JP2021524273A - 改変ノロウイルスｖｐ１タンパク質および改変ノロウイルスｖｐ１タンパク質を含むｖｌｐ - Google Patents
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Abstract
改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする核酸、および１つ以上の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰが提供される。植物、植物の一部、または植物細胞において、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質、およびノロウイルスＶＬＰの産生のための方法も記載されている。
Description
本発明は、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰ、およびそれらを産生する方法に関する。
ノロウイルス感染に起因する世界的な疾病負荷は高く、全世界の下痢症例の推定２０％に関連しており、年間２０万人以上が死亡している。ノロウイルスは、北米での食中毒の発生の主な原因であり、高齢者の医療関連の発生の大部分の原因物質である。ノロウイルス株はまた、世界中の小児胃腸疾患の主要な原因であると認識されている。
ノロウイルスは、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科の多くの属のうちの１つを構成する。ヒトノロウイルスゲノムは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、その５’末端がＶＰｇタンパク質でキャップされた一本鎖プラス鎖ＲＮＡ分子である。ＯＲＦ１は、ＶＰｇ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびウイルスプロテアーゼを含む６つの非構造ウイルスタンパク質をコードする。ＯＲＦ２は、主要なメジャー構造のキャプシドタンパク質（ＶＰ１）をコードする。ＯＲＦ３は、マイナーキャプシドタンパク質（ＶＰ２）をコードする。
ＶＰ１は、シェル（Ｓ）ドメインおよび突出（Ｐ）ドメインの２つのドメインで構成されている。タンパク質のＮ末端にあるＳドメインは、キャプシド集合およびウイルス二十面体の形成に必要な構造要素を含有する。Ｐドメインは、ＶＰ１タンパク質の残りを含み、Ｐ１サブドメインおよびＰ２サブドメインからさらに構成される。Ｐ２サブドメインは、超可変ドメインと呼ばれ、受容体結合および免疫反応性において重要な役割を果たすと考えられている。
ＶＰ１タンパク質は、Ｐドメイン媒介性タンパク質相互作用を介して二量体を形成する。二量体化は、ビリオンキャプシドの安定性を高め、Ｓドメインによって形成されたノロウイルス粒子のベースコアから伸びる突起の形成をもたらす。発現すると、ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、自動的に集合して、２つのビリオン構造：直径３８〜４０ｎｍのＴ＝３正十二面体対称性を有する１８０ｍｅｒのキャプシド構造；および直径２３ｎｍのＴ＝１正二十面体対称を有する６０ｍｅｒのキャプシド構造を形成する。
マイナー構造タンパク質であるＶＰ２の分子量（ＭＷ）は、約２１〜２４ｋＤａである。研究によると、ＶＰ２は、非常に塩基性であり、キャプシドの内部にあることが示唆されている。ＶＰ２の機能は、まだ完全には理解されていないが、一般に、ビリオンを解体および分解から保護することにより、キャプシドの安定性に役割を果たすと考えられている（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔ Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｓ．Ｅ．，Ｈｕｔｓｏｎ Ａ．Ｍ．，Ｅｓｔｅｓ Ｍ．Ｋ．２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１６０３−１１６１５）。ＶＰ２は、ＲＮＡゲノムのパッケージング中にも機能を有し得る。ビリオン中のＶＰ２マイナー構造タンパク質の量は、比較的少なく、成熟したビリオンには１．５〜８コピーが組み込まれている。Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔ ｅｔ．ａｌ．（２００３）は、昆虫および哺乳類細胞において、ＶＰ１／ＶＰ２で構成されたＶＬＰは、ＶＰ１のみのものよりもプロテアーゼ切断に対して耐性があり、シスでのＶＰ２の発現がＶＰ１タンパク質産生の増加をもたらすことを報告している。加えて、ＯＲＦ２遺伝子の下流に３’ＵＴＲが存在すると、ＮＶ ＯＲＦ２ ｍＲＮＡの定常状態レベルが上昇する。ＶＰ１発現の最大の増加は、同じ構築物上に存在し、１つのプロモーターの調節下にあるＯＲＦ２＋ＯＲＦ３＋３’ＵＴＲが発現したときに観察された。トランスでのＶＰ２の発現は、いかなるＶＰ１発現の増加ももたらさなかったが、これは、観察されたＶＰ１産生の増加には、ＯＲＦ２−ＯＲＦ２−３’ＵＴＲのサブゲノム組織が必要であることを示している。
ノロウイルスは、ＶＰ１アミノ酸配列のそれらの系統発生的クラスター化に従って分類される。現在までに７つの遺伝子群（ＧＩ〜ＧＶＩＩ）が分類されており、ヒトに感染することが知られている遺伝子群はＧＩ、ＧＩＩ、およびＧＩＶのみである。現在、ヒトの感染症に関連している３２個の特異的な遺伝子型のうち、ＧＩＩ．４ノロウイルスが最近のノロウイルスの発生の大部分の原因となっている。ＧＩＩ．４の新株は、ＶＰ１の超可変Ｐ２ドメインのエピトープ決定領域の突然変異によって駆動されるプロセスによって進化し、２〜３年ごとに出現する。このプロセスにより、ノロウイルスは初期の株への以前の曝露によって獲得された体液性免疫応答から逃れることができる。
急速に進化し、遺伝的に多様なノロウイルス株の困難に直面している一方で、効果的なノロウイルスワクチンの開発は、さらなる課題によって悪化している。例えば、最近まで、ヒトノロウイルスは、細胞培養で増殖させることができず、現在でも、ＶＬＰおよび弱毒生ノロウイルスの両方に対する堅牢な細胞培養システムが不足している。
ワクチン開発における追加の課題は、ノロウイルス感染に対する免疫が株および遺伝子型に特異的であり、他の遺伝子群に対して最小限の交差免疫が付与されることである。さらに、ノロウイルス株に対する免疫は、生涯続くものではなく、６か月〜９年のどこからでも持続すると推定されている。
世界的には、ノロウイルスＧＩＩ株が優勢であり、ＧＩＩ．４がノロウイルス遺伝子型として優勢である。遺伝的に別個の新規ＧＩＩ．４変異体は、２〜３年ごとに出現し、世界中に急速に広まった。ＧＩＩ．４変異体ＵＳ９５／９６，Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ Ｈｉｌｌｓ ２００２、Ｈｕｎｔｅｒ ２００４，Ｄｅｎ Ｈａａｇ ２００６ｂ（２００６ｂ），Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ ２００９，およびＳｙｄｎｅｙ ２０１２は、パンデミック変異体として認識されているが、Ａｓｉａ ２００３およびＹｅｒｓｅｋｅ ２００６ａなどの一部の変異体が、限られた地域の流行でのみ報告されている。さらに、ＧＩＩ．４は、他の遺伝子型よりも重度の胃腸炎を引き起こすことが報告されている
昆虫および植物の発現系における組換えノロウイルスタンパク質の産生を含む、ノロウイルス感染に対する好適なワクチンを開発するために、様々なアプローチが行われてきた。
Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，２０４：１−５）は、昆虫ＳＦ９細胞で産生されたノロウイルスＶＰ１ ＶＬＰのＭ２７Ｇ突然変異キャプシドタンパク質が、５８ｋＤａおよび５５ｋＤａのタンパク質を含む３８ｎｍおよび２１ｎｍのＶＬＰの産生をもたらしたことを実証した。５５ｋＤａのタンパク質は、内部開始コドンの翻訳産物とは対照的に、完全長のＰ１キャプシドタンパク質の分解または切断の結果であった。ＶＰ１タンパク質の２６または３８個の欠失アミノ酸残基を含むＮ末端欠失変異体は、２１ｎｍのＶＬＰの産生をもたらした。２６個のアミノ酸欠失変異体は、少数の３８ｎｍのＶＬＰを産生したが、３８個のアミノ酸欠失変異体は、３８ｎｍのＶＬＰの形成をもたらさなかった。
ＵＳ２０１３／０２７３１０５は、遺伝子群Ｉ（Ｇ１）、遺伝子群ＩＩ（ＧＩＩ）、またはコンセンサスウイルス配列に由来する抗原ペプチド、タンパク質、またはＶＬＰを含むノロウイルス製剤の製造を教示している。ノロウイルス抗原には、ＶＬＰで発現するキャプシドタンパク質の変異体が含まれ得る。
ＵＳ２０１５／００２３９９５号は、昆虫Ｓｆ９細胞で産生されたＶＬＰを含むワクチン製剤を提供し、ＶＬＰは、少なくとも２つのウイルスタンパク質配列に由来する複合アミノ酸配列を含む。例えば、ＧＩＩ．４ Ｍｉｎｅｒｖａ ２００６−ａ、ならびにＧＩＩ．４ Ｌａｕｒｅｎｓ ２００６−ｂおよびＧＩＩ．４ Ｈｏｕｓｔｏｎ ２００２ノロウイルス株からのＶＰ１配列を含む複合ＧＩＩ．４ ＶＰ１ ＶＬＰが記載されている。ＧＩＩ．１、ＧＩＩ．２ Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、およびＧＩＩ．３由来の複合配列、ならびにＮｏｒｗａｌｋ ＧＩ．１、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ ＧＩ．１、およびＣｈｉｂａ ＧＩ．１由来のＧＩ複合配列についても説明する。
Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６，９３（１１）：５３３５−４０）は、遺伝子操作されたタバコ植物およびジャガイモ塊茎を使用して、天然ＶＰ１タンパク質からＧＩ．１ノロウイルスＶＬＰを発現させることを教示している。植物産生されたノロウイルスＶＬＰは、形態学的および物理的に、昆虫細胞で産生される３８ｎｍのＮｏｒｗａｌｋ ＶＬＰと類似している。天然キャプシドタンパク質から精製されたタバコ産生Ｎｏｒｗａｌｋ ＶＬＰ、またはＧＩ．１キャプシドタンパク質を発現するジャガイモ塊茎の経口投与は、マウスおよびヒトにおいて体液性免疫応答を誘導した（Ｔａｃｋｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２０００，１８２（１）：３０２−５）。
Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００９，１０３（４）：７０６−１４）は、植物でＧＩ．１ノロウイルスＶＬＰを産生するためのジェミニウイルス由来ＤＮＡレプリコンベクターについて説明している。ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）における豆黄矮性ウイルス由来ベクターおよびＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクターの同時送達は、迅速かつ強力なタンパク質産生をもたらした。
本発明は、改変ノロウイルスタンパク質、改変ノロウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにノロウイルスタンパク質および改変ノロウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法に関する。
本発明の目的は、改変ノロウイルスタンパク質、改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを産生すること、および植物において改変ノロウイルスタンパク質を含むＶＬＰを産生することである。
本明細書に記載されるように、改変ノロウイルスＶＰ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記改変ノロウイルスＶＰ１が、Ｓドメイン及びＰドメインを含み、
−前記ＳドメインはノロウイルスＶＰ１ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、もしくは８０に対応する１つもしくは複数のアミノ酸での置換を含む；
−前記ＰドメインはノロウイルスＶＰ１ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３もしくは３６８に対応する１つもしくは複数のアミノ酸での置換を含む、または
−それらの組み合わせ
である、前記核酸が提供される。
−前記ＳドメインはノロウイルスＶＰ１ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、もしくは８０に対応する１つもしくは複数のアミノ酸での置換を含む；
−前記ＰドメインはノロウイルスＶＰ１ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３もしくは３６８に対応する１つもしくは複数のアミノ酸での置換を含む、または
−それらの組み合わせ
である、前記核酸が提供される。
また、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列が任意のノロウイルスＧＩＩ．４株に由来し得る、上記のような核酸も提供される。例えば、限定的であるとは見なされないが、ノロウイルスＧＩＩ．４株は、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（配列番号：１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（配列番号：３）、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９）の群から選択され得る。
さらに、Ｓドメインは、ノロウイルス遺伝子型Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵまたはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来し得、Ｐドメインは、ノロウイルス遺伝子型Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来し得る。
上記の組換え核酸は、以下から独立して選択される、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変ＶＰ１タンパク質をコードし得る：
１）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸８０との配列アラインメントにおいて、またはそれと対応する位置にアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
２）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらと対応する位置に２つのアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８、もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
３）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸５３および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらと対応する位置に２つのアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
４）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらと対応する位置に３つのアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
１）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸８０との配列アラインメントにおいて、またはそれと対応する位置にアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
２）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらと対応する位置に２つのアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８、もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
３）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸５３および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらと対応する位置に２つのアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
４）ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらと対応する位置に３つのアミノ酸置換を含むノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵもしくはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５に由来するＳドメイン。今説明したように改変ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３、３６８もしくはアミノ酸３３３および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する位置にアミノ酸置換を含むＰドメインも含み得る。
上記の核酸は、
−アミノ酸がバリン、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニンに置換されている、アミノ酸３９；
−アミノ酸がセリン、アスパラギン、システイン、またはスレオニンに置換されている、アミノ酸８０；
−アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、またはメチオニンに置換されている、アミノ酸５３；
−アミノ酸がバリン、イソロイシン、またはロイシンに置換されている、アミノ酸３３３；
−アミノ酸がグルタミン酸、アスパラギンまたはアスパラギン酸に置換されている、アミノ酸３６８
に対応するアミノ酸残基に１つまたは複数の置換を含む改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をさらにコードし得る。
−アミノ酸がバリン、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニンに置換されている、アミノ酸３９；
−アミノ酸がセリン、アスパラギン、システイン、またはスレオニンに置換されている、アミノ酸８０；
−アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、またはメチオニンに置換されている、アミノ酸５３；
−アミノ酸がバリン、イソロイシン、またはロイシンに置換されている、アミノ酸３３３；
−アミノ酸がグルタミン酸、アスパラギンまたはアスパラギン酸に置換されている、アミノ酸３６８
に対応するアミノ酸残基に１つまたは複数の置換を含む改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をさらにコードし得る。
上記の核酸のいずれもまた、ヒトコドン使用、増加したＧＣ含有量、またはそれらの組み合わせのために最適化され得る。
上記のような核酸のいずれか１つを含むベクターも本明細書で提供される。
上記の核酸のいずれか１つによってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質も本明細書に記載されている。改変ＶＰ１タンパク質は、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（配列番号：３）またはＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（配列番号：１）と約８０〜約１００％のアミノ酸配列類似性を含み得るが、ただし、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、アミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８位に１つ以上の置換を含むことを条件とする。さらに、上記の組換え核酸のいずれか１つによってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰも開示されている。上記の核酸のいずれか１つによってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰは、ノロウイルスＶＰ２タンパク質をさらに含み得る。
植物、植物の一部、または植物細胞において改変ノロウイルスＶＰ１を産生するための方法も本明細書に提供される。改変ノロウイルスＶＰ１は、上記の核酸のいずれか１つによってコードされ得る。この方法は、上記の核酸のうちの１つまたは複数を植物、植物の一部、または植物細胞に導入し、植物、植物の一部、または植物細胞を１つまたは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の発現を可能にする条件下で、インキュベートすることを含む。本明細書で提供される方法は、植物、植物の一部、または植物細胞を収穫するステップをさらに含み得る。加えて、この方法は、植物、植物の一部、または植物細胞から１つまたは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を抽出する、精製する、または抽出かつ精製するステップを含み得る。さらに、導入ステップにおいて、この方法は、ノロウイルスＶＰ２タンパク質をコードする第２の核酸配列を植物、植物の一部、または植物細胞に導入することをさらに含み得、インキュベーションステップにおいて、条件は、植物、植物の一部、または植物細胞における、１つまたは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質およびノロウイルスＶＰ２タンパク質の両方の共発現および共産生を可能にする。
また、植物、植物の一部、または植物細胞においてノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生するための方法であって、ＶＬＰが、上記の核酸のうちの１つ以上によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つまたは複数を含む、方法も記載されている。この方法は、上記の核酸のうちの１つまたは複数を植物、植物の一部、または植物細胞に導入し、植物、植物の一部、または植物細胞を１つまたは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の発現を可能にする条件下でインキュベートし、それによりノロウイルスＶＬＰを産生することを含む。本明細書で提供される方法は、植物、植物の一部、または植物細胞を収穫するステップをさらに含み得る。加えて、この方法は、植物、植物の一部、または植物細胞からノロウイルスＶＬＰを抽出する、精製する、または抽出かつ精製するステップを含み得る。さらに、導入ステップにおいて、この方法は、ノロウイルスＶＰ２タンパク質をコードする第２の核酸配列を植物、植物の一部、または植物細胞に導入することをさらに含み得、インキュベーションステップにおいて、条件は、植物、植物の一部、または植物細胞における、１つ以上の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質およびノロウイルスＶＰ２タンパク質の両方の共発現および共産生を可能にし、それによりノロウイルスＶＬＰを産生する。本明細書に記載の方法によって産生されたノロウイルスＶＬＰは、約１５ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有し得る。あるいは、ＶＬＰは、約２３ｎｍ（Ｔ＝１正二十面体対称性の場合）または約３８ｎｍ（Ｔ＝３正二十面体対称性の場合）の直径を有し得る。
抗体または抗体フラグメントを産生する方法であって、上記の核酸のうちの１つまたは複数によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数、または改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数を含むノロウイルスＶＬＰを対象または宿主動物に投与して、それによって抗体または抗体フラグメントを産生することを含む、方法が本明細書に提供される。
また、上記の核酸、組換え核酸のうちの１つもしくは複数によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１、または１つもしくは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰを含む植物、植物の一部、または植物細胞も本明細書で提供される。
免疫応答を誘導するための組成物も本明細書に記載されている。組成物は、上記の核酸のうちの１つもしくは複数によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数、または改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数を含むノロウイルスＶＬＰの有効量、および薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または添加剤を含む。
本開示はまた、免疫応答を誘導するためのワクチンであって、上記の核酸のうちの１つもしくは複数によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数、または改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数を含むＶＬＰの有効量を含む、ワクチンが提供される。
抗体または抗体フラグメントであって、上記の核酸のうちの１つもしくは複数によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１のうちの１つもしくは複数、または改変ノロウイルスＶＰ１のうちの１つもしくは複数を含むノロウイルスＶＬＰを対象または宿主動物に投与することによって調製される、抗体または抗体フラグメントが本明細書で提供される。
また、対象においてノロウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、上記の核酸のうちの１つもしくは複数によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数、または改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数を含むノロウイルスＶＬＰを投与することを含む、方法が本明細書に記載されている。改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のうちの１つもしくは複数、またはノロウイルスＶＬＰは、経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、直腸、または膣内で対象に投与され得る。
植物、植物の一部、または植物細胞におけるノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）の収量を増加させる方法が提供される。この方法は、上記のような核酸を植物、植物の一部、または植物細胞に導入し、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の発現を可能にする条件下で、植物、植物の一部、または植物細胞をインキュベートし、それによりノロウイルスＶＬＰを産生することを含み、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰの収量が、同じ条件下で、植物、植物の一部、または植物細胞で産生される野生型ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰの収量よりも大きい。
本発明のこの要約は、必ずしも本発明のすべての特徴を説明するものではない。
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照する以下の説明からより明らかになるであろう。
以下の説明は、好ましい実施形態のものである。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する」という用語、ならびにそれらの文法上の変形は、包括的または非限定型であり、追加の、引用されていない要素および／または方法ステップを除外しない。使用または方法に関連して本明細書で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、追加の要素および／または方法ステップが存在し得るが、これらの追加は、列挙された方法または使用が機能する方法に実質的に影響を及ぼさないことを表す。使用または方法に関連して本明細書で使用される場合の「からなる」という用語は、追加の要素および／または方法ステップの存在を除外する。特定の要素および／またはステップを含むものとして本明細書に記載される使用または方法はまた、特定の実施形態では、本質的にそれらの要素および／またはステップからなり得、他の実施形態では、これらの実施形態が具体的に言及されているかどうかにかかわらず、それらの要素および／またはステップからなる。加えて、単数形の使用には、複数形が含まれ、「または」は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。本明細書で使用される「複数」という用語は、１つ超、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上などを意味する。本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の値からの約＋／−１０％の変動を指す。そのような変動は、それが具体的に言及されているかどうかにかかわらず、本明細書で提供される任意の所与の値に常に含まれることを理解されたい。本明細書で「含む」という用語と併せて使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは複数」の意味とも一致する。
本明細書で使用される「植物」、「植物の一部」、「植物部分」、「植物物質」、「植物バイオマス」、「植物材料」、植物抽出物」、または「植物の葉」という用語は、本明細書に記載の１つまたは複数の核酸を発現するための転写、翻訳、および翻訳後機構を提供することができる、植物全体、組織（例えば、葉、茎、根）細胞、もしくはそれらの任意の画分、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体抽出物、またはそれらの組み合わせを含み得、かつ／またはそこから発現タンパク質もしくはＶＬＰが抽出および精製され得る。植物には、例えば、カノーラ、ブラッシカ属、トウモロコシ、ニコチアナ属、（タバコ）、例えば、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ニコチアナルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、タバカム（ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナアラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）、アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、ジンセン、エンドウ豆、オート麦、米、大豆、小麦、大麦、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、サフラワー（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）を含む農作物が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「植物部分」という用語は、葉、茎、根、花、果実、葉、茎、根、花、果実から得られた植物細胞、葉、茎、根、花、果実から得られた植物抽出物、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない植物の任意の部分を指す。本明細書で使用される「植物抽出物」という用語は、植物、植物の一部、植物細胞、またはそれらの組み合わせを物理的に（例えば、凍結し、続いて好適な緩衝液中での抽出によって）、機械的に（例えば、植物もしくは植物の一部を粉砕もしくは均質化し、続いて好適な緩衝液中での抽出によって）、酵素的に（例えば、細胞壁分解酵素を使用して）、化学的に（例えば、１つ以上のキレート剤もしくは緩衝液を使用して）、またはそれらの組み合わせで処理した後に得られる植物由来の生成物を指す。植物抽出物をさらに処理して、望ましくない植物成分、例えば、細胞壁の破片を除去し得る。植物抽出物は、植物、植物の一部、または植物細胞からの１つ以上の成分、例えば、植物、植物の一部、または植物細胞からのタンパク質（タンパク質複合体、タンパク質超構造、および／もしくはＶＬＰを含む）、核酸、脂質、炭水化物、またはそれらの組み合わせの回収を助けるために得てもよい。植物抽出物がタンパク質を含む場合、そのとき、それはタンパク質抽出物と呼ばれ得る。タンパク質抽出物は、植物組織からの１つ以上のタンパク質、タンパク質複合体、タンパク質超構造、および／またはＶＬＰを含む、粗植物抽出物、部分的に精製された植物もしくはタンパク質抽出物、または精製された生成物であり得る。必要に応じて、タンパク質抽出物もしくは植物抽出物は、当業者に既知である技術を使用して部分的に精製され得、例えば、抽出物は、塩もしくはｐＨ沈殿、遠心分離、勾配密度遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせに供され得る。当業者に既知である技術を使用して、タンパク質抽出物も精製し得る。
