JP2021523744A - 脳卒中の血液バイオマーカー - Google Patents

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Abstract

脳卒中は、死亡、身体障害、および医療費に大きく寄与する破壊的な障害である。現在の課題は、治療ウインドウを広げるため併用療法を用いて、遅発性細胞死を予防することである。脳卒中に関して見込みのある診断方法は、バイオマーカーとしての血液中のＲＮＡの使用であり、これは、医薬において新たに出現した分野である。ここで本発明者らは、脳および血液における脳虚血の発症後の遺伝子の発現を研究する。脳および血液に由来するマカクのマイクロアレイ発現データの試験は、虚血性サンプルおよび非虚血性サンプルがそれらの発現プロファイルに基づき区別でき、著しく差次的に発現した遺伝子の大部分が、虚血から６時間後に虚血性のシナリオにおいてアップレギュレートされることを明らかにした。脳および血液において差次的に発現した遺伝子の比較は、遺伝子発現パターンの有意な重複を明らかにした。このデータは、虚血性の脳および血液の間に共通するシグネチャーが存在することを示しており、患者における神経保護薬物の評価のためのコンパニオンバイオマーカーを開発するために虚血性脳卒中を有する患者を特徴づける生検トランスクリプトーム発現プロファイリングのためのツールとしての血液トランスクリプトミクスの開発を支援している。【選択図】なし

Description

本発明は、目的、短期間および長期間の予後を診断するため、ならびにリスク評価のため、特に虚血性脳卒中の治療の有効性をモニタリングするための、脳卒中の血液バイオマーカーおよびその使用に関する。
脳卒中は、世界における死因の第２位であり、身体障害の原因の第３位である（ＭｃＫａｙ ＆ Ｍｅｎｓａｈ， ２００５． Ｔｈｅ ａｔｌａｓ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ （１ｓｔ ｅｄ．）． Ｇｅｎｅｖａ： Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）。局所性脳虚血、すなわち虚血性脳卒中は、梗塞のコアに重篤かつ迅速な組織損傷をもたらす。最初の損傷の後、脳細胞死はゆっくりと進行し、ペナンブラと呼ばれるコアの周辺の異質の領域にまで広がる（Ａｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， １９７７． Ｓｔｒｏｋｅ． ８（１）：５１−７）。虚血性のペナンブラを救出することは、身体障害の観点からアウトカムを改善する（Ｅｍｂｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｌａｎｃｅｔ． ３８４（９９５８）：１９２９−３５）。
今日までに、この急病の唯一の治療上の解決策は、血栓溶解および／または血栓除去を介した血流再開である。しかしながら、短い介入ウインドウ（血流再開では６時間未満、血栓溶解では４時間３０分未満）および出血の変化のリスクのため、ごく一部の急性虚血性脳卒中患者のみが、この処置に適している。たとえば、総合脳卒中センター（ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｔｒｏｋｅ ｃｅｎｔｒｅ）に６時間以内に到着した全患者の中で、１０．５％のみの血管内が、ＡＨＡ／ＡＳＡ基準による血栓除去に適していることが推定されている（Ｖａｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６． Ｓｔｒｏｋｅ． ４７（７）：１８４４−９）。
よって、治療ウインドウを広げる新規の治療上の戦略を開発することが、主要な公衆衛生の問題である。過去に多くの臨床試験が失敗しているが、血流再開が出現するため、血流再開に関連する神経保護が、依然として治療ウインドウを広げるための潜在的に見込みのある戦略であり続けている。増加しているエビデンスから、末梢性のタンパク質、核酸、または脂質が、虚血性脳卒中の診断を確認するためおよび疾患進行をモニタリングするために使用できることが示唆されている。しかしながら今日までに、臨床診療で行われてはいない（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１３． Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ． １５（１）：２７−３７）。
バイオマーカー試験は、疾患の存在、進行、もしくは重症度、または処置の作用を表す、１つまたはいくつかのマーカーの存在の有無を定性的に評価または定量的に測定するために使用され得るイメージング、化学的試験、または他の生物学的な試験を表す。中枢神経系（ＣＮＳ）のイメージングは、大きな発展を遂げてきているが、他方で末梢性の生物学的マーカーの同定は、あまり進歩していない。ＣＮＳの疾患および処置にとって強力なバイオマーカーとして適用される血液バイオマーカーを同定することは、血液は脳と直接接触しないため、現代の神経学において最も重要な課題の１つである。
診断マーカーとしての血液中のＲＮＡの使用は、乳がん、冠動脈疾患、および感染性疾患の診断におけるその臨床適応により支援されている新たに出現した分野である（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ＆ Ｊｉｃｋｌｉｎｇ， ２０１３． Ｂｉｏｍａｒｋ Ｍｅｄ． ７（１）：３７−４７）。さらに、血液中のＲＮＡは、早期臨床試験において神経保護性の作用物質の効果を評価するためのコンパニオン診断として使用され得る。コーディングＲＮＡに関する急性虚血性脳卒中における診断バイオマーカーとしてのＲＮＡの研究は希少であり、これには少数の患者のみが含まれ、その中で急性期の梗塞である患者はごくわずかである（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． ２６（８）：１０８９−１０２； Ｓｔａｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０． Ｓｔｒｏｋｅ． ４１（１０）：２１７１−７）。近年、脳卒中の梗塞の急性期ではないが、リスク因子としての脳卒中において見込みのあるバイオマーカーとしてノンコーディングＲＮＡに特に急速に興味が集まっている（Ｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１７． Ｓｔｒｏｋｅ． ４８（４）：８２８−８３４）。
遺伝子発現の変化を測定するため、脳虚血での多くの実験的な試験においてトランスクリプトーム解析が使用されている。大部分の実験的なトランスクリプトームの試験は、局所的または全体的な虚血性モデルのラットまたはマウスにおいて行われていた（レビューでは、Ｃｏｘ−Ｌｉｍｐｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １５６４：８５−１００を参照されたい）。虚血に加え、げっ歯類の内因的な脳の保護を試験するためのツールとしてプレコンディショニングもまた使用されている。これらげっ歯類でトランスクリプトームを試験するマイクロアレイ試験の結果は、前初期遺伝子、ストレス応答遺伝子、アポトーシス遺伝子、シグナル伝達遺伝子、神経伝達遺伝子、イオンチャネル遺伝子、炎症遺伝子、細胞骨格遺伝子、リボソーム遺伝子、および神経栄養因子遺伝子が、脳虚血の間発現の変化を経ることを示している（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １０８（１−２）：８１−９３； Ｂｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５２：１−１４； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １３７２：１３−２１； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ２２０：１００−８； Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ７７（６）：８４３−５７）。しかしながら、本出願人らの知識では、霊長類では、ごくわずかの実験のみが行われていた（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｎａｔｕｒｅ． ４８３（７３８８）：２１３−７； Ｃｏｏｋ ＆ Ｔｙｍｉａｎｓｋｉ， ２０１２． Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ９（２）：３７１−９）。霊長類は、ヒトと極めて類似しているゲノムおよび解剖学的な相同性を有するため、脳虚血の試験に特有のモデルを表している。たとえば、霊長類およびヒトは両方とも、平坦ではない（ｎｏｎ−ｌｉｓｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ）脳（すなわち皮質に畳み込みを呈する；皺脳）を有しており、これを有さないげっ歯類とは対照的である。さらに、ヒトおよびチンパンジーの両方における大脳皮質のトランスクリプトームは、互いに非常に類似しており、個体の中の領域間よりも個体間でより異なっている（Ｋｈａｉｔｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４（８）：１４６２−７３）。
動物試験からヒトへの適応までの神経保護治療の変換が成功していない理由が主に４つ同定されている（Ｍｏｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． １４６：２３−３４； Ｔｉｍｓｉｔ ＆ Ｍｅｎｎ， ２０１２． Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． ９１（２）：３２７−３２）：
ｉ）前臨床試験の不十分な質：
前臨床試験において、この分野の課題は、前臨床試験における品質スコアの基準、たとえばＳＴＡＩＲ基準（Ｓｔｒｏｋｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｏｕｎｄｔａｂｌｅ （ＳＴＡＩＲ）， １９９９． Ｓｔｒｏｋｅ． ３０（１２）：２７５２−８； Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｓｔｒｏｋｅ． ４０（６）：２２４４−５０）およびヒトでのランダム化盲検試験（Ｌｌｏｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ７（２９９）：２９９ｒａ１２１）の開発を介して、着実に改善している；
ｉｉ）初期の臨床開発における生物学的なコンパニオン薬力学バイオマーカーの不存在：
薬物を開発するためのコンパニオンバイオマーカーは現在ますます使用されている。疾患状態の患者において有効性が安全な用量で達成され得るかどうかに関する確実性を得るために後期のステージで必要とされる大きな投資の前に、比較的短期間のフェーズのＩｂ臨床試験が、関連する疾患を有する少数の患者で行われる。これは、一部の薬力学バイオマーカーの最も重要な適用である（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． ６１（１１）：１３４３−５３）。
ｉｉｉ）ペナンブラを推定するためのフェーズＩＩのヒト試験での予測イメージングバイオマーカーの不存在：
血栓除去に適切である患者を同定するための脳のイメージングに基づく患者の選択は、選択された患者においてペナンブラを救うためのＤＡＷＮ試験において示されるように、現在有用である（Ｊｏｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ． １２（６）：６４１−６５２； Ｃｈａｉｓｉｎａｎｕｎｋｕｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｓｔｒｏｋｅ． ４６（８）：２２３８−４３； Ｎｏｇｕｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１８． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３７８（１）：１１−２１）。神経保護においてほんのわずかの研究のみが、ペナンブラの特徴に基づき選択を行っている（レビューでは、Ｄｏｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ８（３）：２６１−９を参照されたい）。今日、この新規の概念は、血流再開または再灌流を待機しつつ、治療介入に有用な道を提供し得る（Ｈｉｌｌｉｓ ＆ Ｂａｒｏｎ， ２０１５． Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ６：８５）。
ｉｖ）微細な血流再開の不存在：
血栓除去は、その使用が拡散される必要があるが、急性期の虚血性脳卒中で標準的な処置となりつつある。総合脳卒中センターに６時間以内に到着した全患者のうち、１０．５％のみの「血管内」が、ＡＨＡ／ＡＳＡ基準により、血栓除去に「適している」ことが推定されている（Ｖａｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６． Ｓｔｒｏｋｅ． ４７（７）：１８４４−９）。
脳虚血を経た組織における遺伝子発現パターンをより良好に理解することは、診断技術を向上し得る。よって、本発明者らは、脳および血液における脳虚血の発症後の遺伝子の発現を探索した。脳および血液由来のマカクのマイクロアレイ発現データの研究は、虚血性サンプルおよび非虚血性サンプルが、それらの発現プロファイルに基づき区別でき、著しく差次的に発現した遺伝子の大部分が、虚血から６時間後に虚血性のシナリオ（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｃｅｎａｒｉｏ）においてアップレギュレートされることを明らかにした。脳および血液において差次的に発現した遺伝子の比較は、遺伝子発現パターンの有意な重複を明らかにした。驚くべきことに、これらデータは、虚血性の脳と血液との間に共通するコーディングシグネチャーが存在し、これが、患者における神経保護薬物の評価のためのコンパニオンバイオマーカーを開発するため、虚血性脳卒中を有する患者を特徴づけるための生検トランスクリプトーム発現プロファイリングのためのツールとして、血液のトランスクリプトミクスの開発を支援することを示した。
本発明は、対象の脳卒中（ｓｔｏｋｅ）を診断する方法であって、
ｉ）ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定することにより前記対象から得られたサンプル中のシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは前記少なくとも２つのバイオマーカーが、ＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉ）ステップｉ）で決定したシグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｉｉ）前記シグネチャー中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルが前記参照シグネチャー中の同じ少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルよりも高い場合に、前記対象を、脳卒中を罹患していると診断するステップと
を含む、方法に関する。
一実施形態では、対象の脳卒中を診断する方法のステップｉ）は、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含む。
一実施形態では、対象の脳卒中を診断する方法のステップｉ）は、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭの発現レベルを測定するステップを含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、実質的に健常な対象の参照集団におけるバイオマーカーの発現レベルを測定することにより得られる。
一実施形態では、本発明に係る対象の脳卒中を診断する方法は、脳卒中をｓｔｒｏｋｅ ｍｉｍｉｃと区別することを目的とする。
さらに本発明は、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法であって、
ｉ）ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定することにより前記対象から得られたサンプル中のシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは前記少なくとも２つのバイオマーカーがＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉ）ステップｉ）で決定したシグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｉｉ）前記シグネチャー中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルが前記参照シグネチャー中の同じ少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルよりも低い場合に、前記対象が応答を達成すると結論付けるステップと
を含む、方法に関する。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法のステップｉ）は、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭから選択される９つのバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、上記治療の開始前に同じ対象から得られたサンプル中のバイオマーカーの発現レベルを測定することにより得られる。
本発明は、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、
ｉ）ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定することにより前記対象から得たサンプル中のシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは前記少なくとも２つのバイオマーカーが、ＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉ）ステップｉ）で決定したシグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｉｉ）前記シグネチャー中の少なくとも３つのバイオマーカーの発現レベルが前記参照シグネチャー中の同じ少なくとも３つのバイオマーカーの発現レベルよりも高い場合に、前記対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
を含む、方法に関する。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法のステップｉ）は、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭから選択される９つのバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、実質的に健常な対象の参照集団におけるバイオマーカーの発現レベルを測定することにより得られる。
一実施形態では、対象は、脳卒中を経験しており、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、対象が再発性脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定するためのものである。
本発明の方法のいずれかに関する一実施形態では、脳卒中は、虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作、または出血性脳卒中である。
本発明の方法のいずれかに関する一実施形態では、サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、または血清サンプルである。
本発明の方法のいずれかに関する一実施形態では、サンプルは、脳サンプルではない。
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
「脳卒中」は、本明細書中使用される場合、脳のいずれかの部分に対する破壊、減少、または血液もしくは酸素の流れの停止から生じるいずれかの病態を表す。特に、用語「脳卒中」は、限定するものではないが、虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、および出血性脳卒中を包有する。
「虚血性脳卒中」（または「ＩＳ」）は、急性梗塞のエビデンスを伴う、局所的な脳、脊髄、または網膜の虚血により引き起こされる神経機能障害のエピソードである（Ｅａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｓｔｒｏｋｅ． ４０（６）：２２７６−２２９３）。血流妨害の少なくとも４つの異なる原因：
（１）血管中の血餅；
（２）脳から血液を排出する硬膜静脈洞における血餅；
（３）血管を詰まらせる塞栓；および／または
（４）血圧の急激な低下
が存在する。
脳卒中の症状は、患者が最初の損傷を乗り越えた場合、２４時間を超えて持続する可能性があり、多くの場合では持続する。
「一過性虚血発作」または「ＴＩＡ」は、小発作（ｍｉｎｉ−ｓｔｒｏｋｅ）とも呼ばれる、急性梗塞のエビデンスを伴わない、局所的な脳、脊髄、または網膜の虚血により引き起こされる神経機能障害の一時的なエピソードである。ＴＩＡの症状は、病初では、症状が、通常１時間未満または最大２４時間である短時間のみ持続することを除き脳卒中と同じであり得る。ＴＩＡは一時的であり、通常脳組織損傷をもたらさないが、症状の類似性のため、およびＴＩＡがその後の虚血性脳卒中のリスク因子であるため、ＴＩＡを経た患者は、即座に専門家の支援を探すように勧告されている。
「出血性脳卒中」は、脳のいずれかの脈管構造における何らかの断裂からもたらされる脳卒中を表す。
脳卒中を含むかまたは脳卒中で観察されるものなどの病因もしくは症状を含む急性神経性障害の例は、上記に列挙されており、限定するものではないが、脳虚血または脳梗塞（塞栓性閉塞および血栓性閉塞を含む）、急性虚血後の再灌流、周産期低酸素虚血損傷、心停止、およびいずれかの種類（たとえば硬膜外、硬膜下、クモ膜下、および脳内など）の脳内出血を含む。
「対象」は、本明細書中使用される場合、本発明の方法により診断または処置される個体を表す。対象として、限定するものではないが、哺乳類（たとえばマウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトが挙げられる。本発明の文脈では、用語「患者」は、全般的に、本発明の方法に係る診断または処置を求めているかまたは求めたことのある個体を表す。
「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書中使用される場合、対象における特定の病態（脳卒中など）の軽減、病態（脳卒中など）の症状の排除もしくは低減、病態（脳卒中など）の進行の遅延もしくは排除、および病態（脳卒中など）の最初の発症の予防もしくは遅延、または以前に罹患した対象における病態（脳卒中など）の再発の予防もしくは遅延を表す。
