JP2021523942A - 療法における使用のためのウロリシンaおよびその誘導体 - Google Patents

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ハリバブ・ボッドゥルリ
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プラビーン・クマール・ベムラ
サンディープ・チャンドラシェカラッパ
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Institute For Stem Cell Biology And Regenerative Medicine Instem
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Abstract

本発明のいくつかの実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、(II)、および(III)、ならびにウロリシン誘導体)が開示される。他の実施形態は、本発明の化合物を含む組成物(例えば、医薬組成物)を含む。本発明のさらに他の実施形態は、例えば、本発明の化合物を使用して特定の疾患を治療するための組成物(例えば、医薬組成物)を含む。いくつかの実施形態は、本発明の化合物(例えば、組成物または医薬組成物中)を投与および(例えば、疾患の)治療のために使用する方法を含む。さらなる実施形態は、本発明の化合物を作製する方法を含む。本発明の追加の実施形態もまた、本明細書で論じられる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年5月15日に出願された「Synthetic Analogs of Gut Microbial Metabolites for Protection of Endothelial and Epithelial Barriers and Applications Thereof」と題される米国仮特許出願第62/671,737号の権益を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたR21 CA216090およびP20 GM125504に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
多数の疾患(例えば、炎症性腸疾患、アルコール性肝疾患、がん、および多くの他の疾患)が人類を悩ましている。いくつかの場合において、炎症を制御または軽減することは、これらの疾患の治療に役立ち得る。いくつかの化合物は、ある特定の疾患を治療する(例えば、炎症を低減することによって)ことが知られているが、それは不十分になされる。
本発明の特定の実施形態は、上述の欠陥のうちの1つ以上に対処する。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、本発明の化合物、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、(II)、および(III)、ならびにウロリシン誘導体)が開示される。他の実施形態は、本発明の化合物を含む組成物(例えば、医薬組成物)を含む。本発明のさらに他の実施形態は、例えば、本発明の化合物を使用して特定の疾患を治療するための組成物(例えば、医薬組成物)を含む。いくつかの実施形態は、本発明の化合物(例えば、組成物または医薬組成物中)を投与および(例えば、疾患の)治療のために使用する方法を含む。さらなる実施形態は、本発明の化合物を作製する方法を含む。本発明の追加の実施形態もまた、本明細書で論じられる。
本発明は、バイオテクノロジー部門によって授与されたBT/PR12490/AAQ/3/716/2015の下でインド政府の支援を受けて行われた
本発明のいくつかの実施形態は、以下
Figure 2021523942
それらの塩、光学異性体、幾何異性体、異性体の塩、および誘導体から選択される化合物を含む。他の実施形態では、XとXとの間の結合は、単結合または二重結合である。他の実施形態では、XとXとの間の結合は、単結合または二重結合である。さらに他の実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、CH、O、S、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、N、NH、C−ハロゲン、C(H)(ハロゲン)、C−(ハロゲン)、C−シクロアルキル、C−ヘテロシクリル、C−アリール、C−ヘテロアリール、C(H)(シクロアルキル)、C(H)(ヘテロシクリル)、C(H)(アリール)、またはC(H)(ヘテロアリール)から選択され得、そのCH、CH、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、NH、C(H)(ハロゲン)、C−シクロアルキル、C−ヘテロシクリル、C−アリール、C−ヘテロアリール、C(H)(シクロアルキル)、C(H)(ヘテロシクリル)、C(H)(アリール)、またはC(H)(ヘテロアリール)は、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される。いくつかの実施形態では、XおよびXは、任意選択でさらに環化されて、5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールを形成し、その5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールは、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−CO2H)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される。さらに他の実施形態では、XおよびXは、任意選択でさらに環化されて、5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールを形成し、その5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールは、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−CO2H)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される。特定の実施形態では、R、R、R、R、およびRは、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−C、アルコキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルから選択され得、そのH、OH、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−Cアルコキシ、メチル、エチル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される。いくつかの実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CHまたはNから選択され、そのCHは、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される。
いくつかの実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、O、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=N−アダマンタン、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択され得る。他の実施形態では、XおよびXは同じであるか、XおよびXは同じであるか、XおよびXは同じであるか、XおよびXは同じであるか、またはこれらの組み合わせである。さらに他の実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであるか、または異なり、それぞれが独立して、CHまたはNから選択される。なおも他の実施形態では、R、R、R、R、およびRは、同じであるか、または異なり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、メトキシ、エトキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチル、シクロアルキル、ビシクロアルキル、ヘテロシクリル、またはイミダゾリルから選択される。いくつかの実施形態では、化合物は、式(IA)
Figure 2021523942
それらの塩、光学異性体、幾何異性体、異性体の塩、および誘導体から選択される。特定の実施形態では、XおよびXは、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、O、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択され、そのCH、C(H)(NH)、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)は、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される。他の実施形態では、XおよびXは、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、O、C=O、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択される。なおも他の実施形態では、RおよびRは同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−C、アルコキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチルから選択され、そのH、OH、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−Cアルコキシ、メチル、またはエチルが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される。さらに他の実施形態では、RおよびRは、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、メトキシ、エトキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルから選択される。特定の実施形態では、化合物は、(a)I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122ではないか、(b)表1から選択される化合物であるか、または(c)その両方である。特定の実施形態では、化合物は、(a)I−1、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122ではないか、(b)表1から選択される化合物であるか、または(c)その両方である。
本発明のいくつかの実施形態は、ウロリシン環状エステルの化学基置換を有するウロリシン誘導体を含み、ウロリシンAと比較して誘導体の効力が向上するか、あるいはウロリシンAと比較して酸性pHでのならびに/またはエステラーゼおよび/もしくはプロテアーゼの存在下での誘導体の安定性が向上する。他の実施形態では、ウロリシン環状エステルは、環状エーテルで置き換えられる。なおも他の実施形態では、ウロリシン環状エーテルは1つ以上の置換基を含む。さらに他の実施形態では、環状エーテル置換基は、独立して、ハロ、アミン、置換アミン、ヒドロキシル、ならびに独立して、O、N、またはSから選択される1つまたは2つのヘテロ原子を有するC5またはC6複素環から選択される。特定の実施形態では、ウロリシン環状エステルは、隣接カルボニル基を有する炭素環と置き換えられる。いくつかの実施形態では、ウロリシン環状エステルは、任意選択的で芳香族であり、任意選択的で置換される環状アルケニル基と置き換えられる。他の実施形態では、環状アルケニル基は、1つ以上の置換基を有する。さらに他の実施形態では、環状アルケニル基置換基は、独立して、ケトン、任意選択で置換されたイミン、任意選択で置換されたアミン、ハロ、およびヒドロキシルから選択される。なおも他の実施形態では、ウロリシン環状エステルは、環状アミドと置き換えられる。いくつかの実施形態では、ウロリシン環状エステルは、非環状架橋と置き換えられる。いくつかの実施形態では、ウロリシン芳香族基は、1つ以上の置換基を有する。他の実施形態では、芳香族基は、任意選択で置換されたフェニル基である。特定の実施形態では、1つ以上の芳香族置換基は、独立して、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミン、5員または6員の炭素環式または複素環式環、ニトロ、ニトリル、アルキル、アルキルエーテル、およびハロアルキルから選択される。他の実施形態では、1つ以上のウロリシン芳香族環は、複素環である。さらに他の実施形態では、複素環式環のヘテロ原子は、独立して、N、O、およびSから選択される。なおも他の実施形態では、各芳香族環の置換基は、一緒に第2の架橋環を形成する。特定の実施形態では、第2の架橋環は、第1の架橋環と構造が同じである。他の実施形態では、第2の架橋環は、第1の架橋環と構造が異なる。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)の化合物を含む組成物を含む。他の実施形態では、組成物中の化合物の量は、約0.0001%(総組成物の重量%)〜約99%である。さらに他の実施形態では、組成物は、製剤成分、アジュバント、または担体をさらに含む。なおも他の実施形態では、組成物は、5−フロロウラシルをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)の化合物を含む医薬組成物を含む。他の実施形態では、医薬組成物中の化合物の量は、約0.0001%(総組成物の重量%)〜約50%である。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、製剤成分、アジュバント、または担体をさらに含む。なおも他の実施形態では、医薬組成物は、5−フロロウラシルをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む1つ以上の組成物の1回以上の投与を含む化合物を動物に提供する方法を含み、この組成物は、投与が2回以上である場合、同じであっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つは、製剤成分をさらに含む。他の実施形態では、1つ以上の組成物の少なくとも1つは、本明細書に開示される任意の組成物または本明細書に開示される任意の医薬組成物を含む。さらに他の実施形態では、1回以上の投与のうちの少なくとも1回は、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、皮膚内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与を含む。さらに他の実施形態では、投与が2回以上である場合、少なくとも1回の投与に使用される少なくとも1つの組成物は、少なくとも1回の他の投与の組成物とは異なる。なおも他の実施形態では、1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つの化合物は、動物体重1kg当たり約0.01mg〜動物体重1kg当たり約50mgの量で動物に投与される。特定の実施形態では、動物は、ヒト、げっ歯類、または霊長類である。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む1つ以上の組成物の1回以上の投与を含む、疾患について動物を治療する方法であって、この組成物は、投与が2回以上である場合、同じであっても異なっていてもよい、方法を含む。他の実施形態では、1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つは、製剤成分をさらに含む。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物または医薬組成物のいずれかの1つ以上の少なくとも1つは、本明細書に開示される組成物のいずれかである。さらに他の実施形態では、1回以上の投与のうちの少なくとも1回は、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、皮膚内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与を含む。なおも他の実施形態では、投与が2回以上である場合、少なくとも1回の投与に使用される少なくとも1つの組成物は、少なくとも1回の他の投与の組成物とは異なる。特定の実施形態では、1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つの化合物は、動物体重1kg当たり約0.005mg〜動物体重1kg当たり約50mgの量で動物に投与される。他の実施形態では、動物は、ヒト、げっ歯類、または霊長類である。さらに他の実施形態では、動物は、治療を必要としている。他の実施形態では、本方法は、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、腸透過性、リーキーガット、金属誘発性腸漏出、ストレス誘発性腸漏出、放射線誘発性腸透過性、大腸炎、局所炎症、脳内炎症、口腔内炎症、食道内炎症、胃内炎症、小腸内炎症、全身性炎症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、感染誘発性炎症性疾患、敗血症、敗血症誘発性腎損傷、敗血症誘発性肺損傷、強皮症、血管炎、薬物誘発性血管炎、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、不安、うつ病、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬物誘発性肝損傷、α−抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、肥満、メタボリック症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、がん、がん性腫瘍、乳癌、結腸癌、認知障害、ストレス、気分障害、または線維症を治療するためのものである。さらに他の実施形態では、本方法は、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、大腸炎、腸透過性、リーキーガット、金属誘発性腸漏出、ストレス誘発性腸漏出、放射線誘発性腸透過性、局所炎症、全身性炎症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、感染誘発性炎症性疾患、敗血症、敗血症誘発性腎損傷、敗血症誘発性肺損傷、強皮症、血管炎、薬物誘発性血管炎、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、がん性腫瘍、乳癌、結腸癌、または線維症を治療するためのものである。なおも他の実施形態では、本方法は、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、腸透過性、リーキーガット、金属誘発性腸漏出、ストレス誘発性腸漏出、放射線誘発性腸透過性、局所炎症、全身性炎症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、がん性腫瘍、乳癌、結腸癌、または線維症を治療するためのものである。さらに他の実施形態では、本方法は、血管炎、薬物誘発性血管炎、強皮症、内臓血管出血、薬物誘発性内出血、アトピー性皮膚炎、灌流関連損傷、灌流関連炎症、糖尿病性網膜症、セリアック病、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、アルコール性脂肪性肝炎(ASH)、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、薬物誘発性肝損傷、慢性腎臓疾患、アルファ抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、炎症、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、喘息、がん、認知障害、ストレス、または気分障害を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、方法は、がんを治療するためのものであり、がんは、膵臓癌、膵臓管腺癌、肺癌、肝臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、黒色腫、皮膚悪性黒色腫、黒色腫腫瘍形成、膀胱癌、前立腺癌、悪性神経鞘腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌、扁平上皮細胞癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、リンパ腫、白血病、骨髄癌、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、多形性膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、基底細胞癌、甲状腺癌、神経芽腫、卵巣癌、腎臓細胞癌、肝細胞癌、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病、横紋筋肉腫、髄膜腫、胃癌(gastric cancer)、神経膠腫、口腔癌、咽頭癌、胃癌(stomach cancer)、子宮癌、髄芽腫、転移を引き起こす可能性のあるがん、転移に起因するがん、またはそれらのがん性腫瘍である。
本発明のいくつかの実施形態は、組織におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を誘導する方法であって、ウロリシン構造類似体を含む有効量の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。他の実施形態では、組織におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を誘導する方法であって、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)の有効量の組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法が存在する。いくつかの実施形態では、対象は胃腸透過性または炎症の症状を呈し、組成物は小腸および/または大腸に投与される。他の実施形態では、対象は、炎症性腸疾患を有する。さらに他の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。なおも他の実施形態では、対象は、セリアック病を有する。特定の実施形態では、炎症性腸疾患は、結腸炎症を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、臓器における内皮または血管バリアの完全性を改善するための量の効果で全身に投与される。さらに他の実施形態では、臓器は、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、皮膚、筋肉、脂肪、脳、眼、骨、および腸管から選択される1つ以上である。なおも他の実施形態では、対象は、血管炎、薬物誘発性血管炎、強皮症、内臓血管出血、薬物性内出血、アトピー性皮膚炎、灌流関連損傷、灌流関連炎症、および糖尿病性網膜症から選択される状態を有する。
本発明のいくつかの実施形態は、全身性炎症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。他の実施形態では、組成物は、腸内または非経口投与される。さらに他の実施形態では、対象は、敗血症または感染誘発性炎症性疾患を有するか、または有するリスクがある。なおも他の実施形態では、対象は、アルコール性肝疾患(ALD)を有するか、または有するリスクがある。特定の実施形態では、対象は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)またはアルコール性脂肪性肝炎(ASH)を有するか、または有するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象は、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、皮膚、筋肉、脂肪、脳、眼、骨、骨髄、腸、および軟骨から選択される1つ以上の臓器または組織の炎症を有する。
本発明のいくつかの実施形態は、神経炎症性障害を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。他の実施形態では、神経炎症性障害は、アルツハイマー病である。さらに他の実施形態では、神経炎症性障害は、パーキンソン病である。なおも他の実施形態では、神経炎症性障害は、任意選択で多発性硬化症である神経変性疾患である。特定の実施形態では、
本発明のいくつかの実施形態は、不安またはうつ病を治療する方法であって、必要とする対象に、対象におけるモノアミンオキシダーゼ酵素を阻害するのに有効な量で、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。他の実施形態では、組成物は、脳に全身性または局所的に投与される。さらに他の実施形態では、組成物は、腸内、非経口、または鼻腔内に投与される。
本発明のいくつかの実施形態は、肺における気道バリアの完全性を増強する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。特定の実施形態では、対象は、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、または喘息を有する。
本発明のいくつかの実施形態は、対象においてオートファジーを改善または増加させる方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法を含む。他の実施形態では、オートファジーは、脳、眼、皮膚、骨、骨髄、軟骨、心臓、肺、胃、腸管、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、および脂肪から選択される対象の組織または臓器において改善または増加する。特定の実施形態では、オートファジーは、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される対象の細胞において、改善または増加する。さらに他の実施形態では、対象は、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬物誘発性肝損傷、慢性腎疾患、アルファ−抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、炎症、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、がん、認知障害、ストレス、および気分障害から選択される疾患または状態を有し、それによって、投与が、疾患または状態を治療または改善する。
本発明のいくつかの実施形態は、対象における寿命を増加させる方法であって、対象に、動物の寿命を増加させるのに有効な本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)を含む組成物のレジメンを投与することを含む、方法を含む。他の実施形態では、対象は脊椎動物である。さらに他の実施形態では、対象は、哺乳動物であり、任意選択で霊長類である。なおも他の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は、獣医科患者である。
本発明のいくつかの実施形態は、細胞においてオートファジーを増加させる方法であって、細胞を、有効量の本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)と接触させることを含む、方法を含む。他の実施形態では、オートファジーは、マイトファジーである。さらに他の実施形態では、細胞は、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される。
本発明のいくつかの実施形態は、インビトロで真核細胞の寿命を増加させる方法であって、細胞を、細胞の寿命を増加させる本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(II)、(III)、(IA)、I−1、またはI−2、ウロリシン誘導体)と接触させることを含む、方法を含む。他の実施形態では、真核細胞は、初代培養物中の真核細胞である。なおも他の実施形態では、真核細胞は、細胞株の一部である。特定の実施形態では、真核細胞は、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、および成体幹細胞から選択される細胞である。
本発明のいくつかの実施形態は、式(I)の化合物を調製する方法であって、(a)式(V)の化合物を式(VI)の化合物と反応させて、式(VII)の化合物を含む混合物を得ることと、(b)式(VII)の化合物を好適な化合物と反応させて、式(I)の化合物を含む混合物を得ることと、(c)任意選択で、式(I)の化合物をさらに反応させて、R、R、R、R、R、X、またはXのうちの1つ以上の性質が、さらなる反応によって変化するように、式(I)の化合物をさらに反応させて、式(I)の異なる化合物を得ることと、(d)式(I)を回収することと、を含む、方法を含む。他の実施形態では、式(V)は、
Figure 2021523942
であり、式(VI)は、
Figure 2021523942
であり、
式中、R20は、ハロゲンまたは
Figure 2021523942
であり、式(VII)は、
Figure 2021523942
である。
特定の実施形態では、ステップbにおける好適な化合物は、塩化Ti(IV)、塩化モリブデン(V)、またはこれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、式(I)は、式(IA)、I−1、またはI−2である。なおも他の実施形態では、R20は、Clまたは
Figure 2021523942
である。他の実施形態では、式(V)は
Figure 2021523942
である。
本発明の他の実施形態もまた、本明細書で論じられる。
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の記載と組み合わせてこれらの図面の1つ以上を参照することにより、よりよく理解できる。
UAS03は、UroAの強力な抗炎症構造類似体であり、タイトジャンクションタンパク質を誘導する。(A)UroA、UAS03の化学構造。UroA/UAS03の安定性を、胃pH2.0および消化酵素の存在下で検査した。UroAおよびUAS03(0.2mg/ml)を消化酵素(エステラーゼおよびプロテアーゼ、100U/ml)と共に37℃で12時間インキュベートし、化合物レベルを定量化した。(B)BMDMを、UroA(青色の線)/UAS03(紫色の線)を含まないかまたは含む(0.1、1、10、25、および50μM)LPS(50ng/ml)で6時間刺激した。上清中のIL−6およびTNF−αレベルを測定した。(C)C57BL/6マウス(n=3〜4)を、UroA(20mg/kg)およびUAS03(20mg/kg)で前処理した。4時間後、LPS(2mg/kg)を腹腔内に注入した。LPS投与の4時間後、IL−6およびTNF−αの血清レベルを測定した。(D)RNA−Seqデータのカノニカル経路解析。HT29細胞をビヒクルまたはUroA(50μM)で24時間処理し、全RNAを単離し、方法に記載されるようにIlluminaHiSeqを使用してRNA−Seqを行った。経路解析は、上方または下方に調節されている遺伝子をアップロードすることによってIngenuity経路解析を使用して行った(p<0.05)。2.5logを超えるp値である経路を示す。関心のあるAhRおよびNrf 2経路が強調される。(E−F)RNA−seq分析−UroAは、HMOX1、CLDN4およびCYP1A1遺伝子を上方制御した。HT29細胞をビヒクルまたはUroA(50μM)で24時間処理し、全RNAを単離し、方法に記載されるようにIlluminaNext Seq 500を使用してRNA−Seqを行った。(E)類似性尺度としてユークリッド距離を使用して、LogFc>0.8の遺伝子をクラスター化した。目的の遺伝子は左から強調表示される:HMOX1、CLDN4、CYP1A1Partekプログラムを使用して生成されたヒートマップ。(F)選択された遺伝子、クローディン4(Cldn4)、シトクロムP4501A1(Cyp1A1)、およびヘモキシゲナーゼ(HMOX1、HO1)の遺伝子カウントおよびそれぞれの倍率変化を示す。(G−I)HT29またはCaco2細胞をビヒクル(DMSO−0.01%)またはUroA/UAS03(50μM)で24時間処理した。(G)HT29細胞中のクローディン4(Cldn4)、オクルデン(Ocln)、およびゾナオクルデンス1(ZO1)のmRNAレベルの倍率変化を、RT PCR法によって決定した。(H)HT29細胞中のCldn4、Ocln、およびZO1のUroA/UAS03の誘導されたタンパク質発現を、免疫ブロットによって決定し、Image Jソフトウェアによって定量化した。(I)Caco2またはHT29細胞をカバースリップ底部FluroDish上で成長させ、ビヒクル、UroA/UAS03で24時間処理した。細胞を、抗Cldn4、続いて、Alexa−488で標識された二次抗体で染色した。DAPIを使用して核を染色した。共焦点像をキャプチャした。緑色強度(n=15〜20個の細胞膜領域)を測定した。Caco2細胞およびHT29細胞のスケールバーは、それぞれ50μmおよび25μmを示す。(J−K)UroA/UAS03治療は、マウスの結腸におけるCldn4、HO1、Nrf2、およびAhRの発現を上方制御する。C57BL/6マウス(7〜8週齢のマウス、n=3〜4)に、ビヒクルまたはUroAまたはUAS03(20mg/kg/体重)を7日間毎日経口補充した。タンパク質溶解物を結腸スクレープから調製し、免疫ブロットに供し、方法に記載の適切な抗体を使用して、(J)Nrf2、HO1、Cldn4、および(K)AhRの発現を検出した。(L)膜貫通上の単層のHT29またはCaco2細胞をビヒクルまたはUroA/UAS03(50μM)で24時間処理した後、LPS(50ng/ml)で2時間処理した。FITC−デキストランをこれらの細胞(膜の上部)に添加し、2時間インキュベートし、底部チャンバウェル中のFITC−デキストランレベルを測定した。結果は、各濃度について3重の3つの独立した実験の代表である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、Veh、UroA、またはUAS03間の無対t検定。エラーバー、±SEM。 UroA/UAS03は、AhR依存的様式でタイトジャンクションタンパク質を増強する。(A)HT29細胞をビヒクル(DMSO−0.01%)/UroA/UAS03(50μM)で24時間処理した。シトクロムP4501A1(Cyp1A1)のmRNAレベルをRT PCRによって測定した。(B)Cyp1A1タンパク質レベルを、免疫ブロットを使用して測定し、Image Jソフトウェアによってバンド強度を定量化した。(C)Cyp1A1酵素活性をP450−Glo Cyp1A1アッセイにより測定した。HT29細胞をUroAまたはUAS03(0.1、1、10、25、50μM)またはFICZ(0.1、1、10、25、50nM)で24時間処理し、酵素Cyp1A1活性を測定した。(D)HT29細胞(4重ウェル)をUroAまたはUAS03(50μM)またはTCDD(10nM)またはFICZ(100nM)またはBNF(50μM)で24時間処理し、Cyp1A1酵素活性を、方法に記載されるように、ERODアッセイを使用して測定した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM、****p<0.001、***p<0.01、***p<0.05。(E)C57BL/6およびAhR−/−(n=3)マウスをビヒクル(0.25%CMC)、UroA、またはUAS03(20mg/kg)で1週間経口処理し、エトキシレゾルフィン−O−デエチラーゼ(EROD)アッセイによって、Cyp1A1活性を結腸および肝臓において測定した。(F〜H)インビボのCyp1A1酵素活性。(F〜G)C57BL/6(n=3、7週齢)マウスをビヒクル(0.25%Na−CMC)、またはUroA(20mg/kg/日)またはUAS03(20mg/kg/日)で1週間経口処理した。β−ナフトフラボン(BNF、40mg/kg/日)または5,11−ジヒドロインドール[3,2−b]カルバゾール−6−カルボキサルデヒド(FICZ、1μg/マウス/日)を1週間、毎日腹腔内送達した。7日目に、マウスを安楽死させ、結腸および肝臓からのマイクロソームを単離した。Cyp1A1酵素活性を、ERODおよびP450−GloCyp1A1アッセイ方法を用いて測定した。(H)C57BL/6(n=3、7週齢)マウスを、ビヒクルまたはUroA(5mg/kg/日)またはUAS03(5mg/kg/日)またはFICZ(1μg/マウス/日)で1週間腹腔内で処理した。Cyp1A1酵素活性を、P450−Glo Cyp1A1アッセイ法によって結腸および肝臓組織から単離されたマイクロソームから測定した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM ***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。ns:有意ではない。(I)AhRレポーター(ルシフェラーゼ)を発現する細胞をVehまたはUroA/UAS03またはエラージン酸(EA)またはMeBio(AhR高親和性リガンド)で6時間処理し、ビヒクル処理に対する発光の倍率変化を測定した。(J)ビヒクル/UroA/UAS03(50μM)で6時間処理したHT29細胞の免疫蛍光共焦点画像。細胞を、抗AhR抗体(赤色)およびDAPI(青色)で染色した。細胞質および核中の相対蛍光(n=約20個の細胞)を測定した。スケールバーは10μmを示す。(K)VehまたはUroA/UAS03(50μM)で2時間処理したHT29細胞の細胞質および核画分におけるAhRレベル。(L)HT29細胞中のsiRNAを使用して、AhRまたは(M)Cyp1A1をノックダウンし、細胞をビヒクル/UroA/UAS03(50μM)で24時間処理し、免疫ブロットを行って、AhR、Cyp1A1、およびCldn4の発現を検出した。スクランブル(Sc)siRNAトランスフェクションを対照として用いた。Image Jソフトウェアを使用して免疫ブロットを定量化した。データは、各処理についての三重ウェルで2つの独立した複製の代表である。(N〜O)UroA/UAS03は、AhRおよびCyp1A1依存性様式でCldn4を誘導する。それぞれのsiRNAを使用して(N)AhRまたは(O)Cyp1A1の発現を抑制し、図2L〜Mに記載されるように、UroA/UAS03処理時にCldn4発現を評価した。これらは、免疫ブロットの追加の生物学的複製物(AhR siRNAについてはn=3、Cyp1A1 siRNAについてはn=4)であり、図2L〜Mにおいて定量化に使用した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して無対t検定を使用して実施した統計処理を行った。