JP4401025B2 - 分子間相互作用の腔誘導アロステリック修飾および同一の効果を持つ化合物の同定方法 - Google Patents
分子間相互作用の腔誘導アロステリック修飾および同一の効果を持つ化合物の同定方法 Download PDFInfo
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Description
政府権利の承認
本発明は、National Institutes of HealthからのGrant 1R21RR13360−01のもとで行われた。
発明の領域
本発明は、分子間相互作用を持つタンパク質の機能上重要部位をアロステリックに修飾することによって、その細胞内相互作用を調節する、化合物の同定に関する。
発明の背景
本明細書は、本明細書と同一の名称を持つ、仮明細書S.N,60/091,431、1998年7月1日出願、およびS.N.60/133,435、1999年5月11日出願、に優先権を主張し、その両方をここに参照として採用する。
【0002】
治療用化合物の開発での挑戦の一つは、望ましい生物学的効果を仲介することのできる小分子を見つけだすことである。伝統的には、合成化学および天然生成物のスクリーニングが多くの薬剤生成を誘導する主な手段であった。
【0003】
高処理ランダムスクリーニングは、リード化合物を発見するために、製薬会社によって採用されている標準的方法である。この方法は、天然/医療用生成物の大規模な化学データーベースの利用に頼っている。この方法は、病気の原因となる生物分子の主成分の知識を必要としない。要するに、それは、治療用リード化合物をスクリーニングするための盲目的方法である。この研究方法の長所は、大規模な医療用化学データベースの構築を容易にし、治療化合物をスクリーニングするために繰り返し利用できることである。残念なことに、ランダムスクリーニングは、退屈で、時には天然抽出物からの単離および特徴付けを必要とする。天然生成物は、複雑であり、それらの天然起源に固有の立体化学的複雑性を含む。
【0004】
高処理ランダムスクリーニング法を用いて、いくつかの新規の治療用分子が同定されるが、そのような方法は、時として、大規模化学データベースの入手性によって制限される。コンピューター技術およびタンパク質−タンパク質相互作用の理解の進歩は、 高処理スクリーニング法をコンピューター−援助分析および新規分子の設計で置き換える試みを可能にする。そのような構造を基にした研究方法は、新規化合物を発見するための時間および労力を減らした。
【0005】
構造を基にした研究方法を用いて、「基質類似体」または「アロステリック」インヒビターのいずれかである、さまざまなインヒビターが開発されている。アロステリック効果は、ある場合には:(1)天然リガンドと競合しない、(2)より低い濃度で効果的であり得る、(3)アロステリック結合部位は保存性が低く、それ故、特異性および選択性を強化することができる、そして(4)ある場合には、アロステリック効果は、標的分子を中間の非天然または溶融した球形状態にトラップすることによって、標的分子の機能を阻害することができる:と言う理由から、慣用の基質類似体に勝ると考えられる。
【0006】
構造に基づく研究方法は、病気に応答する生物分子に対して治療薬剤を設計する標的化経路を示している。分子の姿に基づくリード治療用化合物の設計には、主に2つの研究方法がある。酵素に関しては、(活性部位の知識から)基質類似体および示されたペプチド疑似体の設計が、ある場合、有望である。
【0007】
天然基質と競合し、活性部位を塞ぐように基質類似体を開発する。このように、有力な治療化合物は、高いアフィニティーを持ち、選択性を示し、そしてより長い保持時間を持たねばならない。レセプターおよびそれらのリガンドのような、数多くのレセプターおよびその他の非酵素分子は、はっきりした活性部位を持たないため、基質類似体は酵素によりよく適合するが、生物機能を変化させる。そのような場合、タンパク質の局所的構造形態をまねるペプチドの能力は、治療化合物を設計するために用いられる方法の一つである。基質類似体相互作用は、可逆でないときもある。
【0008】
ペプチド疑似体は、治療用薬剤として、および理解されている生物機能に対するプローブとしての両方で開発されている。オピオイドおよびホルモンレセプターを標的とする天然生成物は、合理的設計で切願された多くの概念を有効と認めるので、それらはペプチド疑似体の歴史的例でもある。これらの化合物は、どのように構造的に異なる非ペプチドが(可動性、アミノ結合および明らかな薬物伝達類似性を欠く)それらのペプチド祖先からきたか、そしてそれらの修飾がペプチドおよび非ペプチドの両化合物に関するレセプターのサブタイプについて選択性の高いリガンドに導くか、の古典的例を提供する。
【0009】
ペプチドコンフォメーションの解明は、それがレセプターに結合する構造的必要性についての見識を提供することができる(Boteju,L.W.ら、1996,J.Med.Chem.,39:4120−4;および、Cho,M.J.ら、1996,Trends in Biotechnology,14:153−8;ここにその両方を参照として採用する)。しかしながら、直線ペプチドの構造−活性の研究における主な問題は、側鎖残基のみならずペプチド骨格の可動性の大きさである。個々のアミノ酸の置換、それに続く生物学的スクリーニングは、結合にかかわっていることを示す残基上よりむしろ構造上の感情的差異を反映する。結果的に、多数のコンフォメーション間で急速な平衡が起こりそうな、溶液の分光分析の研究は、直線ペプチド類似体の設計に殆ど影響を与えない。対照的に、抑制されたペプチドは、レセプター結合コンフォメーションとの関係に関する溶液コンフォメーションの輪郭を描く。タンパク質の認識エレメントを示す構造上抑制されたペプチド類似体を基にした生物活性化合物の設計は、疑似薬物設計への有効な研究方法を構築する。時折、特定のコンフォメーションに抑制するためにペプチド上に課された抑制は、タンパク質リガンドの三次構造によって課された抑制を真似ている。課された抑制は、両親媒性のらせん繰り返しのような特定の二次構造の傾向の一因となるアミノ酸を用いることによりもたらされうる。
【0010】
ペプチド疑似体は種々の有用性を持つにもかかわらず、それらの生物生命力の乏しさ故に、ペプチド疑似体は生命力の弱い薬剤のままである。それにもかかわらず、修飾された結合または側鎖を持つ活性ペプチド類似体は、一般にタンパク質分解に対してより耐性であるため、生物活性を持つコンフォメーションをはっきりさせるもう一つの研究方法を提供し、また、価値ある薬力学的プローブでもある。
【0011】
タンパク質の構造は、結晶学、NMRおよび分子モデル化を用いて、解明された。タンパク質の三次構造は、(1)分子の全体折り畳み構造(2)α−ヘリックス、β−シートのような骨格:二次構造の形態、(3)機能性ユニット;β−ターンおよびループ、および(4)それ自身上のアミノ酸鎖、および、ある場合には、それ自身およびその他のサブユニットのアミノ酸鎖上の多量体タンパク質複合体、の折り畳みによって形成される、腔、割れ目、ポケットおよびクレバス:を示す。腔、割れ目、ポケットおよびクレバスは、内部に水分子を収容できる。腔、割れ目、ポケットおよびクレバス分子を形成するアミノ酸の形態に依存して、これらの構造形態の内部は、特定の化学的静電的性質ならびに空間寸法(dimension)をもつ。
【0012】
タンパク質/レセプターの結晶構造の決定は、タンパク質/レセプター機能の基本的理解を提供した。EGFレセプターのようなさまざまなレセプターは、リガンド、またはレセプターのその他のerbBファミリーとの関係のいずれかによって、活性化される。仮説の一つは、リガンドまたはコレセプターのいずれかによって誘導されるコンフォメーション変化が、シグナル導入を促進することである。このように、アロステリックメカニズムを通して、レセプターは、シグナル導入を変調することができると考えられる。アロステリック操縦の生物機能もまた、酵素およびレセプターの両方で知られている(Ellis,J.,1997、Drug.Dev.Res.,40:193−204、およびKundrot,C.E.ら、1991,Biochem.,30:1478−1484、ここにその両方を参照として採用する)。タンパク質/レセプターの機能を変調する試みが行われ、「アロステリック修飾またはアロステリック阻害」と呼ばれることもある。
【0013】
アロステリック修飾は、さまざまな酵素(Iverson,L.F.ら、1997,Protein Science,6:971−982;Ladjimi,M.M.ら、1985,J.Mol.Biol.,186:715−724;Ozaita,A.ら、1997,Brit.J.Pharm.,121:901−912;Tang,J.ら、1997,Chemistry & Biol.,4,453−459;および、Tijane,M.ら、1989,FEBS Lett.,245:30−34;ここにそのそれぞれを参照として採用する)、およびレセプター(Berthold,M.ら、1997,Neurochem,Res.,22:1023−1031;Ellis,J.、1997,Drug.Dev.Res.,40:193−204;Kolliasbaker,C.A.ら、1997,J.Pharmco.Exp.Therap.,281:761−768;および、Robichon,R.ら、1997,Eur.J.Pharmco.,328:255−263;ここにそのそれぞれを参照として採用する)で研究された周知の技術である。今までの技術は、変異誘発、またはスクリーニングから同定されたまたは小分子を用いることがある。アロステリック修飾を酵素に用いると、酵素反応論が変化し、ある場合には、これを用いて阻害剤が開発された。
【0014】
分子間相互作用のモジュレーターおよびそのようなモジュレーターを同定する方法が必要とされる。分子間相互作用の阻害剤およびそのような阻害剤を同定する方法も必要である。分子間相互作用のエンハンサーおよびそのようなエンハンサーを同定する方法も必要である。構造に基づくリガンド設計は、今日実施されているように、活性部位のような既知の機能の腔または高処理(リガンド結合)によって同定される腔、の知識が必要とされる。新規リガンドを設計するための機能的腔を同定する、一般的研究方法が必要である。
発明の要約
本発明は、タンパク質標的と修飾因子の間の分子間相互作用を変調する化合物を同定する方法に関する。モジュレーターは、インヒビター、即ち分子間相互作用を阻害する化合物、または、エンハンサー、例えば細胞内相互作用を強化する化合物、であることができる。本発明の方法に従うと、修飾因子との分子間相互作用に関与する標的タンパク質の機能的に重要な部位に対して近位のタンパク質標的内の腔、割れ目、ポケットまたはクレバスが同定され、触媒部位から遠位および近位であってよい。腔、割れ目、ポケットまたはクレバスの容量を計算し、その化学的静電的性質をマッピングする。腔、割れ目、ポケットまたはクレバスによって収容されうる官能基および化合物を同定する。そのような官能基および化合物を同定するためのパラメーターとしては、サイズ、チャージおよび疎水性/親水性特徴が含まれる。腔、割れ目、ポケットまたはクレバスによって完全に収容されうる化合物を含む、腔、割れ目、ポケットまたはクレバスによって収容されうる官能基を含む化合物は、次に、インビトロアッセイで試験され、それらが標的−修飾因子相互作用を変調するか否かについて決定される。
【0015】
本発明は、炎症状態に苦しむ個人を治療するための医薬組成物および方法に関する。
本発明は、医薬組成物に関連し、非所望の免疫応答または免疫学的状態に苦しむ個人を治療するための方法を開示する。
【0016】
本発明は、医薬組成物に関連し、細菌感染症に苦しむ個人を治療するための方法を開示する。
好ましい実施態様の詳細な説明
ここで用いられる、用語「標的タンパク質」は、修飾因子との分子間相互作用に含まれるタンパク質を指すつもりである。標的タンパク質は、細胞内タンパク質および細胞外に存在するタンパク質であることができる。標的タンパク質としては、例えば、限定するつもりはないが、膜結合タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、酵素、サイトカイン、リンホカイン、ケモキン、粘着性分子、成長因子、またはそのようなタンパク質のレセプターを挙げることができる。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、腫瘍壊死因子(TNF)(tumor necrosis factor) レセプターを含むTNFレセプターファミリ、fas、CD40、gp30、およびfasリガンド、TNFα、CD4、β−ラクタマーゼ、c−erB2 p185翻訳生成物、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン、インスリンレセプター、インスリン、IL−1レセプター、IL−1、IL−2レセプター、IL−2、表皮成長因子レセプター(EGFR)(epidermal growth factor receptor)、および表皮成長因子(EGF)(epidermal growth factor) である。標的タンパク質は、その三次元構造の一部分として腔、クレバスの割れ目グローブポケットを持っていなければならない。
