JP2021522519A - 感染症の技術分野における白血球補充 - Google Patents
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Abstract
本発明はアッセイに関するものであるが、それに限定されたものではなく、白血球接着機能アッセイ(LAFA)、そのようなアッセイの機器および/または方法を使用するものを含む。本発明は、診断、分析的および/または予測的な適用、特に異常な宿主免疫反応を伴う疾患に関する診断、分析的および/または予測的な適用で開示された実施例の適用にも関連するものである。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明はアッセイに関するものであるが、それに限定されたものではなく、白血球接着機能アッセイ(LAFA)、そのようなアッセイの機器および/または方法を使用するものを含む。本発明は、診断、分析的および/または予測的な適用、特に異常な宿主免疫反応を伴う疾患に関する診断、分析的および/または予測的な適用で開示された実施例の適用にも関連するものである。
全身性炎症反応症候群(SIRS)は、非感染性であるか感染性の外因性の侵襲に対する複雑な炎症性の全身反応である。非感染性の原因は大手術、外傷、熱傷と重度組織損傷を含む一方、細菌性、真菌性またはウイルス性の感染性の原因は敗血症症候群を臨床的に定義づける。クリニックでは、伝染性および非伝染性のSIRSはほぼ同一の病態生理を共有する。
さまざまな原因があるため、全身性炎症の非伝染性および伝染性の原因に対する治療は大きく異なる。抗生物質療法が非伝染性の原因には適用されない一方、抗生物質療法と感染源のコントロールは敗血症治療の第一選択治療法である。一方、全身性炎症でICU入室を許可される大部分の患者では、これらの2つの疾患の大きな類似性により、迅速かつ正確に疾患の病因を究明することは困難である。現在の診療業務では感染症の可能性が疑われるならば、患者に抗生物質を与え、非感染性の原因の患者への抗生物質の濫用が頻繁に起こる。担当臨床医が全身性炎症の原因が敗血症でないことを納得するまで、抗生物質は続けられる。非伝染性の原因による患者では、抗生物質のこの不適切な使用が、他の回避可能な副作用のみならず耐性病原体が出現する結果をもたらす恐れがある。
このためクリニックでは、正確迅速に敗血症と非感染性SIRSを区別することに役立つことから、生存率を改善して、治療の副作用を回避する目的でより標的を絞った治療を早期に適用できる。敗血症を非感染性SIRSと区別するためには、大部分の取り組みは、患者の血液および/または組織中の潜在的病原体の決定と特徴づけに注力した。現在、血液培養はSIRSの患者における感染性病原体の同定の標準規格である。一方、血液培養の結果判明には通常12−72時間を必要とするが、ガイドラインは感染の疑いから1時間以内の抗生投与を推奨する。つい最近では、多くの微生物の検出用に他の分子検査が市販されるようになったが、それらにはProve−itTMアッセイ、Verigene(登録商標)、FilmArray(登録商標)およびPNA−FISHが挙げられる。しかしながら、迅速性の欠如、低い感度と特性とにより、臨床設定でこれらの技術の広範囲にわたる使用が妨げられてきた。敗血症の状態に対して役立つ適用であるにもかかわらず、敗血症患者の最高50%は血液培養結果が陰性であり、培養陽性結果は敗血症の診断のために必須でないことが判明した。このように、病態は感染症そのもののみならず、感染症に応答する宿主免疫系の反応も示す。宿主免疫系の生物マーカーの同定になされた取り組みがこれまでにあり、それは宿主免疫反応の状態を決定して、敗血症の診断を支援することを意図していた。これらの標識はプロカルシトニン(PCT)、C反応性蛋白(CRP)を含み、骨髄細胞1(TREM−1)およびデコイ受容体3(DCR3)上で受容体発現を誘発する。これらのマーカーの検定時の迅速性と特性の欠如は、依然として上記の技術の重大な欠点である。
このように、敗血症と非感染性炎症の状態を区別して、伝染性の原因対非感染性の原因を有する全身性炎症の治療に対する被検者の潜在的反応を予測する方法、システムおよび/または装置に対するニーズが依然としてある。
要約
一部の実施例において、本発明は被験者で感染性および非感染性の炎症性免疫反応を区別するための以下の方法を提供するが、その方法は以下によって成り立っている。
一部の実施例において、本発明は被験者で感染性および非感染性の炎症性免疫反応を区別するための以下の方法を提供するが、その方法は以下によって成り立っている。
被検者の血液サンプルを少なくとも1回分の白血球機能アッセイの対象(LAFA)とするが、そこではLAFAは白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に一部基づいて、被験者が感染性の炎症性免疫反応か非感染性の炎症性免疫反応を呈するか否かを究明する。
1つの実施例において、少なくとも1つのLAFAは定量的および/または半定量的に、白血球補充、接着および/または遊走を評価する。
1つの実施例において、その方法は被験者から血液サンプルを得ることから成る。
1つの実施例において、少なくとも1つの内皮細胞分子は、VCAM−1、MAdCAM−1、IL−8、SDF−1α、E−セレクチン、P−セレクチンとICAM−1から選択される。
実施例において、少なくとも1つの内皮細胞分子は、VCAM−1、MAdCAM−1、IL−8、SDF−1α、−セレクチン、P−セレクチンとICAM−1のうちの2つ以上から成る。
実施例1件では、少なくとも1つのLAFAは、以下のパラメータの1つ以上を測定する。すなわち、検出されたローリングする白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出された遊走白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均直線性、検出された個々の白血球細胞の平均的移動および検出された個々の細胞の平均滞留時間。
実施例1件では、被験者からの血液サンプルからの少なくとも1件のLAFAが、1つ以上のインデックスを作成するために使われる1つ以上のパラメータを生成する参考レベルとして使用されている。
実施例1件では、健常血液サンプルからの少なくとも1件のLAFAの結果が、1つ以上のインデックスを作成するために使われる1つ以上のパラメータを生成する参考レベルとして使用されている。
実施例1件では、被検者の血液の活性化電位比率は、被験者のMn2+治療をうけた血液サンプルから少なくとも1つのLAFAの結果によって分けた被験者の血液から少なくとも1つのLAFAの結果に基づいて作成されている。
実施例1件では、その方法はさらに1つ以上の白血球細胞表面マーカーを検出することを含む。
実施例1件では、1つ以上の白血球細胞マーカーは、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19およびCD25から選択している。
実施例1件では、1つの実施例において、被験者には全身性炎症反応症候群(SIRS)に罹患しているか、罹患しているとの疑いがある。
実施例1件では、その方法は白血球補充、接着および/または遊走を白血球補充、接着および/または遊走の参照レベルと比較することから成る。
実施例1件では、白血球補充、接着および/または遊走の参照レベルは、確立したデータセットに由来する。
実施例1件では、確立したデータセットは、感染性の炎症性免疫反応を呈することが知られている被験者の集団および/または非感染性の炎症性免疫反応を呈することが知られている被験者の集団の白血球補充、接着および/または遊走の測定値から成る。
実施例1件では、伝染性の炎症性免疫反応があることが知られている被験者の集団が敗血症に罹患していることが知られている。
実施例1件では、非感染性の炎症性免疫反応があることが知られている被験者集団がSIRSに罹患していることが知られている。
実施例1件では、LAFA結果は以下から成り立つ。
i)補充された白血球および/または接着性白血球の高値または低値、
ii)補充された白血球および/または接着性好中球の割合高値または低値、高値または低値、
iii)補充された単球および/または接着性単球のより高値または低値、参考レベルと比較すると敗血症を示し、
ここでは参考レベルは非感染性SIRSを呈することが知られている被験者集団に由来する。
ii)補充された白血球および/または接着性好中球の割合高値または低値、高値または低値、
iii)補充された単球および/または接着性単球のより高値または低値、参考レベルと比較すると敗血症を示し、
ここでは参考レベルは非感染性SIRSを呈することが知られている被験者集団に由来する。
実施例1件では、その方法は被験者が感染性の炎症性免疫反応を呈すことを見つけ出し、被験者に抗菌製剤か抗ウイルス製剤を投与することから成る。
もう1つの実施例では、その方法は被験者が非感染性の炎症性免疫反応を呈すことを見つけ出し、被験者に抗炎症製剤を投与することから成る。
実施例1件では、その方法は被験者が非感染性の炎症性応答を呈すると確認して、被験者に白血球補充、接着および/または遊走を修正可能な薬剤を投与することから成る。
実施例1件では、例えば、薬剤は内皮細胞分子への白血球接着分子の接着に干渉する抗体であると考えられる。
特定の実施例では、薬剤はα4インテグリンとその内皮分子の間の接着に干渉する抗体であると考えられる。その薬剤は、抗ヒトα4インテグリン抗体であると考えられる。特定の実施例において、薬剤はナタリズマブである。
特定の実施例では、薬剤はα4β7インテグリンとMAdCAM−1の間の接着に干渉する抗体であると考えられる。薬剤は、例えばベドリズマブと考えられる。
特定の実施例では、薬剤はCD11α(αL)とICAM−1との間の接着に干渉する抗体であると考えられる。薬剤は、例えばエファリズマブまたはオデュリモマブと考えられる。
特定の実施例では、薬剤はCD11a(αL)とICAM−1との間の結合に干渉する抗体であると考えられる。薬剤は、例えばUK279またはUK276と考えられる。
特定の実施例では、薬剤はβ2インテグリンとその内皮分子の間の結合に干渉する抗体であると考えられる。薬剤は、例えばエファリズマブまたはロベルリズマブと考えられる。
特定の実施例では、薬剤はβ7インテグリンとその内皮分子の間の結合に干渉する抗体であると考えられる。薬剤は、例えばエトロリズマブと考えられる。
一部の実施例では、被験者の炎症性免疫反応を治療する方法が提供されているが、それはこの中に述べられるような方法、被験者が炎症性免疫反応を呈すると確認する方法および炎症性免疫反応を治療する方法から成る。
実施例1件では、被験者は敗血症である。
実施例1件では、被験者の敗血症の治療は、患者を1剤以上の抗生物質、昇圧剤および副腎皮質ステロイドの薬剤以上で治療することから成る。
一部の実施例では、感染症治療にふさわしい薬剤への被験者の反応または潜在的反応を評価する方法が以下のように提供されている。
被検者の血液サンプルを少なくとも1回分の白血球機能アッセイの対象(LAFA)とするが、そこではLAFAは、白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に一部基づいて、感染症治療薬剤に対して患者の反応または潜在的な反応を評価する。
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に一部基づいて、感染症治療薬剤に対して患者の反応または潜在的な反応を評価する。
一部の実施例では、炎症性免疫反応を呈している被験者に白血球のサブセットを検出する方法が提供される。そして、その方法は被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象とするが、ここではLAFAは白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価することから成り、
1つ以上の白血球細胞表面マーカーを検出して、
少なくとも1つ以上のLAFAの結果と1つ以上の白血球細胞表面マーカーの検出に基づいて、炎症性免疫反応と関連した白血球のサブセットを究明する。
1つ以上の白血球細胞表面マーカーを検出して、
少なくとも1つ以上のLAFAの結果と1つ以上の白血球細胞表面マーカーの検出に基づいて、炎症性免疫反応と関連した白血球のサブセットを究明する。
実施例1件では、その方法は1つ以上の白血球細胞表面マーカーの検出および/または1つ以上の白血球のサブセットの検出から成る。
実施例1件では、被験者には炎症状態または炎症疾患がある。
実施例1件では、被験者はSIRSに罹患しているか、罹患している疑いがある。
実施例1件では、被験者は敗血症である。
一部の実施例では、被検者の炎症の原因を究明する方法が提供されており、その方法は被験者から血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、そこではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価することから成り、そして
少なくとも1回のLAFAの1つ以上の結果に基づいて、被験者の炎症の原因を究明する。
少なくとも1回のLAFAの1つ以上の結果に基づいて、被験者の炎症の原因を究明する。
実施例1件では、その方法は1つ以上の白血球細胞の表面マーカーを検出することから成る。
実施例1件では、1つ以上の白血球細胞マーカーは、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19およびCD25から選択している。
実施例1件では、その方法は1つ以上の白血球細胞の表面マーカーを検出および/または白血球の複数のサブセットを検出することから成る。
実施例1件では、被験者の炎症の原因は感染性の炎症原因と決定された。
実施例1件では、炎症の感染性の原因は細菌、ウイルスまたは寄生虫感染であった。
特定の実施例1件では、細菌感染は、腸内細菌、セラチア属、シュードモナス属、大腸菌および黄色ブドウ球菌の1つ以上に起因する感染症から選択されている。
実施例1件では、被験者の炎症原因は非感染性であった。
実施例1件では、非感染性の炎症原因は心筋梗塞、喘息、出血、動脈瘤および/または間質性肺炎から選択されている。
一部の実施例では、この中に述べられるように、その方法に基づく少なくとも1つのLAFAを行うためのシステムが提供されている
一部の実施例では、この中に述べられるように、その方法に基づく少なくとも1つのLAFAを行うための機器が提供されている。
一部の実施例では、被験者における感染性と非感染性の炎症性免疫反応を分類する方法が提供されており、その方法は次の通り。
被検者の血液サンプルを少なくとも1回分の白血球機能アッセイの対象(LAFA)とするが、そこではLAFAは、白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走のビデオデータをキャプチャーし、そして
被験者が感染性の炎症性免疫反応か非感染性の炎症性免疫反応を呈するか否かを究明するためにビデオデータに機械学習を適用する。
被験者が感染性の炎症性免疫反応か非感染性の炎症性免疫反応を呈するか否かを究明するためにビデオデータに機械学習を適用する。
実施例1件では、ビデオデータは複数の画像から成り、
ビデオデータへの機械学習適用は次から成っている。
複数画像を単一画像に組み合わせて、機械学習を単一画像に適用している。
ビデオデータへの機械学習適用は次から成っている。
複数画像を単一画像に組み合わせて、機械学習を単一画像に適用している。
実施例1件では、複数画像の組み合わせは複数の像を1つの像に結合するための最大値投影法から成る。
実施例1件では、機械学習の適用は、畳み込みニューラルネットワークを1つの像に適用することから成る。
実施例1件では、畳み込みニューラルネットワークを1つの像に適用することが、感染性および非感染性の炎症性免疫反応で複数の訓練検体の各々の単一訓練画像を使用して、検査を受けている被験者の単一画像に訓練された畳み込みニューラルネットワークを適用することから成る。