(P)〜(S)Cyp1A1の発現は、Cldn4のUroA/UAS03媒介性上方制御において役割を果たすらしい。Cyp1A1遺伝子を、HT29細胞においてCRISPR/Cas9法を使用して欠失させた。(P)Cldn4の基礎レベルの発現を、親HT29またはCyp1A1(CRISPR/Cas9)細胞においてウェスタンブロットによって検査し、定量化した。(Q)親HT29またはCyp1A1(CRISPR/Cas9)細胞をVehまたはUroAまたはUAS03(50μM)で24時間処理した。Cyp1A1およびCldn4の発現をウェスタンブロットによって測定した。ウェスタンブロットの3つの独立した複製を使用して、Image Jソフトウェアによってバンド強度を定量化した。(R)Cyp1A1(CRISPR/Cas9)細胞(n=3)をVehまたはUroAまたはUAS03(50μM)で24時間処理し、Cldn4およびNQO1の発現を検査し、定量化した。ビヒクルのCldn4またはNQO1/β−アクチンとの比平均を1として設定し、処理と比較することによって、倍率変化を計算した。(S)Cldn4のmRNAレベルを、図2Qに記載されるように処理からのリアルタイムPCRによって測定した。全てのインビトロ試験を3重で行った。エラーバー、±SEM、**p<0.001、**p<0.01、*p<0.05、ns:有意ではない。 Nrf2は、UroA/UAS03が媒介するタイトジャンクションタンパク質の上方制御において役割を果たす。(A〜B)MCF−7細胞のAhRリガンドChip−seq解析。公開されているChIP−Atlas<http://chip−atlas.org/target_genes>でのAhRリガンドのChip−seq解析。(A)AhRはNrf2およびCyp1A1遺伝子を標的とする。(<<http://dbarchive.biosciencedbc.jp/kyushu−u/hg19/target/AHR.1.html>>)。(B)AhRはまた、TJP1、2、3、Ocln、Clnd2、3、および5等のタイトジャンクションタンパク質を標的とする。(C〜F)UroAおよびUAS03は、Nrf2標的遺伝子の発現を上方制御する。(C)HT29細胞をビヒクルまたはUroAまたはUAS03(50μM)(n=3)で処理し、全RNAを単離した。Nrf2のmRNAレベルをSyBRグリーンリアルタイムPCR法を使用して評価した。β−アクチンを使用して発現を正規化した。(D)HT29細胞を、ARE−ルシフェラーゼベクターでトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後、細胞をVeh/UroA/UAS03(50μM)またはスルフォラファン(10μM)で24時間(n=3)処理し、発光を測定した。(E〜F)HT−29細胞溶解物を上述と同様に調製し、抗HO1を使用してHO1について(E)、および抗NQO1を使用してNQO1について(F)、免疫ブロットした。免疫ブロットの定量化は、Image Jソフトウェアを使用して行った。(G)Nrf2レベルを、ビヒクル/UroA/UAS03(50μM)で24時間処理したHT29細胞での免疫ブロットによって決定した。(H)Veh/UroA/UAS03(50μM)で6時間処理したHT29細胞の細胞質画分および核画分におけるNrf2発現。(I)ビヒクル/UroA/UAS03(50μM)で6時間処理したHT29細胞の免疫蛍光共焦点画像。細胞を抗Nrf2抗体およびDAPIで染色した。相対緑色蛍光(n=約20個の細胞)強度を測定した。スケールバーは25μmを示す。(J)ビヒクル/UroA/UAS03(50μM)で24時間処理したWT、Nrf2−/−、およびAhR−/−マウス由来の結腸外植片におけるCldn4およびNQO1の発現。免疫ブロットImage Jソフトウェアを使用して定量化した。(K)結腸摘出培養物からのCldn4、Nrf2、およびHO1のmRNAレベルを、SyBr緑色法を使用してリアルタイムPCRによって測定した。(L〜N)UroA/UAS03は、AhRおよびNrf2依存的様式でCldn4を誘導する(エクスビボ結腸外植片研究)。これらの実験は、異なるマウスからの生物学的複製を表す。WTおよびAhR−/−マウス(L)、ならびにWTおよびNrf2−/−マウス(M)からの結腸外植片を調製し、ビヒクルまたはUroA(50μM)またはUAS03(50μM)またはFICZ(100nM)で24時間誘導し、示されるタンパク質の発現を測定した。これらは、図3Jからのデータを支持する複製である。(O〜S)UroA/UAS03は、AhRおよびNrf2依存性様式でCldn4を誘導する(インビボ処理研究)。C57BL/6(WT)、Nrf2−/−、およびAhR−/−マウス(n=4〜6)をビヒクル(0.25%Na−CMC)またはUroA(20mg/kg/日)またはUAS03(20mg/kg/日)で1週間処理した。結腸を単離し、絨毛を断片化し、方法に記載されるように、総タンパク質を抽出した。(O)Nrf2は、野生型マウスのUroA/UAS03処理時に上方制御される。(P)結腸組織(WTおよびNrf2−/−マウス)におけるNrf2、Cldn4、Ocln、およびTJP3のmRNAレベルの変化を、RT PCRを用いて測定した。(Q)未処理のC57BL/6(WT)、Nrf2−/−、およびAhR−/−マウス(n=3)由来の結腸を単離し、方法に記載されるように、NQO1およびCldn4の発現の基礎レベルを免疫ブロットによって測定した。(R)ビヒクル(0.25%Na−CMC)またはUroA(20mg/kg/日)またはUAS03(20mg/kg/日)で1週間処理したC57BL/6(WT)、Nrf2−/−、およびAhR−/−マウス(n=4)。結腸組織溶解物を調製し、ウェスタンブロットによるCldn4およびNQO1の発現を調べた。UroA/UAS03は、Nrf2−/−、AhR−/−マウスにおけるCldn4およびNQO1の上方制御をしなかった。免疫ブロットは、図3Fのデータを支持する独立した複製を表す。(S)Nrf2の発現を、免疫ブロットによって、図3Jに記載される同じ試料中で決定した。免疫ブロット(n=3)をImage Jを用いて定量化し、Nrf2/β−アクチンの比を表した。(T)C57BL/6、Nrf2−/−、およびAhR−/−マウス(n=3)を、vehまたはUroA/UAS03(20mg/kg)で1週間毎日経口処理した。結腸におけるCldn4およびNQO1タンパク質レベルを、免疫ブロットによって測定し、Image Jソフトウェアによって定量化した。全てのインビトロ試験を3重で行った。結腸外植片および結腸組織の免疫ブロットを、少なくとも6回の独立した実行から定量化した。タンパク質のレベルをβアクチンに正規化し、野生型ビヒクル処理を1に設定し、倍率変化を計算した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM、*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001。 UroA/UAS03処理は、マウスにおけるTNBS誘発性大腸炎を減衰させる。大腸炎は、C57BL/6(8週齢、n=5/群)マウスにおけるTNBS(2.5mg/マウス)の直腸内投与によって誘導された。マウスを、TNBS滴下後、60時間、ビヒクルまたはUroA(20mg/kg)またはUAS03(20mg/kg体重)で12時間毎に経口処理し、実験を72時間で終了させた。3つの独立した実験のうちの1つからの代表的なデータを示す。(A)体重減少パーセント(なし、TNBS−黒色の実線、Veh+TNBS−赤色の実線、UroA+TNBS−青色の実線、UAS03+TNBS−紫色の実線)。(B)疾患活動性指数、(C)腸透過性、(D)結腸長を測定した。(E)結腸の総形態学的変化、(F)結腸重量/長さの比、(G)結腸骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)レベル、(H)血清IL−6、TNF−α、CXCL1、およびIL−1βレベル、(I)結腸のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色切片の顕微鏡写真、ならびに炎症スコアを示す。スケールバーは300μmを示す。(J)これらのマウス(n=3)の結腸におけるCldn4発現を免疫ブロットによって測定し、定量化した。(K〜P)単回用量のUroAおよびUAS03は、マウスにおけるTNBS誘発性大腸炎から保護する。TNBS(2.5mg/マウス)をC57BL/6オス(n=3〜4/群)中で直腸内投与して大腸炎を誘発した。単回用量のUroA(4もしくは20mg/kg体重)またはUAS03(4もしくは20mg/kg体重)またはビヒクル(0.25%カルボキシメチルセルロースナトリウム)を、TNBS滴下の12時間後に経口投与した。TNBS投与後72時間でマウスを安楽死させた。(K)実験設計および体重の変化(%)を示す。(TNBSなし−黒色の実線;Veh+TNBS−赤色の実線;URoA(20mg/kg)+TNBS−青色の実線;UAS03(20mg/kg)+TNBS−紫色の実線;URoA(4mg/kg)+TNBS−青色の破線;UAS03(20mg/kg)+TNBS−紫色の破線)。(L)代表的な結腸画像(M)結腸長を示す。(N)腸透過性を、FITC−デキストラン透過性アッセイを使用して測定した。(O)標準的なELISA法を使用して、血清サイトカインIL−6、TNF−α、CXCL1、およびIL−1βを測定した。(P)Aperio Imagescopeを使用してキャプチャされた代表的なH&E切片画像。スケールバーは100ミクロンを示す。(Q)図4Kに提示されるデータの体重減少パーセントの詳細な分析。(TNBSなし−黒色の実線;Veh+TNBS−赤色の実線;プレTNBS+UroA−青色の実線;プレTNBS+UAS03−紫色の実線;ポストTNBS+UroA−青色の破線;ポストTNBS+UAS03−紫色の破線)。データは、各時点について別々に提示される。(R〜S)マウスにおけるUroA/UAS03毒性の評価。C57BL/6マウス(7〜8週齢のマウス、n=4〜5)を、ビヒクル(Veh)またはUroAまたはUAS03(20または40mg/kg/体重)で28日間毎日経口補充した。(R)体重の変化を週に1回測定した。(ビヒクル−灰色の実線;UroA(20mg/kg)−青色の破線;UroA(40mg/kg)−青色の実線;UAS03(20mg/kg)−紫色の破線;UAS03(40mg/kg)−紫色の実線)(S)標準ELISAキットを使用して、28日目の血清ASTおよびALTレベルを測定した−有意差は観察されなかった。Graphpad Prismソフトウェアを使用して統計解析(無対t検定)を行った。エラーバー、±SEM****p<0.001、***p<0.01*p<0.05。 UroA/UAS03は、TNBS誘発性大腸炎を予防し、有益なバリア活性を維持する。(A)プレTNBS処理。オスのC57BL/6マウス(7〜8週齢の1群あたりn=5)に、ビヒクル(Veh;0.25%カルボキシメチルセルロースナトリウム)またはUroAまたはUAS03(20mg/kg/体重)を1週間毎日経口投与した後、TNBSを直腸投与して大腸炎を誘発した。これらのマウスは、TNBS投与後にいかなる処理も受けなかった。TNBS投与から72時間後にマウスを安楽死させ、特性評価した。(B)ポストTNBS処理。別のセット群のC57BL/6マウス(7〜8週齢の1群あたりn=5匹)は、TNBSの24時間後、48時間後、および72時間後にVehまたはUroAまたはUAS03(20mg/kg)を受けた。(C)TNBS投与後に体重減少パーセントを記録した。(TNBSなし−黒色の実線;Veh+TNBS−赤色の実線;プレTNBS+UroA−青色の実線;プレTNBS+UAS03−紫色の実線;ポストTNBS+UroA−青色の破線;ポストTNBS+UAS03−紫色の破線)。(D)プレ処理群およびポスト処理群からのビヒクル/UroA/UAS03処理マウスを含む対照(TNBSなし)の代表的な結腸画像。(E)結腸重量/長さの比。(F)腸透過性を、FITC−デキストラン漏出アッセイを使用して評価した。(G)IL−6およびTNF−αの血清レベルを、標準的なELISA法を使用して測定した。(H)図5Cに提示されるデータの体重減少パーセントの詳細分析。データは、各時点について別々に提示される。(TNBSなし−黒色の実線;Veh+TNBS−赤色の実線;プレTNBS+UroA−青色の実線;プレTNBS+UAS03−紫色の実線;ポストTNBS+UroA−青色の破線;ポストTNBS+UAS03−紫色の破線)。(I〜M)UroA/UAS03による処理は、DSS誘発性急性大腸炎を緩和する。C57BL/6マウス(7〜8週齢のマウス、n=8)に、飲料水中の3%DSSを7日間投与し、それらを通常の水で7日間回復させた。UroA(20mg/kg)またはUAS03(20mg/kg)またはビヒクル(0.25%カルボキシメチルセルロースナトリウム)を、DSS後4日目および6日目に100μl体積で経口送達した。15日目に、マウスを安楽死させ、結腸炎症を分析した。(I)実験設計および疾患活動性指数(DAI)スコアを示す(溶媒−赤色の実線;UroA−青色の実線;UAS03−紫色の実線)。(J)結腸長、(K)FITC−デキストランアッセイによる腸透過性を決定した。(L)血清サイトカインを、標準のELISAキットを使用して測定した。(M)Aperio画像スコープを用いて代表的な結腸H&E切片顕微鏡写真をキャプチャした。スケールバーは1mmを示す。Graphpad Prismソフトウェアを使用して統計解析(無対t検定)を行った。エラーバー、±SEM***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。ns:有意ではない。 UroA/UAS03による処理は、DSS誘発性慢性大腸炎を軽減する。(A)C57BL/6マウス(7〜8週齢)を、7日間/サイクルで4サイクルのDSS(2%)によって、14日間の間隔の通常の水によって、処理した。対照群のマウス(n=5)は、DSSなしで通常の水を受けた。0.25%カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC)溶液に再懸濁したUroA/UAS03(20mg/kg/日/体重)(n=9)またはビヒクル(CMC)(n=9)を、各DSSサイクルの4日および6日に投与し、通常の水での1回の処理を行った。n=5/対照;n=9/vehおよびUroA;n=8/UAS03群)マウスを、89日目に安楽死させ、大腸炎表現型特性評価した。(B)FITC−デキストランを用いた腸透過性を評価した。(C)代表的な結腸画像(D)結腸長、(E)結腸重量/長さの比を示す。(F)IL−6、IL−1β、およびTNF−αの血清レベルをELISA法を用いて測定した。(G)MPOレベルを結腸組織において決定した。(H)これらのマウス(n=3)の結腸におけるCldn4発現を免疫ブロットによって測定した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM****p<0.001、***p<0.01*p<0.05。 UroA/UAS03は、Nrf2経路を利用して大腸炎を軽減する。(A〜F)C57BL/6(WT)およびNrf2−/−マウス(n=4〜5/群、7〜8週齢)において、TNBSを使用して大腸炎を誘導した。TNBS投与後12時間ごとにVehまたはUroA/UAS03(20mg/kg体重)でマウスを処理し、72時間で終了した。2つの独立した実験からの代表的なデータを示す。(A)TNBS誘発性大腸炎の実験設計および治療レジメン。(B)体重減少パーセント(TNBSなし−黒色の実線;Veh+TNBS−赤色の実線;UroA+TNBS−青色の実線;UAS03+TNBS−紫色の実線)、(C)代表的な結腸画像、(D)結腸長さ、(E)腸透過性、(F)IL−6およびTNF−αの血清レベルを決定した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して統計解析(無対t検定)を行った。エラーバー、±SEM****p<0.001、***p<0.01*p<0.05。 UroA/UAS03は、AhR依存性経路を介して有益な活性を発揮する。(A〜F)C57BL/6(WT)およびAhR−/−マウス(n=4/群、7〜8週齢)において、TNBSを使用して大腸炎を誘発した。TNBS投与後12時間毎にVehまたはUroA/UAS03(20mg/kg体重)でマウスを処理し、TNBS投与後60時間でマウスを安楽死させた。(A)TNBS誘発性大腸炎の実験設計および治療レジメン。(B)体重減少パーセント(TNBSなし−黒色の実線;Veh+TNBS−赤色の実線;UroA+TNBS−青色の実線;UAS03+TNBS−紫色の実線)、(C)代表的な結腸画像、(D)結腸長さ、(E)腸透過性、(F)IL−6およびTNF−αの血清レベルを決定した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して統計解析(無対t検定)を行った。エラーバー、±SEM****p<0.001、***p<0.01*p<0.05。(G)UroA/UAS03によるAhR−Nrf2依存性タイトジャンクションタンパク質調節。UroA/UAS03(L:リガンド)はAhRに結合し、その核移行を活性化してCyp1A1およびNrf2の発現を誘導する。さらに、UroA/UAS03は、タイトジャンクションタンパク質のNrf2依存性上方制御および強化されたバリア機能を引き起こすらしい。(H)LPS(50ng/ml)誘導IL−6レベルを、野生型(WT)、Nrf2−/−およびAhR−/−マウス由来の骨髄由来マクロファージ(BMDM)中のビヒクルまたはUroAまたはUAS03(0.1、1、10、20、30、および50μM)の存在下で測定した。データは、3重での2つの独立した実験の代表である。Graphpad Prismソフトウェアを使用して統計解析(無対t検定)を行った。エラーバー、±SEM****p<0.001、***p<0.01*p<0.05。 (A)図7Bに提示されるデータの体重減少パーセントの詳細分析。データは、各時点について別々に提示される(TNBSなし−黒色の実線、Veh+TNBS−赤色の実線、UroA+TNBS−青色の実線、UAS03+TNBS−紫色の実線)。(B)図8Bに提示されるデータの体重減少パーセントの詳細分析。データは、各時点について別々に提示される。(なし、TNBS−黒色の実線、Veh+TNBS−赤色の実線、UroA+TNBS−青色の実線、UAS03+TNBS−紫色の実線)。(C〜G)UroA/UAS03は、BMDM中のNrf2依存性経路を活性化する。(C)野生型BMDMを単離し、7日間培養した。BMDMをVeh(0.01%DMSO)またはUroAまたはUAS03(50μM)で6時間処理し、全RNAを単離した。Nrf2レベルをSyBRgreenリアルタイムPCR法を用いて測定した。(D)VehまたはUroAまたはUAS03で処理したBMDM細胞溶解物をNrf2について免疫ブロットした。(E)BMDMの核画分および細胞質画分をNr2について免疫ブロットした。ラミンBおよびβ−アクチンを正規化タンパク質として使用した。(F)BMDM細胞をカバースリップ底のフルオロディッシュ上で一晩増殖させ、ビヒクルまたはUroA(50μM)またはUAS03(50μM)で6時間処理した。Nrf2の発現を、抗Nrf2を使用する免疫蛍光染色、続いてAlexa−488染料で標識された二次抗体によって決定し、DAPIを使用して核を染色した。蛍光画像をNikon A1R共焦点顕微鏡を用いて60倍倍率でキャプチャし、緑色蛍光(n=>15細胞)をNikon素子ソフトウェアを用いて測定した。スケールバーは25μmを示す。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05(G)BMDMはビヒクルまたはUroA(50μM)またはUAS03(50μM)で24時間処理し、方法に記載されるようにSyBR RT PCRを使用してmRNAレベルを推定した。(H〜I)UroA/UAS03は、AhR依存的様式でLPS誘発性NF−κB活性化を低減する。NF−κB活性化をEMSAアッセイによって評価した。生の267.4細胞(H)またはBMDM(I)を、UroAまたはUAS03(25μM)の存在または非在下で6時間LPS(50ng/mL)で処理し、核抽出物(2μg)を使用して、EMSAによってNF−κB結合を決定した。(J〜L)UroA/UAS03は、AhRを通じて抗炎症活性を媒介する。(J〜K)IL−6データは、それ自体の基礎レベルの倍率として表される。絶対値は、主な図(図7Fおよび8F)に提供される。(J)WTおよびNrf2−/−マウス、(K)WTおよびAhR−/−マウスにおけるTNBS誘導大腸炎モデルにおける血清IL−6変化。(L)UroA/UAS03の存在下または非存在下でのIL−6のLPS誘導レベル。絶対値および詳細凡例を図8Hに提供する。基準に対する倍率変化を、それ自体の対照を使用して計算した。WT+VehまたはNrf2−/−+VehまたはAhR2−/−+Vehを使用して、1に正規化した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM****p<0.001、***p<0.01;*p<0.05。 UAS03の合成。化合物UAS03は、本明細書に記載されるように、ラクトンを環状エーテルに還元することによって合成されている。 UroAは、ヒト初代単球中のLPSおよびEtOH誘導TNF−αを低減する。(A)UroAおよびLPS(50ng/ml)で6時間処理したヒト初代単球。上清中のTNF−αを測定した。(B)ヒト初代単球をEtOH(25mM)に7日間曝露した。LPS(50ng/ml)およびUroAを6日目に添加し、24時間インキュベートした。上清中のTNF−αレベルを、標準的なELISA法を使用して測定した。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM;****p<0.001;***p<0.01 UroA/UAS03は、LPSまたはアルコール誘発のOclnの枯渇から保護し、透過性を保護する。(A)Caco2細胞を指示された用量でLPSで24時間処理し、ウェスタンブロットを実施してOclnの発現を決定した。(B)Caco2細胞を、UroAまたはUAS03(10、25、50μM)と組み合わせてLPSで24時間処理し、Ocln発現を決定した。 Caco2細胞を、経ウェル膜フィルター上で単層として増殖させた。(A)細胞を40mMのEtOHで処理し、FITC−デキストラン透過性を時間依存的に行った。(B−F)細胞を、それぞれのウロリシン(50μM)およびエラギン酸(50μM)または異なる用量のUroA(B)で24時間処理した。処理後、細胞をエタノール(40mM)(B、D)または400mM(E、F)、LPS(100ng/mL)、HMGB1(500ng/mL)で2時間処理し、PBSで洗浄した。FITC−Dex(1mg/mL)溶液を、頂部側に(100μl)添加した。単層にわたるFITC−Dexの透過性、およびTEER値を2時間後に測定した。(G〜H)UroAは、Caco−2細胞におけるEtOH誘導TJ破壊から保護する。TJタンパク質染色の共焦点画像。無対t検定を使用して統計処理を行った。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、エラーバー、±SEM。 UAS03は、EtOH誘発バリア機能障害から保護する。経ウェル膜上のCaco2細胞を、ビヒクルまたはUroAまたはUAS03(10、25、50μM)で24時間前処理した後、アルコール(2%)を24時間添加した。TEER値(A)およびFITC−デキストラン透過性アッセイ(B)を、図2に記載されるように行った。Graphpad Prismソフトウェアを使用して、無対t検定を使用して統計処理を行った。エラーバー、±SEM;****p<0.001;***p<0.01。(C)Caco2細胞を、UroAまたはUAS03(10、25、50μM)の存在下またはそれを用いてアルコール(EtOH)(350mMまたは2%)で24時間処理し、ウェスタンブロットによってOclnの発現を決定した。3つの独立したブロットの代表が示された。 UROA処理は、EtOH乱用誘導ALDを低減する。(A)急性アルコールモデル:メスの野生型(C547BL/6)マウス(n=6/群)を、0、12、および24時間でアルコール(5g/kg)を強制経口投与した。マウスを、2、14、および26時間目にVeh(0.25%CMC)またはUroA(20mg/kg)で処理した。マウスを32時間で安楽死させた。(B)FITC−デキストランの強制経口投与後4時間のFITC−デキストランの血清レベルを決定することによって、インビボ透過性を測定し、(C)糞便アルブミンを標準的なELISAを使用して測定した。(D〜I)示される血清サイトカイン/マーカーレベルを、標準的なELISAを使用して血清中で測定した。(J)肝臓中のトリグリセリド(TG)のレベルを、ELISA法を使用して測定した。エラーバー、±SEM。統計は、2元配置分析多重比較を使用して行った。*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001。 UroA処理は、小腸におけるEtOH誘発ZO−1の破壊から保護する。ZO−1(緑色)および核(DAPI染色)の共焦点画像。EtOHが損傷したZO−1タンパク質(中央パネル)およびEtOHによって誘発される損傷から保護されたUroA処理(下パネル)。 UroAは、慢性低用量アルコール誘発性腸管バリア機能障害および炎症から保護する。低用量の慢性ALDモデルにおいて、C57BL/6マウス(10週齢)を使用した。マウスを1日2回EtOH(3g/kg)で3g/kgで5日間経口処理し、UroA(20mg/kg)をEtOH処理の2時間前に経口投与した。6日目にマウスを安楽死させ、示されるパラメータを解析した。エラーバー、±SEM。統計は、2元配置分析多重比較を使用して行った。*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001。 UAS03は、慢性ALDを軽減する。(A)C57BL/6マウス(10週齢)を慢性ALDモデルに使用し、記載されるように4週間後に分析した。ペア供給(n=5/群)およびEtOH供給(n=10/群)マウスをVeh(0.25%CMC)およびUAS03(20mg/kg)で4週間隔日で処理した。(B)FITC−デキストランを使用して、結腸の総画像(C)結腸長、(D)インビボ透過性を測定した。(E)ELISA法を使用して、血清ALT、AST、エンドトキシン、IL−6、TNF−αを測定した。(F)肝臓のH&E切片(20倍)を示す。スケールバーは100μmである。EtOH群には、脂肪滴(白色)が見られる。(G)トリグリセリド(TG)、IL−6、TNF−α、および骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)のレベルを肝臓組織において測定した。(H)VehまたはUAS03で処理したEtOHを供給したマウス由来の回腸組織(n=3)中のOcln発現の免疫ブロット。エラーバー、±SEM。統計は、2元配置分析多重比較を使用して行った。*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001。 UroA処理は、AhR−/−マウスにおいてEtOH乱用誘導ALDから保護することをしなかった。C547BL/6およびAhR−/−マウス(n=4/群)を、0、12、および24時間でアルコール(2.5g/kg)を強制経口投与した。2、14および26時間目にVeh(0.25%CMC)またはUroA(20mg/kg)でマウスを処理した。32時間でマウスを安楽死させた。糞便アルブミンを標準的なELISAを使用して測定した。ELISA法を用いた血清エンドトキシン、TNF−α、ALT、ならびに肝臓ALTおよびTGレベル。エラーバー、±SEM。統計は、2元配置分析多重比較を使用して行った。*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001。 UroA処理は、結腸上皮細胞における接合部タンパク質のEtOH誘導内在化から保護する。ZO1:ゾヌラオクルデン、E−Cad:E−カドヘリン、Ocln:オクルーディン、Cldn4:クローディン4、Cldn1:クローディン1。 UroA処理は、Caco2細胞におけるTNF−αおよびIFN−γ誘導性透過性から保護する。エラーバー、±SEM。統計は、2元配置分析多重比較を使用して行った。*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001。 UAS03(エーテル)は敗血症の死亡率を減衰させる。敗血症マウスのKaplan−Meir生存分析。 敗血症動物におけるUAS03(エーテル)の予防および治療効果。予防および治療環境におけるUAS03のKaplan−Meir生存分析。 UAS03は、Snailトランスジェニックマウスにおける強皮症関連血管透過性を減衰させる。マウスの背中の皮膚におけるエバンの青色染料漏出評価。 Snailトランスジェニックマウスの背中の皮膚における線維症関連遺伝子の発現。マウスの背中の皮膚におけるコラーゲンのmRNA発現。 オートファジー誘導に対するUAS03。蛍光顕微鏡下で見られるオートファゴソームおよびオートリソソームの形成。 10、25、および50μM濃度(6時間)でのマウスBMDMS中のIL−6およびTNF−αについての異なる類似体(PKL3〜10)と共に、UroA、UAS03のスクリーニング。 1、10、および50μM濃度(6時間)でのマウスBMDMS中のIL−6およびTNF−αについての異なる類似体(PKL11〜18)と共に、UroA、UAS03のスクリーニング。 10μM濃度(6時間)でのマウスBMDMS中のIL−6およびTNF−αについての異なる類似体(PKL3〜18)と共に、UroA、UAS03のスクリーニング。 0.01、0.1、1、および10μM濃度(6時間)でのUroA、UAS03、PKL3、PKL4、およびPKL17のスクリーニング。 MAO AおよびMAO B阻害についての異なる類似体と共にURoA、UAS03の一次スクリーニング(100μM濃度)。 MAO AおよびMAO B阻害についての異なる類似体と共にURoA、UAS03の用量依存性(100μM濃度)。 抗炎症活性のスクリーニング。マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、化合物を含んでまたは含まずに、LPS(50ng/ml)で6時間刺激した。上清中のIL−6およびTNF−αレベルを、標準的なELISA方法を使用して測定した。結果は、各濃度について3重の3つの独立した実験の代表である。 様々な化合物の存在下でのMAO酵素の活性。 MAO−AおよびMAO−B活性に対して試験した化合物、ならびに同定されたIC50およびKi値。 化合物は、内皮バリア機能を増強し、内皮バリア機能障害から保護する。 化合物は、化学療法抵抗性がんを化学療法感受性にする。 化合物は、創傷治癒を示す。 P−糖タンパク質(P−gp)の活性に関するUroA。 親細胞および5FUR HCT116細胞におけるEMTマーカーのウェスタンブロット解析。 UroA/UAS03の存在または非存在下で5FUで処理された(72時間)中の5FUR HCT116細胞におけるEMTマーカーのウェスタンブロット解析。 SW−5FUR結腸癌細胞株におけるリアルタイムPCR(A)およびウェスタンブロット(B)によって測定したMRP2の発現。(C)MRP2活性は、SW−FUR結腸癌細胞株におけるCDCFDA(5(6)−カルボキシ−2’,7’−ジクロロフルオレセインのジアセテートエステル)トランスポーターアッセイを使用して測定される。 UroA/UAS03は、薬物輸送体を下方制御する。(A)MRP2の発現は、SW−5FUR結腸癌細胞株中の示された用量のUroAまたはUAS03で処理したときに、リアルタイムPCRによって測定される。(B)MRP2活性を、CDCFDA(5(6)−カルボキシ−2’,7’−ジクロロフルオレセインのジアセテートエステル)トランスポーターアッセイを使用して、UroA/USA03で処理したときのSW−FUR結腸癌細胞株において測定する。
一般的な本発明の概念を包含する実施形態は、多様な形態をとってもよいが、本開示が単なる例示とみなされるべきであり、一般的な本発明の概念は、開示される実施形態に限定されることを意図しないことを理解しながら、様々な実施形態が本明細書に記載される。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、(II)、および(III)、ならびにウロリシン誘導体)が開示される。他の実施形態は、本発明の化合物を含む組成物(例えば、医薬組成物)を含む。本発明のさらに他の実施形態は、例えば、本発明の化合物を使用して特定の疾患を治療するための組成物(例えば、医薬組成物)を含む。いくつかの実施形態は、本発明の化合物(例えば、組成物または医薬組成物中)を投与および(例えば、疾患の)治療のために使用する方法を含む。さらなる実施形態には、本発明の化合物を作製する方法が含まれる。本発明の追加の実施形態もまた、本明細書で論じられる。
本明細書で使用されるとき(別途指定されない限り)、「アルキル」という用語は、一価の直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖(例えば、C〜C24)を意味する。例えば、「C〜Cアルキル」または「C〜Cアルキル」という用語は、それぞれ、1〜7個(例えば、1、2、3、4、5、6、または7個)、または1〜4個(例えば、1、2、3、または4個)の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指す。C〜Cアルキル基の例には、非限定的に、メチル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、n−ブチル、s−ブチル、t−ブチル、n−ペンチル、s−ペンチル、n−ヘキシル、およびn−セプチルが挙げられる。C〜Cアルキル基の例には、非限定的に、メチル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、n−ブチル、s−ブチル、およびt−ブチルが挙げられる。
本明細書で使用する場合(別段の定めがない限り)、「アルキニル」という用語は、1つ以上(例えば、1、2、3、または4つ)の二重結合を含み得る、一価の、直鎖または分枝状炭化水素鎖(例えば、C〜C24)を意味する。アルケニル基の例としては、非限定的に、ビニル、アリル、1−プロペニル、2−プロペニル、1−ブテニル、2−ブテニル、3−ブテニル、1−ペンテニル、2−ペンテニル、3−ペンテニル、4−ペンテニル、1−ヘキセニル、2−ヘキセニル、3−ヘキセニル、4−ヘキセニル、および5−ヘキセニルが挙げられる。
本明細書で使用されるとき(別途指定されない限り)、「アルコキシ」という用語は、酸素原子(アルキル−O−)によって分子の残りに結合される上記アルキル基のいずれか(例えば、C〜C23)を意味する。アルコキシ基の例としては、メトキシ(MeO−)、エトキシ、イソプロポキシ、プロポキシ、およびブチルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき(別段の定めがない限り)、「アルキニル」という用語は、1つ以上の(例えば、1、2、3、または4個の)三重結合を含み、また、任意選択で、鎖中の1つ以上の(例えば、1、2、3、または4個の)二重結合を含み得る、一価の、直鎖または分枝状炭化水素鎖(例えば、C〜C24)を意味する。アルキニル基の例としては、エチニル、1−プロピニル、2−プロピニル、1−ブチニル、2−ブチニル、3−ブチニル、1−ペンチニル、2−ペンチニル、3−ペンチニル、4−ペンチニル、1−ヘキシニル、2−ヘキシニル、3−ヘキシニル、4−ヘキシニル、および5−ヘキシニルが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき(別途指定されない限り)、「アリール」という用語は、非置換の場合、一価、単環式、または二環式、5、6、7、8、9、10、11、または12員の芳香族炭化水素基を意味する。アリール基の例として、非限定的に、フェニル、ナフチル、トリル、およびキシリルが挙げられる。置換環として指定される二環式アリールについては、一方または両方の環を置換することができる。
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」という用語は、一価、単環式または二環式、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12員の炭化水素基を意味する。環は飽和または部分的不飽和であってもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、およびビシクロアルキル(例えば、[2.2.2]ビシクロオクタンまたは[3.3.0]ビシクロオクタン等のビシクロオクタン、[4.3.0]ビシクロノナン等のビシクロノナン、ならびに[4.4.0]ビシクロデカン(デカリン)、またはスピロ化合物等のビシクロデカン)、およびアダマンタンが挙げられるが、これらに限定されない。単環式シクロアルキルの場合、環は芳香族ではない。二環式シクロアルキルについて、一方の環が芳香族である場合、他方は芳香族ではない。置換環として指定される二環式シクロアルキルについては、一方または両方の環を置換することができる。
本明細書で使用されるとき(別途指定されない限り)、「ハロゲン」という用語は、一価のCl、F、Br、またはIを意味する。
本明細書で使用されるとき(特に明記しない限り)、「ヘテロアリール」という用語は、一価、単環式または二環式、5、6、7、8、9、10、11、または12員の炭化水素基を意味し、ここで、1、2、3、4、5、または6個の炭素原子は、窒素、酸素、または硫黄原子から独立して選択されるヘテロ原子によって置き換えられ、単環式または二環式環系は、芳香族である。ヘテロアリール基の例として、チエニル(またはチオフェニル)、フリル、インドリル、ピロリル、ピリジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアキソリル、キノリニル、ピリミジニル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、1H−ピラゾール−4−イル、1−メピラゾール−4−イル、ピリジン−3−イル、ピリジン−4−イル、3,5−ジメチルイソオキサゾリル、1H−ピロール−3−イル、3,5−ジ−メピラゾリル、および1H−ピラゾール−4−イルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールの場合、一方の環がアリールである場合、他方はヘテロアリールである。二環式ヘテロアリールについて、一方または両方の環は、1つ以上のヘテロ原子を有することができる。置換環として指定される二環式ヘテロアリールについては、一方または両方の環を置換することができる。