「診断している（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」または「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」は、本明細書中使用される場合、（脳卒中などの）病態の発症または進行を評価することを表す。当業者に知られているように、この評価は、診断される対象の１００％で正確であると意図されてはいるが、統計的に有意な対象で正確に行われ得る。統計的有意性は、当該分野で広く知られている方法、たとえば信頼区間の決定、ｐ値の決定、ｔ検定、マン・ホイットニー検定などを使用して当業者により容易に決定され得る。好ましい信頼区間は、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、および９９％である。好ましいｐ値は、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、または０．０００１である。好ましくは本発明に係る診断結果は、対象のグループの６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上で正確である。
「予後診断する（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）」または「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」は、特定の治療または介入の後に、（脳卒中などの）病態を有する対象のアウトカムを予測することを表す。
「血液サンプル」は、本明細書中使用される場合、対象に由来するかまたは対象から得られるいずれかの血液サンプルを意味する。血液サンプルの回収は、当業者によく知られている方法により行われ得る。一部の実施形態では、血液サンプルは、全血サンプル、血清サンプル、または血漿サンプルである。
「バイオマーカー」は、本明細書中使用される場合、脳組織または神経細胞の損傷に関連し、脳卒中と相関し得るが、好ましくは他の種類の損傷とは相関していない、遺伝子発現の産物（たとえばｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）のセットを表す。本発明者らにより血液中で同定されたこのような脳卒中の具体的なバイオマーカーとして、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭが挙げられる。これら具体的なバイオマーカーは、本明細書以下で詳述される。
本明細書では、目的の遺伝子のそれぞれの名称は、国際的に認識されている遺伝子配列およびタンパク質配列のデータベース、特に以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能である、ＨＵＧＯのヒトゲノム命名法委員会由来のデータベースにおいて見出されるように、対応する国際的に認識されている遺伝子の名称を表す。
本明細書では、目的の様々なバイオマーカーのそれぞれの名称はまた、国際的に認識されている遺伝子配列およびタンパク質配列のデータベースＥＮＴＲＥ ＩＤ、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＴｒＥＭＢＬ、またはＥＮＳＥＭＢＬで見出されるような、対応する国際的に認識されている遺伝子の名称を表し得る。これら国際的に認識されている配列データベースを通して、本明細書中記載される目的の遺伝子のそれぞれに対応する核酸配列は、当業者により検索され得る。
「ＰＴＧＳ２」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２の遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５７４３）を表す。「ＰＴＧＳ２」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿０００９５４．１（配列番号１）により提示されている。「ＰＴＧＳ２」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿０００９６３．４（配列番号２）により提示されており、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号２の残基１３４〜残基１９４８の範囲にある。
「ＨＭＯＸ１」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、ヘムオキシゲナーゼ１の遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３１６２）を表す。「ＨＭＯＸ１」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿００２１２４．１（配列番号３）により提示されている。「ＨＭＯＸ１」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿００２１３３．３（配列番号４）により提示されており、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号４の残基７９〜残基９４５の範囲にある。
「ＬＤＬＲ」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、低密度リポタンパク質受容体の遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３９４９）を表す。「ＬＤＬＲ」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿０００５１８．１（配列番号５）により提示されている。「ＬＤＬＲ」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿０００５２７．４（配列番号６）により提示されており、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号６の残基１８８〜残基２７７０の範囲にある。
「ＨＳＰＡ１Ｂ」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、熱ショックタンパク質ファミリーＡ（Ｈｓｐ７０）のメンバー１Ｂの遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３３０４）を表す。「ＨＳＰＡ１Ｂ」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿００５３３７．２（配列番号７）により提示されている。「ＨＳＰＡ１Ｂ」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿００５３４６．５（配列番号８）により提示されており、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号８の残基２１４〜残基２１３９の範囲にある。
「Ｇ０Ｓ２」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、Ｇ０／Ｇ１ ｓｗｉｔｃｈ ２の遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５０４８６）を表す。「Ｇ０Ｓ２」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿０５６５２９．１（配列番号９）により提示されている。「Ｇ０Ｓ２」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿０１５７１４．４（配列番号１０）により提示され、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１０の残基１７１〜残基４８２の範囲にある。
「ＢＡＧ３」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、ＢＣＬ２関連ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ ３の遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９５３１）を表す。「ＢＡＧ３」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿００４２７２．２（配列番号１１）により提示されている。「ＢＡＧ３」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿００４２８１．３（配列番号１２）により提示され、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１２の残基３０７〜残基２０３４の範囲にある。
「ＴＭ４ＳＦ１」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、ＴＭ４ＳＦ１（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｌ ｓｉｘ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １）の遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０７１）を表す。「ＴＭ４ＳＦ１」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＸＰ＿０１６８６１８７４．１（配列番号１３）により提示されている。「ＴＭ４ＳＦ１」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＸＭ＿０１７００６３８５．２（配列番号１４）により提示され、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１４の残基２３５〜残基９５４の範囲にある。
「ＤＵＳＰ１」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、二重特異性ホスファターゼ１の遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１８４３）を表す。「ＤＵＳＰ１」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿００４４０８．１（配列番号１５）により提示されている。「ＤＵＳＰ１」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿００４４１７．４（配列番号１６）により提示され、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１６の残基２４４〜残基１３４７の範囲にある。
「ＡＤＭ」は、本明細書中使用される場合、当該分野における一般的な意味を有し、アドレノメデュリンの遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：１３３）を表す。「ＡＤＭ」遺伝子によりコードされる例示的なヒトアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＰ＿００１１１５．１（配列番号１７）により提示されている。「ＡＤＭ」遺伝子の例示的なヒトｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿００１１２４．３（配列番号１８）により提示されており、ここでコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１８の残基１７９〜７３６の範囲にある。
詳細な説明
本発明は、脳卒中のシグネチャーであって、上記シグネチャーが、発現レベルが脳卒中に特異的であるかまたは脳卒中を表すバイオマーカーを含む、シグネチャーに関する。本明細書中以降で、このようなバイオマーカーは、「脳卒中バイオマーカー」と呼ばれる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、脳卒中に特異的かまたは脳卒中を表す。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、虚血性脳卒中、小発作（一過性脳虚血発作、ＴＩＡとしても知られている）および／または出血性脳卒中（特に脳内出血により引き起こされる出血性脳卒中）に特異的であるかまたはこれを表す。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、虚血性脳卒中に特異的であるかまたはこれを表す。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、一過性脳虚血発作に特異的であるかまたはこれを表す。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、出血性脳卒中（特に脳内出血により引き起こされる出血性脳卒中）に特異的であるかまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも１つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも２つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも４つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも５つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも６つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも７つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも８つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。一実施形態では、本発明のシグネチャーは、少なくとも９つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはこれよりなる。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも２つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも２つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも２つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも２つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなり、ただし、この少なくとも２つのバイオマーカーは、ＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも４つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも４つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも４つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも５つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも５つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも５つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも６つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも６つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも６つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも７つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも７つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも７つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも８つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも８つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも９つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも９つの脳卒中バイオマーカーを含むかまたはからなる。
よって本発明は、発現レベルが脳卒中を罹患している対象と実質的に健常な対象との間で異なる、１つまたは複数のバイオマーカーを含むかまたはからなる脳卒中のシグネチャーに関する。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも２つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表し、ただし好ましくは少なくとも２つのバイオマーカーが、ＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも２つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも４つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも４つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも５つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも５つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも６つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも６つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも７つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも７つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも８つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、本発明のシグネチャーは、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーと比較してアップレギュレートされる場合、脳卒中に特異的かまたはこれを表す。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおける本発明の脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、当該分野で知られている標準的なプロトコルを使用して決定され得る。
一実施形態では、本発明の脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、それらの転写レベル（すなわちｍＲＮＡの発現）またはそれらの翻訳レベル（すなわちタンパク質の発現）に対応する。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、対象由来のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおいて、タンパク質レベル、すなわち翻訳レベルで評価される。この実施形態では、本発明に係るシグネチャーは、プロテオミクスのシグネチャーと呼ばれ得る。
サンプル中のタンパク質レベルを決定するための方法は、当該分野でよく知られている。このような方法の例として、限定するものではないが、免疫組織化学的検査、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、質量分析（ＭＳ）、マイクロアレイなど、またはそれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
質量分析（ＭＳ）は、異なる形態は質量分析により解明され得る異なる質量を通常有するため、タンパク質の異なる形態を解明するために使用され得る。よって、ポリペプチドまたはタンパク質の１つの形態が、別の形態のバイオマーカーよりも疾患に対して良好なバイオマーカーである場合、質量分析は、この有用な形態を特異的に検出および測定するために使用され得る。ＭＳは、飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳ（たとえばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＴＯＦ ＭＳ）、表面エンハンス型レーザー脱離／イオン化（ＭＥＬＤＩ）ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化ＭＳ、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳを含み得る。
イムノアッセイは、通常、サンプルを、サンプル中のバイオマーカーと選択的に相互作用できる結合パートナーと接触させることを含む。一部の実施形態では、結合パートナーは、抗体、たとえばモノクローナル抗体またはさらにはアプタマーなどである。たとえば、結合は、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫組織化学アッセイ、競合ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫組織学的アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、蛍光偏光アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、ＨＴＲＦ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）アッセイ、ＩＡｓｙｓ分析、およびＢＩＡｃｏｒｅ分析などの技術を使用する競合的なイムノアッセイ、非競合的なアッセイ系の使用を介して検出され得る。一般に、上述のアッセイは、固体の担体へのパートナー（すなわち抗体またはアプタマー）の結合を含む。本発明の実務に使用され得る固体の担体は、ニトロセルロース（たとえば膜またはマイクロタイターウェルの形態）、ポリビニルクロリド（たとえばシートまたはマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（たとえばビーズまたはマイクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリデン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化したビーズ、磁気応答性ビーズなどの担体を含む。
マルチプレックスアッセイは、ファージディスプレイ、抗体プロファイリング、またはＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用するアッセイを含み得る。ポリペプチドのプロファイルを分析するためのマイクロアレイは、分析的マイクロアレイ、機能的タンパク質マイクロアレイ、または逆相タンパク質マイクロアレイを含み得る。場合により、ポリペプチドまたはタンパク質のプロファイルは、プロテオミクスのマイクロアレイによるプロテオミクスのスキャン（たとえば全プロテオミクスのスキャン）により測定され得る。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、対象由来のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおいて、核酸レベル（すなわちＲＮＡ）、すなわち転写レベルで評価される。この実施形態では、本発明に係るシグネチャーは、トランスクリプトミクスのシグネチャーと呼ばれ得る。
