TWI786538B - 泛素特異性胜肽酶24抑制劑、含此之醫藥組成物及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種泛素特異性胜肽酶24 (USP24)抑制劑、含此之醫藥組成物及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法。USP24抑制劑包含短髮夾(sh)USP24 RNA及/或羰基取代之苯基化合物，可做為化療增敏劑，藉此抑制藥劑排出、癌幹性、癌細胞之基因組不穩定性，進而應用於醫藥組成物及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法。

Description

泛素特異性胜肽酶24抑制劑、含此之醫藥組成物及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法
本發明係有關一種治療癌症多重抗藥性的化療增敏劑，特別是有關於一種泛素特異性胜肽酶24抑制劑、含此之醫藥組成物及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法。
去泛素酶(DUBs)是特異性酵素，藉由調節泛素分子，可調節多種細胞功能。泛素特異性胜肽酶屬於DUBs的超級家族，已知與多種人類疾病相關，包括癌症進展。目前已鑑定出超過50種泛素特異性胜肽酶，這些酵素大多數發揮其作用是藉由逆轉目標蛋白的聚泛素化(polyubiquitination)或單泛素化(monoubiquitination)。泛素系統之功能失常，可增強癌症基因的作用，或者降低腫瘤抑制基因的活性，且泛 素系統已知與不同癌症的腫瘤形成有關。USP24是2620胺基酸的蛋白，其含有一個泛素相關結構域(ubiquitin-associated domain，UBA)，其可結合至受質蛋白的泛素訊息(ubiquitin signal)，以及一個泛素C端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH)結構域，其為催化結構域。目前對USP24的功能了解不多，多數檢驗USP24的研究都集中在USP24之單核苷酸多形性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，其與帕金森氏症(Parkinson’s disease，PD)有關。在一些先前研究中，由於SNPs或RNA編輯可增加mRNA穩定性，故大部分末期肺癌病患之USP24的表現是上調的。在其他研究中，USP24上調會透過促進MDM2的表現，而降低甲基轉移酶(methyltransferase)Suv39h1之穩定性。Suv39h1之下調可釋放下游基因不受抑制，導致癌症轉移相關基因的表現，例如編譯CCL5及ADAM10的基因。基於上述結果，在促進肺癌轉移中，癌細胞中USP24的上調可能扮演關鍵角色。
在不同疾病中，例如細菌感染及癌症，藥物治療引起的抗藥性，降低藥物的有效性。雖然許多相關研究曾試圖解決上述爭議，但抗藥性仍為主要的問題。癌症抗藥性之一項主要挑戰在於抗藥性是多因素造成的。第二項挑戰則在於抗藥性是異質性的(heterogeneous)。最後一項挑戰則是在轉譯研究中，抗藥性容易有採樣不足的問題。 抗藥性涉及許多因素，包括增加藥物排出、減少藥物吸收、改變細胞週期檢查點、誘導緊急反應基因、抑制細胞凋亡、藥物區隔化(compartmentalization)以及改變藥物標的。目前已鑑定出兩類主要的抗藥性相關膜蛋白：ATP-結合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白(transporter)超級家族，以及溶質載體轉運蛋白。有三大類ABC轉運蛋白與多重抗藥性(multiple drug resistance，MDR)有關，包括P-醣蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、ABCG2以及多重抗藥性相關蛋白(multidrug resistance-associated proteins，MRPs)。此外，數種相關蛋白例如埃茲蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)及膜突蛋白(Moesin)(ERM)可與肌動蛋白(actin)交互作用，有助於P-gp在細胞膜的定位。合理假設，上述所有途徑都受基因突變及調控影響，而且USP24可能參與數種ABCs轉運蛋白及其相關蛋白的穩定化。因此，亟需找出一種USP24抑制劑，以延緩或逆轉癌症多重抗藥性。
因此，本發明之一態樣是提供一種專一性抑制癌細胞之泛素特異性胜肽酶24(USP24)的方法，其包括對癌細胞施予醫藥組成物，前述癌細胞為表現多重抗藥性之疑似癌變表型或未分化表型，且前述醫藥組成物包含化學治療藥物及化療增敏劑。
其次，本發明之另一態樣是提供一種延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法，其包括對癌細胞施予醫藥組成物，前述癌細胞為表現多重抗藥性之疑似癌變表型或未分化表型，且前述醫藥組成物包含化學治療藥物及化療增敏劑。
再者，本發明之又一態樣是提供一種專一性抑制癌症USP24的醫藥組成物，其包含化學治療藥物及化療增敏劑，而化療增敏劑包含USP24抑制劑。前述USP24抑制劑包含siRNA、羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類。
此外，本發明之再一態樣是提供一種延緩或逆轉癌症多重抗藥性的醫藥組成物，其包含化學治療藥物、包含USP24抑制劑之化療增敏劑以及醫藥學上可接受之載劑。
根據本發明之上述態樣，提出一種專一性抑制癌細胞之泛素特異性胜肽酶24(USP24)的方法。在一實施例中，前述方法包括下述步驟。對癌細胞施予醫藥組成物，其中癌細胞為表現多重抗藥性之疑似癌變表型或未分化表型，且前述醫藥組成物包含化學治療藥物及化療增敏劑。在此實施例中，前述醫藥組成物包含化學治療藥物以及化療增敏劑，其中化療增敏劑包含泛素特異性胜肽酶24(USP24)抑制劑。此USP24抑制劑包含短干擾核酸(siNA)、羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類，且siNA為短干擾核糖核酸(siRNA)。
在上述實施例中，siRNA為雙股USP24 RNA。在一些例示中，siRNA為具有如SEQ ID NO：1序列所示之短髮夾USP24(shUSP24)RNA。
在上述實施例中，siRNA為單離核糖核酸序列或病毒siRNA構築物。當病毒siRNA構築物為慢病毒siRNA構築物時，病毒siRNA構築物之病毒感染倍數(multiplicity of infection，m.o.i.)的一數值可為2.5至10。
在上述實施例中，羰基取代之苯基化合物具有如式(I)所示之結構：
Figure 110104339-A0305-02-0007-1
在式(I)中，X1代表單鍵或NH，n1代表1或2之整數，Y代表單價基團，且X2代表氫原子或羥基。
在上述實施例中，癌細胞可為固體腫瘤細胞或血液癌細胞，且癌細胞可選自於由肺癌細胞、鼻咽癌細胞、腦癌細胞以及大腸直腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞及多發性骨髓瘤細胞所組成之一族群。
根據本發明之另一態樣，提出一種延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法。在一實施例中，前述方法包括下述步驟。對癌細胞施予醫藥組成物，其中此癌細胞為表現多重抗藥性之疑似癌變表型或未分化表型。在此實施例中， 前述醫藥組成物包含化學治療藥物以及化療增敏劑，而化療增敏劑包含USP24抑制劑。此USP24抑制劑包含siNA、一羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類，且siNA為siRNA。
根據本發明之又一態樣，提出一種專一性抑制癌症USP24的醫藥組成物。在一實施例中，此醫藥組成物包含化學治療藥物以及化療增敏劑，而化療增敏劑包含USP24抑制劑。在此實施例中，USP24抑制劑包含具有如SEQ ID NO：1所示序列的siRNA、具有如式(I)所示之羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類。
根據本發明之再一態樣，提出一種延緩或逆轉癌症多重抗藥性的醫藥組成物。在一實施例中，此醫藥組成物包含化學治療藥物、化療增敏劑以及醫藥學上可接受之載劑。在此實施例中，前述USP24抑制劑包含siRNA、羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類，此siRNA具有如SEQ ID NO：1所示之序列，而羰基取代之苯基化合物具有如式(I)所示之結構。
應用本發明USP24抑制劑及含此之醫藥組成物，其中USP24抑制劑包含siRNA、羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類，藉此抑制藥劑排出、癌幹性、癌細胞之基因組不穩定性，進而延緩或逆轉癌症多重抗藥性。
可以理解的是，前述的概括說明及下述的詳細說明僅為例示，旨在對要求保護的發明提供進一步的解釋。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1A(a)]、[圖1A(b)]、[圖1C(a)]、[圖1C(b)]、[圖1E(a)]及[圖1E(b)]係繪示根據本發明數個實施例的A549細胞及其抗藥性細胞(A549-T24、A549-CPT-R及A549-CDDP-R)之西方墨點分析結果。