本明細書で使用されるとき(特に明記しない限り)、「ヘテロシクリル」という用語は、一価、単環式または二環式、5、6、7、8、9、10、11、または12員の炭化水素を意味し、ここで、1、2、3、4、5、または6個の炭素原子は、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子から独立して選択されるヘテロ原子によって置き換えられ、単環式または二環式環系は芳香族ではない。ヘテロシクリル基の例には、テトラヒドロピラン、ピロリジニル(例えば、ピロリジン−1−イル、ピロリジン−2−イル、ピロリジン−3−イル、またはピロリジン−4−イル)、ピペラジニル(例えば、ピペラジン−1−イル、ピペラジン−2−イル、ピペラジン−3−イル、またはピペラジン−4−イル)、ピペリジニル(例えば、ピペラジン−1−イル、ピペラジン−2−イル、ピペラジン−3−イル、またはピペラジン−4−イル)、およびモルホリニル(例えば、モルホリン−1−イル、モルホリン−2−イル、モルホリン−3−イル、またはモルホリン−4−イル)、が挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロシクリルについて、一方の環が芳香族(例えば、単環式アリールまたはヘテロアリール)である場合、他方の環は芳香族ではない。二環式ヘテロシクリルについて、一方または両方の環は、1つ以上のヘテロ原子を有することができる。置換環として指定される二環式ヘテロシクリルについては、一方または両方の環を置換することができる。
本明細書で使用されるとき(別途指定されない限り)、「ヘテロ原子」という用語は、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子から選択される原子を意味する。
本明細書で使用されるとき(別途指定されない限り)、「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、一価の−OH基の存在を示す。
本明細書で使用されるとき(別段の定めがない限り)、「置換された」という用語(例えば、置換アルキル中のような)は、(1つ以上の水素原子を有する)化学基の1つ以上の水素原子が、指定された選択肢から選択される1つ以上の非水素置換基で置き換えられ得ることを意味する。置き換えは1つ以上の位置で行うことができる。「任意選択で置換される」という用語は、(1つ以上の水素原子を有する)化学基の1つ以上の水素原子が置換され得ることを意味するが、置換されることは必須ではない。
本発明のいくつかの化合物は、1つ以上のキラル中心を有し得、1つ以上のキラル中心のいずれかについて、光学活性形態およびラセミ形態で存在し、単離され得る。いくつかの化合物は、多型を呈し得る。本発明の化合物(例えば、式I)は、任意の光学的に活性な、ラセミ体、立体異性体形態、多型、またはそれらの混合物を包含する。キラル中心が化学構造においてその構成(すなわち、RまたはS)を示す指示を提供しない場合、R、S、またはラセミ体を表すことを検討すべきである。
いくつかの化合物の実施形態
本発明のいくつかの実施形態は、以下の式(I)、(II)、または(III)の化合物を含む:
Figure 2021523942
他の実施形態では、XとXとの間の結合は、単結合または二重結合である。特定の実施形態では、XとXとの間の結合は、単結合または二重結合である。なおも他の実施形態では、X、X、X、およびXは同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、CH、CH、O、S、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、C=N−アダマンタン)、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、N、NH、C−ハロゲン、C(H)(ハロゲン)、C−(ハロゲン)、C−シクロアルキル、C−ヘテロシクリル、C−アリール、C−ヘテロアリール、C(H)(シクロアルキル)、C(H)(ヘテロシクリル)、C(H)(アリール)、またはC(H)(ヘテロアリール)から選択され得、そのCH、CH、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、NH、C(H)(ハロゲン)、C−シクロアルキル、C−ヘテロシクリル、C−アリール、C−ヘテロアリール、C(H)(シクロアルキル)、C(H)(ヘテロシクリル)、C(H)(アリール)、またはC(H)(ヘテロアリール)は、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、もしくはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノール(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、または6個)で置換され得る。特定の実施形態では、XおよびXは、任意選択で、さらに環化されて、5または6員シクロアルキル、5または6員ヘテロシクリル、5または6員アリール、または5または6員ヘテロアリールを形成することができ、これらの5または6員シクロアルキル、5または6員ヘテロシクリル、5または6員アリール、または5または6員ヘテロアリールは、任意選択で、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、もしくはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノール(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、6つ)で置換され得る。特定の実施形態では、XおよびXは、任意選択で、さらに環化されて、5または6員のシクロアルキル、5または6員のヘテロシクリル、5または6員のアリール、または5または6員のヘテロアリールを形成することができ、これらの5または6員のシクロアルキル、5または6員のヘテロシクリル、5または6員のアリール、または5または6員のヘテロアリールは、任意選択で、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノール(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、6つ)で置換され得る。当然に、XとXの選択は、XとXの間に単一または二重結合があるかどうかに依存し、XとXの選択は、XとXの間に単一または二重結合があるかどうかに依存するであろう。
いくつかの実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、CH、O、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、C−ハロゲン、C(H)(ハロゲン)、C−(ハロゲン)、C−シクロアルキル、またはC(H)(シクロアルキル)であり得、そのCH、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、C(H)(ハロゲン)、C−シクロアルキル、またはC(H)(シクロアルキル)は、任意選択で、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、もしくはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、または6)で置換され得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは、さらに、環化して、ピラジニル、1,2,5−チアジアゾール1−オキシド、または2H−イミダゾール−2−オンを形成することができる。いくつかの実施形態では、XおよびXは、さらに環化して、ピラジニル、1,2,5−チアジアゾール1−オキシド、2H−イミダゾール−2−オンを形成することができる。
他の実施形態では、X、X、X、およびXは同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、CH、O、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択することができる。さらに他の実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、CH、O、C=O、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択することができる。さらに他の実施形態では、X、X、X、およびXが、同じであり得るか、または異なることができ、各々が、独立して、CH、O、C=O、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、またはC=NEtOHから選択され得る。
いくつかの実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは、同じであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは、異なるものであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは同じであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは、異なるものであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは同じであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは、異なるものであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは同じであり得る。いくつかの実施形態では、XおよびXは、異なるものであり得る。
いくつかの実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、CHまたはNから選択することができ、そのCHは、任意選択で、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、または6個)で置換されてもよい。いくつかの実施形態では、X、X、X、およびXは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが、独立して、CHまたはNから選択されてもよい。いくつかの実施形態では、X、X、X、およびXは、それぞれ、CHであってもよい。
いくつかの実施形態では、R、R、R、R、およびRは同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル(例えば、C、C、C、またはCアルキル)、C−Cアルケニル(例えば、C、C、またはCアルケニル)、C−Cアルキニル(例えば、C、C、またはCアルキニル)、C−Cアルコキシ(例えば、C、C、またはCアルコキシ)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチル、シクロアルキル(例えば、ビシクロアルキル)、またはヘテロシクリル(例えば、イミダゾリル)であり得、そのH、OH、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル(例えば、C、C、C、またはCアルキル)、C−Cアルケニル(例えば、C、C、またはCアルケニル)、C−Cアルキニル(例えば、C、C、またはCアルキニル)、C−Cアルコキシ(例えば、C、C、またはCアルコキシ)、メチル、エチル、シクロアルキル、またはヘテロシクリル(例えば、イミダゾリル)は、任意選択で、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、または6)で置換され得る。特定の実施形態では、R、R、R、R、およびRは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ、H、OH、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、メトキシ、エトキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチル、シクロアルキル(例えば、ビシクロアルキル)、またはヘテロシクリル(例えば、イミダゾリル)から独立して選択されてもよい。
他の実施形態では、化合物は、式(IA):
Figure 2021523942
から選択される。
いくつかの実施形態では、X、X、R、およびRは、式(I)について上で定義される通りである。他の実施形態において(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、XおよびXは、同じである。なおも他の実施形態において(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、XおよびXは異なる。他の実施形態において(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、RおよびRは、同じである。なおも他の実施形態において(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、RおよびRは異なる。いくつかの実施形態では(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、XおよびXは同じであっても異なってもよく、それぞれが独立して、CH2、O、C(H)(NH2)、C=O、C=N−N2、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択され得、そのC2、C(H)(NH2)、C=N−N2、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)が、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、もしくはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、または6)で置換され得る。他の実施形態(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)において、XおよびXは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、CH、O、C(H)(NH2)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択されてもよい。さらに他の実施形態では(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、XおよびXは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが独立して、CH、O、C=O、C=NH、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択されてもよい。さらに他の実施形態では(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、XおよびXは、同じであっても異なってもよく、それぞれが独立して、CH、O、C=O、C=N−シクロアルキル(例えば、アダマンタン)、またはC=NEtOHから選択することができる。
いくつかの実施形態では(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA)において)、RおよびRは、同じであっても異なってもよく、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル(例えば、C、C、C、またはCアルキル)、C−Cアルケニル(例えば、C、C、またはCアルケニル)、C−Cアルキニル(例えば、C、C、またはCアルキニル)、C−Cアルコキシ(例えば、C、C、またはCアルコキシ)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチルから選択され得、そのH、OH、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル(例えば、C、C、C、またはCアルキル)、C−Cアルケニル(例えば、C、C、またはCアルケニル)、C−Cアルキニル(例えば、C、C、またはCアルキニル)、C−Cアルコキシ(例えば、C、C、またはCアルコキシ)、メチル、またはエチルは、任意選択で、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上(例えば、0、1、2、3、4、5、または6)で置換され得る。特定の実施形態(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA))では、RおよびRは、同じであっても異なってもよく、それぞれ、H、OH、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、またはI)、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、メトキシ、エトキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルから独立して選択されてもよい。特定の実施形態(例えば、式(I)、(II)、(III)、または(IA))では、RおよびRは、同じであっても異なっていてもよく、各々は、独立して、H、OH、またはメトキシから選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、式(I)、(IA)、(II)、または(III)の化合物は、表1に指定されるものから選択され得る。表には、先頭ゼロを有する化合物番号(例えば、I−001またはI−015)が含まれる。これらの化合物番号は、先頭のゼロなしで同定されることがあり、化合物は、先頭のゼロがあってもなくても同じものである(例えば、化合物I−001は、化合物I−1と同じであり、化合物I−015は、化合物I−15と同じである)。
Figure 2021523942
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Figure 2021523942
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いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−56、I−57、I−59、またはI−94のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−56、I−57、I−59、およびI−94が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−56、I−59、またはI−94のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−56、I−59、およびI−94が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、またはI−5のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、およびI−5が、本発明の化合物から除外される。
特定の実施形態では、化合物I−1が本発明の化合物から除外される。特定の実施形態では、化合物I−2が本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、I−1、I−2、I−3、I−4、I−5、I−6、I−7、I−8、I−9、I−10、I−11、I−12、I−13、I−14、I−15、I−16、またはI−17を含む。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、I−1、I−2、I−3、I−4、I−5、I−15、I−16、またはI−17を含む。
いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、式(I)、式(IA)、(II)、または(III)のうちの1つ以上を包含する。他の実施形態では、式(I)、式(IA)、(II)、もしくは(III)の化合物、またはそれらの組み合わせは、ウロリシン誘導体を包含する。いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、式(I)、式(IA)、(II)、または(III)のうちの1つ以上を包含しない。他の実施形態では、式(I)、式(IA)、(II)、もしくは(III)の化合物、またはそれらの組み合わせは、ウロリシン誘導体を包含しない。
いくつかの実施形態では、式(I)、式(IA)、(II)、または(III)の化合物は、塩、光学異性体および幾何異性体、ならびに異性体の塩の形態であり得る。他の実施形態では、化合物は、非荷電分子、分子複合体の成分、または塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、およびサリチル酸塩を含むが、これらに限定されない非刺激性薬理学的に許容される塩等の様々な形態であり得る。いくつかの場合において、酸性化合物について、塩は、金属、アミン、または有機カチオン(例えば、第4級アンモニウム)を含むことができる。なおも他の実施形態では、所望の保持および放出特性を有するが、体内pH、酵素、または他の好適な手段によって容易に加水分解される化合物(例えば、エーテル、エステル、またはアミド)の単純な誘導体を使用することができる。
いくつかの実施形態では、キラル中心を有し、光学的に活性であり、ラセミ形態で存在し、単離され得る本発明の化合物。他の実施形態では、化合物は多型を呈し得る。本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載される化合物の任意のラセミ、光学活性、多型もしくは立体異性体形態、またはそれらの混合物を包含する。光学的に活性な形態の調製は、再結晶化技法によるラセミ形態の分割、光学的に活性な出発材料からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離を含むがこれらに限定されない、任意の好適な方法によって達成され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)は、以下の効果を有し得る。(a)モノアミノオキシダーゼ(MAO)酵素活性を阻害すること、(b)タイトジャンクションタンパク質(例えば、クローディンファミリータンパク質(Cldn1−27)、オクルーディン、ゾヌラオクルデン(例えば、ZO−1、ZO−2)、タイトジャンクションタンパク質(TJP)、ジャンクション関連接着分子(JAM)、例えば血管内皮カドヘリン(VE−カドヘリン))の発現を誘導すること、(c)AhRの核移行および/またはAhRの活性化を誘導すること、(d)Nrf2の核移行および/または活性化を誘導すること、(e)Cyp1A1および/またはCyp1A2の発現を誘導すること、または(f)細胞(例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、成人幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、または生殖細胞))におけるオートファジー(例えば、マイトファジー)を増加させること、または(g)これらの組み合わせ。
化合物の他の実施形態−ウロリシン誘導体
「ウロリシン」は、概して、融合した3環系において、エステルを含む非芳香族架橋環(すなわち、ウロリシンの架橋環は「環状エステル」である)を有する2つの芳香族環を含むと説明することができる。
本明細書で使用されるとき、「ウロリシン誘導体」という用語は、ウロリシンの構造に由来する構造を有し、その構造がウロリシンに十分に類似しており、その類似性に基づいて、ウロリシンと同じもしくは類似の活性および有用性を示すか、または前駆体としてウロリシンと同じもしくは類似の活性および有用性を誘導することが当業者によって予測されるであろう化合物を指す。特定の実施形態によれば、ウロリシン誘導体は、ウロリシン環状エステルの化学基置換を有することができる。いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、ウロリシンAと比較して向上した効力、または酸性pHおよび/もしくはプロテアーゼおよび/またはエステラーゼの存在下でのウロリシンAと比較した向上した安定性を有し得る(図1Aを参照)。ウロリシンAの構造は、PKL−01として本明細書に示される(表1)。
種々の実施形態では、ウロリシン誘導体は、ウロリシン環状エステルの代わりに環状エーテルを有する。いくつかの実施形態では、環状エーテル基は、ハロ、アミン、置換アミン(例えば、メチル、エチル、またはそれらの組み合わせで置換されている)、ヒドロキシル、ならびにC5もしくはC6複素環(例えば、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール)から独立して選択される置換基、例えば、O、N、またはSから独立して選択される1つまたは2つのヘテロ原子を有する置換基等の1つ以上の置換基を含む。いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、ウロリシン環状エステルの代わりに、隣接カルボニル基を有する炭素環(例えば、シクロアルキルまたはアリール)を有する。いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、ウロリシン環状エステルの代わりに、炭素環式基(例えば、シクロアルキルまたはアリール)を有し、任意選択で1つ以上の二重結合を有し、任意選択で芳香族であり、任意選択で置換されている(例えば、本明細書に開示される任意のもので)。いくつかの実施形態では、炭素環式基(例えば、シクロアルキルまたはアリール)は、1つ以上の置換基(例えば、本明細書に開示される任意の置換基)を有する。例示的な置換基としては、独立して、ケトン、任意選択で置換されたイミン、任意選択で置換されたアミン(例えば、メチル、エチル、またはそれらの組み合わせで置換された)、ハロ、およびヒドロキシルから選択されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、ウロリシン環状エステルの代わりに環状アミドを有する。いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、環状エステル架橋の代わりに、非環状架橋を有する。これらの実施形態では、エステル基は、(非環状構造において)カルボン酸およびヒドロキシル官能基と置き換えられ得る。他の実施形態では、芳香族基(例えば、アリールまたはヘトロアリール)(架橋環または基に隣接)は、1つ以上の置換基を有し得る。いくつかの実施形態では、芳香族基(例えば、アリールまたはヘテロアリール)は、任意選択で置換された(例えば、本明細書に開示される任意の)フェニル基である。芳香族基のための例示的な置換基は、独立して、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミン、5または6員の炭素環(例えば、シクロアルキルもしくはアリール)または複素(例えば、複素環またはヘテロアリール)環、ニトロ、ニトリル、アルキル、アルキルエーテル、およびハロアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、芳香環のうちの少なくとも1つは、複素環式(例えば、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール)である。複素環式環のヘテロ原子(例えば、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール)は、独立して、N、O、およびSから選択され得る。いくつかの実施形態では、各芳香族環の置換基は、任意選択で第1の架橋環の同じまたは異なる構造を有する第2の架橋環を一緒に形成し得る。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、またはII−122のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−56、I−57、I−59、またはI−94のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−7、I−20、I−56、I−57、I−59、およびI−94が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−56、I−59、またはI−94のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、I−5、I−20、I−56、I−59、およびI−94が、本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、またはI−5のうちの1つ以上が、本発明の化合物から除外される。いくつかの実施形態では、化合物I−1、I−2、I−3、およびI−5が、本発明の化合物から除外される。
特定の実施形態では、化合物I−1が本発明の化合物から除外される。特定の実施形態では、化合物I−2が本発明の化合物から除外される。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、I−1、I−2、I−3、I−4、I−5、I−6、I−7、I−8、I−9、I−10、I−11、I−12、I−13、I−14、I−15、I−16、またはI−17を含む。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、I−1、I−2、I−3、I−4、I−5、I−15、I−16、またはI−17を含む。
いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、式(I)、式(IA)、(II)、または(III)のうちの1つ以上を包含する。他の実施形態では、式(I)、式(IA)、(II)、もしくは(III)の化合物、またはそれらの組み合わせは、ウロリシン誘導体を包含する。いくつかの実施形態では、ウロリシン誘導体は、式(I)、式(IA)、(II)、または(III)のうちの1つ以上を包含しない。他の実施形態では、式(I)、式(IA)、(II)、もしくは(III)の化合物、またはそれらの組み合わせは、ウロリシン誘導体を包含しない。
いくつかの実施形態では、式(I)、式(IA)、(II)、もしくは(III)の化合物、またはウロリシン誘導体は、塩、光学異性体および幾何異性体、ならびに異性体の塩の形態であり得る。他の実施形態では、化合物は、非荷電分子、分子複合体の成分、または塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、およびサリチル酸塩を含むが、これらに限定されない非刺激性薬理学的に許容される塩等の様々な形態であり得る。いくつかの場合において、酸性化合物について、塩は、金属、アミン、または有機カチオン(例えば、第4級アンモニウム)を含むことができる。なおも他の実施形態では、所望の保持および放出特性を有するが、体内pH、酵素、または他の好適な手段によって容易に加水分解される化合物(例えば、エーテル、エステル、またはアミド)の単純な誘導体を使用することができる。
いくつかの実施形態では、キラル中心を有し、光学的に活性であり、ラセミ形態で存在し、単離され得る本発明の化合物。他の実施形態では、化合物は多型を呈し得る。本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載される化合物の任意のラセミ、光学活性、多型もしくは立体異性体形態、またはそれらの混合物を包含する。光学的に活性な形態の調製は、再結晶化技法によるラセミ形態の分割、光学的に活性な出発材料からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離を含むがこれらに限定されない、任意の好適な方法によって達成され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2、またはウロリシン誘導体)は、以下の効果を有し得る。(a)モノアミノオキシダーゼ(MAO)酵素活性を阻害すること、(b)タイトジャンクションタンパク質(例えば、クローディンファミリータンパク質(Cldn1−27)、オクルーディン、ゾヌラオクルデン(例えば、ZO−1、ZO−2)、タイトジャンクションタンパク質(TJP)、ジャンクション関連接着分子(JAM)、例えば血管内皮カドヘリン(VE−カドヘリン))の発現を誘導すること(c)AhRの核移行および/またはAhRの活性化を誘導すること、(d)Nrf2の核移行および/または活性化を誘導すること、(e)Cyp1A1および/またはCyp1A2の発現を誘導すること、または(f)細胞(例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、成人幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、または生殖細胞))におけるオートファジー(例えば、マイトファジー)を増加させること、または(g)これらの組み合わせ。
医薬組成物を含む組成物
特定の実施形態では、本発明の1つ以上の化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)は組成物の一部であり得、少なくとも約0.0001%、少なくとも約0.001%、少なくとも約0.10%、少なくとも約0.15%、少なくとも約0.20%、少なくとも約0.25%、少なくとも約0.50%、少なくとも約0.75%、少なくとも約1%、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、少なくとも約99.99%、約75%以下、約90%以下、約95%以下、約99%以下、または約99.99%以下、約0.0001%〜約99%、約0.0001%〜約50%、約0.01%〜約95%、約1%〜約95%、約10%〜約90%、または約25%〜約75%以下の量(全組成物の重量%)で存在し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の1つ以上の化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)は、少なくとも約0.0001%、少なくとも約0.001%、少なくとも約0.10%、少なくとも約0.15%、少なくとも約0.20%、少なくとも約0.25%、少なくとも約0.50%、少なくとも約0.75%、少なくとも約1%、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、少なくとも約99.99%、約75%以下、約90%以下、約95%以下、約99%以下、約99.99%以下、約0.0001%〜約99%、約0.0001%〜約50%、約0.01%〜約95%、約1%〜約95%、約10%〜約90%、または約25%〜約75%の量(全組成物の重量%)で精製または単離され得る。
本発明のいくつかの実施形態は、1つ以上の本発明の化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)を含む組成物を含む。特定の実施形態では、組成物は、動物(例えば、哺乳動物、霊長類、サル、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、マウス、ウサギ、またはラット)への投与に好適な組成物等の医薬組成物である。いくつかの場合において、医薬組成物は、毒性がない、副作用を引き起こさない、またはその両方である。いくつかの実施形態では、固有の副作用が存在し得る(例えば、それは、患者を傷つけ得るか、またはいくつかの患者においてある程度毒性または有害であり得る)。
「治療有効量」とは、所望のおよび/または有益な効果を達成するために有効な量を意味する。有効量は1回または複数回の投与で投与することができる。本発明のいくつかの目的のために、治療有効量は、適応症を治療するのに適切な量である。適応症を治療することは、緩和、改善、安定化、逆に、疾患の進行を遅延させる、生活の質を増加させる、または寿命を延長することのうちの1つ以上などの任意の所望の効果を達成することを意味する。そのような達成は、腫瘍サイズの測定等の任意の好適な方法によって測定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の1つ以上の化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)は、医薬組成物の一部であってもよく、少なくとも約0.0001%、少なくとも約0.001%、少なくとも約0.10%、少なくとも約0.15%、少なくとも約0.20%、少なくとも約0.25%、少なくとも約0.50%、少なくとも約0.75%、少なくとも約1%、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、少なくとも約99.99%、約75%以下、約90%以下、約95%以下、約99%以下、約99.99%以下、約0.001%〜約99%、約0.001%〜約99%、約1%〜約95%、約10%〜約90%、または約25%〜約75%の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与経路、皮下投与経路、髄腔内投与経路、腹腔内投与経路、経口投与経路、非経口投与経路、直腸投与経路、皮膚投与経路、鼻投与経路、膣投与経路、または眼投与経路に好適な剤形で提供され得る。他の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、皮膚内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与に好適な剤形で提供され得る。医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸薬、粉末、顆粒剤、懸濁液、乳液、溶液、ゲル(ヒドロゲルを含む)、ペースト、軟膏、クリーム、石膏、乾燥剤、送達装置、座薬、浣腸、注射液、インプラント、スプレー、エアゾール、または他の好適な形態の形態であってもよい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は1つ以上の製剤成分を含むことができる。「製剤成分」は、水(例えば、沸騰水、蒸留水、濾過水、パイロゲンフリー水、またはクロロホルムを含む水)、糖(例えば、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、またはそこから作製されるシロップ)、エタノール、グリセロール、グリコール(例えば、プロピレングリコール)、アセトン、エーテル、DMSO、界面活性剤(例えば、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、もしくは非イオン界面活性剤(例えば、ポリソルベート))、油(例えば、動物油、植物油(例えば、ココナッツ油もしくはアラキ油)、もしくは鉱物油)、油誘導体(例えば、オレイン酸エチル、モノステアリン酸グリセリル、もしくは水素化グリセリド)、賦形剤、保存剤(例えば、システイン、メチオニン、抗酸化剤(例えば、ビタミン(例えばA、E、もしくはC)、セレン、パルミチン酸レチニル、クエン酸ナトリウム、クエン酸、クロロホルム、もしくはパラベン(例えばメチルパラベンもしくはプロピルパラベン))、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されなし、任意の好適な成分(例えば、薬物、薬物の投与、薬物の放出のタイミング、疾患、疾患状態、または投与経路に好適)であり得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、投与の実質的に直後に、または投与の実質的に所定の時間もしくは時間後に、活性成分(例えば、式(I)などの本発明の1つ以上の化合物)を放出するように製剤化され得る。そのような製剤は、例えば、様々な制御放出組成物およびコーティング等の制御放出製剤を含むことができる。
特定の実施形態では、他の製剤(例えば、医薬組成物の製剤)は、薬物(または対照放出製剤)を食品、食品詰め物、飼料、または飲料に組み込む製剤を含むことができる。