本明細書で使用される「核酸セグメント」という用語は、目的のタンパク質をコードする核酸の配列を指す。核酸の配列に加えて、核酸セグメントは、核酸の配列に作動可能に連結された調節領域およびターミネーターを含む。調節領域は、例えば、プロモーター、および任意選択で、プロモーターに作動可能に連結されたエンハンサーエレメントを含み得る。
本明細書で使用される「核酸複合体」という用語は、２つまたは２つより多い核酸セグメントの組み合わせを指す。２つまたは２つより多い核酸セグメントは、単一の核酸中に存在し得、その結果、核酸複合体は、２つまたは２つより多い核酸セグメントを含み、各核酸セグメントは、調節領域およびターミネーターの制御下にある。あるいは、核酸複合体は、２つ以上の別々の核酸を含み得、各核酸は、１つまたは複数の核酸セグメントを含み、各核酸セグメントは、調節領域およびターミネーターの制御下にある。例えば、核酸複合体は、２つの核酸セグメントを含む１つの核酸を含み得、核酸複合体は、２つの核酸を含み得、各核酸は、１つの核酸セグメントを含み得、または核酸複合体は、２つもしくは２つより多い核酸を含み得、各核酸は、１つもしくは複数の核酸セグメントを含む。
本明細書で使用される「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、外因性核酸配列を宿主細胞（例えば、植物細胞）に移入し、宿主細胞における外因性核酸配列の発現を指示するための組換え核酸を指す。「発現カセット」は、宿主細胞における目的の核酸の転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、かつそれらに使用可能に（もしくは作動可能に）連結された目的の核酸を含むヌクレオチド配列を指す。当業者が理解するように、発現カセットは、植物宿主において活性である任意の配列である終結（ターミネーター）配列を含み得る。例えば、終結配列は、二部ＲＮＡウイルス、例えば、コモウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメントに由来してもよく、終結配列は、ＮＯＳターミネーターであってもよく、または終結配列は、アルファルファプラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲから得られてもよい。
本開示の構築物は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含み得る。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる任意の他の調節シグナルを含有する。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸トラックを付加することによって特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは、一般に、標準型５’ＡＡＴＡＡＡ−３’との相同性の存在によって認識されるが、変種は、珍しくない。好適な３’領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのアグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子およびダイズ貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子、リブロース−１，５−ビスホスファートカルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照により本明細書に組み込まれる）、プラストシアニン発現の調節に使用されるターミネーターのポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域である。
「調節領域」、「調節エレメント」、または「プロモーター」とは、常にではないが典型的には、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成され得る遺伝子のタンパク質コード領域の上流にある核酸の一部を意味する。調節領域が活性であり、目的のヌクレオチド配列と機能的に関連しているか、または作動可能に連結されている場合、これは、目的のヌクレオチド配列の発現をもたらし得る。調節エレメントは、器官の特異性を媒介することができ得るか、または発生的もしくは一時的な遺伝子活性化を制御することができ得る。「調節領域」には、プロモーターエレメント、基本的なプロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘導可能なエレメント、負の調節エレメントまたは転写エンハンサーなどのプロモーター活性を媒介するエレメントが含まれる。本明細書で使用される「調節領域」はまた、転写後に活性であるエレメント、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流の活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子などの遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。これらの後者のエレメントのいくつかは、コード領域の近位にあり得る。
本開示の文脈において、典型的には、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、常にではないが通常、構造遺伝子のコード配列の上流（５’）にある、ＤＮＡの配列を指し、これは、特定の部位で転写を開始するために必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子の認識を提供することによるコード領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内にある他のヌクレオチド配列、または配列の３’もまた、目的のコード領域の発現の調節に寄与し得ることが理解されるべきである。特定の部位での開始を確実にするためにＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子の認識を提供する調節エレメントの例は、プロモーターエレメントである。すべてではないが、ほとんどの真核生物プロモーターエレメントは、転写開始部位の約２５塩基対上流に通常位置するアデノシンおよびチミジンのヌクレオチド塩基対から構成される保存された核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基本的なプロモーターエレメント、および遺伝子発現を改変する他の調節エレメントを含み得る。
発達的に調節されている、誘導性または構成的であるものを含む、いくつかのタイプの規制地域がある。発達的に調節されるか、またはその制御下にある遺伝子の差次的発現を制御する調節領域は、その器官または組織の発達中の特異的な時間に、特定の器官または器官の組織内で活性化される。しかしながら、発達的に調節されるいくつかの調節領域は、特異的な発達段階で特定の器官または組織内で優先的に活性であり得、それらはまた、発達的に調節される方法で、または植物内の他の器官もしくは組織でも基礎レベルで活性であり得る。組織特異的調節領域の例、例えば、種子特異的調節領域は、ナピンプロモーター、およびクルシフェリンプロモーターを含む（Ｒａｓｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：５９５−５９９；Ｂｉｌｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１２５−１３０）。葉特異的プロモーターの例には、プラストシアニンプロモーターが含まれる（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，１２５，９７８を参照）。
誘導性調節領域は、インデューサーに応答して、１つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化することができる領域である。インデューサーがない場合、ＤＮＡ配列または遺伝子は、転写されない。典型的には、転写を活性化するために誘導性調節領域に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性型で存在し得、その後、インデューサーによって直接的または間接的に活性型に変換される。しかしながら、タンパク質因子も存在しなくてもよい。インデューサーは、タンパク質、代謝物、成長調節剤、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学薬剤、または熱、寒さ、塩、もしくは毒性要素によって直接的、または病原体もしくはウイルスなどの病因物質の作用によって間接的に課せられる生理学的ストレスであり得る。誘導性調節領域を含有する植物細胞は、噴霧、水やり、加熱、または類似の方法などによって、細胞または植物にインデューサーを外部から適用することによって、インデューサーに曝露され得る。誘導性調節要素は、植物または非植物遺伝子のいずれかに由来し得る（例えば、Ｇａｔｚ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｎｋ，Ｉ．Ｒ．Ｐ．，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．３，３５２−３５８）。潜在的な誘導性プロモーターの例には、テトラカイニン誘導性プロモーター（Ｇａｔｚ，Ｃ．，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，８９−１０８）、ステロイド誘導性プロモーター（Ａｏｙａｍａ，Ｔ．ａｎｄ Ｃｈｕａ，Ｎ．Ｈ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２，３９７−４０４）およびエタノール誘導性プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６，１２７−１３２；Ｃａｄｄｉｃｋ，Ｍ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６，１７７−１８０）サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ，Ｉ．ａｎｄ Ｋｉｅｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０，１００９−１０１９；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，９８２−９８５）およびオーキシン誘導性エレメントＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９，１９６３−１９７１）が含まれるがこれらに限定されない。
構成的調節領域は、植物の様々な部分全体にわたって、かつ植物の発達を通して継続的に遺伝子の発現を指示する。既知である構成的調節エレメントの例には、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写物に関連するプロモーター（ｐ３５Ｓ；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−８１２；参照により本明細書に組み込まれる）、ライスアクチン１（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：１１５５−１１６５）、アクチン２（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１０：１０７−１２１）、またはｔｍｓ ２（Ｕ．Ｓ．５，４２８，１４７）、およびトリオースホスファートイソメラーゼ１（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：４５９−４６７）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、タバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：９９５−１００４）；キャッサバ静脈モザイクウイルスプロモーター、ｐＣＡＳ（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）；リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーター、ｐＲｂｃＳ：（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ｐＵｂｉ（単子葉植物および双子葉植物用）が含まれる。
本明細書で使用される「構成的」という用語は、構成的調節領域の制御下にあるヌクレオチド配列が、すべての細胞型で同じレベルで発現されることを必ずしも示さないが、その配列が、存在量の変動がしばしば観察されるにもかかわらず、広範囲の細胞型で発現されることを示す。
上記のような発現構築物は、ベクター中に存在し得る。ベクターは、生物または宿主のゲノムへの発現カセットの移入および組み込みを可能にする境界配列を含み得る。構築物は、植物のバイナリーベクター、例えば、ｐＰＺＰに基づくバイナリー変換ベクターであり得る（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ、ｅｔ ａｌ．１９９４）。他の例示的な構築物には、ｐＢｉｎ１９が含まれる（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｄ．Ａ．，Ｌ．Ｗ．Ｈａｒｒｉｓ−Ｈａｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７：４０５−４０９を参照）。
本明細書で使用される「天然」、「天然タンパク質」、または「天然ドメイン」という用語は、野生型タンパク質またはドメインのアミノ酸配列と同一の一次アミノ酸配列を有するタンパク質またはドメインを指す。天然のタンパク質またはドメインは、野生型配列と１００％の配列類似性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。天然アミノ酸配列はまた、ヒトコドン（ｈＣｏｄ）最適化ヌクレオチド配列、または野生型ヌクレオチド配列と比較した場合に増加したＧＣ含有量を含むヌクレオチド配列によってコードされ得るが、ただし、ｈＣｏｄヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が、天然アミノ酸配列と１００％の配列同一性を示すことを条件とする。
アミノ酸、アミノ酸配列、またはタンパク質が「改変されている」と述べられている場合、それは、改変されたアミノ酸、アミノ酸配列、またはタンパク質が由来する対応する天然もしくは野生型のアミノ酸、アミノ酸配列、またはタンパク質と比較した場合に、アミノ酸、アミノ酸配列、もしくはタンパク質が何らかの方法で変更されていることを意味する。例えば、改変アミノ酸、アミノ酸配列、またはタンパク質は、置換（すなわち、置き換え）または突然変異による１つ以上のアミノ酸の置き換えを含み得る。改変アミノ配列または改変タンパク質はまた、１つ以上の欠失アミノ酸を含み得るか、または１つ以上の挿入アミノ酸があり得る。そのような改変を実施するための技術は、当業者に周知である。
「ヒトコドン最適化」または「ｈＣｏｄ」ヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列とは、ヒトヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチド配列内で一般的に見られるコドン使用頻度に近づくオリゴヌクレオチド配列またはそのフラグメントの合成のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。「増加したＧＣ含有量」とは、対応する天然オリゴヌクレオチド配列と比較した場合、ＧＣ含有量の増加、例えば、オリゴヌクレオチド配列のコーディング部分の長さにわたって、約１〜約３０％、またはそれらの間の任意の量を含むコドン使用頻度に近づくためのオリゴヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントの合成のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。例えば、オリゴヌクレオチド配列のコーディング部分の長さにわたって、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０％、またはそれらの間の任意の量から。以下に説明するように、ヒトコドン最適化ヌクレオチド配列、または増加したＧＣ含有量（野生型ヌクレオチド配列と比較した場合）を含むヌクレオチド配列は、ヒト以外の最適化された（もしくはより低いＧＣ含有量）ヌクレオチド配列の発現と比較した場合、植物、植物の一部、または植物細胞内での発現の増加を示す。
ノロウイルスＶＰ１変異タンパク質（改変ＶＰ１タンパク質、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質、ノロウイルスＶＰ１タンパク質の変異体、ＧＩＩ．４ ＶＰ１変異タンパク質、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質、ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の変異体などとも称される）および植物においてノロウイルス改変ＶＰ１タンパク質を産生する方法が本明細書に記載されている。改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質のいくつかは、ＧＩＩ．４ ＶＰ１のＳドメインおよび／またはＰドメインに特異的な改変、例えば置換または突然変異を含み、かつノロウイルスＧＩＩ．４遺伝子型ＶＰ１タンパク質の変異体である。さらに、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１融合タンパク質であり得、Ｓドメインは、第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメインまたはＰドメインの一部に融合した第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来する。ノロウイルスＧＩＩ．４遺伝子型では、特異的なアミノ酸を改変すると、野生型ＶＰ１と比較してＶＰ１特性が改善されることが観察されている。ＶＰ１の改善された特性の例には、改変または置換（複数可）を含まない同じ遺伝子型の野生型ＶＰ１と比較して、植物細胞で発現した場合のＶＰ１タンパク質収量の増加；改変または置換（複数可）を含まない同じ遺伝子型の野生型ＶＰ１と比較して、改変ＶＰ１タンパク質で構成されるＶＬＰの密度の増加（例えば、密度勾配分離、ならびに任意選択でＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウエスタン分析を使用して決定）；改変または置換（複数可）を含まない同じ遺伝子型の野生型ＶＰ１を含むＶＬＰの完全性、安定性、または両方と比較して、改変ＶＰ１タンパク質で構成されるＶＬＰの完全性、安定性、または完全性および安定性の両方の改善；改変または置換（複数可）を含まない同じ遺伝子型の野生型レベルのＶＬＰ産生と比較して、植物細胞で発現された場合のＶＬＰ収量の増加；改変または置換（複数可）を含まない同じ遺伝子型の野生型ＶＰ１と比較して、２３ｎｍのＶＬＰとは対照的に３８ｎｍのＶＬＰに集合するＶＬＰのより高い割合；ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
図１Ｄおよび以下の表１に示すように、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２１０２；配列番号：１；図５Ａ；ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）とＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３；図５Ｃ；Ｍｉｒａｎｄａ ｄｅ Ｇｒａａｆ，Ｅｒａｓｍｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｏｔｔｅｒｄａｍから厚意で提供された配列）とでは１１の違いがある。違いのうち４つは、１１９、１４４、１４５、および１７４位のＳドメインにあり、７つの違いは、２９７、３１０、３３３、３３９、３６８、３７３、および３９３位のＰドメインにある。
Ｓドメインの同等物
当業者は、１１９および１４５位にイソロイシン、１４４位にメチオニン、および１７４位にセリン（Ｖ１１９Ｉ、Ｉ１４４Ｍ、Ｖ１４５Ｉ、およびＰ１７４Ｓ）を含むＧＩＩ．４／２０１２のＳドメインが、構造的および機能的にＧＩＩ．４／２０１５からのＳドメインと同等であり、例えば、８０位（Ｐ８０Ｓ）にセリンを含むＧＩＩ．４／２０１２ Ｓドメインが、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、およびＳ１７４Ｐ置換を含むＧＩＩ．４／２０１５ Ｓドメインと構造的および機能的に同等であることを理解するであろう。結果として：
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ａ３９Ｖ、Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ａ３９Ｖ、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ａ３９Ｖ、Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ａ３９Ｖ、Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る。
当業者は、１１９および１４５位にイソロイシン、１４４位にメチオニン、および１７４位にセリン（Ｖ１１９Ｉ、Ｉ１４４Ｍ、Ｖ１４５Ｉ、およびＰ１７４Ｓ）を含むＧＩＩ．４／２０１２のＳドメインが、構造的および機能的にＧＩＩ．４／２０１５からのＳドメインと同等であり、例えば、８０位（Ｐ８０Ｓ）にセリンを含むＧＩＩ．４／２０１２ Ｓドメインが、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、およびＳ１７４Ｐ置換を含むＧＩＩ．４／２０１５ Ｓドメインと構造的および機能的に同等であることを理解するであろう。結果として：
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ａ３９Ｖ、Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ａ３９Ｖ、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１２（Ａ３９Ｖ、Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ）Ｓドメインは、これらのＳドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１５（Ａ３９Ｖ、Ｒ５３Ｉ、Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメインの省略形として使用され得る。
Ｐドメインの同等物
類似の方法で、当業者は、置換Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｖ３３３Ｍ、Ｒ３３９Ｋ、Ｅ３６８Ｑ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎを含むＧＩＩ．４／２０１２のＰドメインが、ＧＩＩ．４／２０１５からのＰドメインと構造的および機能的に同等であり、例えば、Ｍ３３３Ｖ置換を含むＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメインが、以下の置換：Ｈ２９７Ｒ、Ｎ３１０Ｄ、Ｋ３３９Ｒ、Ｑ３６８Ｅ、Ｈ３７３Ｒ、Ｎ３９３Ｇ（３３３位のアミノ酸は、ＧＩＩ．４／２０１２ではすでに「Ｖ」である。表１を参照）を含むＧＩＩ．４／２０１２ Ｐドメインを示すことと同じであることを理解するであろう。結果として：
−ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ）Ｐドメインは、これらのＰドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｒ３３９Ｋ、Ｅ３６８Ｑ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）Ｐドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１５（Ｑ３６８Ｅ）Ｐドメインは、これらのＰドメインが同じ配列を構成するため、「ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｖ３３３Ｍ、Ｒ３３９Ｋ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）」Ｐドメイン（３６８位のアミノ酸は、すでにＧＩＩ．４／２０１２の「Ｅ」である）の省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ、Ｑ３６８Ｅ）Ｐドメインは、これらのＰドメインが同じ配列を構成するため、「ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｒ３３９Ｋ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）」Ｐドメインの省略形として使用され得る。
類似の方法で、当業者は、置換Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｖ３３３Ｍ、Ｒ３３９Ｋ、Ｅ３６８Ｑ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎを含むＧＩＩ．４／２０１２のＰドメインが、ＧＩＩ．４／２０１５からのＰドメインと構造的および機能的に同等であり、例えば、Ｍ３３３Ｖ置換を含むＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメインが、以下の置換：Ｈ２９７Ｒ、Ｎ３１０Ｄ、Ｋ３３９Ｒ、Ｑ３６８Ｅ、Ｈ３７３Ｒ、Ｎ３９３Ｇ（３３３位のアミノ酸は、ＧＩＩ．４／２０１２ではすでに「Ｖ」である。表１を参照）を含むＧＩＩ．４／２０１２ Ｐドメインを示すことと同じであることを理解するであろう。結果として：
−ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ）Ｐドメインは、これらのＰドメインが同じ配列を構成するため、ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｒ３３９Ｋ、Ｅ３６８Ｑ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）Ｐドメインの省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１５（Ｑ３６８Ｅ）Ｐドメインは、これらのＰドメインが同じ配列を構成するため、「ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｖ３３３Ｍ、Ｒ３３９Ｋ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）」Ｐドメイン（３６８位のアミノ酸は、すでにＧＩＩ．４／２０１２の「Ｅ」である）の省略形として使用され得る；
−ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ、Ｑ３６８Ｅ）Ｐドメインは、これらのＰドメインが同じ配列を構成するため、「ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｒ３３９Ｋ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）」Ｐドメインの省略形として使用され得る。
Ｓ＋Ｐドメインの同等物
当業者が理解するように、本明細書に記載の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、定義されたＧＩＩ．４ ＶＰ１改変を達成するために適切なアミノ酸置換を行うことによって得られてもよく、または例えば、ＧＩＩ．４／２０１２からのＳドメインは、本明細書に記載の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を産生するために、所望のアミノ酸置換と共にＧＩＩ．４／２０１５からのＰドメインに融合されてもよい。例えば、以下の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、構造的および機能的に同等である：
ｉ）ＧＩＩ．４／２０１２（Ｐ８０Ｓ）Ｓドメイン＋ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ）Ｐドメイン（融合ＧＩＩ．４ ＶＰ１）；
ｉｉ）ＧＩＩ．４／２０１５（Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメイン＋ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ）Ｐドメイン（ＧＩＩ．４／２０１５参照配列を使用）；および
ｉｉｉ）ＧＩＩ．４／２０１２（Ｐ８０Ｓ）Ｓドメイン＋ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｒ３３９Ｋ、Ｅ３６８Ｑ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）Ｐドメイン（ＧＩＩ．４／２０１２参照配列を使用）。
当業者が理解するように、本明細書に記載の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、定義されたＧＩＩ．４ ＶＰ１改変を達成するために適切なアミノ酸置換を行うことによって得られてもよく、または例えば、ＧＩＩ．４／２０１２からのＳドメインは、本明細書に記載の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を産生するために、所望のアミノ酸置換と共にＧＩＩ．４／２０１５からのＰドメインに融合されてもよい。例えば、以下の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、構造的および機能的に同等である：
ｉ）ＧＩＩ．４／２０１２（Ｐ８０Ｓ）Ｓドメイン＋ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ）Ｐドメイン（融合ＧＩＩ．４ ＶＰ１）；
ｉｉ）ＧＩＩ．４／２０１５（Ｐ８０Ｓ、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、Ｓ１７４Ｐ）Ｓドメイン＋ＧＩＩ．４／２０１５（Ｍ３３３Ｖ）Ｐドメイン（ＧＩＩ．４／２０１５参照配列を使用）；および
ｉｉｉ）ＧＩＩ．４／２０１２（Ｐ８０Ｓ）Ｓドメイン＋ＧＩＩ．４／２０１２（Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｒ３３９Ｋ、Ｅ３６８Ｑ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎ）Ｐドメイン（ＧＩＩ．４／２０１２参照配列を使用）。
本明細書に記載の他の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質はまた、参照配列としてのＧＩＩ．４／２０１２、ＧＩＩ．４／２０１５、またはＧＩＩ．４／２０１２＋ＧＩＩ．４／２０１５フュージョンを使用して上で概説したのと同様の方法で、産生、定義、または産生および定義の両方がされ得る。
したがって、本開示は、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質、および改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を産生する方法を提供する。改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａを参照；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）の任意の１つ以上のアミノ酸残基３９、５３、および８０でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１５の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；または
−ノロウイルス遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２、例えば、限定されないが、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５；図６Ａ）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６；図６Ｂ）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７；図６Ｃ）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８；図６Ｄ）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９；図６Ｅ）のＶＰ１の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
ならびに、
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３；図５Ｃ）の任意の１つ以上のアミノ酸残基３３３および３６８でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２の３３３および３６８位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；または