[圖1B(a)]、[圖1B(b)]、[圖1D(a)]、[圖1D(b)]、[圖1F(a)]及[圖1F(b)]係繪示根據本發明數個實施例之A549細胞及其抗藥性細胞的USP24基因表現減弱(knockdown)與否對紫杉醇(taxol)、CPT及CDDP之細胞毒性結果。
[圖1G(a)]及[圖1G(b)]係繪示根據本發明數個實施例之A549細胞的USP24基因表現減弱與否對紫杉醇處理3個月之細胞IC50結果。
[圖1H]係繪示根據本發明一實施例之NOD/SCID小鼠經皮下注射T24細胞(腫瘤)三天後再於預定時間以紫杉醇處理對腫瘤體積與USP24基因表現減弱與否之曲線圖。
[圖2A(a)]及[圖2A(b)]係繪示根據本發明一實施例之A549細胞及紫杉醇抗藥性A549細胞(T24)的P-gp、ABCG2、MRP1、MRP3及肌動蛋白表現之西方墨點分析結果。
[圖2B(a)]及[圖2B(b)]係繪示根據本發明一實施例之A549細胞的USP24基因表現減弱與否對埃茲蛋白(Ezrin)表現之西方墨點分析結果。
[圖2C(a)]至[圖2C(c)]係繪示根據本發明一實施例之T24細胞以環己亞醯胺(cyclohexmide)及奎寧(chloroquine)處理與否並搭配USP24基因表現減弱對P-gp及ABCG2表現之西方墨點分析結果。
[圖2D(a)]至[圖2F]係繪示根據本發明一實施例之A549細胞的USP24基因表現減弱與否對P-gp、ABCG2及ezrin蛋白泛素化(ubiquitination)表現之西方墨點分析結果。
[圖2G(a)]及[圖2G(b)]係繪示根據本發明一實施例以西方墨點分析T24細胞的USP24基因表現減弱與否對CD44表現之結果。
[圖2H]係繪示根據本發明一實施例利用LC/MS/MS評估USP24基因表現減弱與否對細胞內紫杉醇濃度之圖譜。
[圖2I(a)]係繪示根據本發明一實施例之T24細胞的USP24基因表現減弱與否之細胞球形成的結果。
[圖2I(b)]係繪示根據本發明一實施例以西方墨點分析A549細胞的USP24基因表現減弱與否對CD133、CD44、ABCG2及同源框蛋白(Nanog)之間相關性之結果。
[圖2J(a)]及[圖2J(b)]係繪示根據本發明一實施例以免 疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色影像及西方墨點分析肺癌病患的USP24、P-gp、ABCG2及ezrin蛋白之間相關性的結果。
[圖3A(a)]係繪示根據本發明一實施例之A549細胞經UV照光與否之細胞質(C)及細胞核(N)的USP24表現程度之西方墨點分析結果。
[圖3A(b)]係繪示根據本發明一實施例之A549細胞經UV照光與否對GFP-USP24及其各種突變體之定位的免疫螢光(immunofluorescence，IF)影像結果。
[圖3B]係繪示根據本發明一實施例以西方墨點分析A549細胞之USP24基因表現減弱與否及順鉑(cisplatin)處理對γ-H2AX及單泛素化γ-H2AX(mono-ub-γ-H2AX)表現程度的結果。
[圖3C(a)]及[圖3C(b)]係繪示根據本發明一實施例以細胞聚落形成分析顯示A549細胞經順鉑處理並在USP24基因表現減弱與否及E2F4表現下之細胞存活率的結果。
[圖3D(a)]及[圖3D(b)]係繪示根據本發明一實施例之免疫螢光(IF)病灶(foci)分析的結果。
[圖3E(a)]至[圖3E(c)]係繪示根據本發明數個實施例之HR介導的DNA損傷修復活性的結果。
[圖3F]係繪示根據本發明數個實施例之A549細胞以免疫螢光(IF)對GFP-USP24、CENPA、DAPI的定位結果。
[圖3G(a)]至[圖3G(d)]係繪示根據本發明數個實施例以次世代定序(NGS)及Circos軟體分析A549細胞、T24細胞及USP24基因表現減弱之T24細胞的全基因體以評估結構變體(structure variant，SV)之結果。
[圖4A]係繪示根據本發明數個實施例以USP7為基礎建構USP24結構模型或稱USP24 5N9R模型，藉此篩選出USP24抑制劑候選物。
[圖4B]係繪示根據本發明數個實施例顯示A549以各種USP24抑制物候選物處理後USP24受質、Bax及BRD7的相對蛋白程度之長條圖。
[圖4C]係繪示根據本發明數個實施例之USP24抑制劑存在與否的體外酵素活性分析結果，其係以純化的USP24重組蛋白做為酵素，以生物素標記之四泛素(biotin-tetra-ub)做為受質。
[圖4D]係繪示根據本發明一實施例之A549細胞的USP24過度表現與否或以USP24抑制劑處理下，利用抗泛素抗體評估p300的泛素化之西方墨點分析結果。
[圖4E(a)]至[圖4F(c)]係繪示根據本發明數個實施例之T24細胞[圖4E(a)及圖4E(b)]、TMZR細胞[圖4F(a)]、Hone-1 CPT-R細胞[圖4F(b)]及HCT116OX5細胞[圖4F(c)]以USP24抑制劑處理與否之細胞毒性結果。
[圖4G(a)]至[圖4H(b)]係繪示根據本發明一實施例以西方墨點分析T24細胞經USP24抑制劑處理與否對 P-gp之表現程度及蛋白穩定度的結果。
[圖4I(a)]及[圖4I(b)]係繪示根據本發明一實施例以USP24抑制劑處理與否對T24細胞形成細胞球的結果。
[圖4J]係繪示根據本發明一實施例利用LC/MS/MS評估以USP24抑制劑處理之細胞內紫杉醇濃度的結果。
[圖4K(a)]及[圖4K(b)]係繪示根據本發明一實施例將T24細胞注入SCID小鼠後，在指定時間以紫杉醇及USP24抑制劑處理小鼠之腫瘤大小的結果。
[圖5A]及[圖5B]係繪示根據本發明一實施例之質譜結果以判斷USP24-i101結構。
[圖6A(a)]及[圖6A(b)]係繪示根據本發明一實施例之T24細胞經紫杉醇處理並以USP24抑制劑處理與否之細胞毒性結果。
[圖6B]係繪示利用LC/MS/MS偵測以USP24-i101(上圖)或DMSO(下圖)處理之具紫杉醇抗性之T24細胞內紫杉醇濃度的圖譜。
[圖6C]係繪示根據本發明數個實施例之體外酵素活性分析結果，其係以純化的USP24重組蛋白做為酵素，以生物素標記之四泛素做為受質。
[圖6D(a)]及[圖6D(b)]係繪示根據本發明一實施例之HCC827細胞及吉非替尼(Gefitinib)抗藥性HCC827細胞(HCC827-GR)在不同濃度之吉非替尼下經USP24抑制劑處理與否的細胞毒性結果。
[圖7]係繪示根據本發明一實施例之USP24抑制劑涉及 延緩或逆轉癌症多重抗藥性癌症的機轉。
參酌所附圖式，以下詳細說明本發明的實施例。圖式及說明書使用之相同圖號，盡可能是指相同或類似的部分。倘若引用文獻對一術語的定義或用法，與此處對該術語的定義不一致或相反，則適用此處對該術語的定義，而不適用該引用文獻對該術語的定義。
如前所述，本發明提供一種泛素特異性胜肽酶24(USP24)抑制劑及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法。USP24抑制劑做為化療增敏劑，添加至醫藥組成物，可專一性抑制藥劑排出、癌幹性、癌細胞之基因組不穩定性，進而延緩或逆轉癌症多重抗藥性。
大體而言，USP24抑制劑可包括短干擾核酸(short interfering nucleic acid，siNA)、羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類。在一實施例中，siNA可為單離核糖核酸(RNA)序列，或含有前述單離RNA序列的siRNA構築物。在一些例示中，siNA可為雙股USP24 RNA，例如短髮夾USP24(short-hairpin USP24，shUSP24)RNA或病毒siRNA構築物，例如慢病毒(lentiviral)siRNA構築物。在特定例子中，shUSP24 RNA可具有如SEQ ID NO：1所示的序列。在其他例子中，為了要干擾或抑制USP24的目的，shUSP24 RNA可比SEQ ID NO：1所示之序列更長或短。在其他特定 例子中，shUSP24 RNA的序列與SEQ ID NO：1之序列相似度可為至少80%，以至少90%為佳，以至少95%為較佳，然以至少95%為更佳。詳言之，具有如SEQ ID NO：1所示序列之shUSP24 RNA，不論是單離RNA序列或病毒shUSP24 RNA構築物，皆可專一性抑制內生型USP24 RNA的表現，藉此抑制藥劑排出、癌幹性、癌細胞之基因組不穩定性。
在一實施例中，前述化療增敏劑包含羰基取代之苯基化合物，具有如式(I)所示之結構：
Figure 110104339-A0305-02-0015-2
在式(I)的實施例中，X1代表單鍵或NH，n1代表1或2之整數，Y代單價基團，且X2代表氫原子或羥基。
在一例示中，前述X1代表單鍵，n1代表整數為1，X2代表羥基，Y代表單價基團具有如式(I-1)所示的吩噻嗪基團，且其中*代表與X1之連接點：
Figure 110104339-A0305-02-0015-3
在式(I-1)中，R1代表如式(I-2)所示的烷基哌嗪基團，其中#代表與吩噻嗪基團(I-1)之氮原子之連接點，且n2代表1至4之一整數：
Figure 110104339-A0305-02-0016-4
在上述例示中，前述式(I-2)所示的烷基哌嗪基團具有如式(I-2-1，例如NCI677-08，或稱USP24-i101)、式(I-2-2)或式(I-2-3，例如NCI677397，或稱USP24-i1)所示之結構：