バイオマーカーの転写レベルを評価するための方法は、当該分野でよく知られている。このような方法の例として、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション技術、たとえばマイクロアレイの使用、および限定するものではないがＲＴ−ＰＣＲにより得られるアンプリコンのハイブリダイゼーション、たとえば次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）またはＲＮＡ−ｓｅｑ（「全トランスクリプトームショットガンシーケンシング」としても知られている）などのシーケンシングなどを含むそれらの組み合わせ、またはそれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
従来の方法は、通常、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。たとえば、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、通常、選択された標的核酸配列に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。本発明に有用なプライマーは、標的核酸配列の中での核酸合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法による制限消化から精製することができ、またはこれは、合成的に作製され得る。ＰＣＲは、熱安定性ポリメラーゼの使用を含む。用語「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱に安定的なポリメラーゼ酵素を表す。すなわち、この酵素は、テンプレートに相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖テンプレート核酸の変性に作用するために必要な時間の間高い温度に供される場合に不可逆的に変性しない。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉａｖｕｓ）、Ｔ．ｒｕｂｅｒ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、テルムス・アクウァーティクス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびメタノテルムス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。にもかかわらず、熱安定性ではないポリメラーゼもまた、酵素が補充されるという条件で、ＰＣＲアッセイで使用され得る。通常、ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ（すなわちテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ）である。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、通常、特定の波長の光束で各サンプルを照射し、励起したフルオロフォアにより発せられた蛍光を検出する特性を有するサーマルサイクラーにおいて行われる。またサーマルサイクラーは、サンプルを迅速に加熱および冷却することにより、核酸および熱的ポリメラーゼの物理化学的な性質を利用することができる。サンプル中のアンプリコン（すなわち増幅された標的核酸配列）の量を検出および測定するために、増殖した産物の量に相当する測定可能なシグナルが作製されなければならない。現在の全ての検出システムは、蛍光技術を使用する。これらの一部は、非特異的な技術であり、結果的に、１度に１つの標的の検出のみを可能にする。
あるいは、特定の検出化学が、非特異的な増幅と標的の増幅との間を区別し得る。これら特異的な技術は、アッセイをマルチプレックスする、すなわち同じアッセイにおいていくつかの異なる標的を検出するために使用され得る。たとえば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉプローブ、Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇプローブ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ＬＮＡ（登録商標）プローブ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブが、適切であり得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、最も広く使用されている種類のプローブである。これらは、アンプリコンの鎖の１つと相補的である一本鎖のプローブ配列からなる、放射標識されたプローブ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ８８（１６）：７２７６−８０）を本来使用していたアッセイから、Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）により開発されたものであった。フルオロフォアは、プローブの５’末端に結合され、クエンチャーは、３’末端に結合される。フルオロフォアは、機械により励起され、そのエネルギーを、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を介してクエンチャーに通す。従来、ＦＲＥＴ対は、フルオロフォアとしてＦＡＭに、クエンチャーとしてＴＡＭＲＡにコンジュゲートしている。良好に設計されたプローブでは、ＦＡＭは、ＴＡＭＲＡ上にエネルギーを通すため、蛍光を発しない。ＴＡＭＲＡ蛍光がＦＡＭに対して異なる波長で検出されるため、ＦＡＭのバックグラウンドのレベルは低い。プローブは、ＰＣＲの各アニーリングステップの間、アンプリコンに結合する。Ｔａｑポリメラーゼが、アンプリコンに結合しているプライマーから伸長する場合、これは、プローブの５’末端を変位させ、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により消化させる。切断は、残りのプローブがアンプリコンから溶けるまで続行する。このプロセスは、フルオロフォアおよびクエンチャーを溶液中に放出し、（プローブによりまとめて保持されている場合と比較して）これらを空間的に分離させる。これは、不可逆的なＦＡＭからの蛍光の増加およびＴＡＭＲＡにおける蛍光の減少をもたらす。
一部の実施形態では、核酸レベル（すなわちＲＮＡ）での脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、ＲＮＡ−ｓｅｑにより決定される。使用される場合、用語「ＲＮＡ−ｓｅｑ」または「トランスクリプトームシーケンシング」は、ＤＮＡの代わりにＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）で行われるシーケンシングであって、通常、主要目的が、発現レベルを測定すること、融合転写物、選択的スプライシング、およびＲＮＡから良好に評価され得る他のゲノムの変更を検出することである。ＲＮＡ−ｓｅｑは、通常、全トランスクリプトームシーケンシングを含む。本明細書中使用される場合、用語「全トランスクリプトームシーケンシング」は、サンプルのＲＮＡの内容についての情報を得るための、トランスクリプトーム全体をシーケンシングするための高スループットシーケンシング技術の使用を表す。全トランスクリプトームシーケンシングは、様々なプラットフォーム、たとえばＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）およびＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）で行われ得る。しかしながら、全トランスクリプトームシーケンシングに有用ないずれのプラットフォームもが使用され得る。通常、ＲＮＡは、抽出され、リボソームＲＮＡは、米国特許第９，００５，８９１号に記載されるように欠失され得る。ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）Ｍ ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）などの市販のキットを使用して、方向付けられておりｓｉｎｇｌｅ−ｅｎｄまたはｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄであるｃＤＮＡシーケンシングライブラリーが調製され得る。またこのライブラリーは、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）製のＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｂａｒｃｏｄｅ Ｐｒｉｍｅｒなどの市販のバーコードプライマーを使用するマルチプレックスシーケンシングでバーコード付与され得る。次にＰＣＲが、第２のｃＤＮＡの鎖を作製してバーコードを組み込み、ライブラリーを増幅させるために行われる。ライブラリーを定量化した後、シーケンシングライブラリーがシーケンシングされ得る。核酸シーケンシング技術は、発現解析に適した方法である。これら方法の根底にある原則は、ＤＮＡ配列がサンプル中で検出される回数は、配列に対応する相対的なＲＮＡのレベルに直接関連していることである。これら方法は、場合により、結果得られるデータの別々の数値の特性を反映しているため、用語「Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」またはＤＯＥと呼ばれる。この原則を適用する初期の方法は、ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）およびＭＰＳＳ（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）であった。たとえば、Ｂｒｅｎｎｅｒら（２０００． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８（６）：６３０−６３４）を参照されたい。通常、ＲＮＡ−ｓｅｑは、次世代シーケンシング（またはＮＧＳ）を使用する。本明細書中使用される場合、用語「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」は、従来のＳａｎｇｅｒ法によるシーケンシング技術と比較して比較的新規のシーケンシング技術である。レビューでは、本開示に参照により本明細書中組み込まれているＳｈｅｎｄｕｒｅら（２００８． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ． ２６（１０）：１１３５−４５）を参照されたい。本開示の目的のため、ＮＧＳは、特に、環状アレイのシーケンシング、マイクロ電気泳動によるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシングを含み得る。例として、環状アレイの方法を使用する典型的なＮＧＳでは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーがまず調製され、次に共通するアダプターが、断片化されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにライゲートされ得る。異なるプロトコルが、制御可能な距離の分布を伴うｍａｔｅ−ｐａｉｒｅｄタグのジャンピングライブラリーを作製するために使用され得る。各ポロニーが、単一のショットガンライブラリーフラグメントの多くのコピーからなる、数百万の空間的に固定化されたＰＣＲコロニーのアレイまたは「ポロニー」が作製される。ポロニーは平面のアレイに拘束されているため、単一のマイクロリットルの尺度容量の試薬が、並行してアレイの性質を操作するため、たとえばプライマーのハイブリダイゼーションまたは酵素伸長反応のために、適用され得る。それぞれの伸長に組み込まれた蛍光標識のイメージングベースの検出が、並行してシーケンシングデータを全ての性質に関して獲得するために使用され得る。酵素での照合およびイメージングの連続的な反復もまた、各アレイの性質に関する連続したシーケンシングリードを構成するために使用され得る。
一実施形態では、特定のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおける特定の脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、参照シグネチャーおよび／または所定の参照値と比較してアップレギュレートされているかどうかに関する決定が行われる。
一実施形態では、参照シグネチャーは、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択され、好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される、目的の脳卒中バイオマーカー、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の脳卒中バイオマーカーのそれぞれに関する所定の参照値を含むかまたはからなり、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーは、ＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない。
通常、参照シグネチャーは、ソフトウェアで実施されてもよく、または測定を介した全体の中央値もしくは他の算術平均が構成されてもよい。
一実施形態では、参照シグネチャーは、同じ対象に由来する参照サンプルにおける本発明に係る脳卒中バイオマーカーの発現レベルの以前の測定に由来し、たとえば、本発明に係る脳卒中バイオマーカーの発現レベルのその後の測定より１月前、好ましくは６カ月前、より好ましくは１年前、またはそれ以上前に測定された脳卒中バイオマーカーの発現レベル；またはたとえば、治療を開始する前に測定された脳卒中バイオマーカーの発現レベルである。
一実施形態では、参照シグネチャーは、参照集団における本発明に係る脳卒中バイオマーカーの発現レベルの測定に由来する。
一実施形態では、参照シグネチャーは、限定するものではないが、同様の年齢の範囲を有する対象、同じもしくは同様の民族グループにある対象、同様のがん病歴の対象などを含む、集団試験に由来するシグネチャーに関連し得る。
一実施形態では、参照シグネチャーは、１つ以上の実質的に健常な対象由来の対照サンプルにおける本発明に係る脳卒中バイオマーカーの発現レベルの測定に由来する。本明細書中使用される場合、「実質的に健常な対象」は、脳卒中と以前に診断されていないか、または脳卒中を有するもしくは罹患していると同定されていない。
一実施形態では、参照集団は、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、さらにより好ましくは少なくとも５００の実質的に健常な対象といった、実質的に健常な対象を含む。
参照集団から多数のサンプルを暗示することにより、それぞれの各脳卒中バイオマーカーの発現レベルの中央値および／または平均値を計算することが考えられる。これら結果に関連して、脳卒中バイオマーカーは、差次的に発現される際にモニタリングされ得る。一実施形態では、参照シグネチャーは、参照集団で測定される本発明のシグネチャーの脳卒中バイオマーカーの発現レベルの平均値に対応する。一実施形態では、参照シグネチャーは、参照集団で測定される本発明のシグネチャーの脳卒中バイオマーカーの発現レベルの中央値に対応する。
一実施形態では、参照シグネチャーは、アルゴリズム、ならびに他の統計的分類および構造的分類の方法を使用して構築される。参照集団由来のサンプルは、本発明に係る少なくとも１つの脳卒中バイオマーカー、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの平均プロファイル（すなわち参照シグネチャー）を計算するために使用される。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、発現倍差が、少なくとも約｜１．１｜超、好ましくは少なくとも約｜１．２｜、約｜１．３｜、約｜１．４｜、約｜１．５｜、約｜１．６｜、約｜１．７｜、約｜１．８｜、約｜１．９｜、約｜２．０｜、約｜２．１｜、約｜２．２｜、約｜２．３｜、約｜２．４｜、約｜２．５｜、約｜３．０｜、約｜４．０｜、約｜５．０｜、またはそれ以上の倍差を超える場合、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象と実質的に健常な対象との間で差次的に発現しているとみなされる。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、発現倍差が、少なくとも約１．１超、好ましくは少なくとも約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約３．０、約４．０、約５．０、またはそれ以上の倍差を超える場合、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象と実質的に健常な対象との間で差次的に発現しているとみなされる。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、ｌｏｇ２発現倍差が、少なくとも約｜０．１｜超、好ましくは少なくとも約｜０．２｜、約｜０．３｜、約｜０．４｜、約｜０．５｜、約｜０．６｜、約｜０．７｜、約｜０．８｜、約｜０．９｜、約｜１．０｜、約｜１．１｜、約｜１．２｜、約｜１．３｜、約｜１．４｜、約｜１．５｜、約｜１．６｜、約｜１．７｜、約｜１．８｜、約｜１．９｜、約｜２．０｜、約｜２．１｜、約｜２．２｜、約｜２．３｜、またはそれ以上の倍差を超える場合、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象と実質的に健常な対象との間で差次的に発現しているとみなされる。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、ｌｏｇ２発現倍差が、少なくとも約０．１超、好ましくは少なくとも約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、またはそれ以上の倍差を超える場合、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象と実質的に健常な対象との間で差次的に発現しているとみなされる。
一実施形態では、脳卒中バイオマーカーは、上記バイオマーカーの発現レベルが、実質的に健常な対象、好ましくは参照集団において決定された同バイオマーカーの発現レベルよりも少なくとも約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００倍高い場合、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象と実質的に健常な対象との間で差次的に発現しているとみなされる。
一実施形態では、１超の脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象から得られるサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルで決定される場合、上記発現レベルの複合的なスコアであるスコアが、計算され、所定の参照値と比較され得る。一実施形態では、所定の参照値よりも高いスコアは、対象が脳卒中を有するか有していたことを表す。
通常、所定の参照値は、閾値またはカットオフ値である。通常「閾値」または「カットオフ値」は、実験的、経験的、または理論的に決定され得る。また閾値は、当業者により認識されるように、既存の実験上および／または臨床的な条件に基づき任意に選択され得る。たとえば、適切に預けられ過去に用いられた対象サンプルにおける遡及的な測定が、所定の参照値を確立する際に使用され得る。閾値は、検定の関数およびベネフィット／リスクバランス（偽陽性および偽陰性の臨床結果）による最適な感度および特異度を得るように決定されなければならない。通常、最適な感度および特異度（よって閾値）は、実験データに基づき受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。たとえば、参照集団において本発明のバイオマーカーの発現レベルを決定した後、試験されるサンプルで決定される発現レベルの統計的な処置のためアルゴリズム解析を使用することができ、よって、サンプルの分類に関して有用性を有する分類の基準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の完全名は、受信者操作特性曲線であり、受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）としても知られている。これは、主に、臨床的な生化学の診断試験で使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性比率（感度）および偽陽性比率（１−特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。これは、画像合成法での感度と特異度との間の関係を明らかにする。異なるカットオフ値（閾値または臨界値、診断試験の正常な結果と異常な結果との間の境界値）のシリーズが、感度および特異度の値のシリーズを計算するための連続変数として設定される。次に、曲線を描くために、感度は、垂直座標として使用され、特異度は、並行座標として使用される。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きい場合、診断の正確性が高くなる。ＲＯＣ曲線において、座標図の左上端に最も近い点は、高感度かつ高特異度の値を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０〜０．５である。ＡＵＣ＞０．５である場合、診断結果は、ＡＵＣが１に近づくにつれて良好となる。０．５＜ＡＵＣ＜０．７である場合、正確性は低い。０．７＜ＡＵＣ＜０．９である場合、正確性は中程度である。ＡＵＣ＜０．９である場合、正確性は高い。好ましくは、このアルゴリズム法は、コンピュータを用いて行われる。当該分野における既存のソフトウェアまたはシステム、たとえばＭｅｄＣａｌｃ ９．２．０．１ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳＰＳＳ ９．０、ＲＯＣＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＤＥＳＩＧＮＲＯＣ．ＦＯＲ、ＭＵＬＴＩＲＥＡＤＥＲ ＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＣＲＥＡＴＥ−ＲＯＣ．ＳＡＳ、ＧＢ ＳＴＡＴ ＶＩ０．０（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ， Ｍｄ．， ＵＳＡ）などが、ＲＯＣ曲線の描画に使用され得る。
さらに本発明は、本発明の脳卒中のシグネチャーを使用して、対象の脳卒中を診断する方法に関する。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、虚血性脳卒中、小発作（または一過性脳虚血発作、ＴＩＡ）および／または出血性脳卒中（特に脳内出血により引き起こされる出血性脳卒中）の診断に特に適している。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、脳卒中ではなく脳虚血の結果ではないことを除き脳卒中と同じ症状の一部または全てを呈し得るｓｔｒｏｋｅ ｍｉｍｉｃと、脳卒中を区別することに特に適している。理論により拘束されることを望むものではないが、バイオマーカーのレベルの上昇は、脳卒中の結果であるため、ｓｔｒｏｋｅ ｍｉｍｉｃを有する対象は、バイオマーカーのレベルの上昇を有さない（言い換えると、本発明のシグネチャーは脳卒中に特異的であるかまたはこれを表すため、ｓｔｒｏｋｅ ｍｉｍｉｃを有する対象は同シグネチャーを呈さない）。
