JP2021525533A - 高ペイロードで無孔性の酵素含有被覆顆粒 - Google Patents

Abstract

蒸気ペレット化中の活性消失に対する改善された耐性を有する、安定性であり、高ペイロードであり、無孔性の酵素含有被覆顆粒に関する組成物及び方法が記載される。【選択図】図１

Description

本組成物及び方法は、蒸気ペレット化中の活性消失に対する改善された耐性を有する、安定性であり、高ペイロードであり、無孔性の酵素含有被覆顆粒に関する。

動物用飼料での酵素の使用は、現代の畜産業の一部である。酵素は、動物用飼料中の成分の消化率を改善し、飼料効率を改善する。飼料ペレットは、乾燥配合飼料と比較して改善された飼料品質、病原菌の減少、製造中の粉塵レベルの低下、便宜的な取扱い及びより一様な成分投与量等、業界によって好まれる特性を有する。

業界の好ましいペレット化プロセスは、蒸気ペレット化として公知のプロセスにおいて蒸気噴射を利用する。蒸気ペレット化は、ペレット化ステップ前に水分を添加して、飼料組成物の温度を上昇させるコンディショニングを含み、ここで、蒸気加熱飼料成分又はコンディショニングされたマッシュは、ペレットを形成するためにダイを通して押し進められる。ペレット化プロセスの温度は、一般に約７０℃〜１００℃以上である。酵素の残留活性は、コンディショニング及びその後の貯蔵中に大きく減少されることが多い。不活性化は、プロセス処理後に酵素が再活性化する場合に少なくとも部分的に可逆性であり得、触媒活性がプロセス処理後に再開しない場合に不可逆性である。

蒸気ペレット化後の酵素の活性再生率は、酵素の固有の熱安定性及び例えば被覆顆粒としての酵素の配合の両方の関数である。一部の酵素は、本質的に極めて熱安定性であるため、高い再生酵素活性率を配合に帰する必要はない。しかしながら、任意の所定の酵素について、例えば温度及びコンディショニングの時間等の蒸気ペレット化条件の特定のセットにおいて、配合酵素と未配合酵素との再生した活性を比較することにより、配合の有効性を判断することができる。

原料、加工装置、輸送及び他の取扱い作業のコストを最小限に抑えるために、安定剤及び結合剤、不活性コア及びコーティング材料等の不活性配合用賦形剤に対する重量ベースで活性酵素の可能な最大のペイロードにおいて酵素顆粒を配合することが望ましい。これには、配合中の酵素固体に対してこれらの成分のコストを減少させるという利点がある。しかしながら、高剪断造粒法及び流動層スプレーコーティング等の現行の技術は、まさにそれらの性質により、極めて高ペイロードで配合する能力に重大な制約を課す。蒸気ペレット化のために市販で最も利用可能な酵素顆粒は、必要な保護コーティングに５０重量％以上の配合スペースを割り当てるため、これは、発酵固体及び任意の不活性賦形剤又はコア材料を含む、酵素含有コアのために利用可能な最大で約５０重量％の最終顆粒を残す。高剪断造粒法の場合、高剪断造粒法により、機械的に凝集性であり、良好に形成された酵素マトリックス粒子を製造することは、典型的には、ポリマー結合剤、塩、強化繊維及び潤滑剤等の高レベルの賦形剤の添加を必要とする。典型的には、これらの賦形剤は、少なくとも約８０重量％の酵素マトリックスコア、即ち約４０％の最終被覆酵素顆粒を消費する。従って、典型的な高剪断顆粒中の酵素含有発酵固体は、最大で約１０重量％の最終被覆顆粒を消費する。同様に、流動層スプレーコーティングによって良好に形成された酵素顆粒の製造は、少なくとも約３０重量％の最終顆粒を表す不活性コア粒子から出発することを必要とし、発酵固体に添加される賦形剤のために追加の５重量％程度が必要である。５０重量％の保護コーティングのための余地を残した後、この場合にも同様に酵素含有発酵固体のために利用可能な約１５重量％の配合スペースのみを残す。従って、従来型の酵素造粒技術は、最大で約１０〜１５重量％の発酵固体のペイロードに限定される。実際には、蒸気ペレット化のための殆どの市販の酵素顆粒は、１０％以下の発酵固体のみを含有する。発酵によって製造される飼料用酵素は、典型的には、コストを最小限に抑えるために精製されないため、全発酵固体の最大で約５０重量％を表す。そこで、高剪断造粒法及び流動層スプレーコーティング等の蒸気ペレット化のための飼料用酵素顆粒を造粒するために使用される従来型プロセスは、約５〜８重量％の酵素固体のペイロード上限を有する。従って、蒸気ペレット化用途のための顆粒のペイロードが約１０重量％超の酵素固体又は更に１５重量％超の酵素固体である酵素顆粒を造粒する配合及び方法の必要性がある。

動物用飼料中に包含するための有効成分含有顆粒を造粒する原理は、周知である。この技術空間における現代的革新は、必然的にコンディショニング中の有効成分のペレット化安定性及び／又は再生に対する改善に重点を置いている。そのような改善は、競合的な世界市場において商業的に重要な利点を提供する。本組成物及び方法は、これまでは記載されておらず且つ認められていない組成物及びプロセス条件がペレット化安定性の有意な増加を生じさせるという認識に基づく。

本組成物及び方法は、特定の明確に規定されたコーティングを有する結果として、蒸気ペレット化中の活性消失に対する改善された耐性を有する、安定性であり、高ペイロードであり、低多孔性の酵素顆粒及びその使用方法に関する。以下の独立して番号を付したパラグラフにおいて、組成物及び方法の態様及び実施形態が記載される。
１．一態様では、酵素含有被覆顆粒であって、（ａ）少なくとも１０重量％の酵素固体のペイロード；（ｂ）酵素マトリックスコアを取り囲む連続的保護コーティングであって、（ｉ）径において０．２〜８．０ミクロンの範囲内のマクロ孔について、約０．０３ｃｃ／ｇ未満の気孔率；及び（ｉｉ）６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を有する被覆顆粒を生じさせる、連続的保護コーティングを含む酵素含有被覆顆粒が提供される。
２．一部の実施形態では、パラグラフ１の被覆顆粒は、少なくとも０．９の球形度を有する酵素マトリックスコアを有する。
３．一部の実施形態では、パラグラフ１又は２の被覆顆粒は、少なくとも０．５の真円度を有する酵素マトリックスコアを有する。
４．一部の実施形態では、パラグラフ１〜３の何れかの被覆顆粒は、少なくとも３０重量％のコーティング質量分率を有する。
５．一部の実施形態では、パラグラフ１〜４の何れかの被覆顆粒は、７０重量％未満のコーティング質量分率を有する。
６．パラグラフ１〜５の何れかの被覆顆粒の一部の実施形態では、コアの水分活性は、０．２未満である。
７．パラグラフ１〜６の何れかの被覆顆粒の一部の実施形態では、コーティングの臨界相対湿度は、６０％超である。８．
８．パラグラフ１〜７の何れかの被覆顆粒の一部の実施形態では、コーティングは、非吸湿性材料を含み、且つ６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を有する。
９．一部の実施形態では、パラグラフ１〜８の何れかの被覆顆粒は、６０重量％以下の塩を含むコーティングを有する。
１０．一部の実施形態では、パラグラフ１〜９の何れかの被覆顆粒は、３０重量％以上の塩を含むコーティングを有する。
１１．パラグラフ１〜１０の何れかの被覆顆粒の一部の実施形態では、コアは、２０重量％未満の賦形剤を含む。
１２．一部の実施形態では、パラグラフ１〜１１の何れかの被覆顆粒は、１００μｍ超の全径を有する。
１３．一部の実施形態では、パラグラフ１〜１２の何れかの被覆顆粒は、４００μｍ未満の全径を有する。
１４．パラグラフ１〜１３の何れかの被覆顆粒の一部の実施形態では、酵素マトリックスコアは、スプレー造粒法によって製造される。
１５．パラグラフ１〜１４の何れかの被覆顆粒の一部の実施形態では、酵素固体は、フィターゼを含む。
１６．別の態様では、組成物中の酵素の安定性又は蒸気ペレット化プロセスにおける酵素の再生率を増加させるための方法であって、（ａ）少なくとも１０重量％の酵素固体のペイロード；（ｂ）酵素マトリックスコアを取り囲む連続的保護コーティングであって、（ｉ）径において０．２〜８．０ミクロンの範囲内のマクロ孔について、約０．０３ｃｃ／ｇ未満の気孔率；及び（ｉｉ）６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を有する被覆顆粒を生じさせる、連続的保護コーティングを含む被覆顆粒において酵素を提供するステップを含む方法が提供される。
１７．パラグラフ１６の方法の一部の実施形態では、酵素マトリックスコアは、少なくとも０．９の球形度を有する。
１８．パラグラフ１６又は１７の方法の一部の実施形態では、酵素マトリックスコアは、少なくとも０．５の真円度を有する。
１９．パラグラフ１６〜１８の何れかの方法の一部の実施形態では、顆粒は、少なくとも３０重量％のコーティング質量分率を有する。
２０．パラグラフ１６〜１９の何れかの方法の一部の実施形態では、顆粒は、７０重量％未満のコーティング質量分率を有する。
２１．パラグラフ１６〜２０の何れかの方法の一部の実施形態では、酵素マトリックスコアの水分活性は、０．２未満である。
２２．パラグラフ１６〜２１の何れかの方法の一部の実施形態では、コーティングの臨界相対湿度は、６０％超である。
２３．パラグラフ１６〜２２の何れかの方法の一部の実施形態では、コーティングは、非吸湿性材料を含み、且つ６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を有する。
２４．パラグラフ１６〜２３の何れかの方法の一部の実施形態では、コーティングは、７０重量％以下の塩を含む。
２５．パラグラフ１６〜２４の何れかの方法の一部の実施形態では、コーティングは、３０重量％以上の塩を含む。
２６．パラグラフ１６〜２５の何れかの方法の一部の実施形態では、コアは、３０重量％以下の賦形剤を含む。
２７．パラグラフ１６〜２６の何れかの方法の一部の実施形態では、顆粒は、１００μｍ超の全径を有する。
２８．パラグラフ１６〜２７の何れかの方法の一部の実施形態では、顆粒は、４００μｍ未満の全径を有する。
２９．パラグラフ１６〜２８の何れかの方法の一部の実施形態では、酵素マトリックスコアは、スプレー造粒法によって製造される。
３０．パラグラフ１６〜２９の何れかの方法の一部の実施形態では、顆粒は、スプレー造粒法によって製造される。
３１．パラグラフ１６〜３０の何れかの方法の一部の実施形態では、顆粒は、ワックス又は水和塩を含む水溶性又は水分散性コーティングを有する。
３２．パラグラフ１６〜３１の何れかの方法の一部の実施形態では、酵素固体は、フィターゼを含む。
３３．別の態様では、パラグラフ１〜１５の何れかの顆粒を含むペレット化動物用飼料組成物が提供される。