Figure 110104339-A0305-02-0016-5
Figure 110104339-A0305-02-0016-6
Figure 110104339-A0305-02-0016-7
在上述例示中，前述羰基取代之苯基化合物具有如式(I-3-1，例如NCI677-08，或稱USP24-i101)、式(I-3-2)或式(I-3-3，例如NCI677397，或稱USP24-i1)所示之結構：
Figure 110104339-A0305-02-0016-8
Figure 110104339-A0305-02-0017-9
Figure 110104339-A0305-02-0017-10
在另一例示中，前述X1代表NH，n1代表吩噻嗪基團(I-1)之整數為2且如式(I-4)所示，其中**代表與羰基基團的連接點，X2代表該氫原子，Y代表單價基團具有如式(I-5)所示之硝基苯基磺醯胺基團，其中*代表與氮原子之連接點，且R2代表與丁基基團之連接點：
Figure 110104339-A0305-02-0017-11
在上述例示中，前述羰基取代之苯基化合物具有如式(I-6)所示之結構，例如NCI158067(或稱USP24-i2)：
Figure 110104339-A0305-02-0018-12
本發明之羰基取代之苯基化合物可轉變為藥學上可接受之鹽類，且可利用習知方法將鹽類轉為游離鹼化合物。本發明之羰基取代之苯基化合物不論以游離鹼或藥學上可接受之鹽類，皆具有治療效果，端視所需的性質而定，這些性質例如溶解度、溶離度、吸濕性以及藥動學。前述藥學上可接受之鹽類的具體例包括與無機酸形成之鹽類，其中前述無機酸可例如鹽酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乙磺酸、天門冬胺酸及麩胺酸。前述鹽類可為甲磺酸鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽、苯磺酸鹽或硫酸鹽。前述鹽類可為單鹽或雙鹽。舉例而言，甲磺酸鹽可為單甲磺酸鹽或二甲磺酸鹽。本發明之羰基取代之苯基化合物可以水合物或溶劑化物的形式存在。在一些實施例中，前述羰基取代之苯基化合物或其鹽類可用於醫藥組成物中。前述羰基取代之苯基化合物的鹽類之形式並無特別限制；不 過在一些實施例中，述羰基取代之苯基化合物的鹽類可包括但不限於草酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及鹽酸鹽，端視實際需求而定。
在製備前述式(I)至式(I-6)之羰基取代之苯基化合物時，可能需要用功能基(例如一級胺類或二級胺類)保護其中間產物。上述保護的需求端視製備方法的遠端官能基(remote functionality)及條件而異。適合的胺基保護基包括乙醯基、三氟乙醯基、叔丁氧羰基(t-butoxycarbonyl，Boc)、苯甲氧羰基(benzyloxycarbonyl，CBz)及9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyleneoxycarbonyl，Fmoc)。前述保護的需求是所屬技術領域中具有通常知識者可以輕易確定的。關於保護基及其使用的一般性敘述可以參酌本技術領域的教科書。
詳言之，式(I)的羰基取代之苯基化合物可抑制USP24蛋白的催化活性，以抑制ABC轉運子(transporters)、形成細胞球體以及癌細胞基因體不穩定，從而增加化學治療藥物在細胞中的濃度。需補充說明的是，倘若羰基取代之苯基化合物修改成不同於式(I)至式(I-6)的結構，無法期待這類的羰基取代之苯基化合物能延緩或逆轉癌症多重抗藥性。申言之，式(I)的羰基取代之苯基化合物可抑制USP24蛋白的催化活性，以抑制ABC轉運子(transporters)、形成細胞球體並造成癌細胞基因體不穩定，進而增加細胞內化學治療藥物的濃度。
式(I)至式(I-3-3)的羰基取代之苯基化合物的製程如下具體例所述，並總括如反應(schemes)a、b、c、d、i(或i’)及j(或j’)所示。所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，根據本發明，反應a、b、c、d、i(或i’)及j(或j’)可產生式(I)至式(I-3-3)的其他化合物、前藥、代謝物、式(I)至式(I-3-3)之化合物的藥學上可接受的鹽類。
大體上，在一例示中，合成如式(I-1-1)所示的羰基取代之苯基化合物(USP24-i101，NCI：677-08)之製程可包括但不限於以下反應a、b、c、d、i及j，並可選擇性加入其他反應：
Figure 110104339-A0305-02-0020-13
Figure 110104339-A0305-02-0021-14
Figure 110104339-A0305-02-0021-15
Figure 110104339-A0305-02-0021-16
Figure 110104339-A0305-02-0022-17
Figure 110104339-A0305-02-0022-18
在上述反應a、b、c、d、i及j中，反應d的化合物(i-5)可視實際需求，經由加成反應、縮合反應、取代反應、脫去反應、氧化反應及/或還原反應，轉換為反應i的化合物(i-9a)。在上述例子中，式(I-1-1)之羰基取代之苯基化合物可包括但不限於化合物(i-10a)及化合物(i-11a)。
在其他例示中，合成如式(I-1-3)所示的羰基取代之苯基化合物(USP24-i1，NCI677397)之製程可包 括但不限於以下反應a、b、c、d、i’及j’，並可選擇性加入其他反應：
Figure 110104339-A0305-02-0023-19
Figure 110104339-A0305-02-0023-20
在上述反應a、b、c、d、i’及j’中，反應d的化合物(i-5)可視實際需求，經由取代反應，轉換為反應I’的化合物(i-9b)。在上述例子中，式(I-1-3)之羰基取代之苯基化合物可包括但不限於化合物(i-10b)及化合物(i-11b)。
在一些例示中，上述反應a、b、c、d、i(或i’)及j(或j’)可按照以下試劑及條件進行：(反應a)2-氟 苯硫酚、DIPEA、
Figure 110104339-A0305-02-0024-21
、乙醇(EtOH)、80℃、1-4小時(h)，94%-96%；(反應b)Na2S2O4、四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)/H2O/MeOH、室溫(room temperature，rt)、16小時、97%-99%；(反應c)甲酸、95℃、8-17小時、95%->99%；(反應d)K2CO3、DMF、105℃、3-9小時、78%-82%；(反應i)KI、
Figure 110104339-A0305-02-0024-22
、N-甲基哌嗪(1-methylpiperazine)、DMF、110℃、22小時、50%；(反應i’)KI、丙酮、Acetone、 60℃、18小時、88%；(反應j)草酸、
Figure 110104339-A0305-02-0024-24
、醚(ether)、rt、3小時、99%；(反應j’)草酸、醚rt、3小時、97%。
在一實施例中，化療增敏劑及化學治療藥物可用於醫藥組成物，以施用於癌細胞，其中此癌細胞為表現多重抗藥性之疑似癌變表型或未分化表型，藉此專一性抑制癌細胞的泛素特異性胜肽酶24(USP24)，進而延緩或逆轉癌症多重抗藥性。
在此實施例中，化學治療藥物可為傳統化療藥物，不限於例如紫杉醇、喜樹鹼(Camptothecin，CPT)、順 鉑(cisplatin)等。
在一實施例中，癌細胞可為固體腫瘤細胞或血液癌細胞，其可包括但不限於例如肺癌細胞、鼻咽癌細胞、腦癌細胞、大腸直腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞及多發性骨髓瘤細胞，但不限於上述所舉。
在一些化療方案中，化療增敏劑可於化學治療之前、之中或之後與化學治療藥物併用。在此實施例中，上述醫藥組成物可包括化學治療藥物、化療增敏劑以及選擇性加入醫藥學上可接受之載劑，此醫藥組成物可經由傳統途徑投予癌細胞或個體，前述傳統途徑可例如經由靜脈(intravenous，i.v.)、經由肌肉(intramuscular，i.m.)、經由腹腔(intraperitoneal，i.p.)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、表皮(cutaneous)、皮下(subcutaneous，s.c.)、經皮(transdermal)、舌下(sublingual)、頰黏膜(buccal)、直腸(rectal)、陰道(vaginal)、眼內(ocular)、經耳(otic)、鼻腔(nasal)、吸入(inhalation)、口服(oral)、噴霧(nebulization)等途徑，端視實際需求而定。
在一些例示中，siRNA可為單離核糖核酸(RNA)序列，或含有前述單離RNA序列的siRNA構築物。當siRNA構築物是病毒siRNA構築物，例如慢病毒(lentiviral)siRNA構築物，此慢病毒siRNA構築物之病毒感染倍數(multiplicity of infection，m.o.i.)的數值可為2.5至10，然以4至6為較佳，又以5為更 佳。在其他例示中，上述羰基取代之苯基化合物的體外劑量可為100nM至1μM。在一些特定例示中，上述羰基取代之苯基化合物在醫藥組成物中的劑量可為12.5mg/kg體重至25mg/kg體重。