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１５、もしくは配列番号：３によって定義される配列と約８０〜約１００％のアミノ酸配列類似性、もしくはそれらの間の任意の量のアミノ酸配列類似性を有するＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の３３３位および３６８位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
を含むＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
上記のような改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする配列は、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量の増加、またはそれらの組み合わせに最適化され得る。
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａを参照；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）の任意の１つ以上のアミノ酸残基３９、５３、および８０でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１５の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；または
−ノロウイルス遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２、例えば、限定されないが、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５；図６Ａ）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６；図６Ｂ）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７；図６Ｃ）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８；図６Ｄ）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９；図６Ｅ）のＶＰ１の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
ならびに、
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３；図５Ｃ）の任意の１つ以上のアミノ酸残基３３３および３６８でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１２の３３３および３６８位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；または
−ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／２０１５、もしくは配列番号：３によって定義される配列と約８０〜約１００％のアミノ酸配列類似性、もしくはそれらの間の任意の量のアミノ酸配列類似性を有するＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の３３３位および３６８位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；
を含むＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
上記のような改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする配列は、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量の増加、またはそれらの組み合わせに最適化され得る。
本明細書に記載されるように、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質中のアミノ酸は、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を産生するために、置換、突然変異、または改変され得る。特異的な位置での置換、改変、または突然変異は、当業者が類似の特性を有するアミノ酸が、同定された位置でのアミノ酸の代わりになり得ることを理解するので、本明細書で例示される、または例に示されるようなアミノ酸置換に限定されない。例えば、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、アミノ酸の保存されたまたは保存的な置換を含有し得る。
「残基」という用語は、アミノ酸を指し、この用語は、「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という用語と交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「保存された置換」または「保存的置換」という用語は、記載の置換とは異なるが、それと同じクラスのアミノ酸にある、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の配列でのアミノ酸残基の存在を指す。例えば、非極性アミノ酸を使用して非極性アミノ酸を置き換え、芳香族アミノ酸を使用して芳香族アミノ酸を置き換え、極性非荷電アミノ酸を使用して極性非荷電アミノ酸を置き換え、かつ／または荷電アミノ酸を使用して荷電アミノ酸を置き換えてもよい）。加えて、保存的置換は、対応する野生型アミノ酸を置き換えるアミノ酸と同じ符号であり、一般に類似の大きさの界面ハイドロパシー値を有するアミノ酸を包含することができる。
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、およびプロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）を指し；「芳香族残基」（または芳香族アミノ酸）という用語は、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、およびトリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）を指し；「極性非荷電アミノ酸」という用語は、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、およびグルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）を指し；「荷電アミノ酸」という用語は、負に荷電したアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、ならびに正に荷電したアミノ酸であるリジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、およびヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）を指す。アミノ酸の他の分類は、以下のとおりである：疎水性側鎖を有するアミノ酸（脂肪族）：アラニン（Ａ、Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、およびバリン（Ｖ、Ｖａｌ）；疎水性側鎖を有するアミノ酸（芳香族）：フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；極性中性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、およびスレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；帯電した側鎖を有するアミノ酸（酸性）：アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；帯電した側鎖を有するアミノ酸（塩基性）：アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）、グリシンＧ、Ｇｌｙ）、およびプロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）。
保存的アミノ酸置換は、元の置換または改変と類似の得られた改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の活性に対する影響を与える可能性が高い。保存的置換に関するさらなる情報は、例えば、Ｂｅｎ Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１６９：７５１−７５７，１９８７），Ｏ’Ｒｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，７７：２３７−２５１，１９８９），Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳｃＬ，３：２４０−２４７，１９９４），Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１３２１−１３２５，１９８８）に見出すことができる。
ＢＬＯＳＵＭマトリックスは、ポリペプチド配列の関連性を決定するために一般的に使用される（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）。ＢＬＯＳＵＭ９０マトリックスの高度に保存されたターゲット周波数には、９０％の同一性のしきい値を使用した。ＢＬＯＳＵＭ６５マトリックスには、６５％の同一性のしきい値を使用した。Ｂｌｏｓｕｍマトリックスのゼロ以上のスコアは、表２で選択された同一性のパーセンテージで「保存的置換」と見なされる。以下の表は、保存的アミノ酸置換の例を示している：表２。
本明細書に記載の改変について、アミノ酸は、表２に概説されるような非常に高度に保存された置換、高度に保存された置換、または保存された置換、ならびに上記のような芳香族、極性、極性非荷電、極性中性、または非極性、負荷電、正に帯電した疎水性アミノ酸を使用して置換され得る。
例えば、改変Ｐ８０Ｓは、８０位のプロリンを極性中性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸であるセリンで置換することを含む。この位置のグルタミンはまた、極性中性側鎖を有することを特徴とする代替アミノ酸、例えば、アスパラギン、システイン、またはスレオニンのいずれか、すなわち、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴであるＰ８０Ｘで置換され得る。
アラニンを３９位でバリン（疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ａ３９Ｖによって、バリンに加えて、アラニンも疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニン、すなわち、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであるＡ３９Ｘで置換され得る。
アルギニンを５３位でイソロイシン（疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ｒ５３Ｉによって、イソロイシンに加えて、アルギニンも疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、ロイシン、バリン、アラニン、またはメチオニン、すなわち、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭであるＲ５３Ｘで置換され得る。
メチオニンを３３３位でバリン（疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ｍ３３３Ｖによって、バリンに加えて、メチオニンも疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、イソロイシンまたはロイシン、すなわち、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＡであるＭ３３３Ｖで置換され得る。
グルタミンを３６８位でグルタミン酸（極性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ｑ３６８Ｅによって、グルタミン酸に加えて、グルタミンも極性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、アスパラギンまたはアスパルタート、すなわち、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、またはＤであるＱ３６８Ｘで置換され得る。
改変または変異型ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質はさらに、第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメイン、または第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメインの一部に融合した第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメインを含むノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１融合タンパク質であり得る。例えば、第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメインは、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（配列番号：１；図５Ａを参照；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）の３９、５３、および８０位の任意の１つ以上のアミノ酸で、またはそれらとの配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸で置換、突然変異、または改変され得、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（配列番号：３；図５Ｃ）の３３３および３６８位の任意の１つ以上のアミノ酸で、またはそれらとの配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸で改変、置換、または突然変異される、第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメイン、またはＰドメインの一部に融合され得る。
図５Ａに示す配列を参照すると、ノロウイルスＧＩＩ．４配列ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）は、他のノロウイルスＶＰ１配列をアラインさせ得る参照配列として使用される。
同じ植物かつ同じ条件下で発現させた場合（例えば、図２Ａに示した結果を図３Ａおよび４Ａの結果と比較する）、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３）から得られた野生型または天然のＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の収量と比較した場合に、本明細書に記載されるような改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の発現が増加することが観察された。加えて、第１のノロウイルス遺伝子型変異体のＶＰ１タンパク質からの改変Ｓドメインおよび第２の（異なる）ノロウイルス遺伝子型変異体から得られたＶＰ１タンパク質からの改変Ｐドメインを含むＧＩＩ．４ ＶＰ１融合タンパク質の発現は、同じ植物かつ同じ条件下で発現させた場合、第１または第２のノロウイルス遺伝子型のいずれかから得られた天然ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の収量と比較した場合にＶＰ１融合タンパク質の収量を増加させ得る。例えば、第１のノロウイルス遺伝子型変異体は、ＧＩＩ．４／２０１２であり得、第２のノロウイルス遺伝子型変異体は、ＧＩＩ．４／２０１５であり得る。
また、植物において、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＧＩＩ．４ ＶＬＰの産生を増加させる方法も本明細書で提供される。例えば、方法は、本明細書に記載のように、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする核酸を植物、植物の一部、または植物細胞に導入することを伴い得る。１つまたは複数の改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、１つまたは複数の改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰを産生するために、植物、植物の一部、または植物細胞で発現され得る。あるいは、この方法は、本明細書に記載されるように改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする核酸を含む植物、植物の一部、または植物細胞を提供すること、および１つまたは複数の改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰを産生するために、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする核酸を発現することを含み得る。
ＧＩＩ．４ ＶＰ１改変タンパク質を含むＶＬＰを産生する方法はまた、植物、植物の一部、または植物細胞においてＶＰ２タンパク質をコードする核酸配列を共発現するステップを含み得る。
本明細書で使用される「単一構築物（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」または「単一構築物（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」という用語は、単一の核酸配列を含む核酸ベクターを指す。本明細書で使用される「二重構築物（ｄｕａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」または「二重構築物（ｄｕａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」という用語は、２つの核酸配列を含む核酸ベクターを指す。
共発現とは、２つ以上のヌクレオチド配列の導入および発現を意味し、２つ以上のヌクレオチド配列のそれぞれは、目的のタンパク質、または植物、植物の一部、もしくは植物細胞内の目的のタンパク質のフラグメントをコードする。２つ以上のヌクレオチド配列は、１つのベクター内の植物、植物の一部、または植物細胞に導入され得、その結果、２つ以上のヌクレオチド配列のそれぞれは、別々の調節領域（例えば、二重構築物を含む）の制御下にある。あるいは、２つ以上のヌクレオチド配列は、別々のベクター（例えば、単一の構築物を含む）内の植物、植物の一部、または植物細胞に導入され得、各ベクターは、対応する核酸の発現のための適切な調節領域を含む。例えば、それぞれ別々のベクター上にあり、かつ別々のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主に導入された２つのヌクレオチド配列は、真空浸潤前に各Ａ．ツメファシエンス宿主の懸濁液を所望の容量（例えば、等しい容量、または各Ａ．ツメファシエンス宿主の比率は、変更され得る）で混合することによって、共発現され得る。この方法で、複数のＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）懸濁液の共浸潤により、複数の導入遺伝子の共発現が可能になる。
本明細書に記載されるようにノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１改変または変異タンパク質をコードすることを含む核酸は、植物、植物の一部、または植物細胞におけるノロウイルスＶＰ１改変タンパク質の発現を増強する配列をさらに含み得る。発現を増強する配列は、ノロウイルスＶＰ１改変タンパク質をコードする核酸と機能的に関連するＣＰＭＶエンハンサーエレメント、または植物由来の発現エンハンサーを含み得る。ＶＰ１改変タンパク質または変異タンパク質をコードする配列は、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量の増加、またはそれらの組み合わせに最適化され得る。さらに、ＶＰ２をコードする核酸は、ＶＰ１変異体または改変タンパク質をコードする配列と共に共発現され得る。ＶＰ２をコードする核酸の共発現は、１つまたは複数のタイプのＶＰ１改変タンパク質もしくは突然変異タンパク質を含むＶＬＰの収量の増加、密度の増加、完全性の増加、またはそれらの組み合わせをもたらし得る。
本明細書で使用される「ＣＰＭＶエンハンサーエレメント」という用語は、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２ポリペプチドを調節する５’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列または当技術分野で既知の改変ＣＰＭＶ配列を指す。例えば、ＣＰＭＶエンハンサーエレメントまたはＣＰＭＶ発現エンハンサーは、ＷＯ２０１５／１４３６７；ＷＯ２０１５／１０３７０４；ＷＯ２００７／１３５４８０；ＷＯ２００９／０８７３９１；Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｆ．、およびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ Ｇ．Ｐ．、（２００８，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：ｐｐ．１２１２−１２１８）に記載されているようなヌクレオチド配列を含み、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＰＭＶエンハンサー配列は、それらが結合している下流の異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を増強することができる。ＣＰＭＶ発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ ＨＴ、ＣＰＭＶＸ（Ｘ＝１６０、１５５、１５０、１１４）、例えば、ＣＰＭＶ １６０、ＣＰＭＶＸ＋（Ｘ＝１６０、１５５、１５０、１１４）、例えば、ＣＰＭＶ １６０＋、ＣＰＭＶ−ＨＴ＋、ＣＰＭＶ ＨＴ＋［ＷＴ１１５］、またはＣＰＭＶ ＨＴ＋［５１１］を含み得る（ＷＯ２０１５／１４３５６７；ＷＯ２０１５／１０３７０４、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＰＭＶ発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ発現エンハンサー配列および目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結される調節領域を含む植物発現システム内で使用され得る。
本明細書で使用される「植物由来発現エンハンサー」という用語は、植物から得られたヌクレオチド配列、５’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列を指す。植物由来の発現エンハンサーの例は、米国仮特許出願第６２／６４３，０５３号（２０１８年３月１４日出願；参照により本明細書に組み込まれる）またはＤｉａｍｏｓ Ａ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１６，Ｆｒｏｎｔ Ｐｌｔ Ｓｃｉ．７：１−１５；参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。植物由来の発現エンハンサーは、６２／６４３，０５３に記載されているように、ｎｂＭＴ７８、ｎｂＡＴＬ７５、ｎｂＤＪ４６、ｎｂＣＨＰ７９、ｎｂＥＮ４２、ａｔＨＳＰ６９、ａｔＧＲＰ６２、ａｔＰＫ６５、ａｔＲＰ４６、ｎｂ３０Ｓ７２、ｎｂＧＴ６１、ｎｂＰＶ５５、ｎｂＰＰＩ４３、ｎｂＰＭ６４、およびｎｂＨ２Ａ８６から選択され得る。植物由来の発現エンハンサーは、植物由来の発現エンハンサー配列および目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結される調節領域を含む植物発現システム内で使用され得る。
「５’ＵＴＲ」または「５’非翻訳領域」または「５’リーダー配列」という用語は、翻訳されていないｍＲＮＡの領域を指す。５’ＵＴＲは、典型的には、転写開始部位で始まり、翻訳開始部位またはコーディング領域の開始コドンの直前で終わる。５’ＵＴＲは、ｍＲＮＡ転写産物の安定性および／または翻訳を調節し得る。
「作動可能に連結された」とは、特定の配列が直接的または間接的のいずれかで相互作用して、核酸配列の発現の媒介または調節などの意図された機能を実施することを意味する。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
１つまたは複数のタイプの改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質が植物、植物の一部、または植物細胞で発現する場合、１つまたは複数の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質が自己または自動集合してＶＬＰになる。植物または植物の一部は、ＶＬＰの完全性を維持するために好適な抽出および精製条件下で収穫され得、１つまたは複数のタイプのＶＰ１変異体（改変）タンパク質を含むＶＬＰは、精製され得る。１つまたは複数のＧＩＩ．４ ＶＰ１改変タンパク質または突然変異タンパク質はまた、ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列と共発現され得、その結果、ＶＬＰは、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質およびＶＰ２タンパク質の両方を含み得る。本開示はまた、植物、植物の一部、または植物細胞内での本明細書に記載されるような１つまたは複数のタイプのＧＩＩ．４ ＶＰ１改変または変異タンパク質の産生、ならびに植物、植物の一部、または植物細胞からの１つまたは複数のタイプのＧＩＩ．４ ＶＰ１改変または突然変異タンパク質の抽出および精製を提供して、改変または突然変異ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含む、植物物質、植物抽出物、またはタンパク質抽出物を産生する。
植物物質、植物抽出物、または本明細書に記載のようにノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１改変または突然変異タンパク質を含むタンパク質抽出物も提供される。植物物質、植物抽出物、またはタンパク質抽出物を使用して、対象においてノロウイルス感染に対する免疫を誘導し得る。あるいは、ＧＩＩ．４ ＶＰ１改変もしくは突然変異タンパク質、またはＧＩＩ．４ ＶＰ１改変もしくは突然変異タンパク質（および任意選択で、ＶＰ２）を含むＶＬＰは、精製または部分的に精製され得、精製または部分的に精製された調製物を使用して、対象のノロウイルス感染に対する免疫を誘導し得る。
本開示はまた、免疫応答を誘導するための、１つまたは複数のタイプの改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質、または１つまたは複数の改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質、および任意選択でＶＰ２を含むＶＬＰの有効量、ならびに薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または添加剤を含む組成物を提供する。
また、１つもしくは複数のタイプの突然変異（改変）ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質または１つもしくは複数のタイプのノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１改変もしくは突然変異タンパク質を含むＶＬＰを経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、直腸、または膣内で対象に投与することを含む、対象においてノロウイルス感染に対する免疫を誘導する方法も本明細書に提供される。
本明細書で使用される「ノロウイルス」という用語は、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを有することを特徴とするカリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科のノロウイルス属のエンベロープを持たないウイルス株を指す。ノロウイルスゲノムの長さは、７，６５４ヌクレオチドである。ＯＲＦ１は、ウイルスの３Ｃ様プロテアーゼによってＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む６つのタンパク質に切断される非構造的ポリタンパク質をコードする。ＯＲＦ２およびＯＲＦ３は、それぞれメジャー（ＶＰ１）およびマイナー（ＶＰ２）のキャプシドタンパク質をコードする（図１Ａを参照）。
本明細書に開示されるようなノロウイルス株は、遺伝子型ＧＩＩ．４の任意の既知のノロウイルス株だけでなく、経時的に定期的に発生することが知られている既知のＧＩＩ．４ノロウイルス株への改変も含む。この点で、ＧＩＩ．４の遺伝子型内変動は、周知である（例えば、Ｐａｒｒａ Ｇ．Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，２０１７ ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １３（１）：ｅ１００６１３６，ｄｏｉ：１０．３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００６１３６を参照；参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ノロウイルス株には、（それらのアミノ酸配列によって記載されるように）ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａ；ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）、ＧＩＩ／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３；図５Ｃ；Ｍｉｒａｎｄａ ｄｅ Ｇｒａａｆ，Ｅｒａｓｍｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｏｔｔｅｒｄａｍから厚意で提供された配列）、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５；図６Ａ）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６；図６Ｂ）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７；図６Ｃ）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８；図６Ｄ）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９；図６Ｅ）が含まれ得るが、これらに限定されない。ノロウイルス株にはまた、上記の株の上記のノロウイルス株のいずれかを有するＶＰ１タンパク質に対して、約３０〜１００％またはその間の任意の量のアミノ酸配列同一性を有する株が含まれるが、だたし、ＶＰ１タンパク質が対象に投与された場合に、ＶＰ１タンパク質が、対象におけるノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。例えば、ノロウイルス株には、上記の株の上記のノロウイルス株のいずれかを有するＶＰ１タンパク質に対して、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００％、またはそれらの間の任意の量のアミノ酸配列同一性（配列類似性；パーセント同一性；パーセント類似性）を有する株も含まれるが、だたし、ＶＰ１タンパク質が対象に投与された場合に、ＶＰ１タンパク質が、対象におけるノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ノロウイルス株には、上記の株の上記のノロウイルス株のいずれかを有するＶＰ１タンパク質をコードする約８０〜１００％またはその間の任意の量のヌクレオチド配列同一性を有する株も含まれるが、だたし、ＶＰ１タンパク質が対象に投与された場合に、コードされるＶＰ１タンパク質が、対象におけるノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。例えば、ノロウイルス株には、上記の株の上記のノロウイルス株のいずれかを有するＶＰ１タンパク質をコードする配列に対して、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００％、またはそれらの間の任意の量のヌクレオチド配列同一性（配列類似性；パーセント同一性；パーセント類似性）を有する株も含まれるが、だたし、ＶＰ１タンパク質が対象に投与された場合に、コードされるＶＰ１タンパク質が、対象におけるノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。