一般的なｓｔｒｏｋｅ ｍｉｍｉｃとして、限定するものではないが、片頭痛、失神、末梢性前庭障害、およびＢＰＰＶ（良性発作性頭位めまい症）、けいれん、機能的徴候／不安、一過性全健忘、ベル麻痺、末梢性神経疾患／機能障害、体位性低血圧、腫瘍、ウイルス性疾病、不整脈、多発性硬化症、薬物関連、低血糖、パーキンソン病、網膜／眼性病態、脊髄病態、三叉神経痛、尿路感染症、せん妄、運動ニューロン疾患、くも膜下出血、硬膜下血腫などが挙げられる（Ｎａｄａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｐｒａｃｔ Ｎｅｕｒｏｌ． １４（１）：２３−３１参照）。
よって本発明に係る脳卒中を診断する方法は、早期の正確な脳卒中の診断を可能にする利点を提供し、少なくとも以下の関連する態様において脳卒中を有する疑いのある対象に利益を提供することができる：
（１）脳卒中の誤診断の比率を下げることができる；および／または
（２）処置の必要のある対象において早期に適切な処置を可能にすることにより組織死の度合いを限定することができる。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象由来のサンプルを準備するステップを含む。
用語「サンプル」は、本明細書中使用される場合、全般的に、本発明に係るバイオマーカー、好ましくは脳卒中マーカーの発現レベルに関して試験され得るいずれかのサンプルを表す。
一実施形態では、サンプルは、体液サンプルである。体液の例として、限定するものではないが、血液、血漿、血清、リンパ液、腹水（ａｓｃｅｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、嚢胞液、尿、胆汁、粘液、漿液、皮脂、乳頭滲出液、関節液、気管支肺胞洗浄液、痰、羊水、腹水、脳脊髄液、胸水、心膜液、精液、唾液、涙、粘膜分泌物、汗、および肺胞マクロファージが挙げられる。
一実施形態では、サンプルは、血液サンプルである。用語「血液サンプル」は、本明細書中使用される場合、全血サンプル、血清サンプル、および血漿サンプルを包有する。
一実施形態では、サンプルは、全血、血漿、または血清サンプルである。
一実施形態では、サンプルは、体組織サンプルではない。体組織の例として、限定するものではないが、脳、筋肉、神経、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、前立腺、精巣、卵巣、髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、および脊髄が挙げられる。
一実施形態では、サンプルは、脳組織サンプルではない。よってこの実施形態では、本発明の方法は、対象由来の脳組織サンプルを準備するステップを含まない。
一実施形態では、サンプルは生検サンプルではない。一実施形態では、サンプルは脳生検サンプルではない。
一実施形態では、サンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルは、あらかじめ対象から採取されたものであり、すなわち本発明に係る脳卒中を診断する方法は、対象からサンプルを能動的に採取するステップを含まない。結果として、この実施形態では、本発明の方法は、非侵襲的な方法、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法である。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、上記対象からのサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおいて本発明に係るシグネチャーを決定するステップを含む。
本発明に係るシグネチャーを決定するための手段および方法は、本明細書中上記に詳述されている。
一実施形態では、シグネチャーを決定するステップは、本発明に係る少なくとも１つの脳卒中バイオマーカー、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定するサブステップを含む。
一実施形態では、少なくとも１つの脳卒中バイオマーカー、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、本発明のシグネチャーの脳卒中バイオマーカーのそれぞれの発現レベルが同時に測定されるように、ＤＮＡマイクロアレイを使用して測定される。
一実施形態では、少なくとも１つの脳卒中バイオマーカー、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、ＲＮＡｓｅｑを使用して測定される。
一実施形態では、少なくとも１つの脳卒中バイオマーカー、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルは、ＣｏｄｅＳｅｔを使用して測定される。所定のパネルのマーカー（たとえば本明細書中開示される脳卒中バイオマーカー）のためにカスタムされたＣｏｄｅＳｅｔは、商業的に明示できる。これらは、限定するものではないが、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｃｕｓｔｏｍ ＣｏｄｅＳｅｔｓ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）（Ｍａｌｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２００９． ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅｓ． ２：８０； Ｋｕｌｋａｒｎｉ， ２０１１． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｈａｐｔｅｒ ２５：Ｕｎｉｔ２５Ｂ．１０）を含む。
一実施形態では、１超の脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象からのサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおいて決定される場合、上記発現レベルの複合的なスコアが計算される。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーを、本明細書中上記に定義される参照シグネチャーと比較するステップを含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーを、本明細書中上記に定義される所定の参照値と比較するステップを含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーにおける脳卒中バイオマーカーの発現レベルを、本明細書上記に定義される参照シグネチャーにおける脳卒中バイオマーカーの発現レベルと比較するステップを含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、対象からのサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおけるシグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、対象の脳卒中を診断するステップを含む。
一実施形態では、対象は、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーが、本明細書中上記に定義される参照シグネチャーと異なるとみなされる場合、脳卒中と診断される。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現倍差が、少なくとも約｜１．１｜超、好ましくは少なくとも約｜１．２｜、約｜１．３｜、約｜１．４｜、約｜１．５｜、約｜１．６｜、約｜１．７｜、約｜１．８｜、約｜１．９｜、約｜２．０｜、約｜２．１｜、約｜２．２｜、約｜２．３｜、約｜２．４｜、約｜２．５｜、約｜３．０｜、約｜４．０｜、約｜５．０｜、またはそれ以上の倍差を超える場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現倍差が、少なくとも約１．１超、好ましくは少なくとも約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約３．０、約４．０、約５．０、またはそれ以上の倍差を超える場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーのｌｏｇ２発現倍差が、少なくとも約｜０．５｜超、好ましくは少なくとも約｜０．１｜、約｜０．２｜、約｜０．３｜、約｜０．４｜、約｜０．５｜、約｜０．６｜、約｜０．７｜、約｜０．８｜、約｜０．９｜、約｜１．０｜、約｜１．１｜、約｜１．２｜、約｜１．３｜、約｜１．４｜、約｜１．５｜、約｜１．６｜、約｜１．７｜、約｜１．８｜、約｜１．９｜、約｜２．０｜、約｜２．１｜、約｜２．２｜、約｜２．３｜、またはそれ以上の倍差を超える場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーのｌｏｇ２発現倍差が、少なくとも約０．５超、好ましくは少なくとも約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、またはそれ以上の倍差を超える場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定したシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、実質的に健常な対象、好ましくは参照集団で決定された同バイオマーカーの発現レベルより少なくとも約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００倍高い場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象は、本発明に係る少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、実質的に健常な対象、好ましくは参照集団で決定された同脳卒中バイオマーカーの発現レベルより高い場合、脳卒中と診断される。
一実施形態では、対象は、本発明に係る１超、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルで計算された複合的なスコアが、所定の参照値、すなわち実質的に健常な対象、好ましくは参照集団における同バイオマーカーの発現レベルで計算された複合的なスコアより高い場合、脳卒中と診断される。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、
ｉ）脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと
を含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、
ｉ）脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーが、ＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと
を含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、
ｉ）脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーが、ＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと
を含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、
ｉ）脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと
を含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、
ｉ）脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１の発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと
を含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、
ｉ）脳卒中を罹患しているまたは罹患していないと診断される対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと
を含む。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、ｉ）対象から得たサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおいてＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択されるバイオマーカーの少なくとも１つのレベルの発現レベルを決定するステップと、ｉｉ）ステップｉ）で決定したレベルを、所定の参照値と比較するステップと、ｉｉｉ）ステップで決定された発現レベルが所定の参照値より高い場合、脳卒中と診断するステップとを含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、参照集団、好ましくは少なくとも１つの実質的に健常な対象を含む参照に由来するかまたはこれより得られる。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、脳卒中に関して見込みのある全ての原因を除外するための定期的なスクリーニングをこれまでに経験したことのない脳卒中の症状を提示する対象に適用される。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、限定するものではないが、片目の失明、片腕もしくは片足の脱力、身体の片側全体の脱力、浮動性めまい、回転性めまい、複視、身体の両側の脱力、発話困難、不明瞭発語、または調整の失調などの脳卒中の症状を呈する対象で行われる定期的なテストのセットの一部であり得る。
一実施形態では、本発明に係る脳卒中を診断する方法は、特にコンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を含む他の診断ツールに加えて行われ得る。
さらに本発明は、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法に関する。さらに本発明は、脳卒中を罹患している対象が、治療の完了の間または完了後に応答を達成するかどうかを決定する方法に関する。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、ｉ）ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される本発明の少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、ｉｉ）ステップｉ）で決定した発現レベルを、所定の参照値と比較するステップと、ｉｉｉ）ステップｉ）で決定したレベルが所定の参照値よりも低い場合、対象が応答を達成すると結論付けるステップとを含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、上記シグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップとを含む。これらステップは、脳卒中を診断する方法の枠で本明細書中上記に詳述されており、変更すべき点は変更して本方法に適用する。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）上記本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、対象が応答を達成すると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーが、ＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）上記本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、対象が応答を達成すると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーが、ＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）上記本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、対象が応答を達成すると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）上記本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、対象が応答を達成すると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１の発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）上記本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、対象が応答を達成すると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）上記本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、対象が応答を達成すると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、たとえば治療の開始より前に測定された脳卒中バイオマーカーの発現レベルなど、同じ対象に由来する参照サンプルにおける本発明に係る脳卒中バイオマーカーの発現レベルの以前の測定に由来するかまたはそれより得られる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーが本明細書中上記で定義される参照シグネチャーと異なるとみなされる場合、対象は応答を達成すると結論付けられる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現倍差が、少なくとも約｜１．１｜未満、好ましくは少なくとも約｜１．２｜、約｜１．３｜、約｜１．４｜、約｜１．５｜、約｜１．６｜、約｜１．７｜、約｜１．８｜、約｜１．９｜、約｜２．０｜、約｜２．１｜、約｜２．２｜、約｜２．３｜、約｜２．４｜、約｜２．５｜、約｜３．０｜、約｜４．０｜、約｜５．０｜、またはそれ以上の数未満である場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現倍差が、少なくとも約１．１未満、好ましくは少なくとも約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約３．０、約４．０、約５．０、またはそれ以上の数未満である場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーのｌｏｇ２発現倍差が、少なくとも約｜０．１｜未満、好ましくは少なくとも約｜０．２｜、約｜０．３｜、約｜０．４｜、約｜０．５｜、約｜０．６｜、約｜０．７｜、約｜０．８｜、約｜０．９｜、約｜１．０｜、約｜１．１｜、約｜１．２｜、約｜１．３｜、約｜１．４｜、約｜１．５｜、約｜１．６｜、約｜１．７｜、約｜１．８｜、約｜１．９｜、約｜２．０｜、約｜２．１｜、約｜２．２｜、約｜２．３｜、またはそれ以上の数未満である場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーのｌｏｇ２発現倍差が、少なくとも約０．１未満、好ましくは少なくとも約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、またはそれ以上の数未満である場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーは、本明細書中定義される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、実質的に健常な対象、好ましくは参照集団で決定された同バイオマーカーの発現レベルより少なくとも約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００倍低い場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーは、本発明に係る少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルが、実質的に健常な対象、好ましくは参照集団における同脳卒中バイオマーカーの発現レベル以下である場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
一実施形態では、対象のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルから決定されたシグネチャーは、本発明に係る１超、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルで計算された複合的なスコアが、所定の参照値、すなわち実質的に健常な対象、好ましくは参照集団における同バイオマーカーの発現レベルで計算された複合的なスコア以下である場合、参照シグネチャーと異なるとみなされる。
よって脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法は、「レスポンダー」を「ノンレスポンダー」と区別するのに特に適している。
本明細書中使用される場合、用語「レスポンダー」は、治療応答を達成する対象または患者、すなわち脳卒中が低減、軽減、または治癒されている対象を表す。本発明では、レスポンダーは、客観的な応答を有し、よってこの用語は、安定した状態の脳卒中を有する対象または患者を包有せず、よって疾患は治療後に進行していない。
本明細書中使用される場合、用語「ノンレスポンダー」（または難治性）は、治療後に脳卒中が低減または改善を示さない対象または患者を含む。本発明では、同様に用語「ノンレスポンダー」は、安定化した状態の脳卒中を有する対象または患者を含む。
通常、レスポンダーまたはノンレスポンダーと対象を特徴づけることは、基準またはトレーニングセットを参照することにより行われ得る。この基準は、レスポンダーもしくはノンレスポンダーであることが知られている対象のプロファイルであり得、あるいはまたは数値であり得る。このような所定の基準は、印刷されたリストもしくは図、コンピュータソフトウェアプログラム、または他の媒体などの任意の適切な形態で提供され得る。一部の実施形態では、所定の値は、治療前に決定された発現レベルである。患者がノンレスポンダーであると結論付けられる場合、医師は、さらなるいずれの有害な副作用をも回避するために治療を停止する決定を行う可能性がある。
一実施形態では、モニタリングの目的のため、発現レベルは、複数の時点、たとえば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上の回数、測定され得る。この方法では、治療後または治療中の経時的な発現レベルのモニタリングは、ゆっくりではあるが発現レベルが減少し得る未処置の対象と比較して処置が成功した対象において発現レベルが速く減少することが予想されるため、処置の成功の測定を提供し得る。
通常、治療は、当業者によく知られているいずれかの方法を構成する。治療選択として、限定するものではないが、血管内手法および外科手術、たとえば血栓除去が挙げられる。
