JP2021531827A - 不妊子孫の生成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ここに記述された作業の態様は、アメリカ合衆国農務省および国立食糧・農業研究所からの補助金2019-67030-29002支援によるものである。米国政府は、これらの発明に関し特定の権利を有する。
本開示は、真水および海水生物の不妊化方法に関する。
次項は、これらにおいて議論された内容は、先行技術または当業者の知識の一部であるということを認めているものではない。
この導入の目的は、読者へ対し本明細書を示すことであり、いかなる発明をも定義することではない。以下または本文書の他の部分で記述されている、器具等または方法過程の組み合わせまたは部分的組み合わせにおいて、1つ以上の発明について記載されていることがある。発明者は、他のいかなる発明者または本明細書において公開されたいかなる発明へ対しても、そのような発明または発明者について、本特許請求内に記述しないことにより、その権利を放棄または拒否しない。
現在開示されている方法および生物は、添付図を参照とし、例を通してのみ記述される。
本発明者らは、色素形成に関与する2つの遺伝子、すなわち、チロシナーゼ(tyr)コード化する遺伝子[1]およびミトコンドリア内膜タンパク質MpV17 (mpv17) [2] を別々にターゲットとした。Tyrおよびmpv17それぞれの遺伝子座において、注入された胚全体の50%および46%が、高変異性を示したということを見い出した(図3)。機能欠損アレルは、胚体(図3パネルB)および網膜色素上皮(図3パネルC)において、細胞自律的に無色素の黒色素胞となり、野生型表現型と比較し同定が容易な、メラニンおよび虹色素胞色素の完全欠損から部分欠損におよぶ胚の表現型を生み出した(図3パネルA)。色素の完全欠損を示している胚(処理した魚のうち10〜30%)を、3ヶ月まで育てたが、全てにおいて野生型tyrおよびmpv17配列が欠損していた。これらの魚は、半透明およびアルビノ表現型を表し(図3パネルD)、F0ティラピアにおいて、機能的研究の実施が可能であることを示唆している。
本発明者らは、多重ゲノムの遺伝子座は、同時にターゲットとすることができるのか、およびティラピアのゲノムにおいて、1つの遺伝子座で測定した変異原性効率は、もう1つの遺伝子座での変異を予測することが可能であるのかを検証した。本発明の仮説を検証するため、本発明者らは、tyrおよびDead-end1 (dnd1)を共同ターゲットとした。Dnd1は、生殖細胞運命および移動能力を維持する、PGC特異的なRNA結合タンパク質(RBP)である[3]。プログラムしたヌクレアーゼの注入後、本発明者らは、tyrおよびdnd1両方の遺伝子ターゲットにおける変異は、相関性が高いといことを見い出した。約95%のアルビノ(tyr;図4パネルAの成体表現型を参照)変異体も、dnd1遺伝子座における変異を持ち、選択マーカーとして、色素欠乏の適合性を証明していた(図4)。アルビノの魚10匹の生殖腺をさらに分析したところ、6匹の精巣が、生殖細胞のない半透明のものであった(図4パネルB)。野生型の精巣に強く発現している生殖細胞固有マーカー、vasaの発現は、dnd1変異体の精巣では、全く検知されなかった。この結果は、接合性のdnd1の発現は、生殖細胞の維持に必要であり、その上、母から寄与されたdnd1 mRNAおよび/またはタンパク質は、接合性の消失をレスキューすることはできないということを示唆している。
ティラピアの選択した遺伝子のオルソログおよびnos-3およびdnd1 3’非翻訳領域におけるシスエレメントは、ゲノムデータベースおよびアルゴリズムにより検索するモチーフ発見ソフトウェアから、イン・シリコで同定されている[4-7]。ヌル突然変異の生成頻度を高めるため、本発明者らは、2つの異なるエクソンを同時にターゲットとした。対象となる遺伝子と並行し、突然変異誘発選択マーカーの役割として、色素形成遺伝子も共同ターゲットとした。nos3 3’非翻訳領域をターゲットとしたものを除いた全ての変異体が、ZPC5:eGFP:nos 3’非翻訳領域構成を持つティラピア系で作り出された。本発明の先の研究に基づき、本発明者らは、胚200個へ注入することで、完全に色素が欠乏した胚を、20〜60個産出することができると予想した。これらの胚のうちの5個で、PCRフラグメント分析により、ゲノム修飾を定量的に分析した。さらに、例えば、ターゲットとなる遺伝子座2または4つの変異アレルを、フラグメント分析により検知するなど、1または2細胞期で、変異体が作られた胚のみを育てた。
選択したF0変異体を、形態異常、発育遅延および性分化の目的において選別した。変異した魚が正常に発育した場合、雄3匹および雌3匹をZPC5:eGFP:tnos 3’非翻訳領域ティラピアと交配し、それぞれ4ヶ月および6ヶ月時の繁殖能力を判定した。それぞれの交配に関し、F1子孫30匹の表現型が同定され、さらに20匹を蛍光顕微鏡検査法により分析した。これらの系統は、選択的にPGCでGFPを発現しているため、全てのPGCが、生殖隆起への移動を完了したとき、4 dpfで標識されたPGCを数えることが可能である。PGC総数の平均を、独立したサンプルのt検定を用い、F1子孫全体で統計的に比較した。人工的な変異体が仮説通りに機能する場合、本発明者らは、F0雌が生成したF1の胚のGFP-PGCの数が減少またはGFP-PGCが欠損していると予想した。同様に、変異体が確実に母性効果固有である場合、本発明者らは、F0雄は、PGCの数が正常(PGC ~35+/- 5個/胚)なF1子孫を産出すると予想した (図2A参照)。
