をチェックし、精密化した。Ｂ＿ｔｒｉ構造複合体を差分Ｆｏｕｒｉｅｒによって解き、配位子を水及び金属イオンと同様にＣｏｏｔ（商標）中に手動で構築した。差密度マップにより、アポ構造にＭｎ２＋、配位構造にＣａ２＋の存在が確認された。モデルはＣｏｏｔ（商標）およびＭｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（商標）（Ｃｈｅｎ ２０１０）によって検証された。アポおよびＢ＿ｔｒｉ複合体の原子座標および構造因子は、以下のアクセッション番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）とともにタンパク質データバンク（ＰＤＢ）に寄託されている：
フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質配列番号：ＷＰ＿００９２６０９２６．１、およびフラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質配列番号：ＷＰ＿０４４９４２９５２．１。
フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質配列番号：ＷＰ＿００９２６０９２６．１、およびフラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質配列番号：ＷＰ＿０４４９４２９５２．１。
活性部位変異誘発
構造情報（表示しない）および配列アラインメント（表示しない）に基づいて、ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＿Ｄ１ｍｉｎおよびＦｐＧａｌＮａｓｅ＿ｔｒｕｎｃＡを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）プロトコル（Ｚｈａｎｇ ２００４）を用いて、表Ｂに記載されているプライマーを利用して変異させた。変異体は、上記のようにＮｉＮＴＡおよびＨＩＣカラムを介して精製された。全ての変異体の構造的完全性はＣＤ分光法によって確認された。それによると、すべての試験酵素は野生型と構造的に類似していた。活性が比較的低い変異体については、完全な動態決定に用いたのと同じ条件下で反応を行った。しかし、ｋｃａｔ／ＫＭ値の測定には前述のように基質消費法を用いた（Ｖｏｃａｄｌｏ ２００２）。簡単に説明すると、［基質］＜ＫＭ（Ｋｍの〜１／５−１／１０に相当）である低濃度の基質において、ｋｃａｔ／ＫＭ値は、反応時間経過を一次曲線に非線形に当てはめ、酵素濃度で割ることによって近似することができる。
ＧＨ３６系統発生マッピング
ＧＨ３６の参照配列をＳＡＣＣＨＡＲＩＳ（商標）ｃａｚｙ＿ｅｘｔｒａｃｔ．ｐｌスクリプト（Ｊｏｎｅｓ ２０１８）を用いてＣＡＺｙ（商標）データベースからダウンロードした。系統発生ベースのタンパク質プロファイリングソフトウェア、ＴｒｅｅＳＡＰＰ（商標）（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈａｌｌａｍｌａｂ／ＴｒｅｅＳＡＰＰ、において入手可能）を用いて、参照ツリーを構築し、これらのツリーに配列をマッピングした。簡単に述べれば、ｄｂＣＡＮからのＨＭＭｓを用いて、ＣＡＺｙ（商標）（Ｙｉｎ ２０１２）からダウンロードした全ての全長配列からタンパク質ファミリードメインを抽出した。次いで、これらの配列をＵＣＬＵＳＴ（商標）を用いて７０％の配列類似性でクラスター化し、冗長な配列空間を除去し、ツリーのサイズを減少させた（Ｅｄｇａｒ ２０１０）。ＲＡｘＭＬ（商標）バージョン８．２．０を使用して参照ツリーを構築し、「−−ａｕｔｏＭＲＥ」によって１０００回の複製が実行される前にブートストラップを終了する時期を決定し、ＰＲＯＴＧＡＭＭＡＡＵＴＯ（商標）によって最適なタンパク質モデルを選択した（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ２００６およびＳｔａｍａｔａｋｉｓ２００８）。
次に、ＴｒｅｅＳＡＰＰ（商標）を用いて、クエリー配列をこれらの参照ツリーにマッピングした。簡単に述べれば、タンパク質配列をｈｍｍｓｅａｒｃｈ（商標）を用いてＨＭＭｓに整列させ、整列させた領域を抽出した（Ｅｄｄｙ １９９８）。ｈｍｍａｌｉｇｎ（商標）を使用して、新しいクエリー配列を参照マルチプルアラインメントに含め、ＴｒｉｍＡｌ（商標）は保存されていない位置をアラインメントファイルから削除した（Ｃａｐｅｌｌａ−Ｇｕｔｉeｒｒｅｚ ２００９）。ＲＡｘＭＬ（商標）を用いて、挿入により参照ツリー中のクエリー配列を分類した。各クエリー配列の配置はフィルタリングされ、単一に連結された。ｉＴＯＬ（商標）（Ｍａｔｓｅｎ２０１２およびＬｅｔｕｎｉｃ ２０１６）で表示する前のＪｐｌａｃｅ（商標）ファイル。
ＲＢＣアッセイ
ブリティッシュ・コロンビア大学の臨床倫理委員会によって承認されたプロトコルを用いて、健康な同意ドナーからの全血をクエン酸Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒに採取した。チューブを１０００×ｇで４分間、室温において回転させ、ＲＢＣを分離し、１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４で３回洗浄した。デキストラン４０ｋの存在下でのアッセイのために、洗浄されたＲＢＣ（２００μＬ、１０％ヘマトクリット）をチューブに入れ、上清を部分的に除去し、デキストラン４０ｋの存在下および非存在下で１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４で置き換えた（最終濃度３００ｍｇ／ｍＬ）。さらに、いくつかのアッセイを１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４＋２５％血漿または１００％血漿中で実施した。ＲＢＣを注意深く混合し、３０秒間オービタルシェーカ上に置いた。次に、希釈した酵素溶液を加え、２００μＬの最終容量にした。チューブを非常に穏やかにボルテックスし、設定温度で所定の時間、オービタルシェーカ上に置いた。
ＭＴＳカード
反応後、ＲＢＣを過剰の１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４で３回洗浄し、Ｍｉｃｒｏ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＭＴＳ）カード［ＭＴＳ（商標）、フロリダ、アメリカ）］を使用して分析した。希釈剤中に懸濁されたＲＢＣ（１２μｌ、５％ヘマトクリット）［ＭＴＳ、フロリダ、アメリカ］を、血液とミニゲルの内容物との間に空間を残して、ミニゲルのカラムに注意深く添加した。ＭＴＳカードを、推奨されるように改変された試料ホルダーを有するＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−２２Ｒ（商標）遠心機を用いて、室温で１５６ｘｇで６分間遠心した。ＲＢＣ表面からの抗原除去の程度は、製造業者の指示に従って、回転後のミニゲル中のＲＢＣの位置から評価した。表面抗原濃度の高いＲＢＣはゲルカラムに存在するモノクローナル抗体との相互作用で凝集し、浸透できなかった（ＭＴＳ（商標）スコア４）。表面抗原のないＲＢＣは凝集せず、ミニゲルの底に移動した（ＭＴＳスコア０）。表面抗原の部分的除去を受けたＲＢＣは、これらの間の位置に移動し、製造業者の指示に従って０（存在しない）と４（存在する）との間のスコアが割り当てられた。
Ｈ抗原の凝集アッセイ
酵素処理後のＡ抗原のＨ抗原への変換を分析するために、洗浄したＡ−ＥＣＯ−ＲＢＣｓを２μｇ／ｍＬの抗Ｈ抗体（抗血液型Ｈａｂ抗原抗体［９７−Ｉ］：ｃａｔ ｎｏ．ａｂ２４２１３（Ａｂｃａｍ（商標）））と等量混合し、３０分の時間枠内での凝集の出現をモニタした。抗Ｈ抗体で凝集したＲＢＣは、０（１８００秒以内に凝集しない）と５（１２０秒以内に凝集する）の間のスコアを割り当てた。
ＦＡＣＳ
酵素処理したＲＢＣを１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４で２回洗浄し、１％ヘマトクリットＥＣＯ−ＲＢＣｓを１／１００ＡＰＣ−抗Ａ抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７マウス抗ヒト血液型Ａ：ｃａｔ ｎｏ．５６５３８４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）））および／または抗Ｈ抗体（抗血液型Ｈａｂ抗原抗体［９７−Ｉ］：ｃａｔ ｎｏ．ａｂ２４２１３（Ａｂｃａｍ（商標）））で、室温において３０分間処理し、次いで１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４で２回洗浄した。抗Ｈ抗体の検出には、二次ＦＩＴＣ標識抗体（ヤギＦ（ａｂ′）２抗マウスＩｇＭ ｍｕ鎖（ＦＩＴＣ）：ｃａｔ ｎｏ．ａｂ５９２６（Ａｂｃａｍ（商標）））を１／５００濃度で使用した。データは、フローサイトメータ（ＣｙｔｏＦＬＥＸ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標）））を用いて１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４（ヘマトクリット１％）に再構成した後に評価した。
酵素吸着と抗原性
処理後のＲＢＣから酵素を容易に除去できるかどうかを試験するために、吸着可能性を評価した。パシフィックブルーで標識したＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ及びＦｐＧａｌＮａｓｅ（Ｆ／Ｐ＝１）をＲＢＣとともに３７°Ｃで１時間インキュベートし、数回の洗浄後、フローサイトメータ（ＣｙｔｏＦＬＥＸ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標）））で残留蛍光を測定した。
ＲＢＣを各酵素５０μｇ／ｍＬとインキュベートし、酵素処理したＲＢＣを同種または自家血清と混合し、凝集の可能性を観察することによって、抗原性を試験した。加えて、潜在的な抗−ＩｇＧ，−Ｃ３ｄ曝露を評価するために、処理したＲＢＣを抗−ＩｇＧ，−Ｃ３ｄＭＴＳ（商標）カード［ＭＴＳ（商標）、フロリダ、アメリカ）］で試験した。インキュベーション時間は３７°Ｃにおいて３０分であった。
抗原サブタイプの合成
ＡおよびＢ抗原サブタイプ１／２／４ｔｅｔｒａ−ＭＵの合成は、Ｋｗａｎ（Ｋｗａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）に記載された修正プロトコルを用いて行った。
二段階Ｈ抗原サブタイプ１／２／４ｔｒｉ−ＭＵ合成
２０ｍｇのＧａｌＮＡｃ−α−ＭＵ／ＧｌｃＮＡｃ−α−ＭＵのスケールにおいて、１０ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４，１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０Ｕアルカリホスホリラーゼ、１．５当量ＵＤＰ−Ｇａｌ，１．２当量ＧＤＰ−Ｆｕｃ（ＬａｃＮＡｃ−ＭＵ生成物でスケールされる）中で３つの合成の全てを行った。所望の生成物に応じて、１００μｇ／ｍＬの濃度で種々のグリコシルトランスフェラーゼを添加した。つまり、サブタイプＩに対して、ＣｇｔＢＳ４２およびＴｅ２ＦＴ、サブタイプＩＩに対して、ＨＰ０８２６およびＷｂｇＬ、サブタイプＩＶに対してＬｇｔＤおよびＴｅ２ＦＴである。反応を３７°Ｃで実施し、進行をＴＬＣ（移動相ＥｔＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの比が、６：２：１）によって制御し、４−メチルウンベリフェロンを１０％Ｈ２ＳＯ４を介して化合物から加水分解し、ＵＶ（３６０ｎｍ）によって検出した。さらなる生成物の増加が観察されなくなった後、反応をＨＦ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに適用し、数カラム容量の５％メタノールで洗浄し、生成物を２５％メタノールで溶出した。次いで、溶媒を減圧下で除去した。