【0017】
ここに用いられている、用語「修飾因子」は、標的タンパク質との分子間相互作用に関与する化合物を指すつもりである。修飾因子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのようなタンパク様分子、または糖、多糖、核酸分子またはその他の非タンパク様有機あるいは非有機分子のような、非タンパク様分子であることができる。用語「修飾因子」は、本明細書中では、用語「リガンド」と交換して用いることができる。タンパク様修飾因子の例としては:膜結合タンパク質、サイトゾルタンパク質、および核タンパク質のようなタンパク質;および、タンパク様酵素基質、サイトカイン、リンホカイン、ケモキン、粘着性分子、成長因子またはそのような分子のレセプターのようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド:が含まれる。いくつかの実施態様では、「修飾因子」は、TNFレセプター、fas、CD40、gp30、およびfasリガンド、TNFα、CD4、β−ラクタマーゼ、c−erbB2 p185翻訳生成物、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン、インスリンレセプター、インスリン、IL−1レセプター、IL−1、IL−2レセプター、IL−2、表皮成長因子レセプター(EGFR)(epidermal growth factor receptor)および表皮成長因子(EGF)(epidermal growth factor) を含む、TNFレセプターファミリーである。
【0018】
ここに用いらている、用語「分子間相互作用」は、標的タンパク質とも呼ばれるタンパク質と、修飾因子とも呼ばれる第二の分子との間に起こる相互作用を指すつもりである。相互作用は、標的タンパク質:修飾因子相互作用部位と呼ばれる標的タンパク質上の部位で起こる。分子間相互作用には、例として、会合、オリゴマー化、結合および配座/構造混乱(conformational/structural perturbances)が含まれる。標的タンパク質と修飾因子の間の分子間相互作用は、結果として、ある環境で所望される、ある生物活性の強化または阻害を生じる。生物活性を生じる分子間相互作用の例としては、酵素による基質のプロセシング、リガンド誘導シグナル導入、アロステリックモジュレーター、オリゴマー化によるシグナル導入、および、タンパク質小分子結合(アンタゴニスト/アゴニスト)が含まれる。
【0019】
ここに用いられている、用語「標的タンパク質:修飾因子相互作用部位」は、標的タンパク質と修飾因子との間で相互作用が起こる標的タンパク質上の位置を指すつもりである。標的タンパク質が酵素であり修飾因子が酵素基質である例では、例えば、標的タンパク質:修飾因子相互作用部位は、また、触媒部位とも呼ばれる。標的タンパク質がレセプターである例では、例えば、標的タンパク質:修飾因子相互作用部位は、また、結合部位とも呼ばれる。標的タンパク質がイムノグロブリンスーパーファミリーのメンバーであるようなある例では、標的タンパク質:修飾因子相互作用部位は、修飾因子と直接相互作用する標的タンパク質の部分を明確にする、相補性決定領域(CDRs)(complementarity determining regions) またはループである。
【0020】
ここで用いられる、用語「腔」「割れ目」、「ポケット」、「グローブ」および「クレバス」は、交換して用いることができ、例えば水分子のような少なくとも一つの溶媒を収容することのできる標的タンパク質上の分子表面または位置を指すつもりであるが、いくつかの腔は、溶媒和化されないかもしれない。同定方法には、水分子に近い半径1.4Åの球状プローブを用いて分子表面を探知する分子モデルを用いることが含まれる。腔は、水分子を収容することができる、即ち、水分子の等価な大きさであるプローブは、腔内に適合することができる。従って、腔は、測定されうる寸法(dimension)および容量を持つ。
【0021】
ここで用いられる、用語「機能的に重要な部位」は、機能の変化または仲介、望ましい変調のいずれかに関与する標的タンパク質上の部位または領域または位置または二次構造エレメントを指すつもりである。本発明のいくつかの実施態様では、機能とは、酵素である標的タンパク質によって、酵素基質である修飾因子をプロセシングできることであり、機能的に重要な部位とは、触媒部位である標的タンパク質:修飾因子相互作用部位であり、望ましい変調とは、酵素によってプロセシングされる基質を阻害することである。本発明のいくつかの実施態様では、機能とは、標的タンパク質に修飾因子を結合させうることであり、機能的に重要な部位とは、結合部位である標的タンパク質:修飾因子相互作用であり、望ましい変調とは、標的タンパク質−修飾因子結合を阻害することである。機能的に重要な部位のその他の例としては、標的タンパク質の表面、オリゴマーとの界面、およびオリゴマーによって安定化されるループが含まれる。
【0022】
ここに用いられている、用語「近位」("proximal")は、用語「隣接」と互換性があり、測定可能距離にある腔および機能的に重要な部位とは別の位置を指すつもりである。本発明では、腔は、機能的に重要な位置とは別の位置にある。2つの位置は、互いに別個であり、その故、化合物の官能基が腔を占拠する場合に起こる機能的に重要な位置の修飾は、アロステリック修飾である。もし、機能的に重要な部位を、標的タンパク質と腔に収容されうる化合物の少なくとも一つの官能基の間の分子相互作用によって変化させることができるならば、腔は機能的重要部位の近位にある。好ましい実施態様では、機能的重要部位に対して近位にある腔は、一般的には、機能的重要部位まで約15−20Åである。
【0023】
ここに用いられている、用語「変調する」は、そのような分子間相互作用に関与する分子表面をアロステリック修飾する、本発明の化合物に起因する分子間相互作用上への影響を指すつもりである。そのような化合物は、「モジュレーター」と呼ばれる。ある実施態様では、モジュレータに起因する影響は、分子間相互作用の阻害であり、そのような場合のモジュレーターは、「インヒビター」である。ある実施態様では、モジュレーターに起因する影響は、分子間相互作用の強化であることができ、そのような場合のモジュレータは、「エンハンサー」である。
【0024】
本発明によると、そのような分子間相互作用に含まれる分子表面をアロステリック修飾するために、分子間相互作用のインヒビターまたはエンハンサーのようなモジュレーターを同定または設計することができる。このように、結合部位または修飾部位のような機能的重要部位に近位の腔を持つ標的タンパク質と第二の分子、タンパク質であってもなくても良い修飾因子、の間の任意の分子間相互作用は、本発明に従って同定された化合物を用いて、影響されうる。
【0025】
本発明は;1)機能的重要部位に近位の腔を同定し、2)腔の物理的パラメーターを測定し、3)腔によって収容されうる官能基を同定し、そして4)インビトロアッセイ内にそのような官能基を含む化合物を試験して、そのような化合物が活性であるか否かを決定する;ことを含む、一連の段階を含む。
【0026】
本発明では、標的タンパク質は、修飾因子と相互作用しなくてはならず、機能性部位の近位に腔を持つ。日常実験で行うことのできる、機能的重要部位および標的タンパク質の腔または修飾因子を同定することによって、そのような腔は、もし機能的重要部位の近位にあるならば、修飾因子とのその相互作用について標的タンパク質の活性を修飾できる化合物の標的であることができることを発見した。修飾因子との相互作用は、標的タンパク質に帰する特異的生物機能を必要とするので、標的タンパク質:修飾因子−相互作用の阻害は、そのような相互作用と関連する生物機能を阻害する。同様に、標的タンパク質:修飾因子−相互作用の強化は、そのような相互作用と関連する生物学的機能を強化することができる。
【0027】
標的タンパク質上の機能的重要部位を同定する手段は、数多くあり、変更でき、周知である。例えば、酵素の活性部位または触媒部位の同定、およびレセプターまたはリガンドの結合部位は、周知である。標的タンパク質の機能的重要部位は、限定するつもりはないが、結晶または核磁気共鳴(NMR)画像を用いて、結晶構造からの標的タンパク質原子上の熱β−ファクターまたはNMRシグナルから推論された可動性ループのいずれかによる画像診断、または、化合物の微量熱量測定分析または分子の変異分析として、標的タンパク質構造上のβ−ファクターを同定すること;イムノマッピングを含む標的タンパク質のタンパク質、ペプチドあるいはペプチド疑似体マッピング;および、標的タンパク質構造上のCDRsを同定すること;を含む、さまざまな異なる方法によって同定することができる。β−ファクターは、結晶学的研究から熱パラメーターのような可動性を明らかにするパラメーターである。熱β−ファクターは、X線回析によって決定された3D構造内の原子の無秩序な(可動性)特質を反映するパラメーターである。構造を、X線回析で決定した場合、β−ファクターを決定するために必要なデータは、屈折強度として測定される。これらのデータのフーリエ変換分析から、分子間の原子と関連するβ−ファクターが分かり、β−ファクターは常に結晶構造分析の部分として決定される。これらのβ−ファクターは、分子間での原子の無秩序性または可動性を反映している。また、熱力学研究からの熱量測定値を用いて、標的タンパク質の機能的重要部位を同定することもできる。また、可動領域の同定に有用なアルゴリズムもまた、記載されている。このアルゴリズムおよびその用途は、Daquino,J.A.ら、1996,Proteins,25:143−156;Gomez,J.ら、1995,Journal of Molecular Biology,252:337−350;Hilser,V.J.ら、1996,J.Mol.Biol.,252:756−772;およびXie,D.ら、Protein Science,3:2175−2184に記載されており、そのそれぞれをここに参照として採用する。
【0028】
標的タンパク質の腔は、限定するつもりはないが、結晶構造分析、NMRおよびコンピューターモデルを含む、任意のさまざまな周知の技術によって同定できる。腔の大きさは、少なくとも1分子の水を収容することができるはずである。タンパク質表面上の腔を同定する技術は、周知であり、例として、”Protein Engineering”、Dale,L.編、Oxender,C.Fred Fox,Liss Co.,New York,1987(結晶学およびNMR)および”Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design”,N.Claude Cohen編、Academic Press,1996,San Diego,Calif.1996(コンピューターモデリング)、に記載されており、ここにそのそれぞれを参照として採用する。表面が水を収容できるか否かを決定するために、タンパク質のコンピューターモデルを用いて、水分子の大きさと同様の大きさである半径1.4Åの小球体を用いて、表面を試験した。プローブ球体に触れる原子を、表面原子としてマークした。連続表面としての表面原子のマッピングは、表面の外面的形態を明らかにする。次に、外面的形態は、腔の分類を可能にする。腔に近位であることは、機能的重要部位と同一位置にあってはならないことである。
【0029】
ひとたび、機能的重要部位に近位である腔が同定されるならば、ある種の物理的パラメーターが確かめられる。そのようなパラメーターには、少なくとも一つ、好ましくは1以上の以下のパラメーター:腔の容量および寸法が測定、さもなくば計算される;腔の静電的性質および/または腔の化学的性質、即ち、腔の疎水性/親水性をマッピングすることができる;が含まれる。このように、腔内部は、腔内部の容量および寸法および/または腔内部の静電的性質の地図および/または腔内部の化学的性質の地図、によって明らかにされる。
【0030】