本組成物及び方法のこれら及び他の態様及び実施形態は、本明細書の説明及び図面から明らかになるであろう。

実施例に記載した様々な高ペイロード顆粒についての吸水率対相対湿度を示すグラフである。

Ｉ．定義及び略語
本系統及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、当技術分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するべきである。

本明細書で使用する用語「顆粒」は、物質の小さい小型粒子を指す。粒子は、１つ以上の任意のコーティング層と共に１つのコアを含む。

本明細書で使用する用語「コア」は、用語「シード」と互換性であり、その上に追加のコーティング又は層を塗布できる顆粒の単一の内側部を含む。コアは、塩若しくは氷砂糖等の単一材料を含み得るか、又は材料の混合物から構成され得る。コアは、不活性であり得るか、又は純粋酵素若しくは混合酵素の何れかとしての１種以上の酵素を含み得るか、又は不活性材料のマトリックス内に包埋され得る。

本明細書で使用する用語「酵素マトリックスコア」は、酵素を含む顆粒コアを指す。酵素マトリックスコアは、発酵固体並びに結合剤及び充填剤等の賦形剤を更に含み得る。活性酵素は、酵素マトリックスコア全体に分散又は溶解され、酵素を含まない単一の不活性コア上に層形成されない。

本明細書で使用する用語「多層顆粒」は、１つのコア及び少なくとも１つのコーティング層を含む組成物を指す。コアは、不活性コア又は酵素マトリックスコアであり得る。

本明細書で使用する用語「コーティング層」及び「層」は、互換的である。コーティング層は、一般に、コア表面が被覆されていない領域が殆ど又は全くないように実質的な連続相を形成するためにコアを封じ込める。顆粒及び／又は多層顆粒内で使用される材料（例えば、本明細書で詳述する薬剤、成分及び酵素）は、食品及び／又は動物用飼料において使用するために好適である。材料は、食品グレード又は飼料グレードであり得る。

本明細書で使用する用語「外側コーティング層」は、多層顆粒のコアから最も遠いコーティング層（即ち塗布される最終コーティング層）を指す。

本明細書で使用する用語「酵素コーティング層」又は「酵素層」は、少なくとも１種の酵素を含む酵素層を指す。

本明細書で使用する「気孔率」は、材料中の、材料の質量単位当たりの空隙率又は空所に含有される容積の尺度である。補足として、一部の試験は、材料の表面から接近可能である「接近可能な空隙」を効果的に測定するが、任意の内部空隙を測定しない。

本明細書で使用する用語「無孔性」又は「低多孔性」は、水銀圧入気孔率測定法（ＭＩＰ）によって測定して約０．０３ｃｃ／ｇ未満のマクロ孔気孔率を有するコーティング、被覆顆粒又は他の材料に関する。

本明細書で使用するとき、気孔率に関連して、「マクロ孔」は、水銀圧入気孔率測定法（ＭＩＰ）によって測定して０．２〜８ミクロンの径を有する孔を指す。

本明細書で使用する「マクロ孔気孔率」は、マクロ孔、即ち水銀圧入気孔率測定法（ＭＩＰ）によって測定して０．２〜８．０ミクロンの径を有する固体中の孔部分のみの気孔率を指す。

本明細書で使用する、顆粒コーティングに関する「連続的」は、コーティング内の破損、クラック又は穴とは対照的に、コーティングの連続部分の特性がコーティングの特性を制御するように、破損、クラック又は穴によって中断されていないことを意味する。コーティングの連続性は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）下で顆粒の代表的試料を観察することによって評価することができる。

本明細書で使用する「真円度」は、Ｋｒｕｍｂｅｉｎ（Ｋｒｕｍｂｅｉｎ，Ｗ．Ｃ．（１９４１）Ｊ Ｓｅｄｉｍｅｎｔ．Ｐｅｔｒｏｌ．１１：６４）によって確立された典型的な標準画像セットに従い、物体の外部不規則性が数学的に完全な円の外部不規則性にどの程度密接に近づくかの尺度であるＫｒｕｍｂｅｉｎ真円度を指す。真円度は、０〜１のスケールで測定される。多数の尖った角又は突出部を有する高角度の物体は、０に近い真円度値を有するであろう一方、尖った角を殆ど有さない平滑な物体は、１に近い真円度値を有するであろう。Ｋｒｕｍｂｅｉｎ標準画像に従った真円度値は、Ｒｅｔｓｃｈ Ｃａｍｓｉｚｅｒ ＸＴ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ Ｇ３又はＭｉｃｒｏｔｒａｃ ＰａｒｔＡｎ ３−Ｄ等の画像分析ソフトウエアを用いる光学形態分析装置を使用して、粒子の試料上で測定することができる。

本明細書で使用する「球形度」は、正式には、それを完全に含有する最小の球の容積に対する物体の容積比の三乗根であると定義される、物体の形状が機械的に完全な球形の形状にどの程度密接に近づくかの尺度である。球形度は、０〜１のスケールで測定される。極めて細長い物体は、０に近い球形度値を有するであろう一方、小型又は球形の物体は、１に近い球形度を有するであろう。球形度値は、Ｒｅｔｓｃｈ Ｃａｍｓｉｚｅｒ ＸＴ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ Ｇ３又はＭｉｃｒｏｔｒａｃ ＰａｒｔＡｎ ３−Ｄ等の画像分析ソフトウエアを用いる光学形態分析装置を使用して、粒子の試料上で測定することができる。

本明細書で使用する「重量％」、「重量分率」又は単純に「分率」は、重量％又は分別重量／重量ベースでの質量の相対量、例えば全顆粒の質量と比較したコーティングの質量の相対量を指す。

本明細書で使用する「水分活性（ａ_ｗ）」は、所定の温度での標準状態の水蒸気分圧で割った物質中の水蒸気分圧であると定義される。水分活性は、周囲大気と平衡している固体又は液体の測定特性である。

本明細書で使用する「相対湿度（ＲＨ）」は、所定の温度での平衡水蒸気圧に対する水蒸気分圧の比率である。

本明細書で使用する塩の「臨界相対湿度（ＣＲＨ）」は、材料が大気から水分を吸収し始め、且つそれより下では材料が大気水分を吸収しないであろう（所定の温度での）周囲大気の相対湿度であると定義される。