本発明の他の実施形態は、生物が有する、またはその疑いがある、または所望の生理学的効果を生じやすい、またはもたらす疾患、状態、もしくは障害を治療するのに有効な量の少なくとも1つの本発明の化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)による治療を含むことができる、生物を投与または治療する方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物または医薬組成物は、体重1kg当たり約0.005〜約50mg、体重1kg当たり約0.01〜約15mg、体重1kg当たり約0.1〜約10mg、体重1kg当たり約0.5〜約7mg、約0.005mg/kg、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約5.5mg/kg、約6mg/kg、約6.5mg/kg、約7mg/kg、約7.5mg/kg、約8mg/kg、約10mg/kg/kg、約12mg/kg、または約15mg/kgの量で動物(例えば、哺乳動物、霊長類、サル、またはヒト)に投与することができる、本発明の少なくとも1つの化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)を含む。いくつかの状態に関して、投与量は、ヒト体重約0.5mg/kgヒト体重または約6.5mg/kgヒト体重であり得る。いくつかの事例では、いくつかの動物(例えば、哺乳動物、マウス、ウサギ、ネコ、ブタ、またはイヌ)は、体重1kg当たり約0.005〜約50mg、体重1kg当たり約0.01〜約15mg、体重1kg当たり約0.1〜約10mg、体重1kg当たり約0.5〜約7mg、約0.005mg/kg、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約40mg/kg、約50mg/kg、約80mg/kg、約100mg/kg、または約150mg/kgの投与量で投与され得る。当然ながら、当業者は、本発明の方法に多くの濃度を用いることが可能であることを理解し、本明細書に提供されるガイダンスを部分的に使用することで、所与の状況で所望の結果を達成する濃度を見つけるために任意の数の濃度を調整および試験することができるであろう。他の実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)は、所与の疾患、状態、または障害のための1つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、単位用量の1つ以上の本発明の化合物(例えば、式(I)またはウロリシン誘導体)を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含むことができ、加えて、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤、および賦形剤を含むことができる。特定の実施形態では、担体、ビヒクル、または賦形剤は、組成物の投与、送達、および/または保存を促進することができる。他の実施形態では、1つ以上の担体としては、非限定的に、生理食塩水、例えば、生理食塩水、リンガー液、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、ならびに一般には、糖添加物、例えば、グルコースを含むか含まない、カリウム塩およびリン酸塩含む様々な塩の混合物が挙げられる。担体には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、殺菌抗生物質、および製剤と意図されるレシピエントの体液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれ得る。他の実施形態では、1つ以上の賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。無毒性の補助物質、例えば、湿潤剤、緩衝液、または乳化剤も、組成物に添加され得る。経口製剤は、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウム等の通常使用される賦形剤を含むことができる。
特定の実施形態では、組成物または医薬組成物は、本明細書に開示される量または用量のうちのいずれかで、5−フルオロウラシル(例えば、がん治療または化学耐性癌治療用)をさらに含む。
投与経路、疾患の治療、および他の使用
本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)は、任意の数の好適な投与経路または製剤によって動物に投与され得る。本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)も、様々な疾患のために動物を治療するために使用することができる。動物として、非限定的に、哺乳動物、霊長類、サル(例えば、マカク、アカゲザル、またはブタオザル)、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、鳥類(例えば、ニワトリ)、マウス、ウサギ、およびラットが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒト対象と動物対象の両方を指す。
本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)の投与経路は、任意の好適な経路であり得る。投与経路は、非限定的に、経口経路、非経口経路、皮膚経路、経鼻経路、直腸経路、膣経路、および眼経路であり得る。他の実施形態では、投与経路は、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、皮膚内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与であり得る。投与経路の選択は、化合物の性質(例えば、化合物の物理的および化学的特性)、ならびに動物の年齢および体重、特定の疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌または結腸癌)、または線維症)、ならびに疾患の重症度に依存し得る。当然ながら、所望により、投与経路の組み合わせを投与することができる。
本発明のいくつかの実施形態は、1つ以上のそのような組成物の1回以上の投与を含む、本明細書に記載の本発明の1つ以上の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)を含む組成物(例えば、医薬組成物)を対象に提供するための方法を含み、組成物は、投与が2回以上である場合、同じであっても異なってもよい。
本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)を使用して動物(例えば、哺乳動物、豚、イヌ、鳥類(例えば、ニワトリ)、ウシ、ネコ、霊長類、げっ歯類、サル、ウサギ、マウス、ラット、およびヒト)において治療することができる疾患としては、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)、腸透過性(例えば、金属誘発性リーキーガット、ストレス誘発性リーキーガット、または放射線誘発性腸透過性)、大腸炎、局所炎症(例えば、脳、口、食道、胃、および小腸内)、全身性炎症、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病)、感染誘発性炎症性疾患(例えば、敗血症もしくは敗血症誘発性腎損傷または敗血症誘発性肺損傷)、神経炎症性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、不安、うつ病、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、非アルコール性脂肪肝疾患、薬物誘発性肝損傷、アルファ−抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節炎、神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌または結腸癌)、認知障害、ストレス、気分障害、または線維症が挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの実施形態では、治療することができる疾患としては、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、腸透過性(例えば、金属誘発性リーキーガット、ストレス誘発性リーキーガット、または放射線誘発性腸透過性などのリーキーガット)、大腸炎、局所炎症(例えば、脳、口、食道、胃、および小腸内)、全身性炎症、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病)、感染誘発性炎症性疾患(例えば、敗血症もしくは敗血症誘発性腎傷害もしくは敗血症誘発性肺傷害)、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌または結腸癌)、または線維症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療することができる疾患としては、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、大腸炎、腸透過性、リーキーガット、金属誘発性腸漏出、ストレス誘発性リーキーガット、放射線誘発性腸透過性、局所炎症、全身性炎症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、感染誘発性炎症性疾患、敗血症、敗血症誘発性腎損傷、敗血症誘発性肺損傷、強皮症、血管炎、薬物誘発性血管炎、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌、もしくは結腸癌)、または線維症が挙げられるが、これらに限定されない。治療することができる動物として、非限定的に、哺乳動物、げっ歯類、霊長類、サル(例えば、マカク、アカゲザル、ブタオザル)、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、鳥類(例えば、ニワトリ)、ウシ、マウス、ウサギ、およびラットが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒト対象と動物対象の両方を指す。いくつかの場合において、動物は、治療を必要とする(例えば、疾患もしくはがんの徴候を示すことによって、またはがん性腫瘍を有することによって)。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)を使用して動物(例えば、哺乳動物、ブタ、イヌ、鳥類(例えば、ニワトリ)、ウシ、ネコ、霊長類、げっ歯類、サル、ウサギ、マウス、ラット、およびヒト)において治療することができるがんとしては、膵臓癌(例えば、膵臓管腺癌、肺癌)、肝臓癌、結腸直腸癌(例えば、結腸癌、直腸癌)、黒色腫(例えば、皮膚悪性黒色腫、黒色腫腫瘍形成)、膀胱癌、前立腺癌、悪性神経鞘腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌、扁平上皮細胞癌(例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌)、リンパ腫、白血病、骨髄癌、非ホジキンリンパ腫(例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫)、多形性膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、基底細胞癌、甲状腺癌、神経芽腫、卵巣癌、腎臓細胞癌、肝細胞癌、結腸癌、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病、横紋筋肉腫、髄膜腫、胃癌、神経膠腫、口腔癌、咽頭癌、直腸癌、胃癌、子宮癌、髄芽腫、転移を引き起こす可能性のあるがん、転移に起因するがん、またはそれらのがん性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療することができるがんには、乳癌、結腸癌またはそのがん性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。治療することができる動物として、非限定的に、哺乳動物、げっ歯類、霊長類、サル(例えば、マカク、アカゲザル、ブタオザル)、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、鳥類(例えば、ニワトリ)、ウシ、マウス、ウサギ、およびラットが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ヒト対象と動物対象の両方を指す。いくつかの場合において、動物は、治療を必要とする(例えば、疾患もしくはがんの徴候を示すことによって、またはがん性腫瘍を有することによって)。
.いくつかの実施形態では、治療することができる疾患としては、血管炎、薬物誘発性血管炎、強皮症、内臓血管出血、薬物誘発性内出血、アトピー性皮膚炎、灌流関連損傷、灌流関連炎症、糖尿病性網膜症、セリアック病、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、アルコール性脂肪性肝炎(ASH)、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、薬物誘発性肝損傷、慢性腎臓疾患、アルファ抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、炎症、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、神経変性疾患、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、肺線維症、慢性肺線維障害(COPD)、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、喘息、がん、認知障害、ストレス、または気分障害が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)を使用して動物(例えば、哺乳動物、ブタ、イヌ、鳥類(例えば、ニワトリ)、ウシ、ネコ、霊長類、げっ歯類、サル、ウサギ、マウス、ラット、およびヒト)において治療することができる疾患としては、(a)腸バリアの完全性を増強すること、(b)血管バリアの完全性を増強すること、(c)肺における気道バリアの完全性を増強すること、(d)組織または臓器(例えば、脳、眼、皮膚、骨、骨髄、軟骨、心臓、肺、胃、腸、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、および脂肪からなる群から選択される動物の組織または臓器)または細胞(例えば、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞)における動物(例えば、ヒト)におけるオートファジーを改善または増強すること、(e)モノアミノオキシダーゼ(MAO−AまたはMAO−BなどのMAO)酵素活性を阻害すること、(f)タイトジャンクションタンパク質(例えば、クローディンファミリータンパク質(Cldn1−27)、オクルーディン、ゾヌラオクルデン(例えば、ZO−1、ZO−2)、タイトジャンクションタンパク質(TJP)、ジャンクション関連接着分子(JAM)、または血管内皮カドヘリン(VE−カドヘリン)などのアドヘレンジャンクションタンパク質の発現を誘導すること、(g)AhRの核移行および/または活性化を誘導すること、(h)Nrf2の核移行および/または活性化を誘導すること、(i)Cyp1A1および/またはCyp1A2の発現を誘導すること、(j)細胞(例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞状筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、もしくは生殖細胞)におけるオートファジー(例えば、マイトファジー)を増加させること、または(k)これらの組み合わせによって治療することができる疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「治療すること」という用語(および「治療」等のその変形)は、その最も広範な文脈で考慮されるべきである。特に、「治療すること」という用語は、動物が完全回復するまで治療されることを必ずしも暗示するものではない。したがって、「治療すること」は、症状の寛解、状態に関連する症状もしくは効果からの寛解、状態の重症度の減少、または症状の予防、予防的寛解、またはそれ以外の場合、特定の状態を発症するリスクの低減を含む。本明細書で使用されるとき、動物を「治療すること」への言及は、非限定的に、予防的治療および治療的治療を含む。本明細書に記載される組成物(例えば、医薬組成物)のいずれかを使用して、動物を治療することができる。
疾患(例えば、アルコール性肝臓病(ALD)、腸管透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌または結腸癌)、または線維症)の治療に関連する場合、治療することは、予防的治療および治療的治療を含むことができるが、これらに限定されない。したがって、治療には、疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌または結腸癌)、または線維症)を予防すること;疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌または結腸癌)、または線維症)のリスクを低減すること、疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、または線維症)の症状を改善または緩和すること;疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、または線維症)に対する身体的応答を誘発すること;疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌または結腸癌)、または線維症)の発症または進行を阻害すること;疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)に関連する症状の発症を阻害または予防すること、炎症(例えば局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、癌性腫瘍、乳癌または結腸癌)、または線維症)に関連する症状の発生を阻害または予防すること;疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、または線維症)の重症度を減少させること;疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、癌性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、または線維症)、またはそれに関連する症状のうちの1つ以上を引き起こす疾患の退行を引き起こすこと(例えば、炎症の減少);疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、もしくは線維症)の寛解を引き起こすこと;または疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、もしくは線維症)の再発を予防することが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療は、疾患の予防的治療(例えば、将来の疾患の予防または改善)を含まない。
動物の処理は、任意の好適な投与方法(本明細書に開示されるものなど)を使用し、および任意の好適な量の本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)を使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、治療方法は、疾患(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、リーキーガット)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん(例えば、がん性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、または線維症)について動物を治療することを含む。本発明のいくつかの実施形態は、1つ以上のそのような組成物の1回以上の投与を含む、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)を含む組成物(例えば、医薬組成物)によって対象(例えば、ヒトまたは霊長類などの動物)を治療するための方法を含み、組成物は、投与が2回以上である場合、同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、治療方法は、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)を含む有効量の組成物を投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、動物における治療(例えば、アルコール性肝疾患(ALD)、腸透過性(例えば、漏れ腸)、炎症(例えば、局所または全身性)、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌(例えば、がん性腫瘍、乳癌もしくは結腸癌)、または線維症を含むがこれらに限定されない疾患を治療すること)に影響を与えるのに十分な投与量または一連の投与量を指す。いくつかの実施形態では、有効量は、本明細書において開示される治療有効量を包含することができる。特定の実施形態では、有効量は、対象および影響を受ける特定の治療に応じて変化し得る。必要とされる正確な量は、例えば、対象の年齢および一般的な状態、使用される特定のアジュバント(該当する場合)、投与プロトコル等に応じて、対象によって異なり得る。したがって、有効量は、例えば、特定の状況に基づいて変化することができ、適切な有効量は、特定の場合に決定することができる。有効量は、例えば、本明細書に開示される任意の投与量または組成物量を含むことができる。いくつかの実施形態では、(哺乳動物、霊長類、サル、またはヒトなどの動物に投与することができる)本発明の少なくとも1つの化合物(例えば、化合物I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体などの式(I))の有効量は、体重1kg当たり約0.005〜約50mg、体重1kg当たり約0.01〜約15mg、体重1kg当たり約0.1〜約10mg、体重1kg当たり約0.5〜約7mg、約0.005mg/kg、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約5.5mg/kg、約6mg/kg、約6.5mg/kg、約7mg/kg、約7.5mg/kg、約8mg/kg、約10mg/kg/kg、約12mg/kg、または約15mg/kgの量であり得る。いくつかの状態に関して、投与量は、ヒト体重1kg当たり約0.5mgまたはヒト体重1kg当たり約6.5mgであり得る。いくつかの事例では、(哺乳動物、げっ歯類、マウス、ウサギ、ネコ、ブタ、またはイヌなどの動物に投与することができる)本発明の少なくとも1つの化合物(例えば、化合物I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体などであるが、これらに限定されない式(I))の有効量は、体重1kg当たり約0.005〜約50mg、体重1kg当たり約0.01〜約15mg、体重1kg当たり約0.1〜約10mg、体重1kg当たり約0.5〜約7mg、約0.005mg/kg、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約40mg/kg、約50mg/kg、約80mg/kg、約100mg/kg、または約150mg/kgの量であり得る。いくつかの実施形態では、(哺乳動物、霊長類、サル、またはヒトなどの動物に投与することができる)本発明の少なくとも1つの化合物(例えば、化合物I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体などの式(I))の有効量は、体重1kg当たり約1〜約1000mg、体重1kg当たり約5〜約500mg、体重1kg当たり約10〜約200mg、体重1kg当たり約25〜約100mg、約1mg/kg、約2mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約25mg/kg、約50mg/kg、約100mg/kg、約150mg/kg、約200mg/kg、約300mg/kg、約400mg/kg、約500mg/kg、約600mg/kg、約700mg/kg、約800mg/kg、約900mg/kg、または約1000mg/kgの量であり得る。いくつかの状態に関して、投与量は、ヒト体重約20mg/kgヒト体重または約100mg/kgヒト体重であり得る。いくつかの事例では、(哺乳動物、げっ歯類、マウス、ウサギ、ネコ、ブタ、またはイヌなどの動物に投与することができる)本発明の少なくとも1つの化合物(例えば、化合物I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体などであるが、これらに限定されない式(I))の有効量は、体重1kg当たり約1〜約1000mg、体重1kg当たり約5〜約500mg、体重1kg当たり約10〜約200mg、体重1kg当たり約25〜約100mg、約1mg/kg、約2mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約25mg/kg、約50mg/kg、約100mg/kg、約150mg/kg、約200mg/kg、約300mg/kg、約400mg/kg、約500mg/kg、約600mg/kg、約700mg/kg、約800mg/kg、約900mg/kgまたは約1000mg/kgの量であり得る。
「治療有効量」とは、所望のおよび/または有益な効果(例えば、炎症を減少させること)を達成するために有効な量を意味する。治療有効量は、1回または複数回の投与で投与することができる。本発明のいくつかの目的のために、治療有効量は、適応症を治療する(例えば、疾患を治療する)のに適切な量である。適応症を治療することは、緩和、改善、安定化、逆に、疾患の進行を遅延させる、生活の質を増加させる、または寿命を延長することのうちの1つ以上などの任意の所望の効果を達成することを意味する。そのような達成は、炎症の程度などであるが、これらに限定されない、任意の好適な方法によって測定することができる。
いくつかの実施形態では、治療はまた、外科的介入、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、およびアジュバントシステム療法のうちの1つ以上を含むことができる。アジュバントには、化学療法(例えば、テモゾロミド)、放射線療法、抗血管新生療法(例えば、ベバシズマブ)、ならびにLHRHアゴニストの投与などのホルモン療法、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、高用量プロゲストゲン、アロマターゼ阻害剤、ならびに/または副腎切除術が含まれ得るが、これらに限定されない。化学療法は、単剤として、または既知もしくは新しい療法との組み合わせとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療は、疾患を治療するための他の薬物(例えば、抗生物質もしくは5−フロロルラシル(例えば、がん治療または化学抵抗性がん治療のための))または療法の使用を含むことができる。例えば、本発明の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1もしくはI−2、またはウロリシン誘導体)は、がん(例えば、結腸、乳癌腫瘍、または化学耐性)を治療するために5−フロロウラシルと組み合わせることができる。例えば、抗生物質を使用して感染症を治療することができ、疾患(例えば、炎症に関連する感染症)を治療するために本発明の化合物と組み合わせることができる。他の実施形態では、静脈内免疫グロブリン(IVIG)療法は、治療レジメンの一部として使用され得る(すなわち、本発明の化合物(複数可)の投与に加えて)。
特定の実施形態では、治療は以下をもたらすことができる:(a)腸バリアの完全性を増強すること、(b)血管バリアの完全性を増強すること、(c)肺における気道バリアの完全性を増強すること、(d)組織または臓器(例えば、脳、眼、皮膚、骨、骨髄、軟骨、心臓、肺、胃、腸、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、および脂肪からなる群から選択される動物の組織または臓器)または細胞(例えば、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞)における動物(例えば、ヒト)におけるオートファジーを改善または増強すること、(e)モノアミノオキシダーゼ(MAO−AまたはMAO−BなどのMAO)酵素活性を阻害すること、(f)タイトジャンクションタンパク質(例えば、クローディンファミリータンパク質(Cldn1−27)、オクルーディン、ゾヌラオクルデン(例えば、ZO−1、ZO−2)、タイトジャンクションタンパク質(TJP)、ジャンクション関連接着分子(JAM)、または血管内皮カドヘリン(VE−カドヘリン)などのアドヘレンジャンクションタンパク質の発現を誘導すること、(g)AhRの核移行および/または活性化を誘導すること、(h)Nrf2の核移行および/または活性化を誘導すること、(i)Cyp1A1および/またはCyp1A2の発現を誘導すること、(j)細胞(例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞状筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、もしくは生殖細胞)におけるオートファジー(例えば、マイトファジー)を増加させること、または(k)これらの組み合わせ。
本発明の化合物の調製方法
本発明のいくつかの実施形態は、式(I)の化合物(例えば、式(IA)またはウロリシン誘導体)の調製方法を含む。式(I)の化合物は、任意の好適な方法を使用して調製することができるか、または入手可能であれば、それらを購入することができる。特定の実施形態では、式(I)の化合物(例えば、式(IA)またはウロリシン誘導体)は、式(V)の化合物を式(VI)の化合物と反応させて式(VII)をもたらし、これは、次いで式(I)(例えば、式(IA)またはウロリシン誘導体)に作製されるステップを含むことができる(例えば、1つ以上の合成ステップを使用する)。
Figure 2021523942
特定の実施形態では、式(V)は
Figure 2021523942
であり得る。
いくつかの実施形態では、R20は、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、もしくはI)または
Figure 2021523942
であり得る。他の実施形態では、R20は、Clまたは
Figure 2021523942
であり得る。特定の実施形態では、R、R、R、R、およびRは、本明細書で開示されるものと同じである。他の実施形態では、XおよびXは、本明細書に開示されているものと同じである。式(V)は、任意の好適な方法を使用して調製することができ、または入手可能であれば購入することができる。式(VI)は、任意の好適な方法を使用して調製することができ、または入手可能であれば購入することができる。
いくつかの実施形態では、式(V)は、以下の条件下で式(VI)と反応することができる:式(V)は、溶媒(例えば、THF)、臭化銅、および臭化リチウムを含む混合物中にあり得る。混合物は、一定の時間(例えば、約2時間)一定の温度(例えば、約−78℃)に冷却され得る(例えば、ドライアイスアセトン混合物を使用して)。式(VI)を冷却混合物に(例えば、ゆっくりと)添加することができる。混合物を撹拌し、かつ/または室温に到達させることができる(例えば、一晩)。次いで、混合物を0℃に冷却し、任意選択で(例えば、塩化アンモニウム水溶液で)クエンチすることができる。次いで、式(VII)は、任意選択で回収することができる(例えば、本明細書に開示されるように)。
Figure 2021523942
式(VII)は、任意の好適な方法(例えば、上述を参照のこと)を使用して調製することができ、または入手可能であれば購入することができる。
いくつかの実施形態では、式(VII)は、溶媒(例えば、ジクロロメタン)を含む混合物中にあり得る。混合物は、冷却することができる(例えば、約0℃まで)。次いで、塩化Ti(IV)および/または塩化モリブデン(V)を添加することができる(例えば、ゆっくりと)。混合物を室温で撹拌させ得る(例えば、一晩)。次いで、混合物を0℃に冷却し、任意選択で(例えば、メタノールでゆっくりと)クエンチすることができる。次いで、式(I)(例えば、式(IA))を任意に回収することができる(例えば、本明細書に開示されるように)。
いくつかの実施形態では、式(I)(例えば、式(IA))をさらに反応させて、R、R、R、R、R、X、またはXのうちの1つ以上の性質を変更することができる。そのようなさらなる反応には、非限定的に、以下のうちの1つ以上が含まれ得る:(a)塩化アルミニウム(例えば、無水)と反応させる、または(b)酢酸およびエタノールアミンと反応させる(例えば、110℃で一晩還流させる)。
いくつかの実施形態では、式(I)(例えば、式(IA))(または上述の任意の他の式)を回収することができる。回収は、HPLC(例えば、逆相)、LC、沈殿、濾過、遠心分離、カラムクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー)、シリカゲルの使用、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の好適な方法を使用して行われ得る。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物(例えば、式(IA))の調製方法は、上述のステップのうちの1つ以上を含むことができる。特定の実施形態では、式(I)の化合物(例えば、式(IA))の調製方法は、以下を含む。
(a)式(V)の化合物を式(VI)の化合物と反応させて、式(VII)の化合物を含む混合物を得ること、
(b)式(VII)の化合物を好適な化合物(例えば、Ti(IV)塩化物および/またはモリブデン(V)塩化物)と反応させて、式(I)の化合物(例えば、式(IA))を含む混合物を得ること、
(c)任意選択で、R、R、R、R、R、X、またはXのうちの1つ以上の性質がさらなる反応によって変化するように、式(I)の化合物(例えば、式(IA))をさらに反応させて、式(I)の異なる化合物(例えば、式(IA))を得ること、
(d)式(I)(例えば、式(IA))を回収すること。
追加の実施形態−A
1.ウロリシン誘導体であって、ウロリシン環状エステルの化学基置換を有し、それにより、ウロリシンAと比較して誘導体の効力が向上するか、あるいはウロリシンAと比較して酸性pHでのならびに/またはエステラーゼおよび/もしくはプロテアーゼの存在下での誘導体の安定性が向上する、ウロリシン誘導体。
2.ウロリシン環状エステルが環状エーテルと置き換えられる、実施形態1に記載のウロリシン誘導体。
3.ウロリシン環状エーテルは、1つ以上の置換基を含む、実施形態2に記載のウロリシン誘導体。
4.環状エーテル置換基が、独立して、ハロ、アミン、置換アミン、ヒドロキシル、ならびに独立して、O、N、またはSから選択される1つまたは2つのヘテロ原子を有するC5またはC6複素環から選択される、実施形態3に記載のウロリシン誘導体。
5.ウロリシン環状エステルが、隣接カルボニル基を有する炭素環と置き換えられる、実施形態1に記載のウロリシン誘導体。
6.ウロリシン環状エステルが、任意選択で芳香族であり、任意選択で置換された環状アルケニル基と置き換えられる、実施形態1に記載のウロリシン誘導体。
7.環状アルケニル基が、1つ以上の置換基を有する、実施形態6に記載のウロリシン誘導体。
8.環状アルケニル基置換基が、独立して、ケトン、任意選択で置換されたイミン、任意選択で置換されたアミン、ハロ、およびヒドロキシルから選択される、実施形態7に記載のウロリシン誘導体。
9.ウロリシン環状エステルが、環状アミドと置き換えられる、実施形態1に記載のウロリシン誘導体。
10.ウロリシン環状エステルが、非環状架橋と置き換えられる、実施形態1に記載のウロリシン誘導体。
11.ウロリシン芳香族基が、1つ以上の置換基を有する、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体。
12.芳香族基が、任意選択で置換されたフェニル基である、実施形態11に記載のウロリシン誘導体。
13.1つ以上の芳香族置換基が、独立して、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミン、5員または6員の炭素環式または複素環式環、ニトロ、ニトリル、アルキル、アルキルエーテル、およびハロアルキルから選択される、実施形態11または12に記載のウロリシン誘導体。
14.1つ以上のウロリシン芳香環が、複素環式である、実施形態1〜13のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体。
15.複素環式環のヘテロ原子が、独立して、N、O、およびSから選択される、実施形態14に記載のウロリシン誘導体。
16.各芳香族環の置換基が、一緒に第2の架橋環を形成する、実施形態1〜15のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体。
17.第2の架橋環は、第1の架橋環と構造が同じである、実施形態16に記載のウロリシン誘導体。
18.第2の架橋環は、第1の架橋環と構造が異なる、実施形態16に記載のウロリシン誘導体。
19.組織におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を誘導する方法であって、ウロリシン構造類似体を含む有効量の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法。
20.組織におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を誘導する方法であって、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む有効量の組成物(または本明細書に開示される任意の化合物を含む組成物)を、必要とする対象に投与することを含む、方法。
21.対象が、胃腸透過性または炎症の症状を呈し、組成物が、小腸および/または大腸に投与される、実施形態19または20に記載の方法。
22.対象が、炎症性腸疾患を有する、実施形態21に記載の方法。
23.炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、実施形態22に記載の方法。
24.対象がセリアック病を有する、実施形態21に記載の方法。
25.炎症性腸疾患が結腸炎症を含む、実施形態24に記載の方法。
26.組成物が、臓器における内皮または血管バリアの完全性を改善するための量の効果で全身に投与される、実施形態19または20に記載の方法。
27.臓器が、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、皮膚、筋肉、脂肪、脳、眼、骨、および腸から選択される1つ以上である、実施形態26に記載の方法。
