BR112021002899A2

BR112021002899A2 - composições enzimáticas para a clivagem de antígeno de carboidrato, métodos, usos, aparelhos e sistemas associados às mesmas

Info

Publication number: BR112021002899A2
Application number: BR112021002899-4A
Authority: BR
Inventors: Stephen G. Withers; Peter Rahfeld; Jayachandran Kizhakkedathu
Original assignee: The University Of British Columbia
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-05-11
Also published as: CN117044707A; EP3837370A4; CA3116785A1; JP2021533783A; EP3852526A4; JP2021532838A; CN112839512B; AU2019322933A1; US20210345601A1; CA3109723A1; EP3852526A1; WO2020034043A1; US20210324361A1; EP3837370A1; WO2020034042A1; CN112840027A; CN112839512A

Abstract

São fornecidos aqui composições enzimáticas para clivagem de antígeno de carboidrato, métodos, usos, aparelhos e sistemas associados às mesmas. Em particular, a composição compreende duas enzimas, GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase e a composição pode ainda compreender um agente de aglomeração. Além disso, verificou-se que as composições aqui descritas têm atividade a temperaturas e níveis de pH adequados para a viabilidade celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “COMPOSIÇÕES ENZIMÁTICAS PARA A CLIVAGEM DE ANTÍGENO DE CARBOIDRATO, MÉTODOS, USOS, APARELHOS E SISTEMAS ASSOCIADOS ÀS MESMAS”

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório No. de série US 62/719.272 depositado em 17 de agosto de 2018, intitulado "ENZYMATIC COMPOSITIONS FOR CARBOHYDRATE ANTIGEN CLEAVAGE, METHODS, USES, APPARATUSES AND SYSTEMS ASSOCIATED THEREWITH".

CAMPO TÉCNICO

[002] A presente invenção se refere ao campo das composições enzimáticas. Em particular, a invenção se refere a composições enzimáticas para clivar antígenos e para fornecer métodos, aparelhos e sistemas para clivar antígenos usando as composições.

FUNDAMENTOS

[003] A correspondência correta de tipos de sangue é um requisito central da medicina de transfusão, uma vez que o plasma de indivíduos do grupo sanguíneo A contém anticorpos para o antígeno B e vice-versa, portanto, transfusões incompatíveis podem resultar na ativação do complemento e lise dos glóbulos vermelhos (RBC) (Daniels 2010). Esses antígenos de superfície celular são estruturas de carboidratos que terminam em a-1,3-N-

acetilgalactosamina (GalNAc) ou galactose (Gal) para sangue tipo A e sangue tipo B, respectivamente. Os RBCs do tipo O, por outro lado, não contêm nenhum desses açúcares terminais e podem ser transfundidos universalmente (Garratty 2008).

Consequentemente, um bom suprimento de hemácias do grupo O é necessário em bancos de sangue para situações de emergência, onde o tipo de sangue do paciente é desconhecido ou pouco claro. No entanto, os suprimentos costumam ser limitados.

[004] O conceito de remoção enzimática das estruturas GalNAc ou Gal de RBCs A ou B como um meio de converter RBCs A ou B em O foi primeiro proposto e demonstrado por Goldstein (Goldstein 1982; US 4609627; e CA 2272925).

Usando uma a-galactosidase do grão de café verde, RBCs do tipo B foram convertidos em O e subsequente transfusão bem- sucedida realizada (Kruskall 2000). No entanto, as quantidades de enzima que eram necessárias, tornando a abordagem impraticável. A conversão do tipo A é mais desafiadora, principalmente porque o sangue do tipo A ocorre em muitos subtipos que diferem em suas ligações internas (Clausen 1989). Da mesma forma, a-galactosidases têm sido usadas para remover antígenos do tipo B (por exemplo, ver EP 2243793). Um grande avanço em direção às conversões práticas, incluindo do tipo A, foi feito pela triagem de uma biblioteca de bactérias para atividades de conversão A e B, usando substratos de tetrassacarídeo. Duas novas famílias de glicosidase foram encontradas que mostram alta atividade de clivagem de antígeno em valores de pH neutros: a CAZy GH109 a-N-acetilgalactosaminidases e a GH110 a-galactosidases (Liu 2007). Ambas as enzimas converteram seus eritrócitos correspondentes com a remoção completa dos respectivos antígenos. No entanto, quantidades substanciais de enzima ainda eram necessárias para a conversão, especialmente do tipo A (60 mg de enzima/unidade de sangue), limitando o desenvolvimento posterior. Seriam úteis as enzimas com maior eficiência na clivagem dos antígenos de carboidratos das células.

SUMÁRIO

[005] A presente invenção é baseada em parte, na surpreendente constatação de que a combinação de uma Galactosaminidase e uma GalNAcDeacetilase, como aqui descrito, são ordens de magnitude mais eficientes do que as enzimas de clivagem do antígeno A previamente identificadas. Por exemplo, sob algumas condições, algumas das enzimas GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 1 µ/mL. Além disso, a eficiência de clivagem da combinação de enzimas é mantida a um pH adequado para manter a viabilidade dos eritrócitos (isto é, pH entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5).

Além disso, as enzimas mostraram-se ativas em temperaturas entre 4 °C e 37 °C, o que também é adequado para protocolos de coleta, lavagem e armazenamento de sangue. Além disso, a eficiência das enzimas é ainda melhorada por meio da adição de um agente de aglomeração (por exemplo, dextrano). Também foi reconhecido que o mesmo processo de clivagem em duas etapas poderia ser aplicado a órgãos de doadores. As enzimas aqui descritas foram testadas principalmente em amostras com hematócrito de 10%, uma vez que são melhores para trabalhar e calcularam a quantidade necessária para bolsas de hemácias (rbc) (aproximadamente 220 ml), que contém um nível de cerca de 80% de hematócrito.

[006] Em algumas modalidades, na falta de um agente de aglomeração: 3 µg/ml de hemócrito a 10%, 1h, 37 °C > 5,3 mg de cada enzima por bolsa rbc embalada pode ser usado para clivar o antígeno A dos eritrócitos e em outras modalidades tendo um agente de aglomeração: 0,5 µg/ml de hemócrito a 10%, 1h, 37 °C > 0,9 mg de cada enzima por bolsa de rbc embalada pode ser usado para clivar o antígeno A dos eritrócitos. No entanto, será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que mais enzima pode ser usada para reduzir o tempo em que o sangue pode ser processado ou menos enzima pode ser usada, desde que as células sejam incubadas por mais tempo.

[007] De acordo com uma modalidade, é fornecida uma composição, a composição incluindo: (a) uma proteína GalNAcDeacetilase purificada; e (b) uma proteína Galactosaminidase purificada.

[008] De acordo com uma modalidade, é fornecida uma composição, a composição incluindo: (a) a proteína GalNAcDeacetilase purificada é selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:2; SEQ ID NO.:4; SEQ ID NO.:5; SEQ ID NO.:17; SEQ ID NO.:23; SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:33; SEQ ID NO.:34; e SEQ ID NO.:35; e (b) a proteína Galactosaminidase purificada é selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:7; SEQ ID NO.:9; SEQ ID NO.:10; SEQ ID NO.:19; SEQ ID NO.:21; SEQ ID NO.:36; e SEQ ID NO.:37.

[009] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma composição, a composição incluindo: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

[0010] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma composição, a composição incluindo: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

[0011] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma composição, a composição incluindo: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

[0012] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma composição, a composição incluindo: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 75% idêntica à sequência apresentada em uma das

SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 75% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

[0013] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma composição, a composição compreendendo enzimas selecionadas a partir de uma ou mais dentre: (a) a proteína GalNAcDeacetilase purificada é uma proteína GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:4 e SEQ ID NO.:5; e uma ou mais de: (b) a proteína Galactosaminidase purificada é uma proteína Galactosaminidase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:7, SEQ ID NO.:9 e SEQ ID NO.:10.

[0014] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma composição, a composição compreendendo enzimas selecionadas a partir de uma ou mais dentre: (a) a proteína GalNAcDeacetilase purificada de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:4, SEQ ID NO.:5, SEQ ID NO.:17 e SEQ ID NO.:32; e (b) a proteína Galactosaminidase purificada é uma proteína Galactosaminidase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:7, SEQ ID NO.:9, SEQ ID NO.:10, SEQ ID NO.:19, SEQ ID NO.:21, SEQ ID NO.:36 e SEQ ID NO.:37.

[0015] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma composição, a composição compreendendo enzimas selecionadas a partir de uma ou mais dentre: (a) a proteína GalNAcDeacetilase purificada é uma proteína GalNAcDeacetilase de Clostridium tertium purificada de SEQ ID NO.:17 e SEQ ID NO.:32; e (b) a proteína Galactosaminidase purificada é uma proteína Galactosaminidase de Clostridium tertium purificada de SEQ ID NO.:19 e SEQ ID NO.:36.

[0016] A composição de GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase pode ser capaz de clivar o antígeno A em ou abaixo de 1 µg/ml. A composição de GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase pode ter atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. A composição de GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase pode ter atividade de clivagem do antígeno A a temperaturas entre 4 °C e 37 °C.

[0017] A composição pode incluir: (a) a GalNAcDeacetilase purificada e a Galactosaminidase purificada podem ser imobilizadas; (b) a GalNAcDeacetilase purificada pode ser imobilizada; ou (c) a Galactosaminidase purificada pode ser imobilizada.

[0018] As enzimas imobilizadas podem ser fixadas a uma superfície, a superfície pode ser selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: (a) um grânulo ou microesfera; (b) um recipiente; (c) um tubo; (d) uma coluna; e (e) uma matriz. A composição pode incluir ainda um agente de aglomeração. O agente de aglomeração pode ser selecionado a partir de um ou mais dentre: um dextrano, um sulfato de dextrano, uma dextrina, um pululano, um poli(etilenoglicol), um Ficoll™ e uma proteína inerte.

[0019] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma enzima purificada incluindo uma GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:4 ou SEQ ID NO.:5.

[0020] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma enzima purificada incluindo uma Galactosaminidase de Flavonifractor plautii de SEQ ID NO.:7, SEQ ID NO.:9 ou SEQ ID NO.:10.

[0021] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma enzima purificada incluindo uma GalNAcDeacetilase de Clostridium tertium de SEQ ID NO.:17 ou SEQ ID NO.:32.

[0022] De acordo com uma outra modalidade, é fornecida uma enzima purificada incluindo uma Galactosaminidase de Clostridium tertium de SEQ ID NO.:19 ou SEQ ID NO.:36.

[0023] De acordo com uma modalidade adicional, é fornecida uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica GalNAcDeacetilase selecionada a partir de um ou mais dentre: SEQ ID NO.:1; SEQ ID NO.:3; SEQ ID NO.:16; SEQ ID NO.:24; SEQ ID NO.:26; SEQ ID NO.:28; e SEQ ID NO.:30.

[0024] De acordo com outra modalidade, é fornecida uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica

Galactosaminidase selecionada a partir de uma ou mais dentre: SEQ ID NO.:6; SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:18; e SEQ ID NO.:20.

[0025] De acordo com outra modalidade, é fornecido um vetor incluindo o ácido nucleico aqui descrito. O vetor também pode incluir uma sequência de ácido nucleico heteróloga selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: um marcador de proteína; e um local de clivagem.

[0026] O marcador de proteína pode ser selecionado a partir de um ou mais de: Proteína de ligação à albumina (ABP); Fosfatase Alcalina (AP); Epítopo AU1; Epítopo AU5; AviTag; Epítopo T7 de bacteriófago (T7-tag); Epítopo V5 de bacteriófago (V5-tag); Proteína transportadora de biotina- carboxi (BCCP); Marcador do vírus da febre catarral (B tag); anticorpo camelídeo de domínio único (C-tag); Peptídeo de ligação a calmodulina (CBP ou Calmodulin-tag); Cloranfenicol Acetil Transferase (CAT); Domínio de ligação de celulose (CBP); Domínio de ligação de quitina (CBD); Domínio de ligação à colina (CBD); Dihidrofolato redutase (DHFR); DogTag; Epítopo E2; E-tag; Epítopo FLAG (FLAG-tag); Proteína de ligação à galactose (GBP); Proteína fluorescente verde (GFP); Glu-Glu (EE tag); Glutationa S- transferase (GST); Hemaglutinina da gripe humana (HA); HaloTag™; Marcadores alternados de histidina e glutamina (HQ tag); Marcadores alternados de histidina e asparagina

(HN tag); Marcador de afinidade de histidina (HAT); Peroxidase de rábano (HRP); Epítopo HSV; Isopeptag (Isopep- tag); Isomerase cetosteróide (KSI); Epítopo KT3; LacZ; Luciferase; Proteína de ligação à maltose (MBP); Epítopo Myc (Myc-tag); NE-tag; NusA; Domínio PDZ; Ligando PDZ; Poliarginina (Arg tag); Poliaspartato (Asp tag); Policisteína (Cys-tag); Poliglutamato (Glu-tag); Poli- histidina (His-tag); Polifenilalanina (Phe-tag); Profinity eXact; Proteína C; Rho1D4-tag; Etiqueta S1; S-tag; Softag 1; Softag 3; SnoopTagJr; SnoopTag; Spot-tag; SpyTag (Spy- tag); Peptídeo de ligação à estreptavadina (SBP); Proteína A estafilocócica (Proteína A); Proteína G estafilocócica (Proteína G); Strep-tag; Estreptavadina (SBP tag); Strep- tag II; Sdy-tag; Modificador pequeno do tipo Ubiquitina (SUMO); Purificação de afinidade em tandem (TAP); Epítopo T7; Marcador de tetracisteína (TC tag); Tioredoxina (Trx); TrpE; Marcador Ty; Ubiquitina; Universal; V5 tag; VSV-G ou Marcador VSV; e Marcador Xpress.

[0027] De acordo com outra modalidade, é fornecido um método para clivar enzimaticamente antígenos A do sangue, eritrócitos ou um órgão doador, o método incluindo: (a) combinar uma proteína GalNAcDeacetilase e uma proteína Galactosaminidase com (i) sangue compreendendo antígeno do tipo A; (ii) eritrócitos de tipo A ou tipo AB; ou (iii) um órgão doador exibindo antígeno do tipo A; (b) incubar as enzimas com (i) o sangue; (ii) os eritrócitos de tipo A ou tipo AB; ou (iii) o órgão doador por um período de tempo suficiente para permitir que as enzimas clivem os antígenos A do sangue, dos eritrócitos ou do órgão doador.

[0028] A GalNAcDeacetilase pode ser uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais de: SEQ ID NO.:2; SEQ ID NO.:4; SEQ ID NO.:5; SEQ ID NO.:17; SEQ ID NO.:23; SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:33; SEQ ID NO.:34; e SEQ ID NO.:35; e a Galactosaminidase pode ser uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:7; SEQ ID NO.:9; SEQ ID NO.:10; SEQ ID NO.:19; SEQ ID NO.:21; SEQ ID NO.:36; e SEQ ID NO.:37.

[0029] A composição pode incluir: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

[0030] A GalNAcDeacetilase pode ser uma proteína GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:4 ou SEQ ID NO.:5 e a Galactosaminidase pode ser uma proteína Galactosaminidase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:9 ou SEQ ID NO.:10.

[0031] O método pode incluir ainda adicionar um agente de aglomeração. O agente de aglomeração pode ser selecionado a partir de um ou mais dentre: um dextrano; um sulfato de dextrana; uma dextrina; um pululano; um poli(etilenoglicol); um Ficoll™; um glicerol hiper- ramificado; e uma proteína inerte.

[0032] O método pode incluir ainda lavar o sangue, eritrócitos ou um órgão doador para remover GalNAcDeacetilase, Galactosaminidase e o agente de aglomeração.

[0033] A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 1 µg/ml. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A a temperaturas entre 4 °C e 37 °C.

[0034] De acordo com outra modalidade, é fornecido um sistema de coleta e armazenamento de sangue, incluindo: (a) uma proteína GalNAcDeacetilase purificada; e (b) uma proteína Galactosaminidase purificada.

[0035] O sistema pode incluir ainda uma superfície na qual a enzima é imobilizada, a superfície sendo selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: (a) uma esfera ou microesfera; (b) um recipiente; (c) um tubo; (d) uma coluna; ou (e) uma matriz.

[0036] De acordo com outra modalidade, é fornecido um aparelho de coleta e armazenamento de sangue, o aparelho incluindo: (a) uma superfície; (b) uma proteína GalNAcDeacetilase purificada imobilizada na superfície; e (c) uma proteína Galactosaminidase purificada imobilizada na superfície.

[0037] A superfície do aparelho na qual a enzima é imobilizada pode ser selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: (a) uma esfera ou microesfera; (b) um recipiente; (c) um tubo; (d) uma coluna; ou (e) uma matriz.

O recipiente pode ser uma bolsa.

[0038] A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 100 µg/ml. A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 90 µg/mL. A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 80 µg/ml. A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 70 µg/mL. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 60 µg/ml. A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 50 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 40 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 30 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 20 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 15 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 14 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 13 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 12 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 11 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 10 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 9 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 8 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 7 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 6 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 5 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 4 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 3 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 2 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 1 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,9 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,8 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,7 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,6 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,5 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,4 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,3 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,2 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,1 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,09 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,08 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,07 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,06 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,05 µg/ml.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,04 µg/mL.

A

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,03 µg/mL. A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,02 µg/ml. A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ser capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 0,01 µg/ml.

[0039] A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A em um pH entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,0 e cerca de 8,0. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,8. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,9 e cerca de 7,9. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,4 e cerca de 7,8.

[0040] A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A em temperaturas entre 4 °C e 37 °C. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A em temperaturas entre 3 °C e 38 °C. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A em temperaturas entre 4 °C e

40 °C. A GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A em temperaturas entre 4 °C e 37 °C. A GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase podem ter atividade de clivagem do antígeno A a temperaturas entre 5 °C e 37 °C.

[0041] A GalNAcDeacetilase purificada e a Galactosaminidase purificada podem ser imobilizadas. A GalNAcDeacetilase purificada pode ser imobilizada. A Galactosaminidase purificada pode ser imobilizada. A enzima imobilizada pode ser ligada a uma superfície. A superfície pode ser selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: uma esfera ou microesfera; um recipiente; um tubo; uma coluna; ou uma matriz. A superfície pode ser selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: um recipiente; um tubo; uma coluna; ou uma matriz. O recipiente pode ser uma bolsa.

[0042] De acordo com outra modalidade, é fornecida uma enzima purificada incluindo GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:4 ou SEQ ID NO.:5.

[0043] De acordo com outra modalidade, é fornecida uma enzima purificada incluindo um Galactosaminidase de Flavonifractor plautii de SEQ ID NO.:7, SEQ ID NO.:9 ou SEQ ID NO.:10.

[0044] De acordo com outra modalidade, é fornecida uma enzima purificada incluindo uma proteína de fusão de

GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase de Clostridium tertium purificada de SEQ ID NO.:14.

[0045] De acordo com outra modalidade, é fornecido um vetor incluindo o ácido nucleico como aqui descrito e uma sequência de ácido nucleico heteróloga.

[0046] De acordo com outra modalidade, o método pode ser realizado in vitro ou ex vivo. Tal como aqui utilizado ex vivo significa que o método é realizado fora de um organismo. Por exemplo, ex vivo incluiria perfusão pulmonar ex vivo (EVLP) e tratamento de sangue doado. Tal como aqui utilizado, ex vivo se refere à experimentação ou medições ou tratamentos feitos em ou sobre tecidos ou células (por exemplo, eritrócitos ou um órgão doador) de um organismo em um ambiente externo com o mínimo ou algumas alterações de condições a partir das quais o tecido ou as células estavam sob quando in vivo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0047] A FIGURA 1 mostra uma ilustração esquemática de estruturas de carboidrato de antígeno de superfície celular terminando em a-1,3-N-acetilgalactosamina ligada (GalNAc) ou galactose (Gal) para o tipo A, tipo H e tipo B, em que os triângulos marcam os pontos de clivagem para a-N- acetil-galactosaminidase EmGH109 e a-galactosidase BfGal110.

[0048] A FIGURA 2 mostra a via enzimática de desacetilação da clivagem do antígeno A, em que a GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii (Fp) cliva o grupo acetila do terminal a-N-acetil-galactosamina do antígeno A (-42 m/z) e a galactosaminida intermediária é então clivada pela Galactosaminidase de Flavonifractor plautii (Fp) (-161 m/z), com análise de espectrometria de massa (MS) correspondente.

[0049] A FIGURA 3 mostra a análise FACS de A+RBCs tratados com diferentes concentrações de EmGH109 ou GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii (FpGalNAcDeacetilase) mais Galactosaminidase de Flavonifractor plautii (FpGalactosaminidase) ou por 1 h a 37 °C, em que para visualização do anticorpo anti-H (mais secundário marcado com FITC) e anticorpo anti-A marcado com APC foram usados, onde a área para o aparecimento de antígenos H estão na caixa superior esquerda. As linhas A-D comparam EmGH109 e FpGalNAcDeAc + FpGalNase a 5 µg/ml (A); 10 µg/ml (B); 50 µg/ml (C); e 50 µg/ml + dextrano 40k (D).

[0050] A FIGURA 4 mostra uma comparação de EmGH109 com FpGalNAcDeAc + FpGalNase em várias concentrações de enzima com (■) e sem (♦) dextrano em várias temperaturas (ou seja, 4 °C, temperatura ambiente (RT) e 37 °C).

[0051] A FIGURA 5 mostra a análise de HPAE-PAD de produtos de clivagem de eritrócitos A+ B+ e O+ e uma comparação de GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii (FpGalNAcDeAc) de comprimento total + enzimas Galactosaminidase de flavonifrator plautii (FpGalNase) com enzimas FpGalNAcDeAc truncadas + FpGalNase em eritrócitos A+.

[0052] A FIGURA 6 mostra perfis de pH para cada um de (A) FpGalNAcDeacetilase e (B) FpGalactosaminidase.

[0053] A FIGURA 7 mostra a conversão do antígeno A em antígeno H em RBCs A, conforme analisado via FACS, para (A) controle de RBC A+, (B) GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii (FpGalNAcDeAc) + Galactosaminidase de Flavonifractor plautii (FpGalNase) (10 ug/mL), (C) FpGalNAcDeAc + Clostridium tertium (Ct) Ct5757_GalNase (10 ug/mL) e (D) FpGalNAcDeAc + Galactosaminidase de Robinsoniella peoriensis (Rp) (Rp1021) GalNase (10 ug/mL).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0054] A seguinte descrição detalhada será melhor compreendida quando lida em conjunto com as figuras anexas.

Com o propósito de ilustrar a invenção, as figuras demonstram modalidades da presente invenção. No entanto, a invenção não se limita aos arranjos, exemplos e instrumentos precisos mostrados.