Ａ抗原サブタイプ１／２／４ｔｅｔｒａ−ＭＵ合成
最終合成工程は、１０ｍｇ Ｈ抗原サブタイプ１／２／４ｔｒｉ−ＭＵのスケールで、５ｍＬ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２５Ｕアルカリホスホリラーゼ、１．５当量ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび１００μｇ／ｍＬ ＢｇｔＡ中、３７°Ｃで行われた。さらなる生成物の増加が観察されなかった後、ＴＬＣを介して、反応をＨＦ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに適用し、数カラム容量の５％メタノールで洗浄し、生成物を２５％メタノールで溶出した。次いで、溶媒を減圧下で除去した。最終生成物を１．５×４６ｃｍＨＷ−４０Ｆサイズ排出カラムでさらに精製し、次いで凍結乾燥した。
Ｂ抗原サブタイプ１／２／４ｔｅｔｒａ−ＭＵ合成
最終合成工程は、１０ｍｇＨ抗原サブタイプ１／２／４ｔｒｉ−ＭＵのスケールで、５ｍＬ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２５Ｕアルカリホスホリラーゼ、１．５当量ＵＤＰ−Ｇａｌおよび１００μｇ／ｍＬ ＢｏＧＴ６ａ中、３７°Ｃで実施した。さらなる生成物の増加が観察されなかった後、ＴＬＣを介して進行を追跡し、反応をＨＦ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに適用し、数カラム容量の５％メタノールで洗浄し、生成物を２５％メタノールで溶出した。次いで、溶媒を減圧下で除去した。最終生成物を１．５×４６ｃｍＨＷ−４０Ｆサイズ排除カラムでさらに精製し、次いで凍結乾燥した。
ＧａｌＮ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵ合成
１０ｍｇのＡ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵを１μｇ／ｍＬのＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼと５ｍＬの１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中で３７°Ｃで３０分間インキュベートした後、１ｍＭのＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、基質の完全な変換をＴＬＣで確認し、反応物をＨＦ Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラムに適用し、数カラム容量の２％メタノールで洗浄し、生成物を１０％メタノールで溶出させた。次いで、溶媒を減圧下で除去した。
タンパク質精製
すべてのタンパク質およびその切断は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ（商標）クローニング（Ｅｎｇｌｅｒ ２００８）またはＰＩＰＥクローニング（Ｋｌｏｃｋ ２００８）を介してｐＥＴ１６ｂまたはｐＥＴ２８ａにクローニングされた。プライマー配列は表Ｂに記載する。
拡張された特性評価のためのタンパク質の産生は、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で行い、２０時間、３７°Ｃ、２２０ｒｐｍで、２００ｍＬのＺＹ５０５２自動誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ ２００５）中で培養され、１００μｌの一晩置いたＬＢ培養物に接種した。細胞を遠心分離（４０００ｘｇ、４０°Ｃ、１０分）によって回収し、１０ｍＬの溶解緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）グリセロール、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｘプロテアーゼインヒビターＥＤＴＡフリー（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））、２Ｕベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ（商標））、０．３ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、次いで氷上で音波処理（３分間のパルス時間；５秒パルス、１０秒休止、３５％振幅）した。遠心分離（１４０００×ｇ、４°Ｃ、３０分）による細胞残渣の除去後、上清を回収し、蠕動ポンプを用いてニッケルアフィニティクロマトグラフィカラム（５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐＨＰ（商標）カラム（ＧＥ（商標）））に負荷した。溶出はＡＥＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（商標）システム（ＧＥ（商標））上で行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＤＴＴの１０〜７５％勾配でモニタし、タンパク質を含有する画分を同定し、次いでプールした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ ＤＴＴへの緩衝液交換および濃縮をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（商標）ＭＷＣＯ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））中で行った。
ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ、Ｆｐガラクトサミニダーゼおよびその切断は精製の第二ラウンドを行う必要があり、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））を用いて、疎水性相互作用クロマトグラフィカラム（フェニルセファロース高性能カラム１０ｍＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（商標）））にタンパク質を負荷する前に緩衝液を交換した。カラムの負荷、洗浄および溶出（勾配０〜１００％）は、以下の緩衝液条件を利用して、ＡＥＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ（商標））を通して処理された：ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ、結合１ｘＰＢＳ、８００ｍＭ ＮＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４および溶出１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４およびＦｐガラクトサミニダーゼ、結合２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、溶出２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質を含有する画分を同定し、次いでプールした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４への緩衝液交換および濃縮をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（商標） ＭＷＣＯ １０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））中で行った。
タンパク質の特性解析
最適ｐＨ値
Ａ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵおよびＧａｌＮ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵに対するＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびＦｐガラクトサミニダーゼの活性の一般的なｐＨ範囲を、それぞれ異なるｐＨ値に対するＴＬＣプレート上の生成物の出現によって決定した。反応は１００μｌスケール、３７°Ｃ、５０μＭ基質および１μｇ／ｍＬ酵素を適切な緩衝系中で行った。ｐＨ４〜６の緩衝液は、５０ｍＭクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６〜８の場合は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液およびｐＨ８〜１０の場合は５０ｍＭグリシン／水酸化ナトリウム緩衝液に基づいた。
最適ｐＨ値を決定するために、５μｇ／ｍＬのＦｐガラクトサミニダーゼを１００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ範囲（５．８〜８．０）および２００μＭのＧａｌＮ−α−ｐＮＰとともにインキュベートし、ｐＮＰ放出から生じる（４０５ｎｍにおける）吸収をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ（商標））により３７°Ｃで１時間モニタした。
５μｇ／ｍＬのＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよび５０μＭのＡ抗原サブタイプＩｐｅｎｔａ−ＭＵを、１０分間、３７°Ｃ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中で、種々のｐＨ範囲（５．８〜１０．０）でプレインキュベートした。反応を、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、１００μＭ ＥＤＴＡ、５μｇ／ｍＬ Ｆｐガラクトサミニダーゼ、５０μｇ／ｍＬ ＳｐＨｅｘ、５０μｇ／ｍＬ ＡｆｃＡおよび５０μｇ／ｍＬ ＢｇａＣ、最終容量１００μｌでクエンチした。加水分解によるＭＵ放出から生じる蛍光シグナル（３６５／４３５ｎｍ）を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ（商標））によって３０分間、３７°Ｃでモニタした。
タンパク質の安定性
ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ及びＦｐＧａｌＮａｓｅを１ｘＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、４°Ｃで保存した。２週間後及び１２週間後に、Ａ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵに対する最適ｐＨについて記載したように、ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼとＦｐＧａｌＮａｓｅに対するＧａｌＮ−α−ｐＮＰとの結合酵素反応で酵素活性を試験した。
ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ阻害
ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼを、結合アッセイとして、９６ウェルプレートフォーマットにおいて、異なる可能性のある阻害剤に対して試験した。１００μＬスケールで、３７°Ｃにおいて、５０μＭのＡ抗原サブタイプ１ｐｅｎｔａ−ＭＵおよび５μｇ／ｍＬのＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼを用いて、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４において、１０μｇ／ｍＬのＦｐガラクトサミニダーゼ、５０μｇ／ｍＬのＳｐＨｅｘ、５０μｇ／ｍＬのＡｆｃＡ、５０μｇ／ｍＬのＢｇａＣと反応を行った。阻害剤として、ＥＤＴＡ（１、１０、１００μＭ）、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（１、１０、１００、１０００μＭ）、ＤＭＳＯ（２％、４％）、プロテアーゼインヒビターカクテルＥＤＴＡフリー（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））（１ｘ、２ｘ、および４ｘ）を試験した。蛍光（３６５／４３５ｎｍ）を、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１（商標）プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ（商標））を用いて１時間連続的にモニタした。強い効果を示す添加剤を結合酵素なしで再試験し、生成物形成をＴＬＣで分析した。
限定分解
Ｆｐガラクトサミニダーゼのより小さく安定なサブドメインがあるかどうかを調べるために、限定的なタンパク質分解を行った。Ｆｐガラクトサミニダーゼをサーモリシン（タンパク質：プロテアーゼ質量比１０：１）で種々の温度（２０°Ｃ、３７°Ｃ、４２°Ｃ、５０°Ｃ、および６５°Ｃ）で１．５時間処理した。次いで、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、安定な断片を（最初の１１８ｋＤａから）約７０ｋＤａで泳動して同定し、ほぼ完全な分解が５０°Ｃのインキュベーション温度で達成された。この断片はペプチド同定のためにＵＢＣプロテオミクスコア施設に送られ、アミノ酸６９０〜７００間の切断部位を有する全長タンパク質のＣ末端切断型であると決定された。
グリカンアレイスクリーニング
グリカンアレイスクリーニングのために、５００μｇのＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＿Ｄ ２ｅｘｔを、Ｆｌｕｏｒｏｔａｇ（商標）ＦＩＴＣ結合キット（Ｓｉｇｍａ（商標））を用いてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でＦ／Ｐ比１で標識した。スクリーニングは、５および５０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度に対して６回の反復で６００個のグリカンから構成されたＣＦＧのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇｌｙｃａｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（商標）バージョン５．３の印刷されたアレイで実施された。結合モチーフの分析は、エモリー大学 （ｈｔｔｐｓ：／／ｇｌｙｃｏｐａｔｔｅｒｎ．ｅｍｏｒｙ．ｅｄｕ／）のウェブツールを用いて行った。
緩衝細胞外溶液中での酵素試験
精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ酵素（配列番号５）および精製ガラクトサミニダーゼ酵素（配列番号１０）を含む組成物を用いて、緩衝細胞外溶液ＰＢＳ、Ｓｔｅｅｎ（商標）、およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）との適合性をそれぞれ３７°Ｃ、３７°Ｃおよび４°Ｃで試験した。ヒトＡ型赤血球（ＲＢＣ）を、ＰＢＳ、Ｓｔｅｅｎ（商標）、およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）中において様々な酵素組成物の用量でインキュベートして、赤血球からＡ抗原を切断する酵素の能力を測定した。１％ ＲＢＣ溶液を、ＰＢＳ、Ｓｔｅｅｎ（商標）、およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）溶液中において様々な用量の酵素で処理し、処理終了時の抗原除去のレベルをフローサイトメトリーによって分析した。
動脈生検の免疫組織化学的分析
精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ酵素（配列番号５）および精製ガラクトサミニダーゼ酵素（配列番号１０）を含む酵素組成物の用量増加効果を試験するために、ＳＴＥＥＮ（商標）溶液中のＡ型ヒト動脈を試験するために使用し、未処理（コントロール）、処理（処理）Ａ型動脈およびネガティブコントロールとしてのＯ型動脈から採取した生検の免疫組織化学的分析によって、Ａ型抗原の割合を定量した。面積定量ソフトウェアを使用し、下記式を使用してコントロール群に対して正規化した。
Ｏ型群で定量化されたＡ型抗原の残存陽性レベルにより、プロセス中に生じたアーティファクトが説明される。
ヒト動脈に対する酵素処理をヒト肺動脈において試験した（静的処理）。この場合の用量は、ＳＴＥＥＮ（商標）溶液の体積に対する酵素の重量の単位として調製された。動脈を生検し、処理し、ＣＤ３１（内皮細胞を染める）とＢＴＡ（血液型Ａ抗原を染める）とによる二重染色による免疫組織化学により分析した。ヒト動脈に対して４時間の酵素処理を１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの両方で行った。酵素を用いずに処理した動脈（コントロール）および酵素を用いて処理した動脈（処理）の２０倍の倍率での動脈生検の免疫組織化学的染色を画像化する。ＣＤ３１は内皮細胞（血管）の位置を示し、ＢＴＡは血液型Ａ抗原の位置を示した。未処理動脈のＢＴＡは内皮細胞（ＣＤ３１陽性）と共に存在し、 ＢＴＡは処理動脈には存在しなかった。
ヒトドナー肺試験
ｅｘ ｖｉｖｏで灌流したヒトドナー肺に対する１時間の酵素処理の効果に対して、Ａ型抗原の発現レベルは、肺組織生検の免疫組織化学的分析および、以下の式を使用して処理前生検に対して正規化された面積定量ソフトウェアを使用して定量化された。
ｅｘ ｖｉｖｏ灌流ヒトドナー肺に対する１時間および３時間の酵素処理（すなわち、精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ酵素（配列番号５）および精製ガラクトサミニダーゼ酵素（配列番号１０）を含む酵素組成物）の効果を試験した。生検したヒトドナー肺の免疫組織化学的染色を２０倍で画像化し、酵素組成で処理した肺の影響を測定した。ＣＤ３１は内皮細胞（血管）の位置を示す。ＢＴＡは血液型Ａ抗原の位置を示す。処理前画像により、血液型抗原が血管と気道の両方に局在することが示された。肺の右上部依存性（ＲＵＤ）、右上部非依存性（ＲＵＮＤ）、右中央非依存性（ＲＭＮＤ）、右中央依存性（ＲＭＤ）、右下部非依存性（ＲＬＮＤ）、右下部依存性（ＲＬＤ）領域の処理後画像では、血液型Ａ抗原は血管に存在しない。
本研究では、２つの別々のｅｘ ｖｉｖｏで灌流したヒトドナー肺を試験し、その結果を、それぞれ１時間および３時間に対応して図１０および図１１に示す。
（実施例）
実施例１：メタゲノムライブラリの構築およびスクリーニング
実施例１：メタゲノムライブラリの構築およびスクリーニング
ＡＢ＋血液型の男性ドナーが提供した糞便試料から抽出したＤＮＡの大きな（３５〜６５ ｋｂ）フラグメントを含むメタゲノムライブラリを構築した。このようなライブラリは、細菌当たり複数の遺伝子を含み、これらの遺伝子の少なくともいくつかの発現の確率を高め、複数の遺伝子の小さな「経路」の発現を可能にする。本発明者らのライブラリは、約１９，５００クローンを５１×３８４ウェルプレートに含み、約８０万遺伝子である可能性があり、従って、高価なＡ抗原基質を用いたそのようなライブラリの初期スクリーニングは実用的ではなかった。むしろ、単純で高感度の蛍光発生基質であるガラクトースとＮ−アセチル−ガラクトサミンのメチルウンベリフェリルα−グリコシド（Ｇａｌ−α−ＭＵおよびＧａｌＮＡｃ−α−ＭＵ）を用いてスクリーニングした。この二つの基質を混合した最初のスクリーニングでは、２２６ヒットのサブセットが得られた。これらを各々の個々の基質に対して再スクリーニングし、４４をＧａｌＮＡｃａｓｅで、１６６をガラクトシダーゼ活性で同定した。第二ラウンドのスクリーニングは、図１に示されるＡ抗原およびＢ抗原四糖グリコシド基質を用いて、基質が存在しないコントロール群と共に、結合酵素アッセイ（Ｋｗａｎ ２０１５）を用いて、これらのヒットについて実施した：最初のＧａｌまたはＧａｌＮＡｃが切断された場合にのみ、結合酵素が作用し、ＭＵを放出することができる。これらのヒットのうち１１個は、Ａ抗原切断活性を含み、そのうちの一つは、Ｂ抗原も切断したが、一方で基質の非存在下で、６個は蛍光を生成し、したがって、無関係な蛍光産物を生成する経路をコードする。
実施例２：ヒットのシークエンスおよび初期分析
１１個のプラスミドをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（商標）上で配列決定し、ＣＡＺｙ（商標）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）（Ｌｏｍｂａｒｄ ２０１４）に存在するＯＲＦｓをＭｅｔａｐａｔｈｗａｙｓ（商標）ソフトウェア（Ｋｏｎｗａｒ ２０１５）を用いて同定した。現在利用可能なヒトマイクロバイオーム配列決定のかなりの深さのために、すべてのフォスミドが由来する生物を同定することができた。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の二種のゲノムの重複断片に由来する１１種のうちの８種から、それらの配列は５つのクラスターに分類できた。クラスターＢのすべてのフォスミドに共通な唯一の遺伝子はＧＨ１０９酵素（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ）である。クラスターＡはＧＨ１０９ （Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）も含んでいるが、ＧＨ１０９は他のバクテロイデス由来のフォスミド（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ）に見られる唯一のＣＡＺｙ遺伝子である。偏性嫌気性菌フラボニフラクター・プラウティ（Ｌｉ ２０１５）由来のフォスミドＮ０８はＣＡＺｙ内に見られる三つのＯＲＦ，すなわち見かけの糖鎖結合モジュールＣＢＭ３２と二つの潜在的グリコシドヒドロラーゼＧＨ３６とＧＨ４を含む。最後にコリンゼラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）ｓｐ．、おそらくＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ｔａｎａｋａｅｉ由来のフォスミドＫ０５はＣＡＺｙ関連ＯＲＦを含まない。ここでは、フォスミドＫ０５のサブライブラリの生成により、Ａ切断活性を有するＯＲＦの同定が可能となり、後にＧＨ３６（表示しない）として同定された。
実施例３：ＧＨ１０９酵素の分析