「パーセント類似性」、「配列類似性」、「パーセント同一性」、または「配列同一性」という用語は、特定の配列を指す場合、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧソフトウェアプログラムに記載されているように、または手動アラインメントおよび目視検査によって使用される（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５補足を参照）。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）のアルゴリズムを使用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）のアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４）の類似性メソッドの検索によって、これらのアルゴリズム（例えば：ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピュータ化された実装によって、行うことができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０は、本明細書に記載のパラメータと共に、本発明の核酸およびアミノ酸のパーセント配列同一性を決定するために使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用し得る。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両方の鎖の比較を使用し得る。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターから公開されている（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）。
本明細書で使用される「ＶＰ１」という用語は、本明細書に記載の１つ以上のノロウイルス株のＯＲＦ２によってコードされるタンパク質またはポリペプチドに類似したアミノ酸配列を含むノロウイルスメジャーキャプシドタンパク質またはポリペプチドを指す。メジャーキャプシドタンパク質は、シェル（Ｓ）ドメインおよび突出（Ｐ）ドメインの２つの主要なドメインに折りたたまれる（図１Ｂを参照）。ＶＰ１タンパク質は、ビリオン粒子またはＶＬＰに組み込まれると、二量体を形成する（図１Ｃ）。ＶＰ１のＮ末端の最初の部分はＳドメインを含み、ＶＰ１ポリペプチドの残りはＰドメインを含む。Ｎ末端ＶＰ１タンパク質のアミノ酸は、Ｓドメインを含む。折りたたまれると、ＶＰ１は、図１Ｂに示すように、球状のＳドメイン（リボン構造の下部）およびＰドメイン（リボン構造の上部）を含む立体構造を取る。
図１Ｃに示すように、ＶＰ１タンパク質は、Ｐドメイン相互作用を介して二量体化する。これらの相互作用は、ノロウイルスキャプシド分子の自発的な集合を安定させる。
本明細書で使用される「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」、ＶＬＰ、「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」、または「ＶＬＰｓ」という用語は、１つまたは複数のタイプのノロウイルスＶＰ１タンパク質、１つまたは複数のタイプのＶＰ１改変タンパク質、またはそれらの組み合わせを含み、かつノロウイルスゲノムのすべての部分を欠く非複製、非エンベロープ、非感染性ウイルスキャプシド構造に自己組織化するノロウイルスウイルス様粒子（複数可）を指す。例えば、ＶＬＰは、本明細書に記載されるような１つのタイプの改変ＶＰ１タンパク質を含んでもよく、またはＶＬＰは、本明細書に記載される２つ以上の異なる改変ＶＰ１タンパク質を含んでもよい。さらに、ＶＬＰは、ＶＰ２タンパク質を含み得る。ＶＰ１タンパク質、ＶＰ１＋ＶＰ２タンパク質、改変ＶＰ１タンパク質、または改変ＶＰ１タンパク質＋ＶＰ２タンパク質を含むＶＬＰは、約１５ｎｍ〜５０ｎｍまたはそれらの間の任意の量、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｎｍ、またはそれらの間の任意の量のサイズである。例えば、Ｔ＝１正二十面体対称性の場合、ＶＬＰは、約２３ｎｍであってもよく、またはＴ＝３正二十面体対称性の場合、ＶＬＰは、約３８〜約４０ｎｍであってもよい。
図３Ｂおよび４Ｂの電子顕微鏡写真に示されているように、植物産生されたＶＰ１タンパク質およびいくつかのノロウイルスＧＩＩ．４遺伝子型に由来する改変ＶＰ１タンパク質は、自己組織化してＶＬＰになる。
植物におけるノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質産生
ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａ；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ２０１５（配列番号：３；図５Ｃ）、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５；図６Ａ）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６；図６Ｂ）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７図６Ｃ）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８；図６Ｄ）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９；図６Ｅ）からのＶＰ１アミノ酸配列と約３０〜約１００％、約４０〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％、約８５〜約１００％、約９０〜約１００％、または約９５〜約１００％、約９８〜約１００％、またはそれらの間の任意の量の配列同一性（配列類似性とも称され得る）を有するアミノ酸配列を含む任意のＶＰ１タンパク質を含むが、ただし、ＶＰ１タンパク質が対象に投与された場合にノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。
ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａ；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ２０１５（配列番号：３；図５Ｃ）、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５；図６Ａ）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６；図６Ｂ）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７図６Ｃ）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８；図６Ｄ）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９；図６Ｅ）からのＶＰ１アミノ酸配列と約３０〜約１００％、約４０〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％、約８５〜約１００％、約９０〜約１００％、または約９５〜約１００％、約９８〜約１００％、またはそれらの間の任意の量の配列同一性（配列類似性とも称され得る）を有するアミノ酸配列を含む任意のＶＰ１タンパク質を含むが、ただし、ＶＰ１タンパク質が対象に投与された場合にノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。
改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａを参照；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）の任意の１つ以上のアミノ酸３９、５３、および８０でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸残基でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；またはノロウイルスタンパク質ＧＩＩ．４／２０１２のＶＰ１の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸でのＳドメインの置換、突然変異、もしくは改変；ならびにノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３；図５Ｃ）の任意の１つ以上のアミノ酸３３３および３６８でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２の３３３および３６８位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；またはノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５の３３３および３６８位との配列アラインメントにおいて、もしくはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸でのＰドメインの置換、突然変異、もしくは改変；を含むＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
改変または変異型ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質はさらに、第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメイン、または第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメインの一部に融合した第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメインを含むノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１融合タンパク質であり得る。例えば、第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメインは、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（配列番号：１；図５Ａを参照；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）の３９、５３、および８０位の任意の１つ以上のアミノ酸で、またはそれらとの配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸で置換、突然変異、または改変され得、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（配列番号：３；図５Ｃ）の３３３および３６８位の任意の１つ以上のアミノ酸で、またはそれらとの配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸で、置換、突然変異、または改変される、第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメイン、またはＰドメインの一部に融合され得る。
改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量の増加、またはそれらの組み合わせに最適化され得る。改変ＶＰ１タンパク質は、植物、植物の一部、または植物細胞で発現され得る。
超可変Ｐドメインに対して、ノロウイルスＶＰ１ Ｓドメインの一次アミノ酸配列は、よく保存される。シェルドメインでは８５〜１００％の類似性が見られたが、Ｐ１ドメインおよびＰ２ドメインは、より低い類似性（７５〜９５％）が特徴であった（Ｍｏｎｔｏｙａ ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＶＰ１ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩＩ．４ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ １９７４‐２０１５」，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１７，Ｖｏｌｕｍｅ ８，Ａｒｔｉｃｌｅ ２３９９）。これらの結果は、ＧＩＩ．４株におけるＶＰ１遺伝子の遺伝的分化がドメイン間で異なることを示した。例えば、本明細書に記載の核酸配列は、ＧＩＩ．４ ＶＰ１のＳドメインに対して、約８０〜約９９％、またはそれらの間の任意の量の配列同一性を示し得る。例えば、本明細書に記載の核酸配列は、ＧＩＩ．４ ＶＰ１（ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９；配列番号：１；Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）のＳドメインに対して、約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはその間の任意の量の配列同一性を示し得る。ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４（ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９；配列番号：１）の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する１つ以上のアミノ酸は、改変され得る。さらに、本明細書に記載の核酸配列は、ＧＩＩ．４ ＶＰ１（ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９；配列番号：１）のＰドメインに対して、約８０〜約９９％、またはそれらの間の任意の量の配列同一性を示し得る。例えば、本明細書に記載の核酸配列は、ＧＩＩ．４ ＶＰ１（ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９；配列番号：１）のＰドメインに対して、約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、またはその間の任意の量の配列同一性を示し得る。さらに、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）の３３３および３６８位との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する１つ以上のアミノ酸は、改変され得る。
以前に示したように（ＰＣＴ／ＣＡ２０１８／０５０３５２、２０１８年３月２３日出願；参照により本明細書に組み込まれる）、野生型（天然とも称される）ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、植物で産生され得、ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰも産生され得る。単一の核酸構築物としてのＧＩ．１ ＶＰ１、単一の核酸構築物としてのＧＩ．１ ＶＰ２、ＶＰ１およびＶＰ２核酸配列が別々のベクターに導入されたＧＩ．１ ＶＰ１とＶＰ２の両方（「ＶＰ１＋ＶＰ２」；デュアル構築物）またはＶＰ１およびＶＰ２核酸配列が同じベクターに導入されたＧＩ．１ ＶＰ１とＶＰ２の両方（「ＶＰ１／ＶＰ２」もしくは「ＶＰ１／ＶＰ２／３’ＵＴＲ」；単一の核酸構築物）をコードする発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む葉（Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）から）の真空浸潤によって、ＶＰ１および／またはＶＰ２配列の共発現を可能にし、ＶＰ１およびＶＰ２産生について葉を調べた。浸潤後６日または９日後（それぞれ６ＤＰＩおよび９ＤＰＩ）、葉のホモジネートから総粗タンパク質抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルー色素で染色した。ＶＰ１タンパク質をコードする野生型ＧＩ．１ ＯＲＦ２に対応するヌクレオチド配列を含む発現ベクターを浸潤させた葉は、クーマシー染色ゲルを使用して決定した場合、低レベルまたは検出不可能なレベルのＧＩ．１ ＶＰ１を産生した。対照的に、ヒト発現（ｈＣｏｄ）用にコドン最適化された、または野生型ＶＰ１核酸配列のＧＣ含有量と比較した場合にＧＣ含有量が豊富なＧＩ．１ ＶＰ１ヌクレオチド配列を含む発現ベクターを浸潤させた葉は、クーマシー染色ゲル中のＧＩ．１ ＶＰ１タンパク質の量を増加させ、これは、ｈＣｏｄ ＧＩ．１ ＶＰ１は、ＶＰ１が単独で発現した場合に、植物で産生され得ることを実証している。
さらに、ＰＣＴ／ＣＡ２０１８／０５０３５２（２０１８年３月２３日提出；参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、野生型ＧＩ．１ ＶＰ１およびＶＰ２、またはヒトコドン最適化ＧＩ．１ ＶＰ１およびＶＰ２のいずれかを含むベクターを浸潤させた葉は、クーマシー染色ゲル中の低レベルのＧＩ．１ ＶＰ１タンパク質を産生し、これは、ＶＰ１の発現は、ウイルスゲノムに見られるのと同じ組織を使用して（発現を制御するために１つのプロモーターを使用して）、同じベクター上でシスで共発現した場合、ＶＰ２の存在によって増強されないことを示唆している。しかしながら、ＶＰ１またはヒトコドン最適化ＶＰ１をそれぞれＶＰ２またはｈＣｏｄ ＶＰ２と一緒にトランスで（別々の構築物上で）共発現させた場合（ｈＣｏｄ ＶＰ１＋ＶＰ２）、ＶＰ１タンパク質の増加が観察された。ＶＰ１およびＶＰ２核酸セグメントのそれぞれは、調節領域およびターミネーターを含み、構築物は、核酸複合体として植物に導入され、これは、ＶＰ１タンパク質収量の対応する増加をもたらした。
この観察結果は、昆虫および哺乳類細胞で報告されたもの（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔ Ａ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｓ．Ｅ．，Ｈｕｔｓｏｎ Ａ．Ｍ．，Ｅｓｔｅｓ Ｍ．Ｋ．２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１６０３−１１６１５）が、ＶＰ１発現の増加は、ＶＰ１およびＶＰ２（またはＶＰ１＋ＶＰ２＋３’ＵＴＲ）がシスに存在し、１つのプロモーターおよびターミネーターの制御下で、ウイルスゲノムに見られるのと同じ組織を使用して共発現した場合にのみ観察されたことを報告しているのとは対照的である。昆虫または哺乳動物細胞においてＢｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔ（２００３）によりＶＰ１発現の増加は観察されず、この場合、ＶＰ１とＶＰ２とがトランスで共発現された。
本明細書に記載されるように、改変ＶＰ１タンパク質は、ＶＰ２と共に植物において共発現することができる。ＶＰ２タンパク質の共発現は、例えば、別々のプラスミドで共発現される場合、別々の発現系を伴い得る。あるいは、ＶＰ１およびＶＰ２は、同じベクター上で発現され得るが、ＶＰ１およびＶＰ２をコードする配列のそれぞれは、それらが別々の発現系を有するように、別々のプロモーターおよびターミネーター配列の制御下にあるべきである。
植物におけるノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の収量または抽出量、およびノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの産生は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、または３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する１つもしくは複数のアミノ酸を改変することによって改善され得る。上記のようにアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および／または３６８において改変を有するノロウイルスＶＰ１タンパク質は、直径が主に３８ｎｍである整形式キャプシドを有する高密度ＶＬＰを形成した（例えば、図３Ｂおよび４Ｂを参照）。
例えば、図３Ａおよび４Ａに示されるように、３９（Ａ３９Ｖ）、５３（Ｒ５３Ｉ）、８０（Ｐ８０Ｓ）、３３３（Ｍ３３３Ｖ）、または３６８（Ｑ３６８Ｅ）位での１つまたは複数のアミノ酸の改変を有するノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１の発現は、野生型ＧＩＩ．４／２０１５（構築物＃４１５３；図２Ａ）の発現と比較した場合、２倍（例えば、構築物＃４１５４、図４Ａ）〜２０倍以上（構築物＃４２５５；図４Ａ）の範囲の良好なタンパク質収量（ＳＤＳ ＰＡＧＥを使用して決定）で堅牢であった。例えば、図４Ａに示すように、Ｓドメインにおける３９（Ａ３９Ｖ）、５３（Ｒ５３Ｉ）、ならびに８０（Ｐ８０Ｓ）位での１つ以上の改変およびＰドメインにおける３３３（Ｍ３３３Ｖ）および３６８（Ｑ３６８Ｅ）位での１つ以上の改変（例えば、これに限定されないが、構築物＃４２５５）を含む、遺伝子型変異体ＧＩＩ．４／２０１５からのノロウイルスＶＰ１の発現は、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１発現（図２Ａ、構築物＃４１５３を参照）と比較した場合、堅牢であり、より高い収量を示した（ＳＤＳ ＰＡＧＥを使用して決定）。さらに、ＶＰ１タンパク質の増加した収量が、＃４１７４、＃４１７６、＃４１８７、＃４１８８、＃４１９４、＃４１９１、＃４１８９、＃４１９５、＃４１９２、＃４１９０、＃４１９６、＃４１９３、＃４２４１、＃４２４２、＃４２４３、４２４４、＃４２４５、＃４２４６、＃４２４７、＃４２４８、＃４２４９、＃４２５０、＃４２５１、＃４２５２、＃４２５３、＃４２５４、および＃４２５５を含む図３Ａおよび４Ａ（天然ＧＩＩ．４／２０１５；図２Ａと比較した場合）に示されている各構築物を使用して産生された。
さらに、上記のように、３９（Ａ３９Ｖ）、５３（Ｒ５３Ｉ）、８０（Ｐ８０Ｓ）、３３３（Ｍ３３３Ｖ）、およびＱ３６８Ｅ）位での１つ以上の改変、またはこれらの改変の組み合わせを有するＧＩＩ．４／２０１５遺伝子型変異体のノロウイルスＶＰ１タンパク質は、主に直径３８ｎｍである整形式キャプシドを有する高密度ＶＬＰを形成し（図４Ｂ）、例えば、３９（Ａ３９Ｖ）、５３（Ｒ５３Ｉ）、８０（Ｐ８０Ｓ）、および３３３（Ｍ３３３Ｖ）位での改変を有するＧＩＩ．４／２０１５遺伝子型変異体（構築物＃４２５３；図４Ｂを参照）のＶＰ１タンパク質、ならびに３９（Ａ３９Ｖ）、５３（Ｒ５３Ｉ）、８０（Ｐ８０Ｓ）、および３６８（Ｑ３６８Ｅ）位での改変を有するＧＩＩ．４／２０１５遺伝子型変異体（構築物＃４２５４；図４Ｂを参照）のＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰを参照されたい。しかしながら、ＶＬＰは、＃４２４１、＃４２４２、＃４２４３、４２４４、＃４２４５、＃４２４６、＃４２４７、＃４２４８、＃４２４９、＃４２５９、＃４２５１、＃４２５２、＃４２５３、＃４２５４、および＃４２５５を含む図４Ｂに示す各構築物を使用して産生した。類似の方法で、図３Ｂに示すように、主に直径３８ｎｍの整形式キャプシドを有するＶＬＰも、構築物＃４１７４、＃４１７６、＃４１８７、＃４１８８、＃４１９４、＃４１９１、＃４１８９、＃４１９５、＃４１９２、＃４１９０、＃４１９６、および＃４１９３を参照して観察した。
したがって、植物におけるノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の収量または抽出量、およびノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの産生は、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を発現することによって改善され得、例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１融合タンパク質は、Ｐドメインに融合された第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメイン、または第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメインの一部を含み、Ｓドメインは、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択された位置での１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含み、Ｐドメインは、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４（配列番号：１）のアミノ酸３３３および３６８、またはそれらの組み合わせとの配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択される位置に１つまたは複数の改変を含む。
しかしながら、上記のように（および表１を参照して）、ＧＩＩ．４／２０１２遺伝子型からの改変ＳドメインおよびＧＩＩ．４／２０１５遺伝子型からの改変Ｐドメインを含むＧＩＩ．４ ＶＰ１融合タンパク質は、対応する置換を含む、ＧＩＩ．４／２０１５遺伝子型のＧＩＩ．４／２０１２遺伝子型のいずれかに構造的および機能的に同等である。例えば、１１９および１４５位のイソロイシン、１４４位のメチオニン、および１７４位のセリン（Ｖ１１９Ｉ、Ｉ１４４Ｍ、Ｖ１４５Ｉ、およびＰ１７４Ｓ）を含むＧＩＩ．４／２０１２のＳドメインは、ＧＩＩ．４／２０１５からのＳドメインと構造的および機能的に同等であり、改変Ｒ２９７Ｈ、Ｄ３１０Ｎ、Ｖ３３３Ｍ、Ｒ３３９Ｋ、Ｅ３６８Ｑ、Ｒ３７３Ｈ、Ｇ３９３Ｎを含むＧＩＩ．４／２０１２のＰドメインは、ＧＩＩ．４／２０１５からのＰドメインと構造的および機能的に同等である。したがって、図３Ａおよび３Ｂ（Ｐ８０Ｓ、Ａ３９Ｖ、および／またはＲ５３Ｉ）に示されているＳ（ＧＩＩ．４／２０１２）の命名法および定義された置換は、Ｓ（Ｖ１１９Ｉ＋Ｉ１４４Ｍ＋Ｖ１４５Ｉ＋Ｐ１７４Ｓを含むＧＩＩ．４／２０１５）ならびに定義された置換、Ｐ８０Ｓ、Ａ３９Ｖ、および／またはＲ５３Ｉと構造的および機能的に同等である。
図３Ａに示すように、ノロウイルス遺伝子型変異体ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（図３ＡではＳ（ＧＩＩ．４／２０１２）と呼ばれ；Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、およびＳ１７４Ｐを含み、８０位（Ｐ８０Ｓ）、３９および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ）、５３および８０位（Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）または３９、５３、および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）で置換を有するＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５のＳドメインに同等である）のＳドメイン、ならびに３３３位（Ｍ３３３Ｖ）、３６８位（Ｑ３６８Ｅ）、または３３３および３６８位（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ）で置換を有するノロウイルス遺伝子型変異体ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（（ＧＩＩ．４／２０１５）と呼ばれる）のＰドメインを含む改変ＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰの産生は、天然ＧＩＩ．４／２０１５の収量よりも高い良好なタンパク質収量で堅牢であった（図２Ａを参照；イオジキサノール密度勾配遠心分離に続くＳＤＳ ＰＡＧＥを使用して決定）。最高の収量は、
−８０位（Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１８７）；
３９および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９１）；
−５３および８０位（Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ；構築物＃４１８９）；
５３および８０位（Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９５）；
−５３および８０位（Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９２）；
−３９、５３、および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ；構築物＃４１９０）；
−３９、５３、および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９６）、ならびに
−３９、５３、および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９３）
（すべて図３Ａを参照）で置換を有するＧＩＩ．４／２０１２ Ｓドメイン（ＧＩＩ．４／２０１５＋Ｉ１１９Ｖ＋Ｍ１４４Ｉ＋Ｉ１４５Ｖ＋Ｓ１７４Ｐと同等）を含む改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を発現させることで得た。
−８０位（Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１８７）；
３９および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９１）；
−５３および８０位（Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ；構築物＃４１８９）；
５３および８０位（Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９５）；
−５３および８０位（Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９２）；
−３９、５３、および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ；構築物＃４１９０）；
−３９、５３、および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９６）、ならびに
−３９、５３、および８０位（Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ）ならびに３３３および３６８位で置換を有するＧＩＩ．４／２０１５ Ｐドメイン（Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；構築物＃４１９３）
（すべて図３Ａを参照）で置換を有するＧＩＩ．４／２０１２ Ｓドメイン（ＧＩＩ．４／２０１５＋Ｉ１１９Ｖ＋Ｍ１４４Ｉ＋Ｉ１４５Ｖ＋Ｓ１７４Ｐと同等）を含む改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を発現させることで得た。
さらに、図３Ａに示すようにアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および／または３６８で置換を有する改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、直径が主に３８ｎｍの整形式キャプシドを有する高密度ＶＬＰを形成した（図３Ｂ）。
対照的に、ノロウイルスＧＩＩ．４遺伝子型変異体ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；図２Ａ構築物＃４１５３）の野生型ＶＰ１、またはＳを含む改変ノロウイルスＧＩＩ．４（ＧＩＩ．４／２０１２（Ｐ８０Ｓ）＋Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５）（図２Ｂ、構築物４１７１；ＧＩＩ．４／２０１５（Ｐ８０Ｓ＋Ｉ１１９Ｖ＋Ｍ１４４Ｉ＋Ｉ１４５Ｖ＋Ｓ１７４Ｐ）と同等）を植物において発現させた場合、勾配遠心分離後の画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して決定した場合にＶＰ１タンパク質の収量は低くなった。
本開示は、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする核酸配列であって、改変ノロウイルスＶＰ１が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸からなる群から選択される位置に１つまたは複数の改変、置換、または突然変異を含む、核酸配列を提供する。例えば、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする核酸配列は、第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメインまたはＰドメインの一部に融合した第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメインを含み得、Ｓドメインは、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、および８０との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択された位置に１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含み；Ｐドメインは、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、またはＧＩＩ．４／２０１２、配列番号：１）のアミノ酸３３３および３６８、またはそれらの組み合わせとの配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択される位置に１つまたは複数の改変を含む。あるいは、核酸配列は、Ｉ１１９Ｖ、Ｍ１４４Ｉ、Ｉ１４５Ｖ、およびＳ１７４Ｐを含み、３９、５３、８０、３３３、および３６８位、またはそれらの組み合わせに１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を有する改変ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５ ＶＰ１タンパク質をコードし得る。