(異なる遺伝子背景を持つWTの魚と異系交配した) F1ヘミ接合およびF2ホモ接合系を選択するため、本発明者らは、ターゲットとなる領域におよびアンプリコンについてのQPCR融解分析(MA)を用いた(図8)。ヘテロ接合性障害はそれぞれ、特徴的な融解曲線となるため、同じインデルを持つF1子孫を再グループ化し、繁殖することが可能である。このインデルを完全に特性化するため、本発明者らは、F1の固体からPCR産物を配列した。この変異体リードは、WT配列を取り出すことで、ヘテロ接合性解読から抽出可能である。
それぞれのRBPおよび3’非翻訳領域ターゲットに関し、WT種親と交配したF2ホモ接合変異体雄および雌のF3胚(n=30/グループ)を産出し、2〜3ヶ月目まで育てた。稚魚10匹の生殖腺を解剖し、生殖細胞固有遺伝子、vasaを用い、QPCR によりRNA/cDNAを選別した[9]。それぞれのサンプルに対し、Q-PCRを3回実施し、vasaの発現レベルは、ホストハウスキーピング遺伝子1組まで正常化した[57] (β-actinおよびef1α)。本発明者らは、不妊の魚においてvasaの発現はないと予想した。本発明者らは、5ヶ月時点で、不妊の雄は半透明の精巣を持ち、不妊の雌は紐のような卵巣を産出すると予想した。解剖した生殖腺のサブセット(n=10/グループ)をさらに、ブアン液内で固定し、薄片を作成するため、乾燥させ、パラフィンを浸透させた。生殖細胞が完全に欠損していることから、不妊であることは明確であった。
これらの検証に向け、半同胞のグループを3つ作成するため、F2ホモ接合変異体雌3匹(不妊グループ)およびWT雌3匹(繁殖能力のあるグループ)と交配したWT雄3匹を、孵化場で決められた手順に従い、別々に飼育するする。1ヶ月目までに、ティラピアの子孫(n=100/グループ)の計量、PITタグ付けを行い、27℃に保たれた、再循環式の養殖システムの3x300リットルの水槽内で一緒に育てる。全ての魚には、1日2回、市販の養殖用の餌が飽食量与えられる。それぞれの魚は、24週かけ、4週間ごとに個別に計量および測定される。これらの魚は実験の終わりに、殺処分され、性別判定を行い、体長、重量の平均、フィレットの収量、成長曲線は、独立したサンプルのt検定により、統計的に比較される。
ヌクレアーゼの生成および方法:DNA二本鎖切断(DSB)を特異的ゲノム部位で作成するため、本発明者らは、人工ヌクレアーゼを使用した。ほとんどの応用で、修復テンプレートがない場合、単一DSBが産出され、非相同末端再結合(NHEJ)修復経路の活性化に繋がる。NHEJは、ある割合において、ターゲットとなる部位で挿入または欠失を生成(インデル)し、不完全な修復プロセスとなり得る。インデルの誘導は、遺伝子のコード領域内にフレームシフトを起こす、または制御領域内を変化させることができ、遺伝子翻訳またはその時空的制御を個別に妨害する。対象となる遺伝子におけるヌル突然変異の生成頻度を高めるため、本発明者らは、nos 3’非翻訳領域およびmiR202をターゲットとしたものを除いた、2つの異なるエクソンを同時にターゲットとした。対象となる遺伝子と並行し、突然変異誘発選択マーカーの役割として、色素形成遺伝子も共同ターゲットとした。
遺伝子導入系において、ティラピアZpc5プロモーターであるTg(Zpc5:eGFP:tnos 3’非翻訳領域)は、卵母細胞特異的プロモーターであり、第一減数分裂に先立ち、卵形成の間に活性化する。そのため、ヘテロ接合またはホモ接合トランスジェニックの雌からの胚は全て、eGFP:tnos 3’非翻訳領域mRNAを受け継いでおり、これは3’非翻訳領域(ティラピアnanos3 3’非翻訳領域)におけるシス作用性のRNAエレメントの作用により、PCG内のみに限定され、発現する。胚(受精後4日)を、トリカインメタンスルホネート(MS-222, 200-300mg/l)に最低10分間浸すことで、過量摂取により安楽死させた。ストックは、重炭酸ナトリウムでpH 7まで緩衝し、4g/Lに調整する(重炭酸塩とMS-222を2:1の割合)。この胚をガラス表面のPBSへ浸し、卵黄を取り除いた。卵黄を取り除いた胚を、顕微鏡スライドおよびカバーガラスの間で押し潰し、画像用のカメラを搭載した蛍光顕微鏡で分析した。
単一遺伝子ヘテロ接合変異体の魚の相互交配により生成された胚は、目に見える全体的な異常について、実体顕微鏡を使い分析された(明るい照明および蛍光灯照明の両方)。子孫となる卵は、成体期まで育てられた(3〜6ヶ月間)。魚の成体から切り取られたヒレは、DNAを抽出するため、キレックスレジンを使用し処理され、融解分析による遺伝子型決定に使用された:実施例10−融解分析によるF2および次世代遺伝子型決定(下記参照)。