在此實施例中，前述醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑並無限制，舉例而言，水、溶液、有機溶劑、醫藥學上可接受之油或脂肪或其混合物。在一些例示中，醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑可為生理食鹽水、無菌水、林格氏液(Ringer's solution)、緩衝鹽溶液(buffered saline)、白蛋白注射液(albumin injection)、葡萄糖溶液(dextrose solution)、麥芽糊精溶液(maltodextrin solution)、甘油(glycerol)、乙醇(ethanol)，或使用上述至少一種之混合，若有需要，亦可添加習知添加劑，例如抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑等。
一般而言，USP24抑制劑可調節目標基因及/或蛋白，其中目標基因及/或蛋白可涉及降低USP 24含量，藉此延緩或逆轉癌症多重抗藥性。適合的目標基因及/或蛋白可包括但不限於USP 24、E2F4、enzin、p-醣蛋白(p-glycoprotein，p-gp)、ABCG2等，從而降低腫瘤突變負荷量(tumor mutation burden，TMB)以及藥劑排出量，進而延緩或逆轉癌症多重抗藥性。
可以理解的是，下述特定配置、觀點、例示、條款及實施例僅供舉例說明，並非做為本發明的限制條件。在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的主要特徵可用 於各種實施例。因此本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可輕易確定本案的必要技術特徵，對本發明作各種更動及潤飾，以適用不同的用途及條件。
實施例1 1.1 製備羰基取代之苯基化合物
本發明之化合物可利用多種合成途徑進行合成，前述合成途徑包括習知方法及本發明類似的方法。起始材料通常可由商業來源取得，例如西格瑪奧德里奇化學品(Sigma Aldrich Chemicals，Milwakee,Wis.)或使用所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的方法輕易製備。
1.2 製備USP24-i101(NCI677-08)
反應a、b、c、d、e、f、g、h、i及j可按照以下試劑及條件進行：(反應a)2-氟苯硫酚、DIPEA、
Figure 110104339-A0305-02-0027-25
、乙醇(EtOH)、80℃、1小時，94%；(反應b)Na2S2O4、THF/H2O/MeOH、室溫(rt)、16小時、97%；(反應c)甲酸、95℃、8-17小時、>99%；(反應d)K2CO3、DMF、105℃、9小時、78%；(反應e)乙二醇、對甲苯磺酸(TsOH)、甲苯(toluene)、130℃、22小時、66%；(反應f)氯乙醯氯(chloroacetyl chloride)、甲苯、80℃、16小時、84%；(反應g) BH3-THF、THF、室溫、19小時、58%；(反應h)鹽酸溶於二噁烷(HCl in dioxane)、室溫、16小時、>99%； (反應i)KI、
Figure 110104339-A0305-02-0028-26
、N-甲基哌嗪(1-methylpiperazine)、 DMF、110℃、22小時、50%；(反應j)草酸、
Figure 110104339-A0305-02-0028-27
、醚(ether)、室溫、3小時、99%。
除非另外聲明，所有市售化學品及溶劑皆為試劑級，即可使用而無須進一步純化。利用默克(Merck)60F254矽膠玻璃背板(silica gel glass backed plates，20×20cm)進行薄層色譜分析，以監控所有反應是否完成。在UV光(254nm)下目測呈現的色譜圖。利用Varian Mercury-400光譜儀記錄1H NMR光譜，而化學位移以百萬份之一(ppm,δ)表示。多重峰的記錄如下：s(singlet，單峰)；br s(broad singlet，寬單峰)；d(doublet，雙峰)；t(triplet，三重峰)；q(quartet，四重峰)；dd(doublet of doublets，雙重雙峰)；td(triplet of doublets，雙重三峰)，m(multiplet，多重峰)。耦合常數(coupling constants，J)以赫茲(hertz)表示。電噴灑質譜(Electrospray mass spectra，ESMS)以沃特世(Waters)質譜儀記錄並以m/z值表示。最終化合物的純度則以沃特世的ACQUITY Arc系統判定，其係利用C18管柱(Waters X Select HSS T3 5μm，4.6mm×250mm)在40℃下操作。以移動相(mobile phase)A及移動相B進行沖提(elution)，其中移動相A為甲醇，流動相B為含0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid)的水。沖提條件如下：在0分鐘時為移動相A 10%+移動相B 90%；在6分鐘時為移動相A 70%+移動相B 30%；在12分鐘時為移動相A 50%+移動相B 50%；在18分鐘時為移動相A 10%+移動相B 90%；在23分鐘時為移動相A 90%+移動相B 10%。移動相的流速為1mL/分鐘，樣品的注入體積為200μL。偵測210-400nm的峰值。最終化合物的純度為>95%。
式(i-2)化合物：(4-((2-氟苯)巰基)-3-硝基苯基)(苯基)甲酮[(4-((2-Fluorophenyl)thio)-3-nitrophenyl)(phenyl)methanone]
如反應a所示，將式(i-1)化合物：4-氯-3-硝基苯基(苯基)甲酮[(4-chloro-3-nitrophenyl)(phenyl)methanone，式(i-1)，5g,19.1mmol]的溶液、DIPEA(7.41g,57.3mmol)及2-氟苯硫酚(2-Fluorothiophenol，3.18g,24.8mmol)溶於乙醇(EtOH，100mL)，在80℃攪拌5小時。將反應混合物濃縮至乾。前述混合物經乙酸乙酯(ethyl avcetate，EA，300mL)稀釋、以水(200mL)及鹽水(brine，200mL)潤洗，利用硫酸鈉(Na2SO4)乾燥。前述混合物經過濾後，濃縮至乾。粗 產物利用管柱層析法(column chromatography)純化，以獲得式(i-2)化合物[6.45g，96%，黃色固體]。1H NMR(400MHz，CDCl3)的數據如下：δ 8.69(s,1H)，7.84(d,J=8.6Hz,1 H)，7.77(d,J=7.0Hz,2 H)，7.70-7.55(m,3 H)，7.55-7.45(m,2 H)，7.39-7.28(m,2 H)，6.96(d,J=8.2Hz,1 H)。
Figure 110104339-A0305-02-0030-28
式(i-3)化合物：(3-胺基-4-((2-氟苯)巰基)苯基)(苯基)甲酮[(3-Amino-4-((2-fluorophenyl)thio)phenyl)(phenyl)methanone]
如反應b所示，將式(i-2)化合物(4.94g，14mmol)溶於THF/H2O/MeOH(30/30/2mL)的溶液加入二硫亞磺酸鈉(Na2S2O4，24.5g，140mmol)。前述反應混合物於室溫下攪拌16小時。前述混合物經EA(300mL)稀釋、以水(200mL)及鹽水(brine，200mL)潤洗，利用硫酸鈉(Na2SO4)乾燥。前述混合物經過濾後濃縮至乾，以獲得式(i-3)化合物(4.5g，99%，黃色液體)。1H NMR(400MHz，CDCl3)的數據如下：δ 7.83 (s,1 H)，7.81(d,J=1.6Hz,1 H)，7.62-7.56(m,1 H)，7.50(d,J=1.6Hz,1 H)，7.49-7.46(m,2 H)，7.23-7.15(m,2 H)，7.11(d,J=1.6Hz,1 H)，7.10-7.07(m,1 H)，7.07-6.94(m,2 H)。
Figure 110104339-A0305-02-0031-29
式(i-5)化合物：(10H-吩噻嗪-2-基)(苯基)甲酮[(10H-Phenothiazin-2-yl)(phenyl)methanone]
如反應c所示，將式(i-3)化合物(6g，18.6mmol)溶於甲酸(50mL)的溶液，於95℃攪拌8小時。前述混合物經EA(300mL)稀釋、以水(200mL)及鹽水(brine，200mL)潤洗，利用硫酸鈉(Na2SO4)乾燥。前述混合物經過濾後濃縮至乾，以獲得式(i-4)化合物。如反應d所示，將式(i-4)粗加成物(6.2g，17.6mmol)的溶液以及碳酸鉀(K2CO3，7.32g，52.9mmol)溶於DMF(30mL)中，於105℃攪拌8小時。前述 混合物經EA(300mL)稀釋、以水(200mL)及鹽水(brine，200mL)潤洗，利用硫酸鈉(Na2SO4)乾燥。前述混合物經過濾後濃縮至乾，粗產物利用管柱層析法純化，以獲得式(i-5)化合物(4.4g，82%，黃色固體)。1H NMR(400MHz，CDCl3)的數據如下：δ 7.77(s,1 H)、7.76-7.74(m,1 H)、7.58(t,J=7.4Hz,1 H)、7.51-7.45(m,2 H)、7.20(dd,J=1.6,8.2Hz,1 H)、7.04-6.95(m,4 H)、6.84(t,J=8.0Hz,1 H)、6.54(d,J=7.8Hz,1 H)、5.89(s,1 H)。