改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードし、かつノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸からなる群から選択される位置に１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含む植物発現核酸配列は、１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＧＩＩ．４ ＶＰ１、例えば野生型ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（配列番号：３）と比較して、改善されたＶＰ１特性を示す。
改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１の改善された特性の例として、以下が挙げられる：
−１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＶＰ１と比較して、植物細胞で発現させた場合の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質収量の増加（例えば、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析を使用して決定）。例えば、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の収量の増加は、対応する野生型ＶＰ１収量の１．５〜２０倍、またはその間の任意の量の範囲であり得る；
−例えば、１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＧＩＩ．４ ＶＰ１の密度勾配分離と比較して、タンパク質抽出物のイオジキサノール密度勾配分離を使用して決定された場合、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの密度の増加。例えば、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰは、密度勾配遠心分離後の同じまたはより密度の高い画分で観察され得る；
−１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＧＩＩ．４ ＶＰ１と比較して、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質で構成されるＶＬＰの完全性の改善。例えば、破壊された、または部分的に組み立てられたＶＬＰの数は、ＴＥＭを使用して決定され得る；
−置換（複数可）、突然変異（複数可）、または改変（複数可）を含まない同じ遺伝子型の野生型レベルのＶＬＰ産生と比較して、植物細胞で発現させた場合のＶＬＰ収量の増加。ＶＬＰ収量は、ＴＥＭを使用した密度勾配遠心分離後のＶＬＰ含有画分から得られた洗浄サンプルで決定され得る。例えば、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの収量の増加は、野生型ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの対応する収量の１．５〜２０倍、またはその間の任意の量の範囲であり得る；
−１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＧＩＩ．４ ＶＰ１を含むＶＬＰと比較して、２３ｎｍのＶＬＰとは対照的に３８ｎｍのＶＬＰに組み立てられるＶＬＰのより高い割合（ＴＥＭを使用して決定）；および
−これらの改善された特性の組み合わせ。
−１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＶＰ１と比較して、植物細胞で発現させた場合の改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質収量の増加（例えば、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析を使用して決定）。例えば、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の収量の増加は、対応する野生型ＶＰ１収量の１．５〜２０倍、またはその間の任意の量の範囲であり得る；
−例えば、１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＧＩＩ．４ ＶＰ１の密度勾配分離と比較して、タンパク質抽出物のイオジキサノール密度勾配分離を使用して決定された場合、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの密度の増加。例えば、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰは、密度勾配遠心分離後の同じまたはより密度の高い画分で観察され得る；
−１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＧＩＩ．４ ＶＰ１と比較して、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質で構成されるＶＬＰの完全性の改善。例えば、破壊された、または部分的に組み立てられたＶＬＰの数は、ＴＥＭを使用して決定され得る；
−置換（複数可）、突然変異（複数可）、または改変（複数可）を含まない同じ遺伝子型の野生型レベルのＶＬＰ産生と比較して、植物細胞で発現させた場合のＶＬＰ収量の増加。ＶＬＰ収量は、ＴＥＭを使用した密度勾配遠心分離後のＶＬＰ含有画分から得られた洗浄サンプルで決定され得る。例えば、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの収量の増加は、野生型ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの対応する収量の１．５〜２０倍、またはその間の任意の量の範囲であり得る；
−１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含まない野生型ＧＩＩ．４ ＶＰ１を含むＶＬＰと比較して、２３ｎｍのＶＬＰとは対照的に３８ｎｍのＶＬＰに組み立てられるＶＬＰのより高い割合（ＴＥＭを使用して決定）；および
−これらの改善された特性の組み合わせ。
理論に拘束されることを望まないが、野生型ノロウイルスＶＬＰと比較して、密度勾配遠心分離後に高密度画分で観察されるＶＬＰは、天然ＧＩＩ．４ ＶＰ１を含むＶＬＰの集合が、植物で発現および植物から抽出された場合、改変ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰよりも低い安定性である場合があることを示している。したがって、天然ＶＬＰは、奇形のキャプシド粒子および断片化生成物の生成の影響を受けやすい場合がある。結果として、増加した密度を有することを特徴とする改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰは、対応する野生型ＶＰ１を使用して産生されたＶＬＰよりも大きな構造的完全性を示し得る。
本明細書に記載されるような改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質をコードする核酸配列は、ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする核酸配列と約８０％〜約９９％の配列類似性（または同一性）を示し得、例えば、本明細書に記載の核酸配列は、ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１、例えば：ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａ；ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）、ＧＩＩ／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３；図５Ｃ）、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５；図６Ａ）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６；図６Ｂ）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７；図６Ｃ）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８；図６Ｄ）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９；図６Ｅ）をコードする核酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれらの間の任意の量の配列同一性を示し得るが、ただし、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質が、３９、５３、８０、３３３、３６８位、またはそれらの組み合わせに置換、突然変異、改変を含み、かつＶＰ１タンパク質が対象に投与される場合、改変ＧＩＩ．４タンパク質が、対象のノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。
同様に、本発明は、任意のＧＩＩ．４ ＶＰ１配列、例えば、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１；図５Ａ；ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵとも呼ばれる）、ＧＩＩ／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３；図５Ｃ）、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５；図６Ａ）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６；図６Ｂ）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７；図６Ｃ）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８；図６Ｄ）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９；図６Ｅ）と約３０％〜約９９％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示すアミノ酸配列を含むが、ただし、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質が対象に投与された場合にノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列は、上記で定義されたＧＩＩ．４ ＶＰ１アミノ酸配列のいずれかと約３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ＶＰ１タンパク質が、対象に投与された場合にノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。
「ＶＰ１突然変異タンパク質」、「突然変異ＶＰ１タンパク質」、「改変ＶＰ１タンパク質」、「改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質」などとは、アミノ酸配列内の１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含むノロウイルスＶＰ１タンパク質を意味する。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１改変タンパク質または突然変異タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８とアラインメントする位置に１つ以上の置換を含み得る。改変ＶＰ１タンパク質は、第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメインまたはＰドメインの一部に融合された第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメインを含むノロウイルスＶＰ１融合タンパク質をさらに含み得る。第１のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＳドメインは、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１；図５Ａを参照）の３９、５３、および８０位との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸で置換、突然変異、または改変され得る。第２のノロウイルス遺伝子型変異体に由来するＰドメインまたはＰドメインの一部は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、またはＧＩＩ．４／２０１２，配列番号：１）の３３３および３６８位との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応する任意の１つ以上のアミノ酸で置換、突然変異、または改変され得る。
本明細書に記載されるように、ＧＩＩ．４株の３９、５３、８０、３３３、および３６８位にアミノ酸の１つまたは複数の置換を含む改変ＶＰ１タンパク質は、改変ＶＰ１タンパク質、または改変ＶＰ１タンパク質を使用して産生されたＶＬＰの改善された特性をもたらした。上記のように、当業者は、類似の特性を有するアミノ酸が識別された位置でのアミノ酸の代わりになり得ることを理解するので、改善された特性は、特定の部位で特異的なアミノ酸を置換することに限定されないことを理解されたい。例えば、改変Ｐ８０Ｓは、８０位のプロリンを極性中性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸であるセリンで置換することを含む。この位置のプロリンはまた、極性中性側鎖を有することを特徴とする代替アミノ酸、例えば、アスパラギン、システイン、またはスレオニンのいずれか、すなわち、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴであるＰ８０Ｘで置換され得る。
アラニンを３９位でバリン（疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ａ３９Ｖによって、バリンに加えて、アラニンも疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニン、すなわち、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭであるＡ３９Ｘで置換され得る。
アルギニンを５３位でイソロイシン（疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ｒ５３Ｉによって、イソロイシンに加えて、アルギニンも疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、ロイシン、バリン、アラニン、またはメチオニン、すなわち、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭであるＲ５３Ｘで置換され得る。
メチオニンを３３３位でバリン（疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ｍ３３３Ｖによって、バリンに加えて、メチオニンも疎水性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、イソロイシンまたはロイシン、すなわち、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、またはＬであるＭ３３３Ｖで置換され得る。
グルタミンを３６８位でグルタミン酸（極性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸）で置換することを含む改変Ｑ３６８Ｅによって、グルタミン酸に加えて、グルタミンも極性側鎖を有することを特徴とするアミノ酸、例えば、アスパラギンまたはアスパルタート、すなわち、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、またはＤであるＱ３６８Ｘで置換され得る。
ＶＰ１改変または変異タンパク質（改変ＶＰ１タンパク質）の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１、またはＧＩＩ．４／２０１５、配列番号：３）のアミノ酸８０に対応するプロリンは、例えば、セリン（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ；配列番号：１１、図７Ｂ、配列番号：１３、図７Ｅ、もしくは配列番号：１５、図７Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％もしくはその間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、変異、もしくは改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：１１（図７Ｂ）、配列番号：１３（図１７Ｅ）、または配列番号：１５（図７Ｈ）のいずれかで定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変が、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸８０および３３３にそれぞれ対応するプロリンおよびメチオニンは、例えば、それぞれセリンおよびバリン（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ；配列番号：１７、図８Ｂ、もしくは配列番号：４１、図１２Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：１７（図８Ｂ）または配列番号：４１（図１２Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０および３３３に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、例えばセリン、またはＶ、Ｉ、もしくはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、ＣもしくはＴ＋Ｑ３６８Ｅ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸８０および３６８にそれぞれ対応するプロリンおよびグルタミンは、例えば、それぞれ、セリンおよびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：１９、図８Ｅ、もしくは配列番号：４３、図１２Ｅ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：１９（図８Ｅ）または配列番号：４３（図１２Ｅ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、例えばセリン、またはＥ、Ｎ、もしくはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するプロリン、メチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：２１、図８Ｈ、もしくは配列番号：４５、図１２Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２１（図８Ｈ）または配列番号：４５（図１２Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、例えばセリン、Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、例えばバリン、またはＥ、Ｎ、Ｄ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９および８０にそれぞれ対応するアラニンおよびプロリンは、例えば、それぞれ、バリンおよびセリン（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ；配列番号：２３、図９Ｂ、もしくは配列番号：４７、図１３Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２３（図９Ｂ）または配列番号：４７（図１３Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩ．４のアミノ酸３９および８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、およびＳ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、８０、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、プロリン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、セリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：２５、図９Ｅ、もしくは配列番号：５１、図１３Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２５（図９Ｅ）または配列番号：５１（図１３Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩ．４のアミノ酸３９、８０、および３６８に対応する位置でのｓｓは、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、ＮもしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、プロリン、メチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：２７、図９Ｈ、もしくは配列番号：５３、図１３Ｋ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２７（図９Ｈ）または配列番号：５３（図１３Ｋ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、Ｖ、Ｉ、またはＬ、例えばバリン、Ｅ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１；またはＧＩＩ．４／２０１５、配列番号：３）のアミノ酸５３および８０に対応するアルギニンおよびプロリンは、例えば、それぞれイソロイシン、セリン、およびバリン（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ；配列番号：５５、図１４Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：５５（図１４Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３および８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、およびＳ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸５７、８０、および３３３に対応するアルギニン、プロリン、およびメチオニンは、例えば、それぞれ、イソロイシン、セリン、およびバリン（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ；配列番号：２９、図１０Ｂ、もしくは配列番号：５７、図１４Ｅ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２９（図１０Ｂ）または配列番号：５７（図１４Ｅ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３、８０、および３３３に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸５７、８０、および３６８に対応するアルギニン、プロリン、およびグルタミンは、例えば、それぞれイソロイシン、セリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３１、図１０Ｅ、もしくは配列番号：５９、図１４Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３１（図１０Ｅ）または配列番号：５９（図１４Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３、８０、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸５７、８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するアルギニン、プロリン、メチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、イソロイシン、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３３、図１０Ｈ、もしくは配列番号：６１、図１４Ｋ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３３（図１０Ｈ）または配列番号：６１（図１４Ｋ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３、８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、Ｖ、Ｉ、またはＬ、例えばバリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１、またはＧＩＩ．４／２０１５、配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、および８０にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、およびプロリンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、およびセリン（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ；配列番号：６３、図１５Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：６３（図１５Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、および８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、８０、および３３３にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、プロリン、およびメチオニンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、セリン、およびバリン（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ；配列番号：３５、図１１Ｂ、もしくは配列番号：６５、図１５Ｅ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３５（図１１Ｂ）または配列番号：６５（図１５Ｅ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、８０、および３３３に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、８０、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、プロリン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、セリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３７、図１１Ｅ、もしくは配列番号：６７、図１５Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３７（図１１Ｅ）または配列番号：６７（図１５Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、８０、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、プロリンメチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３９、図１１Ｈ、もしくは配列番号：６９、図１５Ｋ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３９（図１１Ｈ）または配列番号：６９（図１５Ｋ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