[0055] Quaisquer termos não definidos diretamente neste documento devem ser entendidos como tendo os significados comumente associados a eles, conforme entendidos dentro da técnica da invenção.

[0056] Uma "enzima imobilizada", conforme usada neste documento, é uma enzima ligada à superfície, que pode ser um material inerte e insolúvel. A imobilização de enzimas pode fornecer maior resistência a mudanças nas condições como pH, temperatura, etc. e auxiliar na sua remoção após o uso e para a reutilização da enzima.

[0057] A imobilização de uma enzima pode ser realizada por várias maneiras (por exemplo, ligação de etiqueta de afinidade, adsorção de superfície em vidro, resina, esferas ou matriz de alginato, esfera, fibra ou microesfera aprisionada, reticulação a uma superfície ou outras enzimas e ligação covalente a uma superfície).

[0058] Tal como aqui utilizado, "ligação de marcador de afinidade" se refere à imobilização de enzimas em uma superfície (por exemplo, um material poroso, usando marcadores de proteína não covalentes ou covalentes). A ligação de marcador de afinidade foi usada para purificação de proteínas e mais recentemente foi usada para aplicações de biocatálise por EziG™ (ENGINZYME AB™, Suécia - por exemplo, PCT/US1992/010113; e PCT/SE2015/050108). Sistemas alternativos são conhecidos na técnica para anexar enzimas ativas a uma superfície (ver, por exemplo, US 4088538; US 4141857; US 4206259; US 4218363; US 4229536; US 4239854;

US 4619897; US 4748121; US 4749653; US 4897352; US 4954444; US 4978619; US 5154808; US 5962279; US 6030933; US 6291582; US 6254645; US 10.016.490; e US 10.041.055).

[0059] Os marcadores de proteína são sequências de peptídeos geneticamente enxertadas em uma proteína recombinante, muitas vezes removíveis por agentes químicos ou por meios enzimáticos e são fixados a proteínas para vários fins. Os marcadores de proteína apresentados na TABELA A se destinam a ser exemplos e não se destinam a ser limitativos de qualquer forma. Um tipo de marcador de proteína é um marcador de afinidade, que são adicionados a proteínas ou sequências de peptídeos para que possam ser purificadas a partir de uma fonte biológica bruta usando uma técnica de afinidade (por exemplo, de organismos do sistema de expressão) ou para facilitar a imobilização da proteína “marcada” a uma superfície. Alguns exemplos de marcadores de afinidade incluem domínio de ligação de quitina (CBD), proteína de ligação de maltose (MBP), Strep- tag, glutationa-S-transferase (GST) e a Poli-histidina (His-tag), que se liga a matrizes metálicas. Outro tipo de marcador de proteína é um marcador de epítopo (por exemplo, inclui V5-tag, Myc-tag, HA-tag, Spot-tag e NE-tag), que são sequências peptídicas curtas escolhidas pela facilidade de produção de anticorpos de alta afinidade e são frequentemente derivadas de sequências de genes virais para melhorar a imunorreatividade. Os marcadores de epítopo são particularmente úteis para experimentos de western blotting, imunofluorescência e imunoprecipitação, embora também encontrem uso na purificação e imobilização de proteínas em uma superfície. Ainda outro tipo de marcador de proteína é um marcador de cromatografia (por exemplo, aminoácidos polianiônicos, como FLAG-tag), que pode ser usado para alterar as propriedades cromatográficas da proteína para auxiliar na separação e purificação ou imobilização. Ainda, outros marcadores de proteína são marcadores de solubilização (por exemplo, proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa S-transferase (GST), tiorredoxina (TRX) e poli(NANP)) e marcadores de fluorescência (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP)). Marcadores de proteína podem permitir modificação enzimática específica, modificações químicas ou conectar proteínas a outros componentes. No entanto, dependendo do tipo ou número de marcadores adicionados a uma sequência de proteína, a função nativa da proteína, neste caso a função enzimática, pode ser comprometida pelo marcador.

Consequentemente, o marcador de proteína precisaria ser selecionado para garantir que a atividade da enzima não fosse comprometida ou, alternativamente, o marcador de proteína pode ser clivado da proteína antes do uso.

TABELA A: Marcadores de proteína exemplares

Nome do marcador Comprimento SEQ ID Posição (sequência) NO.: Proteína de 137 Terminal N ou ligação à albumina Terminal C (ABP) Fosfatase alcalina 444 Aminas primárias (AP) (epsilon-aminas de cadeia lateral de lisina e a-aminas N- terminais) Epítopo AU1 6 (DTYRYI) 59 Terminal N ou Terminal C Epítopo AU5 6 (TDFYLK) 60 Terminal N ou Terminal C AviTag 15 61 (GLNDIFEAQKIEWHE) Epítopo T7 de 11 (MASMTGGQQMG) 62 Terminal N ou Bacteriófago (T7- interno tag) Epítopo V5 de 14 (GKPIPNPLLGLDST) 63 Terminal C bacteriófago (V5- tag) Proteína 100 Terminal N ou transportadora de Terminal C biotina-carboxi (BCCP) Marcador do vírus 6 (QYPALT) 64 Terminal N ou da febre catarral Terminal C (B-tag) Marcador de 4 (EPEA) 65 peptídeo liga anticorpo camelídeo de domínio único (C- tag) Peptídeo de 26 66 Terminal N ou ligação a (KRRWKKNFIAVSAANRFK Terminal C calmodulina (CBP KISSSGAL) ou Calmodulin-tag) Cloranfenicol 218 Terminal N acetil transferase (CAT) Domínio de ligação 27–189 Terminal N, Terminal a celulose (CBP) C, ou interno (dependente do domínio) Domínio de ligação 51 Terminal N ou a quitina (CBD) Terminal C Domínio de ligação 145 Terminal N a colina (CBD) Di-hidrofolato 227 Terminal N ou redutase (DHFR) Terminal C

DogTag 23 67 (DIPATYEFTDGKHYITNE PIPPK) Epítopo E2 10 (SSTSSDFRDR) 68 Terminal N, Terminal C ou interno E-tag 13 (GAPVPYPDPLEPR) 69 Epítopo FLAG 8 (DYKDDDK) 70 Terminal N ou (FLAG-tag) Terminal C Proteína de 509 Terminal N ou ligação a Terminal C galactose (GBP) Proteína 220 Terminal N ou fluorescente verde Terminal C (GFP) Glu-Glu (EE-tag) 6 (EYMPME ou 71 Terminal N, ou EFMPME) 72 Terminal C, ou interno Glutationa S- 211 Terminal N ou transferase (GST) Terminal C Hemaglutinina de 31 Terminal N, Terminal influenza humana C ou interno (HA) hemaglutinina 9 (YPYDVPDYA) 73 reconhecida por um anticorpo (HA-tag) HaloTag® 312 Terminal N ou Terminal C Marcador de 19 74 Terminal N ou afinidade a (KDHLIHNVHKEFHAHAHN Terminal C histidina (HAT) K) Histidina e 6 (HQHQHQ) 75 glutamina são marcadores de peptído alternados (HQ-tag) Peroxidase de 400 Aminas primárias rábano (HRP) (epsilon-aminas de cadeia lateral de lisina e a-aminas N- terminais) Marcadores de 12 (HNHNHNHNHNHN) 76 peptídeo alternados de histidina e asparagina (HN- tag) Epítopo HSV 11 (QPELAPED) 77 Terminal C

Peptídeo isopeptag 16 78 se ligando (TDKDMTITFTNKKDAE) covalentemente à proteína pilin-C (Isopep-tag)

Cetoesteroide 125 Terminal N isomerase (KSI) Epítopo KT3 11 (KPPTPPPEPET) 79 Terminal N ou Terminal C LacZ 1024 Terminal N ou Terminal C Luciferase 551 Terminal N Proteína de 396 Terminal N ou ligação a maltose Terminal C (MBP) Epítopo Myc 11 (CEQKLISEEDL) 80 Terminal N, Terminal C ou interno Epítopo de 10 (EQKLISEEDL) 81 peptídeo c-myc (Myc-tag) Peptídeo sintético 18 82 (NE-tag) (TKENPRSNQEESYDDNES ) NusA 495 Terminal N ou Terminal C Domínio PDZ 80–90 Terminal N, Terminal C, ou interno Ligando PDZ 5–7 (varia) Terminal C Poliarginina (Arg- 5–6 (geralmente 5; 83 Terminal C tag) RRRRR) Poliaspartato 5–16 (DDDDD) 84 Terminal C (Asp-tag) Policisteína (Cys- 4 (CCCC) 85 Terminal N tag) Marcador 6 (EEEEEE) 86 poliglutamato (Glu-tag) Poli-histidina 2–10 (geralmente 6; 87 Terminal N ou (His-tag) HHHHHH) Terminal C Polifenilalanina 11 (FFFFFFFFFFF) 88 Terminal N (Phe-tag) Profinity eXact 75 Terminal N Proteína C 12 Terminal N ou Terminal C Peptídeo Cinus 9 (TETSQVAPA) 89 terminal intracelular de rodopsina (bovino) (Rho1D4-tag) S1-tag 9 (NANNPDWDF) 90 Terminal N ou Terminal C

Ribonuclease A 15 91 Terminal N, Terminal derivada (S-tag) (KETAAAKFERQHMDS) C ou interno Softag 1, para 13 (SLAELLNAGLGGS) 92 expressão de mamífero

Softag 3, para 8 (TQDPSRVG) 93 expressão procariótica O peptídeo SpyTag 13 (AHIVMVDAYKPTK) 94 se liga covalentemente à proteína SpyCatcher (Spy- tag) Marcador de 38 95 Terminal C ligação a (MDEKTTGWRGGHVVEGLA estreptavidina GELEQLRARLEHHPQGQRE (SBP-tag ou SBP) P) Proteína A 280 Terminal N estafilocócica (Protein A) Proteína G 280 Terminal N ou estafilocócica Terminal C (Protein G) Strep-tag 8–9 (WSHPQFEK) ou 96 Terminal N ou (AWAHPQPGG) 97 Terminal C Estreptavadina 159 Terminal N ou (Strep-tag) Terminal C Strep-tag ligando 8 (WSHPQFEK) 98 peptídeo estreptavidina ou estreptactina (Strep-tag II) SdyTag (Sdy-tag) 13 (DPIVMIDNDKPIT) 99 Modificador 100 Terminal N pequeno semelhante à ubiquitina (SUMO) SnoopTag 12 (KLGDIEFIKVNK) 100 SnoopTagJr 12 (KLGSIEFIKVNK) 101 Spot-tag 12 (PDRVRAVSHWSS) 102 Purificação de Variável Terminal N ou afinidade em Terminal C tandem (TAP) Epítopo T7 260 Terminal N Marcador 6 (CCPGCC) 103 tetracisteína (TC- tag) Tiorredoxina (Trx) 109 Terminal N ou Terminal C TrpE 25–336 Terminal N ou Terminal C Ty-tag 10 (EVHTNQDPLD) 104 Ubiquitina 76 Terminal N Universal 6 (HTTPHH) 105 Terminal N, Terminal C ou internal VSV-G ou VSV-tag 11 (YTDIEMNRLGK) 106 Terminal C

V5-tag 14 (GKPIPNPLLGLDST) 107 Marcador Xpress 8 (DLYDDDDK) 108

[0060] O uso de um marcador de proteína é exemplificado no pedido atual através do uso de marcador de proteína de poli-histidina (His-tag) como mostrado nas SEQ ID NOs.: 5, 10, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 e 31, mas uma pessoa versada na técnica reconheceria prontamente que qualquer número de outros marcadores de proteína pode ser usado para purificar as enzimas e/ou ser usado para anexar as enzimas a uma superfície como aqui descrito, dependendo do método de purificação usado e/ou da superfície à qual as enzimas estão ligadas. Tais marcadores de proteína podem ser selecionados a partir de qualquer um ou mais dos marcadores de proteína listados na TABELA A, mas outros desses marcadores de proteína são conhecidos na técnica.

[0061] Além disso, o uso de um ou mais locais de clivagem (por exemplo, o local de clivagem da trombina, conforme usado em SEQ ID NOs.: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 e 31) pode ser empregado para liberar o marcador de proteína da enzima ou de outra forma clivar a enzima. Um local de clivagem pode ser usado para a remoção da metionina N-terminal, peptídeo de sinal e/ou a conversão de uma proteína inativa ou não funcional em uma proteína ativa (isto é, zimogênios ou pró-enzimas). Alternativamente, um local de clivagem pode ser usado para separar duas ou mais enzimas que foram expressas na mesma fase de leitura. Os exemplos de enzimas que são capazes de clivar proteínas ou peptídeos e que teriam locais de clivagem específicos para a sequência podem ser selecionados de um ou mais dos seguintes: proteinase Arg-C; Endopeptidase Asp-N; endopeptidase Asp-N + Glu BNPS-Skatole N-terminal; Caspase 1; Caspase 2; Caspase 3; Caspase 4; Caspase 5 Caspase 6; Caspase 7; Caspase 8; Caspase 9; Caspase 10; Alta especificidade para quimiotripsina (terminal C para [FYW], não antes de P); baixa especificidade para quimiotripsina (terminal C para [FYWML], não antes de P); Clostripaína (Clostridiopeptidase B); CNBr; Enteroquinase; Fator Xa; Ácido fórmico; Glutamil endopeptidase; GranzymeB; Hidroxilamina; Ácido iodosobenzóico; LysC; LysN; NTCB (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzóico); Elastase de neutrófilos; Pepsina (pH 1,3); Pepsina (pH > 2); Prolina- endopeptidase; Proteinase K; Peptidase I estafilocócica; Protease do vírus etch do tabaco; Termolisina; Trombina; e tripsina.

[0062] Uma pessoa versada na técnica reconheceria que a combinação de uma enzima Galactosaminidase ativa e uma enzima GalNAcDeacetilase ativa, conforme descrito neste documento, capaz de clivar eficientemente o antígeno A é importante e aquela pessoa versada também reconheceria que a adição de um ou mais locais de clivagem e/ou um ou mais marcadores de proteína é opcional e que tais modificações podem ser selecionadas com base no sistema de expressão particular, sistema de purificação e possível estratégia de fixação de superfície. Além disso, são possíveis outras modificações nas sequências de Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase, desde que a atividade de clivagem de antígenos A não seja significativamente prejudicada. Além disso, as modificações nas enzimas Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase são possíveis, desde que a atividade de clivagem do antígeno A não seja significativamente prejudicada. As modificações nas sequências de Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase podem ser uma deleção, uma inserção e/ou uma substituição. A substituição pode ser uma substituição conservadora ou uma substituição neutra. Por exemplo, as sequências de Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase podem compartilhar 90% ou mais de identidade de sequência com as enzimas maduras. Por exemplo, as sequências de Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase podem compartilhar 85% ou mais de identidade de sequência com as enzimas maduras. Por exemplo, as sequências de Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase podem compartilhar 75% ou mais de identidade de sequência com as enzimas maduras.

Alternativamente, as sequências de Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase podem ter modificações em 5, 10, 13, 15, 20 ou até 25% dos aminoácidos.

[0063] Conforme usado neste documento, "adsorção em vidro, esferas de alginato ou matriz" se refere à ligação de uma enzima ao exterior de um material inerte.

Geralmente, esse tipo de imobilização não resulta de uma reação química e o sítio ativo da enzima imobilizada pode ser bloqueado pela superfície que foi absorvida, o que pode reduzir a atividade da enzima que está sendo absorvida.

[0064] Conforme usado neste documento, "aprisionamento" se refere ao aprisionamento de uma enzima dentro de esferas insolúveis ou microesferas. Porém, o aprisionamento pode dificultar a chegada do substrato e a saída dos produtos. Um exemplo é o uso de esferas de alginato de cálcio, que podem ser produzidas pela reação de uma mistura de solução de alginato de sódio e solução de enzima com cloreto de cálcio.

[0065] Tal como aqui utilizado, "reticulação" se refere à ligação covalente de enzimas entre si para criar uma matriz que consiste quase apenas em enzima. Quando uma reação enzimática de ligação cruzada é projetada, o sítio de ligação idealmente não cobre o sítio ativo da enzima, de modo que a atividade da enzima é afetada apenas pela imobilidade e não pelo bloqueio do sítio ativo da enzima.

No entanto, moléculas espaçadoras como poli(etilenoglicol) podem ser usadas para reduzir o impedimento estérico pelo substrato.

[0066] Tal como aqui utilizado, "ligação covalente" se refere à ligação de uma enzima a um suporte ou superfície insolúvel (por exemplo, um gel de sílica) por meio de uma ligação covalente. Devido à força das ligações covalentes entre as enzimas e o suporte ou superfície, há muito menos probabilidade de as enzimas se separarem do suporte ou superfície.

[0067] Tal como aqui utilizado, "agente de aglomeração" se refere a qualquer polímero ou proteína que facilita o aglomerado macromolecular concentrando a enzima na superfície da célula para melhorar a atividade da enzima. Um agente de aglomeração pode ser, por exemplo, um dextrano, um sulfato de dextrano, uma dextrina, um pululano, um poli(etilenoglicol), um Ficoll™, um glicerol hiper-ramificado e uma proteína inerte. (Kuznetsova, I.M et al. Int J Mol Sci. (2014) “What Macromolecular Crowding Can Do to a Protein” 15(12):23090 a 23140).

[0068] Como usado aqui, "dextrano" se refere a um polissacarídeo com pesos moleculares ≥ 1.000 Daltons e tendo uma estrutura linear de unidades de repetição de d- glucopiranosila ligadas a a. Os dextranos podem ser divididos em 3 classes estruturais (ou seja, classes 1 a 3) com base na estrutura do anel de piranose, que contém cinco átomos de carbono e um átomo de oxigênio. Os dextranos de classe 1 contêm a estrutura d-glucopiranosila ligada a a(1 → 6) modificada com pequenas cadeias laterais de ramificações de d-glicose com ligação a(1 → 2), a(1 → 3) e a(1 → 4). Os dextranos de classe 1 variam em seu peso molecular, arranjo espacial, tipo e grau de ramificação e comprimento das cadeias de ramificação, 3 a 5 dependendo das cepas de produção microbiana e das condições de cultivo. Isomaltose e isomaltotriose são oligossacarídeos com a estrutura de base de dextrana classe 1. Os dextranos (alternans) de classe 2 contêm uma estrutura de armação de unidades d-glucopiranosila ligadas a a(1 → 6) e a(1 → 6) com ramificações ligadas a a(1 → 3). Os dextranos (mutans) de classe 3 têm uma estrutura de base de unidades d-glucopiranosila ligadas a a(1 → 3) com ramificações ligadas a a(1 → 6).

[0069] Tal como aqui utilizado, "pululanos" são polissacarídeos estruturais produzidos principalmente a partir de amido pelo fungo Aureobasidium pullulans e são compostos de repetição de unidade de maltotriose ligada a a(1 → 6)(D-glucopiranosil- a(1 → 4)-D-glucopiranosil- a(1 → 4)-D-glicose) com a inclusão de unidades ocasionais de maltotetraose.

[0070] Tal como aqui utilizado, "dextrina" se refere a unidades de D-glucopiranosila com comprimentos de cadeia mais curtos do que dextrano, que começam com uma única ligação a(1 → 6), mas continuam linearmente com unidades D-glucopiranosila ligadas a a(1 → 4).

[0071] Conforme usado neste documento, "sulfatos de dextrano" são derivados de dextrano por meio de sulfatação.

[0072] Conforme usado neste documento, "Ficoll™" é um polissacarídeo hidrofílico neutro, altamente ramificado, de alta massa, que se dissolve prontamente em soluções aquosas.

[0073] Várias modalidades alternativas e exemplos são descritos neste documento. Estas modalidades e exemplos são ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0074] Produtos químicos e enzimas comerciais usados neste estudo foram adquiridos da Sigma-Aldrich™, a menos que indicado de outra forma. Os glicosídeos metilumbeliferil monossacarídeos foram um presente generoso do Dr. Hongming Chen e o subtipo 1penta-MU do antígeno A foi um presente generoso do Dr. David Kwan (Kwan et al.

2015).

Biblioteca metagenômica de fezes humanas

[0075] Para a geração da biblioteca de fosmídeo metagenômica humana, amostras fecais frescas humanas foram coletadas de um voluntário asiático saudável com grupo sanguíneo AB+. A extração direta de DNA e a criação da biblioteca de fosmídeos foram realizadas de acordo com o procedimento descrito no Protocolo MoE (Armstrong et al.

2017).

Triagem da biblioteca de fosmídeo

[0076] As placas da biblioteca de fosmídeo de sangue AB+ de 51 x 384 poços foram descongeladas à temperatura ambiente e replicadas em placas de 384 poços contendo 50 µl de meio LB de triagem (12,5 µg/mL de cloranfenicol, 25 µg/mL de canamicina, 100 µg/mL arabinose, 0,2% (v/v) de maltose, MgSO4 10 mM). As placas foram incubadas a 37 °C por 18 horas em um recipiente selado contendo um reservatório de água para evitar evaporação excessiva. 45 µl da mistura de reação (100 mM NaH2PO4, pH 7,4, 2% (v/v) Triton-X 100, 100 µM de GalNAc-a-MU, 100 µM de Gal-a-MU) foram adicionados em placas de triagem crescidas usando o Instrumento QFill™ [Genetix™]. As placas foram então incubadas a 37 °C em um recipiente selado por 24 h, e a fluorescência (Ex: 365 nm Em: 435 nm, modo de varredura, ganho 80) de cada placa foi medida nas horas 1, 2, 4, 8 e 24 por meio de um leitor de placas Synergy H1 [BioTek™].

Para todos os poços, foi calculado uma pontuação Z, que é dada pela fórmula: pontuação Z = (valor mediano da fluorescência)/Desvio Padrão.

[0077] Todos os acertos positivos acima de um certo limite, foram reorganizados em uma nova placa de 384 poços, designada a placa de "acerto de substrato simples" e armazenados a -70 °C. Duas placas de triagem foram replicadas a partir da placa de "acerto de substrato simples" e re-rastreadas para a atividade GalNAc-a-MU ou Gal-a-MU para verificar e deconvoluir a atividade detectada anteriormente.

[0078] Para determinar qual dos acertos pode clivar as estruturas do antígeno A ou do antígeno B, a sua atividade no subtipo 1tetra-MU do antígeno A 50 µM ou subtipo 1tetra-MU do antígeno B 50 µM foi determinada usando um ensaio de enzima acoplada. Uma versão deste ensaio acoplado foi descrita anteriormente por Kwan (Kwan et al. 2015). Nosso ensaio foi modificado para detectar também a clivagem do antígeno subtipo 1 A, pelo uso de BgaC (Jeong 2009) em vez de BgaA (Singh 2014) como enzima de acoplamento. Potenciais a-N-acetilgalactosaminidases ou a-galactosidases clivariam o açúcar terminal, liberando o antígeno H subtipo Itri-MU.