実施例1件では、その方法はさらに次から成っている。
細胞追跡パラメータ値を測定するために細胞追跡を行うこと、および
機械学習を細胞追跡パラメータ値に適用すること。
細胞追跡パラメータ値を測定するために細胞追跡を行うこと、および
機械学習を細胞追跡パラメータ値に適用すること。
実施例1件では、その方法は、機械学習をパラメータ値の追跡に適用すること、ランダムフォレストを細胞追跡パラメータに適用することから成る。
実施例1件では、細胞追跡パラメータは、ランダムフォレスト中にノードツリーで表されている。
実施例1件では、ランダムフォレストを単一画像に適用することは、感染性および非感染性の炎症性免疫反応で複数の訓練検体の各々の単一訓練画像を使用するランダムフォレストの訓練および、検査を受けている被験者の単一画像に訓練されたランダムフォレストを適用することから成る。
一部の実施例では、被験者の炎症の原因を究明する方法が提供されているが、その方法は以下から成る。
被験者からの血液サンプル少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走のビデオデータをキャプチャーし、被験者の炎症の原因を究明するビデオデータに機械学習を適用すること。
被験者からの血液サンプル少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走のビデオデータをキャプチャーし、被験者の炎症の原因を究明するビデオデータに機械学習を適用すること。
一部の実施例では、被験者における感染の前駆症状検出のための方法が提供されており、その方法は以下から成る。
被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に基づいて、被験者が感染症に罹患しているか否かを究明する。
被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に基づいて、被験者が感染症に罹患しているか否かを究明する。
一部の実施例では、その感染はウイルス感染である。たとえば、実施例1件ではその感染はインフルエンザ感染と考えられる。
一部の実施例では、SIRSの前駆症状検出のための方法が提供されており、その方法は以下から成る。
被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に基づいて、被験者がSIRSに罹患しているか否かを究明する。
被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に基づいて、被験者がSIRSに罹患しているか否かを究明する。
一部の実施例では、SIRSは感染性SIRSである。
一部の実施例では、SIRSは非感染性SIRSである。
一部の実施例では、速度、拡散係数および/または直線性から選択される1つ以上のパラメータの減少は、感染、感染性SIRSおよび/または非感染性SIRSを示す。この仕様全体を通じて、用語「構成する」または「構成する」の変化形から、要素、完全体または段階のグループまたは要素、完全体または段階を含むと理解されるが、その他のいかなる要素、完全体またはそれらのグループの除外を意味しないと理解される。
以下の図は現在の仕様の一部を構成しており、更に本発明の特定の側面をさらに明らかにするために含まれている。本発明は、この中に示される特定の実施例の詳しい説明と組み合わさって、これらの図の1つ以上を参照することによってよりよく理解されると考えられる。
白血球接着機能アッセイ(LAFA)用のマイクロ流体システムの例を示す。接着性の基剤(例えばヒトVCAM−1タンパク質)をマイクロ流体チャネルの底に被覆した。ヒト全血をそのチャネルを通して注ぎ、基質とヒトの白血球の間の相互作用が可能になり、そしてそれが蛍光顕微鏡で検出される。さまざまなヒトの白血球に特定の細胞膜マーカー(例えばCD4−Alexa488、CD8−PEおよびCD15−25 APC、CD19−BV510)に対してさまざまな蛍光プローブ結合抗体を用いて標識して、複数の白血球サブセットの同時検出を可能にした。
(A)従来の画像およびデータの解析に対するフローチャートの例。特定の典型的な実施例にしたがい、白血球接着機能アッセイ(LAFA)でとらえた画像を処理して、Fiji画像分析ソフトウェアからTrackMateを使用して分析した。TrackMateから出力された画像は記述統計を作成するRプログラムによって、更に分析した。画像分析プロセスに関与したスクリプトの活用法も示した。(B)生の画像に基づいた機械学習分析のフローチャートの例を図示する。生の画像は時間とともに標準偏差の予測に変換して、アルゴリズムを「基本」と「異常」の状態を区別するための訓練に用いる。訓練は通常初回のみ必要とされ、その後、ステップ2bは省略できる。(C)追跡結果に基機械学習分析のためのフローチャート例を例示する。TrackMate結果(ステップ4aで取得)は、アルゴリズムを「基本」と「異常」の状態を区別するための訓練に用いる。訓練は通常初回のみ必要とされ、その後、ステップ2cは省略できる。
VCAM−1基剤上でLAFAで測定したα4β1インテグリン接着機能に対するMn2+治療の効果。血液サンプルは健常ボランティアから採取し、続いてLAFAに使用する前に5mMのMncl2の有無にかかわらず処理した。続いて細胞密度(A)、速度(B)、拡散係数(C)、直線性(D)、滞留時間(E)と飛跡長(F)をCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25細胞で測定した。データは、グループ毎のn=7−13独立被験者の平均+−SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01。
MAdCAM−1基剤上でLAFAで測定したα4β7インテグリン接着機能に対するMn2+治療の効果。血液サンプルは健常ボランティアから採取し、続いてLAFAに使用する前に5mMのMncl2の有無にかかわらず処理した。細胞密度(A)、速度(B)、拡散係数(C)、直線性(D)、滞留時間(E)と飛跡長(F)をCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25細胞で測定した。データは、グループ毎のn=12独立被験者の平均+−SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01。
健常対照者およびSIRS患者の全血球数血液サンプルは健常対照者およびSIRS患者から採取した。全血球算定は、製造者の指示に従い、Mindray BC5000血液分析装置を使用して実施した(A)。各白血球の亜集団の割合を続いて測定した(B)、*p<0.05、**p<0.01。
基質としてVCAM−1を使用して健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。相互に作用しているCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。相互に作用している細胞中で、特異的な細胞の亜集団の割合をパネルCで測定した。(細胞型の%)/(血流中の%細胞型)として定義したR因子を算出した(D)。細胞の亜集団の細胞速度(E)、拡散係数(F)、直線性(G)、滞留時間(H)および飛跡長(I)も測定した。データは、グループ毎にn=13(健常者)と14人の(SIRS患者)の平均+−SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01。
非感染性SIRS患者グループを感染性SIRS患者グループと区別するためのLAFA(VCMA−11)の使用。14例のSIRS患者は、患者のカルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染性SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)、および3)不明(n=3)。血液サンプルは健常ボランティア(n=13)とSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。全血球算定は、Mindray BC5000血液分析装置を使用して実施した(A)。全血サンプルは続いて基剤としてVCAM−1を用いてLAFAにより分析した。相互に作用している細胞については、特異的な細胞の亜集団の割合をパネルBで測定した。(細胞型の%)/(血流中の%細胞型)として定義したR因子を算出した(C)。CD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度はパネルDで測定した。細胞密度は適切な細胞数によっても標準化した(E)。
健常者群と3つのSIRS群における細胞密度(A)、速度(B)、拡散係数(C)、直線性(D)、滞留時間(E)と飛跡長(F)を評価した。健常対照者では*p<0.05、**p<0.01。非感染群では#p<0.05。
A−Dは、個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためにVCAM−1基質上でLAFAによって作成した単一細胞速度プロファイルの使用を例示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の速度をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Dは、個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためにVCAM−1基質上でLAFAによって作成した単一細胞速度プロファイルの使用を例示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の速度をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためのVCAM−1基質上でLAFAによって作成した単一細胞の拡散係数プロファイルの使用。血液サンプルはSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の拡散係数をその後測定した。標準的な微生物検査(血液培養検査)とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためのVCAM−1基質上でLAFAによって作成した単一細胞の拡散係数プロファイルの使用。血液サンプルはSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の拡散係数をその後測定した。標準的な微生物検査(血液培養検査)とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためにVCAM−1基質上でLAFAによって作成した単一細胞の直線度プロファイルの使用。血液サンプルはSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の直線度をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためにVCAM−1基質上でLAFAによって作成した単一細胞の直線度プロファイルの使用。血液サンプルはSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の直線度をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Iは、基質としてLAFA+IL−8を用いて健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用を例示する。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCAM−1+IL−8基質上でLAFAによって分析した。相互に作用しているCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は適切な細胞数(B)によっても標準化した。相互に作用している細胞中で、特異的な細胞の亜集団の割合をパネルCで測定した。(細胞型の%)/(血流中の%細胞型)として定義したR因子を算出した(D)。細胞の亜集団の細胞速度(E)、拡散係数(F)、直線度(G)、ドウェル時間(H)およびトラック長(I)も測定した。データはグループ毎のn=13(健常者)と14名の(SIRS)独立被験者の平均±SEMを示す。*p<0.05、**p<0.01。
A−Fは、非感染性SIRS患者グループと感染性のSIRS患者グループを区別するために、VCAM−1+IL−8基剤に対するLAFAの使用を例示する。14例のSIRS患者は、カルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染性SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。血液サンプルは15人の健常なボランティア(n=13)とSIRS患者から採取して、その後VCAM−1+IL−8基質上でLAFAによって分析した。CD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。健常者およびSIRSの3グループの細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線度(E)およびドウェル時間(I)も評価した。データは平均±SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連する。
A−Iは、基質としてVCAM−1+SDF−1αを用いて健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用を例示する。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCAM−1+SDF−1α基質上でLAFAによって分析した。相互に作用しているCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は適切な細胞数(B)によっても標準化した。相互に作用している細胞中で、特異的な細胞の亜集団の割合をパネルCで測定した。(細胞型の%)/(血流中の%細胞型)として定義したR因子を算出した(D)。細胞の亜集団の細胞速度(E)、拡散係数(F)、直線度(G)、ドウェル時間(H)およびトラック長(I)も測定した。データは、グループ毎にn=13(健常者)と14人の(SIRS患者)の平均±SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01。
A−Fは、非感染性SIRS患者グループと感染性のSIRS患者グループを区別するために、VCAM−1+SDF−1α基剤に対するLAFAの使用を例示する。14例のSIRS患者は、患者のカルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染性SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。血液サンプルは健常ボランティア(n=13)とSIRS患者から採取し、その後VCAM−1+SDF−1α基質上でLAFAによって分析した。CD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。健常者よびSIRSの3グループの細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線度(E)およびドウェル時間(I)も評価した。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連する。#p<0.05、##p<0.01は健常対照者に関連する。