ＶＰ１改変または変異タンパク質（改変ＶＰ１タンパク質）の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１、またはＧＩＩ．４／２０１５、配列番号：３）のアミノ酸８０に対応するプロリンは、例えば、セリン（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ；配列番号：１１、図７Ｂ、配列番号：１３、図７Ｅ、もしくは配列番号：１５、図７Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％もしくはその間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、変異、もしくは改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：１１（図７Ｂ）、配列番号：１３（図１７Ｅ）、または配列番号：１５（図７Ｈ）のいずれかで定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変が、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸８０および３３３にそれぞれ対応するプロリンおよびメチオニンは、例えば、それぞれセリンおよびバリン（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ；配列番号：１７、図８Ｂ、もしくは配列番号：４１、図１２Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：１７（図８Ｂ）または配列番号：４１（図１２Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０および３３３に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、例えばセリン、またはＶ、Ｉ、もしくはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、ＣもしくはＴ＋Ｑ３６８Ｅ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸８０および３６８にそれぞれ対応するプロリンおよびグルタミンは、例えば、それぞれ、セリンおよびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：１９、図８Ｅ、もしくは配列番号：４３、図１２Ｅ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：１９（図８Ｅ）または配列番号：４３（図１２Ｅ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、例えばセリン、またはＥ、Ｎ、もしくはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するプロリン、メチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：２１、図８Ｈ、もしくは配列番号：４５、図１２Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２１（図８Ｈ）または配列番号：４５（図１２Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、例えばセリン、Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、例えばバリン、またはＥ、Ｎ、Ｄ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９および８０にそれぞれ対応するアラニンおよびプロリンは、例えば、それぞれ、バリンおよびセリン（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ；配列番号：２３、図９Ｂ、もしくは配列番号：４７、図１３Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２３（図９Ｂ）または配列番号：４７（図１３Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩ．４のアミノ酸３９および８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、およびＳ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、８０、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、プロリン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、セリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：２５、図９Ｅ、もしくは配列番号：５１、図１３Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２５（図９Ｅ）または配列番号：５１（図１３Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩ．４のアミノ酸３９、８０、および３６８に対応する位置でのｓｓは、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、ＮもしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、プロリン、メチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：２７、図９Ｈ、もしくは配列番号：５３、図１３Ｋ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２７（図９Ｈ）または配列番号：５３（図１３Ｋ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、Ｖ、Ｉ、またはＬ、例えばバリン、Ｅ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１；またはＧＩＩ．４／２０１５、配列番号：３）のアミノ酸５３および８０に対応するアルギニンおよびプロリンは、例えば、それぞれイソロイシン、セリン、およびバリン（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ；配列番号：５５、図１４Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：５５（図１４Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３および８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、およびＳ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸５７、８０、および３３３に対応するアルギニン、プロリン、およびメチオニンは、例えば、それぞれ、イソロイシン、セリン、およびバリン（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ；配列番号：２９、図１０Ｂ、もしくは配列番号：５７、図１４Ｅ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：２９（図１０Ｂ）または配列番号：５７（図１４Ｅ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３、８０、および３３３に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸５７、８０、および３６８に対応するアルギニン、プロリン、およびグルタミンは、例えば、それぞれイソロイシン、セリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３１、図１０Ｅ、もしくは配列番号：５９、図１４Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３１（図１０Ｅ）または配列番号：５９（図１４Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３、８０、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸５７、８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するアルギニン、プロリン、メチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、イソロイシン、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３３、図１０Ｈ、もしくは配列番号：６１、図１４Ｋ）、またはＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３３（図１０Ｈ）または配列番号：６１（図１４Ｋ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸５３、８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、Ｖ、Ｉ、またはＬ、例えばバリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１、またはＧＩＩ．４／２０１５、配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、および８０にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、およびプロリンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、およびセリン（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ；配列番号：６３、図１５Ｂ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：６３（図１５Ｂ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、および８０に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、８０、および３３３にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、プロリン、およびメチオニンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、セリン、およびバリン（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ；配列番号：３５、図１１Ｂ、もしくは配列番号：６５、図１５Ｅ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３５（図１１Ｂ）または配列番号：６５（図１５Ｅ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、８０、および３３３に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリンのままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、８０、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、プロリン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、セリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３７、図１１Ｅ、もしくは配列番号：６７、図１５Ｈ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３７（図１１Ｅ）または配列番号：６７（図１５Ｈ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、８０、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
−ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、Ｌ、もしくはＭ＋Ｒ５３Ｘ、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、もしくはＭ＋Ｐ８０Ｘ、Ｘ＝Ｓ、Ｎ、Ｃ、もしくはＴ、＋Ｍ３３３Ｘ、Ｘ＝Ｖ、Ｉ、もしくはＬ＋Ｑ３６８Ｘ、Ｘ＝Ｅ、Ｎ、もしくはＤ、ＶＰ１）：ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８にそれぞれ対応するアラニン、アルギニン、プロリンメチオニン、およびグルタミンは、例えば、それぞれ、バリン、イソロイシン、セリン、バリン、およびグルタミン酸（ＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ；配列番号：３９、図１１Ｈ、もしくは配列番号：６９、図１５Ｋ）、またはＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０〜１００％またはそれらの間の任意の量の配列類似性を示す配列に置換、突然変異、または改変されている。例えば、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質は、配列番号：３９（図１１Ｈ）または配列番号：６９（図１５Ｋ）で定義されるＧＩＩ．４＿Ａ３９Ｖ＋Ｒ５３Ｉ＋Ｐ８０Ｓ＋Ｍ３３３Ｖ＋Ｑ３６８Ｅ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列と約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはそれらの間の任意の量の配列類似性を有し得るが、ただし、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８に対応する位置での置換、突然変異、または改変は、それぞれ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、例えばバリン、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、またはＭ、例えばイソロイシン、Ｓ、Ｎ、Ｃ、またはＴ、例えばセリン、およびＶ、Ｉ、またはＬ、例えばバリン、およびＥ、Ｎ、またはＤ、例えばグルタミン酸のままであり、かつＶＰ１タンパク質が、対象に投与されるとノロウイルスに対する免疫を誘導することを条件とする。ＧＩＩ．４ ＶＰ１をコードする配列は、任意のＧＩＩ．４株、例えば、限定されないが、ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、アミノ酸；配列番号：４、ヌクレオチド；図５Ｃおよび５Ｄ）から得られ得る。
ＶＬＰ収量
ＶＰ１の改善された特性の例は、改変ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの収量を比較して観察され得、図３Ａおよび４Ａを参照して示されている。植物における３９、５３、８０、３３３、および３６８位のアミノ酸の１つまたは複数の置換を含む改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の発現は、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１の収量と比較した場合、約２〜約２０倍高いＶＬＰ収量をもたらした（図２Ａを参照、収量は「１」に設定）。
ＶＰ１の改善された特性の例は、改変ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの収量を比較して観察され得、図３Ａおよび４Ａを参照して示されている。植物における３９、５３、８０、３３３、および３６８位のアミノ酸の１つまたは複数の置換を含む改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の発現は、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１の収量と比較した場合、約２〜約２０倍高いＶＬＰ収量をもたらした（図２Ａを参照、収量は「１」に設定）。
加えて、３９、５３、８０、３３３、および３６８位（もしくはＧＩＩ．４ ＶＰ１の３９、５３、８０、３３３、および３６８位に対応するか、もしくはそれらとアラインメントする）にアミノ酸の１つまたは複数の置換を有する改変ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰは、調べたすべての改変ＶＰ１タンパク質について、対応する野生型または天然ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの収量と比較した場合、ＶＬＰ収量の増加を示した。
野生型（ＧＩＩ．４／２０１５；図２Ａ）と比較したＶＰ１タンパク質収量の増加（図３Ａ、４Ａを参照）、および強力なＶＬＰ産生は、例えば、以下を発現する植物抽出物で観察された。
ＶＬＰのサイズ、密度、安定性、および品質
図３Ｂおよび４Ｂに示すように、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の多くは、ＶＬＰが、野生型ノロウイルスＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１（図２Ａ）と比較して、より高密度の画分、例えば２９〜３５％の画分で観察されるように、密度の高いＶＬＰの改善された特性を示す（タンパク質抽出物のイオジキサノール密度勾配画分のクーマシー染色ＳＤＳ ＰＡＧＥで決定）。理論に拘束されることを望まないが、本明細書に記載されるように改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１を含むＶＬＰは、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１よりも大きな構造的完全性を示し得る。また、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１を含むＶＬＰは、一般に、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して決定した場合、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＬＰよりも直径３８ｎｍのＶＬＰ対直径２３ｎｍのＶＬＰのより大きい相対比率を含むことが観察される。
図３Ｂおよび４Ｂに示すように、改変ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質の多くは、ＶＬＰが、野生型ノロウイルスＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１（図２Ａ）と比較して、より高密度の画分、例えば２９〜３５％の画分で観察されるように、密度の高いＶＬＰの改善された特性を示す（タンパク質抽出物のイオジキサノール密度勾配画分のクーマシー染色ＳＤＳ ＰＡＧＥで決定）。理論に拘束されることを望まないが、本明細書に記載されるように改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１を含むＶＬＰは、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１よりも大きな構造的完全性を示し得る。また、改変ＧＩＩ．４ ＶＰ１を含むＶＬＰは、一般に、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して決定した場合、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＬＰよりも直径３８ｎｍのＶＬＰ対直径２３ｎｍのＶＬＰのより大きい相対比率を含むことが観察される。
ノロウイルス感染に対する免疫の誘導
「免疫応答」は、一般に、対象の適応免疫系の応答を指す。適応免疫系は、一般に、体液性応答および細胞媒介性応答を含む。体液性応答は、Ｂリンパ球系統の細胞（Ｂ細胞）で産生される分泌抗体によって媒介される免疫の側面である。分泌された抗体は、侵入する微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面上の抗原に結合し、それらに破壊のフラグを立てる。体液性免疫は、一般に、抗体産生およびそれに伴うプロセス、ならびにＴｈ２細胞活性化およびサイトカイン産生、記憶細胞産生、食作用のオプソニン促進、病原体除去などを含む抗体のエフェクター機能を指すために使用される。「調節する」または「調節」などの用語は、一般に既知であるまたは使用されるいくつかのアッセイのいずれかによって決定される場合、特定の応答またはパラメータの増加または減少を指し、それらのいくつかは本明細書で例示される。
「免疫応答」は、一般に、対象の適応免疫系の応答を指す。適応免疫系は、一般に、体液性応答および細胞媒介性応答を含む。体液性応答は、Ｂリンパ球系統の細胞（Ｂ細胞）で産生される分泌抗体によって媒介される免疫の側面である。分泌された抗体は、侵入する微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面上の抗原に結合し、それらに破壊のフラグを立てる。体液性免疫は、一般に、抗体産生およびそれに伴うプロセス、ならびにＴｈ２細胞活性化およびサイトカイン産生、記憶細胞産生、食作用のオプソニン促進、病原体除去などを含む抗体のエフェクター機能を指すために使用される。「調節する」または「調節」などの用語は、一般に既知であるまたは使用されるいくつかのアッセイのいずれかによって決定される場合、特定の応答またはパラメータの増加または減少を指し、それらのいくつかは本明細書で例示される。
細胞媒介性応答は、抗体を伴わないが、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および抗原に応答した様々なサイトカインの放出を伴う免疫応答である。細胞媒介性免疫は、一般的に、いくつかのＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化、およびＴ細胞媒介性応答を指すために使用される。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染に対応する上で特に重要であり得る。
例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘導は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定され得；ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の刺激は、増殖アッセイを使用して測定され得る。抗ノロウイルス抗体価は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量化され得；抗原特異的または交差反応性抗体のアイソタイプはまた、抗アイソタイプ抗体（例えば、抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ）を使用して測定され得る。そのようなアッセイを実行するための方法および技術は、当技術分野で周知である。
サイトカインの存在またはレベルも定量化され得る。例えば、Ｔヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）は、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＯｐｔＥＩＡキット）を使用したＩＦＮ−γおよびＩＬ−４分泌細胞の測定によって特徴付けられる。対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または脾細胞を培養し、上清を分析し得る。Ｔリンパ球はまた、当技術分野で既知であるマーカー特異的蛍光標識および方法を使用して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって定量化され得る。
微小中和アッセイはまた、対象における免疫応答を特徴付けるために行われ得、例えば、Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９７３の方法を参照されたい。ウイルス中和力価は、クリスタルバイオレット固定／細胞の着色に続く溶解プラークの数え上げ（プラークアッセイ）；ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養における細胞溶解の顕微鏡観察；ならびに２）ノロウイルスのＥＬＩＳＡおよび分光光度検出を含む多くの方法で定量化され得る。
本明細書で使用される「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」または「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」という用語は、抗体が特異的に結合する抗原の構造部分を指す。
また、本明細書では、改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質、または１つもしくは複数の改変ＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰを対象または宿主動物に投与して、それにより抗体または抗体フラグメントを産生することを含む抗体または抗体フラグメントを産生する方法も提供される。改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１遺伝子型ＧＩＩ．４（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択された位置に１つまたは複数の置換、突然変異、または改変を含む。ＶＬＰは、ノロウイルスＶＰ２タンパク質をさらに含み得る。
改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰの有効量、および薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または添加剤を含む、免疫応答を誘導するための組成物も提供される。
植物の発現
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して植物細胞に導入することができる。そのような技術のレビューについては、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；Ｇｅｉｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．（１９８８）；およびＭｉｋｉ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２ｄ Ｅｄ．ＤＴ．Ｄｅｎｎｉｓ，ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ，ＤＤ Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，ＤＢ Ｌａｙｚｅｌｌ（ｅｄｓ），Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ，Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．５６１−５７９（１９９７）を参照されたい。他の方法には、直接的なＤＮＡの取り込み、リポソームの使用、例えば、プロトプラストを使用したエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、および真空浸潤が含まれる。例えば、Ｂｉｌａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｇｅｎｅ １００：２４７−２５０），Ｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：１０４−１１２），Ｇｕｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：１１１−１１６），Ｎｅｕｈａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７５：３０−３６），Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９：１３５３），Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８：１２６５），Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１），ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１：６９４−７０１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９８８），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ａｎｄ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９８９）、ＷＯ９２／０９６９６，ＷＯ９４／００５８３，ＥＰ３３１０８３，ＥＰ１７５９６６，Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２００２，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ，１０５：３４３−３４８），ＥＰ２９０３９５；ＷＯ８７０６６１４；米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；および同第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日に出願された米国特許出願第０８／４３８，６６６号、ならびに１９９２年９月２５日に出願された同第０７／９５１，７１５号（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して植物細胞に導入することができる。そのような技術のレビューについては、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；Ｇｅｉｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．（１９８８）；およびＭｉｋｉ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２ｄ Ｅｄ．ＤＴ．Ｄｅｎｎｉｓ，ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ，ＤＤ Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，ＤＢ Ｌａｙｚｅｌｌ（ｅｄｓ），Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ，Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．５６１−５７９（１９９７）を参照されたい。他の方法には、直接的なＤＮＡの取り込み、リポソームの使用、例えば、プロトプラストを使用したエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、および真空浸潤が含まれる。例えば、Ｂｉｌａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｇｅｎｅ １００：２４７−２５０），Ｓｃｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：１０４−１１２），Ｇｕｅｒｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：１１１−１１６），Ｎｅｕｈａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７５：３０−３６），Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）；Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９：１３５３），Ｈｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８：１２６５），Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１），ＤｅＢｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１：６９４−７０１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９８８），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ａｎｄ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，１９８９）、ＷＯ９２／０９６９６，ＷＯ９４／００５８３，ＥＰ３３１０８３，ＥＰ１７５９６６，Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２００２，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ，１０５：３４３−３４８），ＥＰ２９０３９５；ＷＯ８７０６６１４；米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；および同第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日に出願された米国特許出願第０８／４３８，６６６号、ならびに１９９２年９月２５日に出願された同第０７／９５１，７１５号（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
一過性発現法を使用して、本発明の構築物を発現させ得る（Ｄ’Ａｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ４８３，ｐａｇｅｓ ４１−５０；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０５：３４３−３４８を参照のこと；これらは参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、Ｋａｐｉｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１２２，１０１−１０８；これは参照により本明細書に組み込まれる）、またはＷＯ００／０６３４００、ＷＯ００／０３７６６３（これらは参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されるような真空ベースの一過性発現法が使用され得る。これらの方法には、例えば、これらに限定されないが、アグロイノキュレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）またはアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、シリンジ浸潤の方法が含まれ得るが、他の一時的な方法も上記のように使用され得る。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーション、またはシリンジ浸潤では、所望の核酸を含むアグロバクテリアの混合物が、組織、例えば、葉、植物の地上部分（茎、葉、および花を含む）、他の植物の一部（茎、根、花）、または植物全体の細胞間空間に入る。表皮を通過した後、アグロバクテリアは、感染し、ｔ−ＤＮＡコピーを細胞に移入する。ｔ−ＤＮＡは、エピソームで転写され、ｍＲＮＡが翻訳されて、感染細胞で目的のタンパク質が産生されるが、核内部でのｔ−ＤＮＡの通過は、一時的なものである。
また、本発明の一部と見なされるのは、本明細書に記載の一過性タンパク質発現に適したプラットフォーム植物として使用され得る、本発明の遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物、植物細胞、または種子である。植物細胞から植物全体を再生する方法も当技術分野で既知である（例えば、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３，Ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ ＲＲＤ ｅｄ）Ｏｘｆｏｒｄ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｐｐ １２１−１４８を参照）。一般に、形質転換された植物細胞は、抗生物質などの選択的薬剤を含有し得る適切な培地で培養され、選択可能なマーカーは、形質転換された植物細胞の同定を容易にするために使用される。カルスが形成されると、既知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いることによってシュート形成を促進することができ、シュートは、植物の再生のために発根培地に移入される。次いで、植物を使用して、種子から、または栄養繁殖技術を使用して、反復世代を確立し得る。トランスジェニック植物は、組織培養を使用せずに生成することもできる。これらの生物の安定した形質転換および再生のための方法は、当業者に確立されており、当業者に既知である。利用可能な技術は、Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，ＶｏＩ Ｉ，Ｉｌ ａｎｄ ＩＩＩ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８４）、ならびにＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）でレビューされている。形質転換および再生された植物を得る方法は、本発明にとって重要ではない。