28.対象が、血管炎、薬物誘発性血管炎、強皮症、内臓血管出血、薬物性内出血、アトピー性皮膚炎、灌流関連損傷、灌流関連炎症、および糖尿病性網膜症から選択される状態を有する、実施形態27に記載の方法。
29.全身性炎症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む有効量の組成物(または本明細書で開示される任意の化合物を含む組成物)を投与することを含む、方法。
30.組成物が、腸内または非経口投与される、実施形態29に記載の方法。
31.対象は、敗血症または感染誘発性炎症性疾患を有するか、または有するリスクがある、実施形態30に記載の方法。
32.対象は、アルコール性肝疾患(ALD)を有するか、または有するリスクがある、実施形態30に記載の方法。
33.対象は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)またはアルコール性脂肪性肝炎(ASH)を有するか、または有するリスクがある、実施形態30に記載の方法。
34.対象が、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、皮膚、筋肉、脂肪、脳、眼、骨、骨髄、腸、および軟骨から選択される1つ以上の臓器または組織の炎症を有する、実施形態29に記載の方法。
35.神経炎症性障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む有効量の組成物(または本明細書で開示される任意の化合物を含む組成物)を投与することを含む、方法。
36.神経炎症性障害が、アルツハイマー病である、実施形態35に記載の方法。
37.神経炎症性障害が、パーキンソン病である、実施形態35に記載の方法。
38.神経炎症性障害が、任意選択で多発性硬化症である神経変性疾患である、実施形態35に記載の方法。
39.不安またはうつ病を治療する方法であって、それを必要とする対象に、対象におけるモノアミンオキシダーゼ酵素を阻害するのに有効な量で、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む有効量の組成物(または本明細書に開示される任意の化合物を含む組成物)を投与することを含む、方法。
40.組成物が、全身性または局所的に脳に投与される、実施形態39に記載の方法。
41.組成物が、腸内、非経口、または鼻腔内に投与される、実施形態39に記載の方法。
42.肺における気道バリアの完全性を増強する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む有効量の組成物(または本明細書で開示される任意の化合物を含む組成物)を投与することを含む、方法。
43.対象が、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、または喘息を有する、実施形態42に記載の方法。
44.対象においてオートファジーを改善または増加させる方法であって、それを必要とする対象に、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む有効量の組成物(または本明細書で開示される任意の化合物を含む組成物)を投与することを含む、方法。
45.オートファジーが、脳、眼、皮膚、骨、骨髄、軟骨、心臓、肺、胃、腸管、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、および脂肪から選択される対象の組織または臓器において改善または増加する、実施形態44に記載の方法。
46.オートファジーが、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される対象の細胞において、改善または増加する、実施形態45に記載の方法。
47.対象が、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬物誘発性肝損傷、慢性腎疾患、アルファ−抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、炎症、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、がん、認知障害、ストレス、および気分障害から選択される疾患または状態を有し、それによって、投与が、疾患または状態を治療または改善する、実施形態44または45に記載の方法。
48.対象において寿命を増加させる方法であって、動物における寿命を増加させるのに有効な実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む組成物(または本明細書で開示される任意の化合物を含む組成物)のレジメンを有効量で投与することを含む、方法。
49.対象が、脊椎動物である、実施形態19〜48のいずれか1つに記載の方法。
50.対象が、哺乳動物であり、任意選択で霊長類である、実施形態49に記載の方法。
51.対象が、ヒトである、実施形態50に記載の方法。
52.対象が、獣医科患者である、実施形態48に記載の方法。
53.細胞におけるオートファジーを増加させる方法であって、細胞を、実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む有効量の組成物(または本明細書で開示される任意の化合物を含む組成物)と接触させることを含む、方法。
54.オートファジーが、マイトファジーである、実施形態53に記載の方法。
55.細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される、実施形態53に記載の方法。
56.インビトロで真核細胞の寿命を増加させる方法であて、細胞を、細胞の寿命を増加させるのに有効な実施形態1〜18のいずれか1つに記載のウロリシン誘導体を含む組成物(または本明細書で開示される任意の化合物を含む組成物)と接触させることを含む、方法。
57.真核細胞が、初代培養物中の真核細胞である、実施形態56に記載の方法。
58.真核細胞が、細胞株の一部である、実施形態56または57に記載の方法。
59.真核細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される、実施形態56〜58のいずれか1つに記載の方法。
60.真核細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、および成体幹細胞から選択される細胞である、実施形態59に記載の方法。
追加の実施形態−B
1.表2に示される構造を有する化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは多形。
61.腸管、非経口、直腸、吸入、鼻腔内、および局所から選択される経路による投与に好適な、本明細書に開示される任意の医薬組成物。
62.静脈内投与のために製剤化された、実施形態61に記載の医薬組成物。
63.組成物が、肺投与用に製剤化されるエアロゾルまたは霧である、実施形態61に記載の医薬組成物。
64.組成物が、皮膚、眼、または粘液膜への局所投与用に製剤化される、実施形態61に記載の医薬組成物。
65.組成物が、胃腸への投与用に製剤化される、実施形態61の医薬組成物。
66.組成物が、有効量の誘導体または化合物を口、食道、胃、小腸、大腸、および/または結腸に送達するために製剤化される、実施形態65に記載の医薬組成物。
67.組成物が、全身投与用に製剤化される、実施形態61に記載の医薬組成物。
68.誘導体または化合物が、経口または非経口投与用に製剤化される、実施形態67に記載の医薬組成物。
69.組成物は対象の中枢神経系に投与される、実施形態60に記載の医薬組成物。
70.組成物が、鼻腔内投与用に製剤化される、実施形態69に記載の医薬組成物。
71.組成物が、髄腔内投与用に製剤化される、実施形態69に記載の医薬組成物。
追加の実施形態−C
1.炎症性腸疾患を予防または治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
2.炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、実施形態2に記載の方法。
3.タイトジャンクションタンパク質の発現を誘導する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書で開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
4.タイトジャンクションタンパク質が、クローディンファミリータンパク質(Cldn1〜27)、オクルーディン、ゾヌラオクルデン(例えば、ZO−1、ZO−2)、タイトジャンクションタンパク質(TJP)、ジャンクション関連接着分子(JAM)、または血管内皮カドヘリン(VE−カドヘリン)などの接着結合タンパク質である、実施形態3に記載の方法。
5.AhRの核移行および活性化を誘導する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
6.Nrf2の核移行および活性化を誘導する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
7.Cyp1A1または/ならびにCyp1A2の発現を誘導する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
8.口、食道、胃、および小腸における炎症を減少させる方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
9.全身性炎症を減少させる方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
10.神経または脳炎症を減少させる方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
11.感染症および感染誘発性炎症性疾患を予防または治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
12.感染症または感染誘発性炎症性疾患が、敗血症または敗血症誘発性腎損傷または敗血症誘発性肺損傷である、実施形態11に記載の方法。
13.結腸における好中球浸潤を減少させる方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
14.臓器または組織への血管成分の浸潤を減少させる方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
15.臓器または組織への好中球浸潤を減少させる方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
16.臓器または組織へのサイトカイン浸潤を減少させる方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
17.臓器または組織が、脳、眼、皮膚、骨、骨髄、軟骨、心臓、肺、胃、腸管、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、および脂肪から選択される、実施形態14〜16のいずれか1つに記載の方法。
18.腸バリア完全性を増強する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
19.血管バリア完全性を増強する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
20.肺における気道バリアの完全性を増強する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
21.神経炎症性障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
22.神経炎症性障害が、アルツハイマー病である、実施形態21に記載の方法。
23.神経炎症性障害が、パーキンソン病である、実施形態21に記載の方法。
24.モノアミノオキシダーゼ(MAO)酵素活性を阻害する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
25.神経変性障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
26.神経変性障害が、不安である、実施形態25に記載の方法。
27.神経変性障害が、うつ病である、実施形態25に記載の方法。
28.細胞におけるオートファジーを増加させる方法であって、細胞を、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物と接触させることを含む、方法。
29.オートファジーが、マイトファジーである、実施形態28に記載の方法。
30.細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞からなる群から選択される、実施形態28に記載の方法。
31.動物において寿命を増加させる方法であって、それを必要とする動物に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、もしくはI−2)またはそれらの前駆体を含む有効量の組成物を投与することを含み、それによって動物の寿命を増加させる、方法。
32.動物が、哺乳動物である、実施形態31に記載の方法。
33.動物が、ヒトである、実施形態32に記載の方法。
34.インビトロで真核細胞の寿命を増加させる方法であって、インビトロで真核細胞を、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、またはI−2)を含む有効量の組成物と接触させることを含み、それによってインビトロで真核細胞の寿命を増加させることを含む、方法。
35.真核細胞が、初代培養物中の真核細胞である、実施形態34に記載の方法。
36.真核細胞が、細胞株の一部である、実施形態34または35に記載の方法。
37.真核細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞からなる群から選択される、実施形態34〜36のいずれか1つに記載の方法。
38.真核細胞が、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、および成体幹細胞からなる群から選択される細胞である、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
39.動物におけるオートファジーを改善または増加させる方法であって、それを必要とする動物に、本明細書に開示される任意の化合物(例えば、式(I)、(IA)、I−1、もしくはI−2)またはそれらの前駆体を含む組成物を有効量で投与することを含み、それによって動物におけるオートファジーを改善または増加させる、方法。
40.動物が哺乳動物である、実施形態39に記載の方法。
41.哺乳動物がヒトである、実施形態40に記載の方法。
42.オートファジーが、脳、眼、皮膚、骨、骨髄、軟骨、心臓、肺、胃、腸管、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、および脂肪からなる群から選択される動物の組織または臓器において改善または増加する、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
43.オートファジーが、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞からなる群から選択される動物の細胞において、改善または増加する、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
44.動物が、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬物誘発性肝損傷、アルファ−抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、炎症、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、がん、認知障害、ストレス、および気分障害からなる群から選択される疾患または状態を有し、それによって、投与が、疾患または状態を治療する、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
45.組成物が経口摂取によって投与される、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
46.組成物が静脈内に投与される、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
47.組成物が腹腔内に投与される、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
48.組成物が吸入またはエアロゾルによって投与される、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
49.組成物が局所投与される、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
現在開示される課題は、以下の特定であるが非限定的な実施例によってさらに説明される。以下の実施例は、本発明に関連する開発および実験の過程中に様々な時間に収集されたデータを代表するデータの編集物を含み得る。
実施例セットA
材料:一般実験化学物質および試薬溶液をSigma−Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。IL−6およびTNF−αのELISAキットをBio−legendから購入した。CXCL1のELISAキットは、R&D systemsから購入した。別段の指定がない限り、全ての抗体をSantacruzから購入した。LPSは、Sigma Aldrichから購入した。大腸炎グレードDSS(36,000〜50,000M.W)は、MP Bioから購入した。UroAは、以前に記載されたようにカスタム合成された(SAHA et al.(2016)“Gut Microbiota Conversion of Dietary Ellagic Acid into Bioactive Phytoceutical Urolithin A Inhibits Heme Peroxidases”PLoS One,Vol.11,Article e0156811)。
マウス:C57BL/6マウスを、我々の動物施設で繁殖させるか、またはJackson Laboratoriesから購入した。Nrf2−/−マウス(B6.129x1−Nfe2/2tm1Ywk/J、ストック番号0170009)の交配対をJackson Laboratoriesから購入し、L動物施設のUで交配して実験動物を生成した。AhR−/−マウス(モデル番号9166)は、Taconic Laboratoriesから購入した。我々は、7〜9週齢のマウスを大腸炎の実験に利用した。マウスを特定の病原体を含まない(SPF)バリア条件下で温度制御された室内で、暗闇および光の交互の12時間のサイクルで維持した。動物は自由に過剰に餌を与え、水を自由に摂取させた。全ての研究は、Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC),University of Louisville,Louisville,KY,USAから承認されたプロトコルの下で行った。
UAS03の合成のための合成手順:化学的なUroA(3,8−ジヒドロキシ−6H−ジベンゾ[b,d]ピラン−6−オン)の構造は、2つのフェニル環上に架橋エステル、ラクトン、および2つのヒドロキシルを有する。UroAは、2つのフェニル環を連結し、平面構造にもたらすラクトン(環状エステル)結合を有する。胃pHまたは消化酵素は、ラクトン結合を加水分解して環の開放をもたらし得る。これは、平面構造を失い、プロペラ構造となり、その活性を失わせ得る。より安定で強力な化合物を生成するために、以下の手順により非加水分解性環状エーテル誘導体UAS03を合成した(図10)。
水素化ホウ素ナトリウム(0.165g、4.38mmol)を乾燥THF(10mL)に加え、混合物を10℃冷却した後、エーテル酸ホウ素塩(0.80g、5.7mmol)を1時間かけて滴下した。次いで、THF(5mL)中の3,8−ジヒドロキシ−6H−ベンゾ[c]クロメン−6−オン(Uro−A)(0.5g、2.19mmol)を10分間にわたって添加した。混合物を50℃で5時間撹拌した。反応の完了を薄層クロマトグラフィー(TLC)によってモニターした。反応物をメタノールでクエンチした。3N HCl水溶液(10ml)を添加し、混合物を50℃に30分間穏やかに加熱した。反応混合物を10%NaOH溶液で中性に調整し、揮発物を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、60〜120メッシュシリカゲルを有するヘキサン中の50%エチルアセテートを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な6H−ベンゾ[c]クロメン−3,8−ジオール生成物を得た。
MS(M+1)=215.2.1 H−NMR(DMSO−d):δ:9.49(2 H,s),7.51−7.50(1 H,d,J=6.6Hz),7.47(1 H,d,J=6.6Hz),6.75−6.73(1 H,m),6.61(1 H,s),6.48(1 H,m),6.32(1 H,s),4.96(2 H,s),13C−NMR(DMSO−d):δ:158.10,156.71,154.93,131.88,123.86,122.79,121.66,115.72,114.89,111.84,110.07,103.95,68.18。
細胞培養:10%胎児ウシ血清、1×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液(100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン;Sigma Aldrich)を補充したDMEM−高グルコースおよびEMEM−高グルコース(Cornings;10−009CV)中で、それぞれ、ヒト結腸上皮癌細胞株、HT29(ATCC番号HTB−38(商標))およびCaco2細胞(ATCC番号HTB−37(商標))を、加湿された雰囲気の中(5%CO、95%空気、37℃)で維持した。マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)を単離し、以下の手順を使用して培養した(KUROWSKA−STOLARSKA et al.(2009)“IL−33 amplifies the polarization of alternatively activated macrophages that contribute to airway inflammation”The Journal of Immunology,Vol.183,pp.6469−6477)。簡潔に述べると、マウスをCO麻酔によって屠殺し、70%エタノールですすぎ、骨髄を脛骨および大腿骨から単離した。骨髄細胞を、分化のために10%FBS、1%グルタミン、1×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、および50ng/mLのマウスM−CSF(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)を補充したDMEM−高グルコース(HyClone)中に7日間播種(2×10細胞/ml)した。
BMDM中のIL−6およびTNF−αの測定:ELISAおよびRNA単離のために、BMDMを96(10,000細胞/ウェル)および12ウェル(0.1×10細胞/ウェル)プレートに播種した。抗炎症特性を評価するために、BMDMを、50ng/mL濃度のE.coli由来リポ多糖(LPS、O55:B5、Sigma)で単独で、または示された濃度(0.01、0.1、1、10、25、50μM)のUroAまたはUAS03と組み合わせて、4重で6時間刺激した。ELISAを介したサイトカイン産生のために、上清を収集し、4℃で10分間10,000×gで遠心分離して任意の細胞をペレットダウンし、サイトカインを、製造業者の使用説明書に従ってIL−6およびTNF−α特異的ELISAキット(Biolegend)を使用して定量化した。
LPS誘発性腹膜炎:オスのマウス(C57BL/6J、6〜8週齢)を、3群、すなわちビヒクル(0.25%カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC))、UroA、およびUAS03に無作為に分割した。UroAおよびUAS03群は、それぞれの化合物(100μlの体積中20mg/kg)を0、6、12、18、および24時間で強制経口投与した。ビヒクル群は同時に同じ体積のCMCを投与した。24時間後、マウスにLPS(2mg/kg;Sigma−Aldrich)を腹腔内注射した。4時間のLPS接種後、マウスを屠殺し、血液を採取した。血清を、BDマイクロテナーセパレータチューブを使用して調製した。それぞれのELISAアッセイキット(Biolegend)を使用して、血清試料をIl−6およびTNF−αについて分析した。
リアルタイムPCR:全RNAを、Maxwell(登録商標)16 LEV simplyRNA組織キット(Promega)を使用して細胞/組織から単離し、TaqManC逆転写キット(Applied Biosystems,CA,USA)で逆転写した。転写したcDNA(希釈後)を100nMの遺伝子特異的プライマー(リアルタイムプライマーLLC)および1×SYBR緑色反応混合物(Power SYBR(登録商標)Green PCR Master Mix;Applied Biosystems,CA,USA)と混合した。遺伝子発現の変化を、CFX96(商標)リアルタイムシステム(Bio Rad)を使用して解析し、発現の倍数変化を、GAPDH/β−アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用して未処理の対照で正規化し、2ΔΔCT法を使用して計算した。
インビトロ透過性試験.インビトロ細胞透過性試験のために、Caco2細胞またはHT29細胞(2×10細胞/cm)を、24ウェルTranswell(登録商標)プレート(Corning;USA)、ポリエステル膜フィルター(孔径0.4μm、表面積1.12cm)上に播種した(KOWAPRADIT et al.(2010)“In vitro permeability enhancement in intestinal epithelial cells(Caco−2)monolayer of water soluble quaternary ammonium chitosan derivatives”Aaps Pharmscitech,Vol.11,pp.497−508)。培養培地を頂部と基底チャンバの両方に添加し、培地をCaco2細胞については21日まで、またはHT29細胞については5〜7日まで隔日交換した。Caco2細胞については、EMD Millipore Millicell−ERS2 Volt−Ohm Meter(Millipore)を使用して経エーテル電気抵抗(TEER)を計算した。600Ω.cmを超えるフィルター(細胞単層を有する)を透過性試験に使用した。細胞が所望のコンフルエント(単層細胞)に到達した後、細胞をビヒクル(0.01%DMSO)、UroA(50μM)、およびUAS03(50μM)で24時間前処理した。処理後、単層をPBSで洗浄して任意の残留薬物を除去し、200μLのLPS(HBSS中50ng/ml)を各ウェルに添加し、2時間インキュベートした。LPS処理後、単層をPBSで2回洗浄し、200μLのFITC−デキストラン(FD−4、Sigma Aldrich,USA)溶液(HBSS中1mg/mL)を添加した。2時間後、基底チャンバからの試料を取り出し、それぞれ480および525nmの励起および発光波長で蛍光96ウェルプレートリーダーを使用してFD4濃度を決定した。
RNA配列決定:ビヒクルおよびUroA(50μM)(n=3)で24時間処理したHT29細胞から全RNAを単離し、トリゾールベースの溶解、続いてQiagen RNeasyキットを使用してRNAを単離した。単離されたRNAを、Agilent Bioanalyzer 2100システム(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)を使用して完全性(RIN>9.5)についてチェックし、Qubitフルオロメトリーアッセイ(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)を使用して定量化した。1μgの全RNAを使用して、IlluminaのTruSeq Stranded mRNA LTライブラリ調製プロトコル(Illumina Inc.,San Diego,CA)に従って、ポリA濃縮mRNASeqライブラリを調製した。15個全ての試料を個別にバーコード化し、断片サイズ決定のために、Agilent Bioanalyzer DNA 1000分析(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)と併せてIllumina PlatformsのためのKAPAライブラリ定量化キット(Kapa Biosystems,Wilmington,MA)で定量化した。平均断片サイズは、約300bpであった。1%PhiXスパイクインを有するプールされた1.8pMのライブラリを、1つのNextSeq500/55075サイクル高出力キットv2配列決定フローセルにロードし、IlluminaNextSeq500シーケンサー上で配列決定した。FASTQC(バージョン0.10.1)を使用して、1×75bp配列の品質をチェックした(ANDREWS(2014)“FastQC:A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data」”。品質の低下が予想される読み取りの終了時に、読み取りの全長にわたって30を超える中央品質スコア(エラー確率=0.001または1,000の1ベースコールが不正確であると予測される)、および20を超えるより低い分位数(エラー確率=0.01)でトリミングする必要はなかった。各試料の生の読み取りを、tophat2(バージョン2.0.13)を使用してHomo sapiens(hg38)参照ゲノムアセンブリ(hg38.fa)に直接整列させ(KIM et al.(2013)“TopHat2:accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions,deletions and gene fusions”Genome biology,Vol.14,Article R36)、bam形式で整列ファイルを生成した。任意のパラメータとしては、−no−coverage−searchおよび−ライブラリ型fr−1本鎖が挙げられる。ヒトENSEMBL(FLICEK et al.,(2014)“Ensembl 2014”Nucleic acids research,Vol.42,pp.D749−D755))トランスクリプトームgtf v82を転写産物同定に使用し、合計60,903個の遺伝子を得た。平均して、試料当たり2600万リードを、97%の平均整列速度で整列させた。配列マッピングに続いて、cuffdiff2(バージョン2.2.1)(TRAPNELL et al.(2013)“Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA−seq”Nature biotechnology,Vol.31,pp.46−53;TRAPNELL et al.,(2012)“Differential gene and transcript expression analysis of RNA−seq experiments with TopHat and Cufflinks”Nature protocols,Vol.7,pp.562−578)を含むプログラムのタキシードスイートを使用して、任意選択のパラメータ−ライブラリー型fr−1本鎖で差次発現遺伝子を決定した。RNA−seqデータを遺伝子データベース(GEO#GSE113581)に蓄積した。
免疫ブロット(ウェスタンブロット):全タンパク質溶解物を、放射免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液(Sigma−Aldrich,USA)を使用して結腸組織/細胞のいずれかから収集し、使用説明書に従ってBCAタンパク質定量キット(Thermo Scientific)を使用して定量化した。総タンパク質(20〜50μg)をNuPAGE(商標)4〜12%Bis−Trisゲル(Novex Life technologies)上で分解し、ポリフッ化ビニリデン膜(0.22μmの孔;Millipore,USA)にトランスファーした。5%(w/v)脱脂粉乳(1×TBSを含む)で1時間ブロッキングした後、膜を4℃で一晩それぞれの抗体と共にインキュベートした(それぞれの抗体の希釈を表A1に示す)。翌日、Horseradishペルオキシダーゼとコンジュゲートしたそれぞれの二次抗体をプローブし、化学発光基質を使用してタンパク質バンドを検出した(ImageQuant LAS 4000)。ImageJソフトウェアを使用してバンドの濃度測定分析を行った。Cldn4、Ocln、Cldn1、Cyp1A1、AhR、HO1、NQO1、Keap1、β−アクチン、およびラミンBに対する抗体を、Santa Cruz Biotechnologies(USA)から購入し、Nrf2をNovus Biologicals(USA)から購入した。抗体の供給源および一覧を表A1に提示する。
表A1:ウェスタンブロットに使用される抗体のリスト。
Figure 2021523942

共焦点イメージング:HT29またはCaCo2またはBMDM細胞(50,000細胞/ウェル)を8ウェルチャンバスライド(154534PK;ThermoFisher Scientific)に播種し、それらを一晩増殖させた。細胞をビヒクル(0.01%DMSO)またはUroA(50μM)またはUAS03(50μM)で所望の時点で誘導し、冷メトノールで固定した。AhRまたはNrf2またはCldn4をそれぞれの抗体(1:200希釈)で染色した後、蛍光標識(AhRについてはAlexa flour 594、Nrf2およびCldn4についてはAlexa flour 488)された二次抗体(1:500希釈;ThermoFisher Scientific)を行った。核をDAPI(Sigma Aldrich)で染色した。Nikon A1R共焦点顕微鏡を用いて、適切なレーザーチャネルを有する60倍倍率レンズを用いて共焦点画像をキャプチャした。
AhRレポーターアッセイ:AhRレポートアッセイを、AhRレポーターアッセイシステム(Indio Biosciences)を使用して行った。AhRレポーター細胞(AhRプロモーター下でルシフェラーゼを発現する)、および陽性対照MeBio(AhRリガンド)化合物をキットで提供された。細胞をビヒクルもしくはUroAもしくはUAS03、またはエラグ酸もしくはMeBioで6時間処理し、発光を製造者の使用説明書に従って測定した。
Nrf2−レポーターアッセイ:ARE−ルシフェラーゼプラスミドベクターは、Cayman Chemicalsから入手した。HT29細胞を、リポフェクタミン3000試薬(ThermoFisher Scientific)を使用して50%コンフルエンシーでトランスフェクトした。簡潔に述べると、細胞を6ウェルプレート(0.5×10細胞)に播種し、24時間成長させた。1μgのプラスミドDNAおよびトランスフェクション試薬を含むトランスフェクション複合体を、FBSの不在下で各ウェルに添加した。6時間後、10%FBSを含有する培地を添加し、細胞をさらに16〜18時間インキュベートした。これらの細胞をビヒクル(0.01%DMSO)もしくはUroA(50μM)もしくはUAS03(50μM)もしくはスルホラファン(10μM)で24時間処理した。誘導物質とのインキュベーション後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼ活性(発光)を、マルチウェルプレートルミノメーター(BMG、LABTECH)を使用してルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)で測定した。
Cyp1A1酵素活性の測定(エクスビボ):ビヒクルまたはUroAまたはUAS03、BNFまたはFICZで、経口経路または腹腔内経路のいずれかを介して、指示された濃度で1週間毎日処理した。1週間後、マウスを安楽死させ、結腸および肝臓組織を解離した。これらの組織由来のマイクロソームを、以下の手順を使用して調製した(SINGH et al.,(2013)“Evaluation of memory enhancing clinically available standardized extract of Bacopa monniera on P−glycoprotein and cytochrome P450 3A in Sprague−Dawley rats”PloS one,Vol.8,Article e72517)。肝ミクロソームについては、肝臓を最初に0.9%の塩化ナトリウム溶液で灌流し、切除した。付着した血液および生理食塩水を組織紙上でブロットすることによって除去し、組織を組織均質化緩衝液(250mMのスクロースを含む50mMのTris−HCl、pH7.4)中でホモジナイズした。ホモジネートを10,000×gで4℃で30分間遠心分離した。得られた上清をさらに105,000×gで4℃で60分間遠心分離した。ペレットをホモジナイゼーション緩衝液で洗浄し、4℃で60分間、105,000×gで再び遠心分離した。ペレットを均質化緩衝液中に懸濁し、タンパク質およびCYPアッセイに使用した。腸ミクロソーム調製のために、腸を除去し、0.9%の塩化ナトリウムで洗浄した。腸を長手方向に切開して粘膜層を露出させ、ガラススライドの助けを借りて粘膜をスクラップした。スクレープした組織を、ホモジナイゼーション緩衝液(グリセロール(20%v/v)、プロテアーゼ阻害剤(1%)、およびヘパリン(3U/ml)を含む50mMのTris−HCl緩衝液)中に収集した。この懸濁粘膜をホモジナイズし、10,000×gで4℃で20分間遠心分離した。得られた上清をさらに105,000×gで4℃で60分間遠心分離した。ペレットを緩衝液で洗浄し、再び105,000×gで4℃で60分間遠心分離した。ペレットをホモジナイゼーション緩衝液に懸濁し、タンパク質およびCYP酵素アッセイに使用した。
エトキシレゾルフィン−O−デエチラーゼ(EROD)アッセイ:マイクロソームタンパク質(0.5mg)を、エトキシレゾルフィン(0.01mM)を含有する200μLのTris緩衝液(0.1M、pH7.4)と混合した。反応を開始するために、NADPH(0.1mM)を添加し、37℃で10分間インキュベートした。10分後、等量のアセトニトリルを添加することによって反応を終了させ、反応混合物を13000×gで4℃で10分間遠心分離させた。上清を使用して、蛍光を測定することによってレゾルフィンを決定した(Ex.530nm、Em.580nm)。純粋なレゾルフィン(Sigma Aldrich)を使用して、標準曲線を生成した。
P450−GloCyp1A1発光アッセイ:上記マイクロソーム(20μg)を、P450−GloCyp1A1発光アッセイに、製造者の使用説明書に従って使用した。