本明細書で使用する「吸水率」は、所定の相対湿度で周囲大気への平衡後に固体によって吸収される水の重量％である。

本明細書で使用する用語「発酵固体」は、酵素等の対象の１種以上の有用な生物活性剤を再生できるように処理される微生物発酵ブロスに由来する乾燥又は部分乾燥固体を指す。発酵固体は、発酵槽から直接的に得られた、濾過又は遠心分離によって除去された細胞を含む浄化ブロス、例えば限外濾過若しくは蒸発によって濃縮された又は例えばクロマトグラフィー、沈降法若しくは結晶化によって様々な程度まで精製された全細胞ブロスから引き出すことができる。発酵固体は、それにより不活性タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖類、糖、塩並びに発酵中及び下流加工処理中に形成された他の残留化合物など、酵素活性剤以外の不純物を含む可能性がある。発酵固体は、乾燥又は造粒プロセス後に一部の残留している遊離水又は結合水も含む可能性がある。発酵固体は、別個の（以下で）定義される賦形剤を含まない。

本明細書で使用する「酵素固体」は、１種以上の活性酵素を含む乾燥又は部分乾燥固体を指す。発酵固体は、酵素固体を全体として又は部分的に含み得、即ち発酵固体が酵素固体に加えて有意な量の不純物を含み得ることが理解される。酵素固体は、組成物中に対象の全活性酵素を含むが、存在する可能性があるが、何れの場合にも酵素マトリックスコア内に存在する全酵素の５％未満のみを含む僅かな又は不注意による酵素活性は、無視する。

本明細書で使用する「ペイロード」は、顆粒内の対象の材料の質量分率を指す。本発明の範囲内の対象の材料は、特定の状況に依存して、凝集体中の何れかの発酵固体又は酵素固体のみである。ペイロードは、顆粒の全質量に対する発酵固体又は酵素固体の何れかの固体の重量％として表示される。このように、「酵素ペイロード」又は「発酵固体ペイロード」と言うこともできる。

本明細書で使用する用語「賦形剤」は、結果として生じる乾燥顆粒の安定性、取扱い又は物理的特性を改善するために、加工処理中又は加工処理後、しかし乾燥又は造粒前に発酵固体に添加される固体を指す。この使用では、賦形剤は、顆粒の酵素ペイロード又は発酵固体ペイロード内で考慮されない。賦形剤としては、安定剤、結合剤、粘度調整剤、界面活性剤、充填剤、潤滑剤、乾燥剤、湿潤剤、顔料等が挙げられるが、それらに限定されない。

本明細書で使用する「低吸湿性」又は「非吸湿性」は、動的蒸気吸着法又は均等な方法によって測定された、６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水を吸水する材料を指す。

本明細書で使用する「ワックス」は、水に不溶性であるが、非極性有機溶媒に可溶性である任意の炭化水素、脂肪酸、脂肪アルコール又はその塩若しくはエステルであると定義される。ワックスの包括的定義は、ヨーロッパではドイツ脂肪科学協会（ＤＧＦ）によって策定されている。この定義によると、ワックスは、（ｉ）４０℃を超える滴点又は融点を有する。（ｉｉ）分解を伴わずに融解する；（ｉｉｉ）融点の１０℃上で１０，０００ｍＰａを超えない溶融粘度を有する；（ｉｖ）粘度に関して強度にマイナスの温度依存性を示し、融点より上で曳糸性に向かう傾向を示さない；（ｖ）僅かな圧力下で研磨可能であり、強度に温度依存性の粘調性及び可溶性を有する；（ｖｉ）混練性若しくは難脆性、粗結晶〜微結晶、透明〜不透明であるが、ガラス状ではないか、又は２０℃で高粘性若しくは液体である；（ｖｉｉ）５０℃〜９０℃で溶融する（２００℃という高温で溶融する、本組成物及び方法において使用される特殊ワックス）及びペースト又はゲルを形成し、且つ熱及び電気の不良導体である（即ち、それらは、熱及び電気の絶縁体である）。

本明細書で使用する用語「ペレット」及び「ペレット化」は、固体の円形、球状及び円筒状の錠剤及びペレット並びにそのような固体形状、特に飼料用ペレット及び固体の押出し動物用飼料を形成するためのプロセスを指す。公知の動物用飼料ペレット化製造プロセスには、一般に、室温で約１〜約５分間にわたって飼料用成分と混合するステップ、生じた混合物をサージビンに移すステップ、この混合物を蒸気コンディショナーに移すステップ、任意選択的に蒸気コンディショニングされた混合物をエキスパンダーに移すステップ、この混合物をペレットミル又は抽出機に移すステップ及び最後にペレットをペレットクーラーに移すステップが含まれる。Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｄ．１９９４．Ｃｈａｐｔｅｒ １０，Ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ Ｃｏｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ．Ｉｎ Ｆｅｅｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＶ．（ＭｃＥｌｌｈｉｎｅｙ，ｅｄ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ，ＵＳＡ，ｐｐ．１１０−１３９。

本明細書で使用する用語「熱処理動物用飼料ペレット」は、典型的には、少なくとも３０秒間にわたって少なくとも９０℃の温度において、粉末状飼料顆粒、例えばコーン又は大豆並びにビタミン、脂質及び酵素等の熱処理（蒸気コンディショニング等）を受けている補助添加剤の混合物を指す。この混合物は、次に、動物用飼料ペレットを形成するために押し出すことができる。

本明細書で使用する用語「安定性」は、飼料を補完（又は補助）する酵素の酵素活性又は機能的特性が有益に維持又は改善される様々な作用の何れかを指す。飼料用酵素は、改善された「再生した活性」、「熱安定性」及び／又は「不活性可逆性」の何れかを示すことによって安定性を示す。「安定性」は、飼料又は飼料ペレットとの組み合わせ前又は後の何れかに酵素組成物中で維持される活性を指すことができる。飼料用酵素の非排他的例は、アミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ及びキシラーゼである。

本明細書で使用する用語「活性再生率」又は「活性再生」は、（ｉ）下記のストレス要因：加熱、高圧、高ｐＨ、低ｐＨ、貯蔵、乾燥、界面活性剤への曝露、溶媒への曝露及び機械的ストレス）の１つ以上を含む処理後の飼料用酵素の活性と、（ｉｉ）処理前の酵素の活性との比率を指す。活性再生率は、パーセンテージとして表すことができる。活活性再生率（％）は、下記のように計算する。

本明細書で使用する「ＦＴＵ」、又は「フィターゼ回転単位」、又は「フィターゼ活性の単位」、又は「単位」は、１分当たりで１μモルの無機リン酸塩を遊離することができる酵素の量である。フィターゼ活性は、“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｆｅｅｄ ｂｙ ａ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ：ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ”Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００１）ＪＡＯＡＣ Ｉｎｔ．８４：６２９−３３に記載されているように、公認分析科学者協会公式法２０００．１２に従ってアッセイされる。手短には、粉末状試料は、２２０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物、６８．４ｍＭの塩化カルシウム脱水剤、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ５．５中で抽出される。次に、上清がアッセイされる。本アッセイは、３７℃で６０分間にわたってｐＨ５．５でイネフィターゼ由来の無機リン酸塩の遊離を測定する。本アッセイは、酸性モリブデン酸／バナジウム酸試薬を用いて停止され、リン酸は、バナドモリブドリン酸の黄色複合体の強度によって定量される。

本明細書で使用する用語「約」は、参照値の±１５％を指す。

容易に参照できるように、本組成物及び方法の要素は、１つ以上の見出しの下に配列することができる。見出し各々の下の組成物及び方法は、更に他の見出しの下の組成物及び方法にも該当することに留意されたい。

本明細書では、単数の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り複数の指示対象を含む。本明細書で言及した全ての参考文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。以下の略語／頭字語は、他に特に規定しない限り、以下の意味を有する。
℃ 摂氏温度
ｃｃ 立方センチメートル
ＣＦＭ 立方フィート／分
Ｄ_５０ メジアン粒径（容積ベース）
ＦＴＵ／ｇ フィターゼ単位／ｇ
ｇ又はｇｍ グラム
ｇ／Ｌ １リットル当たりのグラム数
ｇ／モル １モル当たりのグラム数
モル／モル モル対モル比
ｈｒ又はｈ 時間
ｋｇ キログラム
Ｍ モル
ｍｇ ミリグラム
ｍＬ又はｍｌ ミリリットル
ｍｉｎ 分
ｍＭ ミリモル
μｍ マイクロメートル（ミクロン）
μｍｏｌ マイクロモル
ＵＦＣ 限外濾過濃縮物
ＳＥＭ 走査型電子顕微鏡法／電子顕微鏡
％ｗｔ／ｗｔ 重量％