選択した遺伝子のコード配列または制御配列が、PGC発生にとって不可欠であるかどうかを検証するため、本発明者らは、ドナーDNAの有無に関わらずプログラム可能なヌクレアーゼを使用し、ティラピア変異体を生成した。Nanos3 (nos3)、Dead end-1 (dnd1)、TIAR、Tia1、KHSRP、DHX9、Elavl1、Elavl2、Igf2bp3、Rbm42、Rbms (Hermes) 、Rbm24、Hnrnph1、Hnrmpab、Tdrd6、Hook2、Ptbp1a、KIF5B、Cxcr4a遺伝子におけるヌル突然変異の生成頻度を高めるため、本発明者らは、それぞれの遺伝子の2つの異なるエクソンを同時にターゲットとした。機能欠損変異が生成される可能性を最大化するため、本発明者らは、コード領域の前半でターゲットとなる部位を優先的に選択した。対象となる遺伝子と並行し、突然変異誘発選択マーカーの役割として、色素形成遺伝子も共同ターゲットとした(図3)。さらに、dnd の3’非翻訳領域が、その接合機能に必要であるかを検証するため、本発明者らは、dnd1コード配列のβ-globin 3'非翻訳領域下流へ、ターゲットとなる組み込みを実施した。さらに本発明者らは、nos3 3’非翻訳領域における進化的保存モチーフをターゲットとし、本発明者らが仮定したdnd1 3’非翻訳領域は、卵母細胞および初期胚の対応するmRNAの時空的制御に関与している(図9)。これらのモチーフは、i) オルソログmRNAs の3'非翻訳領域上での同時存在、ii) miRNA結合配列を推定するための並置およびiii)二次構造分析(実施例17の説明参照)に基づき、同定および優先的に選択された。また本発明者らは、発達中の胚のPGCに限定されたmiRNA(miRNA202-5p) (Zhang, Liu et al. 2017)もターゲットとした。
F0変異体ティラピアは、ターゲットとなるDNA二重鎖切断の位置で、予想不可能な複数の配列結果を持ち、残りの野生型またはインフレームインデル配列が、どのくらい表現型を覆い隠すことができるかは未知であるため、表現型の特徴分析を追加で実施した。さらに、オフターゲットのヌクレアーゼ活性は、表現型に寄与しているようであった。従って、本発明者らは、必ず複数のオフターゲット変異が分離され、次世代の子から消失するよう、この対象となる変異を選択的に伝播した。最終的には、F2ホモ接合体ジェネレーションにおける動物の全ての細胞内で、同一の変異が発見されたとき、完全な表現型を測定することが可能である。それにより、それぞれの処理済みグループに関し、本発明者らは、フレームシフト変異、ターゲットとなる遺伝子への挿入または正確な編集のいずれかに対し、ヘテロ接合体F1魚を生成するため、選択した生殖細胞系の遺伝変異を持つファウンダー雄を、雌Tg(Zpc5:eGFP:nanos 3’非翻訳領域)と異系交配した。
その他全てのターゲットとなる遺伝子に関し、本発明者らは、所望するメンデルの法則に基づく頻度で、予想していた成体期を通して明らかな表現型のない遺伝子型を全て回収した。母性効果不妊表現型を全て測定するため、本発明者らは、ホモ接合変異体雌を、WT雄と交配し、胚子孫を分析した。本発明者らは、TIAR、KHSRP、TIA1、DHX9、Elavl1、Cxcr4のアレルに対し、ホモ接合体雌の子孫において、 PGCが著しく減少していることを認めた(図45)。変異体雌のPGCが激減した子孫を成体期まで育て、その生殖腺のサイズおよび変化を分析した。本発明者らは、胚における重度のPGC欠損と一致する、生殖細胞が激減した半透明の精巣だけでなく、紐のような構造の萎縮性卵巣も見い出した。これに対し、F2変異体雄の子孫では、正常なサイズの生殖腺に発達した。例えば、本発明者らは、TIAR1ホモ接合変異体雌は、生殖腺重量指数の平均が、対照(ホモ接合変異体雄の子孫)よりも10〜20倍少ない子孫を産出したことを測定した(図43)。nos3コード配列におけるヌル突然変異と比較し、nos3 3’非翻訳領域に存在するモチーフ1配列の欠失は、雌の不妊化には繋がらず、これはこのモチーフが、卵原幹細胞の維持に必要ではないことを示唆している。ただし重要なのは、これらの雌は、重度のPGCアブレーションを持つ胚を産出するということである(図41および44)。残りの遺伝子に対するこの母性効果表現型については、現在調査中である。単一遺伝子不活性化から生じた不完全なPGCアブレーション表現型は、これらの遺伝子は、かなりの遺伝的重複を持つ複合経路に関与していることを示唆している。
PGC発生の遺伝的構造をより理解し、これらのプロセスに関与する遺伝子の作用の機能的順序を決定するため、本発明者らは、二重変異体系統を確立し、単一遺伝子または二重遺伝子機能損失表現型の子孫におけるPGCの数を比較した。さらに、存在する変異が、nos3の翻訳後調節を支配しているかを決定するため、本発明者らは、卵母細胞特異的プロモーター(MSC遺伝子導入系)の制御のもと、baxを nos3 3’非翻訳領域へ融合したプロアポトティック遺伝子を発現したティラピアの遺伝子導入系での単一変異の効果を詳しく調べる。本発明者らは、MSC雌は、これらの細胞内のBAXの異所性母性発現から、PGCが不足している胚を産出するということを、すでに確立している(Lauth and BUCHANAN 2016)。
本発明の突然変異誘発スクリーニングにより、ティラピアにおけるこの遺伝子の不活性化が繁殖能力のある雌の発達を妨げる、新たな生殖質遺伝子が明らかとなった。本発明者らは、Hnrnph1およびRbmsの不活性化が、胚性致死に繋がるということを見い出した。本発明の結果はさらに、Kif5Baが不足している胚は、中等度から重度が入り混じった腹側化表現型(Campbell, Heim et al. 2015)を示すという前述の結果に合致している。