ＧＨ１０９ファミリーは、そのメンバーのうちのいくつかのＡ抗原切断活性に基づいて見出された。これらの酵素は、通常とは異なるＮＡＤ＋依存性機構を用いるものであるが、この機構は、当該機構を示したＧＨ４ Ａｄｄ Ｙｉｐ Ｒｅｆ（２００４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，８３５４−８３５５における酵素で最初に発見された（Ｖａｒｒｏｔ ２００５およびＬｉｕ ２００７）。ここで同定した３つのＧＨ１０９遺伝子をシグナルペプチドの除去後にＨｉｓタグを付してクローニングし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた。これら三つのタンパク質、ＢｓＧＨ１０９、ＢｖＧＨ１０９＿１およびＢｖＧＨ１０９＿２（表示しない）を、標準としてのＥｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来の標準的なＧＨ１０９（ＥｍＧＨ１０９）（Ｌｉｕ ２００７）と共に精製し、それぞれについて動態パラメータを決定した。３つの新規酵素は、試験した３つのＡサブタイプ基質のそれぞれと同様の触媒効率を示し、主にＥｍＧＨ１０９標準の動態パラメータを反映した。対照的に、承認されたＭＴＳカードを用いてＡ＋ＲＢＣでそれらのＡ抗原切断活性が試験されたとき、残念ながらＥｍＧＨ１０９のみが有意な活性を示した。試験は、クラウディング剤としてのデキストラン４０Ｋの存在下で行ったが、当該クラウディング剤は細胞表面に酵素を集結させることにより活性を増加させることが示されている（Ｃｈａｐａｎｉａｎ ２０１４）。それが存在しない場合、１５０ｕｇ／ｍＬのＥｍＧＨ１０９であっても効果を示さなかったが、３００ｍｇ／ｍＬのデキストラン４０Ｋの存在下では、１５μｇ／ｍＬの酵素で十分であった（図３および４参照）。以前の研究においては、低イオン強度もまた細胞上のＥｍＧＨ１０９の活性を高めることを示している（Ｌｉｕ ２００７）。したがって、ＥｍＧＨ１０９は血液全体においては効果的ではない。
実施例４：Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ｓｐ．由来のフォスミドＫ０５由来のＧＨ３６の分析
フォスミドＫ０５中に同定されたＧＨ３６タンパク質（Ｋ０５ＧＨ３６という名前）はＧａｌＮＡｃ−α−ＭＵとＡ抗原四糖に対して活性を示した。これは、主にα−ガラクトシダーゼとα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを含み、共有結合β−グリコシル酵素中間体を含む二重置換機構により加水分解を行う（ｃｏｍｆｏｒｔ ２００７）ＧＨ３６ファミリーの一員であることと一致する。系統発生解析により、その配列はＧＨ３６サブファミリーのクラスター４内に配置された（Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄ ２０１１）。興味深いことに、このクラスターは、Ａ抗原構造を切断することも知られているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来の特徴づけられたＧＨ３６も近接して含んでいる（Ｃａｌｃｕｔｔ ２００２）。しかし、赤血球からＡ抗原を除去するＫ０５ＧＨ３６の能力を試験したところ、その活性は期待外れであり、クラウディング剤と併用した場合でも３しかスコア付けされなかった。
実施例５：フラボニフラクター・プラウティ由来のフォスミドＮ０８の分析
これらの新規酵素は利点を提供しないので、Ｆ．プラウティ由来のＮ０８フォスミドに注目したが、それは、特にその遺伝子産物がＡ抗原とＢ抗原の両方を切断するためである。三つのＣＡＺ関連遺伝子を複製し、それらのシグナルペプチド配列を除去し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、得られた酵素を１４０ｍｇ／Ｌまでの収率で精製した。驚くべきことに、ＡおよびＢ四糖類基質に対して個々の精製タンパク質を試験したとき、観察された唯一の切断はＮ０８ＧＨ３６によるＢ抗原の切断のみであり、それらのいずれによるＡ抗原の切断もなかった。このため、これらの酵素の対の組み合わせを試験し、Ｎ０８ＣＢＭ３２とＮ０８ＧＨ３６の混合物がＡ抗原四糖類を迅速に切断することを発見したことに驚いた。個々の酵素との反応混合物のＴＬＣ分析により、Ｎ０８ＣＢＭ３２が、より極性を有するが、依然としてＵＶ活性を有する生成物へのＡ抗原の変換を触媒することが明らかにされ、一方で、その後のＮ０８ＧＨ３６の添加により、Ｈ抗原三糖類と共にガラクトサミンと共移動する糖生成物が放出された。反応混合物のＭＳ分析により、Ｎ０８ＣＢＭ３２がＡ抗原デアセチラーゼであることが示され、従って４２ｍ／ｚおよび、より極性を有する生成物の減少であり、一方で、Ｎ０８ＧＨ３６はガラクトサミニダーゼであり、このファミリーにおける新しい活性を有することが示された（図２）。これは反応の高速陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）分析（図５）によってさらに確認され、両酵素によるＡ抗原の処理はガラクトサミンを放出するが、個々の酵素によっては放出しないことを示した。同様の結果は胃粘素基質でも得られたが、この酵素はおそらくこの基質に対して進化したと思われる。したがって、この２つの酵素は、以後、ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ（ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ）およびＦｐガラクトサミニダーゼ（ＦｐＧａｌＮａｓｅ）と呼ばれる。
Ａ抗原分解のこの経路は、これまで特徴づけられていなかったが、興味深いことに、５０年以上前にいわゆる「後天性」Ｂ現象の説明として示唆されていた。この現象では、クロストリジウム・テルチウムに感染したＡ型患者は、テムズ川に沈められたヒト組織の法医学的サンプルと同様に（Ｒｅｆ Ｊｕｄｄ ａｎｄ Ａｎｎｅｓｌｅｙ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０８８７−７９６３（９６）８００８７−３，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９６）１０，１１１−１１７）、血液型がＢ型に明らかに変化した（Ｇｅｒｂａｌ １９７５）。これはおそらく、タイピングに用いた抗Ｂ抗体が末端のＧａｌとＧａｌＮを区別できなかったためであろう。
フォスミドの３番目の酵素であるＧＨ４を調べたところ、それはＧａｌ−α−ｐＮＰ、ＧａｌＮ−α−ｐＮＰおよびＧｌｃＮ−α−ｐＮＰを加水分解するが、Ａ抗原に基づく基質を切断しないことがわかった。したがって、それはＡ抗原の変換に直接関与していないようである。しかしながら、これらのグリコサミニダーゼはＧＨ４ファミリー内において新しい活性を示す。
実施例６：ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの特性評価
Ｐｈｙｒｅ２（商標）（Ｋｅｌｌｅｙ ２０１５）によるこの遺伝子のより詳細な生物情報学的分析により、Ｎ末端においてこれまで機能が未知であった約３０８アミノ酸ドメインおよびＣ末端近くの約１４５アミノ酸ＣＢＭ３２、そしてその間にリンカー領域を有することが示された。未加工のデアセチラーゼドメインを含む全ての構築物が実際に触媒活性を示したことから（表２）、切断分析により、この基本構造が確認された。従って、このタンパク質は、新しい糖鎖エステラーゼファミリー、ＣＥｘｘの創始メンバーとして分類される。
アセトアミド糖デアセチラーゼはすべて二価金属イオンを必要とする金属酵素であることが証明されている（Ｂｌａｉｒ ２００５）。このことと一致して、１００μＭのＥＤＴＡで処理すると、酵素活性はほとんど消失したが、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋またはＺｎ２＋の添加では増加した。（非金属）アミダーゼの他の阻害剤は効果がなかった。本酵素の最適ｐＨは８付近（図６）で、基質特異性は狭く、異なるＡサブタイプとそれより短いバージョンに限定されていた。しかし、これらのサブタイプの中では、それはあまり区別できず、これらのサブタイプのすべての間で、比活性に約２倍の差があるにすぎない（表２）。このようなｐＨ依存性および特異性プロファイルは、Ａのすべてのサブタイプが脱アセチル化されているが、それ以外のものはないため、ＲＢＣ変換に理想的である。
タンパク質のＣＢＭ部分の特異性は、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ＣＦＧ）のグリカンアレイを用いて検討した。好ましい標的は、ＣＢＭ３２ファミリーの創設メンバー、つまりクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｆｉｃｋｏ−Ｂｌｅａｎ ２００６）についても見られるように、反復Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）構造を有するグリカンであった。しかし、ＣＢＭとは異なり、我々の組成物は血液抗原構造に高親和性結合を示さない。反復ＬａｃＮＡｃ構造は、いくつかのＯ−グリカンおよび糖脂質と同様に、複合体およびハイブリッドＮ‐グリカンの一般的成分として細胞表面の共通成分である（Ｃｏｈｅｎ ２００９）。われわれの場合、これらはおそらくデアセチラーゼドメインが結合するためのアンカーポイントとして働いている。これにより、その触媒ドメインは、それ自身の基質と競合することなく、Ａ抗原に近接するようになる。このモデルを支持するように、ドメインを除去すると、可溶性基質の切断速度に影響することなくＲＢＣの活性が低下した（表２）。
実施例７：ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの結晶解析
この新規酵素活性に対する構造的洞察を提供するために、切断されたタンパク質を結晶化試験に供し、ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＿Ｄ１ｅｘｔが最良の分解能に回折する結晶を生成することを見出した。この構造の溶液により、Ｄ１００とＨ２５２により配位結合した二価金属イオンを含む活性部位を有する５回のβプロペラ構造を採用する触媒ドメインが明らかになった。反応生成物の類似体としてのＢ抗原三糖類と酵素の共結晶化により、その結合様式が明らかになった。活性部位ポケットの基部で、Ａ抗原とＢ抗原の区別基である非還元末端ガラクトシル部分は、Ｈ９７、Ｅ６４および２つの金属配位水と水素結合相互作用をする。残りの配位子は表面露出し、フコシル基とＳ６１及びＤ１２１側鎖間の極性相互作用が同定される。還元末端ガラクトシル部分のＣ１−ＯＨ基は溶媒にさらされているので、基質への伸長（すなわちＧｌｃＮＡｃにおいて）は酵素によって容易に調節される。Ａ−三糖類のＮ−アセチル基をこの構造上にモデル化することにより、基質の脱アセチル化に関与する可能性のある近傍アミノ酸の合理的な変異を作ることができた。残基Ｅ６４は両変異体が不活性であることから活性に重要であることが判明し、おそらく求核性水分子の活性化において直接的役割を示すことが示唆される（表１）。二価金属Ｄ１００、Ｙ３１５およびＨ２５２を配位する残基も重要であることが判明し、約５０００倍の速度低下をもたらすいずれの変異も、二価金属イオンの結合におけるそれらの見かけの役割と一致している。他のアセトアミド糖デアセチラーゼから類推して、ＦｐＧａｌＮＡｃデアセチラーゼがカルボニルを分極し、カルボニルへの求核攻撃のための水分子を活性化して四面体中間体を形成する機構により加水分解を行うことを我々は提案する。この中間体の分解はＨｉｓ１００による糖窒素原子へのプロトン供与によって促進される。
表１｜Ａ抗原Ｔｙｐｅ２ｔｅｔｒａ−ＭＵの切断に対するＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＿Ｄ１ｍｉｎのその変異体の比活性
実施例８：ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃおよびＦｐＧａｌＮａｓｅの特性評価