本明細書中使用される場合、用語「血栓除去」は、血餅の何らかの外科的および／または機械的な除去または破壊を表す。通常、３つのクラスの機械的な血栓除去装置：コイル回収装置、アスピレーション装置、およびステント回収装置が知られている。現在開発中の他の装置および方法もまた、本明細書中使用される血栓除去の定義に含まれる。通常、カテーテルが血流遮断部位に送られ、血餅を除去する。血栓除去および血栓溶解の組み合わせを、患者に行うことができる。さらに、虚血性脳卒中はまた、血餅を溶解するための血栓溶解作用物質を投与することにより処置され得る（血栓溶解）。
抗血栓性作用物質は、以下の３つのサブタイプ：抗凝固薬、抗血小板薬、および血栓溶解薬にさらに分類される。
抗凝固薬の例として、限定するものではないが、クマリン、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン（ａｔｒｏｍｅｎｔｉｎ）、フェニンジオン、フォンダパリヌクス、イドラパリナックス、直接的な第Ｘａ因子阻害剤（ｄｉｒｅｃｔ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、直接的なトロンビン阻害剤（ｄｉｒｅｃｔ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、抗トロンビンタンパク質治療物質、バトロキソビン、およびヘメンチン（ｈｅｍｅｎｔｉｎ）が挙げられる。
抗血小板薬の例として、限定するものではないが、不可逆性シクロオキシゲナーゼ阻害薬（たとえばアスピリンまたはトリフルサル）、アデノシン二リン酸受容体阻害剤（たとえばクロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、またはチクロピジン）、ホスホジエステラーゼ阻害剤（たとえばシロスタゾール）、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤（たとえばアブシキシマブ、エプチフィバチド、またはチロフィバン）、アデノシン再取り込み阻害剤（たとえばジピリダモール）、およびトロンボキサン阻害剤（たとえばトロンボキサンシンターゼ阻害剤またはトロンボキサン受容体アンタゴニスト）が挙げられる。
血栓溶解薬の例として、限定するものではないが、組織プラスミノーゲンアクチベーターｔ−ＰＡ（アルテプラーゼおよびその他（デスモテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、…）、アニストレプラーゼ、ストレプトキナーゼ、およびウロキナーゼが挙げられる。ｔ−ＰＡは、任意選択で、血管内手法の間に投与され得る。
一実施形態では、治療は、神経保護性作用物質を投与することを構成する。
神経保護性作用物質の例として、通常、限定するものではないが、抗フリーラジカル、抗グルタミン酸塩作用物質、およびＣＤＫ阻害剤が挙げられる。
一部の実施形態では、神経保護性作用物質は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤である。既知のＣＤＫ阻害剤は、一般にＣＤＫを阻害するそれらの特質によるかまたは特異的なＣＤＫの選択性により分類され得る。たとえば、フラボピリドールは、「ｐａｎ」ＣＤＫアンタゴニストとして作用し、特定のＣＤＫに特に選択的である（Ｄａｉ ＆ Ｇｒａｎｔ， ２００３． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３（４）：３６２−７０）。オロモウシン、ロスコビチン、プルバノロール（ｐｕｒｖａｎｏｌｏｌ）、およびＣＧＰ７４５１４ＡなどのプリンベースのＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ１、２、および５により高い選択性を呈するが、ＣＤＫ４および６に対しては阻害活性を示さないことが知られている（Ｄａｉ ＆ Ｇｒａｎｔ， ２００３． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３（４）：３６２−７０）。さらに、Ｓ−ロスコビチンなどのプリンベースのＣＤＫ阻害剤が、神経系に抗アポトーシス性作用を発揮し得ること（Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． ９３（２−３）：１３５−４３； Ｔｉｍｓｉｔ ＆ Ｍｅｎｎ， ２０１２． Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． ９１（２）：３２７−３２； Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１７． Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． ３７（６）：２２０８−２２２３）、またはアルツハイマー病などの神経変性疾患における神経細胞死を予防し得ること（Ｆｉｌｇｕｅｉｒａ ｄｅ Ａｚｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２９７（５）：１１５４−８； Ｋｎｏｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． ２３（９）：４１７−２５）が示されている。
一部の実施形態では、治療が、低体温を構成する（たとえばＫｕｒｉｓｕ ＆ Ｙｅｎａｒｉ， ２０１８． Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． １３４（Ｐｔ Ｂ）：３０２−３０９）。
さらに本発明は、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、ｉ）対象由来のサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおいてＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択されるバイオマーカーの少なくとも１つのレベルの発現レベルを決定するステップと、ｉｉ）ステップｉ）で決定したレベルを、所定の参照値と比較するステップと、ｉｉｉ）ステップで決定された発現レベルが所定の参照値よりも高い場合に対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップとを含む、方法に関する。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、上記シグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップとを含む。これらステップは、脳卒中を診断する方法の枠で本明細書中上記に詳述されており、変更すべき点は変更して本方法に適用する。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上述されるように上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーが、ＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上述されるように上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーが、ＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上述されるように上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプル中のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上述されるように上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１の発現レベルを測定することにより、上記サンプル中のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上述されるように上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭの発現レベルを測定することにより、上記サンプル中のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上述されるように上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、参照集団、好ましくは少なくとも１つの実質的に健常な対象を含む参照に由来するかこれより得られる。
一実施形態では、対象は、脳卒中をもたらし得る心血管疾患（たとえばアテローム性動脈硬化、高血圧…）を罹患しているか、または罹患したことがあるか、または心血管疾患と診断されている。
一実施形態では、対象は、脳卒中を経験しており、本発明の本発明の方法は、再発性の脳卒中の予測に特に適している。
よって対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法は、予後を提供すること、よってリスクがある対象を同定することに特に適しており、脳卒中を予防するための全ての治療介入を担う。
本明細書中使用される場合、用語「リスク」は、ある事象が特定の時間を通して起こる可能性に関連し、対象の「絶対リスク」または「相対リスク」を意味し得る。
「絶対リスク」は、関連する時間のコホートで実際の測定後の観察に準拠するか、または関連のある期間の間フォローされている統計的に有効な以前使用されたコホートから発展した指標の値に準拠して測定され得る。
「相対リスク」は、どのように臨床的なリスク因子が評価されるかにより変動し得る低リスクコホートの絶対リスクまたは平均集団リスクのいずれかと比較した対象の絶対リスクの比率である。オッズ比は、所定の試験結果の負の事象に対する正の事象の比率であり、同様に、変換することなく一般的に使用されている（オッズは、式ｐ／（１−ｐ）（式中ｐは、事象の確率であり、（１−ｐ）は、事象がない確率である）による）。
「リスク評価」または「リスクの評価」は、本発明の文脈において、事象または疾患状態が起こり得る確率、オッズ、または尤度、事象または１つの疾患状態から別の疾患状態への変換の発生の比率の予測を作製することを含む。またリスク評価は、以前に測定された集団に対する絶対的または相対的な観点からの、将来の臨床パラメータ、従来の研究リスク因子の値、または他の再発の指数の予測を含み得る。
対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定することは、変換のリスクの連続的または分類のための測定を作製するため、よって変換のリスクであると定義される対象のカテゴリーのリスクスペクトラムを診断および定義するために使用され得る。分類によるシナリオでは、本発明は、正常な対象のコホートとリスクの高い他の対象のコホートとの間を区別するために使用され得る。一実施形態では、本発明は、リスクのあるものと正常なものを区別するために使用され得る。
さらに本発明は、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法であって、ｉ）対象から得られたサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルにおけるＤＵＳＰ１、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＡＤＭ、およびＴＭ４ＳＦ１からなる群から選択されるバイオマーカーの少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの発現レベルを決定するステップと、ｉｉ）ステップｉ）で決定したレベルを、所定の参照値と比較するステップと、ｉｉｉ）ステップｉ）で決定したレベルが所定の参照値より低い場合に患者の予後が良好であると結論付けるか、またはステップｉ）で決定したレベルが所定の参照値より高い場合に患者の予後が不十分であると結論付けるステップとを含む、方法に関する。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法は、対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、上記シグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップとを含む。これらステップは、脳卒中を診断する方法の枠で本明細書中上記に詳述されており、変更すべき点は変更して本方法に適用する。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象の患者の予後が良好であると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーがＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象の患者の予後が良好であると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーがＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象の患者の予後が良好であると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象の患者の予後が良好であると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１の発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象の患者の予後が良好であると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象の予後を決定する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき対象の患者の予後が良好であると結論付けるステップと
を含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、参照集団、好ましくは少なくとも１つの実質的に健常な対象を含む参照に由来するかまたはこれより得られる。
一実施形態では、参照シグネチャーは、同じ対象由来の参照サンプルにおける、本発明に係る脳卒中バイオマーカーの発現レベルの以前の測定に由来するかまたはこれより得られ、たとえば、脳卒中の後、好ましくは脳卒中から６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、または９６時間以上後に測定された脳卒中バイオマーカーの発現レベルに由来するかまたはこれより得られる。
本明細書中使用される場合、用語「予後」は、脳卒中の可能性のあるアウトカム、すなわち患者の脳卒中の過程または生存時間の予測を表す。
用語「良好な予後」は、本明細書中使用される場合、脳卒中を罹患している患者において、同じ病態を罹患している同じ性別の他のメンバーと比較して高い平均生存尤度を表す。
用語「不十分な予後」は、本明細書中使用される場合、脳卒中を罹患している患者において、同じ病態を罹患している同じ性別の他のメンバーと比較して低い平均生存尤度を表す。
さらに本発明は、脳卒中を罹患している対象を処置する方法に関する。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象を処置する方法は、対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、上記シグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップとを含む。これらステップは、脳卒中を診断する方法の枠で本明細書中上記に詳述されており、変更すべき点は変更して本方法に適用する。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象を処置する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）上記サンプルにおいて本発明のシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと、
ｖ）対象がステップｉｖ）で脳卒中を罹患していると診断された場合、対象を処置するステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象を処置する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＨＳＰＡ１Ｂ、ＮＰＡＳ４、ＤＮＡＪＢ１、ＡＴＦ３、ＨＳＰＢ１、ＲＲＡＤ、ＮＲ４Ａ１、ＣＹＲ６１、Ｃ−ＦＯＳ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＲＧＳ１、ＡＲＣ、ＥＧＲ４、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ２、ＣＣＬ３、ＢＡＧ３、ＥＧＲ２、ＨＳＰＡ４Ｌ、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＥＧＲ１、ＤＵＳＰ１、ＢＴＧ２、ＬＯＣ７１５４５６、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＤＮＡＪＡ４、ＭＣＬ１、ＨＳＰＡ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＩＬ６、ＡＤＦＰ、ＨＥＳ４、ＤＵＳＰ５、ＧＥＭ、およびＧ０Ｓ２を含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーがＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと、
ｖ）対象がステップｉｖ）で脳卒中を罹患していると診断された場合、対象を処置するステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象を処置する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは少なくとも１つまたは２つの脳卒中バイオマーカーがＤＵＳＰ１および／またはＡＤＭを構成しない、ステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと、
ｖ）対象がステップｉｖ）で脳卒中を罹患していると診断された場合、対象を処置するステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象を処置する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭを含むかまたはからなる群から選択される少なくとも３つの脳卒中バイオマーカーの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと、
ｖ）対象がステップｉｖ）で脳卒中を罹患していると診断された場合、対象を処置するステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象を処置する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、およびＴＭ４ＳＦ１の発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと、
ｖ）対象がステップｉｖ）で脳卒中を罹患していると診断された場合、対象を処置するステップと
を含む。
一実施形態では、脳卒中を罹患している対象を処置する方法は、
ｉ）対象からサンプル、好ましくは体液サンプル、より好ましくは血液サンプルを準備するステップと、
ｉｉ）好ましくはＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭの発現レベルを測定することにより、上記サンプルにおけるシグネチャーを決定するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で決定したシグネチャーを、参照シグネチャーと比較するステップと、
ｉｖ）本明細書中上記で詳述される上記シグネチャーの参照シグネチャーとの相関に基づき、脳卒中を罹患していると対象を診断するステップと、
ｖ）対象がステップｉｖ）で脳卒中を罹患していると診断された場合、対象を処置するステップと
を含む。
一実施形態では、参照シグネチャーは、参照集団、好ましくは少なくとも１つの実質的に健常な対象を含む参照に由来するかまたはこれより得られる。
脳卒中を罹患していると診断された対象に適切な処置および治療の例は、当該分野でよく知られており、本明細書中上記で詳述されている。
さらに本発明を、以下の実施例および図面で例示する。しかしながらこの実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでは全くない。
図１は、ｑＲＴ−ＰＣＲによる（ａ）ＨＳＰＡ１Ｂ、（ｂ）ＧＡＤＤ４５Ｇ、および（ｃ）ＣＤＫＮ１Ａの、ｍＲＮＡレベルとマイクロアレイ強度の値との間の相関を示す３つのグラフのセットである。ｘ軸は、ＳＭＣ２に対して正規化したｑＲＴ−ＰＣＲ ｍＲＮＡのｌｏｇ２比を示し、ｙ軸は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイシグナルを示す。マン・ホイットニーのＵ検定由来のＰ値。 図２は、脳および血液で差次的に発現した遺伝子の２つのセット間の最も有意な重複の２つのベン図のセットである。上部パネルは、ダウンレギュレートされた遺伝子を示し、下部パネルは、アップレギュレートされた遺伝子を示す。 図３は、異なる時点：虚血前（Ｔ０）および虚血後（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）の間の雄性のアカゲザルＳ１における上位９つの差次的に発現した遺伝子に関する血液に動的な血液遺伝子強度を示す。 図４は、異なる時点：虚血前（Ｔ０）および虚血後（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）の間の雄性のアカゲザルＳ２における上位９つの差次的に発現した遺伝子に関する血液に動的な血液遺伝子強度を示す。
実施例
本発明を、さらに以下の実施例により示す。
実施例１：血栓性アカゲザルモデルにおける虚血性の脳および血液の間に共通するシグネチャーの同定
方法
動物実験
実験は、体重が１６．５〜１７．２ｋｇの範囲にある１２〜１３歳の雄性の２匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）において行った。以下では、これら２匹のサルを、Ｓ１およびＳ２と記述した。
実験プロトコルは、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ（Ｎｏｒｍａｎｄｙ）に提出し、本試験を行うための承認を得た（参照番号Ｎ／０２−０３−０８／０３／０２−１１）。実験を、ライセンスが得られた調査者（Ｃ．Ｏ．）により、実験動物のケアおよび使用に関する仏国および欧州の倫理上の法律およびガイドライン（科学的な目的のため使用される動物の保護に関する２０１０年９月２２日の欧州議会および審議会のＤｉｒｅｃｔｉｖｅ ２０１０／６３／ＥＵ）にしたがい、行った。本試験の過程の間、サルは、Ｃｙｃｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ａｇｒｅｅｍｅｎｔ Ｎｏ． Ｂ１４１１８００１）にて、１２時間／１２時間の明／暗周期、２４（℃）、５０％の相対湿度で維持された個別のケージにおいて収容し、新鮮な果物および水が追加された市販の食べ物を自由に与えた。これら試験期間にわたり、動物の福祉を監督するために獣外科医が対応することができた。
動物モデル
血栓性アカゲザルモデル
実験は、前述されるように行った（Ｇａｕｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ． ３３（４）：３２９−３９）。