Figure 110104339-A0305-02-0032-30
Figure 110104339-A0305-02-0032-31
式(i-6a)化合物：2-(2-苯基-1,3-二氧戊環-2-基)-10H-吩噻嗪[2-(2-Phenyl-1,3-dioxolan-2-yl)-10H-phenothiazine]
如反應e所示，將式(i-5)化合物(1.88g，6.2mmol)的溶液、乙二醇(ethanediol，1.73ml，31.0mmol)及甲苯-4-磺酸(toluene-4-sulfonic acid，118mg，0.62mmol)溶於甲苯(16mL)中，在迪安-斯塔克裝置中加熱至130℃回流19小時，以進行縮合反應。前述反應混合物以1M氫氧化鈉溶液(aqueous 1M NaOH)、水及鹽水潤洗，利用硫酸鎂(MgSO4)乾燥並進行減壓濃縮。粗產物利用管柱層析法(CH2Cl2/hexane=3/2)純化，以獲得式(i-6a)化合物(1.42g，66%，灰色固體)。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)的數據如下：δ 8.61(s,1H)，7.41-7.39(m,2H)，7.36-7.33(m,2H)，7.31-7.28(m,1H)，6.97(td,J=7.7,1.4Hz,1H)，6.89(dd,J=7.8,1.2Hz,1H)，6.87(d,J=7.8Hz,1H)，6.81(dd,J=8.4,1.8Hz,1H)，6.79(d,J=1.8Hz,1H)，6.74(td,J=7.4,1.6Hz,1H)，6.63(dd,J=7.8,1.2Hz,1H)，3.96(s,4H)。
Figure 110104339-A0305-02-0034-32
式(i-7a)化合物：2-氯-1-(2-(2-苯基-1,3-二氧戊環-2-基)-10H-吩噻嗪-10-基)乙-1-酮化合物[2-Chloro-1-(2-(2-phenyl-1,3-dioxolan-2-yl)-10H-phenothiazin-10-yl)ethan-1-one]
如反應f所示，將式(i-6a)化合物(840mg，2.42mmol)的溶液溶於甲苯(12mL)中，在0℃加入2-氯乙醯氯(410mg，3.63mmol)。反應混合物於80℃攪拌16小時，冷卻至室溫後，進行減壓濃縮。前述混合物經二氯甲烷(dichloromethane，DCM)稀釋、以水萃取後，利用硫酸鎂(MgSO4)乾燥及濃縮。粗產物利用管柱層析法(EA/hexane=1/4)純化，以獲得式(i-7a)化合物(859mg，84%，固體)。1H NMR(400MHz,CDCl3)的數據如下：δ 7.79-7.77(m,1H),7.71-7.69(m,1H),7.58(dd,J=7.5,1.2Hz,1H),7.55(d,J=7.8Hz,1H),7.46-7.43(m,2H),7.42(td,J=7.7,1.4Hz,1H),7.36-7.33(m,4H),7.30(tt,J=7.2,1.6Hz,1H),4.05-3.99(m,4H),3.29(s,2H)。
Figure 110104339-A0305-02-0035-33
式(i-8a)化合物：10-(2-氯乙基)-2-(2-苯基-1,3-二氧戊環-2-基)-10H-吩噻嗪[10-(2-Chloroethyl)-2-(2-phenyl-1,3-dioxolan-2-yl)-10H-phenothiazine]
如反應g所示，將式(i-7a)化合物(390mg，0.92mmol)的溶液溶於乾式四氫呋喃(THF，5mL)中，在0℃加入1M硼烷-四氫呋喃複合溶液(borane-THF complex solution，410mg，3.43mL)。反應混合物逐漸加溫至室溫並攪拌19小時。前述混合物冷卻至0℃後，逐滴加入甲醇(MeOH)並攪拌10分鐘。前述反應混合物進行減壓濃縮，並利用管柱層析法(EA/hexane=1/5)純化，以獲得式(i-8a)化合物(220mg，58%，淡綠色濃縮液，pale-green syrup)。1H NMR(400MHz，CDCl3)的數據如下：δ 7.50-7.48(m,2H)，7.35-7.32(m,2H)，7.29(tt,J=7.3,1.7Hz,1H)，7.17-7.14(m,1H)，7.13(dd,J=7.8,1.2Hz,1H)，7.09(s,2H)，7.02(s,1H)，6.93(td,J= 7.5,1.0Hz,1H)，6.85(d,J=8.4Hz,1H)，4.21(t,J=7.2Hz,2H)，4.08-4.05(m,4H),=3.72(t,J=7.2Hz,2H)。
Figure 110104339-A0305-02-0036-34
式(i-9a)化合物：(10-(2-氯乙基)-10H-吩噻嗪-2-基)(苯基)甲酮[(10-(2-Chloroethyl)-10H-phenothiazin-2-yl)(phenyl)methanone]
如反應h所示，式(i-8a)化合物(180mg，0.439mmol)溶於4.0M鹽酸(溶於二噁烷，dioxane，3.85mL)，於室溫攪拌22小時。反應混合物經濃縮後，以DCM稀釋，以水及碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)溶液潤洗，利用硫酸鎂(MgSO4)乾燥後，再濃縮至乾，以獲得式(i-9a)化合物(181mg，113%，淡黃色濃縮液)。1H NMR(400MHz，CDCl3)的數據如下：δ 7.78-7.76(m,2H),7.60(tt,J=7.4,1.5Hz,1H),7.50-7.48(m,2H),7.35(d,J=1.8Hz,1H),7.31(dd,J=7.8,1.2Hz,1H),7.22-7.19(m,2H),7.15 (dd,J=7.8,1.8Hz,1H),6.98(td,J=7.5,1.0Hz,1H),6.89(dd,J=8.4,0.6Hz,1H),4.26(t,J=7.2Hz,2H),3.81(t,J=7.2Hz,2H)。
Figure 110104339-A0305-02-0037-35
式(i-10a)化合物：(10-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-10H-吩噻嗪-2-基)(苯基)甲酮[(10-(2-(4-Methylpiperazin-1-yl)ethyl)-10H-phenothiazin-2-yl)(phenyl)methanone]
如反應i所示，式(i-9a)化合物之粗產物溶液、KI及1-甲基哌嗪(1-methylpiperazine)溶於二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)中，於110℃攪拌22小時。在冰上加入氯化銨(NH4Cl)使前述反應驟冷，以EA稀釋、以鹽水潤洗，利用硫酸鎂(MgSO4)乾燥後，進行減壓濃縮。前述粗產物利用管柱層析法((DCM/MeOH=20/1)純化，以獲得式(i-10a)化合物(120mg，50%，橘色濃縮液)。1H NMR(400MHz，CDCl3)的數據如下：δ 7.76-7.74(m,2H)，7.69-7.67(m,1H)，7.57-7.55(m,2H)，7.39(d, J=1.2Hz,1H)，7.29(d,J=7.8Hz,1H)，7.25(dd,J=7.8,1.8Hz,1H)，7.23-7.20(m,1H)，7.15(dd,J=7.8,1.8Hz,1H)，7.05(d,J=7.8Hz,1H)，6.97(td,J=7.5,1.0Hz,1H)，3.95(t,J=6.6Hz,2H)，2.63(t,J=6.6Hz,2H)，2.39-2.10(m,8H)，2.08(s,3H)。
Figure 110104339-A0305-02-0038-36
圖5A及圖5B係繪示根據本發明一實施例之質譜結果以判斷USP24-i101結構，其中圖5B之藍框區503a及藍框區503b是圖5A之藍框區503的部分放大圖，就如圖5A及圖5B的箭頭所示。如圖5A及圖5B所示，USP24-i101的結構被認為與式(i-10a)化合物或式(I-3-1)相同。
式(i-11a)化合物：[(10-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-10H-吩噻嗪-2-基)(苯基)甲酮草酸鹽[(10-(2-(4-Methylpiperazin-1-yl)ethyl)- 10H-phenothiazin-2-yl)(phenyl)methanone oxalate]
如反應j所示，將式(i-10a)化合物(120mg，0.279mmol)溶於醚(20mL)中，加入草酸(30mg，0.335mmol)並於室溫下攪拌3小時。將固體過濾後，用醚潤洗並以真空乾燥，以獲得式(i-11a)化合物(144mg，99%，褐色固體)。1H NMR(400MHz，CDCl3)的數據如下：δ 7.76-7.75(m,2H),7.71-7.68(m,1H),7.57(t,J=7.8Hz,2H),7.40(d,J=1.8Hz,1H),7.32(d,J=7.8Hz,1H),7.27-7.23(m,2H),7.19(dd,J=7.5,1.5Hz,1H),7.07(d,J=7.8Hz,1H),7.0(td,J=7.5,1.0Hz,1H),4.02(t,J=6.3Hz,2H),3.30-2.80(m,8H),2.77(t,J=6.3Hz,2H),2.72(s,3H).LCMS(ESI)m/z 430.5[M+H]+。純度：97.96%。