いくつかの実施態様では、(1水分子に等しい)1.4Åのプローブ球体をローリングすることによって、腔内部の容量および寸法を測定し、表面を形成させることができる。次に、近づきやすい表面を、数多くのその他のプログラムの中から、自由に入手できるプログラムMS(Michael S.Connolly)を用いて、計算する。MSは、QCPE(QCPE,Creative Arts Bldg.,181,Indiana University,Bloomington,IN47405)から入手可能であり、また、INSIGHTおよびQUANTA(両方とも、Molecular Simulations,Inc.San Diego,CAから入手可能)の様なさまざまな図面用ソフトウェア内に組み込まれている。さらに、Kleywegt,G.J.ら、1994、Acta,D50,178−185(ここに参照として採用する)に記載されたプログラムを用いると、腔を検出し、測定し、特徴付けることもできる。
【0031】
腔の静電的性質および化学的性質、即ち疎水性/親水性を、マッピングすることができる。プログラムGENSITESを用いて、結合領域内の残基を、部位点(水素結合、疎水性相互作用を形成する能力を持つ原子)について分析する。DOCKの部分であるSPHGENのようなその他の等価なプログラムもまた、用いることができる。DOCKプログラムは、Kuntz教授の研究室,University of California at San Francisco,San Francisco,CA.から入手できる。プログラムは、標的タンパク質の分子表面上を転がす異なる大きさの球体の表面への近づきやすさの差を基にして可能な位置を同定する。内部表面の寸法、チャージおよび化学的性質と関係する腔内部の三次元地図を作成する。
【0032】
ひとたび、腔の物理的パラメーターが確認されると、腔に収容されうる官能基を同定する。そのような官能基は、それらが腔内部に適合できるような適当な大きさでなければならない。さらに、官能基は、腔内部と静電的および化学的に適合しなければならない。即ち、官能基は、結果として、腔内部を占領することにより官能基を阻害または妨げるであろう力を跳ね返すと言うよりはむしろ、腔内部に官能基が攻撃する力を生じるであろう、静電的性質および化学的性質を持つべきである。腔内に開かれた部位点を用い、可能な分子フラグメントを、プログラムLUDIを用いて同定する。LUDIは、Molecular Simulations,Incから入手できるINSIGHTの一部分である。CAVEATとよがれるQUANTAからのもう一つのプログラムもまた、Moleccular Simulations,INC.から入手でき、これを用いると、腔に収容されうる官能基を同定することができる。
【0033】
いくつかの好ましい実施態様では、形態相同性は、異なる部分を持つフラグメントを検出するための最初のスクリーニングとして用いられる。分子モデル化研究法は、部位が比較的硬直していること、および標的タンパク質/モジュレーター結合時の分子間エネルギー変化が標的タンパク質/修飾因子配座間の相互作用エネルギーと比較して小さいことを仮定する。それ故、結合様式は、モジュレーター上の(Cartesian配位として表される)どの分子点が結合部位のどの部位点(Cartesian配位)と結合するはずであるかを、明快に示している。フィッティング方法は、次にドッキングする相補的表面を持つ共通表面形態の同定と等価である。
【0034】
2つの相補的表面間のドッキングは、既知の形態学でさえ、徹底的な方法であることができる。第一に、プローブ球体は、結合分子の原子によって占領することのできる可能な位置座として、結合表面上を転がされる。座のこの連続体は、それぞれの残基に位置する識別点のセットを減少させ、型を指定することができる。それぞれの部位点に関するさらなる型指定は、その3つの最も近い近隣残基を含むこの残基の比較形態学的記載に依存して、与えられる。これらの点は、LUD1データベース内で同定された適合フラグメントについての領域を明らかにする。複合体は、相対配向を最適化し、複合体形成時に誘導される標的タンパク質内の配座変化をモニターするための、エネルギー最小化および分子動的計算に委ねられる。この方法は、AUTODOCK(Goodsellら、1996,ここに参照として採用される)およびLIGIN(Sobolevら、1996,ここに参照として採用される)またはドッキングアルゴリズムを用いる任意のその他の等価のプログラムを用いて行われる。これら2方法は、結合性を強化するための配座可動性および可能な化学修飾の両方の探究を可能にする。この研究方法は、近隣残基と作用することのできる可能性のある官能基を結合し同定することのできる分子の大きさの評価を提供し、部位点の配置に基づいた新規分子構造を開発する方法を提供する。
【0035】
部位点を基にした新規の分子化合物は、合成での困難および生物学的アッセイでの適合性に遭遇するであろう。この障害を打ち負かすために、大規模三次元化学構造データベース(MDL Corp,San Leandro,CA)をサーチし、化合物を同定した(Good,A.C.ら、1995,J.Comput.Aided Mol.Des.,9:1−2;Kuntz,I.D.,1992,Science,257:1078−1082;および、Li,S.ら、1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94:73−78;ここにそのそれぞれを参照として採用する)。化学的データベースを用いる長所は:(1)より多き化合物内に容易に取り込まれうる小フラグメントに対する新規分子をサーチする唯一の好機を提供し、そして(2)それらの入手しやすさ、合成形路、毒性および溶解性等の知識から化学化合物の選択を容易にする、二点である。最近では、三次元構造化学データベースは、約250,000の小分子を含む。医療的に有用な化合物を、DOCK(Good,A.C.ら、1995,J.Comput.Aided Mol.Des.,9:1−12、およびGoodsell,D.S.ら、1996,J.Mol.Recogn.,9:1−5、ここにその両方を参照として採用する)アルゴリズムを用いて、化学データベース内で、同定することができる。腔は、疎水性、水素結合のような最大相互作用および配座サーチによる相補的静電的性質についてのデータベースからのそれぞれの小分子で調査する。結合エネルギーに基づいて、分子を分類し、例えばトップの200化合物を選択する。さらに、改めてリガンド設計から構築された一つと類似した分子を、三次元的に窮屈なフラグメントサーチを用いて、データベース内で同定することができる。データベースサーチ(DOCK)およびフラグメントサーチの両方によって得られた列挙された短い分子を用いて、MDL’s project library softwareを用いて小化学データベースライブラリーを作り出す。医薬化学および薬理学のQuantitative Structure Activity Relation(ASAR)分析は、オリジナルデータセットのそれらと化学的に類似している分子の断定に、有用に提供された。QSARに向けられた距離結合構造は、物理/化学パラメーターからのその非依存性によりより広いクラスの化合物を試験することを可能にする。ライブラリー内の分子を、共通モチーフについて比較し、3D−QASRに類似した分析を、ASPおよびTSAR(Oxford Molecular,Oxford,England)を用いて行い、最大結合エネルギーについての適当な官能基を見出す。
【0036】
同定に次いで、さまざまな研究方法またはその組み合わせの一つによって選択された化合物を、インビトロアッセイで生物活性について評価し、それらが標的−修飾因子相互作用を変調するか否かについて決定する。結果として検出可能シグナルまたは表現型を生じる分子間相互作用を知るために、または分子間相互作用の阻害が、結果として検出可能シグナルまたは表現型を生じることを知るために、生物学的アッセイを用いる。そのようなアッセイを用いて、同定された化合物の存在下または不在下で比較アッセイを行い、化合物の生物活性を確かめる。
【0037】
本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって同定された成分を含み、さらに、例えば、食塩水のような、医薬として許容しうるキャリヤーまたはベヒクルを含む。化合物の成功裡の配達を可能にする任意の媒質を用いることもできる。当業者らは、本発明に用いることのできる医薬として許容しうる多数の媒質を容易に理解するであろう。用語「医薬的に」は、当業者には、周知であり、広く理解されている。ここに用いられている「医薬組成物」または「注入しうる医薬組成物」、は、当業者らによって理解されている本来の意味を持つことを意味している。注入可能な医薬組成物のような医薬組成物は、無菌性、発熱物質、特定物質ならびに等張性、pH、即ち、なかんずく、無菌性、発熱物質非含有および特定物質非含有、に関して特定標準に合わせる必要がある。
【0038】
当業者らは、医薬組成物を、選択された投与様式に依存して選択された組成物と共に、調合することができる。適当な医薬キャリヤーは、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版、A.R.Gennaro編、Mack Publishing Company、Easton,P,A,(この分野での標準的参考書、ここに参照として採用する)に、記載されている。
【0039】
本発明の医薬組成物を、活性薬剤が哺乳動物体内の薬剤作用部位に到達できるような任意の手段によって、投与することができる。医薬組成物を、非経口、即ち、腫瘍内、静脈内、皮下、細胞内、に投与することができる。静脈内および腫瘍内投与は、好ましい経路である。例えば、筋肉内注射が選択された投与様式である場合、等張調合物を用いることが望ましい。一般的に、等張のための付加物は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含むことができる。ある場合には、リン酸塩緩衝溶液のような等張溶液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
【0040】
投与量は、特定薬剤の薬力学的性質のような既知の因子、および投与の様式および経路;レシピエントの年齢、健康状態および体重、症状の性質および範囲、同時治療の種類、治療頻度および所望される効果、に依存して変化する。
実施例
実施例1
本発明の一つの実施態様では、CIAM技術を用いて、腫瘍壊死因子(TNF)レセプターとTNFα間の相互作用を阻害する化合物を同定する。
【0041】
腫瘍壊死因子レセプターは、複合体および非複合ポリペプチドの両方としての原子を詳細に研究されている最初のレセプターの一つである。TNFレセプターンの複合形および非複合形の両方の結晶構造は、これらレセプターがそれらのリガンドと結合し(Banner,D.ら、1993,Cell,73:431−45;Eck,M.J.ら、1989,J.Biol.Chem.,264:17595−605;およびEck,M.J.ら、1992,J.Biol.Chem.,267:2119−22;ここにそのそれぞれを参照として採用する)、会合したリガンドは、配座変換を誘導する、という一般的理解を提供する。TNFレセプターファミリー内のシステインノットは、3つの鎖内ジスルフィド結合を形成する6システインを含む42アミノ酸残基からなり、構造モチーフを作り出す。三次元構造は、長さ約30Åのシステイン-ノット繰り返しがレセプターの片側にループを露出したhead−to−tail様式で配列されていることを、示している。これらのループは、オリゴマー化またはリガンド結合のいずれかに含まれる。非複合TNFレセプターは、ダイマーとして認められる。ダイマー形では、第一および最後のシステインドメインがダイマー接触に含まれる。膜近位ドメインは、多分、安定状態でこのドメインを正常に保つトランスメンブランの欠如により乱されている。TNFレセプターおよびTNFβ複合体の結晶構造分析は、”WP5”、”WP8”および”WP9”と名付けられた、3つの明確な結合部位があることを示している。
【0042】
最もエネルギッシュな適切な結合部位を理解するために、ペプチドをプローブとして用いて、いくつかの環状ペプチドを種に関して開発した。
ペプチド疑似体を、TNFレセプターの3つの表面ループ:ドメイン1のループ(56−73);ドメイン2のループ(76−83)およびドメイン3のループ(107−114)(図1A):のすべてから開発し、試験した。ペプチド疑似体は、Takasaiら、1997,Nature Biotechnology,15:1266−1270(ここに参照として採用する)に詳細に記載されている。第三ドメインから設計されたペプチド疑似体(WP9QY)は、そのレセプターへのTNFα結合を阻害した(IC50=75mM)。また、ペプチド疑似体は、ペプチドが特異的にTNFαと結合すると考えられる7pgのTNFαでアポトーシスを誘導する場合、細胞死を誘導するTNFαに対して細胞を防御した。ペプチド疑似体(WP9QY)は、抗−TNFα活性を示す第一ペプチドの一つである(図1B)。