配列の系統発生的解析において、ＦｐＧａｌＮａｓｅはＧＨ３６ファミリーの新しいサブグループ（５）に配置された（Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄ ２０１１）。３９０のアミノ酸触媒ドメインは、この大きな（１０７９のアミノ酸）タンパク質の中心に位置し、Ｃ末端に潜在的な糖鎖結合ドメインを有する。このＣ末端ドメインの除去は、可溶性基質による酵素の動態パラメータに影響を及ぼさなかったが（表２）、脱アセチル化Ａ＋ＲＢＣの切断効率を低下させた。この酵素はガラクトサミン含有糖に特異的であり、試験されたどのような状況でもＧａｌＮＡｃ残基を切断しない。しかしながら、それは単純なアリールグリコシドＧａｌＮ−α−ｐＮＰから高次のものにわたる脱Ｎ−アセチル化ガラクトサミニドの切断に対してかなり広い特異性を有する。実際、（表２）試験した三つのＡサブタイプのｋｃａｔ／ＫＭ値は、すべて互いに類似しており、またデアセチラーゼの値と類似していた。Ｂ抗原の切断に対するｋｃａｔ／ＫＭの値は、対応するＧａｌＮ抗原に対する値よりも２０００倍以上低かったが、それにもかかわらず、元のスクリーン上でポジティブヒットを生じさせるには十分であった。脱アセチル化αガラクトース構成基質に対するこの特異性は、その最適ｐＨが約６．５〜７．０であることと相まって、デアセチラーゼとともに血液型変換に用いるのに適している（図６）。
表２｜異なる抗原基質に対するＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃおよびＦｐＧａｌＮａｓｅ構築物の動態パラメータ
実施例９：ＲＢＣからのＡ抗原の切断
Ａ＋、Ｂ＋及びＯ＋型ＲＢＣをＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ及びＦｐＧａｌＮａｓｅそれぞれと及び混合物としてインキュベートし、放出された糖をＨＰＡＥ−ＰＡＤイオンクロマトグラムで分析した。個々に使用した酵素はいずれも糖生成物を放出しなかった。しかし、両者の混合物を用いると、ガラクトサミンはタイプＡ＋ＲＢＣからは明らかに放出されたが、Ｂ＋またはＯ＋からは放出されず、Ａ抗原に対してのみ高い特異性を示した。他の状況ではＧａｌＮＡｃがＲＢＣ表面から放出されないことを示すため、これは非常に重要である。ＦｐＧａｌＮａｓｅの切断型も有効であったが、活性はやや低かった。
次に、業界標準のＭＴＳ（商標）カードを使用して、ＲＢＣから抗原を除去する試験を行った。これらの抗体結合カラムにＲＢＣを負荷し、遠心機で遠心する。抗原を含まないＲＢＣはカラムの底部に移動して０としてスコア化されるが、対応する抗原を含む未処理のＲＢＣは上部に付着して４としてスコア化され、その中間スコアで抗原除去の程度がランク付けされる。ＦｐＧａｌＮａｓｅ単独処理では、（表３）の濃度で、ＡまたはＢ抗原性を除去しなかったが、これは、ＧａｌＮＡｃ基質に対する不活性およびＧａｌに対する低活性と一致する。ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃとのインキュベーションは、アセトアミドのアミンへの変換による抗原性を除去し、使用される抗Ａ抗体の結合を弱める。完全な抗原脱アセチル化に必要な最小量の酵素を、 ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ単独およびＦｐＧａｌＮａｓｅとの併用で、クラウディング剤としてデキストラン３００ｍｇ／ｍｌの有無の両方で評価した。３μｇ／ｍｌまでのＦｐＧａｌＮａｓｅの量はデキストランなしで十分であったが、３００ｍｇ／ｍｌのデキストランを含有することで、必要な負荷は０．５μｇ／ｍｌまで減少した（表３）。従来の最良の酵素ＥｍＧＨ１０９は、低塩緩衝液を使用しない限り、デキストランの非存在下では効果がなかったが、デキストランの存在下では最小有効濃度は１５μｇ／ｍｌであり、これは３０倍高い負荷であった。ＣＢＭを欠くＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃのバージョンは、はるかに効果が低かった。
表３｜Ａ＋、Ｂ＋およびＡＢ＋ＲＢＣをＥｍＧＨ１０９、ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃおよびＦｐＧａｌＮａｓｅで処理した場合のＭＴＳカードの結果
ＭＴＳ（商標）カードテストはＡ抗原の完全な変換を評価しないため、またＧａｌＮ抗原を検出するための抗体が利用できなかったため、処理したＲＢＣ上で新たに形成されたＨ抗原の検出に焦点を当てた。ＦｐＧａｌＮａｓｅはわずか５μｇ／ｍｌの濃度で機能的であり、図３に見られるＦＡＣＳ分析によって確認されるように、Ａ抗原の損失と同時にＨ抗原レベルの増加をもたらした。抗Ｈ抗体の存在下での凝集時間を測定することにより、数名のＡ＋ＲＢＣドナーに対する両酵素の機能性、また全血反応条件において、他の血液変換酵素では達成できなかった能力を実証した。このように、この酵素対は、従来の最良の酵素に必要とされるよりもはるかに低い酵素負荷量で、Ａ＋ＲＢＣをＯ型「全般的ドナー」ＲＢＣに変換する。しかしながら、これらのＲＢＣを患者に輸血する前に、遠心分離後に細胞の洗浄によることが最もあり得るが、変換に使用される微量の酵素を有害な免疫反応を回避するために全て除去することが推奨される。これが達成され得ることを確認するために、ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ及びＦｐＧａｌＮａｓｅの蛍光標識試料でＡ＋ＲＢＣを処理し、次いで、ＦＡＣＳ分析を用いて、実際に単純な洗浄が有効であることを確認した（図３）。
産生されたＡ−ＥＣＯ ＲＢＣのさらなる特性評価は、輸血医学において使用するためのそれらの完全な実行可能性を評価するために有用であるかもしれないが、献血を収集する間を可能性として、血漿に直接酵素を含める可能性は、プロセスを離れて、血液採取保存の既存の自動化ルーチンへの容易かつコスト効率的な実装を可能にするかもしれない。特に、表４に示すように、酵素の安定性を試験した。
表４：ガラクトサミニダーゼおよびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの保存安定性
表４：ガラクトサミニダーゼおよびＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの保存安定性
実施例１０：クロストリジウム・テルチウム由来のＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼ融合体
類似酵素の探索において、ＣＢＭ（ＧＨ３６ドメイン−ＣＢＭ−脱アセチル化ドメイン） で連結したガラクトサミニダーゼとＧａｌＮＡｃデアセチラーゼの新規なクロストリジウム・テルチウム自然融合体を同定した。最初の試験では、この酵素が赤血球のＡ抗原を切断することが示されたが（最初に脱アセチル化、次にガラクトサミン切断という同じ機構）、それほど効率的ではなかった（つまり、ＥｍＧＨ１０９と同様）。クロストリジウム・テルチウム脱アセチル化ドメインは、Ｆ．プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼほど効率的ではないが、Ｆ．プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼで補助すると、クロストリジウム・テルチウムガラクトサミニダーゼドメインは、赤血球上でＦ．プラウティガラクトサミニダーゼと同様の活性を示す。
実施例１１：代替ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼ酵素
データは、クロストリジウム・テルチウム、ガラクトサミニダーゼ（Ｃｔ５７５７＿ＧａｌＮＡｓｅ）およびＲｐ１０２１が、ＧａｌＮ抗原のＨ抗原への変換（第２の反応段階）に対して同等の酵素活性を有することを示す。
また、代替ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼ酵素のデータも収集し、代替酵素をフラボニフラクター・プラウティのＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびフラボニフラクター・プラウティのガラクトサミニダーゼと比較した。表５に示されるように、処理されたＡ ＲＢＣ上の抗Ａ抗体についてのＭＴＳスコアは、ガラクトサミニダーゼとＧａｌＮＡｃデアセチラーゼとのクロストリジウム・テルチウム自然融合体について示され、これは、Ａ抗原を効果的に切断するためにデキストランの存在を必要とし、また、フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼ（ＦｐＧａｌＮａｓｅ）と組み合わせると、良好な活性（Ｃｔ５７５７＿ＤｅＡｃａｓｅ）を示す。また、表６において、データは、ロビンソニエラ・ペオリエンシス（Ｒｐ）Ｒｐ３６７２およびＲｐ３６７１が、ＲＢＣ上のＡ抗原を脱アセチル化することができるが、ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃａｓｅよりも効率が低く、活性がクラウディング剤（すなわち、デキストラン４０ｋ）の存在下でのみ達成されたことを示す。
表５：処理されたＡ ＲＢＣ上の抗Ａ抗体のＭＴＳスコア
表６：ロビンソニエラ・ペオリエンシス（Ｒｐ）３６７１および３６７２のＭＴＳスコア
図７は、（Ａ）Ａ＋ＲＢＣコントロール、（Ｂ）フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ（ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ）＋フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼ（ＦｐＧａｌＮａｓｅ）（１０μｇ／ｍＬ）、（Ｃ）ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＋クロストリジウム・テルチウム（Ｃｔ）Ｃｔ５７５７＿ＧａｌＮａｓｅ（１０μｇ／ｍＬ）、および（Ｄ）ＦｐＧａｌＮＡｃＤｅＡｃ＋ロビンソニエラ・ペオリエンシス（Ｒｐ）ガラクトサミニダーゼ（Ｒｐ１０２１）ＧａｌＮａｓｅ（１０μｇ／ｍＬ）について、ＦＡＣＳ選別によって分析されたＡ抗原のＡ ＲＢＣｓ上のＨ抗原への変換を示す。データは、クロストリジウム・テルチウム（Ｃｔ）Ｃｔ５７５７＿ＧａｌＮａｓｅおよびロビンソニエラ・ペオリエンシス（Ｒｐ）ガラクトサミニダーゼ（Ｒｐ１０２１）ＧａｌＮａｓｅは、ＧａｌＮ抗原のＨ抗原への変換に対して（第２の反応段階）フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼと同程度の酵素活性を示す。
実施例１２：酵素組成物と灌流／保存流体との適合性
酵素組成がＥＶＬＰ系と適合することを確認するために、最初に臓器灌流／保存流体（ＳＴＥＥＮ（商標）およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）、ＸＶＩＶＯ灌流）中の酵素（配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質および配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質）の機能を試験した。適合性は、３７°ＣのＳＴＥＥＮ（商標）または４°ＣのＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）中における赤血球上の血液型Ａ抗原を除去する酵素組成物の能力に基づいて評価された。ＰＢＳが血液処理に使用される標準溶液の一つであるため、３７°Ｃのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が比較群として使用された。ＳＴＥＥＮ（商標）およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）について検討した温度は、臨床診療における作業温度を基にした。抗原除去レベルはフローサイトメトリーにより分析した。臓器における適切な用量の予測に役立てるため、ＳＴＥＥＮ（商標）およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）における用量増加試験が実施された（図８参照）。試験全体を通して用いられる用量の単位は、溶液の体積（ｍＬ）に対する酵素の重量（μｇ）として定義される。