A−Iは、VCAM−1基剤上でSIRS患者の白血球接着機能に対するMn2+効果を評価するために、白血球接着機能アッセイ(LAFA)の使用を例示する。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取して、VCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、室温で5分間5mMのMnで処理した。相互に作用しているCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。相互に作用している細胞中で、特異的な細胞の亜集団の割合をパネルCで測定した。(細胞型の%)/(血流中の細胞型%)として定義されているR因子を算出した(D)。速度活性化電位比(SAPR)、拡散係数活性化電位比(DCAPR)、直線度活性化電位比(STAPR)、ドウェル時間活性化電位比(DTAPR)およびトラック長活性化電位比(TLAPR)を続いて計算した(E−I)。データは、グループ毎にn=13(健常者)と14人の(SIRS患者)独立した被検者の平均±SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01。
16A−Fは、感染性のSIRS患者グループから非感染性のSIRS患者グループを区別するためのVCAM−1基剤上でのLAFAの使用を例示するが、それはMn2+の存在下であった。14例のSIRS患者は、カルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染性SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。血液サンプルは健常ボランティア(n=13)とSIRS患者から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。CD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。速度活性化電位比(SAPR)、拡散係数活性化電位比(DCAPR)、直線性活性化電位比(STAPR)、滞留時間活性化電位比(DTAPR)を計算した(C−F)。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連。#p<0.05、##p<0.01は非感染群に関連。
A−Iは、基質としてP−セレクチン+E−セレクチンを用いて健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用を例示する。血液サンプルは、健常ボランティアとSIRS患者から採取して、その後P−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。相互に作用しているCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。相互に作用している細胞中で、特異的な細胞の亜集団の割合をパネルCで測定した。(細胞型の%)/(血流中の%細胞型)として定義したR因子を算出した(D)。細胞の亜集団の細胞速度(E)、拡散係数(F)、直線性(G)、滞留時間(H)および飛跡長(I)も測定した。データは、グループ毎にn=13(健常者)と14人の(SIRS患者)独立した被検者の平均±SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01。
非感染性のSIRS患者グループと感染性のSIRS患者グループを区別するために、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でのLAFAの使用を例示する。14例のSIRS患者は、カルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。血液サンプルは健常ボランティア(n=13)とSIRS患者から採取し、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でのLAFAによって分析した。CD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。健常者およびSIRSの3グループの細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)および滞留時間(I)も評価した。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連。#p<0.01は非感染群に関連。
A−Dは、個々のSIRS患者で特定のPSGL−1接着機能を評価するために、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でのLAFAによって作成される単一細胞の速度プロフィールの使用を図示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、続いてP−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の速度をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Dは、個々のSIRS患者で特定のPSGL−1接着機能を評価するために、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でのLAFAによって作成される単一細胞の速度プロフィールの使用を図示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、続いてP−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の速度をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Dは、30例の個々のSIRS患者で特定のPSGL−1接着機能を評価するために、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって作成する単一細胞拡散係数プロファイルの使用を例示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、続いてP−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の拡散係数をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者も含めた参考として。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Dは、30例の個々のSIRS患者で特定のPSGL−1接着機能を評価するために、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって作成する単一細胞拡散係数プロファイルの使用を例示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、続いてP−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用しているCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の拡散係数をその後測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者も含めた参考として。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Dは、5名の個々のSIRS患者で特定のPSGL−1接着機能を評価するために、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって作成する単一細胞拡散係数プロファイルの使用を例示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、続いてP−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用するCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の直線性を続いて決定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Dは、5名の個々のSIRS患者で特定のPSGL−1接着機能を評価するために、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって作成する単一細胞拡散係数プロファイルの使用を例示する。血液サンプルはSIRS患者から採取し、続いてP−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互作用するCD15+CD16+(A)、CD4(B)、CD8(C)およびCD19(D)細胞の直線性を続いて決定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS(合計14名)の全身炎症反応の原因を決定した(表3)。3人の健常被験者は参考文献にも含めた。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
A−Cは、VCAM−1基質上でLAFAで測定されるSIRS患者における白血球補充に対するナタリズマブの効果を例示する。血液サンプルを健常な被験者とSIRS患者から採取して、VCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、ナタリズマブ30g/mlの有無にかかわらず5分間室温で処理した。CD15+CD16+(A)、CD4(B)およびCD8(C)細胞の細胞密度を続いて測定した。14例のSIRS患者は、カルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。データは平均±SEMを示す。NC=未治療の対照、NAT=ナタリズマブ治療した。*p<0.05、**p<0.01。
A−Bは、非感染性SIRS患者を感染性SIRS患者群から区別するための血清中C−反応性蛋白(CRP)の使用を例示する。14例のSIRS患者は、カルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。血液サンプルは健常ボランティア(n=13)とSIRS患者から採取し、血清中CRP(A)濃度をELISAによって測定した。
A−Fは、基質としてMAdCAM−1を使用して健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの使用を図示する。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後MAdCAM−1基質上でLAFAによって分析した。相互作用するCD4、CD8およびCD15+CD16+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。細胞速度(C)、細胞の亜集団の拡散係数(D)、直線性(E)および滞留時間(F)も測定した。データは、グループ毎にn=13(健常者)と14人の(SIRS患者)独立した被検者の平均±SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01。
A−Iは、非感染性SIRS患者群を感染性SIRS患者群から区別するためのLAFA(MAdCAM−1)の使用を例示する。14例のSIRS患者は、カルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。血液サンプルは健常ボランティア(n=13)とSIRS患者から採取し、その後MAdCAM−1基質上でLAFAによって分析した。相互作用するCD4、CD8およびCD15+CD16+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。健常者およびSIRSの3グループの細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)および滞留時間(F)も評価した。データは平均±SEMを意味する。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に欄連。#p<0.05、##p<0.01は非感染群に関連。
A−Iは、MAdCAM−1基剤上でSIRS患者の白血球接着機能に対するMn2+効果を評価するために、白血球接着機能アッセイ(LAFA)の使用を例示する。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取して、MAdCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、室温で5分間5mMのMn2+で処理した。相互作用するCD4、CD8およびCD15+CD16+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。細胞の亜集団の細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)および滞留時間(F)も測定した。データは、グループ毎にn=13(健常者)と14人の(SIRS患者)独立した被検者の平均±SEMを意味する。*p<0.05。
A−Fは、感染性のSIRS患者グループから非感染性のSIRS患者グループを区別するためのMAdCAM−1基剤上でのLAFAの使用を例示するが、それはMn2+の存在下であった。14例のSIRS患者は、カルテに基づいて次のように3つの群に分けた。1)非感染SIRS(n=6)、2)感染性SIRS(n=5)および3)不明(n=3)。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取して、MAdCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、室温で5分間5mMのMnで処理した。CD4、CD8 and CD15+CD16+細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。健常者およびSIRSの3グループの細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)および滞留時間(F)も評価した。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連。#p<0.05、##p<0.01は健常対照者に関連。
P+Eセレクチン基質を用いてLAFAによって測定した白血球接着機能に対して予想されるウイルス感染の作用。血液サンプルを次の3つの感染段階で採取した。すなわち、「−」は健常、「+」はインフルエンザの症状なしの潜伏期間、そして、「++」は重度インフルエンザ症状によるインフルエンザ期。血液サンプルを基質としてP+Eセレクチンを用いてLAFAにより分析した。そのデータはLAFAアッセイから追跡した個々の細胞に検出したパラメータを表すが、それには、速度(A)、拡散係数(B)、直線性(C)、滞留時間(D)、飛跡長(E)および転移(F)が含まれる。それぞれの点は細胞を表す。*p<0.05、**p<0.01。
基質としてVCAM−1を用いてLAFAによって測定した白血球接着機能に対して予想されるウイルス感染の作用。血液サンプルを次の3つの感染段階で採取した。すなわち、「−」は健常、「+」はインフルエンザの症状なしの潜伏期間、そして、「++」は重度インフルエンザ症状によるインフルエンザ期。血液サンプルは基剤としてVCAM−1を用いてLAFAにより分析した。そのデータはLAFAアッセイから追跡した個々の細胞に検出したパラメータを表すが、それには、速度(A)、拡散係数(B)、直線性(C)、滞留時間(D)、飛跡長(E)および転移(F)が含まれる。それぞれの点は細胞を表す。*p<0.05、**p<0.01。