【0043】
ペプチド疑似体分析によって同定されたTNFレセプターの第3ドメイン内の小ループの効果を基にして、アロステリックインヒビターのドッキングに利用することのできる大きい割れ目を同定した。腔は:深さ8Å、長さ17.6Åおよび幅12.4Å:の浅さである(図2A)。腔の壁は、TNFα結合を含む残基によって形成されている。一つの結合部位(WP9)の近くの大きな割れ目は、上記方法から設計された小分子を用いて、アロステリック効果によってこれらのループをかき乱すために用いられた(DesJarlais,R.L.ら、1986,J.Med.Chem.,29:2149−2163;DesJarlais,R.L.ら、1988,J.Med.Chem.,3:722−729;Good,A.C.ら、1995,J.Comput.Aided Mol.Des.,9:1−12;Gschwend,D.A.ら、1996,J.Mol.Recogn.,9:175−186;Shoicet,B.K.ら、1991,J.Mol.Biol.,221:327−346;Strynadka,N.C.ら、1996,Nat.Struct.Biol.,3:233−239;およびStrynadka,N.C.ら、1996,Nat.Struct.Biol.,3:290−297、ここにそのそれぞれを参照として採用する)。約232の構造適合分子を、約10000の構造を含むMDL(MDL corporation,San Leandro,CA)構造化学データベースを用いて構築した小化学データベースの最初のスクリーニングから選択した。さらなる分析は、それらのすべてが溶解度および毒性に基づく生物学的実験に貢献するわけではないことを示した。試験の目的で、4化合物を生物活性について試験したが、特異性および反応速度論については試験しなかった。化合物を、標準MTTアッセイ(Hansen,M.B.ら、1989,J.Immunol.Meth.,119:203−210、ここに参照として採用する)を用いて、アポトーシスについて試験した。一つの化合物、結合エネルギー−40Kcal/mol(図2B)を持つS7は、MTTアッセイで活性を示した(図2C)。これらの結果は、小分子を偽のアロステリックインヒビターとして開発できることを示している。
【0044】
本発明は、標的タンパク質であるTNFレセプターと修飾因子であるTNFの間の腔誘導アロステリック修飾(CIAM)(cavity induced allosteric modification)とよばれるアプローチに於ける、特定ループの配座を修飾するための新規のストラテジーを提供する。このストラテジーは、TNFレセプターの既知の結晶構造を用いる。標的タンパク質の表面を、1.4Åのプローブ球体(水分子に等しい)をローリングすることによって、作成した。接近しやすい表面を、プログラムMSを用いて計算した(Connolly,M.L.ら、1993、J.Mol.Graph,11,139−141およびLangridge,R.ら、1981、Science,211,661−666;ここにその両方を参照として採用する)。標的タンパク質の分子表面上をローリングする異なる大きさの球体の表面接近性の違いに基づいて可能な位置を同定するプログラムGENSITESを用いて、結合領域内の残基を部位点(水素結合、疎水性相互作用を形成する能力を持つ原子)について分析した。腔内で開発された部位点を用いて、可能な分子フラグメントを、プログラムLUDIを用いて同定した(Bohm,L.W.ら、J.Mol.Recogn.,6,131−137、ここに参照として採用する)。形態相同性を、異なる部分を持つフラグメントを検出する最初のスクリーニングをして用いた。分子モデル化研究方法は、部位が比較的固定しており、リガンド/インヒビター結合時の分子間エネルギー変化がレセプター/タンパク質コンフォメーション間の相互作用エネルギーと比較して小さい、と仮定する。それ故、結合様式は、インヒビター上の(Cartesian配位として明示された)どの分子点が、結合部位のどの部位点(Cartesian配位)と結合すべきかを、明確にする。フィッティング方法は、次に相補的表面のドッキングを含む共通表面形態の同定と等価である。
【0045】
2つの相補的表面間のドッキングは、既知のトポグラフィーを伴ってさえ、消耗的な方法でありうる。しかしながら、結合表面上の部位点をコンピューティングすることによって、問題の次元を一つ減らすことができる。第一に、プローブ球体を、結合分子の原子によって占領されうる可能な位置の座として、結合表面上をローリングさせる。この座の連続体は、それぞれの残基に位置し型を指定する1セットの識別点に縮小させることができる。それぞれの部位点についてのさらなる型指定は、この残基の3つの最も近位の近隣との相対的幾何学的作図に依存して与えられる。これらの点は、LUDIデータベースで同定された適当なフラグメントについての領域を明らかにする。複合体を、エネルギー最小化および分子動力学計算に委ね、相対方向を最適化し、複合体形成時に誘導されるリガンドの配座変化をモニターする。この方法は、AUTODOK(Goodsell,D.S.ら、1996,J.Mol.Recogn.,9:1−5、ここに参照として採用する)およびLIGIN(Sobolevら、1996,Proteins,25:120−129、ここに参照として採用する)を用いて行われる。これらの2つの方法は、結合性を強化するための配座可動性および可能な化学修飾の両方の探究を可能にする。この研究方法は、結合できる分子サイズの評価を提供し、近隣残基と相互作用できる可能な官能基を同定し、そして、部位点の配置に基づいて新規の分子構造を開発する方法を提供する。時として、部位点に基づく新規の分子化合物は、合成の難しさと生物学的アッセイへの適合性に遭遇する。
【0046】
この障害に打ち勝つために、大きい三次元化学構造データベース(MDL Corp,San Leandro,CA)をサーチして、化合物を同定する(Good,A.C.ら、1995,J.Comput.Aided Mol.Des.,9:1−12;Kuntz,I.D.、1992,Science,257:1078−1082;および、Li,S.ら、1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,94:73−78、ここにそのそれぞれを参照として採用する)。化学的データベースを用いる利点は:(1)より大きい化合物内に容易に取り込まれうる小フラグメントに対する新規分子をサーチするための唯一の機会を提供する、そして(2)化学化合物の選択を、それらの入手性、合成形路、毒性および溶解性等の知識から促進する:の2点である。最近では、三次元構造化学データベースは、約250,000の小分子を含んでいる。治療上有用な化合物を、DOCK(Good,A.C.ら、1995,J.Comput.Aided Mol.Des.,9:1−12、およびGoodsell,D.S.ら、1996,J.Mol.Recogn.,9:1−5、その両方をここに参照として採用する)アルゴリズムを用いて化学データベース内で同定することができる。腔を、疎水性、水素結合のような最大相互作用、および配座サーチによる相補的静電性について、データベースからの個々の小分子で探る。結合エネルギーに基づいて、分子を、ランク付けし、トップの200化合物を選択した。さらに、改めてリガンド設計から構築された一つと類似した分子を、三次元的に束縛されたフラグメントサーチを用いて、データベース内で同定することができる。データベースサーチ(DOCK)およびフラグメントサーチの両方により得られた列挙された短い分子を用いて、MDL’sプロジェクトライブラリーソフトウェアを用いて小さい化学的データベースを作る。臨床化学および薬理学での定量的構造活性関係(QSAR)(Quantitative structure activity Relation)分析は、オリジナルデータセットのそれらと化学的に類似ししている分子の予想に有用に提供された。QSARを直示した距離外面的形態は、物理/化学パラメーターからのその独立性故により、広範なクラスの化合物の試験を可能にする。ライブラリー内の分子を、共通のモチーフについて比較し、3D−QSARに類似した分析を、ASPおよびTSAR(Oxford Molecular,Oxford,England)を順番に用いて行い、最大結合エネルギーについて適当な官能基を見出す。最終的に、異なる研究方法から選択された化合物を、生物活性を用いて評価する。
細胞毒性アッセイ
ネズミ繊維芽細胞系L929を、10%FCSを加えたDulbeccoの修飾イーグル培地内に維持し、アッセイのために細胞を接種する直前に、培地を無血清AIM−V培地(GIBCO BRL)で置き換える。L929細胞を96穴のミクロタイタープレート上に接種(2x104 細胞/穴)し、そして空気中5%のCO2 下、37゜Cで20時間インキュベートした。アクチノマイシンD(ACT−D)と、最終濃度1mg/mlで、2時間プレインキュベーションした後、PBS中、37゜Cで1時間プレインキュベーションしたTNFα(7pg)/インヒビター溶液(100−80ml)を穴に加えた。細胞を、50pg/mlに最終調整したTNFαファミリーと共に、37゜Cで7時間、5%CO2 下でインキュベートし、MTT(Sigma)で染色する。簡単に言えば、10mlの10mg/ml MTT溶液をそれぞれの穴に加え、37゜Cで2時間インキュベーションの後、形成されたホルマザンを、100mlの抽出バッファー(20% SDS/50% DMF、pH4.7)と共に、37゜Cで一晩インキュベーションすることにより発色させる。最終的に、発色ホルマザンの光学密度を600nmで測定する。
競合放射受容体アッセイ
PBS(100ml)中に希釈したTNF−レセプターキメラタンパク質(100ng/ml)を、Micro Test III 可動アッセイプレート(Becton Dickinson,San Jose,CA)上、4゜Cで一晩インキュベーションすることにより、免疫化する。1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで、2時間室温でブロックし、次に0.1% Tween 20を含むPBS(PBS−Tw)で洗浄した後、PBS中、37゜Cで1時間、プレインキュベートした125 I−標識化−TNFα(1ng)/インヒビター溶液(100ml)を、TNF−レセプターでコートした穴上に加える。37゜Cで2時間インキュベーションの後、プレートをPBS−Twで洗浄し、結合した放射能活性を、Cobra−γ カウンター(Packard Instruments,Meriden,CT)で測定する。
【0047】
ある実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示した式Iを持つ化合物を含む。式I化合物中、R1およびR2は、独立的に、−H、−OCH3、−CH2CH3、−t−ブチル、3−カルボキシ−4−クロロフェニルアミン、−N−(CH2CH2OH)2および−O(O)C−Phからなる群より選択される。R3は、−H、エチル、−OCH3、−Cl、Br、F、3−カルボキシ−4−クロロフェニルアミン、−N−(CH2CH2OH)2、−t−ブチルおよび−OC(O)−Phからなる群より選択され、結合されるフェニル環の任意の決まった位置に結合するとは限らない。好ましくは、R3 を、フェニル環の1または4位のいずれかに結合する。R4 は、−Br、−Clおよび−Fからなる群より選択される。
【0048】
式Iのある好ましい化合物では:
R1、R2およびR3は−OCH3であり、R3は4位に結合しており、R4は−Clである;
R1およびR2はメチルであり、R3は4位に結合したエチルであり、R4は−Clである;
R1およびR2は−OCH3であり、R3は2位に結合した−Clであり、R4は−Clである;
R1およびR2は−OCH3であり、R3はHであり、R4は−Clである;
R1はHであり、R2およびR3 は3−カルボキシ−4−クロロフェニルアミノであり、R3は4位に結合しており、R4は−Clである;
R1およびR2は−N(CH2CH2OH)2であり、R3は4位に結合したClであり,R4は−Clである;
R1、R2およびR3はt−ブチルであり、R3は4位に結合しており、R4は −Clである;
R1は−OCH3であり、R2およびR3はHであり、R4はClである;または、
R1、R2およびR3はベンゾエートであり、R3は4位に結合しており、R4 は−Brである。
【0049】
いくつかの好ましい式I化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造I−A、I−B、I−C、I−D、I−E、I−F、I−G、I−HまたはI−Iを持つ。