簡潔に述べると、全身麻酔の後、摘出により、右中大脳動脈（ＭＣＡ）を露出させた。マイクロピペットを挿入し、ヒトトロンビンを注射するＭ１枝を単離するために２つの縫合を位置づけた。約６００μＬのトロンビンを、１Ｕ／μＬの濃度で注射した。最初の１００μＬの注射を適用した後、２分間隔で５０μＬの注射を６回行い、次に、近位縫合を取り除き、残りのトロンビンを注射した。次に遠位縫合を１５分後に除去した。
トロンビン注射のための手法全体は、約３０分間かかった。
麻酔および生理的パラメータの制御
動物を、ケタミン（０．１ｍｇ／ｋｇ；ＩＭ；Ｉｍａｌｇｅｎｅ（登録商標））で鎮静させた。気体の麻酔を、１００％の酸素においてセボフルラン（２．５％；Ｓｅｖｏｒａｎｅ（登録商標））により誘導した。筋弛緩は、伏在静脈を介してアトラクリウム（０．５ｍｇ／ｋｇ；ＩＶ；Ｔｒａｃｒｉｕｍ（登録商標））により得た。
サルに、１分あたり２２の一定した呼吸頻度で間欠的陽圧にて機械的に人工呼吸を行った。一回換気量（ＶＴ）は、炭酸正常状態（ＰａＣＯ２＝３８−４２ｍｍＨｇ）を得るように調節した。麻酔は、６６％の亜酸化窒素を含むセボフルランにより維持された。
外科手術の間、セボフルランの濃度は、３％に増大され、その後、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）手法の間、１．５〜２％に減少された。静脈内アトラクリウム灌流は、０．７５ｍｇ／ｋｇ／ｈに設定した。外科手術前に、動物は、定位固定フレームに載置した。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＲＩの獲得
サルを、３Ｔ臨床ＭＲＩ（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｓｅｎｓｅ Ｆｌｅｘ Ｍ）で試験した。
イメージングは、軸断面および冠状面で行い、以下のシーケンシング：３Ｄ−飛行時間型血管造影、Ｔ２強調型ＦＬＡＩＲ（ｆｌｕｉｄ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）法、拡散強調イメージング（ＤＷＩ）、ならびに造影前および造影後のＴ１強調型および拡散強調型イメージング（ＰＷＩ）を含むものであった。
血液サンプル
血液サンプルを、外科手術の前であるが全身麻酔の後のＴ０、およびＭＣＡ閉塞からＴ１＝＋２ｈ、Ｔ２＝＋３．５ｈ、およびＴ３＝＋４．５ｈ後に、得た。
各血液サンプルにおいて、２．５ｍＬを、ＲＮＡのため採取した。血液サンプルは、ＰＡＸｇｅｎｅｓ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ ｔｕｂｅｓ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）を使用して回収した。
脳サンプル
１２の脳サンプルを、各サルから採取した。各サルにおいて、梗塞部位の近くで６つのサンプルを採取し、他の半球の対応する位置から６つのサンプルを採取した。よって、合計１２の虚血性の脳サンプルおよび１２の非虚血性の脳サンプルを、解析した。
２匹のサルは、閉塞の発症から約５．５時間後（Ｓ１：５ｈ１２；Ｓ２：５ｈ３５）に手術され、屠殺された。閉塞の発症から３〜４時間後（Ｓ１：３ｈ１０；Ｓ２：３ｈ０５）に、ＭＲＩを行った。動物に、総量約８Ｌの４℃の生理食塩水 血清（ｓａｌｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を、開胸後に心臓内注射により注入した。次に、開頭術後に脳を取り外し、冠状断脳切片作製のため特に設計された型へ載置した。脳の各切片を、虚血性の半球および対側の半球上のｘ座標およびｙ座標を同定することができる格子上にさらに載置した。格子上で任意に、ローマ数字は、右の虚血性側の半球用であり、アラビア数字は、左の非虚血性側の半球用であった。
虚血は、裸眼で視認でき（データ不図示）、非虚血性の対側の半球で得られたピンク色がかかった染色と比較して白く見えるテトラゾリウムにより処理された代謝低下状態の虚血性組織により確認された。
動物あたり３つの虚血性皮質サンプルを調製した：１つは、潜在的にコアに対応しており、端由来の２つは、潜在的にペナンブラ領域に対応している。動物あたり３つの対応する対側の半球由来のサンプルも同様に調製した。
ＴＴＣ染色
代謝活性、よって虚血性組織を評価するために、トランスクリプトミクスに関して試験される組織に隣接する脳サンプルを、１％の塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色した。
総ＲＮＡ抽出
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを製造社の説明（Ｑｉａｇｅｎ）に従い使用して、大脳皮質から単離した。ＲＮＡの完全性は、ＲＩＮ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ）を測定することによりＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００６． ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ７：３）。測定したＲＩＮは、６．３〜８．８であった。
総ＲＮＡは、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）を使用して血液サンプルから単離した。グロブリンのｍＲＮＡは、ＧｌｏｂｉｎＣｌｅａｒ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して総ＲＮＡから除去した。測定したＲＩＮは、７．８〜１０であった。
マカクの発現マイクロアレイおよびサンプルの選択
大脳皮質（３０ｎｇ）および血液サンプル（３０ｎｇ）由来のＲＮＡを、Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ ＷＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して標識した。ＲＮＡ ｓｐｉｋｅ−ｉｎ対照を使用して、可能性のある色素作用を調節した。ＲＮＡを、逆転写酵素およびＷＴプライマー（Ｔ７プロモータープライマーおよびＴ７プロモーターを含むランダムプライマー）を使用してｃＤＮＡに変換した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ｃＲＮＡの合成およびＣｙ３での標識に使用した。蛍光標識したｃＲＮＡプローブを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
等量（３．７５μｇ）のＣｙ３ ｃＲＮＡプローブを、４ｘ４４Ｋ Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡチップ（カタログ番号：Ｇ２５１９Ｆ，アカゲザル（Ｍａｃａｃｃａ ｍｕｌａｔｔａ））上にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、６５（℃）、１０ｒｐｍにて回転させながら１７時間行った。次に、製造社の指示にしたがい、サンプルを洗浄し乾燥させた。
ハイブリダイゼーションの画像を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡマイクロアレイスキャナーを使用して入手し、強度のデータを、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抽出した。このアレイは、４３８０３のアカゲザルのプローブを含んでいる。これらプローブは、ＲｅｆＳｅｑ（Ｒｅｌｅａｓｅ ３７， Ｏｃｔ ２００９）、Ｕｎｉｇｅｎｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ １３， Ｏｃｔ ２００９）、ＵＣＳＣ ＭＲＮＡ（Ｏｃｔ ２００９）、Ｅｎｓｅｍｂｌ（Ｒｅｌｅａｓｅ ５６， Ｓｅｐ ２００９）、ＵＣＳＣ ＲｈｅＭａｃ２（Ｊａｎ ２００６）から供給されている。多くのプローブは、オルソロガスなヒト遺伝子に基づき予測される。さらに、一部のプローブは、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）のｃＤＮＡとしてのみ注釈を付されており、ヒトとの相同性から推測され得るもの以外の機能は知られていない。解析は、トランスクリプトーム解析を専門とする会社のＧｅｎｏｓｐｌｉｃｅ（Ｅｖｒｙ， Ｆｒａｎｃｅ）と協同して行った。
マイクロアレイ解析
Ａｇｉｌｅｎｔのマイクロアレイ発現データの差次的な発現解析を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐｒｏｊｅｃｔ製のｌｉｍｍａを使用して行った（Ｓｍｙｔｈ， ２００４． Ｓｔａｔ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３：Ａｒｔｉｃｌｅ３）。生データは、まず、バックグラウンド補正を行い、次に同様にｌｉｍｍａを使用して全ての脳サンプルおよび血液サンプルに関するアレイ間で正規化を行うことにより、正規化した。プローブは、Ａｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ上に提供されるＡｇｉｌｅｎｔのアレイの情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ． ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ／ａｒｒａｙｓ／Ａ−ＧＥＯＤ−９８６１／？ｐａｇｅ＝７１＆ｐａｇｅｓｉｚｅ＝１００＆ｓｏｒｔｂｙ＝ｏｒｇａｎｉｓｍ＆ｓｏｒｔｏｒｄｅｒ＝ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ）およびＧｅｎｏｓｐｌｉｃｅにより提供される遺伝子情報を使用して、注釈を付した。
ｌｉｍｍａパッケージは、まず線形モデルに対して各遺伝子の発現データを適合させることにより差次的な発現の解析を行う。次にこれは、遺伝子を通した情報を借用し、少数のアレイを通して解析を行うことを可能にする経験ベイズ（Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ Ｂａｙｅｓ：ｅＢａｙｅｓ）を利用する。
脳のマイクロアレイデータの全ての差次的な発現解析は、ｌｉｍｍａのｅＢａｙｅｓ法（Ｓｍｙｔｈ， ２００５． ｌｉｍｍａ： Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ． Ｉｎ： Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ）， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ． Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）を使用して行った。
統計
脳において著しく発現した遺伝子の比較
２匹のサルを、別々に解析した。遺伝子は、虚血性脳サンプルと非虚血性脳サンプルとを比較する際に両サルにおいて２超の倍差（すなわち１超のｌｏｇ２倍差）を有する場合、およびサル間で虚血性サンプル比較する際またはサル間で非虚血性サンプルを比較する際に２未満の倍差を有する場合、「著しく差次的に発現した」と標識した。
血液において著しく発現した遺伝子の比較
血液サンプルを、それぞれの閉塞後サンプルと閉塞前のサンプルを比較することにより解析した。２匹のサルを別々に解析した。最大の倍差を伴う時点を、さらなる解析のため選択し、「Ｓ１ ｍａｘ ｂｌｏｏｄ」および「Ｓ２ ｍａｘ ｂｌｏｏｄ」と呼んだ（表１）。遺伝子を、閉塞前のサンプルを「Ｓ１ ｍａｘ ｂｌｏｏｄ」および「Ｓ２ ｍａｘ ｂｌｏｏｄ」と比較する際に両サルにおいて１．５超の倍差を有する場合、「著しく差次的に発現した」と標識した。
上記に定義される虚血性の脳および閉塞後の血液サンプルの両方において著しく差次的に発現した遺伝子のみを比較し、共通する著しく差次的に発現した遺伝子を同定するために使用した。
データのクオリティコントロール
内部検証
マイクロアレイの結果を検証するために、プローブに特異的な２つのステップのＴａｑＭａｎ Ｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを使用した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。検証のための遺伝子は、差次的な発現のランキングおよび虚血に関連する生物学的なアノテーションに基づき選択された。本発明者らは、標的遺伝子を通じた正規化のためＳＭＣ２を選択した。なぜならば、この遺伝子では、虚血性組織サンプルおよび非虚血性組織サンプルにおいて一定した発現が示されたからである。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＡｓｓａｙのプローブＩＤは、以下の通りであった：ＨＳＰＡ１Ｂ（Ａ ０１ Ｐ０１０７２６）、ＧＡＤＤ４５Ｇ（Ａ ０１ Ｐ０１８０４０）、ＣＤＫＮ１Ａ（Ａ ０１ Ｐ００２５８５）、ＳＭＣ２（Ａ ０１ Ｐ０１９１２４）。
各サンプルの総ＲＮＡ１００ｎｇを使用し、製造社のプロトコルにしたがいＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによりｃＤＮＡを作製した。リアルタイムＰＣＲ反応を、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒ４８０ Ｓｙｓｔｅｍで行った。遺伝子発現を、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ６．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を利用してマン・ホイットニーのＵ検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）を伴う比較ＣＴ法（ΔΔＣＴ法）を使用し、虚血性組織および非虚血性組織の間で比較した。
外部検証
本発明者らは、Ｃｏｏｋら（２０１２． Ｎａｔｕｒｅ． ４８３（７３８８）：２１３−７）による研究からのデータを使用して、本発明者らの結果を検証しようと試みた。この研究はまた、皺脳の霊長類においてではあるが、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）の近縁であるカニクイザルを使用して、脳卒中のトランスクリプトミクスも試験した（Ｓｔｒｅｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ８：４８０）。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）で見出された結果を検証するために、本発明者らは、Ｃｏｏｋらの研究からプラセボおよび非虚血性のトランスクリプトミクスのデータを解析した。プラセボの虚血性および非虚血性のデータは、ＧＥＯ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＧＳＥ３５５８９）から利用し、上述される方法を使用して解析した。
脳−血液遺伝子の重複
脳および血液の差次的な発現結果間の有意な重複は、符号間超幾何学的重複検定（ｒａｎｋ−ｒａｎｋ ｈｙｐｅｒｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｏｖｅｒｌａｐ ｔｅｓｔ）（Ｐｌａｉｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１０． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３８（１７）：ｅ１６９）を使用して、決定した。この方法は、２つのセット間の重複が最も有意であるカットオフを同定するために、選別された遺伝子のリストの可能性のある全ての重複に関して超幾何学的検定を行う。完全な遺伝子の列挙は、２匹のサル間の平均ｌｏｇ倍差により選別した。発現が脳および血液で変化した特定の遺伝子を試験するために、本発明者らは、脳で著しく差次的に発現した遺伝子の選別されたリストを作成し（上記の方法を参照されたい）、血液におけるこれら遺伝子のそれぞれに対する最大倍差を計算した。
ＧＳＥＡ（Ｇｅｎｅ−ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）
ＧＳＥＡは、ＧＳＥＡ ｃｏｍｍａｎｄ ｌｉｎｅ ｔｏｏｌ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０２（４３）：１５５４５−５０）を使用して行った。このツールは、所定のセットの遺伝子を提供し、各セットが、選別された実験リストの上位または低位の近くで多く含まれる（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）かどうかを決定し、これは表現型の役割を表す。ＧＳＥＡは、評価される各遺伝子セットに対するエンリッチメントスコア（ＥＳ）を計算する。このスコアは、セットが選別された実験上の遺伝子リストの上位または低位で過剰に提示される度合いを表す。ＮＥＳ（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）は、遺伝子セットの大きさにより正規化される。
脳および血液の差次的な発現解析からの結果を、ｌｏｇ倍差により選別した。これら列挙は、ＧＳＥＡの事前にランク付けされた関数（ｐｒｅ−ｒａｎｋｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に通した。この解析を、１００の並べかえを使用して行い、１０未満の遺伝子を有する遺伝子セットを除外した。結果得られる遺伝子セットを、ＮＥＳにより選別した。ＧＳＥＡ ＥＳは、遺伝子セットが、選別した遺伝子リストの上位または低位で過剰に提示される度合いを表す。ＥＳは、リストを下に移動し、遺伝子が存在する場合はスコアを増大させ、存在しない場合は減少させることにより、計算される。スコアが増大される大きさは、表現型（所定の遺伝子セット）と遺伝子の相関に応じて変化する。ＥＳは、リストを下に移動させる際に直面する０からの最大偏差である。正のＥＳは、（アップレギュレートされた遺伝子における）リストの上位でのエンリッチメントを表し、負のＥＳは、低位でのエンリッチメントを表す。正規化したＥＳは、遺伝子セットの大きさの差異および遺伝子セットと発現データとの間の相関を構成しており、遺伝子セット間の比較を可能にする。
これら遺伝子セットにおける遺伝子間の相互作用を、ＳＴＲＩＮＧデータベース（Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４４７−５２）を使用して可視化した。遺伝子は、脳において少なくとも２、血液において少なくとも１．５の倍差を有する場合、ＳＴＲＩＮＧへと進ませた。線の太さは、関係が存在することの確実性を表し、大きなノードは、三次構造についての情報が存在するタンパク質を表す。
結果
動物は、虚血を発症してから約５．５時間後に屠殺した。軸位ＭＲＩ拡散強調画像は、両動物においてＭＣＡ局所性虚血を示した（データ不図示）。２つの異なる動物における虚血の体積の解析は、梗塞の体積が、著しく可変性であったことを示した：Ｓ１は、Ｓ２よりも明らかに大きい体積の梗塞を有していた。表面的な梗塞および深い梗塞が、動物Ｓ１およびＳ２で観察された。また梗塞は、両動物においてＴ２フレアー画像で見ることができた。Ｗｉｌｌｉｓ Ａｎｇｉｏ−ＭＲＩは、ＭＣＡが動物Ｓ１では近位で閉塞されており、動物Ｓ２ではあまり明確ではなかったことを示した。また梗塞は、動物Ｓ１およびＳ２において大脳基底核のレベルにおいて、Ｔ１シーケンス上で見ることができた。
遺伝子発現の変化：虚血性脳組織対非虚血性脳組織
この試験では、虚血性脳組織と非虚血性脳組織との間での個別の遺伝子についての発現の変化を測定し、これら変化の作用を、遺伝子セットのレベルで試験した。差次的な発現解析を、虚血性脳組織由来の発現データを、虚血を経ていない対側の半球の対応する領域由来のデータと比較することにより行った。
この解析は、虚血性脳サンプルおよび非虚血性脳サンプルの発現パターンが、明らかに異なるものであることを明らかにした（データ不図示）。遺伝子は、各サルの中で虚血性脳サンプルおよび非虚血性脳サンプルを比較する際に２超の倍差を有し、これら遺伝子がサル間の虚血性組織またはサル間の非虚血性組織を比較する際に差次的に発現しなかった場合（倍差＜２）に、著しく差次的に発現したとみなした。階層的なクラスタリングを、これら上位の差次的に発現した遺伝子（３７の遺伝子）に適用する際に、虚血性サンプルは、非虚血性サンプルとは明らかに無関係にクラスター形成する。
著しく差次的に発現した全ての遺伝子は、アップレギュレートされた（表１）。
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内部検証
マイクロアレイの結果のロバスト性を確認するために、３つの虚血に感受性のある遺伝子（ＨＳＰＡ１Ｂ、ＧＡＤＤ４５Ｇ、ＣＤＫＮ１Ａ）のｍＲＮＡレベルを、動物由来のサンプルを使用してＲＴ−ｑＰＣＲにより定量化した。ＳＭＣ２は、全ての試験サンプルで変わらない発現レベルを呈することが見出されており、内部参照（ハウスキーピング）として使用した。各ＲＮＡサンプルに３回の逆転写を行った後、３回独立したｑＰＣＲを実行し、標的および参照遺伝子の両方に関するアッセイ測定を反復した。全ての遺伝子で、変化の方向および大きさは、マイクロアレイデータと良好に一致した（図１および表２）。
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外部検証
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるＣｏｏｋらの脳卒中の研究（２０１２． Ｎａｔｕｒｅ． ４８３（７３８８）：２１３−７）からのトランスクリプトームデータの解析は、本明細書中記載される結果と非常に異なる結果をもたらした。このアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）の解析は、脳卒中を罹患した組織において多くのアップレギュレートされた遺伝子を明らかにしたが、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）からのデータは、主にダウンレギュレートされた遺伝子を示した。これは、霊長類において脳卒中を誘導することに関して著しく異なる方法によるためである可能性が高い。Ｃｏｏｋらによる研究は、外科的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を使用し、これは、ヒトにおいて通常観察されるものよりも重篤な脳卒中をもたらすことが認められている。このより重篤な脳卒中モデルは、大量の細胞死をもたらすことにより、主にダウンレギュレートされた遺伝子をもたらす可能性がある。
遺伝子セットのエンリッチメント
虚血性脳組織において多く含まれる遺伝子セットは、Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓのＧＳＥＡ（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０２（４３）：１５５４５−５０）を使用して同定した。ＧＳＥＡのＨａｌｌｍａｒｋ遺伝子セットからの上位５つのエンリッチメントな遺伝子セットは、ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリング、アポトーシス、Ｐ５３経路、低酸素、およびＵＶ応答の上昇であり、これら全てはアップレギュレートされていた（表３）。
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セットの１０８の遺伝子のうちの６０が、ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリングの遺伝子セットにおいてコアエンリッチメント（ｃｏｒｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を有していた（ＮＥＳ＝２．９６）。本発明者らがデータを有するこのセットのほぼ全ての遺伝子がアップレギュレートされており、有意にダウンレギュレートされた遺伝子はなかった：１５の遺伝子のみが、最大倍差１．１７にてわずかにダウンレギュレートされる。