Cyp1A1酵素活性のインビトロでの測定。ERODアッセイ:ビヒクル、UroAおよびUAS03(24時間)で処理したHT−29細胞(15,000細胞/ウェル)をHBSS緩衝液ですすぎ、次いで新鮮なHBSS緩衝液を5μMの7−エトキシレゾルフィンと共に添加した。細胞をさらに、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション時間後、蛍光(Exc.530nm、Em.580nm)を測定し、生成物(レゾルフィン)をキャリブレーション標準から計算し、タンパク質濃度で正規化した。
P450−GloCyp1A1発光アッセイ:HT29細胞(25,000細胞/ウェル)を48ウェルプレートにプレートした。次いで、細胞をUroA(0.1、1、10、25、および50μM)またはUAS03(0.1、1、10、25、および50μM)またはFICZ(0.1、1、10、25、および50nM)で24時間処理した。処理後、細胞を洗浄して、任意の残留薬物、およびCyp1A1基質を含む新鮮な培地を3時間除去した(キットカタログ番号V8751;Promegaに提供されるプロトコルに従う)。インキュベーション後、25μlの培養培地を各ウェルから除去し、96ウェルの白色不透明プレートに移し、25μlのルシフェリン検出試薬を添加して発光反応を開始し、プレートを室温で20分間インキュベートした。インキュベーション後、発光をルミノメーターに記録した。データは、ビヒクル処理に対する倍率変化として報告された。
低分子干渉RNA(siRNA)媒介ノックダウン実験:AhRsiRNA(SR300136)およびCyp1A1siRNA(SR301093)は、Origeneから購入した。ノックダウン実験のために、HT29細胞(0.5×10細胞/ウェル)を6ウェルプレートに播種し、24時間増殖させた。与えられた使用説明書に従って、Lipofectamine(登録商標)RNAiMAX試薬(ThermoFisher Scientific)を使用して、AhR、Cyp1A1、および対照siRNAをHT29細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション24時間後、細胞をビヒクル(0.01%DMSO)、UroA(50μM)およびUAS03(50μM)で24時間誘導した。誘導物質での処理後、細胞をRIPA緩衝液を使用して溶解し、全タンパク質を使用して、ウェスタンブロットによってAhR、Cyp1A1およびcldn4の発現を解析した。
CRISPR/Cas9法によるCyp1A1欠失:HT29細胞(1.5×10)をトランスフェクションの24時間前に抗生物質を含まない標準増殖培地中6ウェルに播種した。60%コンフルエンシー細胞で、細胞を、UltraCruz(登録商標)トランスフェクション試薬(sc−395739、Santa Cruz)を使用して、CRISPR/Cas9 KOプラスミド(sc−400511−KO−2、Santa cruz)およびHDRプラスミド(sc−400511−HDR−2、Santa cruz)のそれぞれ2μgで共トランスフェクトした。培地を、トランスフェクションの96時間後に(4μg/mLのピューロマイシンを含む)選択培地で置き換えた。蛍光顕微鏡およびウェスタンブロット(CYP1A1)でトランスフェクションが確認された。GFPおよびRFPの二重陽性細胞を、MoFlo XDP選別機器(Beckman Coulter)を使用して選別した。これらの選別におけるCyp1A1の欠失を、ウェスタンブロットによって確認した。次いで、これらの細胞を6ウェルプレートにプレーティングして、Cldn4発現に対するUroA/UAS03の効果を評価するための標準培地に播種した。24時間後、タンパク質のためにUroA/UAS03処理細胞を採取し、正常なHT29細胞と共にCldn4発現を調査した。
NF−κB EMSAアッセイ:10%胎児ウシ血清(FBS)、100U/mlペニシリン、および100U/mlストレプトマイシンで補充したDMEM中で、RAW264.7細胞またはBMDMを100mmディッシュに播種した(1×10)。細胞を24時間増殖させ、インキュベーション後、細胞を、UroA(50μM)およびUAS03(50μM)を含んで、または含まずにLPS(50ng/mL)で6時間処理した。処理後、培養培地を除去し、PBSで洗浄した。細胞を、PBS中でスクレープし、ペレットダウンした。上清を廃棄し、ペレットを、NE−PER核および細胞質キット(Thermo Scientific、カタログ番号78833)を使用する核タンパク質および細胞質タンパク質の単離に使用した。後に、核タンパク質(2μg)を、核因子カッパB p65(Viagene Biotech Incカタログ番号IRTF28260)のIR Fluo−プローブを有する非放射性EMSAキットを使用するEMSAに使用した。
結腸移植培養:野生型(C57BL/6)またはNrf2−/−またはAhR−/−マウス由来の結腸組織片(0.5〜1cmの長さ)を、ビヒクル(0.01%DMSO)、UroA(50μM)またはUAS03(50μM)の存在下で、加湿雰囲気中で、完全なDMEM−高グルコース培地(10%ウシ胎児血清、1×ペニシリンストレプトマイシン溶液を補充)中で3重で24時間培養した。タンパク質調製(RIPA+緩衝液を有する組織溶解物)または全RNA単離のために組織を処理した。これらの組織溶解物またはRNAを使用して、Nrf2、Cldn4、およびAhRの発現を決定した。
RNAおよびタンパク質分析のための組織処理:結果セクションに記載されているように、マウスを処理した。マウスをCO窒息、続いて頸部脱臼で安楽死させた。結腸を解剖し、管腔内容物を冷PBS(PMSFおよびオルトバンデート酸ナトリウムを含む)でフラッシュアウトした。結腸の小さい部分を液体窒素中でスナップ凍結し、RNA分析のために−80℃で保管した。タンパク質試料の調製のために、結腸を長手方向に開き、事前に冷却されたガラススライドを使用して氷冷1×PBS中で粘膜をスクレープし、4℃で300×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをRIPA緩衝液(1×プロテアーゼ阻害剤を含む)中に懸濁し、高速でボルテックスした。氷上で30分間インキュベーションした後、試料を13,000×gで4℃で20分間遠心分離した。上清を収集し、タンパク質を、BCAタンパク質定量キットを使用して定量化した。溶解物をウェスタンブロットに適切に使用した。
28日間繰り返し投与毒性試験:UroAおよびUAS03の毒性を評価するために、28日間の繰り返し用量毒性試験を行った。マウスに、UroA(20および40mg/kg/日)ならびにUAS03(20および40mg/kg/日)を28日間毎日投与した。体重、食物、および水の摂取量を毎週評価した。28日後、マウスを屠殺し、全ての主要臓器の総検査を行った。血液を収集して血清を得た。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を、使用説明書に従ってALT/ASTキット(BioVision)を使用して解析した。
2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)誘発性大腸炎:オスのC57BL/6またはNrf2−/−マウス(6〜8週齢のマウス)を、ケタミン/キシラジン(100mg/12.5mg/kgのIP)混合物で麻酔し、50%エタノール中の単回用量のTNBS(2.5mg/マウス、Sigma Aldrich,USA)を投与した。TNBSの投与後、マウスを30〜60秒間逆さまに保持して、結腸内のTNBSの適切な分布を確保した。対照群は、TNBSを含まない50%のエタノールを投与した。TNBSを有するマウスを、ランダムに、ビヒクル(0.25%カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC))、UroA、およびUAS03の3つの群に分けた。UroAまたはUAS03を、所望の濃度で0.25%ナトリウム−CMCに再懸濁した。マウスに、所望の濃度(体重1kg当たり4または20mg)で100μl中のVehまたはUroAまたはUAS03を経口投与した。処理は、TNBS投与の12時間後に開始し、その後72時間まで12時間毎になされた。この実験は、AhR−/−マウスが関与したTNBSの60時間後に終了した。一部の実験では、我々は、12時間TNBS投与後に1回のみ処理した。投与されたTNBSおよび対照マウスを、80時間のTNBS/エタノール処理後に、組織および血漿収集のために安楽死させた。マウスを大腸炎表現型について検査した。
DSS誘発性大腸炎:マウスにおける急性実験的大腸炎は、飲料水中で3%(w/v)の大腸炎グレードDSS(MP Biomedicals)を7日間投与することによって誘導した。対照動物はDSSを含まない飲料水を投与した。全ての大腸炎群マウスを、DSS処理の4日および6日に、3つの群、すなわちビヒクル処理(0.25%Na−CMC)、UroA(20mg/kg/日)、およびUAS03(20mg/kg/日)にランダムに分けた。7日後、動物を通常の水に7日間戻した。慢性DSS大腸炎モデルについては、2.0%(w/v)のDSSの3つのサイクルを使用し、各DSSサイクルは構成され、または7日、続いて10日の通常の水であり、マウスは、DSSサイクルの4日および6日ごとにUroA(20mg/kg/日)で処理された。
大腸炎の重症度と組織の収集の評価:体重、便の一貫性、および直腸出血の変化についてマウスを毎日評価し、スコアを与え、得られた疾患活動性指数に組み合わせた(MURTHY et al.,(1993)“Treatment of dextran sulfate sodium−induced murine colitis by intracolonic cyclosporin”Dig Dis Sci,Vol.38,pp.1722−1734)。安楽死後、結腸を回収し、PBS含有(1mMのPMSFおよび0.2mMのオルトバナジウム酸ナトリウム)でフラッシュした。結腸長および結腸重量を測定し、結腸の小さな部分をミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性およびRNA単離のために切除した。MPOおよびRNA抽出のための組織を液体窒素中でスナップ凍結し、さらなる分析まで−80℃で保管した。組織学的検査のための組織を、10%リン酸緩衝生理食塩水ホルマリンに保管した。血液を収集し、血清を3500×gで15分間遠心分離することによって分離した。血清サイトカイン(IL−6、TNF−α;Biolegend)およびケモカイン(CXCL1;R&D Systems)レベルを、製造者の使用説明書に従ってELISAによって測定した。
インビボ腸透過性アッセイ:腸バリア機能を、FITC−デキストラン(MW4000、FD4,Sigma−Aldrich,USA)を使用してインビボ腸透過性について評価した(FURUTA et al.,(2001)“Hypoxia−inducible factor 1−dependent induction of intestinal trefoil factor protects barrier function during hypoxia”J Exp Med,Vol.193,pp.1027−1034)。簡潔に述べると、マウスにFITC−デキストラン(100gm体重当たり60mg)を経口投与した。安楽死前にマウスを4時間絶食させた。血清中のFITC−デキストラン濃度は、血清中のFITC−デキストランの標準曲線(励起、485nm、発光、525nm、BMG LABTECH)を使用して決定した。
ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性:結腸におけるMPO活性は、以下の手順を使用して決定した(KIM et al.(2012)“Investigating intestinal inflammation in DSS−induced model of IBD”J Vis Exp,Vol.60,Article e3678(6 pages))。簡潔に述べると、結腸組織を50mMのPBS(pH6.0)中0.5%(w/v)のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(H6269;Sigma−aldrich,USA)中でホモジナイズした。このホモジネートは、均質な懸濁液を得るために3回の凍結融解サイクルおよび10〜15秒超音波処理を行った。この懸濁液からの上清を、13000×gで20分間、4℃で遠心分離した後に回収した。次いで、上清(10μl)を、0.167mg/mlのo−ジアニシジン(Sigma−Aldrich,USA)および0.0005%H(Sigma−Aldrich USA)を含む50mMのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)に添加し、吸光度を2分間間隔で450nm(BMG、LABTECH)で得た。各試料中のMPOの単位は、MPOの1単位(U)=1.13×10−2nm/分のモル吸光係数で割った1μmolのHを考慮して決定され、各試料中のMPOは、[ΔA(t−t)]/Δmin×(1.13×10−2)式を用いて計算し、MPO単位をmg組織あたりで正規化した。
組織病理学:収集した結腸組織を10%緩衝ホルムアルデヒド溶液中で一晩固定し、固定組織に標準的な組織病理学的処理をした。簡潔に述べると、固定後、組織は脱水し、パラフィン埋め込み前にキシレンで洗浄した。5μmのパラフィン切片を切断し(Leicaミクロトーム)、H&E染色のために染色した。Aperio Scanscopeを用いてH&E画像をキャプチャした。H & E切片は、Erben et al.(ERBEN et al.,(2014)“A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models”Int J Clin Exp Pathol,Vol.7,pp.4557−4576)に記載されるスコア付けを用いて、盲検でスコア付けした。
以下に考察される結果に使用される方法は、別段の指示がない限り、実施例セットAで論じられる方法である。
実施例セットB
URoAおよびUAS03の合成および抗炎症活性
UroA(3,8−ジヒドロキシ−6H−ジベンゾ[b,d]ピラン−6−オン)は、平面構造をもたらす2つのモノヒドロキシルフェニル環を連結するラクトン(環状エステル結合)を有する(図1A)。胃pHまたは消化酵素は、ラクトン環を加水分解することができ、これにより環が開き、平面構造および場合によってはその活性が失われる(理論に拘束されることを望むものではない)。より安定し、おそらくより強力な化合物を生成するために、非加水分解性環状エーテル誘導体UAS03(6H−ベンゾ[c]クロメン−3,8−ジオール)を合成した(図1A)。両方の化合物の安定性を、胃pHおよび消化酵素の条件下で検査した。結果は、UAS03が実際に胃pHで、また胃酵素、例えば、エステラーゼおよびプロテアーゼの存在下でも安定であることを示した(図1A)。URoAとUAS03の両方は、マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)においてLPS誘導性IL−6およびTNF−αを減少させ、UAS03は、ナノモル濃度での抗炎症活性を示した(図1B)。次に、UroAおよびUAS03の抗炎症活性をLPS誘導性腹膜炎マウスモデルにおいてインビボで検査した。UroAまたはUAS03処理は、血清IL−6レベルおよびTNF−αレベルのLPS誘導性増加を減少させた(図1C)。これらの結果は、UAS03が、増加した抗炎症活性を有するUroAの強力な構造類似体であることを示唆する。
UroA/UAS03はタイトジャンクションタンパク質を誘導する
微生物代謝産物は腸上皮に近接しているので、我々は、代謝産物が上皮細胞機能に直接影響を及ぼす可能性があると推測する(理論に拘束されることを望まない)。このような効果を調べるために、UroAに曝露した上皮細胞株(HT29)のRNA−Seq分析を行った。方法に記載されているように解析を行い、差異的遺伝子発現の有意性を決定するために、cuffdiff2アルゴリズムを用いた。0.05の未補正p値カットオフに基づいて、1,960個の遺伝子が、HT29細胞におけるUroA処理の結果として差次的に発現されることが決定された。このリストをさらに制限すると、437個の遺伝子が、UroA処理HT29細胞においてFDR補正q値<0.05で差次的に発現することが見出された(図1D)。これらの制限された遺伝子リストを使用した経路分析を、Ingenuity Pathway Analysis(IPA)ソフトウェアを使用して行った(図1D)。真核生物開始因子2(eIF2)、ラパマイシン(mTOR)の哺乳動物標的、およびミトコンドリア機能障害経路は、上位3経路として現れた。MTORおよびeIF2経路に対するUroAの影響は、結腸上皮機能との関連で確立する必要があった。RNA−Seq解析は、シトクロムP4501A1(Cyp1A1)が上位3つのUroA上方制御遺伝子の中にあることを示した。経路分析は、Nrf2およびAhRシグナル伝達経路が上部25にあることをさらに示す(図1D)。バリア機能の調節は、IBDを緩和するのに役立つことがあると推測する(理論に拘束されることを望むものではない)。したがって、RNA−Seqデータにおけるタイトジャンクションタンパク質の発現を調査し、Claudin4(Cldn4)がUroA処理細胞において上方制御されることを見出した(図1E〜F)。Cldn4およびCyp1A1に加えて、UroAはまた、ヘムオキシゲナーゼ1(HMOX1またはHO1)の発現を増加させた(図1E〜F)。HO1はNrf2依存性遺伝子であり、毒性ヘムの除去、酸化ストレスからの保護、アポトーシスおよび炎症の調節を含むいくつかの有益な活性を発揮することができる。これらの観察に基づいて、UroAおよびUAS03がタイトジャンクションタンパク質を誘導し、AhRおよびNrf2経路を通じてバリア機能を増強することができると仮定した。
Ingenuity Pathway Analysis(IPA)は、Nrf2およびAhRシグナル伝達経路の濃縮を明らかにし(図1D)、UroAシグナル伝達におけるこれらの経路の役割を支持した。IBDにおける潜在的な治療手段は、バリア機能を増加させる能力である。したがって、我々は、UroA処理細胞におけるタイトジャンクションタンパク質Cldn4の発現の増加を観察したことに関心があった。RNA−seqデータセットにおいて統計的に有意ではないが、リアルタイムPCRを使用して、追加のタイトジャンクションタンパク質ZO−1およびOcln1の発現の増加をさらに観察した(図1G)。UroAまたはUAS03によるこれらのタンパク質の増加したレベルは、HT29と別の結腸上皮細胞株Caco2の両方におけるウェスタンブロット(図1H)および共焦点イメージングによるCldn4(図1I)によって確認された。さらに、UroA/UAS03で処理したマウスの結腸におけるCldn4の発現の上昇を観察した(図1J)。トランスウェルプレート中のインビトロFITC−デキストラン透過性アッセイを使用して、タイトジャンクションタンパク質の増加の機能結果を検査した。図1Lに示すように、Caco2またはHT29細胞をUAS03またはUroAで前処理することは、LPSを阻害し、FITC−デキストランの底部チャンバへの漏出を誘導した。全体的に、これらの結果は、UroA/UAS03による処理が、腸関門の完全性を潜在的に増強するタイトジャンクションタンパク質の発現を増加させたことを示唆する。
AhRはUroA/UAS03の活動を媒介する
RNA−SeqデータおよびリアルタイムPCRデータは、UroAがCyp1A1を上方制御したことを示唆した(図1E〜F、図2A〜B)。P450−GloCyp1A1アッセイ(図2C)および7−エトキシレゾルフィン−O−デエチラーゼ(EROD)アッセイ(図2D)を実施して、Cyp1A1酵素活性が同様に影響を受けたかどうかを判定した。結腸上皮細胞におけるUroA/UAS03はCyp1A1活性を誘導した(図2Cおよび図2D)。Cyp1A1はAhRシグナル伝達の下流標的であるため、UroA/UAS03がAhRを介してそれらの作用を媒介するかどうかを調べた。これらのアッセイにおいて、強力なAhRリガンド[2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ジオキシン(TCDD)または6−ホルミリンドロ[3,2−b]カルバゾール(FICZ)および低親和性AhRリガンド(β−ナフトフラボン(BNF)]を利用して、Cyp1A1活性をUroA/UAS03と比較した。UroA/UAS03は、50μMで低親和性AhRリガンドBNFと同様にCyp1A1を活性化した。予想通り、FICZおよびTCDD等の高親和性リガンドは、UroA/UAS03/BNFと比較して、ナノモル濃度でもCyp1A1活性の増加を示した(図2Cおよび図2D)。野生型およびAhR−/−マウスを使用して、UroA/UAS03がインビボでCyp1A1活性を誘導するかどうかを試験した。図2Eに示すように、UroA/UAS03は、野生型の結腸および肝臓においてCyp1A1活性を活性化したが、AhR−/−マウスにおいては活性化しなかった。さらに、UroA/UAS03処理野生型マウスは、BNFおよびFICZ処理マウスと比較して、結腸組織において比較的多くのCyp1A1活性を示した(図2F〜G)。腹腔内(i.p)を通して送達されるFICZおよびBNFは、経口経路を通して送達されるUroA/UAS03と比較して、肝臓においてより多くのCyp1A1活性を示した(図2F〜G)。ファーストパス効果に起因する可能性がある。投与経路を直接比較するために、腹腔内を通じてUroAまたはUAS03またはFICZを送達し、Cyp1A1酵素活性を決定した。予想通り、高親和性AhRリガンド、FICZは、UroA/UAS03による5〜6倍と比較して肝臓において約30倍を誘導した(図2H)。結腸において、FICZはCyp1A1活性を最大約5倍まで増加させたが、UroA/USA03は約3倍しか増加しなかった。要約すると、これらの結果から、UroA/UAS03がCyp1A1の発現を上方制御し、低レベルではあるが、インビボでAhRを介して酵素活性を増強することが示唆される。
UroA/UAS03によるAhRの直接活性化を、HT29細胞において、XRE−ルシフェラーゼレポーターアッセイおよびAhRの核移行によって検査した。データは、UroA/UAS03処理が、より高いレベル(約15倍)のAhR活性化を引き起こした高親和性リガンドMeBioと比較して、ルシフェラーゼ活性の2〜4倍の誘導をもたらしたことを示した(図2I)。UroAとUAS03の両方は、AhRの核移行を誘導した(図2J〜K)。AhRは、UroAまたはUAS03で処理したマウスにおいて上方制御された(図1K)。次に、AhRまたはCyp1A1が、タイトジャンクションタンパク質Cldn4のUroA/UAS03媒介性上方制御に関与しているかどうかを調べた。この目的のために、siRNAノックダウンを使用してAhRまたはCyp1A1発現を抑制し、Cldn4発現を検査した。図2L〜Oに示すように、UroA/UAS03は、AhRまたはCyp1A1ノックダウン細胞の両方においてCldn4を誘導しないように見える。さらに、CRISPR/Cas9法を用いてHT29細胞中のCyp1A1も欠失させ、UroA/UAS03媒介活性を調べた。Cyp1A1の欠失は、親HT29細胞と比較して、Cldn4の基礎レベルに対する効果を示さなかった(図2P)。図2Q〜Sに示すように、UroA/UAS03は、Cyp1A1欠失した細胞においてCldn4またはNQO1を上方制御しなかったように見えた。これらの結果は、UroA/US03が、AhR−Cyp1A1依存性経路の活性化を介してタイトジャンクションタンパク質の発現を誘導することを示唆する。
UroA/UAS03はNrf2を介して腸バリア機能を増強する
AhRはUroA媒介活性において役割を果たすように見えるので、乳癌細胞株MCF−7(<<http://dbarchive.biosciencedbc.jp/kyushu−u/hg19/target/AHR.1.html>>)で行ったChIP−Atlas(<<http://chip−atlas.org/target_genes>>)
を使用して既存のAhRリガンドチップ分析を分析した。分析は、Nrf2がAhRシグナル伝達カスケードの標的であることを示唆した(図3A)。同様に、AhRはまた、Ocln、TJP3、Cldn2、3、および5等のタイトジャンクションタンパク質に影響を及ぼす(図3B)。さらに、RNA配列データ(Ingenuity)の経路解析は、AhRおよびNrf2経路が上位25に列挙されていることも明らかにした。TCDDがNrf2経路を介してその活性のいくつかを媒介するにつれて、我々は、UroA/UAS03がAhR−Nrf2依存性経路を活性化することによってタイトジャンクションタンパク質を誘導する可能性があると仮定した。結腸上皮細胞ならびにAhRおよびNrf2が欠損したマウスにおいて、この仮説を試験した。UroA/UAS03による処理は、mRNAとタンパク質レベルの両方でNrf2を上方制御し(図3Cおよび図3G)、HT29細胞内でその核移行を誘導した(図3H〜I)。ARE−ルシフェラーゼアッセイを使用して、Nrf2プロモーター活性を検証し、UroA/UAS03は、より低いレベルではあるが、既知のNrf2活性化剤スルフォラファン(SFN)と同様に、処理時に発光を増強した(図3D)。Nrf2およびその標的遺伝子HO1は、UroA/UAS03で処理された野生型マウスの結腸内(図1J〜K)ならびにHT29細胞内(図3E)で上方制御される。UroA/UAS03に誘導されたCldn4上方制御におけるAhR−Nrf2経路の正確な機能および相互依存性を調べるために、C57BL/6(野生型、WT)、AhR−/−およびNrf2−/−マウス由来の結腸外植片を使用した。NAD(P)H:キノンオキシドレダクターゼ(NQO1)は、細胞質2−電子還元酵素をコードし、誘導はAhRとNrf2経路の両方によって共有される。これらのマウスの結腸外植片におけるNQO1の発現をUroA/UAS03が上方制御するかどうかを調査した。UroA/UAS03での処理は、WT結腸外植片におけるNrf2、NQO1、およびCldn4の両方の発現を誘導した(図3J〜N)。しかしながら、これらの化合物は、Nrf2−/−とAhR−/−結腸外植片の両方におけるCldn4およびNQO1、ならびにAhR−/−マウス結腸外植片におけるNrf2を誘導しなかったように見えた(図3J〜N)。これは、UroA/UAS03媒介活性に対するAhRおよびNrf2発現の可能な要件を示唆している。WT、AhR−/−およびNrf2−/−マウス結腸外植片におけるCldn4およびNQO1の発現の基礎レベル比較は、AhRおよびNrf2の欠如がNQO1およびCldn4の発現を減少させたことを示唆する(図3L)。データは、Clnd4の発現がAhR−/−およびNrf2−/−において減少するが、Cyp1A1ノックダウン細胞においては減少しないことを示唆する。
タイトジャンクションタンパク質のUroA/UAS03媒介性上方制御に対するAhRおよびNrf2の可能なインビボ要件を定義するために、WT、Nrf2−/−およびAhR−/−マウスを利用した。これらのマウスの結腸組織におけるCldn4、NQO1の基礎レベル発現の調査は、AhRまたはNrf2の欠如がNQO1レベルを低下させたが、発現の低下の傾向があったにもかかわらず、Cldn4の低下に対する統計的有意性を示さなかったことを示唆する。(図3Q)。マウスをUroA/UAS03(経口、20mg/kg体重)で7日間毎日処理し、バリア機能を分析した。WTマウスにおけるUroA/UAS03による処理は、Nrf2およびタイトジャンクションタンパク質(Cldn4、NQO1、Ocln、ZO1、およびTJP3)を上方制御した(図3O〜T)。対照的に、UroA/UAS 03は、Nrf2−/−およびAhR−/−マウスにおいてこれらのタンパク質を誘導しないように見えた(図3O〜T)。UroA/UAS03誘導NQO1発現は、HT29細胞においても確認された(図3F)。全体的に、これらの結果は、AhRとNrf2の両方が、タイトジャンクションタンパク質およびNQO1のUroA/UAS03媒介性上方制御において役割を果たすことを示唆する。
UroA/UAS03による処理は、大腸炎を軽減する
UroA/UAS03制御バリア機能の生理学的関連性を、2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)誘導大腸炎モデルで試験した(ANTONIOU et al.(2016)“The TNBS−induced colitis animal model:An overview”Ann Med Surg(Lond),Vol.11,pp.9−15.)。UroA/UAS03(12時間間隔で20mg/kg)による経口治療は、TNBS誘発性体重減少(図4A)、疾患活動性指数(DAI)スコアの低下(図4B)、および腸透過性(図4C)から保護した。UroA/UAS03処理は、TNBS誘発性結腸短縮(図4D〜E)および減少した体重対長比(図4F)から保護し、結腸炎症の減少を示唆する。UroA/UAS03処理はまた、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性(図4G)から実証される好中球浸潤、ならびに潰瘍性大腸炎の特徴であるIL−6、TNF−α、CXCL1、およびIL−1β(図4H)等の血清炎症マーカーを低減した。これらの所見と一致して、結腸切片のH&E分析は、より少ない組織損傷および炎症スコアを示した(図4I)。さらに、UroA/UAS03は、これらのマウスの結腸におけるCldn4のTNBS誘発性下方制御からも保護した(図4J)。UroA/UAS03処理の用量および頻度の効果、ならびに大腸炎の緩和におけるそれらの予防的有効性をさらに検討した。図4K〜Pに示すように、UroA/UAS03は、TNBS誘発性大腸炎を4または20mg/kg体重での単一処理で軽減した。各時点における体重の比較は、全ての群におけるTNBS治療が体重の減少につながったことを示唆し、処理は体重の減少を減少させるように見えるが、有意性には達しなかった(図4Q)。しかしながら、処理は、結腸の短縮からの保護、炎症性メディエーターの遮断などの他のパラメータへの影響を示した。野生型マウスをUroAまたはUAS03で補充することは、それらの体重、CBCカウント、ならびに血清ALTおよびASTレベルにおける観察された変化から立証される毒性の兆候を示さなかった(図4R〜S)。
UroA/UAS03は、タイトジャンクションタンパク質を上方制御することによってバリア保護活性を示したため、これらの代謝産物への定期的な曝露が大腸炎の予防において持続的な有益な効果をもたらすかどうかを調査した。UroA/UAS03の予防活性プロファイルを、TNBS誘発性大腸炎モデルにおいて検査した。WTマウスに、ビヒクルまたはUroA/UAS03を1週間毎日経口投与した後、TNBS投与して大腸炎を誘発した。これらのマウスは、さらなるUroA/UAS03を受けなかった。治療レジメンおよび体重パーセントを図5Aおよび図5Hに示す。前処理したマウスを、処理レジメンと同様のTNBS誘発性結腸短縮および結腸炎症(結腸長/体重)から保護した(図5B〜D)。前処理はまた、バリア機能を増強し、TNBS誘発炎症を減少させた(図5E〜F)。これらの結果は、UroA/UAS03が媒介する強化された腸バリア機能が、大腸炎の予防に長期的な有益な効果をもたらす可能性を示唆している。処理レジメンでは、マウスが重度の大腸炎を発症するTNBSの24時間後にUroAまたはUAS03でマウスを処理した。この設定では、UroA/UAS03による処理はまた、ビヒクル処理と比較して、結腸の短縮、腸管透過性、および炎症を低減することによって、大腸炎表現型を逆転させた。
UroA/UAS03の治療用途を、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性大腸炎モデルにおいても調査した。DSSは、上皮細胞バリアを化学的に破壊し、細菌の浸透の増加をもたらし、炎症および結腸組織損傷をもたらす。図2N〜Oに示すように、UroA/UAS03で処理したマウスは、3%DSS誘導急性大腸炎から保護された。UroA/UAS03処理マウスは、疾患進行中に全体的にDAIスコアの低下を示した。15日目の実験終了時のビヒクル処理と比較して、UroA/UAS03処理は、結腸の短縮、腸管透過性の低下、および炎症の低減から保護した(図5I〜M)。さらに、UroA/UAS03の治療有効性も、慢性DSSモデルにおいて調べられ、マウスに、飲料水中の2%DSSで7日間、通常の水上の各サイクルにおける14日間の間隔の4サイクルで与えた(図6A)。腸管透過性の減少(図6B)、結腸の短縮の減少(図6C〜D)、結腸重量/長さ比の増加(図6E)、炎症の減少(血清IL−6、IL−1β、TNF−α、ならびに結腸組織MPOレベル)から明らかなように、UroA/UAS03による処理は、DSS誘発性大腸炎から保護した(図6F〜G)。これらのマウスにおけるタイトジャンクションタンパク質の分析は、UroA/UAS03による処理がCldn4の発現を増強したことも示唆する(図6H)。これらの結果は、バリアの完全性を維持し、結腸炎症を緩和する上で、UroA/UAS03のモデル非依存的有益活性を強調する。
大腸炎に対するUAS03/UroA媒介性保護は、AhR−Nrf2経路を使用することができる
上述の研究は、UroA/UAS03増強バリア機能におけるAhR−Nrf2経路の役割を示した。結腸炎におけるこれらの経路の関連性を調べるために、Nrf2(図7)およびAhR(図8)のインビボ使用を試験した。UroA/UAS03によるNrf2−/−マウスの処理は、TNBS誘発性大腸炎によって引き起こされる体重減少を回復させないように見え(図7A〜Bおよび図9A)、または結腸の短縮から保護しなかった(図7C)。UroA/UAS03処理は、ビヒクル処理と比較して、UroA/UAS03処理マウスにおける同様のFITC−デキストラン漏出から明らかであるように、Nrf2−/−マウスにおけるバリア機能を増強しなかった(図7D)。これらの結果は、UroA/UAS03に強化される腸関門完全性がNrf2の発現を伴うことを実証した。UroA/UAS03は、Nrf2−/−マウスにおけるIL−6およびTNF−αレベル等の血清炎症媒介体を部分的に低下させ(図7E)、これは、UroA/UAS03が、Nrf2非依存的様式でいくつかの抗炎症活性を媒介し得ることを示唆する。UroA/UAS03媒介性保護活性におけるAhRの役割を定義するために、TNBS誘発性大腸炎モデルを野生型マウスと共にAhR−/−マウスで実行した(図8A)。予想通り、AhR−/−マウスは、急速な体重減少から明らかであるように、TNBS誘発性大腸炎モデルに対してより感受性であった(図8Bおよび図9B)。したがって、TNBS投与後60時間で実験を終了した(図8A)。UroA/UAS03による処理は、野生型マウスと比較してAhR−/−マウスで結腸長の短縮から保護しなかったように見えた(図8C〜D)。加えて、UroA/UAS03は、インビボ透過性アッセイから明らかであるように、AhR−/−マウスにおけるバリア機能障害を是正しなかったように見えた(図8E)。血清炎症性メディエーターの分析は、UroA/UAS03がIL−6を減少させず、AhR−/−マウスにおいてTNF−αをわずかに減少させたように見えたのに対し、UroA/UAS03処理は、上述のように野生型マウスにおいてIL−6およびTNF−αを減少させたことを示唆している(図8F)。これらの結果に基づいて、UroA/UAS03は、タイトジャンクションタンパク質を誘導することによって、AhR−Nrf2依存経路を介して保護バリア機能活性を発揮することを提案する(図8G)。
マクロファージは、IBDにおける結腸炎症のメディエーターであり得るため、我々は、UroA/UAS03媒介性抗炎症活性が、マクロファージにおけるAhR−Nrf2経路に関与するかどうかを判定した。最初に、UroA/UAS03がマクロファージにおけるNrf2依存性経路を活性化するかどうかを調べた。結果は、UroA/UAS03による処理が、Nrf2発現を上方制御し、その核移行、ならびにマクロファージにおけるHO1発現等のNrf2標的遺伝子の上方制御を誘導したことを示した(図9C〜G)。さらに、WT、Nrf2−/−およびAhR−/−マウス由来のマクロファージにおけるLPS誘導性IL−6産生のダ下方制御を媒介したUroA/UAS03の分析は、LPSがNrf2−/−およびAhR−/−マクロファージにおいて、WTと比較してはるかに高いレベルのIL−6を誘導することを示した(図8H)。UroA/UAS03はまた、マクロファージにおけるAhR依存的様式でNF−κB活性化を低下させた(図9H)。AhR−/−BMDMは、野生型と比較して増加したNF−κB活性化ならびに増加したレベルのIL−6から明らかなように、LPS刺激に対して超応答性である(図8Hおよび図9I)。Nrf2−/−マクロファージにおけるUroA/UAS03によるIL−6レベルの低下にもかかわらず、これらの低下したレベルは、WTマクロファージにおけるLPS誘導性IL−6と比較して依然として高い。比較すると、処理時の倍率低減(図9J〜L)、インビボ(TNBSモデル)とインビトロ BMDM(LPS誘導性IL−6)の両方のNrf2非依存性抗炎症活性を示すWTと同様に、UroA/UAS03は、Nrf2−/−におけるIL−6を低減した。対照的に、UroA/UAS03は、30μMまでのAhR−/−マクロファージ中、ならびにTNBS誘導大腸炎モデル中のAhR−/−マウス中でLPS誘導性IL−6産生を遮断しなかったため、UroA/UAS03がAhR依存的様式を介して抗炎症活性を媒介することが示唆された。50μM用量でのIL−6レベルのAhR−/−BMDMのわずかな減少は、未知のAhR非依存性抗炎症活性のいくつかを示唆し得る。ここで提示する結果は、単一の微生物代謝産物が、AhR−Nrf2シグナル伝達経路を活性化することを介して上皮細胞におけるバリア機能を調節し、AhR依存性経路における抗炎症活性も調節することを強調する。
考察
UroAおよびUAS03は、それらの抗炎症活性に加えてバリア機能を増強することによって、腸全体の健康を増加させる。UroA/UAS03は、第I相(AhR−Cyp1A1)および第II相(Nrf2−抗酸化経路)代謝経路を活性化して、タイトジャンクションタンパク質の発現を増強し、炎症を阻害する。さらに、これらの化合物での処理が予防および治療環境の両方で大腸炎を軽減したことを実証する。
RNA−Seq分析によってこれらの代謝産物の上皮細胞機能を検索する我々のアプローチは、それらの機能と潜在的な機序についていくつかの手がかりを明らかにした。UroA/UAS03は、タイトジャンクションタンパク質(例えば、Cldn4、Ocln、およびZO1)の上方制御を媒介し、上皮単層におけるLPS誘導性漏出からの保護は、これらの代謝産物がバリア機能の調節において明らかに役割を果たしていることを示した。タイトジャンクション部は、副細胞透過性を調節し、腸バリア機能を維持するために、膜貫通タンパク質(例えば、オクルーディン、クローディン、接合接着分子、およびトリセルリン)、ならびに末梢膜タンパク質(例えば、ZO−1およびシングルリン)の両方からなる。タイトジャンクション部の破壊は、バリア機能障害をもたらし、IBDおよび他の障害に関与する。
我々のRNA−seq研究および発現解析は、Cldn4の上方制御に加えて、UroAは、結腸上皮細胞におけるCyp1A1およびHO1の発現も誘導したことを示した。Cyp1A1およびHO1は、第I相および第II相薬物代謝経路の活性化を表すため、これらの結果は、UroA/UAS03機能の媒介におけるAhRおよびNrf−2の潜在的な関与を示唆した。AhRは、細胞特異的遺伝子調節および細胞機能をもたらす異種と内因性リガンドの両方に応答する核転写因子である。AhR活性化は、Cyp1A1等の複数のI相およびII相異種生物化学代謝酵素の誘導に関与する。我々の研究は、UroA/UAS03処理が、毒性を示さずに、AhRの発現および核移行を誘導し、XRE標的遺伝子の転写を増強し、Cyp1A1酵素活性を誘導したことを明らかにした。