Figure 110104339-A0305-02-0039-37
1.3 製備USP24-i1(NCI677397)
反應a、b、c、d、e’、I’及j’可按照以下試劑 及條件進行：(反應a)2-氟苯硫酚、DIPEA、
Figure 110104339-A0305-02-0040-38
、乙醇(EtOH)、80℃、7小時，96%；(反應b)Na2S2O4、THF/H2O/MeOH、室溫(rt)、16小時、99%；(反應c)甲酸、95℃、8小時、95%；(反應d)K2CO3、DMF、 105℃、3小時、82%；(反應e’)NaH、
Figure 110104339-A0305-02-0040-39
, DMF、室溫、3小時、82%；(反應i’)KI、
Figure 110104339-A0305-02-0040-40
、丙 酮、60℃、18小時、88%；(反應j’)草酸、
Figure 110104339-A0305-02-0040-41
、醚(ether)、室溫、3小時、97%。所有市售化學品、溶劑、反應條件，皆使用與上述USP24-i101(NCI677-08)相同的方式進行。
此具體例反應a、b、c及d之式(i-1)、式(i-2)、式(i-3)、式(i-4)及式(i-5)化合物皆使用與上述USP24-i101(NCI677-08)相同的方式進行。
式(i-10b)化合物：(10-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁基)-10H-吩噻嗪-2-基)(苯基)甲酮[(10-(4-(4-Methylpiperazin-1-yl)butyl)-10H-phenothiazin-2-yl)(phenyl)methanone]
如反應e’所示，式(i-5)化合物(4.4g，14.5 mmol)之溶液溶於DMF中，在0℃加入氫化鈉(NaH，60%分散於礦物油中，1.74g，43.5mmol)，於室溫攪拌30分鐘。將1-溴-4-氯丁烷(1-Bromo-4-chlorobutane)加入前述反應，再於室溫攪拌4小時。將水(5mL)於0℃加入前述反應中。前述混合物以EA(300mL)稀釋、以水(200mL)及鹽水(200mL)潤洗，利用硫酸鈉(Na2SO4)乾燥。前述混合物進行過濾並濃縮至乾。式(i-9b)粗產物在進行下個步驟前無需純化。以獲得式(i-10a)化合物(120mg，50%，橘色濃縮液)。如反應i’所示，式(i-9b)化合物(4.69g，12mmol)之溶液、KI(0.2g，1.2mmol)及1-甲基哌嗪(1-methylpiperazine，11.9g，120mmol)溶於丙酮(80mL)中，在60℃攪拌18小時。前述混合物以EA(300mL)稀釋、以水(200mL)及鹽水(200mL)潤洗，利用硫酸鈉(Na2SO4)乾燥。前述混合物進行過濾並濃縮至乾。前述粗產物利用管柱層析法純化，以獲得式(i-10b)化合物(4.8g，88%，黃色油)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)的數據如下：δ 7.75(s,1 H)，7.74-7.72(m,1 H)，7.71-7.64(m,1 H)，7.59-7.52(m,2 H)，7.33-7.27(m,1 H)，7.27-7.19(m,3 H)，7.16(d,J=7.4Hz,1 H)，7.07(d,J=8.2Hz,1 H)，7.00-6.94(m,1 H)，3.88(t,J=6.6Hz,2 H)，2.07(s,3 H)，2.41-1.99(m,10 H)，1.76-1.65(m,2 H)，1.55-1.43(m,2 H)。 USP24-i1的結構亦經確認與式(i-10b)化合物或式(I-3-3)相同。
Figure 110104339-A0305-02-0042-42
Figure 110104339-A0305-02-0042-43
式(i-11b)化合物：(10-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁基)-10H-吩噻嗪-2-基)(苯基)甲酮草酸鹽[(10-(4-(4-Methylpiperazin-1-yl)butyl)-10H-phenothiazin-2-yl)(phenyl)methanone oxalate，NCI-677397]
如反應j’所示，將式(i-10b)化合物(4.3g，9.4 mmol)溶於醚(150mL)中，加入草酸(1g，11mmol)並於室溫下攪拌3小時。將固體過濾後，用醚潤洗並以真空乾燥，以獲得式(i-11b)化合物(NCI-677397，5g，97%)。1H NMR(400MHz，CD3OD)的數據如下：δ 7.78(s,1 H)，7.77-7.75(m,1 H)，7.68-7.62(m,1 H)，7.57-7.50(m,2 H)，7.37(s,1 H)，7.31-7.19(m,3 H)，7.15(d,J=7.4Hz,1 H)，7.04(d,J=8.2Hz,1 H)，7.01-6.95(m,1 H)，4.00(t,J=6.6Hz,2 H)，3.04(br.s.,4 H)，2.80(br.s.,4 H)，2.70(s,3 H)，2.65(t,J=7.2Hz,2 H)，1.95-1.84(m,2 H)，1.77-1.66(m,2 H)。LCMS(ESI)m/z 458.6[M+H]+。HPLC純度：98.63%。
Figure 110104339-A0305-02-0043-44
實施例2 2.1 細胞培養及轉染
人類肺癌上皮細胞株(Human lung adenocarcinoma epithelial cell line)A549及其他肺癌細胞株培養於RPMI 1640培養液中(Invitrogen)，其含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100μg/mL鏈黴素(streptomycin)及100U/ml盤尼西林G鈉鹽。所有細胞培養在37℃及5% CO2中。轉染用的質體Polyjet(SignaGen)則根據製造商的說明使用。
2.2 慢病毒基因表現減弱系統(Lentivirus knockdown system)
亂序表現減弱(scramble knockdown)慢病毒及Sp1表現減弱(Sp1 knockdown)慢病毒是由中研院RNAi core核心設施(RNAi core facility of Academia Sinica，臺灣)所提供。細胞種入6孔培養盤，培養16小時後，再以含有10μg聚乙烯(polybrene，Millipore)及病毒感染倍數(multiplicity of infection，m.o.i.)5的慢病毒的RPMI 1640培養液1mL處理。在感染24小時後，將含有慢病毒的培養液更換為新鮮培養液，並繼續維持72小時。
2.3 染色質免疫沉澱
細胞分別以表現亂序RNA的慢病毒、表現shUSP24 shRNA的慢病毒感染4天或以GFP-USP24 過度表現隔夜後，於含有1%甲醛(formaldehyde)的培養液中在室溫培養10分鐘，以進行交聯(cross-linking)反應。利用PBS潤洗細胞後，以裂解緩衝液(lysis buffer，含25nM、pH 7.5 Tris-HCl、150mM NaCl、5mM EDTA、1% Triton X-100、1% SDS)裂解細胞。在冰上利用超音波破碎(sheared)上述樣品(輸出程度：4，震盪15秒後暫停45秒，共3分鐘)。收集50μL上清液，並以450μL的稀釋溶液(含50mM、pH 8.0 Tris-HCl、0.5% NP-40、0.2M NaCl、0.5mM EDTA)予以稀釋。上述樣品與20μg超音波處理的鮭魚精子DNA(sonicated salmon sperm DNA)在旋轉設備中以4℃培養2小時，之後加入指標型抗體(indicated antibodies，1：200)例如抗-USP24抗體，於旋轉設備中再培養16小時。蛋白A或蛋白G瓊脂糖珠加入前述反應物，於4℃培養1小時，再以4000rpm於4℃離心1分鐘收集瓊脂糖珠後，以緩衝液(含20mM pH 8.0 Tris-HCl，0.5% NP-40，0.5M NaCl，2mM EDTA)潤洗3次，再以緩衝液(含10mM pH 8.0 Tris-HCl，0.5% NP-40，0.1M NaCl，1mM EDTA，0.01% SDS)潤洗3次。利用含有1% SDS的TE緩衝液使瓊脂糖珠再懸浮，並於65℃沸騰2小時。收集上清液，以65℃再加熱16小時。DNA沉澱後，以70%乙醇潤洗。利用PCR檢測指標基因。
2.4 免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)
人類及小鼠的試樣培養於10%甲醛達72小時，經過固定、脫水後，包埋於石蠟(paraffin)中。為了進行免疫組織化學，利用二甲苯(xylene)對石蠟包埋的切片進行脫蠟，並利用序列稀釋的乙醇進行脫水。前述樣本利用含有0.3%過氧化氫的PBS反應30分鐘，阻斷內源性過氧化酶(peroxidase)後，再利用1%胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin)予以阻斷。前述樣本與抗-USP24、抗-Wnt、抗-CD44、抗-波形蛋白(vimentin)、抗-Sox2及抗-β-連環蛋白(catenin)抗體在室溫下培養3小時，並利用Vectastain ABC套組將免疫反應性予以可視化，以辨識出有興趣的蛋白。上述切片係利用Olympus BX-51顯微鏡拍照。