アポトーシスの遺伝子セットでは、９８の遺伝子のうち２６が、コアエンリッチメントを有する（ＮＥＳ＝２．５７）。
低酸素の遺伝子セットでは、１１８の遺伝子のうち３３がコアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝２．３８）。
ＵＶ応答の上昇の遺伝子セットの９６の遺伝子のうち３１がコアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝２．３）。
最も有意に多く含まれるダウンレギュレートされた遺伝子セットは、酸化的リン酸化であった。これら遺伝子の１２０のうち８４が、コアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝−２．５７）。
遺伝子産物の相互作用
上位の脳の遺伝子セットのうち脳および血液において著しく差次的に発現される遺伝子（脳において倍差≧２、血液において倍差≧１．５）の遺伝子産物の相互作用を可視化するために、ＳＴＲＩＮＧデータベース（Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４４７−５２）を使用した（データ不図示）。
ＩＬ−６は、ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリング、アポトーシス、および低酸素を提示するネットワークにおいて著しく関連したメンバーであることが知られていた。さらに、ＣＤＫＮ１Ａは、これらネットワークの４つ全てに出現する。ＣＤＫＮ１ＡのＨＭＯＸ１との相互作用は、アポトーシス、ｐ５３経路、および低酸素に関連する遺伝子のネットワークで観察される。遺伝子ＡＴＦ３はまた、４つ全てのネットワークに現れ、これは、上記の３つにおいてＩＬ−６と相互作用する。脳において５位に順位付けられた遺伝子セット（表３）のＵＶ応答の上昇は、このセットにおいて上位で差次的に発現した遺伝子が既知の相互作用を有さないため、示されていない。
遺伝子発現の変化：閉塞前対閉塞後の血液サンプル
脳虚血の間血液において差次的に発現した遺伝子を、全ての閉塞前の血液サンプルを、全ての閉塞後の血液サンプルと比較することにより同定した。階層的クラスタリングを、上位の差次的に発現した遺伝子に適用する際に、閉塞前のサンプルおよび閉塞後のサンプルは、別々にクラスター形成する（データ不図示）。また、この遺伝子クラスタリングに基づき２匹のマカクの血液において異なる発現パターンが表れた。サルＳ１は、サルＳ２よりも顕著なこれら遺伝子のアップレギュレーションを有する。この２匹のサルの区別は、脳の発現パターンでは明らかではない（データ不図示）。
脳サンプルと同様に、血液の差次的な発現結果の遺伝子セットのエンリッチメントを解析した。上位５つのエンリッチメントな遺伝子セットは、ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリング、低酸素、ヘッジホッグシグナリング、炎症性応答、および血管新生である（表４）。
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ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリングおよび低酸素の遺伝子セットは、脳の上位５つの遺伝子セットと同様に出現した（表４）。
ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリングの遺伝子セットにおいて１０８の遺伝子のうち３７が、コアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝１．９２）。
低酸素の遺伝子セットにおいて１１８の遺伝子のうち４２が、コアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝１．９１）。
ヘッジホッグシグナリングの遺伝子セットにおいて２４の遺伝子のうち１０が、コアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝１．７７）。
炎症性応答の遺伝子セットにおいて１１０の遺伝子のうち３５が、コアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝１．７７）。
血管新生の遺伝子セットにおいて２０の遺伝子のうち９つが、コアエンリッチメントを有していた（ＮＥＳ＝１．７６）。
脳および血液の間に共通する差次的に発現した遺伝子
脳および血液からの差次的な発現結果を、倍差により遺伝子を選別した際の有意な重複について試験した。本発明者らは、２つの選別された遺伝子セットが、特に２つの極値：虚血の間最もアップレギュレートされた遺伝子および最もダウンレギュレートされた遺伝子で、著しく類似していることを示している。また本発明者らは、最も有意であるヒートマップからの重複している遺伝子を示した：２１５６のダウンレギュレートされた遺伝子が、脳サンプルおよび血液サンプルの間で有意に重複し、４９３のアップレギュレートされた遺伝子が、有意に重複する（図２）。これら遺伝子の大部分は、比較的低い発現倍差を有するが、差次的に発現した遺伝子の重複は、脳サンプルおよび血液サンプルの間で非常に著しい。
これら重複するセットにおける多くの遺伝子が著しく差次的に発現してはいなかったが、一部は発現しており、これは、本発明者らが最も興味を持っている脳での発現において非常に著しい変化を有するものである。脳において著しく差次的に発現したと同定された遺伝子のうち、９つは、同様に血液でも差次的に発現した（倍差≧１．５；表１、太線で強調）。これら遺伝子の９つ全てが、最も有意な超幾何学的重複の中で生じる（太線）。これら遺伝子は、ＰＴＧＳ２、Ｇ０Ｓ２−ｌｉｋｅ、ＤＵＳＰ１、ＬＤＬＲ−ｌｉｋｅ、ＨＭＯＸ１、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＢＡＧ３、ＡＤＭ、およびＴＭ４ＳＦ１である。これら遺伝子の大部分は、血液の発現において急増し、時間経過とともに横ばいになる（図３および４）。
論考
ＭＣＡの動脈にヒトトロンビンを注射した非ヒト霊長類モデル（Ｇａｕｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ． ３３（４）：３２９−３９）を使用して、虚血性脳卒中の間の遺伝子発現変化のパターンを試験した。これは、部分的なＭＣＡ虚血を伴う局所性虚血の塞栓性モデルである。６時間の時間枠を、治療介入がヒトで可能である時間のウインドウであるため（血栓溶解 発症後最大４ｈ３０分、血栓除去 発症後最大６ｈ）、使用した。
本発明者らの脳および血液由来のマカクのマイクロアレイ発現データの試験は、虚血性サンプルおよび非虚血性サンプルが、それらの発現プロファイルに基づき区別され得ること、および著しく差次的に発現した遺伝子の大部分が、虚血から６時間後に虚血性のシナリオにおいてアップレギュレートされることを明らかにした。これらアップレギュレートされた遺伝子の多くは、細胞死およびＤＮＡ損傷修復に関与する経路に属する。脳および血液において差次的に発現した遺伝子の比較は、遺伝子発現パターンの有意な重複を明らかにした。
これら結果は、脳および血液でのトランスクリプトミクスを介して虚血性脳卒中を同定する見込みを表している。
虚血性脳における遺伝子発現
データのクオリティーを、ＰＣＡ解析により確認し、両サルにおいて遺伝子発現により虚血を非虚血と区別することが可能であることを示した。さらに内部検証は、作成した結果を支援するものであった。
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）の脳の発現データの階層的クラスタリングは、虚血性脳サンプルおよび非虚血性脳サンプルの強力に独立したクラスタリングを明らかにした（データ不図示）。これら結果は、発現プロファイルに基づき虚血性脳組織を同定する可能性を表すものであった。最も有意に差次的に発現した遺伝子は、アップレギュレートされており、これは、マウスでの以前の多くの虚血の研究と一致している（Ｂｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５２：１−１４； Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ． ５（２）：２７０−８３）。この研究は、脳において著しく差次的に発現した遺伝子を、両サルにおいて最小２の倍差を有する遺伝子として定義し、これら遺伝子は、サル間で非虚血性サンプルを比較する際またはサル間で虚血性サンプルを比較する際には差次的に発現していない（倍差＜２）。本発明者らの解析結果は、脳において３７の遺伝子がアップレギュレートされ、ダウンレギュレートされるものはなかったことを見出した。これら結果は、６時間後に１１５のアップレギュレートされた遺伝子および１９のダウンレギュレートされた遺伝子を見出したＢｕｔｔｎｅｒらの結果と同様である（Ｂｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５２：１−１４）。Ｂｕｔｔｎｅｒらにより同定された多数の遺伝子は、上記よりも大きな使用される発現プロファイルアレイおよび種間の発現差異により説明され得る。
虚血性脳組織において全ての著しく差次的に発現した遺伝子がアップレギュレートされた。これら遺伝子の多くは、様々な機能、特にストレス応答、アポトーシス、およびシグナル伝達において、虚血性脳卒中でアップレギュレートされる遺伝子として以前に同定されている。
アップレギュレートされたストレス応答遺伝子の中に、７つの熱ショックタンパク質ＨＳＰＡ１Ｂ（Ｈｓｐ７０）、ＨＳＰ４０、ＨＳＰＢ１、ＨＳＰＡ４Ｌ、およびＤＮＡＪＡ４（Ｈｓｐ４０−ｌｉｋｅ）があった（表１）。多くの研究が、熱ショックタンパク質を虚血において著しくアップレギュレートされると同定している（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １０８（１−２）：８１−９３； Ｂｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５２：１−１４； Ｋａｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． ２４（２）：２１２−２３； Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５（１２）：１９３７−５２）。この遺伝子のヒトのオルソログは、凝集に対してタンパク質を安定化させるストレス誘導性遺伝子として十分に特徴づけられており、ユビキチン−プロテアソーム経路に関与している（ＮＣＢＩ， Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿００５３４６．５）。Ｈｓｐ７０は、虚血性脳卒中において最も共通して報告されているアップレギュレートされる熱ショックタンパク質である（Ｃｏｘ−Ｌｉｍｐｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １５６４：８５−１００）。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）では、熱ショックタンパク質ファミリーＡ（Ｈｓｐ７０）のメンバー１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）は、虚血性脳組織において最もアップレギュレートされる遺伝子である。マウスでのＨＳＰＡ１Ｂノックアウト試験は、この遺伝子を欠いた心臓細胞が、虚血による損傷の影響をより受けやすいことを示した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． １１３（２２）：２５８９−９７）。脳虚血の研究により、ｈｓｐ７０ノックアウトマウスが、野生型マウスよりも大きな梗塞体積を経たこと（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｓｔｒｏｋｅ． ３５（９）：２１９５−９）、およびＨｓｐ７０を過剰発現するマウスが、梗塞の大きさを減少させ、神経機能を改善させること（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８． Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． ２８（１）：５３−６３）が示された。マカクにおいて高レベルのＨＳＰＡ１Ｂの差次的な発現は、これがまた虚血を経た霊長類の脳においても神経保護的な役割を有し得ることを表す。これらマイクロアレイから最も差次的に発現した遺伝子のうちの１つは、熱ショックタンパク質のホモログである、ＤＮＡＪＢ１であることに留意することも興味深い。
ＮＰＡＳ４は、神経保護物質としても知られている、別の著しく差次的に発現されるストレス応答遺伝子である（Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． １６（１２）：２９０１１−２８）。この転写因子は、脳のニューロンで発現され、興奮性ニューロンおよび抑制性ニューロンの早期反応においてある役割を有する。この発現は、ストレス下に神経細胞を置く様々な状況により誘導される。本発明者らの研究では、ＮＰＡＳ４はＳ１で３．５７、Ｓ２で２．６５のｌｏｇ２倍差を有した（表１）。ＮＰＡＳ４により制御される遺伝子Ｃ−ＦＯＳ（Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３３４（６０６３）：１６６９−７５）もまた、はＳ１で２．５３、Ｓ２で３．７７のｌｏｇ２倍差にて本発明者らの研究で著しく差次的に発現されている。Ｃ−ＦＯＳは、一般に脳虚血の存在下でアップレギュレートされることが見出されている（Ｃｏｘ−Ｌｉｍｐｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １５６４：８５−１００）。
遺伝子活性化転写因子３（ＡＴＦ３）は、次に最も差次的に発現した遺伝子である。ＡＴＦ３は、転写因子のｃＡＭＰ応答性エレメント結合（ＣＲＥＢ）ファミリーのメンバーをコードする。これは、細胞のストレス応答に関与する。ＡＴＦ３は、Ｓ１で２．９９、Ｓ２で３．３８のｌｏｇ２倍差を経た（表１）。さらに、この遺伝子は、上位のＧＳＥＡ遺伝子セットの中で著しく結びついている（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）メンバーである（データ不図示）。マウスでの以前の実験は、ＡＴＦ３のノックアウトが脳虚血後により大きな梗塞体積を有し、神経機能を悪化させたことを見出した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． ２２０：１００−８）。
虚血性脳組織でアップレギュレートされた他の重要なストレス応答遺伝子は、２つの損傷誘導性遺伝子ＧＡＤＤ４５ＧおよびＧＡＤＤ４５Ｂ（Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ−Ｄａｍａｇｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ４５）である。ＧＡＤＤ４５遺伝子は、ＤＮＡ修復に関与している。ＧＡＤＤ４５ＧはＳ１で２．２５、Ｓ２で２．０４のｌｏｇ２発現倍差を経ており、ＧＡＤＤ４５Ｂでは、これはそれぞれ１．０８および２．１７であった。熱ショックタンパク質と同様に、Ｇａｄｄ４５の遺伝子ファミリーは、脳虚血を試験した多くのげっ歯類の研究により、アップレギュレートされることが報告されている（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １０８（１−２）：８１−９３； ７−９， ２０）。虚血の間のラット脳の以前の解析は、これら遺伝子の発現が、一時的な広範囲の虚血により誘導されることを明らかにした（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８． Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． １８（６）：６４６−５７）。これら研究者は、これが、これら遺伝子に関する神経保護的な役割を表し得ると結論付けた。本発明者らの結果は、虚血の間のこの発現の増大が霊長類でも起こることを示し、虚血性細胞応答におけるこの役割をさらに暗示している。
アポトーシス性遺伝子ＢＡＧ３もまた、虚血性脳組織で有意にアップレギュレートされ、Ｓ１で１．７、Ｓ２で２．９７のｌｏｇ２倍差を伴う。ラットでの脳虚血の発現の研究もまた、この遺伝子が著しくアップレギュレートされることを報告した（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １０８（１−２）：８１−９３）。細胞骨格タンパク質の溶解が虚血後に起こることが知られており（Ｌｉｐｔｏｎ， １９９９． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ． ７９（４）：１４３１−５６８）、興味深いことに、本発明者らは、遺伝子のＡＲＣ（ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）が、虚血性脳組織でアップレギュレートされる（Ｓ１で１．８４、Ｓ２で１．９のｌｏｇ２倍差）ことを観察した。ＡＲＣのアップレギュレーションは、ラットでの以前の脳虚血の研究で観察されている（Ｂｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５２：１−１４）。
脳虚血に関与している別のクラスの遺伝子は、Ｄｕｓｐ（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ）である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １３７２：１３−２１）。これらタンパク質産物は、ＭＡＰＫタンパク質を不活性化させることができる。２つのＤｕｓｐ遺伝子のＤＵＳＰ１（Ｓ１で１．４３、Ｓ２で１．４３のｌｏｇ２倍差）およびＤＵＳＰ５（Ｓ１で１．０５、Ｓ２で１．６７のｌｏｇ２倍差）が、本発明者らの研究で著しくアップレギュレートされた。興味深いことに、Ｄｕｓｐ５は、ｐ５３の標的であることが示唆されている（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００３． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． ２２（３６）：５５８６−９１）。
血液における遺伝子発現の変化
血液で観察される発現パターンは、脳のパターンと類似していたが、この試験において、血液のトランスクリプトミクスに関する限定がいくつか存在した。比較的少数のサンプル（各サルで時点あたり１つのサンプル）であるため、時間経過解析は、実現可能ではなかった。時間経過解析の代わりに、閉塞の前に回収したサンプルを、ペアワイズ法で各閉塞後のサンプルと比較した。遺伝子セット解析を行うために、発現において最大の変化をもたらした比較からの差次的な発現結果を、ＧＳＥＡで使用した。この解析により関与した遺伝子セットは、脳での発現パターンと強力な相関を示した。
血液発現レベルの階層的クラスタリングは、閉塞前のサンプルおよび閉塞後のサンプルが、独立してクラスター形成することを明らかにした（データ不図示）。この区別は、脳サンプルの場合ほど厳密ではないが、閉塞前および閉塞後の間の遺伝子発現において依然として明確な差異が存在している。これら結果は、さらなる実験が脳卒中の診断に使用され得る血液バイオマーカーのパネルを明らかにし得ることを示唆している。この研究における少数のサンプルおよび個体のため、診断で使用され得る遺伝子のサブセットを特定することは困難ではあるが、明確な発現パターンは、サンプルの大きさが大きい場合、これが可能であり得ることを示唆している。
脳虚血を経たマカクの血液において差次的に発現した遺伝子の本発明者らの解析は、脳と同様に、血液における転写物の大部分がアップレギュレートされることを明らかにした。サンプルがサル間で集められ、全ての閉塞後サンプルが集められる場合、６５１の遺伝子が、高レベルの差次的な発現（２超の倍差）を有し、そのうちの５１３がアップレギュレートされる。
これら差次的に発現した遺伝子の中でも特に、４つのＳ１００遺伝子：Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ｐ、およびＳ１００Ａ９がある。Ｓ１００は、グリア細胞由来のカルシウム結合タンパク質である。このグループの最も著しく差次的に発現したものは、Ｓ１００Ａ８であり（３．２９のｌｏｇ２倍差、ｐ＝０．０２７；データ不図示）、これは、炎症促進性機能と強く関連している（Ｓｅｄａｇｈａｔ ＆ Ｎｏｔｏｐｏｕｌｏｓ， ２００８． Ｈｉｐｐｏｋｒａｔｉａ． １２（４）：１９８−２０４）。
脳虚血に関与する遺伝子セット
脳
脳発現データのＧＳＥＡは、虚血性脳サンプルでアップレギュレートされるＤＮＡ修復およびアポトーシスに関与するいくつかの遺伝子セットを明らかにした。上位５つのエンリッチメントな遺伝子セットは、ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリング、アポトーシス、ｐ５３経路、低酸素、およびＵＶ応答の上昇であった。これら経路の一部は、以前の研究で脳虚血に関連すると記載されている。
脳における大部分のエンリッチメントな遺伝子セットは、ＮＦ−κＢを介した腫瘍壊死因子α（ＴＮＦＡ）シグナリングである。ＴＮＦＡサイトカインは、炎症性応答に関与するＮＦＫＢを活性化する。多くの以前の研究が、炎症促進性サイトカインのアップレギュレーションを報告している（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １０８（１−２）：８１−９３； Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００４． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ７７（６）：８４３−５７； Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｓｔｒｏｋｅ． ４０（５）：ｅ３３１−９）。
同様に、アポトーシスおよびｐ５３経路に関与する遺伝子セットがアップレギュレートされた。これら経路は、ＤＮＡ損傷または細胞ストレスの事象において活性化され、以前の研究は、様々なアポトーシス促進性因子のアップレギュレーションを記載していた（Ｂｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５２：１−１４）。
さらに、ＮＦＫＢおよびｐ５３の経路は、神経保護に寄与することが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００５． Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ． ２５（１）：３０−４０； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１． Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ． １４（８）：１５０５−１７）。
遺伝子ＩＬ−６が、ＴＮＦＡシグナリング、アポトーシス、および低酸素の経路の著しく関連したメンバーであることに留意することは興味深い（データ不図示）。この遺伝子は、Ｓ１およびＳ２の脳サンプルで、それぞれ１．０８および１．５３の発現におけるｌｏｇ２倍差の増加を有する。ＨＭＯＸ１−ＣＤＫＮ１Ａの相互作用はまた、いくつかの遺伝子セット（アポトーシス、ｐ５３、および低酸素）を通して共通しており、ＨＭＯＸ１のアップレギュレーションもまた重要である。