酵素組成物は、ＳＴＥＥＮ（商標）およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）灌流／保存流体に完全に適合し、灌流／保存流体は、ＰＢＳに比べて酵素組成物の効率を高めることが示された。酵素組成物は、総酵素濃度１μｇ／ｍＬでＳＴＥＥＮ（商標）およびＰｅｒｆａｄｅｘ（商標）中の抗原の９０％以上を除去することができたが、ＰＢＳ中では同じ効果が４μｇ／ｍＬの用量で達成された（図８）。
実施例１３：ヒト動脈の静的処理
組織レベルでの酵素（配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質および配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質）の有効性を試験するために、ヒト動脈のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いた。同じヒトドナーの肺動脈をコントロール群（ＳＴＥＥＮ（商標）溶液）と処理群（酵素組成物＋ＳＴＥＥＮ（商標）溶液）に分け、３７°Ｃで４時間静的にインキュベートした。両群ともインキュベーション終了時に生検を行った。酵素組成物を１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬ投与した。血液型抗原の変化を免疫組織化学的に分析した。生検の連続切片をＣＤ３１（内皮細胞のマーカー）で二重染色して血管内面の位置を示し、ＢＴＡで血液型抗原の発現を示した。
処理群の血液型Ａ抗原の発現レベルはコントロール群に比べて有意に低下した。１μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬの用量効果は処理動脈と同様であった。酵素の総濃度（用量）が１μｇ／ｍＬよりも低ければ、酵素も作用する可能性がある。ＢＴＡの染色画像をＣＤ３１と比較したところ、血液型抗原の消失を確認した（図９）。
実施例１４：ヒト肺のｅｘ ｖｉｖｏ灌流
ヒト臓器（例えば肺）における組織血液型抗原の除去における酵素含有ＳＴＥＥＮ（商標）溶液の有効性をＴｏｒｏｎｔｏ ＥＶＬＰ設定で試験した。ヒトドナーの肺を臨床的ｅｘ ｖｉｖｏ肺灌流（ＥＶＬＰ）で評価し、移植に不適当であり、従って酵素組成の試験に適していると決定された。肺が低下した後、酵素組成物（配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質および配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質）をＳＴＥＥＮ（商標）灌流流体に添加して処理を開始した。用量は１μｇ／ｍＬとした。処理前後に生検を行った。血液型抗原の発現変化を免疫組織化学的に解析した。肺の機能と生理も実験期間中１時間ごとにモニタし、処理による急性の副作用がないことを確認した。
ヒト肺では、単肺ＥＶＬＰで１．５Ｌ、両肺ＥＶＬＰで２Ｌの灌流液が必要である。右単肺ＥＶＬＰの最初の試験（図１０）では、酵素組成物１．５ｍｇを灌流流体に加えて１μｇ／ｍＬとした。肺を１時間処理した。免疫組織化学的分析により、処理後の血液型Ａ抗原量の著しい低下が示された（図１０）。血液型抗原と血管を二重染色した処理前生検の切片を比較すると、肺の抗原は血管壁の表面だけでなく気道にも局在していた。二重染色した処理後生検の比較により、血管内抗原が効果的に除去されたことが示される。
第２の試験（図１１）では、右単肺ＥＶＬＰをＳＴＥＥＮ（商標）灌流流体中１．５ｍｇの酵素組成物で処理して１μｇ／ｍＬの濃度とした。肺を３時間処理した。免疫組織化学的分析により、血液型Ａ抗原の発現レベルが著しく低下していることが示された。血液型抗原と血管を二重染色した処理前生検を比較すると、肺の血液型抗原は血管表面だけでなく気道にも局在していた（図１１）。二重染色した処理後生検の比較により、血管内抗原が効果的に除去されたことが示される（図１１）。酵素処理開始後の肺の生理および機能に急性の副作用は観察されなかった。
結果により、１μｇ／ｍＬの用量で、灌流したヒト肺において酵素が１時間以内に効果を示すことが示される。
本明細書では、本発明の様々な実施形態が開示されているが、本発明の範囲内で、当業者の一般的な知識に従って、多くの適応および修正を行うことができ、そのような修正は、実質的に同じ方法で同じ結果を達成するために、本発明の任意の態様に対する既知の等価物の置換を含む。数値範囲は、当該範囲を規定する数値を包括する。本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、これに限定されない」という語句と実質的に等価な、非限定的用語として使用し、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」 という語は対応する意味を有する。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈において明確に断らない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「物（ａ ｔｈｉｎｇ）」への言及は、複数のそのようなものを含む。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の実施形態の先行技術であることを認めるものではない。本発明は、実施例および図面を参照して、実質的に前述したように、すべての実施形態および変形形態を含む。
（配列）
フラボニフラクター・プラウティＤＮＡ配列を天然に存在するＤＮＡ配列（ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ２３１１／２３１９ｎｔ／ ガラクトサミニダーゼ３２２８／３２３７ｎｔ）から改変した。特に、タンパク質精製に使用される配列の長さに差があり、それによってシグナルペプチドが除去され、Ｎ末端Ｈｉｓタグがベクター骨格を介して付加された。
フラボニフラクター・プラウティＤＮＡ配列を天然に存在するＤＮＡ配列（ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ２３１１／２３１９ｎｔ／ ガラクトサミニダーゼ３２２８／３２３７ｎｔ）から改変した。特に、タンパク質精製に使用される配列の長さに差があり、それによってシグナルペプチドが除去され、Ｎ末端Ｈｉｓタグがベクター骨格を介して付加された。
インフォーマル配列リスト
配列番号２
説明：フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ（タンパク質配列）
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配列番号４
説明：フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ（除去シグナルペプチドタンパク質配列）
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配列番号５
説明：Ｈｉｓタグを有するフラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ （ｐＥＴ１６ａ−タンパク質配列）
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配列番号７
説明：フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼ
ＭＲＧＫＫＦＩＳＬＴＬＳＴＭＬＣＬＱＬＬＰＴＡＳＦＡＡＡＰＡＴＤＴＧＮＡＧＬＩＡＥＧＤＹＡＩＡＧＮＧＶＲＶＴＹＤＡＤＧＱＴＩＴＬＹＲＴＥＧＳＧＬＩＱＭＳＫＰＳＰＬＧＧＰＶＩＧＧＱＥＶＱＤＦＳＨＩＳＣＤＶＥＱＳＴＳＧＶＭＧＳＧＱＲＭＴＩＴＳＱＳＭＳＴＧＬＩＲＴＹＶＬＥＴＳＤＩＥＥＧＶＶＹＴＡＴＳＹＥＡＧＡＳＤＶＥＶＳＷＦＩＧＳＶＹＥＬＹＧＡＥＤＲＩＷＳＹＮＧＧＧＥＧＰＭＨＹＹＤＴＬＱＫＩＤＬＴＤＳＧＫＦＳＲＥＮＫＱＤＤＴＡＡＳＩＰＶＳＤＩＹＩＡＤＧＧＩＴＶＧＤＡＳＡＴＲＲＥＶＨＴＰＶＱＥＴＳＤＳＡＱＶＳＩＧＷＰＧＫＶＩＡＡＧＳＶＩＥＩＧＥＳＦＡＶＶＨＰＧＤＹＹＮＧＬＲＧＹＫＮＡＭＤＨＬＧＶＩＭＰＡＰＧＤＩＰＤＳＳＹＤＬＲＷＥＳＷＧＷＧＦＮＷＴＩＤＬＩＩＧＫＬＤＥＬＱＡＡＧＶＫＱＩＴＬＤＤＧＷＹＴＮＡＧＤＷＡＬＮＰＥＫＦＰＮＧＡＳＤＡＬＲＬＴＤＡＩＨＥＨＧＭＴＡＬＬＷＷＲＰＣＤＧＧＩＤＳＩＬＹＱＱＨＰＥＹＦＶＭＤＡＤＧＲＰＡＲＬＰＴＰＧＧＧＴＮＰＳＬＧＹＡＬＣＰＭＡＤＧＡＩＡＳＱＶＤＦＶＮＲＡＭＮＤＷＧＦＤＧＦＫＧＤＹＶＷＳＭＰＥＣＹＮＰＡＨＮＨＡＳＰＥＥＳＴＥＫＱＳＥＩＹＲＶＳＹＥＡＭＶＡＮＤＰＮＶＦＮＬＬＣＮＣＧＴＰＱＤＹＹＳＬＰＹＭＴＱＩＡＴＡＤＰＴＳＶＤＱＴＲＲＲＶＫＡＹＫＡＬＭＧＤＹＦＰＶＴＡＤＨＮＮＩＷＹＰＳＡＶＧＴＧＳＶＬＩＥＫＲＤＬＳＧＴＡＫＥＥＹＥＫＷＬＧＩＡＤＴＶＱＬＱＫＧＲＦＩＧＤＬＹＳＹＧＦＤＰＹＥＴＹＶＶＥＫＤＧＶＭＹＹＡＦＹＫＤＧＳＫＹＳＰＴＧＹＰＤＩＥＬＫＧＬＤＰＮＫＭＹＲＩＶＤＹＶＮＤＲＶＶＡＴＮＬＭＧＤＮＡＶＦＮＴＲＦＳＤＹＬＬＶＫＡＶＥＩＳＥＰＤＰＥＰＶＤＰＤＹＧＦＴＳＶＤＤＲＤＥＡＬＩＹＴＧＴＷＨＤＤＮＮＡＳＦＳＥＧＴＡＲＹＴＮＳＴＤＡＳＶＶＦＳＦＴＧＴＳＩＲＷＹＧＱＲＤＴＮＦＧＴＡＥＶＹＬＤＤＥＬＫＴＴＶＤＡＮＧＡＡＥＡＧＶＣＬＦＥＡＬＤＬＰＡＡＥＨＴＩＫＩＶＣＫＳＧＶＩＤＩＤＲＦＡＹＥＡＡＴＬＥＰＩＹＥＫＶＤＡＬＳＤＲＩＴＹＶＧＮＷＥＥＹＨＮＳＥＦＹＭＧＮＡＭＲＴＤＥＡＧＡＹＡＥＬＴＦＲＧＴＡＶＲＬＹＡＥＭＳＦＮＦＧＴＡＤＶＹＬＤＧＥＬＶＥＮＩＩＬＹＧＱＥＡＴＧＱＬＭＦＥＲＴＧＬＥＥＧＥＨＴＩＲＬＶＱＮＡＷＮＩＮＬＤＹＩＳＹＬＰＥＱＤＱＰＴＰＰＥＴＴＶＴＶＤＡＭＤＡＱＬＶＹＴＧＶＷＮＤＤＹＨＤＶＦＱＥＧＴＡＲＹＡＳＳＡＧＡＳＶＥＦＥＦＴＧＳＥＩＲＷＹＧＱＮＤＳＮＦＧＶＡＳＶＹＩＤＮＥＦＶＱＱＶＮＶＮＧＡＡＡＶＧＫＬＬＦＱＫＡＤＬＰＡＧＳＨＴＩＲＩＶＣＤＴＰＶＩＤＬＤＹＬＴＹＴＴＮＡ
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配列番号９
説明：フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼ（除去シグナルペプチドタンパク質配列）
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配列番号１０
説明：Ｈｉｓタグを有するフラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼ（ｐＥＴ１６ａ−タンパク質配列）
ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＡＡＰＡＴＤＴＧＮＡＧＬＩＡＥＧＤＹＡＩＡＧＮＧＶＲＶＴＹＤＡＤＧＱＴＩＴＬＹＲＴＥＧＳＧＬＩＱＭＳＫＰＳＰＬＧＧＰＶＩＧＧＱＥＶＱＤＦＳＨＩＳＣＤＶＥＱＳＴＳＧＶＭＧＳＧＱＲＭＴＩＴＳＱＳＭＳＴＧＬＩＲＴＹＶＬＥＴＳＤＩＥＥＧＶＶＹＴＡＴＳＹＥＡＧＡＳＤＶＥＶＳＷＦＩＧＳＶＹＥＬＹＧＡＥＤＲＩＷＳＹＮＧＧＧＥＧＰＭＨＹＹＤＴＬＱＫＩＤＬＴＤＳＧＫＦＳＲＥＮＫＱＤＤＴＡＡＳＩＰＶＳＤＩＹＩＡＤＧＧＩＴＶＧＤＡＳＡＴＲＲＥＶＨＴＰＶＱＥＴＳＤＳＡＱＶＳＩＧＷＰＧＫＶＩＡＡＧＳＶＩＥＩＧＥＳＦＡＶＶＨＰＧＤＹＹＮＧＬＲＧＹＫＮＡＭＤＨＬＧＶＩＭＰＡＰＧＤＩＰＤＳＳＹＤＬＲＷＥＳＷＧＷＧＦＮＷＴＩＤＬＩＩＧＫＬＤＥＬＱＡＡＧＶＫＱＩＴＬＤＤＧＷＹＴＮＡＧＤＷＡＬＮＰＥＫＦＰＮＧＡＳＤＡＬＲＬＴＤＡＩＨＥＨＧＭＴＡＬＬＷＷＲＰＣＤＧＧＩＤＳＩＬＹＱＱＨＰＥＹＦＶＭＤＡＤＧＲＰＡＲＬＰＴＰＧＧＧＴＮＰＳＬＧＹＡＬＣＰＭＡＤＧＡＩＡＳＱＶＤＦＶＮＲＡＭＮＤＷＧＦＤＧＦＫＧＤＹＶＷＳＭＰＥＣＹＮＰＡＨＮＨＡＳＰＥＥＳＴＥＫＱＳＥＩＹＲＶＳＹＥＡＭＶＡＮＤＰＮＶＦＮＬＬＣＮＣＧＴＰＱＤＹＹＳＬＰＹＭＴＱＩＡＴＡＤＰＴＳＶＤＱＴＲＲＲＶＫＡＹＫＡＬＭＧＤＹＦＰＶＴＡＤＨＮＮＩＷＹＰＳＡＶＧＴＧＳＶＬＩＥＫＲＤＬＳＧＴＡＫＥＥＹＥＫＷＬＧＩＡＤＴＶＱＬＱＫＧＲＦＩＧＤＬＹＳＹＧＦＤＰＹＥＴＹＶＶＥＫＤＧＶＭＹＹＡＦＹＫＤＧＳＫＹＳＰＴＧＹＰＤＩＥＬＫＧＬＤＰＮＫＭＹＲＩＶＤＹＶＮＤＲＶＶＡＴＮＬＭＧＤＮＡＶＦＮＴＲＦＳＤＹＬＬＶＫＡＶＥＩＳＥＰＤＰＥＰＶＤＰＤＹＧＦＴＳＶＤＤＲＤＥＡＬＩＹＴＧＴＷＨＤＤＮＮＡＳＦＳＥＧＴＡＲＹＴＮＳＴＤＡＳＶＶＦＳＦＴＧＴＳＩＲＷＹＧＱＲＤＴＮＦＧＴＡＥＶＹＬＤＤＥＬＫＴＴＶＤＡＮＧＡＡＥＡＧＶＣＬＦＥＡＬＤＬＰＡＡＥＨＴＩＫＩＶＣＫＳＧＶＩＤＩＤＲＦＡＹＥＡＡＴＬＥＰＩＹＥＫＶＤＡＬＳＤＲＩＴＹＶＧＮＷＥＥＹＨＮＳＥＦＹＭＧＮＡＭＲＴＤＥＡＧＡＹＡＥＬＴＦＲＧＴＡＶＲＬＹＡＥＭＳＦＮＦＧＴＡＤＶＹＬＤＧＥＬＶＥＮＩＩＬＹＧＱＥＡＴＧＱＬＭＦＥＲＴＧＬＥＥＧＥＨＴＩＲＬＶＱＮＡＷＮＩＮＬＤＹＩＳＹＬＰＥＱＤＱＰＴＰＰＥＴＴＶＴＶＤＡＭＤＡＱＬＶＹＴＧＶＷＮＤＤＹＨＤＶＦＱＥＧＴＡＲＹＡＳＳＡＧＡＳＶＥＦＥＦＴＧＳＥＩＲＷＹＧＱＮＤＳＮＦＧＶＡＳＶＹＩＤＮＥＦＶＱＱＶＮＶＮＧＡＡＡＶＧＫＬＬＦＱＫＡＤＬＰＡＧＳＨＴＩＲＩＶＣＤＴＰＶＩＤＬＤＹＬＴＹＴＴＮＡ