UroA/USA03は、AhRを欠く細胞またはAhR−/−結腸外植片、ならびにAhR−/−マウスにおいてそれらの活性を発揮しなかったように見え、UroA/UAS03活性の媒介におけるAhR経路の役割を示唆している。我々の現在の研究は、タイトジャンクションタンパク質およびバリア機能を調節するための上皮細胞におけるこの経路を強調している。
我々のインビトロおよびインビボの両方の研究は、UroA/UAS03が、結腸上皮におけるNrf2ならびにHO1およびNQO1などのその標的遺伝子の発現を誘導したことを示唆している。さらに、我々の結果は、AhR−Cyp1A1−Nrf2経路がUroA/UAS03媒介性のタイトジャンクションタンパク質の上方制御において役割を有することも示した(図2および3)。
大腸炎モデルにおける当社の広範な研究は、UroA/UAS03による治療が、タイトジャンクションタンパク質を増強し、腸管透過性を低下させ、局所および全身性炎症を減少させ、大腸炎の減衰をもたらすことを明らかにした(図4〜8)。単回用量のUroA/UAS03でさえ、TNBS誘発性大腸炎に対する治療有効性を示した。腸バリア機能および大腸炎発生の予防にUroA/UAS03の予防的利点が観察された(図5)。TNBS投与前にUroA/UAS03で前処理したマウスは、腸管透過性を低下させ(図5E)、これは、タイトジャンクションタンパク質の発現の増加と一致する。TNBS投与後にさらなる処理を受けなかったにもかかわらず、これらのマウスは疾患発症から保護され、バリア機能の増強を通じてこれらの化合物の予防効果が示唆された。さらに、7日間毎日補充するUroA/UAS03は、野生型マウスの結腸におけるAhR、Nrf2、およびCldn4の発現を観察可能な毒性を伴わずに誘導し(図3T、図1J〜K、図3O〜S、および図4R〜S)、これらの化合物に対する潜在的なトランスレーショナルアプリケーションを示唆している。さらに、UroA/UAS03による処理はまた、慢性と急性のDSS誘発性大腸炎の両方を緩和し、これらの代謝産物のモデル非依存的有益活性を示す(図6および図5I〜M)。UroA/UAS03は、DSS誘発性大腸炎の発病を抑制したBNF等の低親和性非毒性AhRアゴニストである。
野生型マウスと比較して、Nrf2−/−マウスにおいて炎症媒介体の基礎レベルの増加を観察し、Nrf2−/−BMDMでも同様であった。さらに、IL−6の添加は、野生型BMDMと比較して、Nrf2−/−BMDM中のLPS上方制御し、TNBS誘発性大腸炎モデルでも同様であった。UroA/UAS03は、Nrf2−/−マウスにおけるTNBS誘発バリア機能障害および大腸炎の修復に失敗した(図7)。
UroA/UAS03が媒介するタイトジャンクションタンパク質の上方制御におけるAhRの役割は、AhR siRNA、AhR−/−マウスからの結腸外植片、ならびにAhR−/−マウスにおけるインビボ処理を使用して実証された。加えて、UroA/UAS03は、AhRを欠くマウスにおいてTNBS誘発性大腸炎を緩和するようには見えなかった(図8)。UAS03は、TNBSで処理されるAhR−/−マウスにおいて急速な体重減少に対して何らかの保護作用を有するようである。結腸長の短縮、透過性の増加、炎症性メディエーターの増加などの他のパラメータから保護されていないように見えた。
現在の研究では、AhR−Nrf2がバリア機能障害から保護する役割を強調している。UroA/UAS03が二面性の作用機序によって大腸炎保護活性を発揮する可能性がある。これらの化合物は、LPS/細菌誘発炎症を防止すると共に、AhR−Nrf2経路を通じて抗酸化活性を示すために免疫細胞(例えば、マクロファージ)に作用するように見える。これらの代謝産物は、タイトジャンクションタンパク質を上方制御することによって、腸上皮および腸バリア機能に直接影響を及ぼす。バリア機能の強化は、腸内の細菌漏出を軽減し、全身性炎症の軽減をもたらす。抗炎症およびバリア保護活性に加えて、UroA/UAS03は、ミトコンドリア機能障害を調節することによってIBDを低減し得る。
現在の研究では、腸バリア機能を強化し炎症を軽減することによってIBDを軽減する活性についてUroAおよびUAS03を要約している。既存のIBD治療は、炎症を低減するために抗TNF−α抗体を利用することを含む;ここで、炎症を阻害することに加えて腸バリア機能を増強することが、IBDの制御のためのより良い治療オプションを提供し得ることを示唆する。
実施例セットC
UroAは、ヒト初代単球におけるLPSおよびEtOH誘導TNF−αを低減する。慢性アルコール依存症患者からの末梢血単球は、TNF−α、IL−6、IL−1βおよびIL−12等の増加した自発的炎症性メディエーターを産生する。この状態を模倣するために、健康な末梢血単球を1週間曝露し、UroA/UAS03がLPS誘導性TNF−αを低下させるかどうかを試験した。我々の研究は、EtOHに慢性的に曝露したヒト単球においてUroAがTNF−αを低下させたことを示唆し(図11)、エクスビボヒト初代培養物においてその有益な抗炎症活性を認める。
UroA/UAS03はTJタンパク質を上方制御し、LPS誘発損傷から保護する。Cldn4、ZO−1、Ocln等のTJタンパク質は、腸上皮の完全性を維持し、LPS等の外部損傷から腸を保護する役割を果たす。結腸上皮細胞、HT−29細胞、およびCaco2細胞におけるTJタンパク質調節に対するUroA/UAS03の効果を調査した。インビボとインビトロの両方の一連の実験では、UroA/UAS03による処理がTJタンパク質を上方制御し、腸バリア機能を増強することを実証した。ALDは、破壊されたTJ、透過性の増加、炎症および内毒素血症と関連付けられる。Oclnは、腸上皮において発現するタイトジャンクションタンパク質であり、腸バリア機能の維持に役割を果たす。結腸上皮細胞におけるOclnのLPS(エンドトキシン)枯渇をUroA/UAS03が保護できるかどうかを検討した。図12に示すように、結腸上皮細胞において、LPSによる処理は、Oclnのレベルを低下させ(図12A)、UroA/UAS03は、Oclnの枯渇から保護した(図12B)。次に、UroAがアルコール媒介性上皮細胞損傷に対する保護を示すかどうかを試験した。この目的のために、我々は、経ウェル膜上でCaco−2単層細胞を利用し、経上皮電気抵抗(TEER)およびFITC−デキストラン透過性アッセイを行った。
UroAは、TJタンパク質を上方制御し、EtOH誘導損傷から保護する。次に、UroAがアルコール媒介性上皮細胞損傷に対する保護を示すかどうかを試験した。この目的のために、我々は、経ウェル膜上でCaco−2単層細胞を利用し、経上皮電気抵抗(TEER)およびFITC−デキストラン透過性アッセイを行った。図13に示すように、EtOHは、単層Caco2細胞における損傷を誘導し、時間依存的様式で漏出を誘導した(図13A)。ウロリシン類の中で、UroAは、EtOH誘導性透過性(図13B)から保護し、用量依存性の様式で低減する(図13C)ためのより良好な化合物である。UroAは、EtOHまたはLPSまたはHMGB1誘導上皮透過性から保護する。内毒素血症および腸バリア機能障害は、ALDの病因と関連している。腸管バリア機能障害は、腸管透過性の上昇をもたらし、したがってエンドトキシンの循環レベルを増加させる。LPS(PAMPに代表される)およびHMGB1(DAMPに代表される)等のエンドトキシンは、いくつかの炎症性サイトカイン、ケモカイン、およびROSを誘導し、ALDの病原体を促進する全身性炎症のさらなる増強をもたらす。我々のインビトロ研究(図13D)は、HMGB1またはLPSが、腸管上皮透過性を増加し、UroAによる処理が、EtOHまたはLPSまたはHMGB1誘導透過性から保護することを示唆する。UroAはまた、より高い用量のEtOH(400mM)誘導透過性(図13E)および増強されたTEER値(図13F)においても保護する。UroAによる処理は、ウェスタンブロット(図13G)ならびに染色されたTJタンパク質、ZO−1およびOclnの共焦点画像から証明されるように、EtOH誘導されたタイトジャンクションタンパク質の損傷から保護する(図13H)。
我々は、UAS03が、より高い用量のEtOH(350mM)によって誘発されたCaco2単層細胞におけるバリア機能障害から保護できるかどうかを試験した。図14に示すように、TEERの増加(図14A)およびTJタンパク質Oclnの増加(図14C)で裏付けられる透過性の低下(図14B)から明らかなように、UAS03およびUroAは、EtOH誘発バリア機能障害から保護した。
UroAによる処理は、急性および慢性のアルコール性肝疾患を緩和する。ALDにおけるUroAの治療有効性を調べるために、我々は、Gao Bのグループによって開発された急性マウスモデル(NIAAA)を採用した(BERTOLA et al.,(2013)“Mouse model of chronic and binge ethanol feeding(the NIAAA model)”Nat Protoc.Vol.8,No.3,pp.627−637)。このモデルにおけるUroAの治療有効性を試験した。図15に示すように、UroAは、アルコール誘導(急性モデル、図15A)透過性(FITC−デキストラン漏出、糞便アルブミンのレベル−図15B〜C)、両方の全身炎症(血清IL−6、TNF−α、IL−1β、エンドトキシン−図15D〜G)、循環血清ALT、ASTレベル(図15H〜I)を低減した。UroA処理はまた、肝臓におけるTG蓄積を低減した(図15J)。UroAはまた、腸におけるTJタンパク質(ZO−1)の破壊からも保護する(図16)。
UroAは、慢性低用量アルコール誘発性腸バリア機能障害および炎症から保護する。C57BL/6マウス(1群当たりn=5)をEtOH(3g/kg)で1日2回、5日間経口処理した。EtOH処理の2時間前にUroA(20mg/kg)を経口投与した。血清および肝臓における腸管透過性と炎症パラメータの両方を評価した(図17)。
UAS03による処理は、慢性ALDを改善する:UAS03は炎症および透過性の低減においてより高い有効性を示したため、慢性ALDマウスモデルにおける実験は、UAS03のみを原理証明として行った(図18)。オスC57BL/6N(10週齢)をJackson Laboratoryから購入し、1週間ペア供給液体食事(Lieber DeCarli)で適応させた。適応後、動物にペア供給(n=5匹のマウス/群)およびアルコール食事(n=10匹のマウス/群)を与えた。簡潔に述べると、マウスに、タンパク質として17%のエネルギー、トウモロコシ油として40%、炭水化物として7.5%、およびアルコール(5%v/w、アルコール供給、AF)として35.5%、または等カロリー麦芽糖デキストリン(対供給、PF)のいずれかを含む食事を与えた。マウスが5%アルコールダイエットに進む前に、アルコール濃度を1.6%(3日)から3.6%(3日)に急増させ、最終的に今後4週間にわたって5%にした。UAS03群の動物は、アルコールダイエット開始後2日おきにUAS03を経口(20mg/kg/日)投与した(図18A)。ビヒクル処理として0.25%カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC)を使用した。4週間後にマウスを安楽死させ、結腸長(図18B〜C)、インビボ腸透過性(FITC−デキストランアッセイ)、血清ALT、AST、エンドトキシン、IL−6、およびTNF−α(図18E)を測定した。肝臓組織病理学の分析は、UAS03が肝臓TGレベルおよび脂肪症を裏付ける肝臓脂肪沈着を低減することを示唆した(図18F)。肝臓組織中のIL−6、TNF−α、MPO、およびトリグリセリド(TG)のレベルは、UAS03による処理が、これらのマウスにおける肝炎症およびTGレベルを下方制御したことを示唆する(図18G)。UAS03は、ALDマウスにおけるUAS03処理群における腸透過性の低下を裏付ける腸内のOclnの劣化から保護した(図18H)。
AhRは、ALDモデルにおいてUroA媒介性保護の役割を有する:UroA媒介活性に対するAhR発現の役割に取り組むために、C57BL/6JマウスおよびAhR−/−マウスにおいて急性ALDモデルを行った。この実験では、マウス(WT、AhR−/−マウス(n=4/群))を、0、12、および24時間でEtOH(2.5g/kg)の半量で処理した後、2、14、および26時間で経口処理Veh(0.25%CMC)またはUroA(20mg/kg)で処理した。図19に示されるように、これらのマウスは低用量でEtOHに耐性を示し、UroA処理は、EtOH誘発性腸漏出(糞便アルブミンレベル)、血清エンドトキシン、TNF−α、ALT、ならびに肝臓ALTレベルを救済しないように見えた。UroAは、脂質代謝のAhR非依存的活性を示唆するAhR−/−マウスにおけるTGレベルを下方制御した。
UroA処理は、EtOH誘導結腸上皮接合タンパク質から保護する。結腸上皮細胞(T84細胞)をビヒクル(0.05%DMSO)またはUroA(50μM)で1時間処理し、続いてEtOH(40mM)で6時間処理した。膜および細胞質画分を単離し、タイトジャンクション(TJ)およびアドヘリンジャンクション(AJ)およびデスモソームについて評価した。図20から、UroAがEtOHによって誘導された膜接合タンパク質のサイトゾールへの内部移行から保護したことが明らかである。(すなわち、EtOH処理だけでは、より多くの細胞質タンパク質を有し、EtOH+UroAは、より多くの膜画分を有する)(図20)。
UroAは、CaCo−2細胞におけるTNF−αおよびIFN−γ誘導透過性から保護する:経ウェル膜ウェル上の単層CaCo2細胞を、UroA(50μM)の存在下または非存在下で、TNF−α(10ng/ml)およびIFN−γ(10ng/ml)で48時間処理した。TEER値およびFITC−デキストラン透過性を、SINGH et al(2019)“Enhancement of the gut barrier integrity by a microbial metabolite through the Nrf2 pathway”Nat Commun.,Vol.10,No.1,Article 89(18 pages)によって記載されるように測定した(図21)。
実施例セットD
UAS03(エーテル)は敗血症の死亡率を減衰させる。C57B6/Jマウスに、敗血症用量20mg/kgのリポ多糖を腹腔内に注射した。処理した動物は、20mg/kgの腹腔内注射でウロリシン−AまたはUAS03(エーテル)のいずれかを投与した。未処理の敗血症動物は、50時間以内に100%の死亡率を示した。ウロリシンA処理された動物は20%の生存率を示したが、UAS03(エーテル)処理された動物は90%の長期生存率を示した(図22)。
敗血症動物におけるUAS03(エーテル)の予防および治療効果。動物に20mg/kg用量のLPSを腹腔内に注射して敗血症を誘発した。エーテル+LPS群の動物に、LPS注射の1時間前にUAS03(20mg/kg;腹腔内)を投与した。LPS+エーテル群は、LPS注射の1時間後にUAS03を投与した。敗血症未処理動物は、50時間以内に100%の死亡率を示し、UAS03で前処理した動物は70%の生存率を示し、一方、処理群は100%の生存率を示した(図23)。
UAS03は、Snailトランスジェニックマウスにおける強皮症関連血管透過性を減衰させる。UV分光光度計を使用して背中の皮膚から抽出されたエバンの青色色素の熱量測定。ビヒクル処理したSnail動物は、対照動物よりも3倍多い染料を示した。UAS03で処理した動物は、染料漏出の3倍を超える低減を示す(図24)。これは、UAS03が内皮血管透過性を低減する能力を有することを示す。
Snailトランスジェニックマウスの背部皮膚における線維症関連遺伝子の発現。コラーゲン1のmRNAレベルを、RT−qPCRを使用して背中皮膚において測定した。Snailビヒクルは、対照動物と比較して、ビヒクル処理群のオスとメスの両方において増加した発現を示した。UAS03処理群における発現は、オスとメスの両方において低下した。レベルを、ビヒクルおよび薬物処理動物におけるオスとメスで別々に評価した(図25)。このデータは、UAS03が線維症を低減する能力を有することを示す。
UAS03は、オートファジー誘導を示す。化合物処理後2時間のオートファジー誘導は、細胞内に赤色および緑色の斑点が存在することによって評価される。HeLa細胞を、薬物処理の48時間前にRFP−GFP−LC3プラスミドでトランスフェクトした。薬物処理2時間後、細胞を固定し、画像化する。LC3は、オートファゴソーム上で発現し、緑色の斑点として見られるタンパク質である。オートファゴソームおよびリソソーム融合体がオートリソソームを形成するとき、その内部の酸性pHはGFPタンパク質の分解を引き起こし、赤色斑点のみが見られる(図26)。このデータは、UroAおよびUAS03がオートファジーを誘導する能力を有することを示す。
実施例セットE
我々は、いくつかの化合物を合成し、用量依存性の様式での、それらの抗炎症活性ならびにモノアミンオキシダーゼA(MAO A)およびモノアミンオキシダーゼB(MAO B)の阻害活性を試験した。
抗炎症活性のスクリーニング:マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)をELISAのために96ウェルプレートに播種した。抗炎症特性を評価するために、BMDMを、50ng/mL濃度のE.coli由来リポ多糖(LPS、O55:B5、Sigma)で単独で、または示された濃度の化合物と組み合わせて、4重で6時間刺激した。ELISAを介したサイトカイン産生のために、上清を収集し、4℃で10分間12,000rpmで遠心分離して任意の細胞をペレットダウンし、サイトカインを、製造業者の使用説明書に従ってIL−6およびTNF−α特異的ELISAキット(Biolegend)を使用して定量化した。LPS誘発性IL−6またはTNF−αは100%とみなした。
抗炎症活性(図27〜30):炎症は、炎症性腸疾患、アルコール性肝疾患、様々な種類の癌、関節炎、心臓血管疾患、神経障害、敗血症、腎臓、肺関連および加齢関連疾患を含むが、これらに限定されないいくつかの疾患の根本的な原因および促進である。ここでは、これらの類似体の抗炎症活性をスクリーニングした。このシリーズのいくつかの化合物を同定し、マウス骨髄由来マクロファージにおいて抗炎症活性を示し、LPS誘導性IL−6およびTNF−αを遮断した。提示を容易にするために、LPS誘導性IL−6またはTNF−αを100%とみなした。UroA(親化合物)と比較して、UAS03、PKL3、PKL4、およびPKL17を有効な抗炎症化合物であることを見出した。
要約すると、いくつかの抗炎症性化合物を合成し、炎症を伴う多数の障害の潜在的な治療薬として特定した。
化合物のモノアミンオキシダーゼA(MAO A)およびモノアミンオキシダーゼB(MAO B)阻害活性アッセイ:簡潔に述べると、5μgのMAO−AおよびMAO−Bを、それぞれ160μMおよび16μMのMAO基質と共にインキュベートした。酵素アッセイを、96ウェルホワイトプレート中のカプセル化合物の存在下で行った。対照反応は、同じ割合の溶媒を有する等量のMAO緩衝液を含む。反応プレートを37℃で60分間インキュベートした。インキュベーション期間後、反応をルシフェリン検出試薬を添加して停止させた。デプレニルをそれぞれ、MAO−AおよびMAO−Bの陽性対照として使用した。生成された発光は、マルチモードマイクロプレートリーダーで測定され、それはMAO活性に直接比例する。
アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療には、MAO AおよびMAO Bの阻害剤が検討された。我々は、純粋なMAO AおよびMAO B酵素を利用していくつかの化合物を試験した。我々は、複数の化合物がMAO AおよびMAO B酵素の活性を阻害していることを発見した。図31は、100μM用量でのこれらの化合物の一次スクリーニングを示す。
次に、潜在的な候補化合物(PKL3、4、5、12、13、14、15、16、ならびにUroA、B、C)を選択し、MAO AおよびMAO B酵素に対する用量依存性(0.1、1、10μM)阻害活性を行った(図32)。
図33は、抗炎症活性のスクリーニングを示す。マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)を、化合物を含んでまたは含まずに、LPS(50ng/ml)で6時間刺激した。上清中のIL−6およびTNF−αレベルを、標準的なELISA方法を使用して測定した。結果は、各濃度について3重の3つの独立した実験の代表である。
図34は様々な化合物の存在下でのMAO酵素の活性を示す。図35は、MAO−AおよびMAO−B活性に対して試験した化合物、ならびに同定されたIC50およびKi値を示す。
化合物は、内皮バリア機能を増強し、内皮バリア機能障害から保護する:ヒトの研究は、軽いアルコール摂取でさえ内皮バリア機能を損なう可能性があることを示す。アルコールの急性中毒は、微小血管系の漏出を誘発する可能性があると共に、内皮への直接曝露は、内皮の完全性の破壊をもたらす。循環エンドトキシンレベル(例えば、LPS)ならびに炎症性メディエーター(例えば、IL−6およびTNF−α)のレベルの増加は、内皮バリアを損傷して血管漏出をもたらし、ALDにおける全身および組織の炎症を増強することが知られている。さらに、内皮透過性の増加は、免疫細胞の肝臓への血管外漏出を増強し、炎症の増加をもたらす。内皮細胞透過性に対するUroA/UAS03の効果を調べるために、インビボエバンスブルー透過性アッセイを利用した。簡潔に述べると、C57BL/6マウス(n=4/群)にLPS(100μg)を腹腔内投与し、その後、1時間および18時間後にUAS03またはUroA(20mg/kg)で処理した。エバンスブルー(i.v.)をマウスに投与し(LPS処理の24時間後)、30分後にマウスを安楽死させ、ホルムアミドを使用して肺および肝臓組織からエバンスブルーを抽出した。エバンスブルーのレベルを、620nmでODによって決定した。UroAまたはUAS03で処理したマウスは、エバンスブルーの組織蓄積を減少させ、LPS誘発性漏出からの保護を示す(図36A)。UroA/UAS03処理はまた、血清および気管支肺胞洗浄液(BAL)中のLPS誘発性TNF−αレベルを低下させた(図36B)。内皮バリア機能に対するUroAまたはUAS03の直接的影響を評価するために、インビボMilesアッセイを使用して血管透過性を試験した。血管拡張剤として血管内皮増殖因子(VEGF)を使用した。このアッセイでは、C57BL/6マウス(1群当たりn=3)にビヒクル、またはUroAもしくはUAS03(20mg/kg、経口摂取)を投与した。3時間後、エバンスブルー(100μLの1%溶液)をi.v.投与し、続いて、VEGF(2.5ng/マウス)またはPBS(対照)の真皮内投与を行った。30分後、マウスを安楽死させ、注入部位を取り囲む皮膚組織中のエバンスブルーのレベルを抽出し、前述のように推定した(図36C)。結果は、UroA/UAS03による処理が、VEGFによって誘導される内皮バリア漏出から保護さした(エバンスブルーレベルの低下)が、増加したエバンスブルーから明らかなようにビヒクル処理によって血管漏出を誘導したことを示す(図36C)。UroA/UAS03が媒介する内皮バリア機能の分子機構を理解するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)におけるこれらの化合物の効果を試験した。エンドトキシンまたは炎症性メディエーターは、バリアギャップおよび透過性の増加をもたらす細胞−細胞および細胞−マトリックス接着の減少に関与する。アドヘリンジャンクション(AJ)タンパク質であるVE−カドヘリン(CDH5)は、隣接する細胞とのホモタイプ相互作用を通じて内皮接合部の完全性を維持することができる。図36D〜Eに示すように、UroAまたはUAS03は、CDH5の発現を増加させ、これらの代謝産物がAJの上方制御を介して内皮バリア完全性を潜在的に増強することを示唆する。さらに、インビトロ透過性アッセイ(アルブミン結合エバンスブルー)の結果もまた、UroA/UAS03がHUVECにおけるLPS(100ng/ml)誘発性バリア透過性を低減したことを示唆した(図36F)。
化合物は、化学療法抵抗性がんを化学療法感受性にする。5−フルオロウラシル(5FU−5−フルオロ−1H,3H−ピリミジン−2,4−ジオン)の化学療法有効性に対するUroAおよびUAS03の効果を調査した。我々のデータは、5FUとUroAまたはUAS03との組み合わせが、5FU耐性(5FUR)結腸癌細胞株の細胞生存率を低下させ、組み合わせ指標(CI)が1未満であることを示唆し、それらの相乗効果を示唆した。UAS03は、5FU処理の化学感作においてより効果的(32倍高い)である。UroAによる処理は、P−糖タンパク質(P−gp)、乳癌耐性タンパク質(BCRP)の薬物流出活性を減少させ、結腸癌細胞株におけるE−カドヘリンの発現を増強し、化学感作の潜在的な作用機構を提供する。UAS03は強力な化学感作アジュバントである:がん治療における1つの問題は、薬物治療に対する化学耐性である。結腸癌細胞を5FU処理に化学感作する際のUroAおよび他の化合物を調査した。代表的な結腸癌細胞株(SW480)の増殖アッセイの結果を図37に示す。UroAまたはUAS03による処理は、細胞増殖に対する最小限の効果を示す。5FUでの処理は、細胞生存率を、25μMおよび3.12μMでそれぞれ63%、90%に低下させた。5FU処理にUroAまたはUAS03を添加すると、5FU処理単独と比較するとき、細胞生存率を低下させた(図37A)(阻害が増加した、図37B)。5FU(3.12μM)を有するUroAは、細胞生存率を90%から69%に低下させたが、UAS03は40%に低下させ、これは、5FUの3.12μMであってさえ細胞増殖の阻害の約6倍の増加を表す。5FUについて100μMを試験した最高濃度は、最大60%のがん細胞増殖のみを阻害することができた。一方、UAS03と併用すると、3.12μMの5FU濃度であっても60%まで阻害し、プラトーに達し、化合物の高効力(同様の効果に到達するための5FU薬物濃度よりも32倍以上低い)を示した。アイソボログラム)図37C)から誘導されるChou−Talalay併用指標(CI)値(<1は相乗効果を示す)は<0.5であり、抗増殖活性におけるそれらの相乗効果を示唆している。UroAはまた、クロノジェニックアッセイから明らかなように、結腸癌細胞コロニー形成を減少させた(図37D)。他の結腸癌細胞株(HT−29、HCT−116、Col205)においても、これらの化合物で同様の傾向を観察した(データ図示せず)。UroAおよびUAS03は、親細胞株における5FUおよび5FU耐性(5FUR)細胞株と組み合わせて、CI値<1で5FUR細胞における5FU処理に対する感受性を増強し、それらの相乗効果を示唆した(データ図示せず)。標準的な創傷治癒アッセイを利用して、UroAと5FUとの併用療法が細胞の移動および細胞増殖をブロックするかどうかを調べた。図38に示すように、5FUと組み合わせたUroAは、個々の化合物と比較して、結腸癌細胞の細胞増殖およびスクラッチへの移行を阻害した(右隅画像)。
UroA/UAS03は薬物トランスポーターを減少させる:がん細胞が化学耐性表現型を獲得する機序の1つは、ATP結合カセット(ABC)薬物流出トランスポータータンパク質、BCRPおよびP−ジコタンパク質(P−gp)の誘導によるものである。したがって、その活性を遮断する、および/またはBCRPの発現を下方制御することにより、P−gpは、効果を逆転させ、がん細胞を感作させることができる。UroAがBCRP活性を低下させたことを実証した(データ図示せず)。Rh123流出アッセイ(図39)、UroA(50μM)は、Rh123の流出を遮断した(細胞内にRh123を保持した)。
UroA/UAS03処理は、5FU耐性(5FU R)結腸癌細胞における上皮間葉転換(EMT)シグネチャを低減する:5FU感受性(親)および5FU耐性(5FUR)HCT116結腸癌細胞株におけるEMTマーカーを調べた。図40に示すように、5FUR細胞は、親細胞株と比較して、ZO1、E−カドヘリンの発現の減少、ならびにβ−カテニンおよびSnailの発現の増加を示した。これらの分子の相互発現は、EMTシグネチャの特徴である。次に、UroA/UAS03による処理が5FUR細胞におけるこれらのパターンを逆転させることができるかどうかを調べた。図41から、UroA/UAS03による処理は、5FUの存在下であってもZO−1、E−カドヘリンを上方制御し、スネイルおよびβ−カテニンを下方制御したことが明らかである。全体として、これらの結果は、強化された抗増殖活性に加えて、UroA/UAS03が5FUR結腸癌細胞におけるEMTシグネチャーパターンを逆転させることができることを示唆する。癌細胞が化学耐性表現型を獲得する機構の1つは、多剤耐性関連タンパク質2(MRP2)、ATP結合カセット(ABC)薬物流出トランスポータータンパク質、BCRPおよびP−ジコタンパク質(P−gp)の誘導によるものである。
5FU−R結腸癌細胞は、より高いレベルのMRP2を発現し(図42)、UroA/UAS03による処理は、これらのトランスポーターの発現を低下させる(図43)。これは、細胞内薬物濃度の増加をもたらし、5FUおよびUroA/UAS03による処理の際の細胞死の増加/薬物耐性癌細胞の増殖の減少をもたらし得る。
これらの化合物はまた、化学療法薬に対する化学抵抗性である他のタイプのがんのために、化学療法薬と組み合わせて使用され得る。加えて、これらの化合物を使用することは、より高い用量に起因する大きな副作用を伴わず同様の効果を得るために薬物の用量を低下させるのに潜在的に役立つ。
実施例セットF
スキームF1
Figure 2021523942
1.(3−メトキシフェニル)臭化マグネシウム(2)の合成、
Figure 2021523942
触媒量のI(ヨウ素)の撹拌溶液に、窒素下、水冷冷却コンデンサ備える100mlの2口RBフラスコ中の100mlの無水THF中のマグネシウム2g(83.36mmol)を添加した。これに1−ブロモ−3−メトキシベンゼン15.50g(83.36mmol)を10分間にわたって滴下した。ブロモ化合物を完全に添加した後、それを室温で10分間撹拌した。しばらくすると、溶媒は還流を開始し、これは、グリニャール試薬の生成を示す。氷を使用して冷却するだけでより多くの熱が放出すると、溶媒はしばらく還流し、ゆっくりと停止する。最後に、RBフラスコ内の灰色のグリニャール試薬を観察することができる。これにより、次のステップに直接使用できるグリニャールが生成された。
2.1,2−ビス(3−メトキシフェニル)エタン−1,2−ジオン(3)の合成、
Figure 2021523942
50mlの無水THF中の予め調製した(3−メトキシフェニル)臭化マグネシウムの撹拌溶液に、臭化銅10.24g(71.42mmol)、臭化リチウム6.2g(71.42mmol)を添加し、ドライアイスアセトン混合物を使用して反応混合物を−78℃で冷却した。温度が−78℃に達したら、塩化オキサリル4.53g(35.71mmol)をゆっくりと添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。反応の完了をTLCによってモニターし、反応が完了したら、反応を0℃に冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチした。THF溶媒を減圧下で蒸発させ、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、有機層をブライン、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム下で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、5gの1,2−ビス(3−メトキシフェニル)エタン−1,2−ジオン(26%)を得た。
Mass;m/z:(M+H)=271.2
1 H−NMR(DMSO−d6,600 MHz):δ 7.60−7.52(2 H,m),7.45−7.41(2 H,m),7.39−7.37(4 H,m),3.84(6 H,s);13 C−NMR(DMSO−d6,150 MHz):194.89,160.27,134.01,131.22,123.33,122.40,113.13,56.00。
3.2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオン(5)の合成;
Figure 2021523942
200mlの乾燥ジクロロメタン中の1,2−ビス(3−メトキシフェニル)エタン−1,2−ジオン5g(18.51mmol)の撹拌溶液に。反応混合物を0℃に冷却し、これに塩化Ti(IV)3.51g(18.51mmol)、塩化モリブデン(V)5.05g(18.51mmol)を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌する。反応の完了をTLCによってモニターした。反応混合物を0℃まで冷却し、メタノールでゆっくりクエンチし、反応混合物をセライトに通し、減圧下で蒸発させて粗製2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオンを得た。粗生成物をヘキサンおよび酢酸エチルを溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な3gの2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオン(61%)を得た。
Mass;m/z:(M+H)=269.2
1 H−NMR(DMSO−d6,600 MHz):δ 8.09−8.08(2 H,m),7.42(2 H,s),7.31−7.29(2 H,m),3.86(6 H,s);13 C−NMR(DMSO−d6,150 MHz):179.41,159.61,131.92,129.34,126.32,122.80,112.67,56.04。
4.2,7−ジヒドロキシフェナントレン−9,10−ジオン(6)の合成:
Figure 2021523942
100mlのクロロベンゼン中の2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオン2g(7.46mmol)の撹拌溶液に、無水塩化アルミニウム5.97g(44.77mmol)を添加した。反応混合物を135℃で還流した。反応混合物の完了をTLCによってモニターした。反応混合物を砕いた氷に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、有機層をブライン、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて、粗製の2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオンを得た。粗生成物をヘキサンおよび酢酸エチルを溶出液として使用してカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な1.2gの2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオン(67%)を得た。
Mass;m/z:(M−H)=239.2
1 H−NMR(DMSO−d6,600 MHz):δ 10.05(2 H,s),7.92−7.90(2 H,m),7.30(2 H,s),7.11−7.09(2 H,m);13 C−NMR(DMSO−d6,150 MHz):179.93,157.73,131.64,128.28,125.98,123.62,114.97。
5.(9E,10E)−9,10−ビス((2−ヒドロキシエチル)イミノ)−9,10−ジヒドロフェナントレン−2,7−ジオール(7)の合成。
Figure 2021523942
50mlのエタノール中の2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオン0.5g(2.08mmol)の撹拌溶液に、触媒量の酢酸、エタノールアミン0.317g、(5.20mmol)を添加した。反応混合物を110℃で一晩還流させた。反応の完了をTLCによってモニターした。反応混合物を減圧下で蒸発させ、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、酢酸エチル層をブライン、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、粗製(9E,10E)−9,10−ビス((2−ヒドロキシエチル)イミノ)−9,10−ジヒドロフェナントレン−2,7−ジオールを得た。粗生成物を、溶出液としてクロロホルムおよびメタノールを使用してカラムクロマトグラフィーで精製して、純粋な0.25gの(9E,10E)−9,10−ビス((2−ヒドロキシエチル)イミノ)−9,10−ジヒドロフェナントレン−2,7−ジオール(36.2%)を得た。
Mass;m/z:(M−H)=325.2
1 H−NMR(DMSO−d6,600 MHz):9.99(2 H,s),7.90−7.88(2 H,m),7.40(2 H,s),7.09−7.06(2 H,m),5.58−5.57(2 H,m),4.27−4.25(4 H,m),3.48−3.46(4 H,m);13 C−NMR(DMSO−d6,150 MHz):157.72,155.57,132.98,127.00,126.95,119.14,115.03,65.02,55.36。
6.(E)−2,7−ジヒドロキシ−10−((2−ヒドロキシエチル)イミノ)フェナントレン−9(10H)−オンの合成
Figure 2021523942
50mlのエタノール中の2,7−ジメトキシフェナントレン−9,10−ジオン0.5g(2.08mmol)の撹拌溶液に、触媒量の酢酸、エタノールアミン0.152g(2.5mmol)を添加した。反応混合物を110℃で一晩還流させた。反応の完了をTLCによってモニターした。反応混合物を減圧下で蒸発させ、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、酢酸エチル層をブライン、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、粗製(E)−2,7−ジヒドロキシ−10−((2−ヒドロキシエチル)イミノ)フェナントレン−9(10H)−オンを得た。粗生成物を、溶出液としてクロロホルムおよびメタノールを使用してカラムクロマトグラフィーで精製して、純粋な0.15gの(E)−2,7−ジヒドロキシ−10−((2−ヒドロキシエチル)イミノ)フェナントレン−9(10H)−オン(26%)を得た。
Mass;m/z:(M+H)=284.2
1 H−NMR(DMSO−d6,600 MHz):9.51(1 H,s),9.45(1 H,s),8.39−8.28(2 H,m),7.20(1 H,s),7.11(1 H,s),6.99−6.97(1 H,m),6.86−6.84(1 H,s),5.58−5.57(2 H,m),4.27−4.25(4 H,m),3.48−3.46(4 H,m);13 C−NMR(DMSO−d6,150 MHz):157.72,155.57,132.98,127.00,126.95,119.14,115.03,65.02,55.36。
7.2,2’−((1E,1’E)−(2,7−ジヒドロキシフェナントレン−9,10−ジイリデン)ビス(アザニルリデン))ビス(プロパン−1,3−ジオール)の合成
Figure 2021523942