基質としてP+Eセレクチンを使用して健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用。血液サンプルを健常ボランティア(n=14)と28名のSIRS患者(初回採取14+追加採取14名)から採取して、P+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。患者のカルテと血液培養結果に基づいて、SIRS患者を非感染SIRS(n=11)、感染SIRS(n=10)および不明(n=8)に分類した。相互に作用しているCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。それぞれの細胞の亜集団の細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)、滞留時間(F)、飛跡長(G)および転移(H)を測定した。血液サンプルの全白血球数もパネルIに示す。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連。#p<0.05は非感染群に関連。全血検査のFEBストランド
個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためのP+Eセレクチン基質上でLAFAによって作成した単一細胞のプロファイルの使用。血液サンプルは健常ボランティア(n=6)とSIRS患者(n=28)から採取し、その後セレクチン基質上でLAFAによって分析した。それぞれ相互に作用するCD4(A)およびCD15+CD16+(B)細胞を、続いて測定した。標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS患者の全身炎症反応の原因を決定した(表3および表5)。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
基質としてVCAM−1を使用して健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用。血液サンプルを健常ボランティア(n=14)と28名のSIRS患者(初回採取14+追加採取14名)から採取して、続いてVCAM−1基質上でLAFAによって分析した。患者のカルテと血液培養結果に基づいて、SIRS患者を非感染SIRS(n=11)、感染SIRS(n=10)および不明(n=8)に分類した。相互に作用しているCD14、CD15+CD16+、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。それぞれの細胞の亜集団の細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)、滞留時間(F)、飛跡長(G)および転移(H)を測定した。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連。#p<0.05は非感染群に関連。
個々のSIRS患者で特異的な免疫反応を評価するためのVCAM−1基質上でLAFAによって作成した単一細胞の直線性プロファイルの使用。血液サンプルは健常ボランティア(n=6)とSIRS患者(n=28)から採取し、その後VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。血液サンプル中のそれぞれ相互作用するCD19細胞の速度(A)およびそれぞれ相互作用するCD15+CD16+(B)細胞の直線性を続いて測定した。少なくとも一部は標準的な微生物検査とカルテに基づいて、各SIRS患者の全身炎症反応の原因を決定した(表3および表5)。グラフ上の各実点は単一細胞を示す。データは平均±95%の信頼区間を示す。
基質としてVCAM−1+IL−8を使用して健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用。血液サンプルを健常ボランティア(n=14)とSIRS患者(初回採取14+追加採取14名)から採取して、続いてVCAM−1+IL−8基質上でLAFAによって分析した。患者のカルテと血液培養結果に基づいて、SIRS患者を非感染SIRS(n=11)、感染SIRS(n=10)および不明(n=8)に分類した。相互に作用しているCD15+CD16+、CD4およびCD8細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。それぞれの細胞の亜集団の細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)、滞留時間(F)、飛跡長(G)および転移(H)を測定した。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連。#p<0.05は非感染群に関連。
基質としてVCAM−1+SDF−1αを使用して健常対照者とSIRS患者における白血球接着機能を評価するLAFAの利用。血液サンプルを健常ボランティア(n=14)とSIRS患者(初回採取14+追加採取14名)から採取して、続いてVCAM−1+SDF−1α基質上でLAFAによって分析した。患者のカルテと血液培養結果に基づいて、SIRS患者を非感染SIRS(n=11)、感染SIRS(n=10)および不明(n=8)に分類した。相互に作用しているCD15+CD16+、CD4およびCD8細胞の細胞密度を測定した(A)。細胞密度は、適切な細胞数によっても標準化した(B)。それぞれの細胞の亜集団の細胞速度(C)、拡散係数(D)、直線性(E)、滞留時間(F)、飛跡長(G)および転移(H)を測定した。データは平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.01は健常対照者に関連。#p<0.05は非感染群に関連。
本発明は1つ以上実施例に関してさらに詳細に説明しており、その一部の例は添付図面に図示している。例と実施を説明として提供して、開示の範囲への制限として考慮されないこととする。さらに、1つの実施例の一部として例示または説明した特性は、他の実施例を提供するために単独で使用でき、1つの実施例の一部として例示するか説明した特性は、更なる実施例を提供するために、1つ以上の他の実施例で使える。その例と実施例は説明として提供され、開示範囲への制限として扱わない。
一般的な技術および定義
特に定義されていない限り、ここで使用されている専門用語および科学的用語は、技術的に通常技術の1つによって一般的に理解されると同じ意味を持つとみなすべきである(例えば免疫学、免疫組織化学、蛋白質化学、細胞生物学、生化学と化学)。
特に定義されていない限り、ここで使用されている専門用語および科学的用語は、技術的に通常技術の1つによって一般的に理解されると同じ意味を持つとみなすべきである(例えば免疫学、免疫組織化学、蛋白質化学、細胞生物学、生化学と化学)。
特に明記しない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養および免疫手法は、J. Perbalの分子クローニングに対する解説書(A Practical Guide to Molecular Cloning)、John Wiley & Sons(1984)、J. Sambrookら分子クローニング(Molecular Cloning)に記載されており、当業者に知られているような以下の標準操作法である。すなわち、Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001)、T.A. Brown(エディタ)、Essential Molecular Biology:Practical Approach、第1および2版、IRL Press(1991)、D.M GloverとB.D.Hames(エディタ)、DNA Cloning:Practical Approach、第1−4版、IRL Press(1995と1996)およびF.M. Ausubelら(エディタ)、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub。Associates and Wiley−Interscience(1988年、現在までの最新版を含む)、(Ed HarlowおよびDavid Lane(エディタ)Antibodies):A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、(1988)およびJ.E. Coliganら(エディタ)、Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons(現在までの最新版を含む)。
感染症と宿主免疫反応
感染症は外部からの病原体およびその侵入への反応に対する宿主免疫系からの反応によって引き起こされる疾患である。感染性病原体にはバクテリア、ウイルス、真菌、線虫、節足動物および他のマクロ寄生虫がある。210年には、約1500万人が感染症で死亡し、その多くは既知の微生物の小規模な群によって生じた。
感染症は外部からの病原体およびその侵入への反応に対する宿主免疫系からの反応によって引き起こされる疾患である。感染性病原体にはバクテリア、ウイルス、真菌、線虫、節足動物および他のマクロ寄生虫がある。210年には、約1500万人が感染症で死亡し、その多くは既知の微生物の小規模な群によって生じた。
宿主の体内への侵入後、感染性病原体は増殖して有毒な反応物を生産して、細胞と組織の損傷をもたらす。損傷または影響を受けた宿主細胞は、サイトカインとシグナル伝達分子の異常な産生も引き起こし、その一部は血中に放出されて全身反応が生じる。この段階では、宿主免疫系がホメオスタシスの復元に失敗すれば、全身性宿主免疫反応が悪化すると考えられる。そして、それは病原体単独によって直接的に起因する損傷よりも破壊的な結果が生じると考えられる。
感染症の患者を治療するには、感染源を決定して特性化することが有益である。その後、一連の抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬および抗寄生虫薬を使用して、患者の免疫系が侵入している病原体の除去を支援できる。一方、感染症によって引き起こされる制御されていない宿主炎症反応のリスクが原因で、正確に患者の免疫反応の状態をモニターすることも重要であることから、宿主の組織に免疫系によって引き起こされる望ましくない害を回避するために適切な療法を適用する場合がある。
白血球補充
白血球補充処置中に、血流中の白血球は、白血球発現PSGL−1(P−セレクチン・グリコプロテイン・リガンド−1)とその内皮リガンドであるP−セレクチンとEセレクチンとの間の相互作用を経由して内皮細胞の周りに固定して回転する。ケモカインによる細胞活性化の結果、回転する白血球は次第に回転速度を弱める。これによって、細胞間接着分子I型(ICAM−1)を含んで内皮リガンドをともなう白血球β2およびα4インテグリンと血管細胞接着分子−1(VCAM−1)との間に相互作用が生じて、白血球は内皮表面に強力に接着する。例えば、付着した白血球は内皮ICAM−1と相互作用するためにαLインテグリン(CD11a)とαMインテグリン(CD11b)を用いて、白血球は血管外遊出場所を見つける前に内皮表面上を這うことが可能になる。
白血球補充処置中に、血流中の白血球は、白血球発現PSGL−1(P−セレクチン・グリコプロテイン・リガンド−1)とその内皮リガンドであるP−セレクチンとEセレクチンとの間の相互作用を経由して内皮細胞の周りに固定して回転する。ケモカインによる細胞活性化の結果、回転する白血球は次第に回転速度を弱める。これによって、細胞間接着分子I型(ICAM−1)を含んで内皮リガンドをともなう白血球β2およびα4インテグリンと血管細胞接着分子−1(VCAM−1)との間に相互作用が生じて、白血球は内皮表面に強力に接着する。例えば、付着した白血球は内皮ICAM−1と相互作用するためにαLインテグリン(CD11a)とαMインテグリン(CD11b)を用いて、白血球は血管外遊出場所を見つける前に内皮表面上を這うことが可能になる。
このため、内皮細胞と相互に作用する血流中の白血球の能力の評価から、これらの白血球の活動を究明するための有益なツールがもたらされ、そしてそれは宿主免疫反応の状態を反映する。一般的に、病因におけるその原因と直接的な役割にもかかわらず、白血球接着機能は既存の商用試験によって評価できない。
白血球接着機能アッセイ
本発明は白血球接着機能アッセイ(LAFA)を提示する。このアッセイでは、例えば分子レベルで白血球接着機能アッセイの正確かつ定量的な評価が可能になる。
本発明は白血球接着機能アッセイ(LAFA)を提示する。このアッセイでは、例えば分子レベルで白血球接着機能アッセイの正確かつ定量的な評価が可能になる。
LAFAは自己完結型のマイクロ流体/蛍光撮像と分析システムを用いるが、それは生体外でのヒト血液微小循環を模倣する。特異的白血球接着分子の接着機能を研究するために、それに対応する内皮リガンドは、(担体または基質に密接に結合するとき、「内皮細胞分子」または「接着基質」としてもここに言及されている)マイクロ流体チャネルの内面にプレコート可能である。さまざまな白血球の亜集団は、全血中で特定の白血球マーカーに対して蛍光抱合型抗体で標識可能であることから、白血球の複数のサブセットは蛍光顕微鏡で同時に視覚化可能である。血液はそれから定義済み流速でマイクロ流体チャネルを通って灌流可能であり、続いてプリコートされた内皮分子との白血球相互作用を記録できる。このように、このアッセイでは、例えば、定義済み流速でマイクロ流体チャネルを通じた血液の潅流中に、リアルタイムに白血球接着機能の評価が可能である。記録された画像は、続いてアルゴリズムによって分析可能である。多くの細胞動態パラメータは、続いて白血球の特定のサブセットの接着機能の特徴を定量的に描写するために使用できる。単にプリコート基剤を置換することによって、例えば、接着分子を発現している他の白血球の接着機能も類似の方法で評価可能である。
本発明では、たとえばSIRS患者のような炎症性免疫反応を呈する被験者において宿主免疫反応を評価するための新しい標識を特定するためにLAFAを使用した。新規標識の範囲はLAFAによって発生したが、それは続いて、個々の患者におけるさまざまな炎症性免疫反応の決定に用いることができる。ここで開示する結果は、LAFAが特定原因の炎症に基づいて患者を区別するための役立つツールとして役に立ち、個人ベースで最適治療の発達を促進することを示している。
白血球接着機能アッセイは、さまざまな適切なタイプのアッセイと考えられる。その方法は、1つ以上の結果を得るために複数の白血球接着機能アッセイを行うことから成る。白血球接着機能アッセイは、総体的な結果を提供するために1つ以上の特異的検査を含むことがある。
特定の典型的な実施例では、白血球接着機能アッセイの結果は、半定量的および/または定量的であると考えられる。
白血球接着機能アッセイは以下の1つ以上を成し遂げることができる。すなわち、白血球細胞補充の特徴づけること、白血球細胞追跡を特徴づけること、そして白血球の移動挙動を特徴づけることであり、それは半定量的または定量的な方法を用いる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、量的な白血球遊走の決定を必要とする場合がある。これは、以下のうちの1つを検出、計量または観察することを含む場合がある。すなわち、白血球細胞の接着、回転、緩徐な回転、強固な結合、這うことおよび経内皮の遊走である。一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、以下の1つ以上の検出、測定または観察を伴う場合がある。白血球細胞の平均速度、移動、加速、減速、指向性、滞留時間および直線性。
相互に作用している白血球は、速度分布の方法で特徴づけることができる。例えば、相互に作用している白血球は、細胞の平均速度(Smean)によって、次の5つの相互作用型に分けることができる。すなわち、静的細胞(Smean<5μm/分)、這いまわり細胞(Smean=5−20μm/分)、緩徐回転細胞(Smean=20−300μm/分)および回転細胞(Smean=300−6000μm/分)。加えて、ヒストグラムを用いて細胞速度の分布を示すことができる。