ＩＩ．無孔性酵素顆粒
本組成物及び方法は、実質的にそれらの形状及びコーティング特性による、蒸気ペレット化中の活性消失に対する改善された耐性を有する、安定性であり、高ペイロードであり、無孔性の酵素顆粒に関する。高ペイロード顆粒は、顆粒酵素のコストを減少させる手段として明らかに望ましい。高ペイロード酵素顆粒に関する以前の開示があるが、顆粒が固体製品中にブレンドされた場合の良好な分布を保証するために必要とされる小さい粒径を有することと共に、蒸気ペレット化プロセスにおける高度の安定性を証明した顆粒は全くない。高ペイロード顆粒は、厚膜コーティングを有して製造されてきたが、本発明者らは、厚膜コーティングが蒸気処理に対する適正な保護を保証しないことを見出した。コーティング組成物単独でも成功を保証することができない。

本組成物及び方法は、３つの臨界的特徴、詳細には、
（ａ）少なくとも１０％の酵素固体のペイロード；
（ｂ）約０．０３ｃｃ／ｇ未満のマクロ孔気孔率を有する連続的保護コーティング；及び
（ｃ）６０％のＲＨにおいて０．５％以下の吸水率
を有する顆粒に向けられる。

気孔率は、粒子の比孔容積に関して、本明細書で記載するように、硬度計を使用して水銀圧入気孔率測定法（ＭＩＰ）によって測定され得る。驚くべきことに、本発明の目的を達成することに孔の全孔径が関連するわけではない。０．２μｍ未満又は８．０μｍ超の径を有する孔の比容積は、耐蒸気性と相関しない。０．２〜８．０μｍの規定径範囲内の孔は、本明細書では「マクロ孔」と呼び、被覆酵素顆粒内のこれらのマクロ孔の比容積は、優れたペレット化安定性を提供する必須の特徴である。

０．００３〜４００μｍの範囲内の領域にある気孔率を判定するために、試料上で水銀圧入気孔率測定法を実施した。気体放出試料をＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ＡｕｔｏＰｏｒｅ ＩＩＩの較正済み針入度計に装填した。針入度計を密封し、機器内に据え付け、真空下に置いた。水銀を０〜４１３ＭＰａ（０〜６０，０００ｐｓｉａ）の漸増する圧力で針入度計に圧入させ、水銀圧入を記録し（６４データポイント）、孔径／容積分布を生成するために１３０°の接触角値及び４７８ダイン／ｃｍの表面張力でＷａｓｈｂｕｒｎ方程式によって分析した。試料安定性を評価するために、一連の水銀圧入／排出実験を、再現性／ヒステリシスを評価するための機器上で実施した。

「低多孔性」又は「無孔性」を有すると見なされるには、「被覆顆粒」は、約０．０３ｇ／ｃｃ未満のマクロ孔気孔率を有していなければならない。低多孔性は、例えば、２つの特徴：（ａ）少なくとも０．９の球形度又は代わりに若しくは追加して０．５の真円度を有する平滑な酵素マトリックスコア；及び（ｂ）少なくとも３０重量％のコーティング質量分率の組み合わせによって達成することができる。両方の特徴が必要とされると思われ；これらの２つの特徴の１つのみを有していても、顆粒を無孔性とするために十分でない。これらの個別特徴の各々は、先行技術において開示されてきたが、コーティング気孔率への両方の特徴の組み合わせの重要性及び蒸気安定性に及ぼすその作用は、何れにも記載されていない。更に、球状の円形コアの上方に連続コーティングを塗布することにより、約７０重量％未満のコーティング質量分率を有する無孔性顆粒を入手することができる。従って、高正味ペイロードを可能にし、被覆顆粒中の酵素の適正な保護を保証するために必要とされるコスト及び時間を限定する中等度の肉厚のコーティングのみが必要とされる。

幾つかの特徴は、本組成物及び方法を、以前に記載された方法及び方法から区別する。例えば、ＡＸＴＲＡＰＨＹ（登録商標）２００００ ＴＰＴ２（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ（登録商標）ＨｉＰｈｏｓ ＧＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ／ＤＳＭ）及び他の顆粒は、同様に許容可能な蒸気残存率を示す低多孔性顆粒である。しかしながら、これらの顆粒は、大量の結合剤及びコーティング又は蒸気残存率を付与するために、マトリックス内の小さい成分としての酵素タンパク質の包埋に依存している。例えば、ＲＯＮＯＺＹＭＥ顆粒のタンパク質ペイロードは、およそ１〜２重量％であり、フィターゼの量は、大まかには０．５〜１重量％である。米国特許出願公開第２００３０１２４２２４号明細書（ＤＳＭ）は、高酵素ペイロードを有する粒子について記載しているが、これらの粒子を熱安定性にする方法について示唆も証明も提供していない。例えば、この特許公開において例示された非被覆フィターゼ酵素粒子は、保護されておらず、蒸気ペレット化のために適切ではない。それに反して、この顆粒は、小さい粒径及び高ペイロードを有し、蒸気ペレット化中の適正な保護を付与するための相当に薄いコーティングに依存しなければならない。この目的に合致するには、低多孔性が極めて重要であることが見出されている。

ＩＩＩ．無孔性顆粒のためのコア
本組成物及び方法の特徴は、高ペイロードの酵素マトリックスコアである。本顆粒は、その周りで酵素が層形成されなければならないが、むしろその中で酵素及び他の発酵固体（酵素固体を含む）が顆粒の中心部分を占める一様な酵素マトリックスコアを含む不活性コアを有していない。一部の実施形態では、発酵固体は、コアの大部分を含むが、酵素を保護するために便宜的に添加される賦形剤は、例えば、コアの最大で１５％、２０％又は２５％を含む、コアの小さい成分に過ぎない。この手段並びに形状及び多孔性等のコア及びコーティングの他の実施可能な特徴により、顆粒ペイロードは、さもなければ配合物中の貴重な「財産」を消費し、従って活性酵素及び他の発酵固体の潜在的ペイロードを減少させるであろう非活性且つ不活性の材料の必要性を排除することによって最大化される。

更に、不活性コア又はシードから始めることを必要とせずに、連続的無孔性コーティングのために適切である、必要とされる球状のそのような賦形剤低含有且つ高ペイロードの酵素マトリックスコアを製造することがそれにより可能になることは、本発明の驚くべき態様である。スプレーコーティング等の先行技術プロセスでは、不活性コア又はシード粒子の粒径、形状、平滑さ、密度及び流動化特性は、酵素層及び他のコーティング層のその後の連続下塗りの溶着を保証するための「テンプレート」又は出発点として機能する際に極めて重要な役割を果たす。同様に、極めて小さいパーセンテージの賦形剤のみを含む、大部分が酵素及び発酵固体であるマトリックス粒子から始めることにより、マトリックス粒子の形状及びコーティングの気孔率に注意を向けることにより、湿性環境又は蒸気ペレット化プロセス等の不都合な貯蔵又は取扱い条件下で酵素を保護する酵素顆粒を構築することが可能であることは、驚くべき特徴である。先行技術のマトリックス顆粒は、コアの形状に注意を払わずに又はそれらのコーティングの気孔率に注意を払わずに、肉厚コーティングの塗布によってのみ、主としてコアに高レベルの保護賦形剤を使用することによって保護を提供してきた。

酵素マトリックスコアは、純粋又は他の発酵固体との組み合わせとの何れかで酵素及び賦形剤を含む。賦形剤は、加工処理中又は後、しかし乾燥又は造粒前に、結果として生じる乾燥顆粒の安定性、取扱い又は物理的特性を改善するために発酵固体に添加される固体であり、安定剤、結合剤、粘度調整剤、界面活性剤、充填剤、潤滑剤、乾燥剤、湿潤剤、顔料等を含むことができる。好ましい賦形剤は、非吸湿性形の結合剤ポリマー、粘土及び鉱物である。好ましい賦形剤としては、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン等のポリマー、不溶性粘土、カオリン、タルク及び炭酸カルシウム等の鉱物、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛及び硫酸アンモニウム等の無水又は低水和塩が挙げられるが、それらに限定されない。

コアの粒径は、最終顆粒を含有する飼料用製品中の対象のタンパク質の分布の一様性にとって重要である最終顆粒の粒径にとって重要である。顆粒が小さいほど、大きい粒子よりも一様な分布が保証される。好ましい粒子は、約１００μｍを下限として、６００μｍ未満、５５０μｍ未満、５００μｍ未満、４５０μｍ未満、４００μｍ未満、３５０μｍ未満、３００μｍ又は更に２５０μｍ未満の平均径を有する。この下限により、十分に球状ではなく、本発明の目的を達成するために被覆できない微粒子を含む微粒子及びスプレー乾燥粉末が除外される。