植物、植物部分、または植物細胞が２つ以上の核酸構築物によって形質転換または同時形質転換される場合、核酸構築物は、核酸がプールされ、細菌細胞がトランスフェクトされるように、単一のトランスフェクションイベントでアグロバクテリウムに導入され得る。あるいは、構築物は、連続的に導入され得る。この場合、記載されるように第１の構築物は、アグロバクテリウムに導入され、細胞は、単一で形質転換された細菌のみが増殖できる選択的条件下（例えば、抗生物質の存在下）で増殖される。この第１の選択ステップに続いて、記載されているように第２の核酸構築物は、アグロバクテリウムに導入され、細胞は、二重に形質転換された細菌のみが増殖できる二重選択条件下で増殖される。次いで、二重に形質転換された細菌を使用して、本明細書に記載されるように植物、植物部分、もしくは植物細胞を形質転換してもよく、または第３の核酸構築物を収容するためのさらなる形質転換ステップに供してもよい。
あるいは、植物、植物部分、または植物細胞が２つ以上の核酸構築物によって形質転換または同時形質転換される場合、核酸構築物は、アグロバクテリウム細胞の混合物を植物、植物部分、または植物細胞と共浸潤させることによって植物に導入され得、各アグロバクテリウム細胞は、植物内に導入される１つ以上の構築物を含み得る。構築物内の目的のヌクレオチド配列の植物、植物部分、または植物細胞内の相対的発現レベルを変化させるために、浸潤ステップ中に、所望の構築物を含む様々なアグロバクテリウム集団の濃度を変化させ得る。
したがって、本明細書では、１つもしくは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質、または１つもしくは複数の改変ＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰを含む植物、植物の一部、植物細胞、または植物抽出物が提供される。１つもしくは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択された位置に１つもしくは複数の置換、突然変異、または改変を含む。ＶＬＰは、ノロウイルスＶＰ２タンパク質をさらに含み得る。
また、１つもしくは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチド配列を含む、植物、植物の一部、植物細胞、または植物抽出物も本明細書で提供される。１つもしくは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、またはＧＩＩ．４／２０１２、配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択された位置に１つもしくは複数の置換、突然変異、または改変を含む。
以下の例において、本発明をさらに説明する。
例１：ノロウイルスＶＰ１構築物
ＧＩＩ．４ ＶＰ１の候補天然配列の例は、例えばＧｅｎｂａｎｋで公開されている。ノロウイルス株は、経時的に定期的に突然変異および進化することが既知であり、ＧＩＩ．４の遺伝子型内変動は、周知であるため、以下に提供する例は、非限定的であると見なされることを理解されたい（例えば、Ｐａｒｒａ Ｇ．Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，２０１７ ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １３（１）：ｅ１００６１３６，ｄｏｉ：１０．３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００６１３６を参照；参照により本明細書に組み込まれる）。天然ＧＩＩ．４ ＶＰ１配列の非限定的な例には、以下が含まれる：
ＧＩＩ．４ ＶＰ１の候補天然配列の例は、例えばＧｅｎｂａｎｋで公開されている。ノロウイルス株は、経時的に定期的に突然変異および進化することが既知であり、ＧＩＩ．４の遺伝子型内変動は、周知であるため、以下に提供する例は、非限定的であると見なされることを理解されたい（例えば、Ｐａｒｒａ Ｇ．Ｉ．ｅｔ．ａｌ．，２０１７ ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ １３（１）：ｅ１００６１３６，ｄｏｉ：１０．３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００６１３６を参照；参照により本明細書に組み込まれる）。天然ＧＩＩ．４ ＶＰ１配列の非限定的な例には、以下が含まれる：
Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（ＧＩＩ．４＿Ｓｙｄｎｅｙ＿２０１２＿Ｋ４ＬＭ８９とも呼ばれる；ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１および２；図５Ａおよび５Ｂ）。
Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ２０１５（ＧＩＩ．４／２０１５；配列番号：３および４；図５Ｃおよび５Ｄ）；
ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（ＧＩＩ．４；配列番号：５；図６Ａ）；
ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（ＧＩＩ．４；配列番号：６；図６Ｂ）；
Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（ＧＩＩ．４；配列番号：７；図６Ｃ）；
２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（ＧＩＩ．４；配列番号：８；図６Ｄ）；
ＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（ＧＩＩ．４；配列番号：９；図６Ｅ）。
表２に記載されたプライマーを使用して、以下に説明する構築物を調製した。
２Ｘ３５Ｓ／ａｔＰＫ７４／ＶＰ１ ＧＩＩ．４−Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５（ｈＣｏｄ）／ＮＯＳ＋ＭＡＲ（構築物番号４１５３）
ノロウイルス株ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５からのＶＰ１をコードするヒトコドン最適化配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現システムにクローニングした。ＧＩＩ．４ ＶＰ１コーディング配列を含有するフラグメントは、テンプレートとしてヒトコドン最適化ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５ ＶＰ１遺伝子配列（配列番号：４）を使用してプライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ（配列番号：７３）およびＩＦ−（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）．ｒ（配列番号：７４）を使用して増幅した。配列最適化のために、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５株のタンパク質配列（配列番号：３）を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量、およびｍＲＮＡ構造のために最適化した。ＰＣＲ産物は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現システムでクローニングした。構築物番号３６７４（配列番号：７０、図１６Ａ；構築物の概略図１６Ｂ）をＡａｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線形化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号３６７４は、ＭＡＲ調節エレメントと共に２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。また、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを共発現させるための遺伝子構築物も組み込む。バックボーンは、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左Ｔ−ＤＮＡから右Ｔ−ＤＮＡ境界の配列は、配列番号：７０に含まれる。得られた構築物に番号４１５３（配列番号：７１）を与えた。ノロウイルス株ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５由来の天然ＶＰ１のアミノ酸配列は、配列番号：３で示される。プラスミド４１５３の表現を図５Ｅに示す。
ノロウイルス株ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５からのＶＰ１をコードするヒトコドン最適化配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現システムにクローニングした。ＧＩＩ．４ ＶＰ１コーディング配列を含有するフラグメントは、テンプレートとしてヒトコドン最適化ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５ ＶＰ１遺伝子配列（配列番号：４）を使用してプライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ（配列番号：７３）およびＩＦ−（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）．ｒ（配列番号：７４）を使用して増幅した。配列最適化のために、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５株のタンパク質配列（配列番号：３）を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量、およびｍＲＮＡ構造のために最適化した。ＰＣＲ産物は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現システムでクローニングした。構築物番号３６７４（配列番号：７０、図１６Ａ；構築物の概略図１６Ｂ）をＡａｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線形化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号３６７４は、ＭＡＲ調節エレメントと共に２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。また、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを共発現させるための遺伝子構築物も組み込む。バックボーンは、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左Ｔ−ＤＮＡから右Ｔ−ＤＮＡ境界の配列は、配列番号：７０に含まれる。得られた構築物に番号４１５３（配列番号：７１）を与えた。ノロウイルス株ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５由来の天然ＶＰ１のアミノ酸配列は、配列番号：３で示される。プラスミド４１５３の表現を図５Ｅに示す。
２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＧＩＩ．４−Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５＿Ｐ８０Ｓ（ｈＣｏｄ）／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ＋ＭＡＲ（構築物番号４１５４）
ＳドメインにＰ８０Ｓ置換を含む株ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５株のＶＰ１をコードするヒトコドン最適化配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ＋ＭＡＲ発現システムにクローニングした。ＰＣＲの最初のラウンドでは、改変Ｐ８０Ｓアミノ酸を有するＳドメインを含有するフラグメントは、テンプレートとしてヒトコドン最適化ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５ ＶＰ１遺伝子配列（配列番号：４）を使用してプライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ（配列番号：７３）およびＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｒ（配列番号：７９）を使用して増幅した。ＳおよびＰドメインの残りを有するＰ８０Ｓ置換を含有する第２のフラグメントは、テンプレートとしてヒトコドン最適化ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５ ＶＰ１遺伝子配列（配列番号：４）を使用してＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｃ（配列番号：８０）およびＩＦ−（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）．ｒ（配列番号：７４）を使用して増幅した。配列最適化のために、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５株のタンパク質配列（配列番号：３）を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量、およびｍＲＮＡ構造のために最適化した。ＰＣＲ産物は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現システムでクローニングした。構築物番号３６７４（図１６Ｂ）をＡａｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線形化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号３６７４は、ＭＡＲ調節エレメントと共に２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。また、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを共発現させるための遺伝子構築物も組み込む。バックボーンは、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左Ｔ−ＤＮＡから右Ｔ−ＤＮＡ境界の配列は、配列番号：７０に含まれる。得られた構築物に番号４１５４（配列番号：７２）を与えた。改変ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５＿Ｐ８０Ｓのアミノ酸配列は、配列番号：１３で示される。プラスミド４１５４の表現を図７Ｆに示す。
ＳドメインにＰ８０Ｓ置換を含む株ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５株のＶＰ１をコードするヒトコドン最適化配列を、以下のＰＣＲベースの方法を使用して２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ＋ＭＡＲ発現システムにクローニングした。ＰＣＲの最初のラウンドでは、改変Ｐ８０Ｓアミノ酸を有するＳドメインを含有するフラグメントは、テンプレートとしてヒトコドン最適化ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５ ＶＰ１遺伝子配列（配列番号：４）を使用してプライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ（配列番号：７３）およびＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｒ（配列番号：７９）を使用して増幅した。ＳおよびＰドメインの残りを有するＰ８０Ｓ置換を含有する第２のフラグメントは、テンプレートとしてヒトコドン最適化ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５ ＶＰ１遺伝子配列（配列番号：４）を使用してＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｃ（配列番号：８０）およびＩＦ−（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）．ｒ（配列番号：７４）を使用して増幅した。配列最適化のために、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５株のタンパク質配列（配列番号：３）を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含有量、およびｍＲＮＡ構造のために最適化した。ＰＣＲ産物は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳ発現システムでクローニングした。構築物番号３６７４（図１６Ｂ）をＡａｔＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、線形化したプラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号３６７４は、ＭＡＲ調節エレメントと共に２Ｘ３５Ｓ／ｎｂＰＫ７４／ＣＰＭＶ ３’ＵＴＲ／ＮＯＳベースの発現カセットに目的の遺伝子を「Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングすることを目的としたアクセプタープラスミドである。また、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーターの下でサイレンシングのＴＢＳＶ Ｐ１９サプレッサーを共発現させるための遺伝子構築物も組み込む。バックボーンは、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左Ｔ−ＤＮＡから右Ｔ−ＤＮＡ境界の配列は、配列番号：７０に含まれる。得られた構築物に番号４１５４（配列番号：７２）を与えた。改変ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ ２０１５＿Ｐ８０Ｓのアミノ酸配列は、配列番号：１３で示される。プラスミド４１５４の表現を図７Ｆに示す。
野生型および改変ＶＰ１タンパク質、プライマー、テンプレート、および生成物の概要を表３および４に提供する。改変ＶＰ１タンパク質は、上記と同じ方法を使用して集合させた。
例２：方法
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）トランスフェクション
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ１は、Ｄ’Ａｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００８（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．６：９３０−４０）に記載されている方法を使用して、天然ノロウイルスＶＰ１、天然ノロウイルスＶＰ２、またはノロウイルスＶＰ１改変タンパク質発現ベクターでのエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトしたアグロバクテリウムは、１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地で、０．６〜１．６のＯＤ６００まで増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）トランスフェクション
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ１は、Ｄ’Ａｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００８（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．６：９３０−４０）に記載されている方法を使用して、天然ノロウイルスＶＰ１、天然ノロウイルスＶＰ２、またはノロウイルスＶＰ１改変タンパク質発現ベクターでのエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクトしたアグロバクテリウムは、１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地で、０．６〜１．６のＯＤ６００まで増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁した。
植物バイオマスの調製、接種物、およびアグロインフィルトレーション
Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物は、市販のピートモス基質で満たされたフラットの種子から育てた。植物は、１６／８の光周期および２５℃の日中／２０℃の夜の温度レジーム下の温室内で育てた。播種から３週間後、個々の苗木を取り出し、鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに３週間温室で放置して育てた。
Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物は、市販のピートモス基質で満たされたフラットの種子から育てた。植物は、１６／８の光周期および２５℃の日中／２０℃の夜の温度レジーム下の温室内で育てた。播種から３週間後、個々の苗木を取り出し、鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに３週間温室で放置して育てた。
各天然ノロウイルスＶＰ１、天然ノロウイルスＶＰ２、またはノロウイルスＶＰ１改変発現ベクターでトランスフェクトされたアグロバクテリウムを、それらが、０．６〜１．６のＯＤ６００に達するまで、１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンｐＨ５．６を補充したＹＥＢ培地で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁し、４℃で一晩保存した。浸潤の日に、培養バッチを２．５培養容量に希釈し、使用前に加温した。Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の植物全体を２０〜４０トルの真空下で２分間気密ステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液に逆さまに置いた。収穫まで、植物を６または９日のインキュベーション期間の間、温室に戻した。
葉の収穫および総タンパク質抽出
インキュベーション後、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、細かく砕いた。凍結粉砕した植物材料の各サンプルを２倍量の冷１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４μｇ／ｍｌメタ重亜硫酸ナトリウム、および１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドでホモジナイズ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）することにより、総可溶性タンパク質を抽出した。均質化後、スラリーを１０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離し、これらの清澄化された粗抽出物（上清）を分析のために保存した。
インキュベーション後、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、細かく砕いた。凍結粉砕した植物材料の各サンプルを２倍量の冷１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．４μｇ／ｍｌメタ重亜硫酸ナトリウム、および１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドでホモジナイズ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）することにより、総可溶性タンパク質を抽出した。均質化後、スラリーを１０，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離し、これらの清澄化された粗抽出物（上清）を分析のために保存した。
清澄化された粗抽出物の総タンパク質含有量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって決定した。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。クーマシーブリリアントブルーでゲルを染色することにより、タンパク質を視覚化した。あるいは、タンパク質をＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で視覚化し、免疫検出のためにポリフッ化ビニレン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）にエレクトロトランスファーした。イムノブロッティングの前に、メンブレンをトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて、４℃で１６〜１８時間ブロックした。
タンパク質分析およびイムノブロッティング
イムノブロッティングをＧＩおよびＧＩＩ遺伝子型のＶＰ１に特異的な一次ｍＡｂ ２４２Ｐ抗体との最初のインキュベーションで実行し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％中の２％スキムミルクで１／５００に希釈した。１／１００００に希釈したペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ＃１１５−０３５−１４６）を化学発光検出用の二次抗体として使用し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％中の２％スキムミルクで希釈した。免疫反応性複合体を基質としてルミノールを使用する化学発光によって検出した（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ヒトＩｇＧ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ−酵素コンジュゲーションは、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（登録商標）活性化ペルオキシダーゼコンジュゲーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を使用して実施した。
イムノブロッティングをＧＩおよびＧＩＩ遺伝子型のＶＰ１に特異的な一次ｍＡｂ ２４２Ｐ抗体との最初のインキュベーションで実行し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％中の２％スキムミルクで１／５００に希釈した。１／１００００に希釈したペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ＃１１５−０３５−１４６）を化学発光検出用の二次抗体として使用し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％中の２％スキムミルクで希釈した。免疫反応性複合体を基質としてルミノールを使用する化学発光によって検出した（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ヒトＩｇＧ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ−酵素コンジュゲーションは、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（登録商標）活性化ペルオキシダーゼコンジュゲーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を使用して実施した。
ＶＬＰ形成／イオジキサノール勾配の分析
タンパク質は、２倍量の抽出緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いたブレンダーでの機械的抽出により、凍結バイオマスから抽出した。スラリーを大きな孔のナイロンフィルターで濾過して、大きな破片を取り除き、５０００ｇで５分間４℃で遠心分離した。上清を回収し、５０００ｇで３０分間（４℃）で再度遠心分離して、余分な破片を取り除いた。次いで、上澄みを不連続なイオジキサノール密度勾配にロードする。分析密度勾配遠心分離を以下のように実行した：酢酸緩衝液中の不連続イオジキサノール密度勾配を含有する３８ｍｌチューブ（４５％で１ｍｌ、３５％で２ｍｌ、３３％で２ｍｌ、３１％で２ｍｌ、２９％で２ｍｌ、および２５％で５ｍｌのイオジキサノール）を調製し、ウイルス様粒子を含有する２５ｍｌの抽出物で覆った。勾配を１７５０００ｇで４時間（４℃）遠心分離した。遠心分離後、１ｍｌの画分を下から上に収集し、タンパク質染色またはウエスタンブロットと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって画分を分析した。
タンパク質は、２倍量の抽出緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いたブレンダーでの機械的抽出により、凍結バイオマスから抽出した。スラリーを大きな孔のナイロンフィルターで濾過して、大きな破片を取り除き、５０００ｇで５分間４℃で遠心分離した。上清を回収し、５０００ｇで３０分間（４℃）で再度遠心分離して、余分な破片を取り除いた。次いで、上澄みを不連続なイオジキサノール密度勾配にロードする。分析密度勾配遠心分離を以下のように実行した：酢酸緩衝液中の不連続イオジキサノール密度勾配を含有する３８ｍｌチューブ（４５％で１ｍｌ、３５％で２ｍｌ、３３％で２ｍｌ、３１％で２ｍｌ、２９％で２ｍｌ、および２５％で５ｍｌのイオジキサノール）を調製し、ウイルス様粒子を含有する２５ｍｌの抽出物で覆った。勾配を１７５０００ｇで４時間（４℃）遠心分離した。遠心分離後、１ｍｌの画分を下から上に収集し、タンパク質染色またはウエスタンブロットと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって画分を分析した。
電子顕微鏡法
上記のように、不連続なイオジキサノール密度勾配で部分的に清澄化した植物抽出物を遠心分離した後、サンプルを含揺する画分（１ｍｌ／画分）をプールし、１００ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液と混合してチューブを完全に満たし、１０００００ｇで１２０分遠心分離する。ＶＰ１の量に応じて、ペレットを３００〜１０００μｌの緩衝液に再懸濁した。タンパク質含有量をＢＣＡによって分析した。
上記のように、不連続なイオジキサノール密度勾配で部分的に清澄化した植物抽出物を遠心分離した後、サンプルを含揺する画分（１ｍｌ／画分）をプールし、１００ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．２＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液と混合してチューブを完全に満たし、１０００００ｇで１２０分遠心分離する。ＶＰ１の量に応じて、ペレットを３００〜１０００μｌの緩衝液に再懸濁した。タンパク質含有量をＢＣＡによって分析した。
メッシュサイズが２００ｎｍのカーボンコーティングされた銅グリッド。プールされた溶出液は、カーボン側を上にしてペトリ皿のワットマン紙に置き、４℃で一晩インキュベートすることによって親水性になる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察する密度勾配遠心分離からの２０μｌのプール画分をＰａｒａｆｉｌｍに堆積させ、カーボン側を下に向けてグリッドを浮かせ、室温で５分間インキュベートした。次いで、グリッドを２０μｌの水滴で４回洗浄し、グリッドの側面でワットマン紙に触れることにより、最後の洗浄で余分な水を排出する。次いで、グリッドを水中の２％酢酸ウラニルの２０μｌ液滴上で１分間インキュベートする。グリッドをワットマン紙で５分間乾燥させる。観察は、透過型電子顕微鏡下で、１０，０００倍〜１５０，０００倍の範囲の倍率で実行した。
例３：植物におけるＶＰ１タンパク質およびＶＬＰの産生
例２に記載のように、Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に、野生型ノロウイルスＶＰ１またはＶＰ１配列の発現を可能にする改変ノロウイルスＶＰ１構築物をコードする発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を真空浸透させ、ＶＰ１タンパク質および／またはＶＬＰ産生について葉を調べた。浸潤後９日（ＤＰＩ）後、葉ホモジネートから全粗タンパク質抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色するか（ＶＰ１産生）、または上記の例２で記載のように不連続イオジキサノール密度勾配を使用して分離した（ＶＬＰ産生）。密度勾配からの画分は、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して調べた。ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、約５５〜６０ｋＤａのバンドで出現する。密度勾配の画分内でのＶＰ１タンパク質の発生は、密度勾配遠心分離中にＶＬＰが平衡化する画分（複数可）を示している。密度勾配遠心分離後のピーク画分から得られたＶＬＰの収量も決定した。