特定の実験例では、白血球接着機能アッセイは実際の生理的条件で白血球移動の検出、測定および/または観察を実施する。
一部の実施例では、このアッセイではさまざまな白血球のサブセットの同時検出が可能である。
特定の実施例では、白血球接着機能アッセイにはフローアッセイに関与する。
白血球接着機能アッセイの一部として、血液サンプルを使用前に混合して、1つ以上の細胞染色、1つ以上の化学物質(例えば、α4インテグリン活性化を誘導するマンガンなど)、1つ以上の薬剤(検出可能な部分にかかわらず)、1つ以上の抗体および/または1つ以上の検出可能な部分または他の試薬または薬剤で事前混合、事前処理または事前培養可能である。
一部の実施例では、その方法は生体外で1つ以上の薬剤を用いて、被験者の(ヒトまたは動物)血液を治療して、その後白血球接着能アッセイを行うことから成る可能性がある。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、現実的な生理的状況下で白血球遊走を評価することができる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、蛍光分子または他の検出可能な部分に結合可能な部分で標識された白血球を利用することができる。一部の実施例では、同アッセイは、さまざまな蛍光分子に結合した抗体のサブセットに特有な抗体によって白血球のさまざまなサブセットの検出を実施できる。例えば、抗体または抗体カクテルおよび/または抗体染色は、血液サンプルに加えることができる。例えば、特定の白血球膜標識に対する蛍光標識抗体は、フローアッセイを行う前に血液サンプルに加えることができる。
白血球接着機能アッセイまたはフローアッセイは適切なタイプの機器を用いて白血球遊走などの検出、測定または観察するが、それには、現実の生理的状況下で白血球遊走の検出、測定または観察が含まれる。適切なマイクロフローアッセイおよび/または装置の例が、以下の文書で記述されている。すなわち、US8,940,494;US8,380,443;US7,326,563;WO92/21746;Vaidyanathan(2014)であるが、これらの参考文献の各々のすべての内容はそれらの全てに組み入れられている。
マイクロ流体デバイスをフローアッセイ実施に使用できる。一部の実施例では、さまざまな白血球サブセットおよび/または接着分子を検出するために、フローアッセイでは、例えば1、2、3、4、5、6またはそれ以上のマイクロ流体チャネルがあるマイクロ流体デバイスを使用する。
一部の実施例では、血液サンプルを生体内の血流を模擬するために、マイクロ流体デバイスで検定できる。
一部の実施例では、フローアッセイでは、例えば注射器ポンプを使用して血液サンプルを1つ以上のマイクロ流体チャネルに引き込むか押し込むが、例えば、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、100、150、200、300ダイン/cm2を含む約0.5〜300ダイン/cm2の剪断応力で、血液サンプルを1つ以上のマイクロ流体チャネルに引き入れるか押し込む。
白血球接着機能アッセイでは、内皮接着分子による白血球細胞移動挙動の特性付け、白血球細胞追跡の特性付けまたは白血球細胞補充の特性付けのための視覚分析が可能である。視覚分析は適切な方法で実施できる。例えば、視覚化は顕微鏡と画像記録装置(例えばビデオまたはコマ撮り写真)を使用して達成できる。白血球の転位行動、追跡、補充などは画像記録装置で撮影した画像のコンピューター解析により分析できる。接着性および/または非接着性白血球の種類と数は測定可能であり、それらの個々の速度/挙動は定量的方法で記録できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、白血球細胞の相互作用を捕えるのに十分な期間にわたって高フレームレートで撮像可能である。例えば、そのアッセイは細胞相互作用の型を撮影するために5分間毎秒2コマで撮像できる。一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、白血球の詳細な3D動作を撮影可能である。一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、蛍光顕微鏡検査の時系列を記録できる。
白血球細胞の動態パラメータは以下の方法で導くことができる。記録した一連の画像時間は、相互作用している白血球細胞が検出されたかまたは検出された多くの部分のx、yおよびz(位置)とt(時間)の座標を提供できる。「最も近い近隣者」のような数学的アルゴリズムを使用しているいくつかのフレームの間で同じ白血球細胞の局在性をリンクさせることによって、細胞は細胞運動(以下の1つ以上、すなわち追跡方向、長さ、転位、期間、直線性、平均速度、加速/減速、有方向運動型および/または局限性運動型および/またはランダム運動型)を特徴づけるために得られた時間とさまざまなパラメータについて追跡可能である。それらのパラメータは、続いて、薬物治療に応じてさまざまな白血球細胞の亜集団の運動性挙動または運動性の変化を区別するために使用できる。
あるいは、例えば次に述べられるように白血球細胞を検出する他の方法を使うことができる。すなわち、Nan Sunら(2012)、彼らの全ての言及によってここで組み込まれている全コンテンツ。
例えば、内皮細胞分子は、サポートまたは基質に結合される組換えタンパク質の形状であると考えられる。一部の実施例では、同アッセイではサポートまたは基剤(おそらく、脂質二重層を含む)に固定された複数の内皮分子の使用が必要であり、そして、他の実施例では、同アッセイはそのような内皮細胞分子を発現している実際の細胞を使用することが必要な場合がある。サポートまたは基剤に固定した内皮細胞分子については、多くの技術が例えば、KimとHerr(2013)に参照されており、その結果、組み込まれている。また、そのような分子は以下の文書で記述されており、その全コンテンツは次のように参考としてこの中に組み込まれていう。すなわち、US8,940,494、US8,380,443、US7,326,563、そしてWO92/21746。
白血球接着機能アッセイの粘着性の基剤(すなわち、サポートまたは基質に結合)として使用できる内皮細胞分に子は、以下の1つ以上を含むがそれに限定されるものではない。
1.ここですでに説明した接着分子、
2.ここで言及されたようなケモカインおよび、
3.次の精製された抗原と人工の抗原提示細胞システム。
a.精製された抗原:i)α、βおよびイプシロン毒素およびii)抗原CFA/I
b.人工の抗原提示細胞システム、1)Thomasらが開示したようなもの(2002)および2)Turtleら(2010)、そのそれぞれがこの結果、参照することによりそのすべてが組み込まれている。
4.細胞間の相互作用を調整可能な他の分子(蛋白質を含む)、および
5.ここに公開されているケモカイン受容体。
1.ここですでに説明した接着分子、
2.ここで言及されたようなケモカインおよび、
3.次の精製された抗原と人工の抗原提示細胞システム。
a.精製された抗原:i)α、βおよびイプシロン毒素およびii)抗原CFA/I
b.人工の抗原提示細胞システム、1)Thomasらが開示したようなもの(2002)および2)Turtleら(2010)、そのそれぞれがこの結果、参照することによりそのすべてが組み込まれている。
4.細胞間の相互作用を調整可能な他の分子(蛋白質を含む)、および
5.ここに公開されているケモカイン受容体。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、白血球発現PSGL−1(P−セレクチン・グリコプロテイン・リガンド−1)とその内皮分子であるP−セレクチンおよび/またはEセレクチンとの間の相互作用を検出、測定、観察する。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、α4インテグリン接着機能の定量的評価を実施できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、白血球のα4インテグリン発現と活性化増強を検出、測定または観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、白血球a4インテグリンと内皮VCAM−1との間の相互作用を測定、検出および/または観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、CD11a(αLインテグリン)とICAM−1との間の相互作用を検出、測定および/または観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、CD11b(αMインテグリン)とICAM−1との間の相互作用を検出、測定または観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、α4β7インテグリンとMAdCAM−1との間の相互作用の検出、測定および/または観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、細胞間接着分子I型(ICAM−1)および/または血管細胞接着分子−1(VCAM−1)とそれらの白血球接着分子との間の相互作用を検出、測定および/または観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、白血球β2イングリンおよびその内皮分子との間の相互作用を検出、測定および/または観察できる。
白血球接着機能アッセイは、CD4、CD8およびCD15細胞などの1つ以上の白血球 を検出、測定および/または観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、サイトカインまたはケモカイン(例えばTNFaとIL−4)活性化初代培養内皮細胞(たとえばHUVEC)または固定化内皮細胞系(例えばヒトの微小循環内皮細胞(HMEC))上の白血球転位挙動を検出、測定、観察できる。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイは、同時に、特定の膜標識を用いてサブセットに標識化することによってさまざまな白血球サブセットを検出、測定および/または観察できる。そのような標識はさまざまな蛍光分子に結合可能な抗体の場合がある。
白血球接着機能アッセイは、1件人以上の対照を含むことがある。使用される対照の性質は、アッセイの性質とアッセイ使用方法の性質に依存すると考えられる。例えば、対照は疾患または障害がある(例えば炎または感染症)個人から得られる血液サンプルで
あると考えられる。例えば、対照は薬剤(例えば抗炎症剤)で内科治療中ではない個人から得られる血液サンプルであると考えられる。例えば、制御は薬剤を投与される前、薬物治療を受ける前または、投与計画参加する前、または、投与計画の間に被験者から得られる血液サンプルであると考えられる。対照は、さまざまな個人(コホート)由来のプールされた血液サンプルから成る血液サンプルであると考えられる。
あると考えられる。例えば、対照は薬剤(例えば抗炎症剤)で内科治療中ではない個人から得られる血液サンプルであると考えられる。例えば、制御は薬剤を投与される前、薬物治療を受ける前または、投与計画参加する前、または、投与計画の間に被験者から得られる血液サンプルであると考えられる。対照は、さまざまな個人(コホート)由来のプールされた血液サンプルから成る血液サンプルであると考えられる。
一部の実施例では、その方法/白血球接着機能アッセイは、次のステップから実施できる。1.フローチャネルを内皮分子でプレコートすること、または、フローチャンネル中の内皮細胞モデル、種子細胞と培養細胞、試薬または炎症性のサイトカインまたはケモカイン(例えばTNFα)で細胞を処理することによって内皮接着分子の発現を活性化するのであれば、さまざまな用量の薬剤の有無を問わず(例えば小分子、抗体など)フローチャネルを培養。それにより内皮接着分子機能は変化し、3.被験者からの血液採取、そして4.(薬剤投与なしの対照との比較で)薬効を究明するために、投薬後のさまざまな時刻に白血球接着機能アッセイ分析を行うこと。
白血球と接着分子
白血球を含むが、以下の1つ以上を含むがそれに限定されない。好中球、好酸球、好塩基球、CD4Tリンパ球、CD8Tリンパ球、T調節性細胞、Bリンパ球、樹状細胞、単球およびナチュラルキラー細胞。
白血球を含むが、以下の1つ以上を含むがそれに限定されない。好中球、好酸球、好塩基球、CD4Tリンパ球、CD8Tリンパ球、T調節性細胞、Bリンパ球、樹状細胞、単球およびナチュラルキラー細胞。
白血球の白血球接着分子または他の結合分子は以下の1つ以上を含む。すなわち、セレクチン、インテグリン、ケモカイン、ケモカイン受容体およびその他の分子型である。このように、接着分子は以下の1つ以上を含むがそれらに限定されない。すなわち、PSGL−1、L−セレクチン、α1インテグリン、α2インテグリン、α3インテグリン、α4インテグリン、α5インテグリン、α6インテグリン、α7インテグリン、α8インテグリン、α9インテグリン、α10インテグリン、α11インテグリン、αDインテグリン、αEインテグリン、αVインテグリン、αXインテグリン、CD11α(αLインテグリン)、CD11b(αMインテグリン)、P1インテグリン、P2インテグリン、P4インテグリン、P5インテグリン、P6インテグリン、P7インテグリンP8インテグリン、CD44、ESL−1、CD43、CD66、CD15sとALCAM。
内皮細胞分子
内皮細胞分子は、以下の1つ以上を含む。すなわち、セレクチン、細胞接着分子(CAMs)、ケモカイン、ケモカイン受容体および他のタイプの分子。このように、内皮分子は次の1つ以上を含む。すなわち、E−セレクチン、P−セレクチン、VCAM−1、ICAM−1、ICAM−2、MAdCAM−1、PECAM、GlyCAM−1、JAMA、JAM−B、JAM−C、JAM−4、JAM−L、CD34、CD99、VAP−1、L−VAP−2、ESAM、E−LAM、カドヘリンおよびヒアルロン酸。
内皮細胞分子は、以下の1つ以上を含む。すなわち、セレクチン、細胞接着分子(CAMs)、ケモカイン、ケモカイン受容体および他のタイプの分子。このように、内皮分子は次の1つ以上を含む。すなわち、E−セレクチン、P−セレクチン、VCAM−1、ICAM−1、ICAM−2、MAdCAM−1、PECAM、GlyCAM−1、JAMA、JAM−B、JAM−C、JAM−4、JAM−L、CD34、CD99、VAP−1、L−VAP−2、ESAM、E−LAM、カドヘリンおよびヒアルロン酸。
血液サンプル
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイでは、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、300、400、500、750および1,000μlのように、約5〜1000μlの間の全血量を必要とする。この方法は、被験者から得た1件の白血球接着機能アッセイまたは複数の白血球接着機能アッセイ用の複数の血液サンプルを対象とする場合がある。
一部の実施例では、白血球接着機能アッセイでは、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、300、400、500、750および1,000μlのように、約5〜1000μlの間の全血量を必要とする。この方法は、被験者から得た1件の白血球接着機能アッセイまたは複数の白血球接着機能アッセイ用の複数の血液サンプルを対象とする場合がある。
この方法は、血液サンプルを被験者から分離するステップを含む場合がある。これは、さまざまな適切な方法で達成可能である。例えば、血液は指を刺して滴を集めるか、静脈穿刺によって採取できる。特定の実施例では、血液の滴をその方法に使用できる。特定の実施例では、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90または100μLとして血液約100μL未満が白血球接着機能アッセイに必要と考えられる。特定の実施例では、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90または100μLとして血液約100μL未満が白血球接着機能アッセイに必要と考えられる。