コアの形状は、低多孔性コーティングで被覆された顆粒さえ、最終顆粒の特性に有意な影響を及ぼすことが発見されてきた。好ましいコアは、少なくとも０．９、例えば少なくとも０．９０、少なくとも０．９１、少なくとも０．９２、少なくとも０．９３、少なくとも０．９４、少なくとも０．９５、少なくとも０．９６、少なくとも０．９７又は更に少なくとも０．９９の球形度を有する。代わりに又は追加して、好ましいコアは、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７又は更に少なくとも０．８の真円度を有する。

平均径、球形度、真円度及び他のコア特性は、多数の方法、例えば基本的な数学的測定値と組み合わせた試料の走査型電子顕微鏡検査を使用して、即ち統計的に重要な数を得るために、十分な数の電子顕微鏡写真に単純なルーラーを適用することによって測定することができる。画像処理ソフトウエアを使用すると、このプロセスを更に自動化することができる。

本顆粒は、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％若しくは少なくとも３５重量％の発酵固体及び／又は少なくとも１０％、少なくとも１５％若しくは少なくとも２０重量％の酵素固体を含む高ペイロードを有する。

ＩＶ．低多孔性顆粒のためのコーティング
酵素含有マトリックスコアは、少なくとも１種の無孔性で水溶性又は水分散性のコーティング層で被覆される。好ましくは、コーティングは、非吸湿性である。コーティング層で使用される材料は、飼料及び／又は動物用飼料において使用するために好適でなければならない（例えば、米国特許出願公開第２０１００１２４５８６号明細書、国際公開第９９３２５９５号パンフレット及び米国特許第５３２４６４９号明細書を参照されたい）。コーティングは、連続的、即ちコアを保護することに関連のないコーティングのミクロン規模の気孔率にさせる間隙、クラック及び／又は穴の非存在によって特徴付けられる連続的でなければならない。一部の実施形態では、酵素含有マトリックスコアは、単一コーティングのみで被覆される。

コーティング層は、下記の材料：無機塩（例えば、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛及び硫酸アンモニウム）、クエン酸、糖（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース及びフルクトース）、可塑剤（例えば、ポリオール、尿素、フタル酸ジブチル及びフタル酸ジメチル）、繊維性材料（例えば、セルロース及びセルロース誘導体、例えばヒドロキシ−プロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロース及びヒドロキシ−エチルセルロース）、粘土、ノンパレイル（糖及びデンプンの組み合わせ）、ケイ酸塩、リン酸塩、デンプン（例えば、コーンスターチ）、脂肪、油（例えば、菜種油及びパラフィン油）、脂質、ビニルポリマー、ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、可塑剤（例えば、ポリオール、尿素、フタル酸ジブチル、フタル酸ジメチル及び水）、抗凝集剤（例えば、タルク、粘土、非晶質シリカ及び二酸化チタン）、消泡剤（ＦＯＡＭＢＬＡＳＴ ８８２（登録商標）及びＥＲＯＬ ６０００Ｋ（登録商標）等）並びにタルクの１つ以上を含み得る。米国特許出願公開第２０１００１２４５８６号明細書、国際公開第９９３２５９５号パンフレット及び米国特許第５３２４６４９号明細書は、コーティング層のための好適な成分について詳述している。

一部の実施形態では、コーティング層は、糖（例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、顆粒状スクロース、マルトデキストリン及びフルクトース）を含む。一部の実施形態では、コーティング層は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等のポリマーを含む。多層状顆粒のコーティング層に組み込むために好適なＰＶＡには、低度〜高度の粘度を有する部分加水分解、完全加水分解及び中間加水分解されたものが含まれる。一部の実施形態では、コーティング層は、例えば、硫酸ナトリウム等の無機塩を含む。

コーティング層は、動的蒸気吸着測定法（ＤＶＳ）又は均等な方法によって測定される、６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を有する非吸湿性でなければならない。吸湿性コーティングは、湿度の存在下での貯蔵中又は動物用飼料の蒸気ペレット化におけるような蒸気への曝露中に水を吸収する傾向を示すであろう。吸水は、気孔率測定によって捕捉されない方法で被覆粒子の水分に対する気孔率又は透過性を更に増加させる傾向を示すであろう。水銀圧入気孔率測定法（ＭＩＰ）は、乾燥試料の使用を必要とするため、そこで吸収された水のこの透過効果を考慮に入れることができない。非吸湿性コーティングは、当業者により、ＤＶＳによる低吸水率、即ち６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を個別に明示する材料を選択及び結合することによって容易に配合される。単独又は組み合わせて、ＤＶＳを使用して候補コーティング材料のための吸水等温線を生成することは、容易である。多数の材料の吸水等温線は、食品科学、ポリマー科学及び材料科学に関する文献において公表されている。定義に従った非吸湿性材料の例には、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムが挙げられる。吸湿性材料の例としては、スクロース、デキストリン、デンプン、モノリン酸二ナトリウム及び硫酸亜鉛が挙げられる。

コーティング層は、本明細書で記載するように、顆粒が、硬度計を使用して、水銀圧入気孔率測定法（ＭＩＰ）によって決定される約０．０３ｃｃ／ｇ未満のマクロ孔気孔率を有するように選択されなければならない。気孔率値の例は、約０．０３０ｃｃ／ｇ未満、約０．０２８ｃｃ／ｇ未満、約０．０２６ｃｃ／ｇ未満、約０．０２４ｃｃ／ｇ未満、約０．０２２ｃｃ／ｇ未満、約０．０２０ｃｃ／ｇ未満、約０．０１８ｃｃ／ｇ未満、約０．０１６ｃｃ／ｇ未満、約０．０１４ｃｃ／ｇ未満、約０．０１２ｃｃ／ｇ未満、約０．０１０ｃｃ／ｇ及び更に約０．００８ｃｃ／ｇ未満である。

一部の実施形態では、コーティング層は、顆粒が５０％超、６０％超、７０％超又は更に８０％超の臨界相対湿度を有するように選択される。一部の実施形態では、コーティング層は、非吸湿性材料を含み、且つ６０％の相対湿度において０．５重量％以下、０．４重量％以下及び更に０．３重量％以下の吸水率を有する。

一部の実施形態では、全顆粒に対するコーティングの質量分率は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％以上である。一部の実施形態では、コーティングの質量分率は、５０重量％未満である。

一部の実施形態では、コーティングは、少なくとも３０重量％の塩を含む。一部の実施形態では、コーティングは、６０重量％未満の塩を含む。

Ｖ．酵素マトリックスコアの製造
高ペイロードの酵素マトリックスコアは、賦形剤又はコア材料等の約２０％を超える配合成分を添加する必要を伴わずに、連続的無孔性コーティングを塗布するために適切である、良好に形成された球状の円形粒子を製造できる任意のプロセスによって製造することができる。好ましい実施形態では、高ペイロードの酵素マトリックスコアを製造するために使用されるプロセスは、ときに噴流層式造粒法として公知である、酵素マトリックスコアが発酵固体及び賦形剤を流動層中に噴霧し、最初に核としてのスプレー乾燥粒子を形成するステップ及びその後、最初の不活性コアを必要とせずに、出発核上に更にスプレー及び層形成させることによって径が増加する粒子を構築するステップによるスプレー造粒法である。スプレー造粒法のために適切な装置の例は、Ｇｌａｔｔ ＧｍｂＨ（Ｂｉｎｚｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能なＧｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌシステムである。連続的無孔性コーティングを塗布するために適切である、良好に形成された粒子を製造するために、酵素マトリックスコアの２０〜３０重量％過剰で高レベルの不活性賦形剤及びコア材料を必要とするプロセスは、本発明のためのプロセスのために適切ではない。本発明のために適切ではないそのようなプロセスには、スプレー乾燥法、流動層スプレーコーティング法、流動層凝集法、高剪断造粒法、押出法、球状化法、ロールコンパクション法、小球化法、結晶化法及びロールコンパクション法が含まれるが、それらに限定されない。そのようなプロセスが適切な酵素マトリックスコアを製造できる見込みはない。

ＶＩ．本顆粒において包含するための対象の特定のタンパク質
本顆粒に包含するために、対象の多数のタンパク質が適切である。顆粒のペイロードは、理想的には特定の対象のタンパク質を含む、顆粒内に含有される全タンパク質の量によって定義され得ることを理解すべきである。対象のタンパク質を含有する多数のタンパク質組成物は、対象の特定のタンパク質が高度に富裕であるが、他のタンパク質、細胞溶解物又は更に全無傷細胞を含有して均質又は「不純」である。本明細書で記載したように、本顆粒は、少なくとも２５重量％の発酵固体又は対象のタンパク質を含む少なくとも１０重量％の酵素固体を必要とする。