【0050】
これらの化合物は、以下の供給者より入手できる。
化合物 カタログ番号 供給者
I−A F36,700−1 Aldrich,ミルウオーキー、WI
I−B S11,245−3 Aldrich,ミルウオーキー、WI
I−C 00569 Ryan Scientific,パーム島、S.C.
I−D F10,001−3 Aldrich,ミルウオーキー、WI
I−E 00129 George UHE,パラマス、NJ
I−F F37,166−1 Aldrich,ミルウオーキー、WI
I−G S−11,239−9 Aldrich,ミルウオーキー、WI
I−H F−27,721−5 Aldrich,ミルウオーキー、WI
I−I F12,920−8 Aldrich,ミルウオーキー、WI
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示した、式IIを持つ化合物を含む。式IIを持つ化合物中、R1 は、ージフェニルクロロメチル、ージ(4−クロロフェニル)クロロメチル、および4−(ジフェニルクロロメチル)フェニルからなる群より選択され;R2、R3、R4 は、独立的に、−Br、−Clおよび−Fからなる群より選択され、好ましくは−Clである。
【0051】
好ましい式II化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造II−A、II−B、II−CおよびII−Dを持つ。これらの化合物は、以下の供給者らより入手できる。
化合物 カタログ番号 供給者
II−A S5,479−9 Aldrich,ミルウオーキー、WI
II−B S5,755−0 Aldrich,ミルウオーキー、WI
II−C S5,740−2 Aldrich,ミルウオーキー、WI
II−D S5,751−8 Aldrich,ミルウオーキー、WI
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示した式III を持つ化合物を含む。式III 化合物では、R1 はHまたはジエチルアミノであり;R2は−O−または−N(C6H6)−であり、そしてR3は−Br、ClまたはFである。
【0052】
好ましい式III 化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造III−AおよびIII−Bを持つ。
これらの化合物は、以下の供給者より入手できる。
化合物 カタログ番号 供給者
III−A F21,855−5 Aldrich,ミルウオーキー、WI
III−B C−390 Biosynth,ナパービル、IL
実施例2
医薬組成物を、Sigma、Aldrich、ICN、Ryan Scientific,George Uhe(Paramus,NJ)およびBiosynth(Naperville,IL)の様な化学供給会社から市販されている、式I、IIおよびIII の化合物を用いて調製する。医薬組成物は、TNF−仲介疾病、障害および病状に苦しむ個体の治療に有用である。TNF−仲介疾病、障害および状態の例としては、例えば、炎症性疾病および慢性関節リューマチ(RA)(Rheumatoid arthritis)、多発性硬化症(MS)(multiple sclerosis)、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病(IDDM)(insulin dependent diabetes mellitus) 、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節症、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病、潰瘍性大腸炎、狼瘡(SLE)、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症(primary biliary sclerosis) および悪性貧血のような自己免疫病、を含む。本発明に従って、そのような疾病、障害および状態に苦しむ個人を、式I、IIおよびIII を持つ化合物を含む治療上有効量の医薬組成物を投与することにより治療することができる。
【0053】
方法は、TNF仲介疾病の阻害に効果的な治療上有効量の化合物を、哺乳動物、好ましくはヒトに、投与することを含むことができる。任意の特定の例で投与される量は、化合物の薬力学的性質、投与の様式および経路;レシピエントの年齢、健康状態および体重、症状の性質および範囲、同時治療の種類、治療頻度、所望する効果、の様な因子に依存するであろう。
【0054】
本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約1μg−約10g/日の範囲であろうと考えられる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約10mg−約1g/日の範囲であろう。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約100mg−約500mg/日の範囲であろう。本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約1μg−約100mg/kg体重の範囲であり、いくつかの実施態様では、約1μg−約40mg/kg体重であり、ある実施態様では、約10μg−約20mg/kg体重であり、いくつかの実施態様では、10μg−約1mg/kg体重である、と考えられる。
【0055】
医薬組成物は、一回投与で、分割投与で、または放出持続で、投与されることができる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物は,1日当たり複数回の投与で投与されるであろう。ある好ましい実施態様では、化合物は,1日当たり3−4回投与で投与されるであろう。
【0056】
当業者らは、投与形および投与量を、本発明の検討に基づく1回のみの日常実験で決定することができるであろう。
化合物投与法には、カプセル、錠剤および粉末の様な固体投与形、またはエレクシル、シロップおよび乳濁液のような液体投与形で、経口の医薬組成物としての投与を含む。また、化合物を、無菌液体投与形、非経口で、またはキャリヤー内で局所的に、投与することができる。化合物を、医薬調製物の分野で標準的な習慣に従って、投与形内に調合することができる。Remington’s Pharmaceuical Sciences、第18版、A.R.Gennaro編、Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(ここに参照として採用する)を参照のこと。
【0057】
化合物を、ゼラチンカプセル内に挿入するため、または錠剤を形成するために、ラクトース、スクロース、マンニトール、スターチ、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸のような粉末状キャリヤーと混合することができる。錠剤およびカプセルは両方とも、1時間以上にわたって、薬剤を連続放出する持続性放出生成物として、製造することができる。
【0058】
経口投与用の液体投与形は、水、バッファーまたは食塩水の様な医薬として許容しうる希釈剤に加えて、患者受けを増すための着色剤および香味剤を含むことができる。
【0059】
非経口投与では、化合物を、水、油脂、食塩水、水性デキストロース(グルコース)および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、のようなキャリヤーまたは希釈液と混合することができる。非経口投与の溶液は、好ましくは、化合物の水溶性塩を含む。安定剤、抗酸化剤および保存剤もまた、加えることができる。適当な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸、クエン酸およびその塩、およびEDTAナトリウムを含む。適当な保存剤は、塩化ベンズアルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールを含む。
実施例3
本発明の一つの実施態様では、CIAM技術を用いて、CD4とMHC/抗原/TCR複合体の間の相互作用を阻害する化合物を同定する。
【0060】
CD4を阻害することによって、MHC/抗原/TCR複合体と関連するT細胞の活性化を減少させることができ、それ故に、免疫応答が抑制された。CD4複合体の結晶構造は、明確な結合部位を示している。
【0061】
ペプチド疑似体を、CD4の表面ループから開発し試験した。CD4ドメインから工作されたペプチド疑似体は、MHC/抗原/TCR複合体と関連するT細胞の活性化を阻害した。
【0062】
ペプチド疑似体を用いて同定した機能的に活性なアミノ酸配列の位置を用いて、CD4分子の表面を再検討し、偽りのアロステリックインヒビターをドッキングするための用いることのできた大きな割れ目を同定した。腔内部をマッピングし、化学データベースをサーチした。−34Kcal/molの結合エネルギーを持ち、式IVを持つ化合物を同定した。Salor/Aldrich(カタログ#S69,246−8)から市販されているこの化合物は、インビトロでのT細胞活性化アッセイで活性を示した。
【0063】
医薬組成物を、「式」と題した以下の節に示した式IV、VまたはVIの化合物を用いて調製した。医薬組成物は、CD4−仲介疾病、障害および状態に苦しむ個人の治療に有用である。CD4−仲介疾病、障害および状態の例としては、例えば、炎症性疾病、ならびに、慢性関節リューマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病(IDDM) 、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節症、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病、潰瘍性大腸炎、狼瘡(SLE)、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症および悪性貧血のような自己免疫病、が含まれる。本発明に従って、そのような疾病、障害および状態に苦しむ個人を、式IV、V又はVIのいずれかを持つ化合物を含む治療上有効な量の医薬組成物を彼らに投与することにより、治療することができる。
【0064】
方法には、哺乳動物、好ましくはヒトへの、CD4−仲介疾病の阻害に効果的な治療上有効な量の化合物の投与が含まれる。任意の特定の例で投与される投与量は、化合物の薬力学的特性、その投与様式および経路;レシピエントの年齢、健康状態および体重;症状の性質および範囲;同時治療の種類;治療の頻度、および所望する効果、のような因子に依存するであろう。
【0065】
本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約1μg−約10g/日の範囲であろうと考えられる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約10mg−約1g/日の範囲であろう。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約100mg−約500mg/日の範囲であろう。本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約1μg−約100mg/kg体重の範囲であり、いくつかの実施態様では、約1μg−約40mg/kg体重であり、ある実施態様では、約10μg−約20mg/kg/日であり、いくつかの実施態様では、10μg−約1mg/kg/日であろう、と考えられる。
【0066】
医薬組成物は、一回投与、分割投与または持続放出で、投与されることができる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物は、1日当たり複数回の投与で投与するであろう。ある好ましい実施態様では、化合物は1日当たり3−4回投与で投与される。
【0067】
当業者らは、投与形および投与量を、本発明の検討に基づく1回のみの日常実験で決定することができるであろう。
化合物投与法には、カプセル、錠剤および粉末の様な固体投与形、またはエレクシル、シロップおよび乳濁液のような液体投与形で、経口の医薬組成物としての投与が含まれる。また、化合物を、無菌液体投与形、非経口で、またはキャリヤー内で局所的に、投与することができる。化合物を、医薬調製物の分野で標準的な習慣に従って、投与形内に調合することもできる。Remington’s Pharmaceuical Sciences、第18版、A.R.Gennaro編、Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(ここに参照として採用する)を参照のこと。