Posteriormente, uma a-fucosidase (AfcA (Katayarna 2004)), b-galactosidase (BgaC (Jeong 2009)) e b-hexosaminidase (SpHex (Williams 2002)) irá clivar os açúcares residuais em exoforma, até que o álcool 4-metilumbeliferílico seja liberado; detectável como aumento da fluorescência. Para conseguir isso, 50 µg/mL de cada enzima foram adicionados à mistura de reação. Todos os acertos positivos acima de um certo limite foram selecionados novamente em triplicado e uma cepa de célula hospedeira contendo um vetor sem qualquer inserção foi usada como controle negativo. Todos os resultados verificados foram armazenados separadamente a -70 °C em meio LB (12,5 µg/mL de cloranfenicol, 25 µg/mL de canamicina, 15% (v/v) de glicerol, 0,2% (v/v) de maltose, 10 mM de MgSO4).

Sequenciamento de acerto de fomsídeo

[0079] Para isolar o DNA de fosmídeo para sequenciamento, os estoques de glicerol de fosmídeo positivos foram usados para inocular 5 mL de meio TB (12,5 µg/mL de cloranfenicol, 25 µg/mL de canamicina, 100 µg/mL de arabinose, 0,2% (v/v) maltose, MgSO4 10 mM), incubado durante a noite a 37 °C 220 rpm. O isolamento do fosmídeo foi realizado usando o kit de miniprep de plasmídeo GeneJet™ (Thermo Fisher™). Os fosmídeos isolados foram purificados do DNA contaminante de E. coli linear usando Plasmid-Safe™ ATP-Dependent DNase (Epicenter™), seguido por outra rodada de purificação com um kit de purificação de PCR GeneJet™ (Thermo Fisher™). A concentração foi calculada com um kit de ensaio Quant-iT™ dsDNA HS (Invitrogen™) em um fluorímetro Qbit™

(ThermoFisher™). O tamanho de DNA esperado foi validado com um gel de agarose a 1%. Para sequenciamento completo de fosmídeo, 2 ng de cada fosmídeo foram enviados para o UBC Sequencing Centre (Vancouver, BC, Canadá). Cada fosmídeo foi individualmente codificado em barras e sequenciado usando um sistema Illumina MiSeq™.

[0080] Todos os dados de sequência bruta Illumina MiSeq™ foram aparados e montados usando um script python disponível no GitHub™ em https://github.com/hallamlab/FabFos. Resumidamente, Trimmomatic foi usado para remover adaptadores e sequências de baixa qualidade das leituras (Bolger 2014). Essas leituras foram selecionadas para sequências de vetor e hospedeiro usando BWA (Li 2013) e, em seguida, filtradas usando Samtools™ e um script bam2fastq para remover contaminantes. Essas leituras de alta qualidade e purificadas foram montadas por MEGAHIT com valores de k-mer variando entre 71 e 241, aumentando em incrementos de 10 (Li 2015). Uma vez que essas bibliotecas frequentemente tinham mais de 20.000 vezes de cobertura e para evitar o acúmulo de erros de sequenciamento interferindo na montagem de sequência adequada, a multiplicidade mínima de k-mer foi calculada por 1% da cobertura estimada de um fosmídeo. Fora dos conjuntos de script python, que geraram mais de um contig, foram então estruturados usando minimus2 (Treangen

2011). Comandos parametrizados podem ser encontrados na documentação na página GitHub™ e no próprio script python.

Predição de ORF de Fosmídeo e validação de acerto

[0081] ORFs de fosmídeo foram identificados usando a versão metagenômica do Prodigal™ (Hyatt 2010) e comparados com o banco de dados CAZy™ usando BLASTP™ como parte do pacote de software MetaPathways™ v2.5 (Konwar 2015).

Parâmetros MetaPathways™: comprimento > 60, pontuação do BLAST > 20, razão da pontuação da explosão > 0,4, valor EV < 1 x 10-6.

[0082] Todas as ORFs previstas com anotações para membros de uma família GH ou CBM (com atividades de a- galactosidase e/ou a-N-acetilgalactosaminidase conhecidas ou suspeitas) foram clonadas no plasmídeo pET16b usando a estratégia de clonagem Golden Gate™ (Engler 2008), as sequências de iniciador são apresentadas na TABELA B. As proteínas foram expressas em BL21 (DE3), cultivadas em 10 mL de meio de auto-indução ZY5052 (Studier 2005) durante 20 h a 37 °C, 220 rpm. As células foram coletadas por centrifugação (4000xg, 4 °C, 10 minutos) e ressuspensas em 1 mL de tampão de lise (100 mM NaH2PO4, pH 7,4, 2% (v/v) Triton-X™ 100, 1x inibidor de protease sem EDTA [Pierce™]).

Um ensaio acoplado (Kwan 2015) foi realizado com 50 µl de lisado celular bruto dos candidatos misturados com 50 µl de tampão de ensaio (100 mM NaH2PO4, pH 7,4, 50 µg/mL de SpHex, 50 µg/mL de AfcA, 50 µg/mL de BgaC, 100 µM de antígeno subtipo 1tetra-MU ou 100 µM de antígeno B subtipo 1tetra-MU) e incubados a 37 °C. Todas as reações foram realizadas como triplicatas em uma placa preta de 96 poços.

A fluorescência (365/435 nm) foi monitorada continuamente durante 4 horas usando um leitor de placas Synergy™ H1 [BioTek™]. Os ensaios de extratos brutos mostrando atividade de clivagem para o antígeno A ou B foram repetidos, desta vez sem as enzimas acopladas, e o produto da reação foi isolado através de uma coluna HF Bond Elut C18 e analisado com LC-MS e/ou TLC. A TLC foi realizada utilizando placas TLC Silica Gel 60 F254 TLC [EMD Millipore Corp.™, Billerica, MA, EUA].

TABELA B: Sequências de iniciador Primer Sequence SEQ ID NO: FpGalNAcDeAc_ ATGGTCTCGCCATGCAGACTCCAGCGAGTCCG 38 withoutSignalP_fw FpGalNAcDeAc_D1mi ATGGTCTCGATTCTTACGTCGTGTAGCCGGGGTC 39 n_rv FpGalNAcDeAc_D1ex ATGGTCTCGATTCTTAATCACTGGAGGTATATTTCA 40 t_rv CGACC FpGalNAcDeAc_D1+2 ATGGTCTCGATTCTTACGCAGGCTCGATTGGACCAT 41 _rv AC FpGalNAcDeAc_D2ex ATGGTCTCGCCATGATGTGGCGACGGTGGATGAG 42 t_fw FpGalNAcDeAc_rv ATGGTCTCGATTCTTATTCTCCCACATACGAAAAAT 43

AGTCG FpGalNase_ ATGGTCTCGCCATCGTGGTAAAAAGTTCATATCACT 44 withoutSignalP_fw CAC FpGalNase_truncA_ ATGGTCTCGATTCTTATGCGTTAGTGGTATAAGTCA 45 rv AATAGTC FpGalNase_rv ATGGTCTCGATTCTTATTCCGAAATTTCCACCGCTT 46

TAAC Ct5757_fw ATGGTCTCGccatTATAATTTAATTGATAATATTAG 47

TGTTGAAAAATTAG Ct5757_rv ATGGTCTCGattcTTATTGTGTTAAACCCTCAATAA 48

AC Ct5757_GalNase_rv ATGGTCTCGattcTTAATGAGTACTTTGATTTAATC 49

CATCATAAG Ct5757_DeAcase_fw ATGGTCTCGccatTCAGGGCAATATTGGTTAGTTTT 50

C Rp1021_fw ATGGTCTCGccatGGGAACGGATTAGAGGTGAAAG 51 Rp1021_rv ATGGTCTCGattcTCATAATACCATTTTGTATTTCT 52

TTATATTGG Rl8755_fw ATGGTCTCGccatGAAGAAACCGATTTGCTTGTAAA 53

C Rl8755_rv ATGGTCTCGattcTTAGCGTTCCAATATTTTCATAA 54

ATTCAG Rp3671_fw ATGGTCTCGccatTCACCATTGAGCGCTGCGG 55 Rp3671_rv ATGGTCTCGattcTTATGACTTTGTTTTAACATTTA 56

CAGACTTG Rp3672_fw ATGGTCTCGccatGCTGAGACTGCAACAGAAGAAAA 57

TG Rp3672_rv ATGGTCTCGattcTTATTTCTGAATTTTTGCCTTGC 58

CAG Ensaio HPAE-PAD

[0083] A análise da liberação enzimática de galactosamina foi realizada em um sistema HPAE-PAD (Dionex™) HPLC. A atividade de clivagem das diferentes proteínas foi testada nos seguintes substratos: 7,5 µg/µL de mucina de estômago de suíno Tipo II em NaH2PO4 100 mM, pH 7,4; 5 mM de antígeno A subtipo 1penta-MU em 100 mM NaH2PO4 pH 7,4 e RBCs (50% de hematócrito) de A+, B+ e doadores do tipo O em 1 x PBS pH 7,4. Amostras contendo 10 µg/mL de enzima foram incubadas por duas horas a 37 °C e então armazenadas a -80 °C para análise posterior. Pequenas alíquotas da reação (10 µl) foram diluídas em H2O (100 µl) e submetidas à análise no instrumento HPAE-PAD. A separação foi realizada em uma coluna CarboPAC PA200™ (150 mm) com coluna de guarda, e a detecção foi obtida usando um eletrodo de ouro descartável em politetrafluoroetileno (PTFE) e uma forma de onda de quatro potenciais. As condições de separação foram as seguintes: hidróxido de sódio 100 mM e um gradiente de acetato de sódio de 70 a 300 mM ao longo dos primeiros 10 minutos da separação. O eluente foi mantido nas condições finais do gradiente durante 1 minuto e depois voltou às condições iniciais no minuto seguinte. O fluxo foi de 1,0 ml/min e uma injeção foi feita a cada 27 minutos. Um padrão dos açúcares livres GalNAc, Gal e GalN (10 µM) foi também aplicado a HPAE-PAD para determinar o tempo de eluição de pico para referência.

Ensaios cinéticos

[0084] Todos os ensaios cinéticos utilizando 4- metilumbeliferona como grupo de saída foram realizados através da medição de fluorescência. Para evitar erros de medição com base no efeito do filtro interno (Palmier 2007), curvas padrão foram usadas para validar a faixa linear do fluoróforo.

FpGalactosaminidase

[0085] O parâmetro Michaelis-Menten foi determinado para o subtipo 1penta-MU do antígeno GalN e o subtipo 1penta-MU do antígeno A em NaH2PO4 100 mM, pH 7,4 a 37 °C. A reação foi realizada em 100 µl com 3,4 nM de FpGalactosaminidase

(5,31 nM de FpGalNase_truncA) e 0,1 mg/mL de SpHex, AfcA, 0,2 mg/mL de BgaC e concentrações variáveis de substrato (5 µM a 2 mM). As reações foram realizadas como uma série de quatro com controles (sem FpGalactosaminidase) como duplicatas. O sinal de fluorescência (365/435 nm) resultante da liberação de MU por hidrólise foi monitorado pelo leitor de placas Synergy H1™ [BioTek™] e convertido para concentração usando curvas de concentração padrão de MU determinadas em condições de reação idênticas. As taxas iniciais (µM/s) foram determinadas e plotadas no Grafit

7.0™ para determinar os parâmetros cinéticos.

[0086] O parâmetro kcat/KM foi determinado para o antígeno GalN subtipo 1/2/4tetra-MU e o antígeno B subtipo 1tetra-MU a pH 7,4 e 37 °C. As reações (volume total de 100 µL) foram realizadas em poços de 96 placas pretas e como ensaios acoplados em NaH2PO4 100 mM (pH 7,4) com FpGalactosaminidase 8,63 nM, SpHex 0,1 mg/mL, BgaC (BgaA para o subtipo 2), AfcA, variando concentrações de substrato (25 µM, 20 µM, 15 µM, 10 µM, 7,5 µM, 5 µM). As reações foram realizadas como uma série de quatro com controles (sem FpGalactosaminidase) como duplicatas. O sinal de fluorescência (365/435 nm) resultante da liberação de MU por hidrólise foi monitorado pelo leitor de placas Synergy H1™ [BioTek™] e convertido para concentração usando curvas de concentração padrão de MU determinadas em condições de reação idênticas. As taxas iniciais (µM/s) foram determinadas e plotadas no Grafit 7.0™ para determinar os parâmetros kcat/KM (s-1*mM-1).

[0087] Os parâmetros de Michaelis-Menten foram determinados para GalN-a-pNP em 96 placas transparentes a 37 °C com FpGalactosaminidase 863,2 nM (em NaH2PO4 100 mM, pH 7,4) ou FpGH4 369,9 nM (em Tris/HCl 50 mM, pH 7,4, NAD+ 100 µM, MnCl2 1 mM) com concentrações variáveis de substrato (10 µM a 5 mM) em um volume de 100 µl. As reações foram realizadas como uma série de três com dois controles (sem enzima). A absorção (a 405 nm) resultante da liberação de pNP por hidrólise foi monitorada pelo leitor de placas Synergy H1™ [BioTek™] e convertida para concentração usando curvas de concentração padrão de p-nitrofenol determinadas em condições de reação idênticas. As taxas iniciais (µM/s) foram determinadas e plotadas no Grafit 7.0™ para determinar os parâmetros cinéticos.

FpGalNacDeacetilase

[0088] Os parâmetros de Michaelis-Menten foram determinados para o subtipo de antígeno A 1penta-MU em NaH2PO4 100 mM, pH 7,4 a 37 °C usando os ensaios acoplados descritos anteriormente (Kwan 2015). O ensaio foi modificado para permitir a detecção da clivagem do subtipo

1 (e posteriormente 4), pelo uso de BgaC (Jeong 2009) em vez de BgaA (Singh 2014) como b-galactosidase. Além disso, uma vez que o subtipo de antígeno A 1penta-MU contém uma galactose adicional, a concentração de BgaC foi aumentada para 0,2 mg/mL para compensar sua necessidade de clivar tanto o Gal-b-1,3-b-GlcNAc-b-1,3-Gal-b-MU e Gal-b-MU. Além disso, a FpGalactosaminidase foi incluída para permitir a clivagem do intermediário contendo galactosamina. A configuração da reação em 100 µl foi 3 nM FpGalNacDeacetilase (4,52 nM FpGalNacDeAc_D1ext, 3,55 nM FpGalNacDeAc_D1+2) e 0,01 mg/mL de FpGalactosaminidase, 0,1 mg/mL de SpHex, AfcA, 0,2 mg/mL de substrato BgaC e variando as concentrações de substrato (5 µM a 2,5 mM). As reações foram realizadas como uma série de quatro com controles (sem FpGalNacDeacetilase) como duplicatas. O sinal de fluorescência (365/435 nm) resultante da liberação de MU por hidrólise foi monitorado em um leitor de placas Synergy H1™ (BioTek™) e convertido para concentração usando curvas de concentração padrão de MU determinadas em condições de reação idênticas. As taxas iniciais (µM/s) foram determinadas e plotadas no Grafit 7.0 para determinar os parâmetros cinéticos.

[0089] O parâmetro kcat/KM foi determinado para o antígeno A subtipo 1/2/4tetra-MU a pH 7,4 a 37 °C. As reações

(volume total de 100 µL) foram realizadas em poços de 96 placas pretas e como ensaios acoplados em 100 mM NaH2PO4 (pH 7,4) com 12 nM FpGalNAcDeacetilase 0,1 mg/mL de SpHex, BgaC (BgaA para o subtipo II), AfcA, em concentrações variadas de substrato (25 µM, 20 µM, 15 µM, 10 µM, 7,5 µM, 5 µM). As reações foram realizadas como uma série de quatro com controles (sem FpGalNAcDeacetilase) como duplicatas. O sinal de fluorescência (365/435 nm) resultante da liberação de MU por hidrólise foi monitorado em um leitor de placas Synergy H1™ (BioTek™) e convertido para concentração usando curvas de concentração padrão de MU determinadas em condições de reação idênticas. As taxas iniciais (µM/s) foram determinadas e plotadas no Grafit™ 7.0 para determinar os parâmetros kcat/KM (s-1*mM-1).

Cinética do subtipo GH109

[0090] O parâmetro kcat/KM foi determinado para o antígeno A subtipo 1/2/4tetra-MU a pH 7,4 e 37 °C. As reações (volume total de 100 µL) foram realizadas em 96 poços de placa preta e realizadas como ensaios acoplados em 100 mM NaH2PO4, pH 7,4 com 86,02 nM BvGH109_1/100,49 nM EmGH109/80,52 nM BvGH109_2/87,4 nM BsGH109 e 5 µM NAD+, 0,1 mg/mL de cada um de SpHex, BgaC (BgaA para Subtipo 2), AfcA, concentrações variáveis de substrato (25 µM, 20 µM, 15 µM, 10 µM, 7,5 µM, 5 µM). As reações foram realizadas como uma série de quatro com controles (sem a-N- acetilgalactosaminidase) como duplicatas. O sinal de fluorescência (365/435 nm) resultante da liberação de MU por hidrólise foi monitorado pelo leitor de placas Synergy H1™ [BioTek™] e convertido para concentração usando curvas de concentração padrão de MU determinadas em condições de reação idênticas. As taxas iniciais (µM/s) foram determinadas e plotadas no Grafit 7.0™ para determinar os parâmetros kcat/KM (s-1*mM-1).

Cristalografia

[0091] Antes da cristalização, FpGalNAcDeAc_D1ext foi digerido com trombina (Novagen™) a uma concentração de 1 mg/mL durante a noite usando o protocolo sugerido pelo fabricante. A proteína foi então purificada por coluna HisTrap FF e o fluxo foi coletado, trocado por tampão em Tris 10 mM pH 8,0 + NaCl 75 mM e concentrado a 12 mg/mL.

Cristalização

[0092] FpGalNAcDeAc_D1ext (12 mg/mL) foi cristalizado pelo uso do método de difusão de gota suspensa usando uma solução de reservatório composta por 0,2 M de CaCl2, 0,1 M de MES de pH 6, 18% de PEG 4000 e 20 mM de MnCl2 a 1:1 relação proteína:reservatório. Uma rápida imersão de brometo foi usada para derivatizar os cristais para o faseamento e foi preparada pela transferência do cristal para uma solução de NaBr 1 M, glicerol 25%, PEG4000 18%, CaCl2 20 mM e pH Mes 0,1 M por 30 segundos e flash congelados em nitrogênio líquido. Os complexos de cristal com trissacarídeo de antígeno do grupo sanguíneo B (B_tri) foram preparados por pré-incubação de proteína (12 mg/mL) com 10 mM de B_tri por 2 horas antes de configurar gotas nas mesmas condições acima, mas omitindo MnCl2. Os cristais foram crioprotegidos com solução reservatório suplementada com glicerol 25%.

Coleta de dados, determinação de fases e estrutura

[0093] Conjuntos de dados foram coletados na Canadian Light Source™. Os dados foram integrados usando XDS (Kabsch 2010) e dimensionados com Aimless™ (Evans 2013). A solução de fases e estrutura automatizada foi realizada usando CRANK2™ (Skubak 2013) no conjunto de programas CCP4I2™ (Potterton 2018). A estrutura foi verificada e refinada usando ciclos alternados de Coot™ (Emsley 2004) e Refmac™ (Vagin 2004). O complexo da estrutura B_tri foi resolvido pela diferença de Fourier e o ligante foi construído manualmente em Coot™ assim como a água e os íons metálicos.

Os mapas de densidade de diferença confirmaram a presença de Mn2+ na estrutura apo e Ca2+ na estrutura ligante. Os modelos foram validados por Coot™ e Molprobity™ (Chen 2010). Coordenadas atômicas e fatores de estrutura do complexo apo e B_tri foram depositados no Protein Data Bank

(PDB) com números de acesso: Proteína GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii SEQ ID NO: WP_009260926.1; e Proteína Galactosaminidase de Flavonifractor plautii SEQ ID NO: WP_044942952.1 Mutagênese de sítio ativo

[0094] Com base em informações estruturais (não mostradas) e alinhamento de sequência (não mostrado), FpGalNAcDeAc_D1min e FpGalNase_truncA foram mutados usando o protocolo QuickChange™ (Zhang 2004), utilizando os iniciadores observados na TABELA B. Os mutantes foram purificados por meio de colunas NiNTA e HIC como descrito acima. A integridade estrutural de todos os mutantes foi verificada por meio de espectroscopia de CD; todas as enzimas testadas eram estruturalmente semelhantes ao seu tipo selvagem. Para mutantes com atividade relativamente baixa, as reações foram realizadas sob as mesmas condições usadas para determinações cinéticas completas; no entanto, o método de esgotamento do substrato foi usado para a determinação dos valores de kcat/KM, conforme descrito anteriormente (Vocadlo 2002). Em resumo: em baixas concentrações de substrato, onde [Substrato] < KM (equivalente a ~1/5 a 1/10 de Km), o valor kcat/KM pode ser aproximado mediante ajuste não linear do curso do tempo de reação a uma primeira ordem curva e dividindo pela concentração de enzima.

Mapeamento filogenético de GH36

[0095] Sequências de referência de GH36 foram baixadas do banco de dados CAZy™ usando o script SACCHARIS™ cazy_extract.pl (Jones 2018). O software de perfil de proteína com base filogenética, TreeSAPP™ (disponível em https://github.com/hallamlab/TreeSAPP), foi usado para construir as árvores de referência e mapear as sequências para essas árvores. Resumidamente, HMMs de dbCAN foram usados para extrair domínios da família de proteínas de todas as sequências de comprimento total baixadas do CAZy™ (Yin 2012). Essas sequências foram então agrupadas em 70% de similaridade de sequência usando UCLUST™ para remover o espaço de sequência redundante e diminuir o tamanho da árvore (Edgar 2010). RAxML™ versão 8.2.0 foi usado para construir as árvores de referência com o '--autoMRE' para decidir quando encerrar a inicialização antes de 1000 replicados terem sido realizados, e PROTGAMMAAUTO™ para selecionar o modelo de proteína ideal (Stamatakis 2006; e Stamatakis 2008).

[0096] TreeSAPP™ foi então usado para mapear as sequências de consulta nessas árvores de referência.

Resumidamente, as sequências de proteínas foram alinhadas aos HMMs usando hmmsearch™ e as regiões alinhadas foram extraídas (Eddy 1998). O hmmalign™ foi usado para incluir as novas sequências de consulta no alinhamento múltiplo de referência e então o TrimAl™ removeu as posições não conservadas do arquivo de alinhamento (Capella-Gutierrez 2009). RAxML™ foi usado para classificar as sequências de consulta na árvore de referência por meio de inserções. As veiculações de cada sequência de consulta foram filtradas e concatenadas em uma única. Arquivo Jplace™ antes de ser visualizado no iTOL™ (Matsen 2012; e Letunic 2016).