対象の例示した酵素は、変異ブチアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼであるが、フィターゼは、決して本顆粒によって保護可能である唯一の酵素ではない。例えば、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシゲナーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ及びそれらの組合せを含む、蒸気ペレット化を受ける任意の酵素は、本発明の記載に含まれる。

ＶＩＩ．追加の使用
本顆粒は、蒸気ペレット化を含む用途において使用するために記載されてきたが、それらは、特にストレスの多い湿潤環境を含むもの等の用途において疑いなく有用である。そのような環境には、水性液体及び貯蔵中に一様に中等度の湿度に曝される乾燥固体が含まれる。そのような用途の特定の例としては、固体及び液体洗剤配合剤並びに自動食器洗浄配合物が挙げられる。

ＶＩＩＩ．様々な実施形態の組み合わせ
様々なセクションの見出しの下で記載されたものを含む、本明細書で記載する組成物及び方法の実施形態並びに当業者に明らかになるであろう他の実施形態は、それらの組み合わせが本発明の組成物及び方法の主張された目的及び利点を無効にしない限り、組み合わせることができる。

実施例１．高ペイロード顆粒における多孔性及び蒸気安定性の傾向
ブチアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ ｓｐ．）由来のフィターゼの変種を発現するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞由来の液体酵素ＵＦＣは、標準方法を使用して製造した。全タンパク質中、濃縮物は、活性に基づいて約４０重量％のフィターゼを含有していた。固体酵素マトリックスコアは、数種の異なる配合方法及び賦形剤を使用して製造した。これらの固体酵素マトリックスコアは、引き続いてバッチ式流動層コーティング機内において、ポリビニルアルコール、タルク、デキストリン及び硫酸ナトリウムを含有する１つ以上のスプレーを含む様々な防湿性コーティングを用いてコーティングした。全最終顆粒中、酵素マトリックスコア内に含有される全発酵固体は、最終顆粒の２０〜６０重量％の範囲であり、これは、活性に基づいて６〜２５重量％のフィターゼ酵素に対応する。コーティングは、最終顆粒の４０〜８０重量％を占めた。最終顆粒のフィターゼ活性は、４０，０００〜１００，０００ＦＴＵ／ｇの範囲に及んだ。

顆粒は、９５℃の温度で３０秒間のコンディショニング時間を用いて、試験ペレットミル上で動物用飼料と共にペレット化した。０．０３ｃｃ／ｇ以下のマクロ孔容積を有する全高ペイロード顆粒は、典型的には、最高活性再生率と相関する最低マクロ孔容積と共に約７０％以上のペレット化再生率を示した。８０％を超えるペレット化再生率を有していた全高ペイロード顆粒は、０．０２ｃｃ／ｇ以下のマクロ孔容積を有していた。６０％以下のペレット化再生率を示した全高ペイロード顆粒は、０．０４ｃｃ／ｇ以上のマクロ孔容積を有していた。これらの傾向は、明白であり、科学的及び商業的に重要である。

顆粒は、１００℃の飽和蒸気中において１２秒間のコンディショニング時間を用いて、追加して検査室規模の蒸気化試験にかけた。０．０２ｃｃ／ｇ以下のマクロ孔容積を有する全高ペイロード顆粒は、典型的には、最高活性再生率と相関する最低マクロ孔容積と共に約８０％以上の検査室規模の蒸気再生率を示した。約７０％未満の検査室規模の蒸気再生率を示した全高ペイロード顆粒は、０．０４ｃｃ／ｇ以上のマクロ孔容積を有していた。

実施例２．様々な方法を用いて製造した酵素マトリックスコアの比較
フィターゼを含有するＵＦＣは、以前のように製造した。固体酵素マトリックスコアは、数種の様々な造粒法及び賦形剤を用いて製造し、これらの酵素マトリックスコアは、引き続いて耐水性コーティングを用いて被覆した。顆粒Ａ及びＢのためのコアは、発酵固体に添加した６０重量％までの賦形剤と共にＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ＣＣＳ２２０装置上でのロールコンパクション法によって製造した。顆粒Ｃ及びＤのためのコアは、発酵固体に添加した１０重量％未満の賦形剤と共にＧｌａｔｔ ＷＳＴ−５流動層コーター上での連続的流動層スプレー凝集法によって製造した。顆粒Ｅ及びＦのためのコアは、発酵固体に添加した１０重量％未満の賦形剤と共にＧｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌ ５ Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍ装置上での連続的流動層スプレー顆粒法によって製造した。

各セットのコアは、１５０〜４２５μｍの粒径範囲に個別にふるいにかけ、引き続いてＶＦＣ−ＬＡＢ １装置上でのバッチ式流動層法でコーティングした。各顆粒のコーティングは、一緒に５５〜６５重量％の顆粒を含む塩層（硫酸ナトリウム）及び疎水性層（ＰＶＡ／タルク）を含んでいた。各顆粒についてのバッチサイズは、１〜２ｋｇであった。塩層は、４０〜５０℃の流動層温度及び２０〜３０ｇの溶液／分の速度において、２０〜３０重量％の硫酸ナトリウムを含有する水溶液から噴霧された。疎水性層は、５０〜５５℃の流動層温度及び懸濁液５〜１５ｇ／分の速度において、合計１５〜２５重量％のタルク及びＰＶＡを含有する水性懸濁液から噴霧された。タルク及びＰＶＡは、約２：１のモル比で混合した。流動層を流動化させるために使用される空気の流量は、流動層の総質量に依存して２０〜５０ＣＦＭであった。スプレーパラメーターは、コーティング固体の流動層の凝集又はスプレー乾燥の何れかを最小限に抑えるために必要に応じて調整した。生じた顆粒は、４０，０００〜１００，０００ＦＴＵ／ｇの範囲内のフィターゼ活性を示した。

顆粒の蒸気安定性は、引き続いて２種の方法を使用して試験した。第１に、顆粒は、検査室規模の蒸気安定性試験機上で１２秒間にわたって１００℃の飽和蒸気に曝露させた。第２に、顆粒は、３０秒間のコンディショニング時間及び９５℃の供給条件温度を用いて、典型的な動物用飼料ペレットミル上のコーン及び大豆マッシュと共にペレット化した。

顆粒についての気孔率、粒径及び蒸気安定性情報は、更にＳＥＭ画像に基づく粒子形態に関する観察を含む、下記の表１に要約した。表（及び全ての続く表）の最後の行では、記載した配合物が本組成物及び方法の範囲内に含まれるかどうかを同定する。

ロールコンパクション法を使用して製造した顆粒は、最高マクロ孔気孔率及び最小蒸気安定性を示している。スプレー造粒法を使用して製造した顆粒のみが０．０３ｃｃ／ｇ以下の所望の範囲内の気孔率を示し、これらの顆粒は、最高蒸気安定性を示している。スプレー凝集法を使用して製造したコアは、ＳＥＭ下で最小規則性を示した。これらのコアのマクロ孔気孔率は、おそらく課題の多い形態に起因して、スプレーコーティングによって所望の範囲に減少しなかった。

コアの性能は、使用した賦形剤の量又は顆粒内のフィターゼの濃度に相関していない。むしろ、それは、最高蒸気安定性と相関する、気孔率測定値によって明らかになるようなコーティングの質である。適切な高ペイロードコア製造法は、低多孔性コーティング及び高温蒸気条件下での安定性を可能にするために選択されなければならない。

実施例３．様々なスプレー造粒したフィターゼ顆粒のコーティング
同一のコア製造法を使用した場合でも、低多孔率コーティングを用いて被覆できる顆粒を得るには、製造パラメーターを制御することが重要である。下記の表２は、Ｇ及びＨと指定した２種の被覆顆粒についての物理的特性及び蒸気性能を要約している。コアの球形度及び真円度は、各試料について少なくとも１０，０００個の個別粒子を分析して、Ｒｅｔｓｃｈ Ｃａｍｓｉｚｅｒ ＸＴ機器及びそれに含まれる画像処理プロセスソフトウエアを用いて測定した。顆粒Ｇ及びＨのコアは、（上記のように）フィターゼを含有するＵＦＣから製造し、これを、次にＧｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌ ５ Ｌａｂシステム装置を使用して連続的流動層内でスプレー造粒した。スプレー造粒のパラメーターは、ＰｒｏＣｅｌｌ装置内のコアの滞留時間が、顆粒Ｇを製造するために使用されるコアと比較して、顆粒Ｈを製造するために使用されるコアについてよりも長くなるように調整した。これらのコアは、実施例２において記載した範囲内のコーティングパラメーターを使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＦＣ−ＬＡＢ １装置内で引き続いてバッチ式流動層中でコーティングした。生じた顆粒は、９０，０００〜１００，０００ＦＴＵ／ｇの範囲内のフィターゼ活性を示した。