1 H−NMR(DMSO−d6,800 MHz):9.50(1 H,s),9.44(1 H,s),8.34−8.29(2 H,m),7.78(1 H,m),7.23(1 H,s),6.99(1 H,s),6.85−6.84(1 H,s),4.60−4.58(8 H,m),3.76−3.75(2 H,m)。
8.(E)−10−((1,3−ジヒドロキシプロパン−2−イル)イミノ)−2,7−ジヒドロキシフェナントレン−9(10H)−オンの合成
Figure 2021523942
1 H−NMR(DMSO−d6,800 MHz):9.50(1 H,s),9.44(1 H,s),8.34−8.29(2 H,m),7.78(1 H,m),7.23(1 H,s),6.99(1 H,s),6.85−6.84(1 H,s),4.60−4.58(8 H,m),3.76−3.75(2 H,m);13 C−NMR(DMSO−d6,200 MHz):157.72,155.57,132.98,127.00,126.95,119.14,115.03,65.02,55.36。
9.2,2’−((1E)−(2,7−ジヒドロキシフェナントレン−9,10−ジイリデン)ビス(アザニルリデン))ビス(2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール)の合成
Figure 2021523942
Mass;m/z:(M−H)=445.2
1 H−NMR(DMSO−d6,800 MHz):9.50(1 H,s),9.44(1 H,s),8.37−8.36(2 H,m),7.98(2 H,s),6.99−6.86(2 H,s),4.73(6 H,m),3.52−3.51(12 H,m);13 C−NMR(DMSO−d6,200 MHz):157.72,155.57,137.25,132.98,128.00,126.15,118.14,116.03,64.02,59.36。
10.(E)−10−((1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル)イミノ)−2,7−ジヒドロキシフェナントレン−9(10H)−オンの合成
Figure 2021523942
Mass;m/z:(M−H)=342.2
1 H−NMR(DMSO−d6,800 MHz):9.77(1 H,s),9.71(1 H,s),7.94−7.91(2 H,m),7.65(1 H,s),7.11(1 H,s),7.02−7.01(1 H,m),6.91−6.89(1 H,m),5.09−5.07(3 H,m),3.82−3.81(6 H,m);13 C−NMR(DMSO−d6,200 MHz):167.33,157.01,155.42,133.52,132.76,129.80,127.04,122.20,121.06,118.16,115.54,109.44,65.10,59.34。
11.9,10−ジイミノ−9,10−ジヒドロフェナントレン−2,7−ジオールの合成
Figure 2021523942
Mass;m/z:(M+H)=239.2
1 H−NMR(DMSO−d6、600 MHz):9.96(2 H、s)、8.99(2 H、s)、8.10−8.08(2 H、m)、7.95(2 H、s)、7.57(2 H、s)、7.09−7.07(2 H、m);13 C−NMR(DMSO−d6、150 MHz):162.77、158.42、157.19、126.99、126.77、125.91、120.77、112.17。
12.ジベンゾ[f,h]キノキサリン−6,11−ジオールの合成
Figure 2021523942
Mass;m/z:(M−H)=261.2
1 H−NMR(DMSO−d6、600 MHz):9.95(2 H、s)、8.99(2 H、s)、8.52−8.50(2 H、m)、8.42−8.41(2 H、s)、7.28−7.26(2 H、m);13 C−NMR(DMSO−d6、150 MHz):156.74、144.41、140.96、129.94、124.76、124.50。
13.2−ブロモ−6H−ベンゾ[c]クロメン−3,8−ジオールの合成
Figure 2021523942
1 H−NMR(DMSO−d6,600 MHz):10.27(1 H,s),9.58(1 H,s),7.79(1 H,s),7.55−7.53(1 H,m),6.75−6.73(1 H,m),6.62−6.61(1 H,m),6.53(1 H,s),4.99(2 H,s);13 C−NMR(DMSO−d6,150 MHz):158.74,153.41,126.56,123.32,115.86,111.88,105.11,68.25。
実施例セットG
スキームG1
Figure 2021523942
1.1−(3−メトキシフェニル)−2−フェニルエタン−1,2−ジオンの合成
Figure 2021523942
Mass;m/z:(M+H)=241.2
1 H−NMR(DMSO−d6、800 MHz):δ 7.93−7.91(2 H、m)、7.80−7.79(1 H、m)、7.64−7.52(1 H、m)、7.46(1 H、s)、7.43−7.39(2 H、m)、3.85(6 H、s)、13 C−NMR(DMSO−d6、200 MHz):195.10、160.27、136.01、134.01、132.69、131.23、130.06、129.97、123.36、122.42、113.10、56.00。
3.2−メトキシフェナントレン−9,10−ジオンの合成
Figure 2021523942
Mass;m/z:(M+H)=239.2
1 H−NMR(DMSO−d6,600 MHz):δ 8.12−8.08(1 H,m),7.83−7.81(2 H,m),7.61−7.57(2 H,m),7.36−7.34(2 H,m),3.85(3 H,s);13 C−NMR(DMSO−d6,150 MHz):179.41,159.61,131.92,129.34,126.32,122.80,112.67,56.04。
本開示で使用される見出しは、見出しに関連する全ての開示が、その見出しで始まるセクション内に見出されることを示唆することを意味するものではない。任意の対象についての開示は、明細書全体を通して見出すことができる。
「好ましくは」、「一般的には」、および「典型的には」のような用語は、本明細書では、特許請求の範囲を限定するために、または特定の特徴が特許請求の範囲の構造もしくは機能にとって重要であることを暗示するために使用されないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態において利用され得るか否かの代替または追加の特徴を強調することのみを意図する。
別段の指定がない限り、本開示で使用されるとき、「a」または「an」は、1つまたは2つ以上を意味する。特許請求の範囲で使用される場合、「a」または「an」という単語と「含むこと」という単語と併せて使用されるとき、特に指定されない限り、1つまたは2つ以上を意味する。本開示または特許請求の範囲で使用されるとき、「別の」は、別段の指定がない限り、少なくとも第2またはそれ以上を意味する。本開示で使用されるとき、「など」、「例えば」、および「例えば」という語句は、用語(「など」、「例えば」、または「例えば」)の後のリストがいくつかの例を提供するが、リストが必ずしも完全に包括的なリストではないという点で、「例えば、非限定的に」を意味する。「含むこと(comprising)」という用語は、「含むこと(comprising)」という用語の後の項目が、追加の列挙されていない要素またはステップを含んでもよく、すなわち、「含むこと(comprising)」は、追加の列挙されていないステップまたは要素を除外しないことを意味する。
別途示されない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などの特性等を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載される数値は、本明細書で開示される主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、値、または質量、重量、時間、体積、濃度、またはパーセンテージの量を指す場合、いくつかの実施形態では±20%、いくつかの実施形態では±10%、いくつかの実施形態では±5%、いくつかの実施形態では±1%、いくつかの実施形態では±0.5%、およびいくつかの実施形態では±0.1%の、指定された量からの変動を包含することを意味し、これは、そのような変動が、開示される方法を実施するのに適切であるためである。
1つ以上の実施形態の詳細な説明は、本明細書で提供されている。しかしながら、本発明が、様々な形態で具現化され得ることを理解されたい。したがって、本明細書に開示された特定の詳細(好ましいまたは有利と指定されたとしても)は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求の範囲の例示的な根拠として、および当業者に本発明を任意の適切な方法で用いるように教示するための代表的な根拠として使用されるべきである。実際、本明細書説明されるものに加えて、本発明の様々な改変が、上述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。

Claims (104)

  1. 以下の式:
    Figure 2021523942
    それらの塩、光学異性体、幾何異性体、異性体の塩、および誘導体から選択され、
    式中、
    とXとの間の結合が、単結合または二重結合であり、
    とXとの間の結合が、単結合または二重結合であり、
    、X、X、およびXが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、CH、O、S、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、N、NH、C−ハロゲン、C(H)(ハロゲン)、C−(ハロゲン)、C−シクロアルキル、C−ヘテロシクリル、C−アリール、C−ヘテロアリール、C(H)(シクロアルキル)、C(H)(ヘテロシクリル)、C(H)(アリール)、またはC(H)(ヘテロアリール)から選択され得、そのCH、CH、C−NH、C−N=CH、C(H)(NH)、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=N−S(O)H、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、NH、C(H)(ハロゲン)、C−シクロアルキル、C−ヘテロシクリル、C−アリール、C−ヘテロアリール、C(H)(シクロアルキル)、C(H)(ヘテロシクリル)、C(H)(アリール)、またはC(H)(ヘテロアリール)が、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換され、
    およびXが、任意選択でさらに環化されて、5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールを形成し、その5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換され、
    およびXが、任意選択でさらに環化されて、5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールを形成し、その5もしくは6員のシクロアルキル、5もしくは6員のヘテロシクリル、5もしくは6員のアリール、または5もしくは6員のヘテロアリールが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換され、
    、R、R、R、およびRが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−Cアルコキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルから選択され、そのH、OH、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−Cアルコキシ、メチル、エチル、シクロアルキル、またはヘテロシクリルが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換され、
    、X、X、およびXが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CHまたはNから選択され、そのCHが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される、化合物。
  2. 、X、X、およびXが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、O、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=N−アダマンタン、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択され得る、請求項1に記載の化合物。
  3. およびXが同じであるか、XおよびXが同じであるか、XおよびXが同じであるか、XおよびXが同じであるか、またはこれらの組み合わせである、請求項1または2に記載の化合物。
  4. 、X、X、およびXが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CHまたはNから選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の化合物。
  5. 、R、R、R、およびRが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、メトキシ、エトキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチル、シクロアルキル、ビシクロアルキル、ヘテロシクリル、またはイミダゾリルから選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の化合物。
  6. 式(IA)
    Figure 2021523942
    それらの塩、光学異性体、幾何異性体、異性体の塩、および誘導体から選択される、請求項1〜5のいずれかに記載の化合物。
  7. およびXが同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、O、C(H)(NH)、C=O、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択され、そのCH、C(H)(NH)、C=N−NH、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)が、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される、請求項1〜6のいずれかに記載の化合物。
  8. およびXが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、CH、O、C=O、C=NH、C=N−シクロアルキル、C=NC(EtOH)、C=NCH(EtOH)、C=NEtOH、C(CH)(OH)、またはC(H)(シクロアルキル)から選択される、請求項1〜7のいずれかに記載の化合物。
  9. およびRが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−Cアルコキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、過フッ素化エチルから選択され、そのH、OH、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、スルホ(−SOH)、C−Cアルキル、C−Cアルケニル、C−Cアルキニル、C−Cアルコキシ、メチル、またはエチルが、任意選択で、ハロゲン、ヒドロキシ(−OH)、メタノイル(−COH)、−COCH、カルボキシ(−COH)、エチニル(−CCH)、シアノ(−CN)、スルホ(−SOH)、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルのうちの1つ以上で置換される、請求項1〜8のいずれかに記載の化合物。
  10. およびRが、同じであるか、または異なるものであり、それぞれが独立して、H、OH、ハロゲン、メタノイル(−COH)、−OCF、−COCH、カルボニル、カルボキシ(−COH)、シアノ(−CN)、アミン、−NO、メトキシ、エトキシ、メチル、エチル、過フッ素化メチル、または過フッ素化エチルから選択される、請求項1〜9のいずれかに記載の化合物。
  11. 前記化合物が、(a)I−1、I−3、I−5、I−7、I−20、I−26、I−27、I−28、I−33、I−53、I−54、I−55、I−56、I−57、I−59、I−94、I−98、II−99、II−100、II−101、II−102、II−103、II−118、II−119、II−120、II−121、およびII−122ではないか、(b)表1から選択される化合物であるか、または(c)その両方である、請求項1〜10のいずれかに記載の化合物。
  12. ウロリシン誘導体であって、ウロリシン環状エステルの化学基置換を有し、それにより、ウロリシンAと比較して前記誘導体の効力が向上するか、あるいはウロリシンAと比較して酸性pHでのならびに/またはエステラーゼおよび/もしくはプロテアーゼの存在下での前記誘導体の安定性が向上する、ウロリシン誘導体。
  13. 前記ウロリシン環状エステルが、環状エーテルと置き換えられる、請求項12に記載のウロリシン誘導体。
  14. 前記ウロリシン環状エーテルが、1つ以上の置換基を含む、請求項13に記載のウロリシン誘導体。
  15. 前記環状エーテル置換基が、独立して、ハロ、アミン、置換アミン、ヒドロキシル、ならびに独立して、O、N、またはSから選択される1つまたは2つのヘテロ原子を有するC5またはC6複素環から選択される、請求項14に記載のウロリシン誘導体。
  16. 前記ウロリシン環状エステルが、隣接カルボニル基を有する炭素環と置き換えられる、請求項12に記載のウロリシン誘導体。
  17. 前記ウロリシン環状エステルが、任意選択で芳香族であり、任意選択で置換された環状アルケニル基と置き換えられる、請求項12に記載のウロリシン誘導体。
  18. 前記環状アルケニル基が、1つ以上の置換基を有する、請求項17に記載のウロリシン誘導体。
  19. 前記環状アルケニル基置換基が、独立して、ケトン、任意選択で置換されたイミン、任意選択で置換されたアミン、ハロ、およびヒドロキシルから選択される、請求項18に記載のウロリシン誘導体。
  20. 前記ウロリシン環状エステルが、環状アミドと置き換えられる、請求項12に記載のウロリシン誘導体。
  21. 前記ウロリシン環状エステルが、非環状架橋と置き換えられる、請求項12に記載のウロリシン誘導体。
  22. 前記ウロリシン芳香族基は、1つ以上の置換基を有する、請求項12〜21のいずれか一項に記載のウロリシン誘導体。
  23. 前記芳香族基が、任意選択で置換されたフェニル基である、請求項22に記載のウロリシン誘導体。
  24. 前記1つ以上の芳香族置換基が、独立して、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミン、5員または6員の炭素環式または複素環式環、ニトロ、ニトリル、アルキル、アルキルエーテル、およびハロアルキルから選択される、請求項22または23に記載のウロリシン誘導体。
  25. 1つ以上のウロリシン芳香環が、複素環式である、請求項12〜24のいずれか一項に記載のウロリシン誘導体。
  26. 前記複素環式環の前記ヘテロ原子が、独立して、N、O、およびSから選択される、請求項25に記載のウロリシン誘導体。
  27. 各芳香族環の置換基が、一緒に第2の架橋環を形成する、請求項12〜26のいずれか一項に記載のウロリシン誘導体。
  28. 前記第2の架橋環は、第1の架橋環と構造が同じである、請求項27に記載のウロリシン誘導体。
  29. 前記第2の架橋環は、前記第1の架橋環と構造が異なる、請求項27に記載のウロリシン誘導体。
  30. 請求項1〜29のいずれかに記載の化合物を含む、組成物。
  31. 前記化合物の量が、約0.0001%(総組成物の重量%)〜約99%である、請求項30に記載の組成物。
  32. 製剤成分、アジュバント、または担体をさらに含む、請求項30または請求項31に記載の組成物。
  33. 5−フロロウラシルをさらに含む、請求項30〜32のいずれかに記載の組成物。
  34. 請求項1〜29のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物。
  35. 前記化合物の量が、約0.0001%(総組成物の重量%)〜約50%である、請求項34に記載の医薬組成物。
  36. 製剤成分、アジュバント、または担体をさらに含む、請求項34または請求項35に記載の医薬組成物。
  37. 5−フロロウラシルをさらに含む、請求項34〜36のいずれかに記載の医薬組成物。
  38. 請求項1〜29のいずれかに記載の化合物を含む1つ以上の組成物の1回以上の投与を含む、化合物を動物に提供する方法であって、前記組成物は、投与が2回以上である場合、同じであっても異なっていてもよい、方法。
  39. 前記1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つが、製剤成分をさらに含む、請求項38に記載の方法。
  40. 前記1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つが、請求項30〜33のいずれかに記載の組成物または請求項34〜37のいずれかに記載の医薬組成物を含む、請求項38または請求項39に記載の方法。
  41. 前記1回以上の投与のうちの少なくとも1回が、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、皮膚内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与を含む、請求項38〜40のいずれかに記載の方法。
  42. 投与が2回以上である場合、少なくとも1回の投与に使用される少なくとも1つの組成物が、少なくとも1回の他の投与の組成物とは異なる、請求項38〜41のいずれかに記載の方法。
  43. 前記1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つの前記化合物が、動物体重1kg当たり約0.01mg〜動物体重1kg当たり約50mgの量で前記動物に投与される、請求項38〜42のいずれかに記載の方法。
  44. 前記動物が、ヒト、げっ歯類、または霊長類である、請求項38〜43のいずれかに記載の方法。
  45. 請求項1〜29のいずれかに記載の化合物を含む1つ以上の組成物の1回以上の投与を含む、疾患について動物を治療する方法であって、前記組成物は、投与が2回以上である場合、同じであっても異なっていてもよい、方法。
  46. 前記1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つが、製剤成分をさらに含む、請求項45に記載の方法。
  47. 前記1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つが、請求項30〜33のいずれかに記載の組成物または請求項34〜37のいずれかに記載の医薬組成物を含む、請求項45または請求項46に記載の方法。
  48. 前記1回以上の投与のうちの少なくとも1回が、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、皮膚内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与を含む、請求項45〜47のいずれかに記載の方法。
  49. 投与が2回以上である場合、少なくとも1回の投与に使用される少なくとも1つの組成物が、少なくとも1回の他の投与の組成物とは異なる、請求項45〜48のいずれかに記載の方法。
  50. 前記1つ以上の組成物のうちの少なくとも1つの前記化合物が、動物体重1kg当たり約0.005mg〜動物体重1kg当たり約50mgの量で前記動物に投与される、請求項45〜49のいずれかに記載の方法。
  51. 前記動物が、ヒト、げっ歯類、または霊長類である、請求項45〜50のいずれかに記載の方法。
  52. 前記動物が、前記治療を必要としている、請求項45〜51のいずれかに記載の方法。
  53. 前記方法が、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、腸透過性、リーキーガット、金属誘発性腸漏出、ストレス誘発性腸漏出、放射線誘発性腸透過性、大腸炎、局所炎症、脳内炎症、口腔内炎症、食道内炎症、胃内炎症、小腸内炎症、全身性炎症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、感染誘発性炎症性疾患、敗血症、敗血症誘発性腎損傷、敗血症誘発性肺損傷、強皮症、血管炎、薬物誘発性血管炎、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、不安、うつ病、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬物誘発性肝損傷、α−抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、肥満、メタボリック症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、がん、がん性腫瘍、乳癌、結腸癌、認知障害、ストレス、気分障害、または線維症を治療するためのものである、請求項45〜52のいずれかに記載の方法。
  54. 前記方法が、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、大腸炎、腸透過性、リーキーガット、金属誘発性腸漏出、ストレス誘発性腸漏出、放射線誘発性腸透過性、局所炎症、全身性炎症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、感染誘発性炎症性疾患、敗血症、敗血症誘発性腎損傷、敗血症誘発性肺損傷、強皮症、血管炎、薬物誘発性血管炎、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、がん性腫瘍、乳癌、結腸癌、または線維症を治療するためのものである、請求項45〜53のいずれかに記載の方法。
  55. 前記方法が、アルコール性肝疾患(ALD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、腸透過性、リーキーガット、金属誘発性腸漏出、ストレス誘発性腸漏出、放射線誘発性腸透過性、局所炎症、全身性炎症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、がん性腫瘍、乳癌、結腸癌、または線維症を治療するためのものである、請求項45〜54のいずれかに記載の方法。
  56. 前記方法が、血管炎、薬物誘発性血管炎、強皮症、内臓血管出血、薬物誘発性内出血、アトピー性皮膚炎、灌流関連損傷、灌流関連炎症、糖尿病性網膜症、セリアック病、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、アルコール性脂肪性肝炎(ASH)、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、薬物誘発性肝損傷、慢性腎臓疾患、アルファ抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、炎症、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、神経炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、喘息、がん、認知障害、ストレス、または気分障害を治療するためのものである、請求項45〜55のいずれかに記載の方法。
  57. 前記方法が、がんを治療するためのものであり、前記がんが、膵臓癌、膵臓管腺癌、肺癌、肝臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、黒色腫、皮膚悪性黒色腫、黒色腫腫瘍形成、膀胱癌、前立腺癌、悪性神経鞘腫瘍、多発性骨髄腫、乳癌、扁平上皮細胞癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、リンパ腫、白血病、骨髄癌、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、多形性膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、基底細胞癌、甲状腺癌、神経芽腫、卵巣癌、腎臓細胞癌、肝細胞癌、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病、横紋筋肉腫、髄膜腫、胃癌、神経膠腫、口腔癌、咽頭癌、胃癌、子宮癌、髄芽腫、転移を引き起こす可能性のあるがん、転移に起因するがん、またはそれらのがん性腫瘍である、請求項45〜56のいずれかに記載の方法。
  58. 組織におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を誘導する方法であって、ウロリシン構造類似体を含む有効量の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法。
  59. 組織におけるタイトジャンクションタンパク質の発現を誘導する方法であって、有効量の請求項30〜32のいずれか一項に記載の組成物を、必要とする対象に投与することを含む、方法。
  60. 前記対象が、胃腸透過性または炎症の症状を呈し、前記組成物が、小腸および/または大腸に投与される、請求項58または59に記載の方法。
  61. 前記対象が、炎症性腸疾患を有する、請求項60に記載の方法。
  62. 前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項61に記載の方法。
  63. 前記対象がセリアック病を有する、請求項60に記載の方法。
  64. 前記炎症性腸疾患が結腸炎症を含む、請求項61に記載の方法。
  65. 前記組成物が、臓器における内皮または血管バリアの完全性を改善するための量の効果で全身に投与される、請求項58または59に記載の方法。
  66. 前記臓器が、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、皮膚、筋肉、脂肪、脳、眼、骨、および腸から選択される1つ以上である、請求項65に記載の方法。
  67. 前記対象が、血管炎、薬物誘発性血管炎、強皮症、内臓血管出血、薬物性内出血、アトピー性皮膚炎、灌流関連損傷、灌流関連炎症、および糖尿病性網膜症から選択される状態を有する、請求項66に記載の方法。
  68. 全身性炎症を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項30に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  69. 前記組成物が、腸内または非経口投与される、請求項68に記載の方法。
  70. 前記対象は、敗血症または感染誘発性炎症性疾患を有するか、または有するリスクがある、請求項69に記載の方法。
  71. 前記対象は、アルコール性肝疾患(ALD)を有するか、または有するリスクがある、請求項69に記載の方法。
  72. 前記対象は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)またはアルコール性脂肪性肝炎(ASH)を有するか、または有するリスクがある、請求項69に記載の方法。
  73. 前記対象が、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、皮膚、筋肉、脂肪、脳、眼、骨、骨髄、腸、および軟骨から選択される1つ以上の臓器または組織の炎症を有する、請求項68に記載の方法。
  74. 神経炎症性障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項30に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  75. 前記神経炎症性障害が、アルツハイマー病である、請求項74に記載の方法。
  76. 前記神経炎症性障害が、パーキンソン病である、請求項74に記載の方法。
  77. 前記神経炎症性障害が、任意選択で多発性硬化症である神経変性疾患である、請求項74に記載の方法。
  78. 不安またはうつ病を治療する方法であって、それを必要とする対象に、前記対象におけるモノアミンオキシダーゼ酵素を阻害するのに有効な量で、有効量の請求項30に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  79. 前記組成物が、全身性または局所的に脳に投与される、請求項78に記載の方法。
  80. 前記組成物が、腸内、非経口、または鼻腔内に投与される、請求項79に記載の方法。
  81. 肺における気道バリアの完全性を増強する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項30に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  82. 前記対象が、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性肺損傷、輸血関連急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、または喘息を有する、請求項81に記載の方法。
  83. 対象においてオートファジーを改善または増加させる方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項30に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  84. オートファジーが、脳、眼、皮膚、骨、骨髄、軟骨、心臓、肺、胃、腸管、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉、および脂肪から選択される前記対象の組織または臓器において改善または増加する、請求項83に記載の方法。
  85. オートファジーが、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される前記対象の細胞において、改善または増加する、請求項84に記載の方法。
  86. 前記対象が、代謝ストレス、心血管疾患、サルコペニア、筋変性疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬物誘発性肝損傷、慢性腎疾患、アルファ−抗トリプシン欠乏症、虚血/再灌流損傷、炎症、炎症性腸疾患、クローン病、肥満、代謝症候群、II型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、がん、認知障害、ストレス、および気分障害から選択される疾患または状態を有し、それによって、投与が、前記疾患または状態を治療または改善する、請求項83または84に記載の方法。
  87. 対象における寿命を増加させる方法であって、対象に、動物における寿命を増加させるのに有効な請求項30に記載の組成物のレジメンを投与することを含む、方法。
  88. 前記対象が、脊椎動物である、請求項58〜87のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記対象が、哺乳動物であり、任意選択で霊長類である、請求項88に記載の方法。
  90. 前記対象が、ヒトである、請求項89に記載の方法。
  91. 前記対象が、獣医科患者である、請求項88に記載の方法。
  92. 細胞内のオートファジーを増加させる方法であって、細胞を、有効量の請求項1〜29のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
  93. 前記オートファジーが、マイトファジーである、請求項92に記載の方法。
  94. 前記細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される、請求項92に記載の方法。
  95. インビトロで真核細胞の寿命を増加させる方法であって、前記細胞を、前記細胞の寿命を増加させるのに有効な、請求項1〜29のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
  96. 前記真核細胞が、初代培養物中の真核細胞である、請求項95に記載の方法。
  97. 前記真核細胞が、細胞株の一部である、請求項95または96に記載の方法。
  98. 前記真核細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、分化細胞、血液細胞、造血細胞、上皮細胞、外分泌細胞、内分泌細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、骨細胞、平滑筋細胞、縞筋細胞、神経細胞、感覚細胞、心臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、肺細胞、腎臓細胞、および生殖細胞から選択される細胞である、請求項95〜97のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記真核細胞が、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、および成体幹細胞から選択される細胞である、請求項98に記載の方法。
  100. 請求項1〜11のいずれかに記載の式(I)の化合物を調製するための方法であって、
    (a)式(V)の化合物を式(VI)の化合物と反応させて、式(VII)の化合物を含む混合物を得ることと、
    (b)前記式(VII)の化合物を好適な化合物と反応させて、式(I)の化合物を含む混合物を得ることと、
    (c)任意選択で、R、R、R、R、R、X、またはXのうちの1つ以上の性質が、さらなる反応によって変化するように、式(I)の化合物をさらに反応させて、式(I)の異なる化合物を得ることと、
    (d)式(I)を回収することと、を含み、
    式(V)が、
    Figure 2021523942
    であり、
    式(VI)が、
    Figure 2021523942
    であり、R20がハロゲンであるか、または
    Figure 2021523942
    であり、
    式(VII)が、
    Figure 2021523942
    である、方法。
  101. ステップbにおける前記好適な化合物が、塩化Ti(IV)、塩化モリブデン(V)、またはこれらの組み合わせを含む、請求項100に記載の方法。
  102. 式(I)が、式(IA)、I−1、またはI−2である、請求項100または請求項101に記載の方法。
  103. 20が、Clまたは
    Figure 2021523942
    である、請求項100〜102のいずれかに記載の方法。
  104. 式(V)が
    Figure 2021523942
    である、請求項100〜103のいずれかに記載の方法。
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