Ensaios de RBC

[0097] Sangue total de doadores saudáveis consentindo foi coletado em um Vacutainer citrato usando um protocolo aprovado pelo comitê de ética clínica da Universidade de British Columbia. O tubo foi centrifugado a 1000xg por 4 minutos à temperatura ambiente, e os RBCs foram separados e lavados 3 vezes com 1 x PBS pH 7,4. Para os ensaios na presença de dextrano 40k, RBCs lavados (200 µL, 10% de hematócrito) foram colocados em um tubo e o sobrenadante foi parcialmente removido e substituído por 1 x PBS pH 7,4 com e sem dextrano 40k (concentração final de 300 mg/mL). Além disso, alguns ensaios foram realizados em 1 x PBS pH 7,4 + plasma 25% ou plasma 100%. RBCs foram misturados cuidadosamente e colocados em um agitador orbital por 30 s. Soluções de enzima diluída foram então adicionadas, para um volume final de 200 µL. Os tubos foram agitados com muito cuidado e colocados em um agitador orbital por tempos definidos em temperaturas definidas.

Cartões MTS

[0098] Após a reação, os RBCs foram lavados 3 vezes com um excesso de 1 x PBS pH 7,4 e analisados usando cartões Micro Typing System™ (MTS) [MTS™, Flórida, EUA].

RBCs (12 µl, 5% de hematócrito), suspensos em diluente [MTS, Flórida, EUA], foram adicionados cuidadosamente à minicoluna de gel, deixando um espaço entre o sangue e o conteúdo do minigel. Os cartões MTS foram centrifugados a 156xg por 6 minutos em temperatura ambiente usando uma centrífuga Beckman Coulter Allegra X-22R™ com um suporte de amostra modificado conforme recomendado. A extensão da remoção do antígeno da superfície da RBC foi avaliada a partir da localização das RBCs no mini gel após a rotação, de acordo com as instruções do fabricante. RBCs com uma alta concentração de antígeno de superfície aglutinaram após a interação com o anticorpo monoclonal presente na coluna de gel e não puderam penetrar (pontuação MTS™ 4).

RBCs sem antígenos de superfície não aglutinaram e migraram para o fundo do minigel (pontuação MTS 0). RBCs que passaram por remoção parcial de antígenos de superfície migraram para posições entre estes e foram atribuídas pontuações entre 0 (não presente) e 4 (presente) de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaios de aglutinação para antígeno H

[0099] Para analisar a conversão do antígeno A em antígeno H após o tratamento enzimático, A-ECO-RBCs lavados foram misturados em partes iguais com 2 µg/mL de anticorpo anti-H (anticorpo de antígeno ab Anti-Grupo Sanguíneo H [97-I]: cat No. ab24213 (Abcam™)) e o aparecimento de aglutinação dentro de um período de 30 minutos monitorado.

RBCs que sofreram aglutinação com o anticorpo Anti-H foram atribuídos pontuações entre 0 (sem aglutinação em 1800 segundos) e 5 (aglutinação em 120 segundos).

FACS

[00100] RBCs tratados com enzima foram lavados 2 x com 1 x PBS pH 7,4 e 1% de hematócrito ECO-RBCs foram tratados com anticorpo 1/100 APC-anti-A (Alexa Fluor™ 647 Ratinho Anti-Humano Grupo Sanguíneo A: cat No. 565384 (BD Pharmingen™)) e/ou anticorpo anti-H (anticorpo antígeno ab Anti-Grupo sanguíneo H [97-I]: cat No. Ab24213 (Abcam™)) por 30 minutos à temperatura ambiente, em seguida, lavado 2 x com 1 x PBS pH 7,4. Para a detecção do anticorpo anti- H, foi utilizado um anticorpo secundário marcado com FITC (cadeia mu de IgM anti-camundongo F(ab')2 de cabra (FITC): cat No. Ab5926 (Abcam™)) em uma concentração de 1/500. Os dados foram avaliados após reconstituição em 1 x PBS pH 7,4 (hematócrito a 1%) com um citômetro de fluxo (CytoFLEX™ (Beckman Coulter™)).

Adsorção de enzimas e antigenicidade

[00101] Para testar se as enzimas podem ser prontamente removidas das RBCs após o tratamento, a adsorção potencial foi avaliada. FpGalNAcDeacetilase e FpGalNase (F/P = 1) marcados com azul Pacífico foram incubados com os RBCs por 1 h a 37 °C sozinhos, e após várias etapas de lavagem e, em seguida, a fluorescência residual medida em um citômetro de fluxo (CytoFLEX™ (Beckman Coulter™)).

[00102] A antigenicidade foi testada incubando RBCs com 50 µg/mL de cada enzima e misturando os RBCs tratados com enzima com soro alogênico ou autólogo, observando potencial aglutinação. Além disso, para avaliar a exposição potencial a Anti-IgG, -C3d, os RBCs tratados foram testados em cartões Anti-IgG, -C3d MTS™ [MTS™, Flórida, EUA]. O tempo de incubação foi de 30 minutos a 37 °C.

Síntese de subtipo de antígeno

[00103] A síntese dos subtipos 1/2/4tetra-MU dos antígenos A e B foi realizada com um protocolo modificado, descrito em Kwan (Kwan et al. 2015).

Síntese de antígeno H de duas etapas subtipo 1/2/4tri-MU

[00104] Todas as três sínteses foram realizadas em escalas de 20 mg de GalNAc-a-MU/GlcNAc-a-MU em 10 mL de Tris/HCl 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4, MnCl2 10 mM,

Fosforilase alcalina 50 U, 1,5 UDP-Gal equivalente, 1,2 PIB-Fuc equivalente (dimensionado no produto LacNAc-MU).

Dependendo do produto desejado, foram adicionadas diferentes glicosil transferases em uma concentração de 100 µg/mL; para o subtipo I CgtB S42 e Te2FT, para o subtipo II HP0826 e WbgL, para o subtipo IV LgtD e Te2FT. A reação foi realizada a 37 °C e o progresso controlado via TLC (fase móvel, EtAc:MeOH:H2O com uma proporção de 6:2:1), a 4-metilumbeliferona foi hidrolisada dos compostos via H2SO4 a 10% e detectada via UV (360 nm). Após nenhum aumento adicional do produto poder ser observado, a reação foi aplicada a uma coluna HF Bond Elut C18, lavada com vários volumes de coluna de 5% de metanol e o produto foi eluído com 25% de metanol. O solvente foi então removido sob vácuo.

Síntese de antígeno subtipo 1/2/4tetra-MU

[00105] A etapa de síntese final foi realizada na escala de 10 mg de antígeno H subtipo 1/2/4tri-MU em 5 mL de Tris/HCl 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4, MnCl2 10 mM, Fosforilase alcalina 25 U, 1,5 UDP-GalNAc equivalente e BgtA 100 µg/mL a 37 °C. O progresso foi seguido por meio de TLC, após nenhum aumento de produto adicional poder ser observado, a reação foi aplicada a uma coluna HF Bond Elut C18, lavada com vários volumes de coluna de metanol a 5% e o produto foi eluído com metanol a 25%. O solvente foi então removido sob vácuo. O produto final foi ainda purificado em uma coluna de exclusão de tamanho HW-40F de 1,5 x 46 cm e, em seguida, liofilizado.

Síntese de antígeno B subtipo 1/2/4tetra-MU

[00106] A etapa de síntese final foi realizada na escala de 10 mg de antígeno H subtipo 1/2/4tri-MU em 5 mL de Tris/HCl 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4, Fosforilase alcalina 25 U, 1,5 equivalente UDP-Gal e BoGT6a 100 µg/mL a 37 °C. O progresso foi seguido por meio de TLC, após nenhum aumento de produto adicional poder ser observado, a reação foi aplicada a uma coluna HF Bond Elut C18, lavada com vários volumes de coluna de metanol a 5% e o produto foi eluído com metanol a 25%. O solvente foi então removido sob vácuo. O produto final foi ainda purificado em uma coluna de exclusão de tamanho HW-40F de 1,5 x 46 cm e, em seguida, liofilizado.

Síntese de antígeno GalN subtipo 1penta-MU

[00107] 10 mg de antígeno A subtipo 1penta-MU foram incubados com 1 µg/mL de FpGalNAcDeacetilase em 5 mL de NaH2PO4 100 mM a 37 °C por 30 minutos e então interrompidos através da adição de EDTA 1 mM. A conversão completa do substrato foi verificada por meio de TLC e a reação aplicada a uma coluna HF Bond Elut C18, lavada com vários volumes de coluna de 2% de metanol e o produto foi eluído com 10% de metanol. O solvente foi então removido sob vácuo.

Purificação de proteína

[00108] Todas as proteínas e seus truncamentos foram clonados por meio de clonagem Golden Gate™ (Engler 2008) ou clonagem PIPE (Klock 2008) em pET16b ou pET28a. As sequências de iniciador são apresentadas na TABELA B.

[00109] A produção de proteínas para caracterização estendida foi realizada em células BL21 (DE3), cultivadas em 200 mL de meio de auto-indução ZY5052 (Studier 2005) por 20 h a 37 °C, 220 rpm inoculado com 100 µl de uma cultura LB durante a noite. As células foram coletadas por centrifugação (4000xg, 40 °C, 10 minutos) e ressuspensas em 10 mL de tampão de lise (Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, 1% (v/v) de Glicerol, Imidazol 40 mM, pH 7,4, DTT 2 mM, 1 x inibidor de protease sem EDTA (Pierce™), 2 U de benzonase (Novagen™), 0,3 mg/mL de lisozima, MgCl2 10 mM), seguido de sonificação (tempo de pulso de 3 minutos; pulso de 5 s, pausa de 10 s, 35% de amplitude) no gelo. Após a remoção dos resíduos celulares por centrifugação (14000xg. 4 °C, 30 minutos), o sobrenadante foi coletado e carregado em uma coluna de cromatografia de afinidade de níquel (coluna HisTrap HP™ de 5 mL (GE™)) usando uma bomba peristáltica. A eluição foi realizada e monitorada em um sistema

AEKTApurifier™ (GE™) com um gradiente de 10 a 75% de Tris/HCl 50 mM, Imidazol 400 mM, pH 7,4, DTT 2 mM, via SDS- PAGE, as frações contendo a proteína foram identificadas e agrupadas. A troca do tampão em Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, DTT 2 mM e a concentração foi realizada em Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15™ MWCO 10 kDa (Millipore™).

[00110] FpGalNAcDeacetilase, FpGalactosaminidase e seus truncamentos tiveram que passar por uma segunda rodada de purificação, um filtro centrífugo Amicon Ultra-15 Units™ MWCO 10 kDa (Millipore™) foi usado para trocar os tampões antes de carregar as proteínas em uma coluna de cromatografia de interação hidrofóbica (Coluna de 10 mL Phenyl Sepharose High Performance (Pharmacia Biotech™)). O carregamento, a lavagem e a eluição (gradiente 0 a 100%) da coluna foram processados através de um sistema AEKTApurifier™ (GE™), utilizando as seguintes condições tampão: FpGalNAcDeacetilase; ligação 1 x PBS, NH2PO4 800 mM, pH 7,4 e eluição 1 x PBS, pH 7,4 e FpGalactosaminidase; ligando Tris/HCl 25 mM, NaCl 1 M, pH 7,4 e eluição Tris/HCl 25 mM pH 7,4. Por meio de SDS-PAGE, as frações contendo a proteína foram identificadas e depois reunidas. A troca do tampão em Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 e a concentração foi realizada em Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15™ MWCO 10 kDa (Millipore™).

Caracterização de proteínas Valor de pH ideal

[00111] A faixa geral de pH para a atividade de FpGalNAcDeacetilase e FpGalactosaminidase para o antígeno A subtipo 1penta-MU e o antígeno GalN subtipo 1penta-MU, respectivamente, foi determinada pela ocorrência do produto em placas de TLC para valores de pH variáveis. A reação foi realizada em escalas de 100 µl a 37 °C com substrato 50 µM e 1 µg/mL de enzima no sistema tampão apropriado. Os tampões para pH 4 a 6 foram baseados em um tampão de ácido cítrico/citrato de sódio 50 mM, para pH 6 a 8 um tampão de fosfato de sódio 50 mM e pH 8 a 10 um tampão de glicina/hidróxido de sódio 50 mM.

[00112] Para determinar o valor de pH ideal, 5 µg/mL de FpGalactosaminidase foi incubada em 100 µl de tampão de fosfato de sódio 50 mM com faixa de pH variável (5,8 a 8,0) e 200 µM de GalN-a-pNP. A absorção (a 405 nm) resultante da liberação de pNP foi monitorada por um leitor de placas Synergy H1™ (BioTek™) durante 1 h a 37 °C.

[00113] 5 µg/mL de FpGalNAcDeacetilase e 50 µM de subtipo de antígeno Ipenta-MU foram pré-incubados por 10 minutos a 37 °C em tampão de fosfato de sódio 25 mM com faixa de pH variável (5,8 a 10,0). A reação foi extinta com tampão de fosfato de sódio 100 mM pH 7,5, EDTA 100 µM,

FpGalactosaminidase 5 µg/mL, SpHex 50 µg/mL, AfcA 50 µg/mL e BgaC 50 µg/mL, volume final 100 µl. O sinal de fluorescência (365/435 nm) resultante da liberação de MU por hidrólise foi monitorado por um leitor de placas Synergy H1™ (BioTek™) por 30 minutos a 37 °C.

Estabilidade da proteína

[00114] FpGalNAcDeacetilase e FpGalNase foram armazenadas em tampão PBS 1 x pH 7,4 a 4 °C. Após 2 e 12 semanas, a atividade das enzimas foi testada conforme descrito para o pH ótimo contra o antígeno A subtipo 1penta-MU em uma reação de enzima acoplada para FpGalNAcDeacetilase e com GalN-a-pNP para FpGalNase.

Inibição de FpGalNAcDeacetilase

[00115] FpGalNAcDeacetilase foi testada contra diferentes inibidores potenciais em formato de placa de 96 poços como um ensaio acoplado. A reação foi realizada em escala de 100 µL a 37 °C com 50 µM de antígeno A subtipo 1penta-MU e 5 µg/mL de FpGalNAcDeacetilase em NaH2PO4 100 mM pH 7,4 com 10 µg/mL de FpGalactosaminidase, 50 µg/mL de SpHex, 50 µg/mL de AfcA, 50 µg/mL de BgaC. Como inibidores EDTA (1, 10, 100 µM), Marimastat (1, 10, 100, 1000 µM), DMSO (2%, 4%), Coquetel Inibidor de Protease sem EDTA (Pierce™) (1 x, 2 x e 4 x) foram testados. A fluorescência (365/435 nm) foi monitorada continuamente durante 1 hora usando um leitor de placas Synergy H1™ (BioTek™). Os aditivos que mostraram efeitos fortes foram executados novamente sem as enzimas acopladas e a formação do produto analisada por TLC.

Proteólise limitada

[00116] Para investigar se existem subdomínios menores e estáveis de FpGalactosaminidase, uma proteólise limitada foi realizada. A FpGalactosaminidase foi tratada com Termolisina (proporção de massa de proteína:protease de 10:1) a várias temperaturas (20 °C, 37 °C, 42 °C, 50 °C e 65 °C) durante 1,5 h. As amostras foram então corridas em um gel SDS-PAGE e um fragmento estável foi identificado rodando em torno de 70 kDa (abaixo dos 118 kDa iniciais) com digestão quase completa alcançada na temperatura de incubação de 50 °C. Este fragmento foi enviado para a instalação de núcleo proteômica UBC para identificação de peptídeo e foi determinado ser uma versão truncada do terminal C da proteína de comprimento total com local de clivagem entre os aminoácidos 690-700.

Triagem de matriz de glicano

[00117] Para a triagem de matriz de glicano, 500 µg de FpGalNAcDeAc_D2ext foram marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) com uma razão F/P de 1 usando o kit de conjugação Fluorotag™ FITC (Sigma™). A triagem foi realizada no CFG Protein-Glycan Interaction Core Facility™ com a versão 5.3 do arranjo impresso, consiste em 600 glicanos em réplicas de 6 para 5 e 50 µg/mL de concentração de proteína. A análise dos motivos de ligação foi realizada com o webtool na Emory University (https://glycopattern.emory.edu/).

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Construção e triagem da biblioteca metagenômica

[00118] Foi construída uma biblioteca metagenômica que contém grandes (35 a 65 kb) fragmentos de DNA extraídos de amostras fecais fornecidas por um doador do sexo masculino do tipo sanguíneo AB+. Essa biblioteca contém vários genes por bactéria, aumentando a probabilidade de expressão de pelo menos alguns desses genes e permitindo a expressão de pequenas “vias” de vários genes. Nossa biblioteca compreendia ~19.500 clones em placas de 51 x 384 poços, potencialmente em torno de 800.000 genes, portanto, a triagem inicial de tal biblioteca com substratos de antígeno A caros era impraticável. Em vez disso, primeiro foi rastreado com substratos fluorogênicos simples e sensíveis - os metilumbeliferil a-glicosídeos de galactose e N-acetil-galactosamina (Gal-a-MU e GalNAc-a-MU). Essa tela inicial, com uma mistura dos dois substratos, rendeu um subconjunto de 226 acertos. Estes foram re-selecionados contra cada substrato individual, identificando 44 com atividade de GalNAcase e 166 com atividade de galactosidase. Uma segunda rodada de triagem foi realizada nesses acertos usando os substratos de glicosídeo tetrassacarídeo de antígeno A e antígeno B mostrados na FIGURA 1, usando um ensaio de enzima acoplada (Kwan 2015), juntamente com um controle sem substrato: somente se o Gal inicial ou GalNAc é clivado se as enzimas de acoplamento atuarem e liberarem MU. Onze desses acertos continham atividade de clivagem do antígeno A, um dos quais também clivou o antígeno B, enquanto seis produziram fluorescência na ausência de substrato, portanto, codificam vias que geram produtos fluorescentes não relacionados.

EXEMPLO 2: Sequenciamento e análise inicial de acertos

[00119] Os onze fosmídeos foram sequenciados em um Illumina MiSeq™ e ORFs nele que estão presentes no banco de dados CAZy™ (http://www.cazy.org/)(Lombard 2014) foram identificados usando o software Metapathways™ (Konwar 2015). Devido à profundidade considerável do sequenciamento do microbioma humano agora disponível, os organismos dos quais todos os fosmídeos foram derivados puderam ser identificados. Suas sequências podem ser agrupadas em cinco grupos, já que oito dos onze derivaram de fragmentos sobrepostos dos genomas de apenas dois Bacteroides sp. O único gene comum a todos os fosmídeos no agrupamento B é uma enzima GH109 (B. vulgatus); O agrupamento A também contém um GH109 (B. stercoris), enquanto um GH109 é o único gene CAZy encontrado no outro fosmídeo derivado de Bacteroides (B. vulgatus). Fosmídeo N08, do anaeróbio obrigatório Flavonifractor plautii (Li 2015), contém três ORFs encontrados em CAZy: um módulo de ligação de carboidrato aparente CBM32 e duas potenciais hidrolases de glicosídeo - um GH36 e um GH4. Finalmente fosmídeo K05 de um Collinsella sp., provavelmente Collinsella tanakaei, não contém ORFs relacionados a CAZy. Aqui, a geração de uma sub-biblioteca de fosmídeo K05 permitiu a identificação da ORF com atividade de clivagem A, posteriormente identificada como GH36 (não mostrada).

EXEMPLO 3: Análise das enzimas GH109

[00120] A família GH109 foi fundada com base na atividade de clivagem do antígeno A de vários de seus membros. Essas enzimas empregam um mecanismo dependente de NAD+ incomum, descoberto pela primeira vez em enzimas de GH4 Add Yip Ref (2004) J. Amer. Chem. Soc., 126, 8354 a 8355 uma vez que foi este que mostrou o mecanismo (Varrot 2005; e Liu 2007). Os três genes GH109 identificados aqui foram clonados com um marcador de His após a remoção dos peptídeos de sinal e expressos em Escherichia coli BL21 (DE3). Estas três proteínas, BsGH109, BvGH109_1 e BvGH109_2 (não mostradas), juntamente com o GH109 canônico de Elizabethkingia meningosepticum (EmGH109) (Liu 2007) como um padrão foram purificados e os parâmetros cinéticos para cada um foram determinados. As três novas enzimas exibiram eficiências catalíticas semelhantes com cada um dos três substratos do subtipo A testados, refletindo amplamente os parâmetros cinéticos do padrão EmGH109. Por outro lado, quando sua atividade de remoção do antígeno A foi testada em RBCs de A+ usando cartões MTS aprovados, decepcionantemente, apenas EmGH109 foi significativamente ativo. O teste foi realizado na presença de Dextran 40K como um agente de aglomeração, que foi demonstrado aumentar a atividade ao concentrar a enzima na superfície da célula (Chapanian 2014). Na sua ausência, mesmo 150 ug/mL de EmGH109 foi ineficaz, enquanto na presença de 300 mg/mL de Dextran 40K, 15 µg/mL de enzima foi suficiente (ver FIGURAS 3 e 4). Estudos anteriores mostraram que a baixa força iônica também aumentou a atividade do EmGH109 nas células (Liu 2007). Consequentemente, EmGH109 não é eficaz no sangue total.

EXEMPLO 4: Análise de GH36 de Fosmídeo K05 de Collinsella sp.

[00121] A proteína GH36 identificada dentro do Fosmídeo K05 (denominado K05GH36) foi ativa para GalNAc-a- MU e o tetrassacarídeo do antígeno A. Isso é consistente com sua participação na família GH36, que contém principalmente a-galactosidases e a-N-acetil galactosaminidases e realiza hidrólise por meio de um mecanismo de deslocamento duplo envolvendo um intermediário de enzima b-glicosila covalente (Comfort 2007). A análise filogenética alinhou sua sequência com o agrupamento 4 das subfamílias GH36 (Fredslund 2011). Curiosamente, este agrupamento também contém, nas proximidades, um GH36 caracterizado de Clostridium perfringens que também é conhecido por clivar estruturas do antígeno A (Calcutt 2002). No entanto, quando a capacidade do K05GH36 de remover antígenos A dos glóbulos vermelhos foi testada, sua atividade foi decepcionante, marcando apenas 3, mesmo quando usado em conjunto com um agente de aglomeração.