2.5 製備條件培養液
THP-1細胞與M2巨噬細胞在37℃培養2天後，收集培養液，並以800rpm離心5分鐘。上清液與含有10% FBS之新鮮配製的培養液以1：2的比例混合，以製備條件培養液。亂序RNA表現減弱或USP24表現減弱或過度表現USP24之M2巨噬細胞經慢病毒感染24小時，以PBS潤洗後，將細胞培養於新鮮的培養液中。培養72小時後，以800rpm離心5分鐘收集亂序RNA表現減弱或USP24表現減弱或過度表現USP24之M2巨噬細胞的細胞培養液，上清液與含有10% FBS之新鮮配製的培養液以1：2的比例混合，以製備條件培養液。
2.6 動物照護
動物相關的試驗業經國立成功大學(National Cheng Kung University，NCKU)實驗動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的審查通過。這些基因轉殖小鼠是由國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center，NLAC；台灣台南)產生。經繁殖後，以下使用2月齡的基因轉殖小鼠研究肺癌的進展。獸籠提供適當的空間，所容納的族群密度適當，使動物足以自由活動。提供的飼料足以讓基因轉殖小鼠能正常生長，並維持正常的體重。基因轉殖小鼠可接觸到新鮮未污染的飲用水。基因轉殖小鼠每週至少觀察及照護2至3次。所有與動物相關的方法皆依照相關的指南及規範進行。
2.7 USP24結構的同源性模擬法(Homology modeling)
目前仍無法取得USP24結構，以下係進行同源性模擬分析。首先，以USP7(PDB ID：5N9R)為模板，其中USP7可由Protein Data Bank19取得，是USP24的同源蛋白。接著，將USP24的蛋白質序列與模板進行序列比對(aligned)。之後，利用商用軟體Chimera內建的組件MODELLER20，建立同源性模型。
2.8 虛擬篩選出結構為主的潛在USP24抑制劑
利用分子對接平台(molecular docking platform LeadIT22)LeadIT22提供建模的USP24 結構。USP24同源性模型與模板結構進行比對。模板結構(USP7)的共晶配體是用來判斷結合位點。結合位點係以共晶配體半徑10Å內的殘基定義。水分子已移除。利用LeadIT分析，NCI化合物(約250,250種化合物)可與上述結合位點對接。對接過程可使用混合焓熵法(hybrid enthalpy and entropy approach)。每個迭代(iteration)及片段化(fragmentation)之解答最大數分別設為200。
實施例3 3.1 評估癌症治療時USP24正向調節抗藥性
發明人先前研究指出，癌細胞與腫瘤相關之巨噬細胞的USP24上調，可促使肺癌惡化。這些資料指出癌細胞與巨噬細胞的USP24喪失，可顯著抑制癌症惡化的能力。既然抗藥性是引發癌症復發及惡化的主要因素，實有必要了解USP24在抗藥性的角色。利用紫杉醇、喜樹鹼(CPT)及順鉑(cisplatin)等多種化學治療藥物誘導抗藥性細胞株，發現這些抗藥性細胞株之USP24的程度為增加，如圖1A(a)、圖1A(b)、圖1C(a)、圖1C(b)、圖1E(a)及圖1E(b)所示。將這些抗藥性細胞株之USP24表現減弱可部分抑制上述藥物誘導之抗藥性，如圖1B(a)、圖1B(b)、圖1D(a)、圖1D(b)、圖1F(a)及圖1F(b)所示。此外，在其他癌細胞株例如Hone1及HCT116中亦顯示，喪失USP24可部分逆轉紫杉醇及益樂鉑(oxaliplatin)對Hone-1R及HCT116R癌細胞的 細胞毒性。此外，對紫杉醇敏感的A549細胞施予紫杉醇處理及USP24基因表現減弱與否達3個月，以評估誘導抗藥性的效果，如圖1G(a)及圖1G(b)所示。有趣的是，結果顯示紫杉醇處理3個月可誘導出抗藥性細胞株T24(IC50=25nM)，不過USP24喪失可完全阻斷抗藥性(IC50=6.6nM)。將紫杉醇誘導出抗藥性且USP24基因表現減弱之肺癌細胞株T24，注入SCID小鼠，以評估腫瘤的形成(圖1H)。結果顯示USP24喪失能顯著逆轉紫杉醇的細胞毒性，降低腫瘤形成。綜上所述，USP24在化療過程中可正向調節抗藥性。
3.2 評估USP24穩定ABCs轉運蛋白以將藥物排出癌細胞外
ABCs轉運蛋白對於抗藥性相當關鍵，在紫杉醇誘導之肺癌細胞T24中，P-gp、ABCG2及MRP1的程度會提升，如圖2A(a)及圖2A(b)所示。當USP24表現減弱時，P-gp、ABCG2及埃茲蛋白(Ezrin)的程度則下降，代表USP24做為去泛素酶(deubiquitinase)，可穩定P-gp、ABCG2及ezrin蛋白，以增加將藥物排出癌細胞外的能力，如圖2A(a)、圖2A(b)、圖2B(a)及圖2B(b)所示。USP24表現減弱會降低P-gp、ABCG2及ezrin蛋白的蛋白穩定性，但利用MG132處理P-gp，並利用ezrin蛋白與氯奎寧(chloroquine)處理ABCG2，可以逆轉上述情況，如圖2C(a)至圖2C(c)所示。USP24可與P-gp、ABCG2及ezrin蛋白交互作 用，而USP24表現減弱可增加P-gp、ABCG2及ezrin蛋白的泛素化訊號(ubiquitinated signal)，暗示USP24可穩定這些ABCs轉運蛋白相關的蛋白，以排出藥物，如圖2D(a)至圖2F所示。一些先前的研究指出，ezrin蛋白能協助ABCs轉運蛋白到細胞膜。在此實施例中，發現USP24不僅能穩定ezrin蛋白，ezrin蛋白更能增加ABCG2(結果未顯示)。其他之前的研究亦顯示，癌幹性也與抗藥性有關。USP24表現減弱會減少細胞球體形成，如圖2I(a)所示。其次，T24細胞之USP24基因表現減弱與否可利用西方墨點分析法偵測CD44的程度[圖2G(a)及圖2G(b)]，並利用LC/MS/MS偵測USP24基因表現減弱與否之細胞內紫杉醇濃度，如圖2H所示。結果顯示，USP24喪失可增加抗藥性細胞T24內累積的紫杉醇，累積濃度從110.8nM/1000nM至272.7nM/1000nM，如圖2H所示。此外，研究臨床肺癌病患群的USP24、P-gp及ABCG2之間的相關性，如圖2I(b)所示，其顯示在肺癌病患中，USP24、P-gp及ABCG2之間的正相關性較高，如圖2J(a)及圖2J(b)所示。上述所有結果顯示，USP24可穩定ABCs轉運蛋白並增加癌幹特性，進而誘導抗藥性。
3.3 評估USP24進入細胞核誘導基因組不穩定性，並降低在DNA受損條件下的DNA損傷修復活性
發明人先前研究指出，USP24主要是位於細胞質。在此具體例中，發現肺癌細胞經UV照光後，USP24可 移入細胞核，如圖3A(a)及圖3A(b)所示。USP24中所有的ATM磷酸化保留序列(phosphorylation conserve sequences)都分別產生突變，在UV照光下可評估前述序列在細胞內的表現及分布，如圖3A(a)及圖3A(b)所示。資料顯示，S1352、S1422A及S1620等三個位置對於USP24核內定位是重要的。USP24基因表現減弱(knockdown)可降低E2F4匯集(recruitment)至Rad51的啟動子，進而增加Rad51的轉錄活性(結果未顯示)。USP24基因表現減弱可減少CPT的細胞毒性，並增加DNA損傷修復能力，如圖3B所示。Rad51基因表現減弱或過度表現E2F4可中斷(abolished)因喪失USP24造成的效果，包括聚落形成、次G1(sub-G1)間期、病灶形成、HR-介導之DNA損傷修復活性，如圖3C(a)、圖3C(b)、圖3D(a)、圖3D(b)、圖3E(a)、圖3E(b)及圖3E(c)所示。以上所有結果顯示USP24使E2F4穩定而降低DNA損傷修復活性，從而抑制Rad51以降低基因組不穩定性。因此，過度表現GFP-USP24會引起細胞分裂後期橋(anaphase bridge)及超細橋(ultra-fine bridge，UFB)，如圖3F所示，暗示USP24會誘導基因組不穩定性，進而增加腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)。
利用次世代定序(NGS)及Circos軟體對USP24基因表現減弱與否之A549細胞及T24細胞的全基因體進行定序，如圖3G(a)至圖3G(d)所示。結果顯 示，在基因缺失(deletion，DEL、重複(duplication，DUP)及倒位(inversion，INV)並無顯著差異，不過紫杉醇引起的抗藥性會增加結構變體(structure variant，SV)及易位(translocation，TRA)，但可中斷USP24基因表現減弱的效果，表示USP24可透過增加藥物排出細胞以及誘導基因組不穩定性，而促進腫瘤突變負荷，如如圖3G(a)至圖3G(d)所示。
3.4 評估新穎專一的USP24抑制劑在癌症治療時阻斷USP24酵素活性以抑制抗藥性