意外なことに、本発明者らは、機能欠損変異体が、成体期まで他に明らかな表現型のない、重度の欠損をPGC発生において産出する遺伝子を同定することに成功し、これは、これらが生存能力または繁殖能力には必要ではないことを示している。ここで、本発明者らは、生殖細胞が、母性遺伝により指定されるあらゆる動物種において、TIA1, TIAR, KHSRP, Rbm24, Rbm42, DHX9, Igf2pb3, Hnrnph1およびElavL1機能欠損変異により生じる欠損を初めて記述した(例、全ての魚、多くの昆虫種およびカエルの種)。これらの遺伝子に対し、変異体母に由来する胚は、平均で、PGC数が60%から最大88%減少した。一部だが全てではない母体変異体表現型では、この減少は、この量的形質の分散における増大と相関関係があった。分散の増大は、生殖細胞の数をコントロールする遺伝子制御ネットワークを安定させるための、緩衝剤の役割を示唆している。TIAL1が欠如しているネズミは、部分的な胚性致死および欠損のある生殖細胞変異を示し(Beck et al., 1998)、これには、脊椎動物発生の本質的側面の制御におけるTIAL1タンパク質が関係している。また本発明者らは、ティラピア内のHook2、Tdrd6、dnd1およびKIF5Bの不活性化により生じる最初の欠損についても記述する。
生殖細胞の維持に必要な重要なタンパク質の多面的な機能に関連する問題を解決するため、本発明者らは、接合作用に影響を与えることなく、選択的に母性遺伝子機能を不活性化する可能性を調査した。本発明者らは、生殖細胞系の形成および継続的な維持のため、胚および成体内でそれぞれ必要なティラピアnos3およびdnd1の3’非翻訳領域機能を特別に調査した。PGC形成におけるElavl2の関与の可能性(Mickoleit, Banisch et al. 2011)、および成体内の生殖細胞系維持におけるその必要条件(本発明の研究)を考慮し、本発明者らは、さらにElavl2 3’非翻訳領域も分析に含めた。
本発明者らは、PGC発生に関し、miR-202-5pの不活性化により生じる効果を初めて記述する。このmiR202は、進化的に保存され、成熟した転写物を2つ、miR-202-5p およびゼブラフィッシュ(Juanchich, Le Cam et al. 2013)、インドメダカ(Presslauer, Bizuayehu et al. 2017)、ニジマス(Juanchich, Le Cam et al. 2013)、ティラピア(Xiao, Zhong et al. 2014)、大西洋オヒョウ(Bizuayehu, Babiak et al. 2012)およびネッタイツメガエル(Armisen, Gilchrist et al. 2009)の後期卵黄形成期間中、卵巣内で優性なアームを示すmiR-202-5pを持つmiR-202-3pを持っている。メダカにおけるmiR-202 (combined loss of miR202-3pおよびmiR202-5pの複合欠失)の不活性化は、異常および生存能力のない、少ない数の卵を生む、卵子が不足している不妊の雌または低受精率の雌に繋がるということが、最近報告された。この生殖表現型は、卵胞形成に障害を及ぼす(Gay, Bugeon et al. 2018)。興味深いことに、本発明のF0およびF1 miR-202変異体雌は、生存能力のあるPGCが激減した子孫を産出した。
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生物: ナイルティラピア
長さ: 999bpおよび332aa
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生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
長さ: 1227bp (-7pb)および178aa
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生物: ナイルティラピア
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タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 154)および(SEQ ID NO: 156)
生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
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生物: ナイルティラピア
長さ: 793bp
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
長さ: 769bp
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
長さ: 465bp
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
Claims (40)
- 次のステップを含む、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法:
(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する
遺伝子型選択によりホモ接合型である雌原始を選択する、および
不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するためホモ接合体雌原始を繁殖する;
変異が、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を破壊する、および
PGC発生遺伝子の母性効果を阻害する変異が、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。 - この変異が次を含む、請求項1記載の方法:
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異;