EXEMPLO 5: Análise de Fosmídeo N08 de Flavonifractor plautii

[00122] Uma vez que essas novas enzimas não ofereciam vantagens, a atenção se voltou para o fosmídeo N08 de F. plautii, especialmente porque seus produtos gênicos clivam os antígenos A e B. Os três genes relacionados com CAZy foram clonados, suas sequências de peptídeos de sinal removidas, expressas em E. coli BL21 (DE3) e as enzimas resultantes purificadas em rendimentos de até 140 mg/L. Surpreendentemente, quando as proteínas individuais purificadas foram testadas contra os substratos de tetrassacarídeos A e B, a única clivagem observada foi do antígeno B por N08GH36, sem clivagem dos antígenos A por nenhum deles. Portanto, combinações de pares dessas enzimas foram testadas e surpreendentemente foi constatado que a mistura de N08CBM32 e N08GH36 clivou rapidamente o tetrassacarídeo do antígeno A. A análise de TLC das misturas de reação com as enzimas individuais revelou que N08CBM32 catalisou a conversão do antígeno A em um produto mais polar, mas ainda ativo em UV, enquanto a adição subsequente de N08GH36 liberou um produto de açúcar que co- migrou com galactosamina, juntamente com o trissacarídeo do antígeno H. A análise de MS de misturas de reação demonstrou que N08CBM32 é uma desacetilase do antígeno A, daí a diminuição de 42 em m/z e o produto mais polar, enquanto N08GH36 é uma galactosaminidase, uma nova atividade para esta família (FIGURA 2). Isto foi ainda confirmado por análise de cromatografia de troca aniônica de alto desempenho (HPAE-PAD) da reação (FIGURA 5), que mostrou que o tratamento do antígeno A com ambas as enzimas liberou galactosamina, enquanto as enzimas individuais não.

Resultados semelhantes foram obtidos com substratos de mucina gástrica, para os quais esta enzima provavelmente evoluiu. Estas duas enzimas são, portanto, doravante referidas como FpGalNAc desacetilase (FpGalNAcDeAc) e FpGalactosaminidase (FpGalNase).

[00123] Embora esta via de degradação do antígeno A não fosse caracterizada anteriormente, fascinantemente ela foi sugerida há mais de 50 anos como uma explicação para o chamado fenômeno B "adquirido", em que pacientes do tipo A infectados com Clostridium tertium foram submetidos a um mudança aparente no tipo de sangue para o tipo B (Gerbal 1975), assim como amostras forenses de tecido humano que haviam sido submersas no rio Tamisa (Ref Judd and Annesley https://doi.org/10.1016/S0887-7963(96)80087-3, Transfusion medicine reviews (1996) 10, 111 a 117). Isso provavelmente surgiu porque os anticorpos anti-B usados na tipagem eram incapazes de distinguir entre terminal Gal e GalN.

[00124] A investigação da terceira enzima no fosmídeo, o GH4, mostrou que, embora hidrólise Gal-a-pNP, GalN-a-pNP e GlcN-a-pNP, não cliva nenhum substrato à base de antígeno A. Portanto, não parece desempenhar um papel direto na conversão do antígeno A. No entanto, essas glicosaminidases representam novas atividades dentro da família GH4.

EXEMPLO 6: Caracterização de FpGalNAc desacetilase

[00125] Uma análise bioinformática mais próxima deste gene com Phyre2™ (Kelley 2015) indicou um domínio de ~308 aminoácidos de função previamente desconhecida no terminal N e um CBM32 de ~145 aminoácidos perto do terminal

C, com regiões de ligação entre eles. A análise de truncamento confirmou esta estrutura básica, uma vez que todos os construtos contendo o domínio desacetilase intacto eram de fato cataliticamente ativas (TABELA 2). Esta proteína é, portanto, classificada como o membro fundador de uma nova família de esterases de carboidratos, CExx.

[00126] As acetamido-desacetilases provaram ser metaloenzimas que requerem íons metálicos divalentes (Blair 2005). Consoante com isso, o tratamento com 100 µM de EDTA obliterou amplamente a atividade da enzima, enquanto a adição de Mn2+, Co2+, Ni2+ ou Zn2+ a aumentou. Outros inibidores de (não metalo) amidases não tiveram efeito. A enzima tem um perfil de pH um tanto amplo com um ótimo em torno de pH 8 (FIGURA 6) e uma especificidade de substrato estreita, restrita aos diferentes subtipos A e versões mais curtas dos mesmos. No entanto, dentro desses subtipos não é muito discriminatório, havendo apenas uma diferença de ~2 vezes na atividade específica entre todos esses subtipos (TABELA 2). Tal dependência de pH e perfil de especificidade é ideal para a conversão de RBC, uma vez que todos os subtipos de A são desacetilados, mas nada mais.

[00127] A especificidade da porção CBM da proteína foi explorada usando a matriz de glicano do Consortium for Functional Glycomics (CFG). Os alvos preferidos eram glicanos com estruturas repetidas de N-acetil lactosamina

(LacNAc), como também visto para o membro fundador da família CBM32; a N-acetilglucosaminidase de Clostridium perfringens (Ficko-Blean 2006). No entanto, ao contrário do CBM, o nosso não apresenta ligação de alta afinidade às estruturas do antígeno sanguíneo. As estruturas repetitivas do LacNAc são um componente comum das superfícies celulares (Cohen 2009) como um componente universal de N-glicanos complexos e híbridos, bem como alguns O-glicanos e glicolipídios. Em nosso caso, eles presumivelmente servem como ponto de ancoragem para a ligação do domínio desacetilase. Isso traria seu domínio catalítico em estreita proximidade com o antígeno A sem competição por seu próprio substrato. Em apoio a este modelo, a remoção do domínio resultou em uma diminuição da atividade em RBC, sem efeito nas taxas de clivagem do substrato solúvel (TABELA 2).

EXEMPLO 7: Análise cristalográfica da desacetilase FpGalNAc

[00128] Para fornecer uma visão estrutural desta nova atividade enzimática, as proteínas truncadas foram submetidas a testes de cristalização e foi constatado que FpGalNAcDeAc_D1ext produz os cristais que difratam para a melhor resolução. A solução desta estrutura revelou um domínio catalítico que adota uma estrutura de hélice beta de 5 vezes com um sítio ativo abrigando um íon metálico divalente coordenado por D100 e H252. A co-cristalização da enzima com o trissacarídeo do antígeno B como um análogo próximo do produto da reação revelou seu modo de ligação.

Na base da bolsa do sítio ativo, a porção galactosila da extremidade não redutora, que é o grupo distintivo entre o antígeno A e o antígeno B, faz interações por ligação de hidrogênio com H97, E64 e duas das águas coordenadas de metal. O resto do ligante é exposto à superfície e as interações polares são identificadas entre o grupo fucosila e as cadeias laterais S61 e D121. O grupo C1-OH da porção galactosila da extremidade redutora é exposto ao solvente, portanto, extensões ao substrato (isto é, com GlcNAc) são prontamente acomodadas pela enzima. A modelagem do grupo N- acetila do trissacarídeo A nessa estrutura permitiu fazer mutações racionais dos aminoácidos próximos, potencialmente envolvidos na desacetilação do substrato. O resíduo E64 mostrou-se crítico para a atividade uma vez que ambos os mutantes eram inativos, sugerindo um papel direto, provavelmente na ativação da molécula de água nucleofílica (TABELA 1). Os resíduos que coordenam o metal divalente, D100, Y315 e H252, também provaram ser importantes, com mutação de qualquer um resultando em reduções de taxa de ~5000 vezes, consistente com seu papel aparente na ligação de íons de metal divalente. Por analogia com outras acetamidosacetilases, foi proposto que a FpGalNAc desacetilase realiza a hidrólise pelo mecanismo, em que o metal serve para polarizar a carbonila e ativar uma molécula de água para o ataque nucleofílico à carbonila para formar o intermediário tetraédrico. A decomposição desse intermediário é facilitada pela doação de prótons ao átomo de nitrogênio do açúcar por His 100.

TABELA 1 | Atividade específica de FpGalNAcDeAc_D1min seus mutantes para a clivagem do antígeno A Type2tetra-MU Local de mutação kcat/KM [min-1*mM-1] WT 492,751 ± 124,002 E64A N.D. E64L N.D. C99A 140,680 ± 5,798 C99S 75,595 ± 2,491 D100N 0,073 ± 0,005 H252A 0,084 ± 0,012 H252F 0,030 ± 0,002 Y315F 0,167 ± 0,039 N.D. = nenhuma atividade detectável EXEMPLO 8: Caracterização de FpGalNAcDeAc e FpGalNase

[00129] A análise filogenética da sequência coloca FpGalNase em um novo subgrupo (5) da família GH36 (Fredslund 2011). O domínio catalítico de 390 aminoácidos está localizado no centro desta grande (1079 aminoácidos) proteína, com um domínio potencial de ligação a carboidratos no terminal C. A remoção deste domínio C terminal não teve efeito sobre os parâmetros cinéticos da enzima com substratos solúveis (TABELA 2), mas levou a uma eficiência reduzida na clivagem de RBCs A + desacetilados.

A enzima é específica para açúcares contendo galactosamina e não clivará resíduos de GalNAc em nenhum contexto testado. No entanto, tem uma especificidade bastante ampla para a clivagem de galactosaminidas des-N-acetiladas variando dos arilglicosídeos simples GalN-a-pNP para cima.

Na verdade (TABELA 2) os valores de kcat/KM para os três subtipos A testados foram todos semelhantes entre si e com os da desacetilase. Os valores de kcat/KM para a clivagem do antígeno B foram mais de 2.000 vezes mais baixos do que para o antígeno GalN correspondente, mas mesmo assim foram suficientes para produzir um resultado positivo na tela original. Esta especificidade para substratos alfa-galacto desacetilados, juntamente com seu pH ótimo de ~6,5 a 7,0, é adequada para uso na conversão de tipo sanguíneo em conjunto com a desacetilase (FIGURA 6).

TABELA 2 | Parâmetros cinéticos de construtos FpGalNAcDeAc e FpGalNase para diferentes substratos de antígeno kcat kcat/KM Substrato KM [µM] [s-1] [s-1*mM-1] comprimento Antígeno A tipo1 340 ± 4,86 14,28 completo penta-MU 35 Antígeno A tipo1 212 ± _D1ext 5,37 25,23 penta-MU 37 Antígeno A tipo1 265 ± _D1+2 9,99 37,59 penta-MU 43 FpGalNAcDeAc comprimento Antígeno A tipo1 23,49 ± - - completo tetra-MU 0,63 comprimento Antígeno A tipo2 23,37 ± - - completo tetra-MU 0,71 comprimento Antígeno A tipo4 33,27 ± - - completo tetra-MU 2,08 comprimento Antígeno GalN 64,5 ± FpGalNase 2,35 36,48 completo tipo1 penta-MU 7,6

Antígeno GalN 54,7 ± _truncA 1,86 34,08 tipo1 penta-MU 3,1 comprimento Antígeno GalN 45,70 ± - - completo tipo1 tetra-MU 3,57 comprimento Antígeno GalN 47,27 ± - - completo tipo 2 tetra-MU 7,49 comprimento Antígeno GalN 30,05 ± - - completo tipo4 tetra-MU 2,33 comprimento Antígeno B tipo - - 0,02 completo 1 tetra-MU comprimento 700 ± GalN-a-pNP 0,029 0,04 completo 151 EXEMPLO 9: Clivagem do antígeno A de RBCs

[00130] RBCs Tipo A+, B+ e O+ foram incubados com FpGalNAcDeAc e FpGalNase, individualmente e como uma mistura e os açúcares liberados analisados em um cromatograma de íons HPAE-PAD. Nenhuma das enzimas usadas individualmente liberou quaisquer produtos de açúcar. No entanto, quando a mistura das duas foi empregada, a galactosamina foi claramente liberada dos eritrócitos Tipo A+, mas não de B+ ou O+, provando uma alta especificidade apenas para o antígeno A. Isso é muito importante, pois mostra que GalNAc não é liberado da superfície de RBC em nenhum outro contexto. A versão truncada de FpGalNase também foi eficaz, mas com atividade ligeiramente inferior.

[00131] Em seguida, passamos para o teste de remoção de antígeno de RBCs usando os cartões MTS™ padrão da indústria. Essas colunas conjugadas com anticorpos são carregadas com RBCs e giradas em uma centrífuga. RBCs sem antígeno migram para a parte inferior da coluna e são classificados como 0, enquanto RBCs não tratados com o bastão de antígeno correspondente no topo e são classificados como 4, com pontuações intermediárias classificando o grau de remoção do antígeno. O tratamento com FpGalNase sozinho não removeu a antigenicidade A ou B na concentração empregada (TABELA 3) consistente com sua inatividade em substratos GalNAc, e sua baixa atividade em Gal. A incubação com FpGalNAcDeAc removeu a antigenicidade devido à conversão da acetamida em uma amina, comprometendo a ligação do anticorpo Anti-A empregado. A quantidade mínima de enzima necessária para a desacetilação completa do antígeno foi avaliada para FpGalNAcDeAc sozinho e em combinação com FpGalNase, tanto na ausência quanto na presença de 300 mg/ml de Dextrano como agente de aglomeração. Quantidades de FpGalNase até 3 µg/ml foram suficientes sem a ajuda de Dextrano, enquanto a inclusão de 300 mg/ml de dextrano reduziu a carga necessária para 0,5 µg/ml (TABELA 3). Em comparação com a melhor enzima anterior, EmGH109 foi ineficaz na ausência de Dextrano, a menos que tampões de baixo sal foram empregados, enquanto na presença de dextrano a concentração mínima eficaz foi de 15 µg/ml, uma carga 30 vezes maior. As versões de FpGalNAcDeAc sem o CBM foram muito menos eficazes.

TABELA 3 | Resultados do cartão MTS para o tratamento de RBCs de A+, B+ e AB+ com EmGH109, FpGalNAcDeAc e FpGalNase.

Tipo Dextran Conc. de Anti-A Anti-B Enzima sanguíneo 40k enzima[µg/ml] MTS MTS Nenhuma A+ 4 Nenhuma B+ 4 Nenhuma AB+ 4 4 EmGH109 A+ 300 mg/ml 15 0 FpGalNAcDeAc A+ 3 0 FpGalNAcDeAc A+ 2 1 FpGalNAcDeAc A+ 300 mg/ml 0,5 0 FpGalNAcDeAc A+ 300 mg/ml 0,4 2 FpGalNase B+ 100 4 FpGalNase B+ 300 mg/ml 100 4 FpGalNase AB+ 100 4 4 FpGalNase AB+ 300 mg/ml 100 4 4

[00132] Uma vez que o teste de cartão MTS™ não avalia a conversão completa do antígeno A e uma vez que nenhum anticorpo estava disponível para detectar o antígeno GalN, nos concentramos na detecção de antígenos H recém- formados nos RBCs tratados. A FpGalNase foi funcional a uma concentração de apenas 5 µg/ml, levando a um aumento do nível do antígeno H em conjunto com a perda do antígeno A, conforme confirmado pela análise FACS observada na FIGURA

3. Medindo os tempos de aglutinação na presença de anticorpos Anti-H a funcionalidade de ambas as enzimas foi demonstrada para vários doadores de RBC de A+, também em condições de reação de sangue total, uma habilidade que nenhuma outra enzima conversora de sangue alcançou antes.

Assim, este par de enzimas converte RBCs de A+ em RBCs “doadores universais” do tipo O, usando cargas de enzimas muito mais baixas do que as necessárias para as melhores enzimas anteriores. No entanto, antes da transfusão desses eritrócitos em um paciente, recomenda-se a remoção de todos os vestígios das enzimas usadas na conversão para evitar uma resposta imune adversa, provavelmente por lavagem das células após a centrifugação. Para confirmar que isso poderia ser alcançado, RBCs de A+ foram tratados com uma amostra marcada com fluorescência de FpGalNAcDeAc e FpGalNase, então usamos a análise de FACS para confirmar que de fato a lavagem simples foi eficaz (FIGURA 3).

[00133] A caracterização adicional dos A-ECO RBCs produzidos pode ser útil para avaliar sua viabilidade total para uso em medicina de transfusão, mas a possibilidade de incluir as enzimas diretamente no plasma sanguíneo, potencialmente durante a coleta da doação de sangue, pode permitir uma implementação fácil e econômica do processo nas rotinas automatizadas já existentes de coleta e armazenamento de sangue. Em particular, a estabilidade das enzimas foi testada como mostrado na TABELA 4.

TABELA 4: Estabilidade de armazenamento para galactosaminidase e uma GalNAcDeacetilase Proteína Momento Amostras [mU] amostra fresca 1 0,492 0,494 0,502 amostra fresca 2 0,425 0,437 0,439 FpGalNase 2 semanas armazenada à 0,480 0,454 0,468 4 oC 12 semanas armazenada à 0,494 0,497 0,499

4 oC Substrato: 100 µM de GalN-a-pNP Proteína Momento Amostras [mU] amostra fresca 1 888 840 888 2 semanas armazenada à FpGalNAcDeAc 864 840 936 4 oC 12 semanas armazenada à 864 840 888 4 oC Substrato: 100 uM de antígeno A T1tetra-MU EXEMPLO 10: Fusão de GalNAcdacetilase e Galactosaminidase de Clostridium tertium

[00134] Ao procurar enzimas semelhantes, foi identificada uma nova fusão natural de Clostridium tertium de uma Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase conectada por um CBM (GH36_domain-CBM-Deacetylation_domain). O teste inicial mostrou que a enzima cliva o antígeno A (mesmo mecanismo, primeiro desacetilação e depois clivagem da galactosamina) de glóbulos vermelhos, mas não tão eficientemente (isto é, semelhante ao EmGH109). O domínio de desacetilação de Clostridium tertium não é tão eficiente quanto GalNAcDeacetilase de F. plautii, mas se subsidiado com GalNAcDeacetilase de F. plautii, o domínio de Galactosaminidase de Clostridium tertium mostra atividade semelhante a Galactosaminidase de F. plautii em células vermelhas do sangue.

EXEMPLO 11: Enzimas alternativas de GalNAcdacetilase e Galactosaminidase

[00135] Os dados mostram que a Galactosaminidase de

Clostridium tertium (Ct5757 _GalNAse) e Rp1021 têm atividade enzimática comparável para a conversão do antígeno GalN em antígeno H (2ª etapa da reação)

[00136] Os dados também foram coletados para as enzimas GalNAcdacetilase e Galactosaminidase alternativas e as enzimas alternativas foram comparadas com GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii e Galactosaminidase de Flavonifractor plautii. Como mostrado na TABELA 5, as pontuações MTS para anticorpos anti-A em RBC de A tratados são mostrados para a fusão natural de Clostridium tertium de uma Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase, que requer a presença de Dextrano para clivar eficazmente o antígeno A, e também mostra boa atividade de GalNAcDeacetilase de Clostridium tertium (Ct5757 _DeAcase) quando combinado com Galactosaminidase de Flavonifractor plautii (FpGalNase). Também na TABELA 6, os dados mostram que Robinsoniella peoriensis (Rp) Rp3672 e Rp3671 são capazes de desacetilar o antígeno A em RBCs, mas são menos eficientes do que FpGalNAcDeAcase e a atividade só foi alcançada na presença de um agente aglomerante (ou seja, Dextran 40k).

TABELA 5: Pontuações MTS para anticorpos anti-A em RBC de A tratados Amostra Pontuação MTS de Anti-A Controle de RBC de A 4 FpGalNAcDeAcase + FpGalNase 0

(10 µg/mL) Ct5757 (10 µg/mL) 4 Ct5757 (50 µg/mL) + Dextran 40k 0 Ct5757_DeAcase + FpGalNase 0 (10 µg/mL) TABELA 6: Pontuação de Robinsoniella peoriensis (Rp) 3671 e 3672 MTS Amostra Pontuação MTS de Anti-A Controle de RBC de A 4 Rp3671 (50 µg/mL) + Dextrano 3 40k Rp3672 (50 µg/mL) + Dextrano 1 40k

[00137] A FIGURA 7 mostra a conversão do antígeno A em antígeno H em RBCs de A conforme analisado por meio de classificação FACS, para (A) controle de RBC de A+, (B) GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii (FpGalNAcDeAc) + Galactosaminidase de Flavonifractor plautii (FpGalNgase) (10 µg/mL), (C) FpGalNAcDeAc + Ct5757_GalNase de Clostridium tertium (Ct) (10 µg/mL) e (D) FpGalNAcDeAc + Galactosaminidase de Robinsoniella peoriensis (Rp) (Rp1021) GalNase (10 µg/mL). Os dados mostram que Ct5757_GalNase de Clostridium tertium (Ct) e Galactosaminidase de Robinsoniella peoriensis (Rp) (Rp1021) GalNase têm atividade enzimática comparável ao Galactosaminidase de Flavonifractor plautii (FpGalNase) para a conversão do antígeno GalN em antígeno H (2ª etapa).

[00138] Embora várias modalidades da invenção sejam divulgadas neste documento, muitas adaptações e modificações podem ser feitas dentro do escopo da invenção de acordo com o conhecimento geral comum daquelas pessoas versadas na técnica. Tais modificações incluem a substituição de equivalentes conhecidos para qualquer aspecto da invenção a fim de atingir o mesmo resultado substancialmente da mesma maneira. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. A palavra "compreendendo" é usada neste documento como um termo em aberto, substancialmente equivalente à frase "incluindo, mas não se limitando a", e a palavra "compreende" tem um significado correspondente. Conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “uma coisa” inclui mais de uma tal coisa. A citação de referências aqui não é uma admissão de que tais referências são da técnica anterior a uma modalidade da presente invenção. A invenção inclui todas as modalidades e variações substancialmente conforme descrito anteriormente e com referência aos exemplos e desenhos.