一部の実施例では、血液サンプルは処理済みか否かに関係なく、血液サンプルは全血であると考えられる。一部の実施例では、血液サンプルは処理済みであることから、全血の1つ以上の成分がお互いに分離している。すなわち、一部の実施例では血液サンプルは全血であると考えられ、他の実施例では血液サンプルが全血の1つ以上の白血球成分から成ると考えられる(加工/処理済)。1つの実施例では、血液サンプルは血漿である。
特定の実施例では、血液成分は生体内の血液を模擬するために、全血サンプルから分離していない。特定の実施例では、分離した血球、培養血液細胞および/または血液細胞系を使うことができる。
検体が含む可能性がある血液を採取して、貯蔵するために用いることができる抗凝固剤は、ヘパリン、ETDA、ACD、クエン酸塩、ヒルジン、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムおよびシュウ酸カリウム/フッ化ナトリウムが含まれるが、それに限定されない。
被検対象
被験対象は、哺乳類または他の適切な種類の動物と考えられる。哺乳類にはヒト、霊長類、家畜と畜類(例えばウマ、ヒツジおよびブタ)、ペット(例えばイヌとネコ)および実験動物(例えばラット、マウスおよびウサギ)が含まれる。特定の実施例では、被験者はヒトである。
被験対象は、哺乳類または他の適切な種類の動物と考えられる。哺乳類にはヒト、霊長類、家畜と畜類(例えばウマ、ヒツジおよびブタ)、ペット(例えばイヌとネコ)および実験動物(例えばラット、マウスおよびウサギ)が含まれる。特定の実施例では、被験者はヒトである。
被検対象の取り扱い
被験対象は、その特定の疾患で知られている従来の方向で治療を受けることができる。加えて、被験対象は従来以外の方法で治療を受けることができる。例えば、LAFA分析からの結果に基づいて、ある薬剤が通常この特定の疾患に使われない場合であっても、特定の疾患に罹患した被験者の治療のために薬剤の適合性を反映可能である。
被験対象は、その特定の疾患で知られている従来の方向で治療を受けることができる。加えて、被験対象は従来以外の方法で治療を受けることができる。例えば、LAFA分析からの結果に基づいて、ある薬剤が通常この特定の疾患に使われない場合であっても、特定の疾患に罹患した被験者の治療のために薬剤の適合性を反映可能である。
1つの実施例は、少なくとも1つのLAFAの一部に基づいて、その方法は、被験対象が非感染性の炎症性免疫反応を呈するとの決定、被験者の非感染性の炎症性免疫反応の治療から成る。その治療は、被験者に抗炎症性組成物を投与することから成ると考えられる。抗炎症剤の例には、副腎皮質ステロイドのみならず、セレコキシブ、エトリコキシブ、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、スリンダクおよび/またはその組合せからなる非ステロイド系抗炎症薬を含む。抗炎症剤は、認められた診療に従って多くの投与経路で投与されることがある。好ましい経路には、既知の技術を用いて、静脈内、筋肉内、皮下および経皮投与が含まれる。他の投与経路も予想される。局所の急性炎症状態の治療の場合、急性炎症の部位またはその周辺あたりに治療剤を投与する非全身投与が好まれると考えられる。
1つの実施例は、少なくとも1つのLAFAの一部に基づいて、その方法は、被験対象が非感染性の炎症性免疫反応を呈するとの決定、被験者の非感染性の炎症性免疫反応の治療から成る。被験者の伝染性の炎症性免疫反応を治療することは、例えば抗菌薬または抗ウイルス薬などの適切な抗感染性薬剤で被験者を治療することが含まれる場合がある。細菌性感染症を治療するための抗生物質は周知の技術であって、ペニシリン、セファロスポリン、ポリミキシン、リファマイシン、リピアルマイシン、キノロン、スルホンアミド、マクロライド、リンコサミド、テトラサイクリンおよびアミノグリコシドを含む。
1つの実施例では、その方法は被験者が敗血症(すなわちSIRS患者における感染の存在)に罹患すると確認して、被験者を1種類以上の抗生物質、昇圧剤および副腎皮質ステロイドで治療することから成る。適切なステロイドは以下が挙げられるが、それらのみには限定されないブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンおよび/またはその組合せ。
炎症の原因の究明
感染疾患の患者では、免疫系は外来病原体の侵入により非常に活性化して、高度炎症と白血球接着機能増大に至る。
感染疾患の患者では、免疫系は外来病原体の侵入により非常に活性化して、高度炎症と白血球接着機能増大に至る。
1つの実施例では、ここに述べられる方法は、少なくとも1回の白血球接着機能アッセイ(LAFA)を被験者からの血液サンプルに実施して、1つ以上のLAFAの結果に基づいて、被験者の炎症原因を究明することから成る。炎症の原因は、LAFAアッセイで細胞動態パラメータを分析することで究明され得る。一部の実施例では、LAFAアッセイは、白血球細胞の標識を検出することによる白血球細胞のサブセット分析を含む。
1つの実施例では、その方法は炎症の感染原因または非感染原因を究明することから成る。一部の実施例では、その方法は炎症の感染原因が細菌性、ウイルス性、寄生性のいずれの感染症かを究明することから成る。1つの実施例では、その方法はバクテリア、ウイルスまたは寄生虫の科、属または種を決定することから成る。
感染症は次を含むがそれらのみに限定されない。すなわち、例えばライノウイルスによる感染症、アメーバ性髄膜脳炎、急性リウマチ熱、炭疽、非定型ミコバクテリア感染、鳥インフルエンザ(鳥フル)、バベシア症、細菌性膣炎、亀頭炎、バーマフォレストウイルス感染、ブラストシスティス感染、ボツリヌス症、ブルセラ感染症などのICAM−l介在性感染症、カンピロバクター感染症、水疱瘡と帯状疱疹、チクングニア熱ウイルスが、口唇ヘルペス(単純ヘルペスウイルス1型)、一般的な風邪、結膜炎、クリプトスポリジウム感染症、サイトメガロウイルス属(CMV)感染症、デング熱、ジアルジア感染症、腺熱、淋病、ヘモフィルス・インフルエンザ菌b型(Hib)、肝炎、手足口病、ヘンドラウイルス感染症、包虫症、ヒトパピローマウイルス(HPV)、性器疣贅及び関連した癌、日本脳炎、クンジン/ウエストナイルウイルス感染症、ハンセン病、レジオネラ・ニューモフィラ菌感染症、レプトスピラ症、リステリア感染症、ライム病、はしか、髄膜炎菌感染症、伝染性軟属腫、おたふく風邪、性器マイコプラズマ感染症、肺炎マイコプラズマ感染症、中東呼吸器症候群(MERS)、非特異性尿道炎(NSU)、ノロウイルス感染症、パルボウイルスB19感染症、ペスト、肺炎球菌感染症、ポリオウイルス感染症、オウム病、キュー熱、狂犬病ウイルスとオーストラリアコウモリリッサウイルス、呼吸系発疹ウイルス(RSV)感染症、リケッチア感染症、突発性発疹、ロス川ウイルス感染症、ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ感染症、伝染性膿痂疹、重度急性呼吸症候群、志賀毒素産生性大腸菌(STEC)と溶血性尿毒症症候群(HUS)、赤痢、天然痘、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、連鎖球菌咽頭炎、梅毒、破傷風、鵞口瘡、トキシックショック症候群、トキソプラズマ感染症、トリコモナス感染症、結核、野兎病、腸チフスとパラチフス、尿路感染症、腸炎ビブリオ感染症、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性出血熱、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性呼吸器感染症、いぼ、百日咳、蠕虫、黄熱病、エルシニア感染、エルシニア感染、ジカウイルス感染またはその組合せ。
特定の実施例1件では、細菌感染は、腸内細菌、セラチア属、シュードモナス属、大腸菌および黄色ブドウ球菌の1つ以上に起因する感染症から選択されている。
もう1つの実施例では、その方法は炎症の非感染性の原因が心血管疾患、喘息、出血、動脈瘤または間質性肺炎であると究明することから成る。他の疾患および望ましくない炎症反応に関連する臨床疾患には、出血性貧血、血液透析、輸血、特定の血液学的悪性疾患、肺炎、虚血後の心筋炎症と壊死、気圧性外傷(減圧疾患)、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、サイトカイン誘発毒性、壊死性腸炎、顆粒球輸血関連の症候群、レイノー症候群、敗血症または外傷に続発する多臓器損傷症候群、急性化膿髄膜炎、他の中枢神経系炎症性疾患またはその組合せ。
機械学習
上記のように、LAFAは検査中の細胞のビデオデータを提供する可能であり、機械学習(ML)にビデオデータを適用可能である。ビデオデータは50フィート/秒のフレーム速度で2048x2048ピクセルであり、同じであるか異なるフレーム速度で682x682ピクセルであると考えられる。しかしながら、長方形の設定を含むさまざまなフレーム速度による他の解像度が適切である点に注意するべきである。各フレームの解像度はサンプリング数減少および/または周辺ピクセル(例えば3x3ブロック)の総数減少により低下して、計算の複雑さが低下する一方、強度したがって感度が増大可能である。
上記のように、LAFAは検査中の細胞のビデオデータを提供する可能であり、機械学習(ML)にビデオデータを適用可能である。ビデオデータは50フィート/秒のフレーム速度で2048x2048ピクセルであり、同じであるか異なるフレーム速度で682x682ピクセルであると考えられる。しかしながら、長方形の設定を含むさまざまなフレーム速度による他の解像度が適切である点に注意するべきである。各フレームの解像度はサンプリング数減少および/または周辺ピクセル(例えば3x3ブロック)の総数減少により低下して、計算の複雑さが低下する一方、強度したがって感度が増大可能である。
最大値投影法では、3Dデータを例えばCTまたはMRIスキャンのスライス画像などの複数の2D層から成る3Dデータに適用できる。3Dデータは、2D画素位置ごとに、その2D画素位置に対して2D層全体で最大強度を選択することによって2D空間に投影される。ここで述べられる方法では、ビデオの各画像が1枚の2D層を構成するという点で、3次元は時間寸法である。換言すれば、ビデオのコマは1つの単一画像を作成するために重ね合わせして、他のフレームの中の最大強度は出力像のそのピクセルのための強度に選ばれる。その結果、それが活性化されるので細胞が移動しない場合、1つの像は恒常的な細胞場所で明るい点を示す。逆に言えば、それが活性化されずに細胞が移動する場合、単一画像は運動の通り道に沿って線を示す。動きが非線形であれば、もちろんこれは曲線である。
細胞がビデオのフレーム速度と比較してゆっくり移動する場合、それぞれの時間に細胞を表している点が重なることから、線は実線である。一方、細胞がビデオのフレーム速度と比べて速く移動する場合、細胞がフレームの間で細胞直径よりも大きく移動する時に、それぞれの時間に細胞を表している点がお互いに間隔を置いて配置されているので、線は点線である。
CNNが画像中の構造特徴を利用できることから、畳み込みニューラルネットワーク(CNN)と組み合わせたとき、単独2D画像へのこの投影は特に役立つ。特に、CNNは第1の層が全体に明るいと考えられる画像の層に役立つ。活性化された細胞ではより多くの細胞が基質に接着することから、いっそう明るい。従って、MLは細胞活性化のための指標として、明るさを使用することができる。第2の層では、CNNは線機能を考慮でき、細胞の動きによって線がある場合、MLは細胞が活性化されていないという徴候としてこれをみなすことができる。
この説明が単一画像の構造特性について比較的明確である一方、その方法を実行するためにこれを知っている必要はない点に留意すること。単一画像に結合されたサンプルのCNNの訓練相は、感染性および非感染性の炎症性免疫反応間の区別に用いられる最高のパラメータとして、CNNをこれらの特性に自動的に適応させる。
別の例では、LAFAビデオデータは、例えば、TrackMateを用いて細胞追跡の実施に用いられる。例えば細胞密度(すなわちスポット数)、速度、拡散係数、直線性、滞留時間(すなわち期間)、飛跡長(すなわち移動)などの細胞追跡出力パラメータの各々が、機械学習機能として使用可能である。さまざまな特性は、ランダムフォレストなどの機械学習プロセスに組み込み可能である。ランダムフォレストは複数の木から成り、そして、それはエッジノードグラフ構造である。それぞれのノードは、決定経路を定義するためにエッジによって接続された1つの特性(すなわち細胞追跡パラメータ)を表す。この木は、訓練相の間に特性選択によってつくられる。評価相の間に、最終的な分類子を提供するためにそれぞれの木の出力は、他の木の出力と結合される。
なお、活性化細胞および非活性化細胞が速度などの1つのパラメータに基づいて分類される可能性がある一方、これは他の疾患などの他のアプリケーションでは当てはまらない。より多くの疾患は分類されるか、区別されるか、または、疾患がそれらの特徴値でより類似しているほど、より多くのパラメータ/寸法を使うことができる。これは、過剰適合の問題なしに多数のパラメータを含むことができることから、ランダムフォレストの力が重要になる場所である。
一例では、瞬間的な速度は、その後の画像で細胞の位置に基づいて算出されている。速度値は、続いて集計値(例えば平均、最大、最小、高速度(例えば上記の中央値)、高速+速度(例えば70%を超える)、変動、総変動および正の変動)を算出するために用いることができる。これらの値は、10のフレームなどのあらかじめ定義された閾値よりも長いトラックに対してのみ算出可能である。速度値を1より小さな速度の負の数および1より大きな速度の正の数に換算するために、log10常用対数(または他のベース)の対数を算出することも可能である。記録された細胞(それが検出されるフレームの数)が続いて変動機能として使われる時で割った正の数から負の数までの対数スケールベース10の速度が変化する時間数。
要約すると、次のように利用可能な13の特性がある。すなわち、平均、中央値、最大、最小、高速度、高速+速度、変動、総変動、正の変動、スポット数持続期間、転位および初期平均。上記の特性は短いトラック(10−20フレーム)、中間トラック(21−50フレーム)および長いトラック(>50フレーム)のそれぞれに対して測定可能です。その結果は39特性中にある。加えて、すべてのトラックの平均、最大、最小があり、トラック数をかけて合計43特性となる。この分析では例えばCD4、CD8とCD19などのさまざまな細胞型に対して直ちに繰り返しでき、その結果患者毎に43*3=129特性となる。
訓練データは、患者の診断、対応する特性を標識化することによって発生可能である。この訓練データは、続いてランダムに種サンプルを選択してランダムフォレストをつくることができる。ランダムフォレストのそれぞれの木は、その木の種にしたがった特性変数を持つ。続いて設定される全訓練を使用してランダムフォレストを訓練することができる。すなわち、訓練データのさまざまなサブセットはそれぞれのランダムフォレストの特性を選択するために用いられて、実際の訓練は続いて設定される全訓練を使用して実施される。
既存のランダムフォレスト実施例は、scikit−learn(cikit−learn.org)またはJava実施からsklearn.enSEMble.RandomForestClassifierのような特性選択、シード処理および訓練を最適化する目的で用いることができる
http://weka.sourceforge.net/doc.dev/weka/lassifiers/trees/RandomForest.html.
http://weka.sourceforge.net/doc.dev/weka/lassifiers/trees/RandomForest.html.