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異;
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異;
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異;または
これらの組み合わせ。 - PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が次である、請求項2記載の方法:Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9。
- 生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、請求項2記載の方法。
- このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項4記載の方法。
- このアダプタータンパク質がhook2である、請求項4記載の方法。
- 生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子がノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項2記載の方法。
- ノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項7記載の方法。
- シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は破壊しない、請求項2記載の方法。
- PGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、ElavI2、またはpiwi様遺伝子である、請求項9記載の方法。
- この変異がPGC発生遺伝子の母性効果を低下させるため、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の翻訳後調節を阻害する、およびPGC発生遺伝子の翻訳後調節を阻害する変異がその遺伝子の体性機能は損なわない、繁殖不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- この変異が次を含む、請求項11記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類:
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異;
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異;
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異;
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異;またはこれらの組み合わせ。 - PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が、Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9である、請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- 生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、 請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項14記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- このアダプタータンパク質がhook2である、請求項14記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- 生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子が、ノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- このノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項17記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は阻害しない、請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- このPGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、ElavI2、またはpiwi様遺伝子である、請求項19記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
- 不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するため、次のステップを含む、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する方法:
不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を、野生型雄の魚、甲殻類、または軟体類、ヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖する、
この変異が始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害する、および
PGC発生遺伝子の母性効果を阻害する変異が、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。 - この変異が次を含む、請求項21記載の方法:
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異;
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異;
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異;
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異;または
これらの組み合わせ。 - PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が次である、請求項22記載の方法:Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9。
- 生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、請求項22記載の方法。
- このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項24記載の方法。
- このアダプタータンパク質がhook2である、請求項24記載の方法。
- 生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子が、ノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項22記載の方法。
- このノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項27記載の方法。
- シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は阻害しない、請求項22記載の方法。
- このPGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、またはpiwi様遺伝子である、請求項29記載の方法。
- A次のステップを含む、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出する繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法:
(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する、および
遺伝子型選択によりホモ接合型である雌原始を選択する、
変異が、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害する、および
PGC発生遺伝子の母性効果を阻害する変異が、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。 - この変異が次を含む、請求項31記載の方法:
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異;
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異;
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異;
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異;または
これらの組み合わせ。 - PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が次である、請求項32記載の方法:Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9。
- 生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、請求項32記載の方法。
- このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項34記載の方法。
- このアダプタータンパク質がhook2である、請求項34記載の方法。
- 生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子が、ノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項32記載の方法。
- このノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項37記載の方法。
- シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は阻害しない、請求項32記載の方法。
- このPGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、Elavl2またはpiwi様遺伝子である、請求項39記載の方法。
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