SEQUÊNCIAS

[00139] As sequências de DNA de Flavonifractor plautii foram modificadas a partir da sequência de DNA de ocorrência natural (GalNAcDeacetilase 2311/2319nt /Galactosaminidase 3228/3237nt). Em particular, há uma diferença no comprimento das sequências usadas para purificação de proteínas, em que os peptídeos de sinal foram removidos e uma HisTag N terminal foi adicionada através da estrutura do vetor.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS INFORMAL SEQ ID NO:2 Descrição: GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii (Sequência de proteína)

MRNRRKAVSLLTGLLVTAQLFPTAALAADSSESALNKAPGYQDFPAYYSDSAHADDQVTHPDVVVLEEPW NGYRYWAVYTPNVMRISIYENPSIVASSDGVHWVEPEGLSNPIEPQPPSTRYHNCDADMVYNAEYDAMMA YWNWADDQGGGVGAEVRLRISYDGVHWGVPVTYDEMTRVWSKPTSDAERQVADGEDDFITAIASPDRYDM LSPTIVYDDFRDVFILWANNTGDVGYQNGQANFVEMRYSDDGITWGEPVRVNGFLGLDENGQQLAPWHQD VQYVPDLKEFVCISQCFAGRNPDGSVLHLTTSKDGVNWEQVGTKPLLSPGPDGSWDDFQIYRSSFYYEPG SSAGDGTMRVWYSALQKDTNNKMVADSSGNLTIQAKSEDDRIWRIGYAENSFVEMMRVLLDDPGYTTPAL VSGNSLMLSAETTSLPTGDVMKLETSFAPVDTSDQVVKYTSSDPDVATVDEFGTITGVSVGSARIMAETR EGLSDDLEIAVVENPYTLIPQSNMTATATSVYGGTTEGPASNVLDGNVRTIWHTNYAPKDELPQSITVSF DQPYTVGRFVYTPRQNGTNGIISEYELYAIHQDGSKDLVASGSDWALDAKDKTVSFAPVEAVGLELKAIA GAGGFGTAAELNVYAYGPIEPAPVYVPVDDRDASLVFTGAWNSDSNGSFYEGTARYTNEIGASVEFTFVG TAIRWYGQNDVNFGAAEVYVDGVLAGEVNVYGPAAAQQLLFEADGLAYGKHTIRIVCVSPVVDFDYFSYV

GE SEQ ID NO:4 Descrição: GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii (Sequência de proteína de peptídeo de sinal removido)

ADSSESALNKAPGYQDFPAYYSDSAHADDQVTHPDVVVLEEPWNGYRYWAVYTPNVMRISIYENPSIVAS SDGVHWVEPEGLSNPIEPQPPSTRYHNCDADMVYNAEYDAMMAYWNWADDQGGGVGAEVRLRISYDGVHW GVPVTYDEMTRVWSKPTSDAERQVADGEDDFITAIASPDRYDMLSPTIVYDDFRDVFILWANNTGDVGYQ NGQANFVEMRYSDDGITWGEPVRVNGFLGLDENGQQLAPWHQDVQYVPDLKEFVCISQCFAGRNPDGSVL HLTTSKDGVNWEQVGTKPLLSPGPDGSWDDFQIYRSSFYYEPGSSAGDGTMRVWYSALQKDTNNKMVADS SGNLTIQAKSEDDRIWRIGYAENSFVEMMRVLLDDPGYTTPALVSGNSLMLSAETTSLPTGDVMKLETSF APVDTSDQVVKYTSSDPDVATVDEFGTITGVSVGSARIMAETREGLSDDLEIAVVENPYTLIPQSNMTAT ATSVYGGTTEGPASNVLDGNVRTIWHTNYAPKDELPQSITVSFDQPYTVGRFVYTPRQNGTNGIISEYEL YAIHQDGSKDLVASGSDWALDAKDKTVSFAPVEAVGLELKAIAGAGGFGTAAELNVYAYGPIEPAPVYVP VDDRDASLVFTGAWNSDSNGSFYEGTARYTNEIGASVEFTFVGTAIRWYGQNDVNFGAAEVYVDGVLAGE

VNVYGPAAAQQLLFEADGLAYGKHTIRIVCVSPVVDFDYFSYVGE SEQ ID NO:5

Descrição: GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii com HisTag (pET16a-Sequência de proteína)

MGHHHHHHHHHHSSGADSSESALNKAPGYQDFPAYYSDSAHADDQVTHPDVVVLEEPWNGYRYWAVYTPN VMRISIYENPSIVASSDGVHWVEPEGLSNPIEPQPPSTRYHNCDADMVYNAEYDAMMAYWNWADDQGGGV GAEVRLRISYDGVHWGVPVTYDEMTRVWSKPTSDAERQVADGEDDFITAIASPDRYDMLSPTIVYDDFRD VFILWANNTGDVGYQNGQANFVEMRYSDDGITWGEPVRVNGFLGLDENGQQLAPWHQDVQYVPDLKEFVC ISQCFAGRNPDGSVLHLTTSKDGVNWEQVGTKPLLSPGPDGSWDDFQIYRSSFYYEPGSSAGDGTMRVWY SALQKDTNNKMVADSSGNLTIQAKSEDDRIWRIGYAENSFVEMMRVLLDDPGYTTPALVSGNSLMLSAET TSLPTGDVMKLETSFAPVDTSDQVVKYTSSDPDVATVDEFGTITGVSVGSARIMAETREGLSDDLEIAVV ENPYTLIPQSNMTATATSVYGGTTEGPASNVLDGNVRTIWHTNYAPKDELPQSITVSFDQPYTVGRFVYT PRQNGTNGIISEYELYAIHQDGSKDLVASGSDWALDAKDKTVSFAPVEAVGLELKAIAGAGGFGTAAELN VYAYGPIEPAPVYVPVDDRDASLVFTGAWNSDSNGSFYEGTARYTNEIGASVEFTFVGTAIRWYGQNDVN

FGAAEVYVDGVLAGEVNVYGPAAAQQLLFEADGLAYGKHTIRIVCVSPVVDFDYFSYVGE SEQ ID NO:7 Descrição: Galactosaminidase de Flavonifractor plautii

MRGKKFISLTLSTMLCLQLLPTASFAAAPATDTGNAGLIAEGDYAIAGNGVRVTYDADGQTITLYRTEGS GLIQMSKPSPLGGPVIGGQEVQDFSHISCDVEQSTSGVMGSGQRMTITSQSMSTGLIRTYVLETSDIEEG VVYTATSYEAGASDVEVSWFIGSVYELYGAEDRIWSYNGGGEGPMHYYDTLQKIDLTDSGKFSRENKQDD TAASIPVSDIYIADGGITVGDASATRREVHTPVQETSDSAQVSIGWPGKVIAAGSVIEIGESFAVVHPGD YYNGLRGYKNAMDHLGVIMPAPGDIPDSSYDLRWESWGWGFNWTIDLIIGKLDELQAAGVKQITLDDGWY TNAGDWALNPEKFPNGASDALRLTDAIHEHGMTALLWWRPCDGGIDSILYQQHPEYFVMDADGRPARLPT PGGGTNPSLGYALCPMADGAIASQVDFVNRAMNDWGFDGFKGDYVWSMPECYNPAHNHASPEESTEKQSE IYRVSYEAMVANDPNVFNLLCNCGTPQDYYSLPYMTQIATADPTSVDQTRRRVKAYKALMGDYFPVTADH NNIWYPSAVGTGSVLIEKRDLSGTAKEEYEKWLGIADTVQLQKGRFIGDLYSYGFDPYETYVVEKDGVMY YAFYKDGSKYSPTGYPDIELKGLDPNKMYRIVDYVNDRVVATNLMGDNAVFNTRFSDYLLVKAVEISEPD PEPVDPDYGFTSVDDRDEALIYTGTWHDDNNASFSEGTARYTNSTDASVVFSFTGTSIRWYGQRDTNFGT AEVYLDDELKTTVDANGAAEAGVCLFEALDLPAAEHTIKIVCKSGVIDIDRFAYEAATLEPIYEKVDALS DRITYVGNWEEYHNSEFYMGNAMRTDEAGAYAELTFRGTAVRLYAEMSFNFGTADVYLDGELVENIILYG QEATGQLMFERTGLEEGEHTIRLVQNAWNINLDYISYLPEQDQPTPPETTVTVDAMDAQLVYTGVWNDDY HDVFQEGTARYASSAGASVEFEFTGSEIRWYGQNDSNFGVASVYIDNEFVQQVNVNGAAAVGKLLFQKAD

LPAGSHTIRIVCDTPVIDLDYLTYTTNA SEQ ID NO:9 Descrição: Galactosaminidase de Flavonifractor plautii (Sequência de proteína de peptídeo de sinal removido)

AAPATDTGNAGLIAEGDYAIAGNGVRVTYDADGQTITLYRTEGSGLIQMSKPSPLGGPVIGGQEVQDFSH ISCDVEQSTSGVMGSGQRMTITSQSMSTGLIRTYVLETSDIEEGVVYTATSYEAGASDVEVSWFIGSVYE LYGAEDRIWSYNGGGEGPMHYYDTLQKIDLTDSGKFSRENKQDDTAASIPVSDIYIADGGITVGDASATR REVHTPVQETSDSAQVSIGWPGKVIAAGSVIEIGESFAVVHPGDYYNGLRGYKNAMDHLGVIMPAPGDIP DSSYDLRWESWGWGFNWTIDLIIGKLDELQAAGVKQITLDDGWYTNAGDWALNPEKFPNGASDALRLTDA IHEHGMTALLWWRPCDGGIDSILYQQHPEYFVMDADGRPARLPTPGGGTNPSLGYALCPMADGAIASQVD FVNRAMNDWGFDGFKGDYVWSMPECYNPAHNHASPEESTEKQSEIYRVSYEAMVANDPNVFNLLCNCGTP QDYYSLPYMTQIATADPTSVDQTRRRVKAYKALMGDYFPVTADHNNIWYPSAVGTGSVLIEKRDLSGTAK EEYEKWLGIADTVQLQKGRFIGDLYSYGFDPYETYVVEKDGVMYYAFYKDGSKYSPTGYPDIELKGLDPN KMYRIVDYVNDRVVATNLMGDNAVFNTRFSDYLLVKAVEISEPDPEPVDPDYGFTSVDDRDEALIYTGTW HDDNNASFSEGTARYTNSTDASVVFSFTGTSIRWYGQRDTNFGTAEVYLDDELKTTVDANGAAEAGVCLF EALDLPAAEHTIKIVCKSGVIDIDRFAYEAATLEPIYEKVDALSDRITYVGNWEEYHNSEFYMGNAMRTD EAGAYAELTFRGTAVRLYAEMSFNFGTADVYLDGELVENIILYGQEATGQLMFERTGLEEGEHTIRLVQN AWNINLDYISYLPEQDQPTPPETTVTVDAMDAQLVYTGVWNDDYHDVFQEGTARYASSAGASVEFEFTGS EIRWYGQNDSNFGVASVYIDNEFVQQVNVNGAAAVGKLLFQKADLPAGSHTIRIVCDTPVIDLDYLTYTT

NA SEQ ID NO:10 Descrição: Galactosaminidase de Flavonifractor plautii com HisTag (pET16a-Sequência de proteína)

MGHHHHHHHHHHSSGAAPATDTGNAGLIAEGDYAIAGNGVRVTYDADGQTITLYRTEGSGLIQMSKPSPL GGPVIGGQEVQDFSHISCDVEQSTSGVMGSGQRMTITSQSMSTGLIRTYVLETSDIEEGVVYTATSYEAG ASDVEVSWFIGSVYELYGAEDRIWSYNGGGEGPMHYYDTLQKIDLTDSGKFSRENKQDDTAASIPVSDIY IADGGITVGDASATRREVHTPVQETSDSAQVSIGWPGKVIAAGSVIEIGESFAVVHPGDYYNGLRGYKNA MDHLGVIMPAPGDIPDSSYDLRWESWGWGFNWTIDLIIGKLDELQAAGVKQITLDDGWYTNAGDWALNPE KFPNGASDALRLTDAIHEHGMTALLWWRPCDGGIDSILYQQHPEYFVMDADGRPARLPTPGGGTNPSLGY ALCPMADGAIASQVDFVNRAMNDWGFDGFKGDYVWSMPECYNPAHNHASPEESTEKQSEIYRVSYEAMVA NDPNVFNLLCNCGTPQDYYSLPYMTQIATADPTSVDQTRRRVKAYKALMGDYFPVTADHNNIWYPSAVGT GSVLIEKRDLSGTAKEEYEKWLGIADTVQLQKGRFIGDLYSYGFDPYETYVVEKDGVMYYAFYKDGSKYS PTGYPDIELKGLDPNKMYRIVDYVNDRVVATNLMGDNAVFNTRFSDYLLVKAVEISEPDPEPVDPDYGFT SVDDRDEALIYTGTWHDDNNASFSEGTARYTNSTDASVVFSFTGTSIRWYGQRDTNFGTAEVYLDDELKT TVDANGAAEAGVCLFEALDLPAAEHTIKIVCKSGVIDIDRFAYEAATLEPIYEKVDALSDRITYVGNWEE YHNSEFYMGNAMRTDEAGAYAELTFRGTAVRLYAEMSFNFGTADVYLDGELVENIILYGQEATGQLMFER TGLEEGEHTIRLVQNAWNINLDYISYLPEQDQPTPPETTVTVDAMDAQLVYTGVWNDDYHDVFQEGTARY ASSAGASVEFEFTGSEIRWYGQNDSNFGVASVYIDNEFVQQVNVNGAAAVGKLLFQKADLPAGSHTIRIV

CDTPVIDLDYLTYTTNA SEQ ID NO:12 Descrição: Sequência de proteína de Clostridium tertium isolado para identidade 099345757.1 - Ct5757 (fusão de Galactosaminidase e GalNAcDeacetilase ligada por um CBM (Sequência de proteína original)

MKKRILATFITAMCGLGFFSNWTSSNAYNLIDNISVEKLDTDISQANENVFLNGNGIALEVDNRGATCIY LVDENGVKTKATTSLDTADFSGYPIIGGQKIRDFVIISKNLEENINSILGVGNRLTIISKSSSTNLIRKI VFETSNSNPGAIYSTVSYKAESNDLLVDSFHENEYTMSLGQGPFLAYQGCADQQGANTIVNVTNGYNHNS GQNNYSVGVPFSYVYNSVGGIGIGDASTSRREFKLPIIGKDNTVSLGMEWNGQTLKKGAETAIGTSVITT TNGDYYSGLKSYAEVMKDKGISAPASIPDIAYDSRWESWGFEFDFTIEKIVNKLDELKAMGIKQITLDDG WYTYAGDWKLSPQKFPNGNADMKYLTDEIHKRGMTAILWWRPVDGGINSKLVSEHPEWFIKNSQGNMVRL PGPGGGNGGTAGYALCPNSEGSIQHHKDFVTVALEEWGFDGFKEDYVWGIPKCYDSSHKHSSLSDTLENQ YKFYEAIYEQSIAINPDTFIELCNCGTPQDFYSTPYVNHAPTADPISRVQTRTRVKAFKAIFGDDFPVTT DHNSVWLPSALGTGSVMITKHTTLSSSDREQYNKYFGLARDLELAKGEFIGNLYKYGIDPLESYVIRKGE DIYYSFYKDNSSYSGNIEIKGLDSNATYRIEDYVNNRVIARGVKGPTATINTSFTDNLLVRAIPDDTPAE VTTFDVGNNTILSSTDSGNSKYLNAVSTTLEKTATIDSLSIYIGNNSENGKLQIAIYDDNNGKPGTKKAY VEEFVPTKNSWNTKKVVNSVTLPSGQYWLVFQPDNDVLQTKTNPSSMKQSANNNPYNYNILPNSFPIGTG YNAYKGDVSFYATFKEASSQAIPQNSWALKYVDSEETTGENGRATNAFDGNNNTIWHTKYSGGNAAPMPH EIQIDLRGVYNINQINYLPRQDGGTNGTIKDYEVYLSLDGVNWGQPISKGTFESNSTEKIVKFNETKSRY VKLKALSEINNKQFTTVADLKVFGWEISKIEKPLQNAETYLNIPTYDGLNQSTHPDVKYFKNGWNGYKYW MIMTPNRTGSSVAENPSILASDDGINWEVPAGVTNPIAPMPQVGHNCDVDMIYNEATDELWVYWVESDDI TKGWVKLIKSKDGVNWSSQQVVVDDNRAKYSTLSPSIIFKDNKYYMWSVNTGNSGWNNQSNKVELRESSD GVNWSNPTVVNTLAQDGSQIWHVNVEYIPSKNEYWAIYPAYKNGTGSDKTELYYAKSSDGVNWTTYKNPI

LSKGTSGKWDDMEIYRSCFVYDEDTNMIKVWYGAVSQNPQIWKIGFTENDYDKFIEGLTQ SEQ ID NO:14 Descrição: Sequência de proteína de Clostridium tertium 5757 (Ct5757) isolado com peptídeo de sinal removido (identidade 099345757.1 - Ct5757)

YNLIDNISVEKLDTDISQANENVFLNGNGIALEVDNRGATCIYLVDENGVKTKATTSLDTADFSGYPIIG GQKIRDFVIISKNLEENINSILGVGNRLTIISKSSSTNLIRKIVFETSNSNPGAIYSTVSYKAESNDLLV DSFHENEYTMSLGQGPFLAYQGCADQQGANTIVNVTNGYNHNSGQNNYSVGVPFSYVYNSVGGIGIGDAS TSRREFKLPIIGKDNTVSLGMEWNGQTLKKGAETAIGTSVITTTNGDYYSGLKSYAEVMKDKGISAPASI PDIAYDSRWESWGFEFDFTIEKIVNKLDELKAMGIKQITLDDGWYTYAGDWKLSPQKFPNGNADMKYLTD EIHKRGMTAILWWRPVDGGINSKLVSEHPEWFIKNSQGNMVRLPGPGGGNGGTAGYALCPNSEGSIQHHK DFVTVALEEWGFDGFKEDYVWGIPKCYDSSHKHSSLSDTLENQYKFYEAIYEQSIAINPDTFIELCNCGT PQDFYSTPYVNHAPTADPISRVQTRTRVKAFKAIFGDDFPVTTDHNSVWLPSALGTGSVMITKHTTLSSS DREQYNKYFGLARDLELAKGEFIGNLYKYGIDPLESYVIRKGEDIYYSFYKDNSSYSGNIEIKGLDSNAT YRIEDYVNNRVIARGVKGPTATINTSFTDNLLVRAIPDDTPAEVTTFDVGNNTILSSTDSGNSKYLNAVS TTLEKTATIDSLSIYIGNNSENGKLQIAIYDDNNGKPGTKKAYVEEFVPTKNSWNTKKVVNSVTLPSGQY WLVFQPDNDVLQTKTNPSSMKQSANNNPYNYNILPNSFPIGTGYNAYKGDVSFYATFKEASSQAIPQNSW ALKYVDSEETTGENGRATNAFDGNNNTIWHTKYSGGNAAPMPHEIQIDLRGVYNINQINYLPRQDGGTNG TIKDYEVYLSLDGVNWGQPISKGTFESNSTEKIVKFNETKSRYVKLKALSEINNKQFTTVADLKVFGWEI SKIEKPLQNAETYLNIPTYDGLNQSTHPDVKYFKNGWNGYKYWMIMTPNRTGSSVAENPSILASDDGINW EVPAGVTNPIAPMPQVGHNCDVDMIYNEATDELWVYWVESDDITKGWVKLIKSKDGVNWSSQQVVVDDNR AKYSTLSPSIIFKDNKYYMWSVNTGNSGWNNQSNKVELRESSDGVNWSNPTVVNTLAQDGSQIWHVNVEY IPSKNEYWAIYPAYKNGTGSDKTELYYAKSSDGVNWTTYKNPILSKGTSGKWDDMEIYRSCFVYDEDTNM

IKVWYGAVSQNPQIWKIGFTENDYDKFIEGLTQ SEQ ID NO:15 Descrição: Construto de expressão de sequência de proteína de fusão de Clostridium tertium 5757 (Ct5757) (no vetor pET28a) com HisTag e sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHYNLIDNISVEKLDTDISQANENVFLNGNGIALEVDNRGATCIYLVDENGV KTKATTSLDTADFSGYPIIGGQKIRDFVIISKNLEENINSILGVGNRLTIISKSSSTNLIRKIVFETSNS NPGAIYSTVSYKAESNDLLVDSFHENEYTMSLGQGPFLAYQGCADQQGANTIVNVTNGYNHNSGQNNYSV GVPFSYVYNSVGGIGIGDASTSRREFKLPIIGKDNTVSLGMEWNGQTLKKGAETAIGTSVITTTNGDYYS GLKSYAEVMKDKGISAPASIPDIAYDSRWESWGFEFDFTIEKIVNKLDELKAMGIKQITLDDGWYTYAGD WKLSPQKFPNGNADMKYLTDEIHKRGMTAILWWRPVDGGINSKLVSEHPEWFIKNSQGNMVRLPGPGGGN GGTAGYALCPNSEGSIQHHKDFVTVALEEWGFDGFKEDYVWGIPKCYDSSHKHSSLSDTLENQYKFYEAI YEQSIAINPDTFIELCNCGTPQDFYSTPYVNHAPTADPISRVQTRTRVKAFKAIFGDDFPVTTDHNSVWL PSALGTGSVMITKHTTLSSSDREQYNKYFGLARDLELAKGEFIGNLYKYGIDPLESYVIRKGEDIYYSFY KDNSSYSGNIEIKGLDSNATYRIEDYVNNRVIARGVKGPTATINTSFTDNLLVRAIPDDTPAEVTTFDVG NNTILSSTDSGNSKYLNAVSTTLEKTATIDSLSIYIGNNSENGKLQIAIYDDNNGKPGTKKAYVEEFVPT KNSWNTKKVVNSVTLPSGQYWLVFQPDNDVLQTKTNPSSMKQSANNNPYNYNILPNSFPIGTGYNAYKGD VSFYATFKEASSQAIPQNSWALKYVDSEETTGENGRATNAFDGNNNTIWHTKYSGGNAAPMPHEIQIDLR GVYNINQINYLPRQDGGTNGTIKDYEVYLSLDGVNWGQPISKGTFESNSTEKIVKFNETKSRYVKLKALS EINNKQFTTVADLKVFGWEISKIEKPLQNAETYLNIPTYDGLNQSTHPDVKYFKNGWNGYKYWMIMTPNR TGSSVAENPSILASDDGINWEVPAGVTNPIAPMPQVGHNCDVDMIYNEATDELWVYWVESDDITKGWVKL IKSKDGVNWSSQQVVVDDNRAKYSTLSPSIIFKDNKYYMWSVNTGNSGWNNQSNKVELRESSDGVNWSNP TVVNTLAQDGSQIWHVNVEYIPSKNEYWAIYPAYKNGTGSDKTELYYAKSSDGVNWTTYKNPILSKGTSG

KWDDMEIYRSCFVYDEDTNMIKVWYGAVSQNPQIWKIGFTENDYDKFIEGLTQ SEQ ID NO:17 Descrição: Construto de expressão de Sequência de proteína de GalNAcDeacetilase de Clostridium tertium 5757 (Ct5757) (no vetor pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHSGQYWLVFQPDNDVLQTKTNPSSMKQSANNNPYNYNILPNSFPIGTGYNA YKGDVSFYATFKEASSQAIPQNSWALKYVDSEETTGENGRATNAFDGNNNTIWHTKYSGGNAAPMPHEIQ IDLRGVYNINQINYLPRQDGGTNGTIKDYEVYLSLDGVNWGQPISKGTFESNSTEKIVKFNETKSRYVKL KALSEINNKQFTTVADLKVFGWEISKIEKPLQNAETYLNIPTYDGLNQSTHPDVKYFKNGWNGYKYWMIM TPNRTGSSVAENPSILASDDGINWEVPAGVTNPIAPMPQVGHNCDVDMIYNEATDELWVYWVESDDITKG WVKLIKSKDGVNWSSQQVVVDDNRAKYSTLSPSIIFKDNKYYMWSVNTGNSGWNNQSNKVELRESSDGVN WSNPTVVNTLAQDGSQIWHVNVEYIPSKNEYWAIYPAYKNGTGSDKTELYYAKSSDGVNWTTYKNPILSK