例1.方法と材料
白血球接着機能アッセイのプロトコル(LAFA)
白血球接着機能アッセイ(LAFA)は、定量的に、フロー状況下で、他のタンパク質および/または分子(例えば、アッセイで接着性の基質に差し向けられる接着分子、ケモカインおよび/または関連ペプチド)と相互に作用する白血球の能力を評価する。相互に作用している白血球は白血球膜上の特定の標識に対して蛍光抱合抗体による標識化によって通常視覚化されるため、細胞は蛍光顕微鏡(図1)で検出可能である。特定の白血球サブセット検出のために使用される抗体の例を表1に掲載する。これらの抗体は、組合せまたは個々に使用可能である。いくつかの実験では、他の膜タンパク質に対する蛍光抱合抗体は、上述の細胞表面タンパク質の発現濃度を評価する目的でも使用可能である。
白血球接着機能アッセイのプロトコル(LAFA)
白血球接着機能アッセイ(LAFA)は、定量的に、フロー状況下で、他のタンパク質および/または分子(例えば、アッセイで接着性の基質に差し向けられる接着分子、ケモカインおよび/または関連ペプチド)と相互に作用する白血球の能力を評価する。相互に作用している白血球は白血球膜上の特定の標識に対して蛍光抱合抗体による標識化によって通常視覚化されるため、細胞は蛍光顕微鏡(図1)で検出可能である。特定の白血球サブセット検出のために使用される抗体の例を表1に掲載する。これらの抗体は、組合せまたは個々に使用可能である。いくつかの実験では、他の膜タンパク質に対する蛍光抱合抗体は、上述の細胞表面タンパク質の発現濃度を評価する目的でも使用可能である。
生体外で血液微小循環を模擬するためには、マイクロ流体システムを使用するが、それはマイクロ流体ポンプとマイクロ流体チップ/チャネルから成る。接着性の基質はマイクロ流体チャネルの底でプレコートされ、白血球はその後マイクロ流体ポンプでチャネルに引き入れられ、白血球はプレコートされた接着性の基質と相互作用可能となる(図1)。これらの相互作用は蛍光顕微鏡で記録され、その画像は画像分析ソフトウェアを用いて解析される。その結果、細胞相互作用の振る舞いは細胞動態パラメータの範囲を使用して説明でき、そのことから、特定の接着性の基質と相互作用する白血球の能力を定量的に評価できる。さらに、白血球膜タンパク質の発現を評価するために、相互作用している白血球のこれらのタンパク質に対する抗体の蛍光強度を同じ蛍光顕微鏡で評価できる。
試薬と接着性基質
a)LAFAの接着性の基剤として使われたタンパク質を表2に掲載する。これらの基質は、組合せまたは個々に使用可能。在庫品は−80℃で貯蔵し、製造者によって示唆された保存期間後に廃棄した。凍結-解凍の繰り返しは許可されない。
b)ハンクス平衡塩類溶液(HBS)(シグマ、Cat#:H1387)HBSS粉末1パックを1Lの水で戻して、4℃で冷蔵庫に保存した。
c)Microfluidic chips:(Microfluidic ChipShop、Cat#:01−0178−0152−01)、PMMA、Lid厚さ(175p,m)、ストレート・チャネル・チップ(16パラレル・チャネル)、ミニ・ルアー・インタフェース、幅(1,000p,m)/深さ(200p,m)/長さ(18mm)。
d)チップ入口:
1.ルアーアダプタに対するミニルアー、最高70μLを保持可能
ii.ルアープラス500μLタンクに対するミニルアー、最高500μLを保持可能
e)Mncl2、(シグマ、Cat#:450995)
全血に1:100希釈液を用いて0.5Mのストックを作成する(5mMの最終濃度)。
f)0.5Mのストック作成では、1:100で希釈した全血を使用する(5mMの最終濃度)。
i.Anti−CD4−Alexa488(BD、Cat#:557695)
ii.Anti−CD8−PE(BD、Cat#:555635)
iii.Anti−CD15−APC(BD、Cat#:551376)
iv.Anti−CD19−BV510(BD、Cat#:562947)
v.Anti−D16−BV510(BD、Cat#:360723)
vi.Anti−CD25−APC(BD、Cat#:560987)
a)LAFAの接着性の基剤として使われたタンパク質を表2に掲載する。これらの基質は、組合せまたは個々に使用可能。在庫品は−80℃で貯蔵し、製造者によって示唆された保存期間後に廃棄した。凍結-解凍の繰り返しは許可されない。
b)ハンクス平衡塩類溶液(HBS)(シグマ、Cat#:H1387)HBSS粉末1パックを1Lの水で戻して、4℃で冷蔵庫に保存した。
c)Microfluidic chips:(Microfluidic ChipShop、Cat#:01−0178−0152−01)、PMMA、Lid厚さ(175p,m)、ストレート・チャネル・チップ(16パラレル・チャネル)、ミニ・ルアー・インタフェース、幅(1,000p,m)/深さ(200p,m)/長さ(18mm)。
d)チップ入口:
1.ルアーアダプタに対するミニルアー、最高70μLを保持可能
ii.ルアープラス500μLタンクに対するミニルアー、最高500μLを保持可能
e)Mncl2、(シグマ、Cat#:450995)
全血に1:100希釈液を用いて0.5Mのストックを作成する(5mMの最終濃度)。
f)0.5Mのストック作成では、1:100で希釈した全血を使用する(5mMの最終濃度)。
i.Anti−CD4−Alexa488(BD、Cat#:557695)
ii.Anti−CD8−PE(BD、Cat#:555635)
iii.Anti−CD15−APC(BD、Cat#:551376)
iv.Anti−CD19−BV510(BD、Cat#:562947)
v.Anti−D16−BV510(BD、Cat#:360723)
vi.Anti−CD25−APC(BD、Cat#:560987)
マイクロ流体チップの調製
a.必要に応じて−80℃フリーザーからタンパク質ストックを解凍して、表2に記載されたようにコーティング濃度にHBSSで希釈する。
b.それぞれのマイクロ流体チャネルをプレコートするために、希釈した溶液15μLを終夜4℃で使用する。
c.チップの最初のチャネルは、InCellに自動フォーカシングするために空のままとする。
d.次の日に、LAFAに使用する前に1回HBSSでチャネルを洗浄する。
a.必要に応じて−80℃フリーザーからタンパク質ストックを解凍して、表2に記載されたようにコーティング濃度にHBSSで希釈する。
b.それぞれのマイクロ流体チャネルをプレコートするために、希釈した溶液15μLを終夜4℃で使用する。
c.チップの最初のチャネルは、InCellに自動フォーカシングするために空のままとする。
d.次の日に、LAFAに使用する前に1回HBSSでチャネルを洗浄する。
血液採取
a.7−10mlの全血を静脈穿刺経由で採血し、2mlはEDTA管(全血球計数のため)に、5mlをリチウムヘパリン管(LAFA用に)に採取する。
b.翼付静脈留置針を血液採取に使う場合、血液はEDTA管とヘパリン管に採取するが、例えば、2mlの血液はEDTA管そして5mlの血液はヘパリン管に採取する。
c.採血後、採血管は室温(〜20℃)で貯蔵して、採血から8時間以内に使用する。
d.血球を活性化させる可能性があるので、採血管の激しい振とうは回避する。
a.7−10mlの全血を静脈穿刺経由で採血し、2mlはEDTA管(全血球計数のため)に、5mlをリチウムヘパリン管(LAFA用に)に採取する。
b.翼付静脈留置針を血液採取に使う場合、血液はEDTA管とヘパリン管に採取するが、例えば、2mlの血液はEDTA管そして5mlの血液はヘパリン管に採取する。
c.採血後、採血管は室温(〜20℃)で貯蔵して、採血から8時間以内に使用する。
d.血球を活性化させる可能性があるので、採血管の激しい振とうは回避する。
血液の前処理と標識化
a.各アッセイでは、130μLのヘパリン添加血液が必要であった。
b.一部の実験では、アッセイのために使う前に、血液を室温(RT)で5分間5mMのMnによって活性化させる必要がある
c.以下の標識を単独または以下の組合せの1つ以上で全血に加えて、RTで5分間培養する。
-Anti CD4−Alexa488(2μl/100μl全血)
-Anti CD8−PE(1.5μl/100μl全血)
-Anti CD15−APC(3μl/100μl全血)
-Anti CD19−BV510(2μl/100μl全血)
-Anti CD25−APC(0.15μl/100μl全血)
d.薬効を試験する場合、薬剤を血液に加えてアッセイ前に暖める必要がある。薬剤の性質によって、培養に必要な時間と温度には様々な可能性がある。Mn実験では、薬剤はMn治療の少なくとも5分後に加える必要がある。
a.各アッセイでは、130μLのヘパリン添加血液が必要であった。
b.一部の実験では、アッセイのために使う前に、血液を室温(RT)で5分間5mMのMnによって活性化させる必要がある
c.以下の標識を単独または以下の組合せの1つ以上で全血に加えて、RTで5分間培養する。
-Anti CD4−Alexa488(2μl/100μl全血)
-Anti CD8−PE(1.5μl/100μl全血)
-Anti CD15−APC(3μl/100μl全血)
-Anti CD19−BV510(2μl/100μl全血)
-Anti CD25−APC(0.15μl/100μl全血)
d.薬効を試験する場合、薬剤を血液に加えてアッセイ前に暖める必要がある。薬剤の性質によって、培養に必要な時間と温度には様々な可能性がある。Mn実験では、薬剤はMn治療の少なくとも5分後に加える必要がある。
LAFAアッセイ
a.チップをInCell 2200のスライドホルダーに入れる。39℃に一番上と一番下のヒーターを設定する(スライドは35.5℃になる)。
c.チップの入口に、血液サンプルを載せる。
d.チップの出口をマイクロ流体ポンプに接続する。
e.InCellソフトウェアでプロトコルを開ける。
f.焦点を見つける。
g.1.5ダイン/cm2のせん断ストレスを与えて、16本のゲージ針で10mlの注射器を使用しながら0.6ml/時間でポンプ/血液灌流を始める。
h.記録開始
a.チップをInCell 2200のスライドホルダーに入れる。39℃に一番上と一番下のヒーターを設定する(スライドは35.5℃になる)。
c.チップの入口に、血液サンプルを載せる。
d.チップの出口をマイクロ流体ポンプに接続する。
e.InCellソフトウェアでプロトコルを開ける。
f.焦点を見つける。
g.1.5ダイン/cm2のせん断ストレスを与えて、16本のゲージ針で10mlの注射器を使用しながら0.6ml/時間でポンプ/血液灌流を始める。
h.記録開始
ビデオ分析
a.Fijiオープンソース画像分析ソフトウェアを開く。Fijiを過去に使わなかった場合、分析を始める前に利用されるオペレーティングシステムにふさわしいバージョンをダウンロードして、インストールする(https://imagej.net/Fiji/Downloads)。
b.‘TrackMate_−3.6.1−SNAPSHOT−sources.jar’、‘TrackMate_−3.6.1−SNAPSHOT−testsjar’および‘TrackMate_−3.6.1−SNAPSHOTjar’を追跡分析に先がけてFiji>Pluginsフォルダーに追加する。
c.「Pre−process_Flow.ijm」をFijiにドラッグしてドロップすることでマクロを開ける。
d.ファイル名の順序に従ってチャネルの数を決めて、チャネルを指定する。
e.「Run(実施)」をクリックして、フォルダのディレクトリを選択する。
f.指示を受けたとき、ROIを調整してチャネルセンターを含めて、チャネル端を除外する。「OK」を押す。
g.マクロ完了時、各実験に対する個々のルートからの一組の「TIF」ファイルを作成できる。
h.組み入れまたは除外基準で分析を必要とする実験では、新しいチャネルマクロ作成を実施する。
-CD15+CD16+、CD15+CD16−、実行マクロ
−Create_CD15+CD15+_CD15+CD16−_Channel.ijm’
−CD4+CD25+,run macro‘Create_CD4−25_Channel.ijm’
i.細胞を追跡するためには、rag「TrackMate_Batch.py」ファイルをFiji中にドラッグする。
j.33行目の追跡テンプレートファイル「Expt1_anti−flow.xml」のディレクトリと69行目の画像フォルダーを指定する。
k.操作が完了したら、Fiji>Plugins>Tracking>Loada TrackMate file(Fiji>Plugins>Tracking>TrackMateファイルをロード)と進んでいき追跡情報をチェックする。続いて、追跡ファイルを選択して、マクロが正しく終了したことを確認する。
l.続いてTrackMate.csvファイルがRで解析可能となる。
a.Fijiオープンソース画像分析ソフトウェアを開く。Fijiを過去に使わなかった場合、分析を始める前に利用されるオペレーティングシステムにふさわしいバージョンをダウンロードして、インストールする(https://imagej.net/Fiji/Downloads)。
b.‘TrackMate_−3.6.1−SNAPSHOT−sources.jar’、‘TrackMate_−3.6.1−SNAPSHOT−testsjar’および‘TrackMate_−3.6.1−SNAPSHOTjar’を追跡分析に先がけてFiji>Pluginsフォルダーに追加する。