【0068】
化合物を、ゼラチンカプセル内に挿入するため、または錠剤を形成するために、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸のような粉末状キャリヤーと混合することができる。錠剤およびカプセルは両方とも、1時間以上にわたって、薬剤を連続放出する持続性放出生成物として、製造することができる。
【0069】
経口投与用の液体投与形は、水、バッファーまたは食塩水の様な医薬として許容しうる希釈剤に加えて、患者受けを増すために着色剤および香味剤を含むことができる。
【0070】
非経口投与では、化合物を、水、油脂、食塩水、水性デキストロース(グルコース)および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、のようなキャリヤーまたは希釈液と混合することができる。非経口の投与溶液は、好ましくは、化合物の水溶性塩を含む。安定剤、抗酸化剤および保存剤もまた、加えることができる。適当な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸、クエン酸およびその塩、およびEDTAナトリウムを含む。適当な保存剤は、塩化ベンズアルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールを含む。
実施例4
本発明の一つの実施態様では、CIAM技術を用いて、β−ラクタマーゼを阻害する化合物を同定する。酵素β−ラクタマーゼの阻害は、細菌のペニシリン耐性株をペニシリン感受性にするために有用である。β−ラクタマーゼの活性部位から近い上記の診断基準を持つ腔を、β−ファクターおよび薬効分析によって同定した。
【0071】
β−ラクタマーゼ分子の表面を再調査し、アロステリックインヒビターのドッキングに利用することのできる近位の適当な割れ目を同定した。腔をマッピングし、化学データベースをサーチした。一連の化合物を同定した。これらの化合物を、「式」と題した以下の節に、式VII−XIXとして示した。それらは、Aldrich(Milwaukee,WI;www,sigma−aldrich,com.)、Sigma(www,sigma−aldrich,com.)、Fluka(www,sigma−aldrich,com)、ICN(www.icnpharm,com)、Ryan Scienific(Isle of Palms,SC)、SynTec(Germany)およびBayer(Leverkusen,Germany;www,bayer,com)を含むさまざまな供給会社から市販されている。
【0072】
医薬組成物を、式VII−XIXの群より選択された化合物の一つを用いて、調製する。医薬組成物は、細菌感染症、特に、ペニシリン耐性であるそれら、に苦しむ個人の治療に有用である。本発明に従って、そのような感染症に苦しむ個人を、ペニシリン−誘導抗生物質と組み合わせて、式VII、VIII 、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIIIまたはXIXを持つ化合物を含む治療上有効量の医薬組成物を、かれらに投与することによって治療することができる。
【0073】
方法は、細菌のペニシリン耐性株をペニシリン感受性にするために、β−ラクタマーゼの阻害に有用な治療上有効量の化合物を、哺乳動物、好ましくはヒト、に投与することを含むことができる。任意の特定の例で投与される投与量は、化合物の薬効特性、その投与様式および経路、レシピエントの年齢、健康状態および体重;症状の性質および範囲;同時治療の種類、治療頻度、および所望する効果、の様な因子に依存するであろう。
【0074】
発明の方法に用いられる化合物の毎日投与量は、約1μg−約10g/日の範囲であろうと考えられる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約10mg−約1g/日の範囲であろう。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約100mg−約500mg/日の範囲であろう。本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約1μg−約100mg/kg体重の範囲であり、いくつかの実施態様では、約1μg−約40mg/kg体重であり、ある実施態様では、約10μg−約20mg/kg/日であり、いくつかの実施態様では、10μg−約1mg/kg/日である、と考えられる。
【0075】
医薬組成物は、一回投与で、分割投与で、または持続放出で、投与することができる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物を1日当たり複数回の投与で投与するであろう。ある好ましい実施態様では、化合物は、1日当たり3−4回投与で投与されるであろう。
【0076】
当業者らは、投与形および投与量を、本発明の検討に基づく1回のみの日常実験で決定することができるであろう。
化合物投与法には、カプセル、錠剤および粉末の様な固体投与形、またはエレクシル、シロップおよび乳濁液のような液体投与形で、経口の医薬組成物としての投与を含む。また、化合物を、無菌液体投与形、非経口で、またはキャリヤー内で局所的に、投与することができる。化合物を、医薬調製物の分野で標準的な習慣に従って、投与形内に調合することができる。Remington’s Pharmaceuical Sciences、第18版、A.R.Gennaro編、Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(ここに参照として採用する)を参照のこと。
【0077】
化合物を、ゼラチンカプセル内に挿入するため、または錠剤を形成するために、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸のような粉末状キャリヤーと混合することができる。錠剤およびカプセルは両方とも、1時間以上にわたって、薬剤を連続放出する持続性放出生成物として、製造することができる。
【0078】
経口投与用の液体投与形は、水、バッファーまたは食塩水の様な医薬として許容しうる希釈剤に加えて、患者受けを増すための着色剤および香味剤を含むことができる。
【0079】
非経口投与では、化合物を、水、油脂、食塩水、水性デキストロース(グルコース)および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、のようなキャリヤーまたは希釈液と混合することができる。非経口投与用溶液は、好ましくは、化合物の水溶性塩を含む。安定剤、抗酸化剤および保存剤もまた、加えることができる。適当な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸、クエン酸およびその塩、およびEDTAナトリウムが含まれる。適当な保存剤には、塩化ベンズアルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールが含まれる。
【0080】
いくつかの実施態様では、本発明の方法に用いられる本発明の医薬組成物は、式VII−XVIを持つ式を含む。
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式VIIを持つ化合物を含む。
【0081】
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式VIIIを持つ化合物を含む。
式VIII の化合物は、R1 位に、「式」と題した以下の節に示す、式8−1−1、8−1−2、9−1−3、8−1−4、8−1−5、8−1−6、8−1−7、8−1−8、8−1−9および8−1−10を持つ基を持つことができる。
【0082】
式VIII の化合物は、R2位とR2位に、独立的に、−H、−C1、−C2、−C3直鎖または分枝鎖、−C4直鎖または分枝鎖、−C5 直鎖または分枝鎖、−C6直鎖または分枝鎖、−C7直鎖または分枝鎖、−C8 直鎖または分枝鎖を持つことができる。R2とR3は、好ましくは、互いに同一である。R2とR3は、好ましくは、−Hまたは−C8分枝4−tert−オクチルである。
【0083】
式VIII のいくつかの好ましい化合物には、
R1は8−1−1であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−1であり、R2は4−tert−オクチルであり、そしてR3 は4−tert−オクチルである;
R1は8−1−2であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−3であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−4であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−5であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−6であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−7であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−8であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
R1は8−1−9であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;そして、
R1は8−1−10であり、R2は−Hであり、そしてR3は−Hである;
化合物が含まれる。
【0084】
いくつかの好ましい式VIII 化合物は、「式」と題された以下の節に示す、構造VIII−A、VIII−B、BIII−C、VIII−D、VIII−E、BIII−F、VIII−G、VIII−H、BIII−I、VIII−JまたはVIII−Kを含む。
化合物 源 カタログ番号
VIII-A ALDRICH F28,168−9
VIII-B ALDRICH 25,762−1
VIII-C SIGMA-ALDRICH S68,073−7
VIII-D SIGMA-ALDRICH S15,490−3
VIII-E SIGMA-ALDRICH S15,495−4
VIII-F SIGMA-ALDRICH S15,498−9
VIII-G SIGMA-ALDRICH S15,504−0
VIII-H SIGMA-ALDRICH S15,505−5
VIII-I SIGMA-ALDRICH R17,712−1
VIII-J SIGMA-ALDRICH R17,271−5
VIII-K SIGMA-ALDRICH R17,703−2
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式IXを持つ化合物を含む。
【0085】
式IXは、R1、R2、R3およびR4位に、独立的に、−H、0C6H5Cl、−N(CH3)2、−OCH3、−CH3、−OHまたは−ハロゲン、を持ち、もしハロゲンであれば、Clが好ましい。いくつかの実施態様では、R1は−OCH3、−OHまたはハロゲンであり、もしハロゲンであれば、−Clが好ましい。いくつかの実施態様では、R2は−H、−N(CH3)2、−OCH3、−CH3または−ハロゲンであり、もしハロゲンであれば−Clが好ましい。いくつかの実施態様では、R3 は、−OCH3、−CH3、−OHまたは−ハロゲンであり、もしハロゲンであれば、好ましくは−Clである。いくつかの実施態様では、R4 は、−OC6H5Cl、−OCH3、−CH3または−OHである。
【0086】
いくつかの好ましい式IX化合物は:
R1が−Clであり、R2が−Hであり、R3が−Clであり、R4がOC6H5Clである;
R1が−N(CH3)2であり、R2が−Hであり、R3が−Clであり、R4が−OCH3である;
R1が−OCH3であり、R2が−Hであり、R3が−OCH3であり、R4が−OCH3である;
R1が−Clであり、R2が−Hであり、R3が−Clであり、R4が−OCH3である;
R1が−Clであり、R2が−Hであり、R3が−CH3 であり、R4が−OCH3である;
R1が−OCH3 であり、R2が−Clであり、R3が−Hであり、R4が−OHである;
R1が−0Hであり、R2が−Hであり、R3が−Clであり、R4が−OCH3である;
R1が−OCH3であり、R2が−Hであり、R3が−CH3であり、R4が−OCH3である;
R1が−Clであり、R2が−Clであり、R3が−OCH3であり、R4 が−OCH3である;