GTSGKWDDMEIYRSCFVYDEDTNMIKVWYGAVSQNPQIWKIGFTENDYDKFIEGLTQ SEQ ID NO:19 Descrição: Construto de expressão de sequência de proteína de Galactosaminidase de Clostridium tertium 5757 (Ct5757) (no vetor pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHYNLIDNISVEKLDTDISQANENVFLNGNGIALEVDNRGATCIYLVDENGV KTKATTSLDTADFSGYPIIGGQKIRDFVIISKNLEENINSILGVGNRLTIISKSSSTNLIRKIVFETSNS NPGAIYSTVSYKAESNDLLVDSFHENEYTMSLGQGPFLAYQGCADQQGANTIVNVTNGYNHNSGQNNYSV GVPFSYVYNSVGGIGIGDASTSRREFKLPIIGKDNTVSLGMEWNGQTLKKGAETAIGTSVITTTNGDYYS GLKSYAEVMKDKGISAPASIPDIAYDSRWESWGFEFDFTIEKIVNKLDELKAMGIKQITLDDGWYTYAGD WKLSPQKFPNGNADMKYLTDEIHKRGMTAILWWRPVDGGINSKLVSEHPEWFIKNSQGNMVRLPGPGGGN GGTAGYALCPNSEGSIQHHKDFVTVALEEWGFDGFKEDYVWGIPKCYDSSHKHSSLSDTLENQYKFYEAI YEQSIAINPDTFIELCNCGTPQDFYSTPYVNHAPTADPISRVQTRTRVKAFKAIFGDDFPVTTDHNSVWL PSALGTGSVMITKHTTLSSSDREQYNKYFGLARDLELAKGEFIGNLYKYGIDPLESYVIRKGEDIYYSFY KDNSSYSGNIEIKGLDSNATYRIEDYVNNRVIARGVKGPTATINTSFTDNLLVRAIPDDTPAEVTTFDVG NNTILSSTDSGNSKYLNAVSTTLEKTATIDSLSIYIGNNSENGKLQIAIYDDNNGKPGTKKAYVEEFVPT KNSWNTKKVVNSVTLPSGQYWLVFQPDNDVLQTKTNPSSMKQSANNNPYNYNILPNSFPIGTGYNAYKGD VSFYATFKEASSQAIPQNSWALKYVDSEETTGENGRATNAFDGNNNTIWHTKYSGGNAAPMPHEIQIDLR GVYNINQINYLPRQDGGTNGTIKDYEVYLSLDGVNWGQPISKGTFESNSTEKIVKFNETKSRYVKLKALS

EINNKQFTTVADLKVFGWEISKIEK SEQ ID NO:21 Descrição: Construto de expressão de proteína de Galactosaminidase de Robinsoniella peoriensis Rp1021 (no vetor pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHGNGLEVKASPREVAQITGNGVSVTFFQEDGTVQLSCIEDDGNTAFMTRNS EVSYPVVGGEEVTDFSDFQCEVQENVTGAAGAGSRMTITSISSGRGIQRSVVIETVDEVKGLLHISSSYR AEEEVDADEFIDSRFSLDNPSDTVWSYNGGGEGAQSRYDTLQKIDLSDGESFYRENLQNQTAAGIPVADI YGKDGGITVGDASVTRRQLSTPVNERNGTAYVSVKHPGAVITQRETEISQSFVNVHRGDYYSGLRGYADG MKQIGFTTLSREQIPESSYDLRWESWGWEFDWTVELIINKLDELKEMGIKQITLDDGWYNAAGEWGLNNW KLPNGALDMRHLTDAIHERGMTAVLWWRPCDGGREDSALFKEHPEYFIKNQDGSFGKLAGPGQWNSFLGS CGYALCPLSEGAVQSQVDFINRAMNEWGFDGFKSDYVWSLPKCYSQDHHHEYPEESTEQQAVFYRAVYEA MTDNDPNAFHLLCNCGTPQDYYSLPYVTQVPTADPTSVDQTRRRVKAYKALCGDYFPVTTDHNEVWYPST IGTGAILIEKRDLSGWEEEEYAKWLKIAQENQLHKGTFIGDLYSYGYDPYETYTVYKDGIMYYAFYKDGN RYRPSGNPDIELKGLEDGKLYRIVDYVNNQVVATNVTSSNAVFSYPFSDYLLVKAVEISEPDTDGPGPVP DPEGAVTVEENDPELVYTGDWVREENDGYHGGGARYTKEAEASVELAFYGTGAAWYGQHDVNFGSARIYI DGTYVKTVSCMGEPGINIKLFEISGLDLASHRIKIECETPVIDIDRLTYIKGEEVPAKVMTADLRALTVI ANQYDMNSFADGNYKDQLGVSLVRANQLLAADDVTQGAVNEEQKYLLNAMLKIRKKVDKSWIGLPGPIPQ DIQTENISRDNLAKVISYTGQLDRDEIIPAIKEQLNDSYDKAVSIAERQDASQPEIDRAWAELMNAVQYS SYIRGSKEELLSLLDEYGKVDTTVYKDAALFIESLEAAKKVYQDENAMDGEISDCIKQLRDAKDQLQLKD PVDPPKPDPDPDPKPDPTPDPGPDPKPDPTPDPTPDPKPNPTPTPDPTPEPALKKPEQVSGLKSKAETDY LTVSWKKLNNAESYKVYIYKSGKWRLAGKTTKTSIKIKKLVSGTKYTVKVAAVNKAGQGKYSSQVYTAAK PKKVKLKSVSRYRTSKVKLNYGKVKAGGYEIWMKNGKGSYKKAATSTKTTAIKSGLKKGKTYYFKVRAYV

KNKNQVIYGSFSNIKKYKMVL SEQ ID NO:23 Descrição: Construto de expressão de sequência de proteína de GalNAcDeacetilase de Ruthenibacterium lactatiformans Rl8755 (no vetor pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHEETDLLVNGGFETGDSTGWNWFNNAVVDSAAPHSGNYCAKVAKNSSYEQV VTVSPDTKYVLTGWAKSEGSSVMTLGVKNYGGQETFSATLSADYQQLAVTFTTGPNAQTATIYGYRQNSG SGAGYFDDVELTAVQDFAPYQPLANAIAPQAIPTYDGANQPTHPSVVKFEQPWNGYLYWMAMTPYPFNDG SYENPSIVASNDGENWIVPEGVSNPLAGTPSPGHNCDVDLVYVPASDELRMYYVEADDIISSRVKMISSR DGVHWSEPQVVMQDLVRKYSILSPSIEILPDGTYMMWYVDTGNAGWNSQNNQVKYRTSADGIKWSGAVTC TDFVQPGYQIWHIDVHYDTSSGAYYAVYPAYPNGTDCDHCNLFFAVNRTGKQWETFSRPILKPSTEGGWD

DFCIYRSSMLIDDGMLKVWYGAKKQEDSSWHTGLTMRDFSEFMKILER SEQ ID NO:25 Descrição: Construto de expressão de proteína de GalNAcDeacetilase Robinsoniella peoriensis Rp3671 (no vetor pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHSPLSAAAESGTGTRLVKGQTGYLTEEQAIRNQEQTTEEREQKLTGEETAE VLMEGTKDSGIVQTEEVQTKEMQTEDAQTEEVQTEEMQTEDAQTKEVQTEEMQTEDAQTEEVQTKEEPAE ETHMKEIQTQGTKKASDRNGKARVTEILEDAQDPANRIVYLSDLQWKSENHTVDSELPTRKDKSFGGGKI TLKVDGTVTEFDKGIGTQTDSTIVYDLEGKGYTKFETYVGVDYSQKENIPGEVCDVKFRVKIDDKIVSET GVLDPLSNAVKISVNIPDTAKTLTLYADKVTETWSDHANWADAKFYQALPEPENVAFKKTVVTRKTSDNS EAPVNPDSAVNSSKAVDGVIDSSSYFDFGDQANSGAVRESLYMEVDLKGSYLLSDIQLWRYWKDGRTYAA TAIVVAEDENFENAAVIYNSDTTGEIHHLGAGSDMLYAETESGKTFPVPENTKARYIRVYTYGVNGTSGV TNHIVELKVNAYVFGDEILPEKPDDSKIFPNAVNPLKLQGPGTNDQVTHPDVTVFDEPWNGYKYWMAYTP NKPGSSYFENPCIAASNDGVNWEFPAQNPVQPRYDSEIENQNEHNCDTDIVYDPVNDRLIMYWEWAQDEA VNGKTHRSEIRYRVSYDGINWGVEDKTGVLMTGPTDHGCAIATEGERYSDLSPTVVYDKTEKIYKMWAND AGDVGYENKQNNKVWYRTSQDGISNWSDKTYVENFLGVNEDGLQMYPWHQDIQWVEEFQEYWALQQAFPA GSGPDNSSLRFSKSKDGLHWEPVSEKALITVGAPGTWDAGQIYRSTFWYEPGGAKGNGTFHIWYAALAEG QSHWDIGYTSANYADAMYKLTGSRPEVEKRIEVNNENPLLIMPLYGKSYSESGSTLDWGDDLVSRWKQVP EDLKENAVIEIHLGGKIGLNESDSHTAKAFYEQQLAIAQENNIPVMMVVATAGQQNYWTGTANLDAEWID RMFKQHSVLKGIMSTENYWTDYNKVATMGADYLRVAAENGGYFVWSEHQEGVIENVIANEKFNEALKLYG NNFIFTWKNTPAGTNSNAGTASYMQGLWLTGICAQWGGLADTWKWYEKGFGKLFDGQYSYNPGGEEARPV ATEPEALLGIEMMSIYTNGGCVYNFEHPAYVYGSYNQNSPCFENVIAEFMRYAIKNPAPGKEEVLADTKA VFYGKLSSLKSAGNLLQKGLNWEDATLPTQTTGRYGLIPAVPEAVDEKTVKAVFGDIEILNQSSAQLANK DAKKAYFEEKYPEQYTGTAFGQLLNDTWYLYNSNVNVDGVQNAKLPLEGNKSVDITMTPHTYVILDDQDG ELQIKLNNYRVDKDSIWEGYGTTVTDRWDTDHNTKLQDWIRDEYIPNPDDDTFRDTTFELVGLESEPEVN VTNGLKDQYQEPVVEYDAAAGTAMITVSGNGWVDLTIDTNTAEVPQVDKAKLNSKIAEAKGIRQGNYTDE SYKALQEEIGKSQAVSNKTDATQEEVNAQLSRLESAIARLKEKPAVVSKTALNAKIAEAKGIRQGNYTDE SYKALQNAIVKAQELSNKTDATQQQVNDLVSALTNAIKNLKIDADKLAAESAKKVAAVKVAVKAVSYKSK EIKLSWKTVADADGYVIRVKTGKKWSTEKTIKNNRIITYTYKKGTPGKKYVFEVKAFKKVNGKTTYSKYK TATKKVVPQTVTAKAKASKNNVVVKWNKVSGASGYVVMKKKGKTWVKAAQVNAKKLYFTDKKVKKGKVYS

YKVKAYKVYKGKKVYGSYSKSVNVKTKS SEQ ID NO:27 Descrição: Construto de expressão de proteína de GalNAcDeacetilase de Robinsoniella peoriensis Rp3672 (no veotr pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHAETATEENAALEKTVTLHKSDGTELPEDYRNPQRPATMAVDGIIDDTGEY NYCDFGKDGDKAALYMQVDLGGLYDLSRVNMWRYWKDSRTYDATVITTSESGDFTDEAVIYNSDRSNVHG FGAGGDERYAETASGHEFPVPDGTKAQAVRVYVFGSQNGTTNHINELQVWGTPHTENPDVNSYQVTIPQG NGYQVIPYENDPTTVEEGGSFRFQVLIDSDNGYSATSAVKANGVSLEAVDSVYTIENITEDQVITIEGVH KAQYEVKFPENPQGYSVEIQNEGSTTVDYNGSVSFKLIIDEAYNESVPVVKANGGAALGKDELGVYTIAN IQDDITVTVEGIQENTVVKTKTMYLSDMDWKSAANAVGATGEKDTPTKDLNHLQQQMKLLVNGAEKSFDK GIGVQTDSSIVYDLEDKGYTSFHTLAGVDYSAMEYVDGEGCDIQFKVYLDDVVVFDSGVVDASDEAQEVN VAITSENKELKLEAKMVKEPYNDWGNWADASFEMAYPEPSNVALNKTVTVKKTADNSDSEVNSSRPGSMA VDGIIGPTSDSNYCDFGQDGDNTSRYLQVDLGDVYELTQINMFRYWADGRVYNGTVIAVSENADFSNPTF IYNSDKADKHGLGAGSDDTYGETQSGKLFEVPAGTMGQYVRVYMAGSNKGTTNHIAELQVMGYNFNTEPK PYEANAFENAEVYLDMPTHFQDLDSNKNDDGSLKHIGGQVTHPDIQVFDQPWNGYKYWMIYTPNTMITSQ YENPYIVASEDGQTWVEPEGISNPIEPEPPSTRFHNCDADLLYDSVNDRLLAYWNWADDGGGIDDELKDQ NCQIRLRISYDGINWGVPYDKDGNIATTADTVVRMETGDKDFIPAISEKDRYGMLSPTFTYDDFRGIYTM WAQNSGDAGYNQSGKFIEMRWSEDGINWSEPQKVNNFLGKDENGRQLWPWHQDIQYIPELQEYWGLSQCF STSNPDGSVLYLTKSRDGVNWEQAGTQPVLRAGKSGTWDDFQIYRSTFYYDNQSDSPTGGKFRIWYSALQ ANTSGKTVLAPDGTVSLQVGSQDTRIWRIGYTENDYMEVMKALTQNKNYEEPELVDAVSLNLSMDKTSIS VGEEATVSTAFVPENATDRIVKYTSQDPEIAVIDPTGIVTGVKDGTTTIVAETKSGAKGELSVTVGELQR GEIRFEVSNDHPMYLENYYWSDDAPKKDGLDANKNYYGDERVDSPVMLYNTVPEELKDNTVILLIAERSL NSTDAVRDWIKKNVELCNENKIPCAVQIANGETNVNTTIPLSFWNELATNNEYLVGFNAAEMYNRFAGDN RSYVMDMIRLGVSHGVCMMWTDTNIFGTNGVLYDWLTQDEKLSGLMREYKEYISLMTKESYGSEAANTDA LFKGLWMTDYCENWGIASDWWHWQLDSNGALFDAGSGGDAWKQCLTWPENMYTQDVVRAVSQGATCFKSE AQWYSNATKGMRTPTYQYSMIPFLEKLVSKEVKIPTKEEMLERTKAIVVGAENWNNFNYNTTYSNLYPST GQYGIVPYVPSNCPEEELAGYDLVVRENLGKAGLKSALDTVYPVQKSEGTAYCETFGDTWYWMNSSEDKN VSQYTEFTTAINGAESVKIAGEPHVFGIIKENPGSLNVYLSNYRLDKTELWDGTIPGGLSDQGCYNYVWQ MCERMKNGTGLDTQLRDTVITVKNAVEPKVNFVTESPADRSFAEDNYVRPYKYTVAQKEGTTDEWVITVS HNGIVEFNIVTGDEKVPATSVELSTDKVDVIRNRTAVVKATVLPQNAGNKQLTWTIADPEIASVDNKGTV TGLKEGKTVLRAAISGSVYKECEVNVIDRKVTEVNLNKTELSLSAGDSAKLEASIAPEDPSDSSITWTST NENVATVASNGTVTAHKAGVAQIIAQSAYQAKGIATVTVNYAASVKLDRTGMTATANSEQSKSGGEGPAS NVLDGKQDTMWHTSWTDKPELHPHWIKIDLNGTKTINKFAYTPRTGASNGTIYNYVLIITDLEGNEKQVA KGVWAANADVKYAEFDAVEATAIKLQVDGNDDKASKGGYGSAAEINIFEVAQKPSANELAENIKVIAPVK AEDTKVSIPVITGFDIVISNSSNPDVIGIDGSITRPENDTVVTLTLKVKETDAKSVKAAGTEATTNVDVL VTGTKTSDVEAESVTLDQTSADLTVGGELLLNAVVKPDIATNKAVTWSSDKPGTATVENGRVKALAAGEA RITAATANGKTADCVINVKEKEEPEVILPAEVRLNIPSAEFTVGDQIQLTASVLPANAADKTITWKSDKP EVATVANGWVKGIAAGTAKITATSVNGKTAVCVITVKAQPQNLPTGVSLNKKTASVKLNKTLTLSAVVQP SNADNKTVKWTSDNTYVATVENGVVKAVNAGTARITAATVNGHKATCTITVPGTKISKAKVSLASSKTHT GKALKPSVKVTYGKNTLKKNTDYTVSYKNNINPGTASVTITGKGKYYGTINKTFAIKAAEGKTYTVGKGK YKVTDASAKNKTVTFMAPVKKTYSSFSVPSKVKIGNDTYKVTAVAKNAFKKNTKLTKLTIGSNVKTIGSY

AFYGASQLKTLTLKTTGLNSVGKNAFKKTNAKLTVKVPKSKLADYKKLLKGKGLSGKAKIQK SEQ ID NO:29 Descrição: Construto de expressão de proteína de GalNAcDeacetilase de Robinsoniella peoriensis Rp3671 (no vetor pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHSPLSAAAESGTGTRLVKGQTGYLTEEQAIRNQEQTTEEREQKLTGEETAE VLMEGTKDSGIVQTEEVQTKEMQTEDAQTEEVQTEEMQTEDAQTKEVQTEEMQTEDAQTEEVQTKEEPAE ETHMKEIQTQGTKKASDRNGKARVTEILEDAQDPANRIVYLSDLQWKSENHTVDSELPTRKDKSFGGGKI TLKVDGTVTEFDKGIGTQTDSTIVYDLEGKGYTKFETYVGVDYSQKENIPGEVCDVKFRVKIDDKIVSET GVLDPLSNAVKISVNIPDTAKTLTLYADKVTETWSDHANWADAKFYQALPEPENVAFKKTVVTRKTSDNS EAPVNPDSAVNSSKAVDGVIDSSSYFDFGDQANSGAVRESLYMEVDLKGSYLLSDIQLWRYWKDGRTYAA TAIVVAEDENFENAAVIYNSDTTGEIHHLGAGSDMLYAETESGKTFPVPENTKARYIRVYTYGVNGTSGV TNHIVELKVNAYVFGDEILPEKPDDSKIFPNAVNPLKLQGPGTNDQVTHPDVTVFDEPWNGYKYWMAYTP NKPGSSYFENPCIAASNDGVNWEFPAQNPVQPRYDSEIENQNEHNCDTDIVYDPVNDRLIMYWEWAQDEA VNGKTHRSEIRYRVSYDGINWGVEDKTGVLMTGPTDHGCAIATEGERYSDLSPTVVYDKTEKIYKMWAND AGDVGYENKQNNKVWYRTSQDGISNWSDKTYVENFLGVNEDGLQMYPWHQDIQWVEEFQEYWALQQAFPA GSGPDNSSLRFSKSKDGLHWEPVSEKALITVGAPGTWDAGQIYRSTFWYEPGGAKGNGTFHIWYAALAEG

QSHWDIGYTSANYADAMYKLTGSR SEQ ID NO:31 Descrição: Construto de expressão de proteína de GalNAcDeacetilase de Robinsoniella peoriensis Rp3672 (no veotr pET28a) com HisTag e Sítio de clivagem de trombina

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHAETATEENAALEKTVTLHKSDGTELPEDYRNPQRPATMAVDGIIDDTGEY NYCDFGKDGDKAALYMQVDLGGLYDLSRVNMWRYWKDSRTYDATVITTSESGDFTDEAVIYNSDRSNVHG FGAGGDERYAETASGHEFPVPDGTKAQAVRVYVFGSQNGTTNHINELQVWGTPHTENPDVNSYQVTIPQG NGYQVIPYENDPTTVEEGGSFRFQVLIDSDNGYSATSAVKANGVSLEAVDSVYTIENITEDQVITIEGVH KAQYEVKFPENPQGYSVEIQNEGSTTVDYNGSVSFKLIIDEAYNESVPVVKANGGAALGKDELGVYTIAN IQDDITVTVEGIQENTVVKTKTMYLSDMDWKSAANAVGATGEKDTPTKDLNHLQQQMKLLVNGAEKSFDK GIGVQTDSSIVYDLEDKGYTSFHTLAGVDYSAMEYVDGEGCDIQFKVYLDDVVVFDSGVVDASDEAQEVN VAITSENKELKLEAKMVKEPYNDWGNWADASFEMAYPEPSNVALNKTVTVKKTADNSDSEVNSSRPGSMA VDGIIGPTSDSNYCDFGQDGDNTSRYLQVDLGDVYELTQINMFRYWADGRVYNGTVIAVSENADFSNPTF IYNSDKADKHGLGAGSDDTYGETQSGKLFEVPAGTMGQYVRVYMAGSNKGTTNHIAELQVMGYNFNTEPK PYEANAFENAEVYLDMPTHFQDLDSNKNDDGSLKHIGGQVTHPDIQVFDQPWNGYKYWMIYTPNTMITSQ YENPYIVASEDGQTWVEPEGISNPIEPEPPSTRFHNCDADLLYDSVNDRLLAYWNWADDGGGIDDELKDQ NCQIRLRISYDGINWGVPYDKDGNIATTADTVVRMETGDKDFIPAISEKDRYGMLSPTFTYDDFRGIYTM WAQNSGDAGYNQSGKFIEMRWSEDGINWSEPQKVNNFLGKDENGRQLWPWHQDIQYIPELQEYWGLSQCF STSNPDGSVLYLTKSRDGVNWEQAGTQPVLRAGKSGTWDDFQIYRSTFYYDNQSDSPTGGKFRIWYSALQ

ANTSGKTVLAPDGTVSLQVGSQDTRIWRIGYTENDYMEVMKALTQNKNYEE SEQ ID NO:32 Descrição: Sequência de proteína de GalNAcDeacetilase de Clostridium tertium 5757 (Ct5757)

HSGQYWLVFQPDNDVLQTKTNPSSMKQSANNNPYNYNILPNSFPIGTGYNAYKGDVSFYATFKEASSQAI PQNSWALKYVDSEETTGENGRATNAFDGNNNTIWHTKYSGGNAAPMPHEIQIDLRGVYNINQINYLPRQD GGTNGTIKDYEVYLSLDGVNWGQPISKGTFESNSTEKIVKFNETKSRYVKLKALSEINNKQFTTVADLKV FGWEISKIEKPLQNAETYLNIPTYDGLNQSTHPDVKYFKNGWNGYKYWMIMTPNRTGSSVAENPSILASD DGINWEVPAGVTNPIAPMPQVGHNCDVDMIYNEATDELWVYWVESDDITKGWVKLIKSKDGVNWSSQQVV VDDNRAKYSTLSPSIIFKDNKYYMWSVNTGNSGWNNQSNKVELRESSDGVNWSNPTVVNTLAQDGSQIWH VNVEYIPSKNEYWAIYPAYKNGTGSDKTELYYAKSSDGVNWTTYKNPILSKGTSGKWDDMEIYRSCFVYD