前述結果顯示，USP24增加ABC轉運蛋白以及腫瘤突變負荷(TMB)，分別促使癌細胞排出藥物及增加癌症多元性(cancer heterogenicity)，進而導致抗藥性。USP24可望作為開發抑制劑的潛在標的，以於癌症治療時阻斷抗藥性。在此具體例中，USP7用來做為母結構(parent)，以預測USP24之催化域的結構，以油NCI化合物資料庫中篩選出抑制劑，如圖4A所示。從化合物資料庫中收集的150種化合物，用來研究對受質Bax、BRD7以及對USP24催化活性的抑制效果(圖4B及圖4C)。NCI677397(亦稱為USP24-i1)與NCI158067(亦稱為USP24-i2)之二種化合物可降低Bax、BRD7(圖4B)及p300(圖4D)的程度，亦可抑制純化之USP24重組蛋白之催化活性(圖4C)。有趣的是，NCI677397(亦稱為USP24-i1)不能阻斷USP7、USP9x及USP10的催化活性，但NCI158067(亦稱為USP24-i2)能阻 斷USP7及USP10(結果未顯示)，代表NCI677397(亦稱為USP24-i1)對於阻斷USP24酵素活性具有較高專一性。此外，化合物WP1130可以透過阻斷USP24的活性而抑制淋巴瘤，但無法抑制肺癌USP24的受質(圖4C)。因此，選擇以NCI677397(亦稱為USP24-i1)評估抗藥性的抑制效果。圖4E(a)、圖4E(b)、圖4F(a)、圖4F(b)及圖4F(c)指出，NCI677397(亦稱為USP24-i1)能分別顯著阻斷肺癌、腦癌、鼻咽癌及大腸直腸癌中紫杉醇、TMZ及益樂鉑(oxaliplatin)引起的抗藥性。此外，NCI677397(亦稱為USP24-i1)處理能降低P-gp的程度[圖4G(a)至圖4H(b)]，並抑制T24細胞球體形成的能力[圖4I(a)及圖4I(b)]，推測USP24催化能力喪失會減少癌幹特性，而癌幹特性對於抗藥性可能是重要的。再者，在1000nM的紫杉醇處理下，NCI677397(亦稱為USP24-i1)可使細胞內紫杉醇濃度從4.78nM增加至321.36nM(圖4J)，亦可增加紫杉醇的細胞毒性，在SCID小鼠中可抑制癌症大小及重量[圖4K(a)及圖4K(b)]，但不影響體重(結果未顯示)。此外，NCI677397(亦稱為USP24-i1)亦可抑制細胞球體形成及EMT標記，暗示NCI677397(亦稱為USP24-i1)抑制USP24可避免抗藥性。再者，由於USP24可促進肺癌惡化，可選擇NCI677397(亦稱為USP24-i1)、NCI158067(亦稱為USP24-i2)及其他NCI化合物評估阻斷肺癌轉移能力(migratory ability) 的效果(結果未顯示)。這些結果指出，NCI677397(亦稱為USP24-i1)與NCI158067(亦稱為USP24-i2)二者能抑制肺癌轉移，但其他化合物則不能。
其次，圖6A(a)及圖6A(b)係繪示根據本發明一實施例之T24細胞經紫杉醇處理並以USP24抑制劑處理與否之細胞毒性結果。在圖6A(a)及圖6A(b)結果中，NCI699397(或稱USP24-i)能以低於NCI699397(或稱USP24-i1)的濃度，增加紫杉醇在細胞內的細胞毒性。再者，圖6B係繪示利用LC/MS/MS偵測以USP24-i101(上圖)或DMSO(下圖)處理之具紫杉醇抗性之T24細胞內紫杉醇濃度的圖譜。如圖6B所示，在1000nM紫杉醇處理下，NCI677397(亦稱為USP24-i1)能增加紫杉醇在細胞內的細胞毒性，從903.98nM增加至6397.62nM。
圖6C係繪示根據本發明數個實施例之體外酵素活性分析結果，其係以純化的USP24重組蛋白做為酵素，以生物素標記之四泛素做為受質。結果指出，化合物NCI677-08(或稱USP24-i101)抑制純化的重組USP24蛋白之催化活性，與NCI677397(亦稱為USP24-i1)相當，而且發現圖6C的結果與圖4C一致。
此外，圖6D(a)及圖6D(b)係繪示根據本發明一實施例之HCC827細胞及吉非替尼(Gefitinib)抗藥性HCC827細胞(HCC827-GR)在不同濃度之吉非替尼下經USP24抑制劑處理與否的細胞毒性結果。有趣的是， 數據指出吉非替尼處理3個月可誘導出抗藥性癌細胞株HCC827-GR(IC50=21.9nM)，但1μg/mL的USP24-i101可阻斷其抗藥性(IC50=6.3nM，94.0%細胞存活率)，5μg/mL的USP24-i101能更強地阻斷其抗藥性(IC50=3.1nM，80.5%細胞存活率)。
綜言之，USP24誘導之腫瘤突變負荷及藥物排出造成抗藥性。新穎且專一性的USP24抑制劑包括短干擾核酸(siNA)及/或羰基取代之苯基化合物，可穩定基因組、減少癌幹特性並增加細胞內藥物濃度，藉此阻斷抗藥性。當USP24抑制劑用於處理抗藥性細胞，例如肺癌細胞、腦癌細胞、鼻咽癌細胞以及大腸直腸癌細胞時，會挽回(rescue)部分的細胞毒性，有可能是USP24抑制劑僅能挽回ABCs轉運蛋白途徑，但不能挽回結構變體(structure variant)、TRA及TMB。USP24抑制劑延緩或逆轉癌症多重抗藥性涉及的機轉如圖7所示。因此，USP24抑制劑有潛力與化學治療藥物併用，成為新穎的雞尾酒療法(cocktail)，進而治療抗藥性的病患。
總之，上述特定核酸序列、特定化合物、特定病患群、特定分析模式或特定評估方法僅用於例示說明泛素特異性胜肽酶24抑制劑、醫藥組成物及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他核酸序列、其他化合物、其他病患群、其他分析模式或其他評估方法亦可用於泛素特異性胜肽酶24抑制 劑、醫藥組成物及其用於延緩或逆轉癌症多重抗藥性的方法，並不限於上述。舉例而言，shUSP24 RNA可與其他習知序列併用，或者可修飾USP24-i化合物但不改變其特性，藉此有利於延緩或逆轉癌症多重抗藥性。
根據本發明上述實施例，USP24抑制劑包括shUSP24 RNA及/或羰基取代之苯基化合物，可減少癌細胞排出藥物，同時抑制癌細胞癌幹性及基因組不穩定性，藉此延緩或逆轉癌症多重抗藥性。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但其他實施例亦有可能。因此，本發明後附請求項之精神及範圍不應限於這裡包含的實施例所述。

Claims (8)

  1. 一種泛素特異性胜肽酶24抑制劑，包含：一短干擾核酸(siNA)、一羰基取代之苯基化合物及/或其鹽類，該siNA為具有如SEQ ID NO：1所示序列之一短干擾核糖核酸(siRNA)，該羰基取代之苯基化合物具有如式(I)所示之一結構，藉此延緩或逆轉一癌細胞之多重抗藥性：
    Figure 110104339-A0305-02-0058-45
     在該式(I)中，X1代表單鍵或NH，n1代表1或2之一整數，Y代表一單價基團，X2代表氫原子或羥基，且該羰基取代之苯基化合物之該鹽類係選自於由草酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及鹽酸鹽所組成之一族群，且其中當該X1代表該單鍵時，該n1代表該整數為1，在該式(I-1)中，該R1代表如式(I-2)所示的烷基哌嗪基團，其中#代表與該吩噻嗪基團(I-1)之該氮原子之一連接點，且n2代表1至4之一整數：
    Figure 110104339-A0305-02-0058-46
    ，或其中當該X1代表該NH時，該n1代表該整數為2且如式(I-4)所示，其中**代表與該羰基基團的一連接點：
    Figure 110104339-A0305-02-0059-47
     其中當該X2代表該氫原子時，該Y代表該單價基團具有如式(I-1)所示的吩噻嗪基團，且該式(I-1)的*代表與該X1之一連接點，或當該X2代表該羥基時，該Y代表該單價基團具有如式(I-5)所示之硝基苯基磺醯胺基團，該式(I-5)的*代表與該X1之一連接點，該X1代表NH，且該式(I-5)的R2代表丁基：
    Figure 110104339-A0305-02-0059-48
  2. 如請求項1所述之泛素特異性胜肽酶24抑制劑，其中該羰基取代之苯基化合物具有如式(I-3-1)、式(I-3-2)或式(I-3-3)所示之一結構：
    Figure 110104339-A0305-02-0060-49
    Figure 110104339-A0305-02-0060-50
    Figure 110104339-A0305-02-0060-51
  3. 如請求項1所述之泛素特異性胜肽酶24抑制劑，其中該羰基取代之苯基化合物具有如式(I-6)所示之一 結構：
    Figure 110104339-A0305-02-0061-52
  4. 如請求項1所述之泛素特異性胜肽酶24抑制劑，其中該siRNA為一雙股USP24 RNA、一短髮夾USP24 RNA(shUSP24 RNA)、一單離核糖核酸序列或一病毒siRNA構築物，且該病毒siRNA構築物為一慢病毒siRNA構築物。
  5. 一種延緩或逆轉癌症多重抗藥性的醫藥組成物，包含：一化學治療藥物；一化療增敏劑，其中該化療增敏劑為如請求項1至請求項4任一項所述之泛素特異性胜肽酶24抑制劑；以及一醫藥學上可接受之載劑。
  6. 如請求項5所述之延緩或逆轉癌症多重抗藥性的醫藥組成物，其中該病毒siRNA構築物之m.o.i.的 一數值為2.5至10。
  7. 如請求項5所述之延緩或逆轉癌症多重抗藥性的醫藥組成物，其中該羰基取代之苯基化合物之一劑量為12.5mg/kg體重至25mg/kg體重。
  8. 一種泛素特異性胜肽酶24抑制劑用於製備延緩或逆轉癌症多重抗藥性之醫藥組成物的用途，包含：對一癌細胞施予如請求項5至請求項7任一項所述之一醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含如請求項1至請求項4任一項所述之泛素特異性胜肽酶24抑制劑，該癌細胞為表現多重抗藥性之一疑似癌變表型或一未分化表型，且該癌細胞包含一肺癌細胞、一鼻咽癌細胞、一腦癌細胞以及一大腸直腸癌細胞。
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