例２に記載のように、Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に、野生型ノロウイルスＶＰ１またはＶＰ１配列の発現を可能にする改変ノロウイルスＶＰ１構築物をコードする発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を真空浸透させ、ＶＰ１タンパク質および／またはＶＬＰ産生について葉を調べた。浸潤後９日（ＤＰＩ）後、葉ホモジネートから全粗タンパク質抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色するか（ＶＰ１産生）、または上記の例２で記載のように不連続イオジキサノール密度勾配を使用して分離した（ＶＬＰ産生）。密度勾配からの画分は、クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して調べた。ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、約５５〜６０ｋＤａのバンドで出現する。密度勾配の画分内でのＶＰ１タンパク質の発生は、密度勾配遠心分離中にＶＬＰが平衡化する画分（複数可）を示している。密度勾配遠心分離後のピーク画分から得られたＶＬＰの収量も決定した。
野生型ＧＩＩ．４／２０１５遺伝子型変異体Ｈｕ／ＧＩＩ．４＿Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５ ＶＰ１は、植物ではほとんど発現しなかった（図２Ａ）。
対照的に、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４（配列番号：１）の３９、５３、８０、３３３、および３６８位との配列アラインメントにおいて、それらにまたは対応する任意の１つ以上のアミノ酸で置換、突然変異、または改変されている改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１よりも高い収量（図３Ａおよび４Ａ）をもたらし、図３Ｂおよび４Ｂに示すように改変ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰを産生した（図３Ａおよび４Ｂならびに以下に示される収量の倍増は、「１倍」；図２Ａに設定されたＧＩＩ．４／２０１５の発現後に得られた収量に対してである）：
すべての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、１つ以上の実施形態に関して説明してきた。しかしながら、当業者には、記載された主題に対して多くの変形および修正を行うことができることが明らかであろう。特許請求の範囲の範囲は、例に記載された好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
配列表２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１２／Ｋ４ＬＭ８９の核酸配列
配列表４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５の核酸配列
配列表１０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表１２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表１４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５）の核酸配列
配列表１６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表１８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表２２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表２４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表２６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ）＋Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ａ＋Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表２８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｒ５３Ｉｐｌｕｓ記号 Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表３０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｒ５３Ｉプラス記Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ））の核酸配列
配列表３２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３６８Ｅ））の核酸配列
配列表３４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表３６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表３８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３６８Ｅの核酸配列
配列表４０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表４２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３６８Ｅの核酸配列
配列表４４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３６８Ｅの核酸配列
配列表４６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表４８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表５０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表５２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表５４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表５６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表５８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表６０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表６２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表６４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表６６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表６８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表７０ ＜２２３＞左Ｔ−ＤＮＡから右Ｔ−ＤＮＡまでのクローニングベクター３６７４の核酸配列
配列表７３ ＜２２３＞プライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ
配列表７４ ＜２２３＞プライマーＩＦ−（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）．ｒ
配列表７５ ＜２２３＞プライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２．ｃ
配列表７６ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４（Ｐ８０Ｓ）．ｒ
配列表７７ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４（Ｐ８０Ｓ）．ｃ
配列表７８ ＜２２３＞プライマーＩＦ−ＧＩＩ４Ｓｙｄ１２ＶＰ１．ｒ
配列表７９ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｒ
配列表８０ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｃ
配列表８１ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）＋ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２．ｒ
配列表８２ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２＋ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ
配列表８３ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｍ３３３Ｖ）．ｒ
配列表８４ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｍ３３３Ｖ）．ｃ
配列表８５ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｑ３６８Ｅ）．ｒ
配列表８６ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｑ３６８Ｅ）．ｃ
配列表８７ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ａ３９Ｖ）．ｒ
配列表８８ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ａ３９Ｖ）．ｃ
配列表８９ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ｒ５３Ｉ）．ｒ
配列表９０ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ｒ５３Ｉ）．ｃ
配列表９１ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ａ３９Ｖ）．ｒ
配列表９２ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ａ３９Ｖ）．ｃ
配列表９３ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ｒ５３Ｉ）．ｒ
配列表９４ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ｒ５３Ｉ）．ｃ
配列表４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５の核酸配列
配列表１０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表１２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表１４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５）の核酸配列
配列表１６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表１８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表２２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表２４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表２６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖ＋Ｐ８０Ｓ）＋Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ａ＋Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表２８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｒ５３Ｉｐｌｕｓ記号 Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表３０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｒ５３Ｉプラス記Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ））の核酸配列
配列表３２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３６８Ｅ））の核酸配列
配列表３４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖ）の核酸配列
配列表３６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｑ３６８Ｅ）の核酸配列
配列表３８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ Ｓ（ＧＩＩ．４／２０１２＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓ）プラス記号Ｐ（ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３６８Ｅの核酸配列
配列表４０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表４２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３６８Ｅの核酸配列
配列表４４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３６８Ｅの核酸配列
配列表４６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表４８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表５０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表５２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表５４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表５６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表５８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表６０ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表６２ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓの核酸配列
配列表６４ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖの核酸配列
配列表６６ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表６８ ＜２２３＞Ｈｕ ｃｏｄ ＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１５＿Ａ３９Ｖプラス記号Ｒ５３Ｉプラス記号Ｐ８０Ｓプラス記号Ｍ３３３Ｖプラス記号Ｑ３８６Ｅの核酸配列
配列表７０ ＜２２３＞左Ｔ−ＤＮＡから右Ｔ−ＤＮＡまでのクローニングベクター３６７４の核酸配列
配列表７３ ＜２２３＞プライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ
配列表７４ ＜２２３＞プライマーＩＦ−（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）．ｒ
配列表７５ ＜２２３＞プライマーＩＦ（ｎｂＰＫ７４）ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２．ｃ
配列表７６ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４（Ｐ８０Ｓ）．ｒ
配列表７７ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４（Ｐ８０Ｓ）．ｃ
配列表７８ ＜２２３＞プライマーＩＦ−ＧＩＩ４Ｓｙｄ１２ＶＰ１．ｒ
配列表７９ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｒ
配列表８０ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｐ８０Ｓ）．ｃ
配列表８１ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）＋ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２．ｒ
配列表８２ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２＋ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）．ｃ
配列表８３ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｍ３３３Ｖ）．ｒ
配列表８４ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｍ３３３Ｖ）．ｃ
配列表８５ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｑ３６８Ｅ）．ｒ
配列表８６ ＜２２３＞プライマーＧＩＩ．４Ｓｙｄ１５（ｏｐｔ１）（Ｑ３６８Ｅ）．ｃ
配列表８７ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ａ３９Ｖ）．ｒ
配列表８８ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ａ３９Ｖ）．ｃ
配列表８９ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ｒ５３Ｉ）．ｒ
配列表９０ ＜２２３＞プライマーＶＰ１＿ＧＩＩ．４Ｓｙｄ１２（Ｒ５３Ｉ）．ｃ
配列表９１ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ａ３９Ｖ）．ｒ
配列表９２ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ａ３９Ｖ）．ｃ
配列表９３ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ｒ５３Ｉ）．ｒ
配列表９４ ＜２２３＞プライマーＶＰ１（Ｓｙｄ１５）ＧＩＩ４（ｏｐｔ１）（Ｒ５３Ｉ）．ｃ
野生型（ＧＩＩ．４／２０１５；図２Ａ）と比較したＶＰ１タンパク質収量の増加（図３Ａ、４Ａを参照）、および強力なＶＬＰ産生は、例えば、以下を発現する植物抽出物で観察された。
また、１つもしくは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチド配列を含む、植物、植物の一部、植物細胞、または植物抽出物も本明細書で提供される。１つもしくは複数の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１５（配列番号：３、またはＧＩＩ．４／２０１２、配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、８０、３３３、および３６８との配列アラインメントにおいて、またはそれらに対応するアミノ酸から選択された位置に１つもしくは複数の置換、突然変異、または改変を含む。
対照的に、ＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４（配列番号：１）の３９、５３、８０、３３３、および３６８位との配列アラインメントにおいて、それらにまたは対応する任意の１つ以上のアミノ酸で置換、突然変異、または改変されている改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質は、野生型ＧＩＩ．４／２０１５ ＶＰ１よりも高い収量（図３Ａおよび４Ａ）をもたらし、図３Ｂおよび４Ｂに示すように改変ＶＰ１タンパク質を含むＶＬＰを産生した（図３Ａおよび４Ｂならびに以下に示される収量の倍増は、「１倍」；図２Ａに設定されたＧＩＩ．４／２０１５の発現後に得られた収量に対してである）：
Claims (47)
- 改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ＳドメインおよびＰドメインを含み、
前記ＳドメインはノロウイルスＶＰ１ ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（ＧＩＩ．４／２０１２；配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、または８０に対応する１つもしくは複数のアミノ酸での置換を含む、
前記ＰドメインはノロウイルスＶＰ１ ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３または３６８に対応する１つもしくは複数のアミノ酸での置換を含む、または
それらの組み合わせ
である、上記核酸。 - 前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ＧＩＩ．４ノロウイルスＧＩＩ．４ ＶＰ１タンパク質に由来する、請求項１に記載の核酸。
- 前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質をコードし、前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（配列番号：１）、Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（配列番号：３）、ＵＳ９６／ＧＩＩ．４／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＤＥ＿ＡＹ７４１８１１（配列番号：５）、ＦＨ０２／ＧＩＩ．４／ＦａｒｍｉｎｇｔｏｎＨｉｌｌｓ／２００２／ＵＳ＿ＡＹ５０２０２３（配列番号：６）、Ｈｎｔ０４：ＧＩＩ．４／Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＳＷ５０４Ｄ／２００４／ＡＵ＿ＤＱ０７８８１４（配列番号：７）、２００６ｂ：ＧＩＩ．４／Ｓｈｅｌｌｈａｒｂｏｕｒ−ＮＳＷ６９６Ｔ／２００６／ＡＵ＿ＥＦ６８４９１５（配列番号：８）、およびＮＯ０９：ＧＩＩ．４／Ｏｒａｎｇｅ−ＮＳＷ００１Ｐ／２００８／ＡＵ＿ＧＱ８４５３６７（配列番号：９）の群から選択されるＧＩＩ．４ノロウイルス株由来である請求項１に記載の核酸。
- 前記Ｓドメインが、ノロウイルス株Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５またはＨｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵに由来し、かつＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のノロウイルスＶＰ１タンパク質のアミノ酸８０に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３６８に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３および３６８に対応する位置に２つのアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の核酸。
- 前記Ｓドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９および８０に対応する位置に２つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項８に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３６８に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項８に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３および３６８に対応する位置に２つのアミノ酸置換を含む、請求項８に記載の核酸。
- 前記Ｓドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸５３および８０に対応する位置に２つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１２に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３６８に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１２に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３および３６８に対応する位置に２つのアミノ酸置換を含む、請求項１２に記載の核酸。
- 前記Ｓドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９、５３、および８０に対応する位置に３つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１６に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３６８に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項１６に記載の核酸。
- 前記Ｐドメインが、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３３３および３６８に対応する位置に２つのアミノ酸置換を含む、請求項１６に記載の核酸。
- 前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸３９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、かつ前記アミノ置換が、バリン、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニンへの置換である、請求項１に記載の核酸。
- 前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸８０に対応する位置にアミノ酸置換を含み、かつ前記アミノ置換が、セリン、アスパラギン、システイン、またはスレオニンへの置換である、請求項１に記載の核酸。
- 前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２（配列番号：１）のアミノ酸５３に対応する位置にアミノ酸置換を含み、かつ前記アミノ置換が、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、またはメチオニンへの置換である、請求項１に記載の核酸。
- 前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２配列番号：１）のアミノ酸３３３に対応する位置にアミノ酸置換を含み、かつ前記アミノ置換が、バリン、イソロイシン、またはロイシンへの置換である、請求項１に記載の核酸。
- 前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質が、ノロウイルスＶＰ１タンパク質ＧＩＩ．４／２０１２配列番号：１）のアミノ酸３６８に対応する位置にアミノ酸置換を含み、かつ前記アミノ置換が、グルタミン酸、アスパラギン、またはアスパラギン酸への置換である、請求項１に記載の核酸。
- 前記ヌクレオチド配列のコドン使用頻度が、ヒトコドン使用頻度、増加したＧＣ含有量、またはそれらの組み合わせに最適化されている、請求項１に記載の核酸。
- 請求項１に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項１に記載の核酸によってコードされる改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質。
- Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／２０１５（配列番号：１）またはＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（配列番号：３）と約８０〜約１００％の配列類似性を含む、請求項２７に記載の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質。
- 請求項２８に記載の改変ノロウイルスＶＰ１を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
- 植物、植物の一部、または植物細胞において改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を産生する方法であって、
請求項１に記載の核酸を前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞に導入すること、および
前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞をインキュベートすること
を含む、上記方法。 - 前記方法が、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞を収穫するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記方法が、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞から前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を抽出するステップ、精製するステップ、または抽出かつ精製するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
- 請求項３２に記載の方法によって産生された改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質。
- 植物、植物の一部、または植物細胞においてノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
請求項１に記載の核酸を前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞に導入すること、および
前記ノロウイルスＶＬＰの発現を可能にする条件下で、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞をインキュベートすること
を含む、上記方法。 - 前記方法が、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞を収穫するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記方法が、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞から前記ノロウイルスＶＬＰを抽出するステップ、精製するステップ、または抽出かつ精製するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
- 請求項３４に記載の方法によって産生されたノロウイルスＶＬＰ。
- 請求項３３に記載のノロウイルスＶＰ１タンパク質を含む植物、植物の一部、または植物細胞。
- 請求項３７に記載のＶＬＰを含む植物、植物の一部、または植物細胞。
- 請求項１に記載の前記組換え核酸を含む植物、植物の一部、または植物細胞。
- 請求項３０に記載の方法によって産生された改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含む植物抽出物。
- 請求項３４に記載の方法によって産生されたノロウイルスＶＬＰを含む植物抽出物。
- 請求項２９に記載のＶＬＰの有効量、および薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または添加剤を含む、免疫応答を誘導するための組成物。
- 免疫応答を誘導するための、請求項２７に記載の改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の有効量を含むワクチン。
- 対象においてノロウイルス感染に対する免疫を誘導するための方法であって、請求項２９に記載のＶＬＰを前記対象に投与することを含む方法。
- 前記ＶＬＰが、経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、直腸、または膣内で前記対象に投与される、請求項４５に記載の方法。
- 植物、植物の一部、または植物細胞におけるノロウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）の収量を増加させる方法であって、
請求項１に記載の核酸を前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞に導入すること、および
前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞をインキュベートし、それにより前記ノロウイルスＶＬＰを産生すること、
を含み、前記改変ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含む前記ノロウイルスＶＬＰの収量が、同じ条件下で、前記植物、前記植物の一部、または前記植物細胞で産生される野生型ノロウイルスＶＰ１タンパク質を含むノロウイルスＶＬＰの収量よりも大きい、上記方法。
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