EDTNMIKVWYGAVSQNPQIWKIGFTENDYDKFIEGLTQ SEQ ID NO:33 Descrição: Sequência de proteína de GalNAcDeacetilase de Ruthenibacterium lactatiformans Rl8755

HEETDLLVNGGFETGDSTGWNWFNNAVVDSAAPHSGNYCAKVAKNSSYEQVVTVSPDTKYVLTGWAKSEG SSVMTLGVKNYGGQETFSATLSADYQQLAVTFTTGPNAQTATIYGYRQNSGSGAGYFDDVELTAVQDFAP YQPLANAIAPQAIPTYDGANQPTHPSVVKFEQPWNGYLYWMAMTPYPFNDGSYENPSIVASNDGENWIVP EGVSNPLAGTPSPGHNCDVDLVYVPASDELRMYYVEADDIISSRVKMISSRDGVHWSEPQVVMQDLVRKY SILSPSIEILPDGTYMMWYVDTGNAGWNSQNNQVKYRTSADGIKWSGAVTCTDFVQPGYQIWHIDVHYDT SSGAYYAVYPAYPNGTDCDHCNLFFAVNRTGKQWETFSRPILKPSTEGGWDDFCIYRSSMLIDDGMLKVW

YGAKKQEDSSWHTGLTMRDFSEFMKILER SEQ ID NO:34 Descrição: Proteína de GalNAcDeacetilase de Robinsoniella peoriensis Rp3671

HSPLSAAAESGTGTRLVKGQTGYLTEEQAIRNQEQTTEEREQKLTGEETAEVLMEGTKDSGIVQTEEVQT KEMQTEDAQTEEVQTEEMQTEDAQTKEVQTEEMQTEDAQTEEVQTKEEPAEETHMKEIQTQGTKKASDRN GKARVTEILEDAQDPANRIVYLSDLQWKSENHTVDSELPTRKDKSFGGGKITLKVDGTVTEFDKGIGTQT DSTIVYDLEGKGYTKFETYVGVDYSQKENIPGEVCDVKFRVKIDDKIVSETGVLDPLSNAVKISVNIPDT AKTLTLYADKVTETWSDHANWADAKFYQALPEPENVAFKKTVVTRKTSDNSEAPVNPDSAVNSSKAVDGV IDSSSYFDFGDQANSGAVRESLYMEVDLKGSYLLSDIQLWRYWKDGRTYAATAIVVAEDENFENAAVIYN SDTTGEIHHLGAGSDMLYAETESGKTFPVPENTKARYIRVYTYGVNGTSGVTNHIVELKVNAYVFGDEIL PEKPDDSKIFPNAVNPLKLQGPGTNDQVTHPDVTVFDEPWNGYKYWMAYTPNKPGSSYFENPCIAASNDG VNWEFPAQNPVQPRYDSEIENQNEHNCDTDIVYDPVNDRLIMYWEWAQDEAVNGKTHRSEIRYRVSYDGI NWGVEDKTGVLMTGPTDHGCAIATEGERYSDLSPTVVYDKTEKIYKMWANDAGDVGYENKQNNKVWYRTS QDGISNWSDKTYVENFLGVNEDGLQMYPWHQDIQWVEEFQEYWALQQAFPAGSGPDNSSLRFSKSKDGLH WEPVSEKALITVGAPGTWDAGQIYRSTFWYEPGGAKGNGTFHIWYAALAEGQSHWDIGYTSANYADAMYK

LTGSR SEQ ID NO:35 Descrição: proteína de Rp3672_GalNAcDeacetilase de Robinsoniella peoriensis

HAETATEENAALEKTVTLHKSDGTELPEDYRNPQRPATMAVDGIIDDTGEYNYCDFGKDGDKAALYMQVD LGGLYDLSRVNMWRYWKDSRTYDATVITTSESGDFTDEAVIYNSDRSNVHGFGAGGDERYAETASGHEFP VPDGTKAQAVRVYVFGSQNGTTNHINELQVWGTPHTENPDVNSYQVTIPQGNGYQVIPYENDPTTVEEGG SFRFQVLIDSDNGYSATSAVKANGVSLEAVDSVYTIENITEDQVITIEGVHKAQYEVKFPENPQGYSVEI QNEGSTTVDYNGSVSFKLIIDEAYNESVPVVKANGGAALGKDELGVYTIANIQDDITVTVEGIQENTVVK TKTMYLSDMDWKSAANAVGATGEKDTPTKDLNHLQQQMKLLVNGAEKSFDKGIGVQTDSSIVYDLEDKGY TSFHTLAGVDYSAMEYVDGEGCDIQFKVYLDDVVVFDSGVVDASDEAQEVNVAITSENKELKLEAKMVKE PYNDWGNWADASFEMAYPEPSNVALNKTVTVKKTADNSDSEVNSSRPGSMAVDGIIGPTSDSNYCDFGQD GDNTSRYLQVDLGDVYELTQINMFRYWADGRVYNGTVIAVSENADFSNPTFIYNSDKADKHGLGAGSDDT YGETQSGKLFEVPAGTMGQYVRVYMAGSNKGTTNHIAELQVMGYNFNTEPKPYEANAFENAEVYLDMPTH FQDLDSNKNDDGSLKHIGGQVTHPDIQVFDQPWNGYKYWMIYTPNTMITSQYENPYIVASEDGQTWVEPE GISNPIEPEPPSTRFHNCDADLLYDSVNDRLLAYWNWADDGGGIDDELKDQNCQIRLRISYDGINWGVPY DKDGNIATTADTVVRMETGDKDFIPAISEKDRYGMLSPTFTYDDFRGIYTMWAQNSGDAGYNQSGKFIEM RWSEDGINWSEPQKVNNFLGKDENGRQLWPWHQDIQYIPELQEYWGLSQCFSTSNPDGSVLYLTKSRDGV NWEQAGTQPVLRAGKSGTWDDFQIYRSTFYYDNQSDSPTGGKFRIWYSALQANTSGKTVLAPDGTVSLQV

GSQDTRIWRIGYTENDYMEVMKALTQNKNYEE SEQ ID NO:36 Descrição: Sequência de proteína de Galactosaminidase de Clostridium tertium 5757 (Ct5757)

HYNLIDNISVEKLDTDISQANENVFLNGNGIALEVDNRGATCIYLVDENGVKTKATTSLDTADFSGYPII GGQKIRDFVIISKNLEENINSILGVGNRLTIISKSSSTNLIRKIVFETSNSNPGAIYSTVSYKAESNDLL VDSFHENEYTMSLGQGPFLAYQGCADQQGANTIVNVTNGYNHNSGQNNYSVGVPFSYVYNSVGGIGIGDA STSRREFKLPIIGKDNTVSLGMEWNGQTLKKGAETAIGTSVITTTNGDYYSGLKSYAEVMKDKGISAPAS IPDIAYDSRWESWGFEFDFTIEKIVNKLDELKAMGIKQITLDDGWYTYAGDWKLSPQKFPNGNADMKYLT DEIHKRGMTAILWWRPVDGGINSKLVSEHPEWFIKNSQGNMVRLPGPGGGNGGTAGYALCPNSEGSIQHH KDFVTVALEEWGFDGFKEDYVWGIPKCYDSSHKHSSLSDTLENQYKFYEAIYEQSIAINPDTFIELCNCG TPQDFYSTPYVNHAPTADPISRVQTRTRVKAFKAIFGDDFPVTTDHNSVWLPSALGTGSVMITKHTTLSS SDREQYNKYFGLARDLELAKGEFIGNLYKYGIDPLESYVIRKGEDIYYSFYKDNSSYSGNIEIKGLDSNA TYRIEDYVNNRVIARGVKGPTATINTSFTDNLLVRAIPDDTPAEVTTFDVGNNTILSSTDSGNSKYLNAV STTLEKTATIDSLSIYIGNNSENGKLQIAIYDDNNGKPGTKKAYVEEFVPTKNSWNTKKVVNSVTLPSGQ YWLVFQPDNDVLQTKTNPSSMKQSANNNPYNYNILPNSFPIGTGYNAYKGDVSFYATFKEASSQAIPQNS WALKYVDSEETTGENGRATNAFDGNNNTIWHTKYSGGNAAPMPHEIQIDLRGVYNINQINYLPRQDGGTN GTIKDYEVYLSLDGVNWGQPISKGTFESNSTEKIVKFNETKSRYVKLKALSEINNKQFTTVADLKVFGWE

ISKIEK SEQ ID NO:37 Descrição: Sequência de proteína de Galactosaminidase de Robinsoniella peoriensis Rp1021

HGNGLEVKASPREVAQITGNGVSVTFFQEDGTVQLSCIEDDGNTAFMTRNSEVSYPVVGGEEVTDFSDFQ CEVQENVTGAAGAGSRMTITSISSGRGIQRSVVIETVDEVKGLLHISSSYRAEEEVDADEFIDSRFSLDN PSDTVWSYNGGGEGAQSRYDTLQKIDLSDGESFYRENLQNQTAAGIPVADIYGKDGGITVGDASVTRRQL STPVNERNGTAYVSVKHPGAVITQRETEISQSFVNVHRGDYYSGLRGYADGMKQIGFTTLSREQIPESSY DLRWESWGWEFDWTVELIINKLDELKEMGIKQITLDDGWYNAAGEWGLNNWKLPNGALDMRHLTDAIHER GMTAVLWWRPCDGGREDSALFKEHPEYFIKNQDGSFGKLAGPGQWNSFLGSCGYALCPLSEGAVQSQVDF INRAMNEWGFDGFKSDYVWSLPKCYSQDHHHEYPEESTEQQAVFYRAVYEAMTDNDPNAFHLLCNCGTPQ DYYSLPYVTQVPTADPTSVDQTRRRVKAYKALCGDYFPVTTDHNEVWYPSTIGTGAILIEKRDLSGWEEE EYAKWLKIAQENQLHKGTFIGDLYSYGYDPYETYTVYKDGIMYYAFYKDGNRYRPSGNPDIELKGLEDGK LYRIVDYVNNQVVATNVTSSNAVFSYPFSDYLLVKAVEISEPDTDGPGPVPDPEGAVTVEENDPELVYTG DWVREENDGYHGGGARYTKEAEASVELAFYGTGAAWYGQHDVNFGSARIYIDGTYVKTVSCMGEPGINIK LFEISGLDLASHRIKIECETPVIDIDRLTYIKGEEVPAKVMTADLRALTVIANQYDMNSFADGNYKDQLG VSLVRANQLLAADDVTQGAVNEEQKYLLNAMLKIRKKVDKSWIGLPGPIPQDIQTENISRDNLAKVISYT GQLDRDEIIPAIKEQLNDSYDKAVSIAERQDASQPEIDRAWAELMNAVQYSSYIRGSKEELLSLLDEYGK VDTTVYKDAALFIESLEAAKKVYQDENAMDGEISDCIKQLRDAKDQLQLKDPVDPPKPDPDPDPKPDPTP DPGPDPKPDPTPDPTPDPKPNPTPTPDPTPEPALKKPEQVSGLKSKAETDYLTVSWKKLNNAESYKVYIY KSGKWRLAGKTTKTSIKIKKLVSGTKYTVKVAAVNKAGQGKYSSQVYTAAKPKKVKLKSVSRYRTSKVKL NYGKVKAGGYEIWMKNGKGSYKKAATSTKTTAIKSGLKKGKTYYFKVRAYVKNKNQVIYGSFSNIKKYKM VL

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Epub 30de julho de 2011

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada pelo fato de compreender: (a) uma proteína GalNAcDeacetilase purificada; e (b) uma proteína Galactosaminidase purificada.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é selecionada a partir de uma ou mais de: (a) a proteína GalNAcDeacetilase purificada é selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:2; SEQ ID NO.:4; SEQ ID NO.:5; SEQ ID NO.:17; SEQ ID NO.:23; SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:33; SEQ ID NO.:34; e SEQ ID NO.:35; e (b) a proteína Galactosaminidase purificada é selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:7; SEQ ID NO.:9; SEQ ID NO.:10; SEQ ID NO.:19; SEQ ID NO.:21; SEQ ID NO.:36; e SEQ ID NO.:37.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das

SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a composição compreende enzimas selecionadas a partir de uma ou mais de: (a) a proteína GalNAcDeacetilase purificada é uma proteína GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:4 e SEQ ID NO.:5; e (b) a proteína Galactosaminidase purificada é uma proteína Galactosaminidase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:7, SEQ ID NO.:9 e SEQ ID NO.:10.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a composição é selecionada a partir de uma ou mais de: (a) a proteína GalNAcDeacetilase purificada é uma proteína GalNAcDeacetilase de Clostridium tertium purificada de SEQ ID NO.:17 ou SEQ ID NO.:32; e (b) a proteína Galactosaminidase purificada é uma proteína Galactosaminidase de Clostridium tertium purificada de SEQ ID NO.:19 ou SEQ ID NO.:36.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase são capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 1 µg/ml.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase têm atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a GalNAcDeacetilase e Galactosaminidase têm atividade de clivagem do antígeno A a temperaturas entre 4 °C e 37 °C.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que (a) a GalNAcDeacetilase purificada e a Galactosaminidase purificada são imobilizadas; (b) a GalNAcDeacetilase purificada é imobilizada; ou (c) a Galactosaminidase purificada é imobilizada.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a enzima imobilizada é fixada a uma superfície, a superfície sendo selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: (a) uma esfera ou microesfera; (b) um recipiente; (c) um tubo; (d) uma coluna; ou (e) uma matriz.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente um agente de aglomeração.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o agente de aglomeração é selecionado a partir de um ou mais dentre: um dextrano, um sulfato de dextrano, uma dextrina, um pululano, um poli(etilenoglicol), um Ficoll™ e uma proteína inerte.

13. Enzima purificada caracterizada pelo fato de compreender GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii de SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:4 ou SEQ ID NO.:5.

14. Enzima purificada caracterizada pelo fato de compreender Galactosaminidase de Flavonifractor plautii de SEQ ID NO.:7, SEQ ID NO.:9 ou SEQ ID NO.:10.

15. Enzima purificada caracterizada pelo fato de compreender GalNAcDeacetilase de Clostridium tertium de SEQ ID NO.:17 ou SEQ ID NO.:32.

16. Enzima purificada caracterizada pelo fato de compreender Galactosaminidase de Clostridium tertium de SEQ ID NO.:19 ou SEQ ID NO.:36.

17. Sequência de ácido nucleico isolada caracterizada pelo fato de codificar GalNAcDeacetilase selecionada a partir de uma ou mais de: SEQ ID NO.:1; SEQ ID NO.:3; SEQ ID NO.:16; SEQ ID NO.:24; SEQ ID NO.:26; SEQ ID NO.:28; e SEQ ID NO.:30.

18. Sequência de ácido nucleico isolada caracterizada pelo fato de codificar Galactosaminidase selecionada a partir de uma ou mais de: SEQ ID NO.:6; SEQ ID NO.:8; SEQ ID NO.:18; e SEQ ID NO.:20.

19. Vetor caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 ou 18 e uma sequência de ácido nucleico heteróloga.

20. Vetor, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico heteróloga é selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: um marcador de proteína; e um local de clivagem.

21. Vetor, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o marcador de proteína é selecionado a partir de um ou mais dentre: Proteína de ligação à albumina (ABP); Fosfatase Alcalina (AP); Epítopo AU1; Epítopo AU5; AviTag; Epítopo T7 de bacteriófago (T7- tag); Epítopo V5 de bacteriófago (V5-tag); Proteína transportadora de biotina-carboxi (BCCP); Marcador do vírus da febre catarral (B-tag); anticorpo camelídeo de domínio único (C-tag); Peptídeo de ligação a calmodulina (CBP ou Calmodulin-tag); Cloranfenicol Acetil Transferase (CAT); Domínio de ligação de celulose (CBP); Domínio de ligação de quitina (CBD); Domínio de ligação à colina (CBD); Dihidrofolato redutase (DHFR); DogTag; Epítopo E2; E-tag;

Epítopo FLAG (FLAG-tag); Proteína de ligação à galactose (GBP); Proteína fluorescente verde (GFP); Glu-Glu (marcador EE); Glutationa S-transferase (GST); Hemaglutinina da gripe humana (HA); HaloTag™; Marcadores alternados de histidina e glutamina (HQ tag); Marcadores alternados de histidina e asparagina (HN tag); Marcador de afinidade de histidina (HAT); Peroxidase de rábano (HRP); Epítopo HSV; Marcador Isopep (Isopep-tag); Isomerase cetosteróide (KSI); Epítopo KT3; LacZ; Luciferase; Proteína de ligação à maltose (MBP); Epítopo Myc (Myc-tag); NE-tag; NusA; Domínio PDZ; Ligando PDZ; Poliarginina (Arg-tag); Poliaspartato (Asp-tag); Policisteína (Cys-tag); Poliglutamato (Glu-tag); Poli- histidina (His-tag); Polifenilalanina (Phe-tag); Profinity eXact; Proteína C; Rho1D4-tag; S1-tag; S-tag; Softag 1; Softag 3; SnoopTagJr; SnoopTag; Spot-tag; SpyTag (Spy-tag); Peptídeo de ligação à estreptavadina (SBP); Proteína A estafilocócica (Proteína A); Proteína G estafilocócica (Proteína G); Strep-tag; Estreptavadina (SBP-tag); Strep- tag II; Sdy-tag; Modificador pequeno do tipo Ubiquitina (SUMO); Purificação de afinidade em tandem (TAP); Epítopo T7; Marcador de tetracisteína (TC-tag); Tioredoxina (Trx); TrpE; Marcador Ty; Ubiquitina; Universal; V5 tag; VSV-G ou VSV-tag; e Marcador Xpress.

22. Vetor caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 ou 18.

23. Método para clivar enzimaticamente antígenos A de eritrócitos, o método caracterizado pelo fato de compreender: (a) combinar uma proteína GalNAcDeacetilase e uma proteína Galactosaminidase com (i) sangue compreendendo o antígeno tipo A; ou (ii) eritrócitos de tipo A ou tipo AB; (b) incubar as enzimas com (i) o sangue; ou (ii) os eritrócitos de um tipo A ou tipo AB; por um período de tempo suficiente para permitir que as enzimas clivem os antígenos A do sangue ou eritrócitos.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a GalNAcDeacetilase é uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:2; SEQ ID NO.:4; SEQ ID NO.:5; SEQ ID NO.:17; SEQ ID NO.:23; SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:33; SEQ ID NO.:34; e SEQ ID NO.:35; e a Galactosaminidase é uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:7; SEQ ID NO.:9; SEQ ID NO.:10; SEQ ID NO.:19; SEQ ID NO.:21; SEQ ID NO.:36; e SEQ ID NO.:37.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a composição compreende: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

26. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a GalNAcDeacetilase é uma proteína GalNAcDeacetilase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:4 ou SEQ ID NO.:5 e a Galactosaminidase é uma proteína Galactosaminidase de Flavonifractor plautii purificada de SEQ ID NO.:9 ou SEQ ID NO.:10.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelo fato de compreende ainda adicionar um agente de aglomeração.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o agente de aglomeração é selecionado a partir de um ou mais dentre: um dextrano; um sulfato de dextrana; uma dextrina; um pululano; um poli(etilenoglicol); um Ficoll™; um glicerol hiper- ramificado; e uma proteína inerte.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizado pelo fato de compreender ainda lavar o sangue ou os eritrócitos para remover GalNAcDeacetilase, Galactosaminidase e o agente de aglomeração.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizado pelo fato de que a GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase são capazes de clivar o antígeno A em ou abaixo de 1 µg/ml.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, caracterizado pelo fato de que a GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase têm atividade de clivagem do antígeno A a um pH entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 31, caracterizado pelo fato de que a GalNAcDeacetilase e a Galactosaminidase têm atividade de clivagem do antígeno A a temperaturas entre 4 °C e 37 °C.

33. Sistema de coleta e armazenamento de sangue caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma proteína GalNAcDeacetilase purificada; e (b) uma proteína Galactosaminidase purificada.

34. Sistema, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que: (a) a GalNAcDeacetilase é uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais de: SEQ ID NO.:2; SEQ ID NO.:4; SEQ ID NO.:5; SEQ ID NO.:17; SEQ ID NO.:23; SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:33; SEQ

ID NO.:34; e SEQ ID NO.:35; e (b) a Galactosaminidase é uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:7; SEQ ID NO.:9; SEQ ID NO.:10; SEQ ID NO.:19; SEQ ID NO.:21; SEQ ID NO.:36; e SEQ ID NO.:37.

35. Sistema, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a composição compreende: uma enzima purificada possuindo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

36. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33, 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende ainda uma superfície na qual a enzima é imobilizada, a superfície sendo selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: (a) uma esfera ou microesfera; (b) um recipiente; (c) um tubo; (d) uma coluna; ou (e) uma matriz.

37. Aparelho de coleta e armazenamento de sangue, o aparelho caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma superfície; (b) uma proteína GalNAcDeacetilase purificada imobilizada na superfície; e (c) uma proteína Galactosaminidase purificada imobilizada na superfície.

38. Aparelho, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que: (a) a GalNAcDeacetilase é uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais de: SEQ ID NO.:2; SEQ ID NO.:4; SEQ ID NO.:5; SEQ ID NO.:17; SEQ ID NO.:23; SEQ ID NO.:29; SEQ ID NO.:31; SEQ ID NO.:32; SEQ ID NO.:33; SEQ ID NO.:34; e SEQ ID NO.:35; e (b) a Galactosaminidase é uma proteína purificada selecionada a partir de uma ou mais das seguintes: SEQ ID NO.:7; SEQ ID NO.:9; SEQ ID NO.:10; SEQ ID NO.:19; SEQ ID NO.:21; SEQ ID NO.:36; e SEQ ID NO.:37.

39. Aparelho, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a composição compreende: uma enzima purificada tendo uma atividade GalNAcDeacetilase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 2, 4, 5, 17, 23, 29, 31 e 32 a 35; e uma enzima purificada com atividade de galactosaminidase consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência apresentada em uma das SEQ ID NOs.: 7, 9, 10, 19, 21, 36 e 37.

40. Aparelho, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a superfície na qual a enzima é imobilizada é selecionada a partir de um ou mais dos seguintes: (a) uma esfera ou microesfera; (b) um recipiente; (c) um tubo; (d) uma coluna; ou (e) uma matriz.

41. Aparelho, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o recipiente é uma bolsa.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o recipiente é uma bolsa.

43. Sistema, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o recipiente é uma bolsa.