ＰｒｏＣｅｌｌスプレー造粒装置内でのその短い滞留時間の結果として、顆粒Ｇを製造するために使用した酵素コアは、顆粒Ｈを製造するために使用した酵素コアよりも低い球形度及び真円度を示した。装置内のより長い滞留時間は、酵素マトリックスコアの追加の摩耗及び平滑化を可能にする。顆粒Ｇを製造するために使用したコアのマクロ孔気孔率は、相当に低かったが、顆粒の不良な球形度は、スプレーコーティング中の一様な無孔性コーティングの溶着を許容しなかった。従って、最終顆粒Ｇのコーティングは、最終顆粒Ｈのコーティングよりも有意に高いマクロ孔気孔率を有していた。顆粒Ｇの蒸気安定性は、何れも以前に記載した検査室規模の蒸気試験及びペレットミル試験の両方によって測定されるように、顆粒Ｈの蒸気安定性よりも相応して不良であった。

実施例４．スプレー造粒コア上のコーティング肉厚の増加
十分に低多孔性のコーティングをコア上に溶着させた後、顆粒の追加のコーティング及びペイロードの減少が蒸気安定性をそれ以上改善しない可能性があることは、注目に値する。下記の表３は、顆粒Ｊ−１及びＪ−２と指定した２種の被覆フィターゼ顆粒についての物理的特性及び蒸気性能を要約している。顆粒Ｊ−１及びＪ−２は、何れも（上記のように）フィターゼを含有するＵＦＣから製造された同一セットのコアから製造し、これを、次にＧｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌ ５ Ｌａｂシステム装置を使用して連続的流動層内でスプレー造粒した。コアは、実施例２に記載した範囲内のコーティングパラメーターを使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＦＣ−ＬＡＢ １装置上においてバッチ式流動層内で引き続いてコーティングした。各顆粒のコーティングは、５５〜７７重量％の顆粒を一緒に含む塩層（硫酸ナトリウム）及び疎水性層（ＰＶＡ／タルク）を含んでいた。各顆粒についてのバッチサイズは、１〜２ｋｇであった。生じた顆粒は、４０，０００〜１１０，０００ＦＴＵ／ｇの範囲内のフィターゼ活性を示した。

顆粒Ｊ−１のペイロードは、顆粒Ｊ−２のペイロードの２倍超であるが、粒径は、１６％小さく、２種の被覆顆粒のマクロ孔気孔率は、ほぼ同一である。これに対応して、検査室規模の蒸気試験及びペレットミル試験の両方によって測定した２種の顆粒の全蒸気安定性は、類似しており、これらのアッセイの変動性範囲内にある。顆粒質量のおよそ２５％であった顆粒Ｊ−２に塗布された追加のコーティングは、顆粒の蒸気安定性をそれ以上増加させない。これらのデータは、確実に塗布されたより低い気孔率のコーティングが、より厚いコーティング及び減少したペイロードと比較して同一の蒸気安定性を付与できることを示唆しており、これは、性能パラメーターとしての気孔率の重要性を強調している。

実施例５．様々なコーティング条件下で塗布されたコーティングの特性
２種の方法を用いてコーティングされた酵素マトリックスコアを有する４種のフィターゼ顆粒を調製した。酵素マトリックスコアＮは、（上記のような）フィターゼを含有するＵＦＣを用いてＧｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌ ２５ Ｐｉｌｏｔシステムを使用して連続式流動層法でスプレー造粒された酵素マトリックスコアのセットからの代表的な試料である。顆粒Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳは、同一の実験ランにおいて製造されたコアのセットから製造したが、類似の気孔率を示す全部が酵素マトリックスコアＮを生じさせる。

顆粒Ｐ及びＱは、実施例２に記載した範囲内のコーティングパラメーターを使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＦＣ−ＬＡＢ １装置上でこのセットのスプレー造粒コアをコーティングすることによって製造した。バッチサイズは、製造中の湿度、流動化及び機械的衝撃等のパラメーターの慎重な制御を可能にする約２ｋｇであった。使用したコーティング条件は、実施例２において記載したコーティング条件と類似であった。機械的衝撃ストレスは、流動層の重量が少ないために低いが、流動層内のスプレーパラメーターは、含水量を最小限に抑えるため、且つコーティング固体をスプレー乾燥せずに可能な限り乾燥していた顆粒を造粒するために制御された。

顆粒Ｒ及びＳは、約１００ｋｇのバッチサイズにおいて、検査室規模の流動層コーティング機上の同一セットのスプレー造粒コアからのコアをコーティングすることによって製造した。流動層の重量が大きいほど、相応してより高い機械的ストレスを導入し、より大きい流動層を通した全てのランパラメーターの精密な制御を許容しなかった。スプレー溶液濃度及びスプレー温度は、実施例２において記載した範囲内に含まれた。流動化気流は、製造中の流動層の質量に依存して８００〜１１００立方メートル／時で変動した。塩溶液は、３６〜６０Ｌ／時の速度でスプレーし、疎水性コーティング溶液は、２０〜４５Ｌ／時の速度でスプレーした。生じた顆粒Ｐ、Ｑ、Ｒ及びＳは、７５，０００〜９５，０００ＦＴＵ／ｇの範囲内のフィターゼ活性を示した。

下記の表４は、２つの異なる方法を使用してコーティングされた酵素マトリックスコアを用いて、４種のフィターゼ顆粒の物理的特性及び蒸気安定性を例示している（ＨＧは、均質を意味する）。

コーティング特性に対する最高レベルのコントロールに起因して、顆粒Ｐ及びＱは、最低マクロ孔気孔率及び相応して高い蒸気安定性を示す。検査室規模及び最小制御条件下で製造した顆粒Ｒは、以前に記載した検査室規模及びペレット化塗布試験の両方において、顆粒Ｐ及びＱよりも高いマクロ孔気孔率並びに有意に低い蒸気安定性を示す。この結果は、賦形剤の同一コーティング構成を同一セットのコアに塗布すること及びほぼ同一の最終径を有することにかかわらない。顆粒Ｒのマクロ孔気孔率がより高いことは、明らかにコーティング品質をより不良にさせ、顆粒の蒸気安定性は、相応してより低くなる。

顆粒Ｓは、１００ｋｇのバッチサイズで検査室規模の流動層コーティング機上でも製造した。しかしながら、流動化レベルを低下させることによってコーティングプロセス中の機械的衝撃ストレスを低下させるために追加の注意を払った。コーティングプロセス中の顆粒の含水率は、塩スプレーの温度を４５℃〜５０℃に上昇させ、塩を緩徐な速度でスプレーし、コーティング間の乾燥時間を延長させ、且つ追加の乾燥ステップを加えることによって低下した。機械的ストレスを低下させ、且つ含水率制御のレベルを増加させることは、全コーティングプロセスを通してコーティングの均質性及び品質を改善することに役立った。相応して、顆粒Ｓは、顆粒Ｒと比較した場合、顆粒Ｐ及びＱの特性に近いより低いマクロ孔気孔率及び改善されたレベルの蒸気安定性を示した。これらのデータは、高品質のコアを製造すること及び適切なレベルの賦形剤コーティングを選択することが、問題のない顆粒を造粒するために十分でないことを示唆している。むしろ、低マクロ孔気孔率を達成するには、コーティング条件を慎重に制御しなければならない。

実施例６．様々な吸湿性を有するコーティングの特性
低多孔性コーティングを溶着させることに加えて、低吸湿性を有するコーティングを溶着させることも必要である。下記の表５は、様々なコーティングの化学的性質を使用してコーティングした３種のフィターゼ顆粒についての物理的特性及び吸水特性を例示している。酵素マトリックスコアは、フィターゼを含有するＵＦＣを用いるＧｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌ ５ Ｐｉｌｏｔシステムを使用して、連続式流動層においてスプレー造粒法によって製造した。コアは、次に、約２ｋｇのバッチサイズを有するＶｅｃｔｏｒ ＶＦＣ−ＬＡＢ １装置を使用してスプレーコーティングした。コアは、吸湿性化合物であるマルトデキストリンを含有する顆粒Ｔ及びＵのコーティング並びにマルトデキストリンを含有していない顆粒Ｖのコーティングを用いて、様々な化学的性質を使用してコーティングした。コーティングパラメーターは、実施例２において記載した範囲内にあった。顆粒Ｔ及びＵについて、塩層を溶着させるために、硫酸ナトリウム溶液単独をスプレーするステップよりむしろ、２２．５重量％の硫酸ナトリウム及び２．５重量％のマルトデキストリンを含有する水溶液を使用した。それらの塩層における様々なコーティングの化学的性質の結果として、最終顆粒について様々なレベルの吸湿性が達成された。コアの球形度及び真円度は、各試料について少なくとも１０，０００個の個別粒子を分析するＲｅｔｓｃｈ Ｃａｍｓｉｚｅｒ ＸＴ機器及びそれに含まれる画像処理プロセスソフトウエアを用いて測定した。