R1が−Clであり、R2が−Hであり、R3が−OCH3であり、R4 が−OCH3である;
R1が−OCH3であり、R2が−Hであり、R3が−OCH3であり、R4が−OCH3である;
R1が−OCH3であり、R2が−CH3であり、R3が−Clであり、R4が−Hである;
R1が−0Hであり、R2が−Hであり、R3が−Clであり、R4 が−CH3である;
R1が−OCH3であり、R2が−OCH3であり、R3が−OHであり、R4が−Hである:
化合物を含む。
【0087】
いくつかの好ましい式IX化合物は、「式」と題された以下の節に示す、構造IX−A、IX−B、IX−C、IX−D、IX−E、IX−F、IX−G、IX−H、IX−I、IX−J、IX−K、IX−L、IX−MまたはIX−Nを含む。
化合物 源 カタログ番号
IX-A SIGMA-ALDRICH S50,872−1
IX-B SIGMA-ALDRICH S69,044−9
IX-C SIGMA-ALDRICH S69,613−7
IX-D SIGMA-ALDRICH S69,516−5
IX-E SIGMA-ALDRICH S12,931−3
IX-F SIGMA-ALDRICH S72,315−0
IX-G SIGMA-ALDRICH S69,055−4
IX-H SIGMA-ALDRICH S76,872−3
IX-I SIGMA-ALDRICH S90,369−8
IX-J SIGMA-ALDRICH S90,370−1
IX-K SIGMA-ALDRICH S74,299−6
IX-L SIGMA-ALDRICH S72,956−6
IX-M SIGMA-ALDRICH S91,728−1
IX-N SIGMA-ALDRICH S91,730−3
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式Xを持つ化合物を含む。
【0088】
式Xに従った化合物は、R1 位に、「式」と題した以下の節に示す、式10−1−1、10−1−2または10−1−3を持つ基を持つことができる。
式Xに従った化合物は、R2、R3およびR4位に、独立的に、−H、−NO2、−NH2または−CH3を持ち、R2は好ましくは−Hまたは−NH2である。R3 は、好ましくは、−NO2または−NH2である。R4 は、好ましくは、−Hまたは−CH3である。
【0089】
いくつかの好ましい式X化合物は:
R1が10−1−1であり、R2が−Hであり、R3が−NO2であり、R4 が−Hである;
R1が10−1−2であり、R2が−Hであり、R3が−NO2であり、R4 が−Hである;および、
R1が10−1−3であり、R2が−NH2であり、R3が−NH2であり、R4が−CH3である:
化合物を含む。
【0090】
いくつかの好ましい式X化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造X−A、X−BまたはX−Cを含む。
化合物 源 カタログ番号
X-A RYAN SCIENTIFIC NRB01150
X-B SIGMA S93,056−3
X-C ALDRICH 21,222−9
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XIを持つ化合物を含む。
【0091】
式XIに従った化合物は、R1およびR2位に、独立的に、「式」と題した以下の節に示す、式11−1/2−1、11−1/2−2、11−1/2−3、11−1/2−4、または−H、−NO2 あるいは−OHを持つ基を持つことができる。
【0092】
式XIに従った化合物は、R3位に、−H、−NH2、−OHまたはハロゲンのいずれかを持つことができ、R3 がハロゲンである場合には、−Clまたは−Brが好ましい。
【0093】
式XIに従った化合物は、R3位に、−H、−NH2、−OHまたはハロゲンのいずれかを持つことができ、R3がハロゲンである場合、−Clまたは−Brが好ましい。
【0094】
式XIに従った化合物は、R4位に、−Hまたは−CH(CH3)3のいずれかを持つことができる。
いくつかの好ましい式XI化合物は:
R1は11−1/2−1であり、R2は11−1/2−1であり、R3 は−Hであり、R4は−Hである;
R1は11−1/2−2であり、R2は11−1/2−2であり、R3 は−NH2であり、R4は−Hである;
R1は11−1/2−3であり、R2は11−1/2−3であり、R3 は−Clであり、R4は−Hである;
R1は11−1/2−4であり、R2は−Hであり、R3 は−NO2であり、R4は−Hである;
R1は−NO2であり、R2は−OHであり、R3が−OHであり、R4 が−Hである:
化合物を含む。
【0095】
いくつかの好ましい式XI化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造XI−A、XI−B、XI−C、XI−DまたはXI−Eを含む。
化合物 源 カタログ番号
XI-A SIGMA-ALDRICH S18,982−0
XI-B SIGMA-ALDRICH S18,611−2
XI-C SIGMA S3,634−0
XI-D SIGMA S86,927−9
XI-E SIGMA S53,622−9
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XIIを持つ化合物を含む。
【0096】
式XIIに従った化合物は、R1 位に、「式」と題した以下の節に示したN−ピリジニウム、4−メチル−N−ピリジニウム、4−ジメチルアミノ−N−ピリジニウム、3−メチル−N−ピリジニウム、N−ピリジニウム、2,6ジメチル−N−ピリジニウム、3,5ジメチル−N−ピリジニウム、3−エチル−N−ピリジニウム、12−1−1、12−1−2、または、4−エチル−N−ピリジニウム、4−ベンジル−N−ピリジニウム、N−キノリニルあるいはCH3 を持つことができる。
【0097】
いくつかの好ましい式XII化合物には:
R1はN−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は4−メチル−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は4−ジメチルアミノ−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は3−メチル−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1はN−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は2,6ジメチル−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は3,5ジメチル−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は3−エチル−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は12−1−1であり、R2はNO2である;
R1は12−1−2であり、R2はNO2である;
R1は4−エチル−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1は4−ベンジル−N−ピリジニウムであり、R2はNO2である;
R1はN−キノリニルであり、R2はNO2である;そして、
R1はCH3であり、R2はHである:
化合物が含まれる。
【0098】
いくつかの好ましい式XII化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造XII−A、XII−B、XII−C、XII−D、XII−E、XII−F、XII−G、XII−H、XII−I、XII−J、XII−K、XII−L、XII−MまたはXII−Nを含む。
化合物 源 カタログ番号
XII-A SIGMA S14,318−9
XII-B SIGMA S96,676−2
XII-C SIGMA S14,440−1
XII-D SIGMA S96,664−9
XII-E SIGMA S96,668−1
XII-F SIGMA S96,670−3
XII-G SIGMA S14,386−3
XII-H SIGMA S96,674−6
XII-I SIGMA S96,682−7
XII-J SIGMA S96,677−0
XII-K SIGMA S96,679−7
XII-L SIGMA S96,685−1
XII-M SIGMA S14,675−7
XII-N SIGMA-ALDRICH S67,954−2
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示す、式XIII を持つ化合物を含む。式XIII を持つ化合物は、SIGMA−ALDRICH、カタログ番号S42,591−5、から入手可能である。
【0099】
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XIVを持つ化合物を含む。
式XIVに従った化合物は、R1 位に、−OCH3、−NO2または−ハロゲンのいずれかを持つことができ、もし−ハロゲンであるならば、−Clが好ましい。
【0100】
式XIVに従った化合物は、R2位に、−H、−NO2または−ハロゲンのいずれかを持つことができ、もし−ハロゲンであるならば、−Clが好ましい。
いくつかの好ましい式XIV化合物は:
R1は−Clであり、R2は−Clである;
R1は−OCH3であり、R2は−Hである;
R1は−Clであり、R2は−Hである;そして、
R1は−NO2であり、R2は−NO2である:
化合物を含む。
【0101】
いくつかの好ましい式XIV化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造XIV−A、XIV−B、XIV−CまたはXIV−Dを含む。
化合物 源 カタログ番号
XIV-A SIGMA S6,886−2
XIV-B SIGMA S12,703−5
XIV-C SIGMA S62,321−0
XIV-D SIGMA S24,232−2
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XVを持つ化合物を含む。
【0102】
式XVに従った化合物は、R1 位に、「式」と題した以下の節に示す、−H、−NO2、−FSO2、−CH3、−OCH3、−SO2CH3、15−1−1、15−1−2または15−1−3のいずれかを持つことができる。
【0103】
式XVに従った化合物は、R2位に、−H、−OHまたは−NO2のいずれかを持つことができる。
式XVに従った化合物は、R3 位に、−Hまたは−OHのいずれかを持つことができる。
【0104】
式XVに従った化合物は、R4 位に、「式」と題した以下の節に示す、−H、15−4−1、15−4−2、15−4−3、15−4−4、15−4−5、15−4−6、15−4−7、15−4−8、15−4−9、15−4−10、15−4−11、15−4−12またはハロゲンを持つことができ、R4 がハロゲンである場合−Clが好ましい。
【0105】
いくつかの好ましい式XV化合物は:
R1は−NO2であり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4 は−Clである;
R1は−Hであり、R2は−OHであり、R3は−Hであり、R4は15−4−1である;
R1は−FSO2であり、R2は−NO2であり、R3は−OHであり、R4は−Hである;
R1は15−1−1であり、R2は−NO2であり、R3は−OHであり、R4 は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−Hであり、R4は15−4−2である;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4は15−4−3である;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4は15−4−5である;
R1は−Hであり、R2は−OHであり、R3は−OCH3であり、R4 は15−4−6である;
R1は−OCH3であり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4 は15−4−7である;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4は15−4−8である;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4は15−4−9である;
R1は−OCH3であり、R2は−Hであり、R3は−Hであり、R4 は15−4−10である;