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配列番号１２
説明：クロストリジウム・テルチウム単離タンパク質配列０９９３４５７５７．１−Ｃｔ５７５７（ＣＢＭ（元のタンパク質配列）で連結したガラクトサミニダーゼとＧａｌＮＡｃデアセチラーゼとの融合物）
ＭＫＫＲＩＬＡＴＦＩＴＡＭＣＧＬＧＦＦＳＮＷＴＳＳＮＡＹＮＬＩＤＮＩＳＶＥＫＬＤＴＤＩＳＱＡＮＥＮＶＦＬＮＧＮＧＩＡＬＥＶＤＮＲＧＡＴＣＩＹＬＶＤＥＮＧＶＫＴＫＡＴＴＳＬＤＴＡＤＦＳＧＹＰＩＩＧＧＱＫＩＲＤＦＶＩＩＳＫＮＬＥＥＮＩＮＳＩＬＧＶＧＮＲＬＴＩＩＳＫＳＳＳＴＮＬＩＲＫＩＶＦＥＴＳＮＳＮＰＧＡＩＹＳＴＶＳＹＫＡＥＳＮＤＬＬＶＤＳＦＨＥＮＥＹＴＭＳＬＧＱＧＰＦＬＡＹＱＧＣＡＤＱＱＧＡＮＴＩＶＮＶＴＮＧＹＮＨＮＳＧＱＮＮＹＳＶＧＶＰＦＳＹＶＹＮＳＶＧＧＩＧＩＧＤＡＳＴＳＲＲＥＦＫＬＰＩＩＧＫＤＮＴＶＳＬＧＭＥＷＮＧＱＴＬＫＫＧＡＥＴＡＩＧＴＳＶＩＴＴＴＮＧＤＹＹＳＧＬＫＳＹＡＥＶＭＫＤＫＧＩＳＡＰＡＳＩＰＤＩＡＹＤＳＲＷＥＳＷＧＦＥＦＤＦＴＩＥＫＩＶＮＫＬＤＥＬＫＡＭＧＩＫＱＩＴＬＤＤＧＷＹＴＹＡＧＤＷＫＬＳＰＱＫＦＰＮＧＮＡＤＭＫＹＬＴＤＥＩＨＫＲＧＭＴＡＩＬＷＷＲＰＶＤＧＧＩＮＳＫＬＶＳＥＨＰＥＷＦＩＫＮＳＱＧＮＭＶＲＬＰＧＰＧＧＧＮＧＧＴＡＧＹＡＬＣＰＮＳＥＧＳＩＱＨＨＫＤＦＶＴＶＡＬＥＥＷＧＦＤＧＦＫＥＤＹＶＷＧＩＰＫＣＹＤＳＳＨＫＨＳＳＬＳＤＴＬＥＮＱＹＫＦＹＥＡＩＹＥＱＳＩＡＩＮＰＤＴＦＩＥＬＣＮＣＧＴＰＱＤＦＹＳＴＰＹＶＮＨＡＰＴＡＤＰＩＳＲＶＱＴＲＴＲＶＫＡＦＫＡＩＦＧＤＤＦＰＶＴＴＤＨＮＳＶＷＬＰＳＡＬＧＴＧＳＶＭＩＴＫＨＴＴＬＳＳＳＤＲＥＱＹＮＫＹＦＧＬＡＲＤＬＥＬＡＫＧＥＦＩＧＮＬＹＫＹＧＩＤＰＬＥＳＹＶＩＲＫＧＥＤＩＹＹＳＦＹＫＤＮＳＳＹＳＧＮＩＥＩＫＧＬＤＳＮＡＴＹＲＩＥＤＹＶＮＮＲＶＩＡＲＧＶＫＧＰＴＡＴＩＮＴＳＦＴＤＮＬＬＶＲＡＩＰＤＤＴＰＡＥＶＴＴＦＤＶＧＮＮＴＩＬＳＳＴＤＳＧＮＳＫＹＬＮＡＶＳＴＴＬＥＫＴＡＴＩＤＳＬＳＩＹＩＧＮＮＳＥＮＧＫＬＱＩＡＩＹＤＤＮＮＧＫＰＧＴＫＫＡＹＶＥＥＦＶＰＴＫＮＳＷＮＴＫＫＶＶＮＳＶＴＬＰＳＧＱＹＷＬＶＦＱＰＤＮＤＶＬＱＴＫＴＮＰＳＳＭＫＱＳＡＮＮＮＰＹＮＹＮＩＬＰＮＳＦＰＩＧＴＧＹＮＡＹＫＧＤＶＳＦＹＡＴＦＫＥＡＳＳＱＡＩＰＱＮＳＷＡＬＫＹＶＤＳＥＥＴＴＧＥＮＧＲＡＴＮＡＦＤＧＮＮＮＴＩＷＨＴＫＹＳＧＧＮＡＡＰＭＰＨＥＩＱＩＤＬＲＧＶＹＮＩＮＱＩＮＹＬＰＲＱＤＧＧＴＮＧＴＩＫＤＹＥＶＹＬＳＬＤＧＶＮＷＧＱＰＩＳＫＧＴＦＥＳＮＳＴＥＫＩＶＫＦＮＥＴＫＳＲＹＶＫＬＫＡＬＳＥＩＮＮＫＱＦＴＴＶＡＤＬＫＶＦＧＷＥＩＳＫＩＥＫＰＬＱＮＡＥＴＹＬＮＩＰＴＹＤＧＬＮＱＳＴＨＰＤＶＫＹＦＫＮＧＷＮＧＹＫＹＷＭＩＭＴＰＮＲＴＧＳＳＶＡＥＮＰＳＩＬＡＳＤＤＧＩＮＷＥＶＰＡＧＶＴＮＰＩＡＰＭＰＱＶＧＨＮＣＤＶＤＭＩＹＮＥＡＴＤＥＬＷＶＹＷＶＥＳＤＤＩＴＫＧＷＶＫＬＩＫＳＫＤＧＶＮＷＳＳＱＱＶＶＶＤＤＮＲＡＫＹＳＴＬＳＰＳＩＩＦＫＤＮＫＹＹＭＷＳＶＮＴＧＮＳＧＷＮＮＱＳＮＫＶＥＬＲＥＳＳＤＧＶＮＷＳＮＰＴＶＶＮＴＬＡＱＤＧＳＱＩＷＨＶＮＶＥＹＩＰＳＫＮＥＹＷＡＩＹＰＡＹＫＮＧＴＧＳＤＫＴＥＬＹＹＡＫＳＳＤＧＶＮＷＴＴＹＫＮＰＩＬＳＫＧＴＳＧＫＷＤＤＭＥＩＹＲＳＣＦＶＹＤＥＤＴＮＭＩＫＶＷＹＧＡＶＳＱＮＰＱＩＷＫＩＧＦＴＥＮＤＹＤＫＦＩＥＧＬＴＱ
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配列番号１４
説明：シグナルペプチドを除いたクロストリジウム・テルチウム５７５７（Ｃｔ５７５７）単離タンパク質配列（識別番号０９９３４５７５７．１−Ｃｔ５７５７）
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配列番号１５
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するクロストリジウム・テルチウム５７５７（Ｃｔ５７５７）融合タンパク質配列発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおける）
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配列番号１７
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するクロストリジウム・テルチウム５７５７（Ｃｔ５７５７）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質配列発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおける）
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配列番号１９
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するクロストリジウム・テルチウム５７５７（Ｃｔ５７５７）タンパク質配列ガラクトサミニダーゼ発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおいて）
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配列番号２１
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ１０２１ガラクトサミニダーゼタンパク質発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおいて）
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配列番号２３
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するＲｕｔｈｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔａｔｉｆｏｒｍａｎｓ Ｒ１８７５５ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質配列発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおいて）
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配列番号２５
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ ３６７１ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおいて）
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配列番号２７
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ ３６７２ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおいて）
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配列番号２９
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ ３６７１ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質Ｒｐ３６７１＿発現構築物（ｐＥＴ２８ ａベクターにおいて）
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配列番号３１
説明：Ｈｉｓタグおよびトロンビン切断部位を有するロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ ３６７２＿ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ＿タンパク質発現構築物（ｐＥＴ２８ａベクターにおいて）
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配列番号３２
説明：クロストリジウム・テルチウム５７５７（Ｃｔ５７５７）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質配列
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配列番号３３
説明：Ｒｕｔｈｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔａｔｉｆｏｒｍａｎｓ Ｒ１８７５５ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質配列
ＨＥＥＴＤＬＬＶＮＧＧＦＥＴＧＤＳＴＧＷＮＷＦＮＮＡＶＶＤＳＡＡＰＨＳＧＮＹＣＡＫＶＡＫＮＳＳＹＥＱＶＶＴＶＳＰＤＴＫＹＶＬＴＧＷＡＫＳＥＧＳＳＶＭＴＬＧＶＫＮＹＧＧＱＥＴＦＳＡＴＬＳＡＤＹＱＱＬＡＶＴＦＴＴＧＰＮＡＱＴＡＴＩＹＧＹＲＱＮＳＧＳＧＡＧＹＦＤＤＶＥＬＴＡＶＱＤＦＡＰＹＱＰＬＡＮＡＩＡＰＱＡＩＰＴＹＤＧＡＮＱＰＴＨＰＳＶＶＫＦＥＱＰＷＮＧＹＬＹＷＭＡＭＴＰＹＰＦＮＤＧＳＹＥＮＰＳＩＶＡＳＮＤＧＥＮＷＩＶＰＥＧＶＳＮＰＬＡＧＴＰＳＰＧＨＮＣＤＶＤＬＶＹＶＰＡＳＤＥＬＲＭＹＹＶＥＡＤＤＩＩＳＳＲＶＫＭＩＳＳＲＤＧＶＨＷＳＥＰＱＶＶＭＱＤＬＶＲＫＹＳＩＬＳＰＳＩＥＩＬＰＤＧＴＹＭＭＷＹＶＤＴＧＮＡＧＷＮＳＱＮＮＱＶＫＹＲＴＳＡＤＧＩＫＷＳＧＡＶＴＣＴＤＦＶＱＰＧＹＱＩＷＨＩＤＶＨＹＤＴＳＳＧＡＹＹＡＶＹＰＡＹＰＮＧＴＤＣＤＨＣＮＬＦＦＡＶＮＲＴＧＫＱＷＥＴＦＳＲＰＩＬＫＰＳＴＥＧＧＷＤＤＦＣＩＹＲＳＳＭＬＩＤＤＧＭＬＫＶＷＹＧＡＫＫＱＥＤＳＳＷＨＴＧＬＴＭＲＤＦＳＥＦＭＫＩＬＥＲ
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配列番号３４
説明：ロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ３６７１ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質