図１は、ＡｑｕａＬａｂ ＶＳＡシステムにおける動的蒸気吸着によって測定される、３種の顆粒の吸水特性を例示している。これらのデータは、２５℃で動的蒸気吸着（ＤＶＳ）モードにおいて収集され、０．０１％未満の２回の連続質量変化事象の平衡閾値を使用した平衡測定値を表す。吸水速度は、各顆粒中のマルトデキストリンの量と相関する。明らかに、顆粒Ｔは、最も急速な吸水率を示す一方、顆粒Ｖは、最も遅い吸水速度を示している。相応して、顆粒Ｖは、検査室規模及びペレット化規模の両方で測定して最高蒸気安定性を示すが、顆粒Ｔは、有意に低い蒸気安定性を示す。中間レベルの吸水率を示す顆粒Ｕの蒸気安定性は、最低限である。これは、全顆粒がさもなければ許容可能なマクロ孔気孔率であろうことを示すことにかかわらない。従って、それは、低多孔性コーティングを溶着させるために不十分である。コーティングの賦形剤及び化学的性質は、高水分条件における安定性を保証するために吸水率を最小限に抑えるようにも選択されなければならない。

実施例７：マクロ孔の粒径及び蒸気安定性
上記に例示した全試料について、水銀気孔率測定値は、径が０．０１μｍのマクロ孔〜径がマクロ孔４０μｍの粒径範囲で入手した。この範囲内において、径が０．２〜８．０μｍの粒径範囲内のマクロ孔の全容積は、蒸気安定性との最高相関を示す。８μｍの上限は、粒径が１００〜４００μｍの顆粒について約１０μｍと小さいことがあり得る、個別の顆粒間の間隔の検出によって混同される、８μｍ超のマクロ孔の測定値として、対象のこの孔粒径範囲に設定された。

下記の表６は、４種の以前に例示した顆粒Ｃ、Ｇ、Ｐ及びＳについての様々な孔径範囲における気孔率を示している。これらの顆粒についての製造条件については、先行実施例において記載してきた。

顆粒Ｃ及びＧは、０．２〜８．０μｍのマクロ孔径範囲内で高いマクロ孔容積を、しかし０．０１〜０．２μｍの孔径範囲内で低い孔容積を示す。これらの顆粒は、不良な蒸気安定性結果を、特に動物用飼料を用いてペレット化した場合に極度に不良な結果を示す。顆粒Ｃ及びＧと比較して、顆粒Ｐ及びＳは、０．２〜８．０μｍの孔径範囲内で低い孔容積及び０．０１〜０．２μｍの孔径範囲内で高い孔容積を有する。これらの顆粒は、顆粒Ｃ及びＧと比較して大いに改善された蒸気安定性を示す。これらのデータは、０．２〜８．０μｍの孔径範囲が最終顆粒の蒸気安定性と最高に相関することを例示している。０．０１〜８．０μｍの完全孔径範囲に関してまとめた孔容積も蒸気安定性と全く相関しない。

Claims (33)

1. 酵素含有被覆顆粒であって、
   （ａ）少なくとも１０重量％の酵素固体のペイロード；
   （ｂ）酵素マトリックスコアを取り囲んでいる連続的保護コーティングであって、
   （ｉ）径において０．２〜８．０ミクロンの範囲内のマクロ孔について、約０．０３ｃｃ／ｇ未満の気孔率；及び
   （ｉｉ）６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率
   を有する被覆顆粒を生じさせる、連続的保護コーティング
   を含む酵素含有被覆顆粒。
2. 少なくとも０．９の球形度を有する酵素マトリックスコアを有する、請求項１に記載の被覆顆粒。
3. 少なくとも０．５の真円度を有する酵素マトリックスコアを有する、請求項１又は２に記載の被覆顆粒。
4. 少なくとも３０重量％のコーティング質量分率を有する、請求項１〜３の何れか一項に記載の被覆顆粒。
5. ７０重量％未満のコーティング質量分率を有する、請求項１〜４の何れか一項に記載の被覆顆粒。
6. 前記コアの水分活性は、０．２未満である、請求項１〜５の何れか一項に記載の被覆顆粒。
7. 前記コーティングの臨界相対湿度は、６０％超である、請求項１〜６の何れか一項に記載の被覆顆粒。
8. 前記コーティングは、非吸湿性材料を含み、且つ６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を有する、請求項１〜７の何れか一項に記載の被覆顆粒。
9. ６０重量％以下の塩を含むコーティングを有する、請求項１〜８の何れか一項に記載の被覆顆粒。
10. ３０重量％以上の塩を含むコーティングを有する、請求項１〜９の何れか一項に記載の被覆顆粒。
11. 前記コアは、２０重量％未満の賦形剤を含む、請求項１〜１０の何れか一項に記載の被覆顆粒。
12. １００μｍ超の全径を有する、請求項１〜１１の何れか一項に記載の被覆顆粒。
13. ４００μｍ未満の全径を有する、請求項１〜１２の何れか一項に記載の被覆顆粒。
14. 前記酵素マトリックスコアは、スプレー造粒法によって製造される、請求項１〜１３の何れか一項に記載の被覆顆粒。
15. 前記酵素固体は、フィターゼを含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の被覆顆粒。
16. 組成物中の酵素の安定性又は蒸気ペレット化プロセスにおける酵素の再生率を増加させるための方法であって、
    （ａ）少なくとも１０重量％の酵素固体のペイロード；
    （ｂ）酵素マトリックスコアを取り囲んでいる連続的保護コーティングであって、
    （ｉ）径において０．２〜８．０ミクロンの範囲内のマクロ孔について、約０．０３ｃｃ／ｇ未満の気孔率；及び
    （ｉｉ）６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率
    を有する被覆顆粒を生じさせる、連続的保護コーティング
    を含む被覆顆粒において前記酵素を提供するステップを含む方法。
17. 前記酵素マトリックスコアは、少なくとも０．９の球形度を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記酵素マトリックスコアは、少なくとも０．５の真円度を有する、請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 前記顆粒は、少なくとも３０重量％のコーティング質量分率を有する、請求項１６〜１８の何れか一項に記載の方法。
20. 前記顆粒は、７０重量％未満のコーティング質量分率を有する、請求項１６〜１９の何れか一項に記載の方法。
21. 前記酵素マトリックスコアの水分活性は、０．２未満である、請求項１６〜２０の何れか一項に記載の方法。
22. 前記コーティングの臨界相対湿度は、６０％超である、請求項１６〜２１の何れか一項に記載の方法。
23. 前記コーティングは、非吸湿性材料を含み、且つ６０％の相対湿度において０．５重量％以下の水の吸水率を有する、請求項１６〜２２の何れか一項に記載の方法。
24. 前記コーティングは、７０重量％以下の塩を含む、請求項１６〜２３の何れか一項に記載の方法。
25. 前記コーティングは、３０重量％以上の塩を含む、請求項１６〜２４の何れか一項に記載の方法。
26. 前記コアは、２０重量％以下の賦形剤を含む、請求項１６〜２５の何れか一項に記載の方法。
27. 前記顆粒は、１００μｍ超の全径を有する、請求項１６〜２６の何れか一項に記載の方法。
28. 前記顆粒は、４００μｍ未満の全径を有する、請求項１６〜２７の何れか一項に記載の方法。
29. 前記酵素マトリックスコアは、スプレー造粒法によって製造される、請求項１６〜２８の何れか一項に記載の方法。
30. 前記顆粒は、スプレー造粒法によって製造される、請求項１６〜２９の何れか一項に記載の方法。
31. 前記顆粒は、ワックス又は水和塩を含む水溶性又は水分散性コーティングを有する、請求項１６〜３０の何れか一項に記載の方法。
32. 前記酵素固体は、フィターゼを含む、請求項１６〜３１の何れか一項に記載の方法。
33. 請求項１〜１５の何れか一項に記載の顆粒を含むペレット化動物用飼料組成物。

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