R1は−FSO2であり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4 は15−4−1である;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−Hであり、R4は15−4−12である;
R1は−SO2CH3であり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4は−Hである;
R1は15−1−2であり、R2は−Hであり、R3は−OHであり、R4は−Hである;そして、
R1は15−1−3であり、R2は−NO2であり、R3は−OHであり、R4 は−Hである:
化合物を含む。
【0106】
いくつかの好ましい式XV化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造XV−A、XV−B、XV−C、XV−D、XV−E、XV−F、XV−G、XV−H、XV−I、XV−J、XV−K、XV−L、XV−M、XV−N、XV−O、XV−P、XV−QまたはXV−Rを含む。
化合物 源 カタログ番号
XV-A SIGMA S72,767−9
XV-B SIGMA S72,772−5
XV-C SIGMA S73,689−9
XV-D BAYER CORP. 25/08
XV-E SIGMA S50,245−6
XV-F SIGMA S65,507−4
XV-G SIGMA S78,072−3
XV-H SIGMA S79,426−0
XV-I SIGMA S79,453−8
XV-J SIGMA S80,012−0
XV-K SIGMA S84,486−1
XV-L RYAN NRB01429
XV-M SIGMA S92,407−5
XV-N SIGMA S72,781−4
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XVIを持つ化合物を含む。
【0107】
式XVIに従った化合物は、R1位に、−H、−SO3またはハロゲンのいずれかを持つことができ、ハロゲンである場合−Clが好ましい。
式XVIに従った化合物は、R2位に、−Hまたは−CH3のいずれかを持つことができる。
【0108】
式XVIに従った化合物は、R3 位に、「式」と題した以下の節に示した、−H、−OCH3、−NSO2、−NO2、16−3−1またはハロゲンのいずれかを持ち、R3がハロゲンである場合、−Clが好ましい。
【0109】
式XVIに従った化合物は、R4 位に、−H、−OCH3、−SO3、またはハロゲンのいずれかを持ち、R4がハロゲンである場合、−Clが好ましい。
式XVIに従った化合物は、R5位に、−H、−NO2またはハロゲンのいずれかを持ち、R5がハロゲンである場合、−Clが好ましい。
【0110】
式XVIに従った化合物は、R6位に、−H、−O(CH3)2またはフェニルのいずれかを持つ。
いくつかの好ましい式XVI化合物は:
R1は−Hであり、R2は−CH3であり、R3は−OCH3であり、R4は−OCH3であり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−CH3であり、R3は−NSO2であり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−CH3であり、R3は−0CH2であり、R4は−Clであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−NSO3であり、R2は−CH3であり、R3は−OCH3であり、R4は−SO3であり、R5は−NO2であり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−Hであり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−Hであり、R3は−Clであり、R4は−Clであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−CH3であり、R3は−Fであり、R4 は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−CH3 であり、R3は16−3−1であり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−CH3 であり、R3は−Hであり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−C(CH3)2である;
R1は−Hであり、R2は−CH3であり、R3は−OCH3であり、R4は−OCH3であり、R5は−Clであり、R6は−Hである;
R1は−Hであり、R2は−CH3 であり、R3は−Fであり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Clであり、R2は−Hであり、R3は−Hであり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;
R1は−Clであり、R2は−Hであり、R3は−OCH3 であり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6は−Hである;または
R1は−Hであり、R2は−CH3であり、R3は−Hであり、R4は−Hであり、R5は−Hであり、R6はフェニルである;
化合物を含む。
【0111】
いくつかの好ましい式XVI化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造XVI−A、XVI−B、XVI−C、XVI−D、XVI−E、XVI−F、XVI−G、XVI−H、XVI−I、XVI−J、XVI−K、XVI−L、XVI−MまたはXVI−Nを含む。
化合物 源 カタログ番号
XVI-A SIGMA S53,065−4
XVI-B SYNTEC,ドイツ ST 58/4
XVI-C SIGMA S62,937−5
XVI-D SIGMA S50,191−3
XVI-E SIGMA S21,210−5
XVI-F SIGMA S21,212−1
XVI-G SIGMA S6,965−6
XVI-H SIGMA S6,971−0
XVI-I SIGMA S7,002−6
XVI-J SIGMA S21,225−3
XVI-K SIGMA S21,234−2
XVI-L SIGMA S21,241−5
XVI-M SIGMA S21,243−1
XVI-N SIGMA S63,263−5
XVI-O SIGMA S21,212−1
XVI-P SIGMA S38,916−1
XVI-Q SIGMA S50,242−0
XVI-R SIGMA S62,979−0
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XVIIを持つ化合物(SIGMA S86,927−9)を含む。
【0112】
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XVIIIを持つ化合物(RYAN SCIENTIFIC E191B)を含む。
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式XIXを持つ化合物(SIGMA S12,962−3)を含む。
【0113】
【表1】
【0114】
【表2】
【0115】
【表3】
【0116】
【表4】
【0117】
【表5】
【0118】
【表6】
【0119】
【表7】
【0120】
【表8】
【0121】
【表9】
【0122】
【表10】
【0123】
【表11】
【0124】
【表12】
【0125】
【表13】
【0126】
【表14】
【0127】
【表15】
【0128】
【表16】
【0129】
【表17】
【0130】
【表18】
【0131】
【表19】
【0132】
【表20】
【0133】
【表21】
【0134】
【表22】
【0135】
【表23】
【0136】
【表24】
【0137】
【表25】
【0138】
【表26】
【0139】
【表27】
【0140】
【表28】
【0141】
【表29】
【0142】
【表30】
【0143】
【表31】
【0144】
【表32】
【0145】
【表33】
【0146】
【表34】
【0147】
【表35】
【0148】
【表36】
【0149】
【表37】
【0150】
【表38】
【0151】
【表39】
【0152】
【表40】
【0153】
【表41】
【0154】
【表42】
【図面の簡単な説明】
【図1】 AおよびBは、TNFレセプターの第三ドメインの構造を示している。Aは、結合部位付近のシステイン−ノットループ(WP9)および腔の位置を示している。矢印で示された分子部分は、ペプチド疑似体を設計するための鋳型として用いられたループを示している。Bは、アンタゴニストペプチドによるL929細胞のTNF−α誘導による細胞溶解の阻害を示している。1mg/mlのACT−Dのみ、およびACT−D+50pg/mlのTNFαで得られた吸光度を、それぞれ100%生存および100%細胞毒性と考えた。結果は、3回の独立実験から誘導された平均および標準偏差を示している。
【図2】 A、BおよびCは、TNFレセプターの第三ドメインの小データベースサーチから得られた予備結果を示している。鮮明さのために、レセプタードメインのみを示す。Aは、TNFレセプターのWP9腔を示している。Bは、分子s7が、如何なる化学的最適化も行わずに−40Kcal/molの結合エネルギーを持つ複合体を形成することを示している。この化合物はリガンドの最大結合を化学的に変化させないので、リガンドの反応速度論は行わなかった。Cは、ペプチド疑似体に類似したアポトーシスアッセイで試験した場合の結果、例えば、300μM濃度で約20%保護、を示している。
Claims (11)
- 標的タンパク質の機能的に重要な部位と修飾因子間の分子間相互作用のアロステリックな変調因子である小分子化合物を同定する方法であって:
a)前記標的タンパク質の機能的に重要な部位から15ないし20オングストロームの範囲内ににある標的タンパク質上のアロステリックな腔を同定し;
b) 前記腔の寸法(dimension)を計算し、前記腔の化学的および/または静電的性質をマッピングし;
c) 工程b)において得られた計算された寸法、化学的および/または静電的性質を利用して前記腔によって収容されうる少なくとも一つの官能基を含む小分子化合物を同定し;
d) インビトロでのアッセイで前記化合物を試験して、前記標的タンパク質と前記修飾因子の間の機能的に重要な部位における分子間相互作用を変調する小分子化合物を検出し;
それにより、前記標的タンパク質と前記修飾因子の間の機能的に重要な部位における分子間相互作用のアロステリック変調因子である小分子化合物を同定する
段階を含む方法。 - 標的タンパク質が、膜結合タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、酵素、サイトカイン、リンホカイン、ケモキン、粘着性分子、成長因子、またはそれらのレセプターからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 標的タンパク質がレセプターである、請求項2記載の方法。
- レセプターがTNFレセプタースーパーファミリーのメンバーである、請求項1記載の方法。
- TNFレセプタースーパーファミリーのメンバーが、TNFレセプター、fas、CD40、gp120、fasリガンド、TNFα、β−ラクタマーゼ、c−erB2、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン、インスリンレセプター、インスリン、IL−1レセプター、IL−1、IL−2レセプター、IL−2、表皮成長因子レセプター(EGFR)、および表皮成長因子からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- TNFスーパーファミリーのメンバーがTNFレセプターである、請求項5記載の方法。
- 標的タンパク質がイムノグロブリンスーパーファミリーのメンバーである、請求項2記載の方法。
- 標的タンパク質がCD4である、請求項7記載の方法。
- 標的タンパク質が酵素である、請求項2記載の方法。
- 標的タンパク質がβ−ラクタマーゼである、請求項9記載の方法。
- 標的タンパク質の構造内の腔を同定することが、核磁気共鳴(NMR)、結晶学分析、熱力学研究の比色値、またはコンピューターモデリングを用いることを含む、請求項1記載の方法。
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