ＨＳＰＬＳＡＡＡＥＳＧＴＧＴＲＬＶＫＧＱＴＧＹＬＴＥＥＱＡＩＲＮＱＥＱＴＴＥＥＲＥＱＫＬＴＧＥＥＴＡＥＶＬＭＥＧＴＫＤＳＧＩＶＱＴＥＥＶＱＴＫＥＭＱＴＥＤＡＱＴＥＥＶＱＴＥＥＭＱＴＥＤＡＱＴＫＥＶＱＴＥＥＭＱＴＥＤＡＱＴＥＥＶＱＴＫＥＥＰＡＥＥＴＨＭＫＥＩＱＴＱＧＴＫＫＡＳＤＲＮＧＫＡＲＶＴＥＩＬＥＤＡＱＤＰＡＮＲＩＶＹＬＳＤＬＱＷＫＳＥＮＨＴＶＤＳＥＬＰＴＲＫＤＫＳＦＧＧＧＫＩＴＬＫＶＤＧＴＶＴＥＦＤＫＧＩＧＴＱＴＤＳＴＩＶＹＤＬＥＧＫＧＹＴＫＦＥＴＹＶＧＶＤＹＳＱＫＥＮＩＰＧＥＶＣＤＶＫＦＲＶＫＩＤＤＫＩＶＳＥＴＧＶＬＤＰＬＳＮＡＶＫＩＳＶＮＩＰＤＴＡＫＴＬＴＬＹＡＤＫＶＴＥＴＷＳＤＨＡＮＷＡＤＡＫＦＹＱＡＬＰＥＰＥＮＶＡＦＫＫＴＶＶＴＲＫＴＳＤＮＳＥＡＰＶＮＰＤＳＡＶＮＳＳＫＡＶＤＧＶＩＤＳＳＳＹＦＤＦＧＤＱＡＮＳＧＡＶＲＥＳＬＹＭＥＶＤＬＫＧＳＹＬＬＳＤＩＱＬＷＲＹＷＫＤＧＲＴＹＡＡＴＡＩＶＶＡＥＤＥＮＦＥＮＡＡＶＩＹＮＳＤＴＴＧＥＩＨＨＬＧＡＧＳＤＭＬＹＡＥＴＥＳＧＫＴＦＰＶＰＥＮＴＫＡＲＹＩＲＶＹＴＹＧＶＮＧＴＳＧＶＴＮＨＩＶＥＬＫＶＮＡＹＶＦＧＤＥＩＬＰＥＫＰＤＤＳＫＩＦＰＮＡＶＮＰＬＫＬＱＧＰＧＴＮＤＱＶＴＨＰＤＶＴＶＦＤＥＰＷＮＧＹＫＹＷＭＡＹＴＰＮＫＰＧＳＳＹＦＥＮＰＣＩＡＡＳＮＤＧＶＮＷＥＦＰＡＱＮＰＶＱＰＲＹＤＳＥＩＥＮＱＮＥＨＮＣＤＴＤＩＶＹＤＰＶＮＤＲＬＩＭＹＷＥＷＡＱＤＥＡＶＮＧＫＴＨＲＳＥＩＲＹＲＶＳＹＤＧＩＮＷＧＶＥＤＫＴＧＶＬＭＴＧＰＴＤＨＧＣＡＩＡＴＥＧＥＲＹＳＤＬＳＰＴＶＶＹＤＫＴＥＫＩＹＫＭＷＡＮＤＡＧＤＶＧＹＥＮＫＱＮＮＫＶＷＹＲＴＳＱＤＧＩＳＮＷＳＤＫＴＹＶＥＮＦＬＧＶＮＥＤＧＬＱＭＹＰＷＨＱＤＩＱＷＶＥＥＦＱＥＹＷＡＬＱＱＡＦＰＡＧＳＧＰＤＮＳＳＬＲＦＳＫＳＫＤＧＬＨＷＥＰＶＳＥＫＡＬＩＴＶＧＡＰＧＴＷＤＡＧＱＩＹＲＳＴＦＷＹＥＰＧＧＡＫＧＮＧＴＦＨＩＷＹＡＡＬＡＥＧＱＳＨＷＤＩＧＹＴＳＡＮＹＡＤＡＭＹＫＬＴＧＳＲ
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配列番号３５
説明：ロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ３６７２＿ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ＿タンパク質
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配列番号３６
説明：クロストリジウム・テルチウム５７５７（Ｃｔ５７５７）ガラクトサミニダーゼタンパク質配列
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配列番号３７
説明：ロビンソニエラ・ペオリエンシスＲｐ１０２１ガラクトサミニダーゼタンパク質配列
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Claims (25)
- ドナー臓器からＡ抗原を酵素的に切断するための灌流流体であって、前記灌流流体は、
（ａ）精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、
（ｂ）精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と、
を含む、灌流流体。 - （ａ）ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５のうちの１つ以上から選択される精製タンパク質であり、
（ｂ）ガラクトサミニダーゼは、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３６、および配列番号３７のうちの１つ以上から選択される精製タンパク質である、請求項１に記載の灌流流体。 - 請求項１に記載の灌流流体であって、前記灌流流体は、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１、および３２〜３５のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６および３７のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む、灌流流体。
- 請求項１または２に記載の灌流流体であって、前記灌流流体は、
（ａ）配列番号２、配列番号４および配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である、前記精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、
（ｂ）配列番号７、配列番号９および配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質である、前記精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と
の１つ以上から選択される酵素を含む、灌流流体。 - 請求項１または２に記載の灌流流体であって、前記灌流流体は、
（ａ）配列番号１７または配列番号３２の精製クロストリジウム・テルチウムＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質である、前記精製ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質と、
（ｂ）配列番号１９または配列番号３６の精製クロストリジウム・テルチウムガラクトサミニダーゼタンパク質である、前記精製ガラクトサミニダーゼタンパク質と
の１つ以上から選択される、灌流流体。 - 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、１μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断することができる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の灌流流体。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有する、請求項１〜６のいずれか１つに記載の灌流流体。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有する、請求項１〜７のいずれか１つに記載の灌流流体。
- 前記灌流流体が、緩衝細胞外溶液をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１つに記載の灌流流体。
- 前記緩衝細胞外溶液が、Ｓｔｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ Ｐｌｕｓ（商標）、ＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、ウィスコンシン大学溶液（ＵＷ）、Ｃｅｌｓｉｏｒ溶液、腎臓灌流溶液（ＫＰＳ−１）、京都大学溶液、ＩＧＬ−１溶液、およびクエン酸塩溶液から選択される、請求項９に記載の灌流流体。
- ドナー臓器からｅｘ ｖｉｖｏでＡ抗原を酵素的に切断する方法であって、
（ａ）Ａ型抗原を提示するドナー臓器を、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質を含む流体で、酵素がドナー臓器からＡ型抗原の切断を可能にするのに十分な時間灌流する工程、または、
（ｂ）Ａ型抗原を提示するドナー臓器を、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質およびガラクトサミニダーゼタンパク質を含む流体と、酵素がドナー臓器からＡ抗原の切断を可能にするのに十分な時間インキュベートする工程を含む、方法。 - 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼが、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５のうちの１つ以上から選択される精製タンパク質であり、前記ガラクトサミニダーゼが、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３６、および配列番号３７のうちの１つ以上から選択される精製タンパク質である、請求項１１に記載の方法。
- 前記組成物が、配列番号２、４、５、１７、２３、２９、３１、および３２〜３５のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列から本質的になるＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ活性を有する精製酵素と、配列番号７、９、１０、１９、２１、３６および３７のうちの１つの配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列から本質的になるガラクトサミニダーゼ活性を有する精製酵素とを含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼが配列番号４または配列番号５の精製フラボニフラクター・プラウティＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質であり、前記ガラクトサミニダーゼが配列番号９または配列番号１０の精製フラボニフラクター・プラウティガラクトサミニダーゼタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質および前記ガラクトサミニダーゼタンパク質が、緩衝細胞外溶液中に存在する、請求項１１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
- 前記緩衝細胞外溶液が、Ｓｔｅｅｎ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ（商標）、Ｐｅｒｆａｄｅｘ Ｐｌｕｓ（商標）、ＥｕｒｏＣｏｌｌｉｎｓ溶液、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、ウィスコンシン大学溶液（ＵＷ）、Ｃｅｌｓｉｏｒ溶液、腎臓灌流溶液（ＫＰＳ−１）、京都大学溶液、ＩＧＬ−１溶液、およびクエン酸塩溶液から選択される、請求項１５に記載の方法。
- 前記ドナー臓器が固形臓器である、請求項１１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
- 前記固形臓器が、肺、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、および腸のうちの１つから選択される、請求項１７に記載の方法。
- 前記固形臓器が肺である、請求項１８に記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質および前記ガラクトサミニダーゼタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏ緩衝細胞外肺溶液と混合され、前記肺を通って循環され、それによって、前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼタンパク質および前記ガラクトサミニダーゼタンパク質は、前記肺の血管系からＡ抗原を実質的に除去するのに十分な時間、前記ドナー臓器の血管系と接触する、請求項１７に記載の方法。
- 前記肺の血管系からＡ抗原を除去する時間は、約１時間である、請求項２０に記載の方法。
- 前記方法はさらに、前記ドナー臓器を洗浄して、ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼ、ガラクトサミニダーゼおよび切断されたＡ抗原を除去する工程を含む、請求項１１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、１μｇ／ｍｌ以下でＡ抗原を切断することができる、請求項１１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、約６．５と約７．５との間のｐＨでＡ抗原切断活性を有する、請求項１１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
- 前記ＧａｌＮＡｃデアセチラーゼおよびガラクトサミニダーゼが、４°Ｃと３７°Ｃとの間の温度でＡ抗原切断活性を有する、請求項１１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
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