血液
血液由来の差次的な発現結果のＧＳＥＡは、シグナリング、低酸素、および炎症性応答に関与する経路を明らかにした。虚血性血液サンプルに多く含まれる上位５つの遺伝子セットは、ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリング、低酸素、ヘッジホッグシグナリング、炎症性応答、および血管新生であった。
興味深いことに、脳における大部分のエンリッチメントな遺伝子セットのうちの２つ：ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリングおよび低酸素応答は、同様に血液でも多く含まれている。これら経路は、両方とも、虚血応答のモデルに良好に適合する。ＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリングの遺伝子セットにおける１０８の遺伝子のうち３７は、血液においてコアエンリッチメントを有し（ＮＥＳ＝１．９２）、低酸素応答の遺伝子セットにおける１１８の遺伝子のうち４２は、コアエンリッチメントを有する（ＮＥＳ＝１．９１）。遺伝子セットのＮＦＫＢを介したＴＮＦＡシグナリングは、脳においてセットの５０％超がコアエンリッチメントを有し、血液において３０％超がコアエンリッチメントを有しているため、虚血に最も関与する経路であると思われる。
脳および血液の間で共通する発現
脳および血液の差次的な発現を比較するために、全ての遺伝子を、倍差により選別し、全ての見込みのある超幾何学的重複を試験し、これにより、遺伝子のリストにおいてアップレギュレートされた遺伝子およびダウンレギュレートされた遺伝子の有意な重複が存在することが明らかにした。アップレギュレートされた遺伝子およびダウンレギュレートされた遺伝子の最も有意な超幾何学的重複の本発明者らの解析は、交差が、それぞれ４９３および２１５６の遺伝子を含むことを明らかにした（図２）。
血液発現データのさらなるより厳密な解析も行い、ここで各サルにおける閉塞前および閉塞後のサンプルを別々に比較し、最大倍差をもたらす時点のみを保存した。これら結果を、脳の発現データと統合し、遺伝子を、脳（倍差≧２）および血液（倍差≧１．５）での著しい差次的な発現に関してフィルタリングした。９つの遺伝子が、脳および血液の両方において著しく差次的に発現したと同定された（表１）。これら遺伝子の９つ全てが、上述される最も有意な超幾何学的重複に現れる。
これら上位９つの遺伝子は、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＰＴＧＳ２、ＢＡＧ３、ＡＤＭ、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ−ｌｉｋｅ、およびＧ０Ｓ２である。ＨＳＰＡ１Ｂ、ＢＡＧ３、およびＤＵＳＰ１は、以前のセクションで論述されている。これら遺伝子の大部分は、発現で急激に増加し、時間を経て横ばい状態になる（図３および４）。
プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２／ＣＯＸ２）は、プロスタグランジンの生合成においてある役割を果たす酵素である。この遺伝子は、炎症の間アップレギュレートされることが知られており、アスピリンの標的である。アスピリンは、プロスタグランジンの産生を抑制し、ある用量は、脳卒中のリスクを下げる（Ｔｏｈｇｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２． Ｓｔｒｏｋｅ． ２３（１０）：１４００−３； Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． １０５（１４）：１６５０−５）。
血液におけるアドレノメデュリン（ＡＤＭ）遺伝子の発現レベルは、虚血性脳卒中の重症度に関連することが示されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． Ｉｎｔ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２４（４）：２７１−８０）。Ｌｉｕらは、末梢性血液の白血球におけるＡＤＭの発現レベルが、組織損傷の重症度を表し得ることを示唆している。この仮説はまた、サルＳ１が、Ｓ２よりも、ＭＲＩにより示されるように（データ不図示）大きな梗塞体積を有しており、血液においても高いＡＤＭの発現レベルを有しているため本発明者らの結果に関連している。しかしながらこの発現パターンは、脳では反転されている。
ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ１）は、本発明者らが以前に論述した熱ショックタンパク質のファミリーのメンバーである。これは、脳卒中のような酸化ストレス介在性損傷に対する細胞の防御システムの一部であると考えられている（Ｃｈｅｎ ＆ Ｍａｉｎｅｓ， ２０００． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）． ４６（３）：６０９−１７）。さらに、以前の研究により、脳虚血後の脳においてＨＭＯＸ１がアップレギュレートされることが見出されている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７． Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ． ２６（７）：１６２２−１６３４）。
結論
本発明者らのデータは、虚血性脳と血液との間に共通するシグネチャーが存在することを示しており、虚血性脳卒中を有する患者を特徴づけるため、および／または虚血性脳卒中を有する患者における神経保護薬物の評価のためのコンパニオンバイオマーカーを開発するための、生検トランスクリプトーム発現プロファイリング用のツールとして、血液のトランスクリプトミクスの発展を支援する。
血漿中細胞外ノンコーディングＲＮＡ（ｅｘ−ＲＮＡ）が、標的組織における遺伝子発現のネットワークを直接制御する循環性ＲＮＡ分子のクラスであることは知られているが（Ｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１７． Ｓｔｒｏｋｅ． ４８（４）：８２８−８３４）、脳および血液において共通するＲＮＡコーディング配列のプロファイルを同定することは極めて予想外なことであった。この、脳虚血を有する患者の血液で観察される虚血関連遺伝子の発現パターンは、Ｍｏｏｒｅらによる研究（２００５． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． １１１（２）：２１２−２１）において以前に記載されている。Ｍｏｏｒｅらは、ＰＢＭＣ自体が低酸素性ではないにもかかわらず、脳が低酸素状態であったことを介して、ＰＢＭＣの低酸素に関連した遺伝子を見出した。さらに本発明者らの結果は、血液が虚血性脳卒中を確認するための診断ツールとして使用され得るとのＭｏｏｒｅらの結論をさらに推し進めている。
実施例２：臨床試験のプロトコル
本発明者らは、ＭＣＡの動脈にヒトトロンビンを注射した非ヒト霊長類モデル（Ｇａｕｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１２． Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ． ３３（４）：３２９−３９）を使用した。本発明者らの試験は、虚血性サンプルおよび非虚血性サンプルが、虚血から６時間後のそれらの発現プロファイルに基づき区別され得ることを明らかにした。同定されたアップレギュレートされた遺伝子は、細胞死およびＤＮＡ損傷修復に関与する経路に属している。脳および血液で差次的に発現した遺伝子の比較は、遺伝子発現パターンの有意な重複を明らかにした。
まとめると、これら結果は、脳および血液におけるトランスクリプトミクスプロファイルを介して虚血性脳卒中を同定する見込みを示した。
脳および血液において最も有意に重複する９つのアップレギュレートされた遺伝子が同定され、ヒト試験にさらに使用される。
本発明者らは、サルから作製したデータをヒトへ変換することを提案する。虚血性脳卒中の霊長類モデルにおける虚血性脳および末梢血の両方で同定されたアップレギュレートされた遺伝子は、２０名の虚血患者、２０名の出血性患者および一致する対照由来のサンプルで試験される。次に本発明者らは、他の心血管疾患ですでに行われたような迅速な検出試験を将来的に開発することを可能にするために、対応するタンパク質を探索する。
パイロット症例対照試験
患者における脳卒中指標（ｉｎｄｅｘ ｓｔｒｏｋｅ）の前にスコア（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｓｃｏｒｅ）により測定された年齢、性別、および心血管リスクと対形成された初めての虚血性脳卒中である症例を用いた症例対照試験。
虚血性の症例は、ブレストの脳卒中登録所（Ｂｒｅｓｔ ｓｔｒｏｋｅ ｒｅｇｉｓｔｒｙ）から採用される。この登録所は、１年あたり９００名の患者を含む。対照のグループは、１つのセンター（Ｂｒｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｏｓｐｉｔａｌ）から採用される。
主目的：
発現が有意に増大すると同定された遺伝子に基づくＲＮＡ血液バイオマーカー試験を決定するため。
試験設計：
患者における脳卒中指標の前にスコア（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｓｃｏｒｅ）により測定された年齢、性別、および心血管リスクと対形成された初めての虚血性脳卒中である症例を用いた症例対照試験。
プライマリーエンドポイント：
虚血発症から６時間後に同定された各遺伝子の発現（ｌｏｇ２で測定）。
プライマリー統計解析：
各候補遺伝子の発現を、対形成されたデータについてスチューデント検定を用いて、症例および対照において比較する。
セカンダリー統計解析：
各遺伝子の発現を、虚血性脳卒中の急性期とその３か月後との間で、症例について比較する。
完全な試験のためのサンプルの大きさの推定：
症例と対照との間の差異は、対照と比較して症例で１．５倍に設定され（倍差 ＦＣ＝１．５およびｌｏｇ２ＦＣ＝０．５８５）、ｌｏｇ２発現強度の標準偏差では、１未満に設定される（個人的なデータ）。
これら仮説（差異＝０．５８５および標準偏差＝１）、９０％の検出力および試験の多重度に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いる場合、必要とされる対象の推定数は、１１０の症例および１１０の対照である。この計算は、応答の相関レベルが不明であるため、対形成することにより提供される検出力の見込みのある増加の作用を考慮していない。
試験対象患者基準
患者：
１８歳超；６時間未満での頸動脈虚血性脳卒中の発症；６時間前にＴ１血液サンプルを有することができる；血栓溶解または血栓除去に適合可能。
最初のＮＩＨＳＳスコア＞０；虚血性脳卒中と適合可能なＣＴまたはＭＲＩのイメージングを有する患者；ＭＲＩまたはＣＴ灌流のいずれかを介してペナンブラを解析することが可能なマルチモーダルイメージング、ならびに大動脈上部の血管および脳内血管（Ｗｉｌｌｉｓ動脈輪）のイメージングを有する患者。
除外基準は、脳内出血を伴う患者を含む。
対照：
年齢＞１８歳超；脳卒中なし、画一化されたアンケート；心血管疾患を伴うことのなく、脳卒中のない高いリスクの心血管対象。
症例報告書（ＣＲＦ）：
各患者および対照に、人口動態および臨床上の特徴、心血管のリスク因子、および現在の処置を、ブレストの脳卒中登録所の画一化されたレポート形式で記録させる。
大脳のイメージング：
急性期に、灌流ＭＲＩまたはＣＴおよびＭＲＡ（ａｎｇｉｏ−ＭＲ）または血管スキャン。
臨床およびイメージングでの経過観察：
患者では、３カ月±１５日でのランキンスコア、および３カ月±１５日での脳のＭＲＩ。
患者あたりのサンプル数：
血液４２ｍＬは、６回の異なる時間：脳卒中の発症から６時間未満、１２時間±２、２４時間±４、４８時間±４、７日±２日、および３カ月±１５日後に、採取される。
対照あたりのサンプルの数：
各対象で血液４２ｍＬを１回採取する。
患者および対照の数：
虚血性の症例では２０名の患者；年齢、性別、およびＥｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ ｓｃｏｒｅに関して虚血性の症例と一致した２０名の対照。
出血性の患者
出血性の症例は、虚血性のグループの場合と同様に患者あたり同じサンプル数にて、異なるグループとしてブレストの脳卒中登録所から採用される。
試験対象患者基準
患者：
年齢＞１８歳；６時間未満での脳内出血の発症；６時間前にＴ１血液サンプルを有することができる。
最初のＮＩＨＳＳスコア＞０；出血性脳卒中と適合可能なＣＴまたはＭＲＩのイメージングを有する患者。
除外基準は、外傷性脳内出血を有する患者および虚血性脳卒中を有する患者を含む。
患者の数
出血性の症例では、２０名の患者。
倫理的な態様：
このプロジェクトは、ヘルシンキ宣言の原則および医薬品の臨床試験の実施基準（ＧＣＰ−ＩＣＨＥ６）にしたがい行われる。これは、仏国の臨床試験に関する規則に従いヒト研究倫理委員会に承認されるため提出される。記載済みのインフォームドコンセントは、各参加者から回収される。
データの管理およびバイオバンク：
データの投入は、ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｌｉｎｓｉｇｈｔ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ）により管理されるデータベースの中へ、データ管理者により行われる。バイオバンクは、ブレスト大学病院の生物遺伝資源部門（Ｂｒｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ’ｓ ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）（ＣＲＢ−Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ）により承認されたＮＦＳ ９６−９００において保存される。
患者および対照の採用
採用センター：
患者および対照の表現型および血液の回収は、ブレストのＣＨＲＵを介して行われる。
イメージングの特徴付けおよびデータの処置後の回収
最初の機能的なイメージング（ＣＴまたはＭＲＩ灌流）の目的は、梗塞のコアおよびそのペナンブラをマッピングすること、ならびにＭＲＩで３カ月目に両領域の発展を追跡することである。最初のイメージングは、血管の開通性を考慮している。あるソフトウェアは、ＭＲＩおよびＣＴスキャンの規格化された灌流解析を可能にする。別のソフトウェアは、ＭＲＩ上での最終的な体積の推定、および最初のイメージングで評価されたペナンブラとの比較を可能にする。
イメージングプラットフォーム：
６４列（またはそれ以上）のｍｕｌｔｉ−ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＣＴ ｓｃａｎまたは１．５ Ｔｅｓｌａ ＭＲＩまたは３．０ Ｔｅｓｌａ ＭＲＩスキャナーが、最初のイメージングのための造影媒体を伴い使用される。
データ獲得の方法：
ＣＴ非造影頭部：ＣＴ脳灌流；コンピュータ断層撮影 血管造影（ＣＴＡ）頭頸部；または
拡散強調イメージング（ＤＷＩ）、ＦＬＡＩＲ（ＦＬｕｉｄ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）、およびＧＲＥ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｒｅｃａｌｌｅｄ Ｅｃｈｏ）、飛行時間を使用した頭部の磁気共鳴血管造影（ＭＲＡ）、ＤＳＣ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒａｓｔ）を使用するＭＲ脳灌流、動脈弓および頸部動脈のガドリニウムＭＲＡを含む脳のＭＲ
のいずれか。
ＣＴのグループでは、虚血性コアは、相対的な脳血流または脳血液量（ＣＢＶ）のいずれかにより評価される。患者のＭＲグループでは、虚血性コア（不可逆的に損傷したとみなされる組織）が、見かけの拡散係数（ＡＤＣ）の閾値に基づき評価される。
非常に低灌流の組織が、６秒超の逆畳みこみされたシグナル強度の曲線（Ｔｍａｘ）の閾値の最大シグナルに対する時間に基づき、ＭＲおよびＣＴのグループで評価される。ＤＷＩ病変の体積またはＣＴのＡＳＰＥＣＴＳ（Ａｌｂｅｒｔａ Ｓｔｒｏｋｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅａｒｌｙ ＣＴ Ｓｃｏｒｅ）が、ＭＲＩまたはＣＴでそれぞれ記録される。閉塞の位置（内頸動脈（ＩＣＡ）、Ｍ１、Ｍ２、脳底、または閉塞なし）が記録される。
３カ月目に、ＤＷＩ、３Ｄ Ｔ２−ＦＬＡＩＲおよび３Ｄ Ｔ１ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｅｃｈｏ、Ｔ２（ＧＲＥ）、ＴＯＦを使用した頭部のＭＲＡを含む脳のＭＲ。
イメージング後の処理
灌流イメージング（ＣＴまたはＭＲＩ）の生のＤＩＣＯＭデータを、灌流ミスマッチ解析器ソフトウェアを使用して後処理される。最終的な梗塞体積を、断片化法によりＴ２ ＦＬＡＩＲで測定する。Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ＬａＴＩＭ−ＩＮＳＥＲＭ ＵＭＲ １１０１ Ｂｒｅｓｔ）からのエンジニアが、この試験に参加する。

Claims (15)

  1. 対象の脳卒中（ｓｔｏｋｅ）を診断する方法であって、
    ｉ）ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定することにより前記対象から得られたサンプル中のシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは前記少なくとも２つのバイオマーカーが、ＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない、ステップと、
    ｉｉ）ステップｉ）で決定したシグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップと、
    ｉｉｉ）前記シグネチャー中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルが前記参照シグネチャー中の同じ少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルよりも高い場合に、前記対象を、脳卒中を罹患していると診断するステップと
    を含む、方法。
  2. ステップｉ）が、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも３つのバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. ステップｉ）が、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭの発現レベルを測定するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記参照シグネチャーを、実質的に健常な対象の参照集団において前記バイオマーカーの発現レベルを測定することにより得る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 脳卒中をｓｔｒｏｋｅ ｍｉｍｉｃと区別するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 脳卒中を罹患している対象が治療での応答を達成するかどうかを決定する方法であって、
    ｉ）ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定することにより前記対象から得られたサンプル中のシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは前記少なくとも２つのバイオマーカーがＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない、ステップと、
    ｉｉ）ステップｉ）で決定したシグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップと、
    ｉｉｉ）前記シグネチャー中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルが前記参照シグネチャー中の同じ少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルよりも低い場合に、前記対象が応答を達成すると結論付けるステップと
    を含む、方法。
  7. ステップｉ）が、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭから選択される９つのバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記参照シグネチャーを、前記治療の開始前に同じ対象から得たサンプル中の前記バイオマーカーの発現レベルを測定することにより得る、請求項６または７に記載の方法。
  9. 対象が脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、
    ｉ）ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭからなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーの発現レベルを測定することにより前記対象から得たサンプル中のシグネチャーを決定するステップであって、ただし好ましくは前記少なくとも２つのバイオマーカーが、ＤＵＳＰ１およびＡＤＭを構成しない、ステップと、
    ｉｉ）ステップｉ）で決定したシグネチャーを参照シグネチャーと比較するステップと、
    ｉｉｉ）前記シグネチャー中の少なくとも３つのバイオマーカーの発現レベルが前記参照シグネチャー中の同じ少なくとも３つのバイオマーカーの発現レベルよりも高い場合に、前記対象が脳卒中を有するリスクがあると結論付けるステップと
    を含む、方法。
  10. ステップｉ）が、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１、ＬＤＬＲ、ＨＳＰＡ１Ｂ、Ｇ０Ｓ２、ＢＡＧ３、ＴＭ４ＳＦ１、ＤＵＳＰ１、およびＡＤＭから選択される９つのバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記参照シグネチャーを、実質的に健常な対象の参照集団における前記バイオマーカーの発現レベルを測定することにより得る、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記対象が脳卒中を経験したことがあり、前記方法が、前記対象が再発性脳卒中を有するリスクがあるかどうかを決定するためのものである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 脳卒中が、虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作、または出血性脳卒中である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記サンプルが、血液サンプル、血漿サンプル、または血清サンプルである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記サンプルが、脳サンプルではない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
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