c.「Pre−process_Flow.ijm」をFijiにドラッグしてドロップすることでマクロを開ける。
d.ファイル名の順序に従ってチャネルの数を決めて、チャネルを指定する。
e.「Run(実施)」をクリックして、フォルダのディレクトリを選択する。
f.指示を受けたとき、ROIを調整してチャネルセンターを含めて、チャネル端を除外する。「OK」を押す。
g.マクロ完了時、各実験に対する個々のルートからの一組の「TIF」ファイルを作成できる。
h.組み入れまたは除外基準で分析を必要とする実験では、新しいチャネルマクロ作成を実施する。
-CD15+CD16+、CD15+CD16−、実行マクロ
−Create_CD15+CD15+_CD15+CD16−_Channel.ijm’
−CD4+CD25+,run macro‘Create_CD4−25_Channel.ijm’
i.細胞を追跡するためには、rag「TrackMate_Batch.py」ファイルをFiji中にドラッグする。
j.33行目の追跡テンプレートファイル「Expt1_anti−flow.xml」のディレクトリと69行目の画像フォルダーを指定する。
k.操作が完了したら、Fiji>Plugins>Tracking>Loada TrackMate file(Fiji>Plugins>Tracking>TrackMateファイルをロード)と進んでいき追跡情報をチェックする。続いて、追跡ファイルを選択して、マクロが正しく終了したことを確認する。
l.続いてTrackMate.csvファイルがRで解析可能となる。
二次データ解析
a.Rを開く。
b.「FlowAnalysis_GUI_v9.R」を開く。
c.「FlowAnalysis」ウインドウに行く
d.「Analysis Type(分析タイプ)」メニューから「Batch(バッチ)」を選択する。
e.「Browse Working Directory(ブラウザワーキングディレクトリ)」をクリックして、分析するファイルが存在するフォルダーを選択する。
f.以前のステップから得た追跡データを含むフォルダーをクリックして、「OK」を押す。
g.「Batch(バッチ)」ボタンを押す。
a.Rを開く。
b.「FlowAnalysis_GUI_v9.R」を開く。
c.「FlowAnalysis」ウインドウに行く
d.「Analysis Type(分析タイプ)」メニューから「Batch(バッチ)」を選択する。
e.「Browse Working Directory(ブラウザワーキングディレクトリ)」をクリックして、分析するファイルが存在するフォルダーを選択する。
f.以前のステップから得た追跡データを含むフォルダーをクリックして、「OK」を押す。
g.「Batch(バッチ)」ボタンを押す。
パラメータは要約表に作成可能であり、それぞれのパラメータに対する個々の細胞データは別のデータシートに作成可能。
例2.白血球接着機能アッセイ(LAFA)のマイクロ流体システム
現行の例は、白血球接着機能アッセイのマイクロ流体システムを対象とする。LAFAは、生体外でのヒト血液の微小循環を模擬する自己完結型のマイクロ流体/蛍光撮像およびと分析システムである。
現行の例は、白血球接着機能アッセイのマイクロ流体システムを対象とする。LAFAは、生体外でのヒト血液の微小循環を模擬する自己完結型のマイクロ流体/蛍光撮像およびと分析システムである。
図1に示すように、マイクロ流体チャネルは、例えば内皮接着分子とケモカインのような粘着性の基質でプレコートする。白血球は特定の白血球膜標識(例えばCD4、CD8およびCD15)に対してさまざまな蛍光分子結合抗体によって標識されており、これらの白血球サブセットの同時検出が可能となっている。続いて定義済みの流速でマイクロ流体チャネルを通って白血球を灌流して、白血球とプレコートした接着性の基質との間の相互作用が可能になるが、それは蛍光顕微鏡検査によってデジタル的に記録される。相互に作用している細胞の挙動は、細胞動態パラメータを組み込んで、定量的に白血球/リガンド相互作用動力学の特性化するソフトウェアを利用して分析可能性である。
例3に記載している。LAFAの画像とデータ分析を実施するワークフロー
例3に記載している。LAFAの画像とデータ分析を実施するワークフロー
現行の例は、白血球接着機能アッセイ(LAFA)画像とデータ分析を実施するフローチャートの例の提供を対象とする。画像は蛍光顕微鏡検査によって記録した後に、ステップ(図2)に続いて更に分析可能である。
さまざまな分析パイプラインは、必要な出力と速度に応じて適所にある。
a)従来の分析パイプライン(図2A)
Fiji画像分析ソフトウェアとRスタジオを用いて、白血球接着機能アッセイ(LAFA)実施中に作成した画像を処理、分析することから、細胞動態パラメータの範囲がおそらく測定されて、細胞転位挙動の特性を明らかにする目的で用いられる。
a)従来の分析パイプライン(図2A)
Fiji画像分析ソフトウェアとRスタジオを用いて、白血球接着機能アッセイ(LAFA)実施中に作成した画像を処理、分析することから、細胞動態パラメータの範囲がおそらく測定されて、細胞転位挙動の特性を明らかにする目的で用いられる。
例えば、画像とデータ分析プロセスは、以下のステップから成ると考えられる。
1.顕微鏡でとらえられる生のTIF画像は、Fiji像分析ソフトウェアで開かれコマ落しのシーケンスに再編成される。
2.正しいスケーリング情報が適用される。フローチャネルの端部は、画像のトリミングにより取り除く。画像の平坦化アルゴリズムは平坦ではない背景の蛍光性を除去するために適用する。
3.画像シーケンスは、分析の個々のチャンネルに分割される。
4.FijiソフトウェアからのTrackMateのプラグインは、チャネル毎に設定された細胞および強度閾値で個々の細胞の追跡に用いる。
5.TrackMateから出力は、細胞数、速度、直線性、滞留時間、拡散係数に限らず、細胞動態パラメータ細胞動態パラメータの範囲の望ましい測定単位までのデータを変換するR統計ソフトウェアのパッケージによって、データを更に分析する。
6.そして、図形統計グラフ(たとえば、動態加えて、他の画像ソフトウェアを用いてこの画像を分析して、結果を作成する目的で用いることが可能である。バッチ処理スクリプトは適所にあって、設定するだけで忘れても大丈夫なアプローチで画像分析を自動化し、画像が処理されて分析されたときに、ボタンを押すことで分析を開始して分析結果を集める。
1.顕微鏡でとらえられる生のTIF画像は、Fiji像分析ソフトウェアで開かれコマ落しのシーケンスに再編成される。
2.正しいスケーリング情報が適用される。フローチャネルの端部は、画像のトリミングにより取り除く。画像の平坦化アルゴリズムは平坦ではない背景の蛍光性を除去するために適用する。
3.画像シーケンスは、分析の個々のチャンネルに分割される。
4.FijiソフトウェアからのTrackMateのプラグインは、チャネル毎に設定された細胞および強度閾値で個々の細胞の追跡に用いる。
5.TrackMateから出力は、細胞数、速度、直線性、滞留時間、拡散係数に限らず、細胞動態パラメータ細胞動態パラメータの範囲の望ましい測定単位までのデータを変換するR統計ソフトウェアのパッケージによって、データを更に分析する。
6.そして、図形統計グラフ(たとえば、動態加えて、他の画像ソフトウェアを用いてこの画像を分析して、結果を作成する目的で用いることが可能である。バッチ処理スクリプトは適所にあって、設定するだけで忘れても大丈夫なアプローチで画像分析を自動化し、画像が処理されて分析されたときに、ボタンを押すことで分析を開始して分析結果を集める。
b)画像上で訓練が実施される機械学習(図2B)
PythonのTensorFlowを用いて、機械学習アルゴリズムを生画像コマ落しシーケンスの標準偏差投影法で開発訓練した。
PythonのTensorFlowを用いて、機械学習アルゴリズムを生画像コマ落しシーケンスの標準偏差投影法で開発訓練した。
例えば、画像とデータ分析プロセスは、以下のステップから成ると考えられる。
1.顕微鏡で捉えた生のTIF画像を、実験ごとに標準偏差投影法に変換する。
2.アルゴリズムは、既知の疾患状態(「basal(定常状態)」または「abnormal(異常状態)」)を用いてデータの標準偏差投影法を訓練対象とする。重要なことは、このステップは初回のみ必要である。アルゴリズムが訓練されたあと、ステップ2は省略可能であり、結果(ステップ3)が直ちに得られる。
3.アルゴリズムは、未知のデータセットに対して「basal(定常状態)」または「abnormal(異常状態)」を予測する。
c)追跡結果上で訓練される機械学習(図2C)
1.顕微鏡で捉えた生のTIF画像を、実験ごとに標準偏差投影法に変換する。
2.アルゴリズムは、既知の疾患状態(「basal(定常状態)」または「abnormal(異常状態)」)を用いてデータの標準偏差投影法を訓練対象とする。重要なことは、このステップは初回のみ必要である。アルゴリズムが訓練されたあと、ステップ2は省略可能であり、結果(ステップ3)が直ちに得られる。
3.アルゴリズムは、未知のデータセットに対して「basal(定常状態)」または「abnormal(異常状態)」を予測する。
c)追跡結果上で訓練される機械学習(図2C)
RのRandomForestパッケージを用いて、TrackMate追跡結果に対して機械学習アルゴリズムを開発して訓練した。
例えば、画像とデータ分析プロセスは、以下のステップから成ることがある。
1.とらえた生のTIF画像は、従来の分析パイプライン(a)で分析する。
2.アルゴリズムは、(ステップ4aで得た)既知の疾患状態(「basal(定常状態)」または「abnormal(異常状態)」)を用いてデータの追跡結果を訓練対象とする。重要なことは、このステップは初回のみ必要である。アルゴリズムが訓練されたあと、ステップ2は省略可能であり、結果(ステップ3)が直ちに得られる。
1.とらえた生のTIF画像は、従来の分析パイプライン(a)で分析する。
2.アルゴリズムは、(ステップ4aで得た)既知の疾患状態(「basal(定常状態)」または「abnormal(異常状態)」)を用いてデータの追跡結果を訓練対象とする。重要なことは、このステップは初回のみ必要である。アルゴリズムが訓練されたあと、ステップ2は省略可能であり、結果(ステップ3)が直ちに得られる。
アルゴリズムは、未知のデータセットに対して「basal(定常状態)」または「abnormal(異常状態)」を予測する。
例4.Mn2+はVCAM−1基質に対するα4β1インテグリン接着機能を活性化させる
現行の例は、定量的に白血球α4β1インテグリンのMn2+誘発性の活性化を評価する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を試験することを対象とした。健常ボランティアから採取した全血中の白血球を、粘着性の基剤としてVCAM−1を使用してLAFAに使う前に、5mMのMncl2(汎インテグリン活性化因子)の有無にかかわらず処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は、定量的に白血球α4β1インテグリンのMn2+誘発性の活性化を評価する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を試験することを対象とした。健常ボランティアから採取した全血中の白血球を、粘着性の基剤としてVCAM−1を使用してLAFAに使う前に、5mMのMncl2(汎インテグリン活性化因子)の有無にかかわらず処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
健常被験者1名または健常被験者数名を定義するために次の基準を用いた。
1.病歴を含む医学評価で決定されるように、明らかに健常である
2.妊娠していないか、現在授乳中ではない女性
3.自己免疫性、炎症性、血液学的および、血管の疾患について診断がなされていないこと
4.避妊薬を除き現在処方されている薬剤がない
5.抗ヒスタミン薬、アスピリンなどを含んで、血球機能に影響を及ぼす可能性がある現在市販薬を服用していない。ビタミン剤摂取は、本試験に許容される
6.現在、上気道感染症(すなわち風邪)、発熱または既知のアレルギー反応を呈していない
7.最近の(直近の5年)喫煙歴がないこと
1.病歴を含む医学評価で決定されるように、明らかに健常である
2.妊娠していないか、現在授乳中ではない女性
3.自己免疫性、炎症性、血液学的および、血管の疾患について診断がなされていないこと
4.避妊薬を除き現在処方されている薬剤がない
5.抗ヒスタミン薬、アスピリンなどを含んで、血球機能に影響を及ぼす可能性がある現在市販薬を服用していない。ビタミン剤摂取は、本試験に許容される
6.現在、上気道感染症(すなわち風邪)、発熱または既知のアレルギー反応を呈していない
7.最近の(直近の5年)喫煙歴がないこと
Mn2+汎インテグリン活性化因子は白血球膜のα4β1インテグリンを活性化することから、その内皮リガンド(VCAM−1)に対するα4β1インテグリン結合化活性は増大する。Mn2+によって誘発されたα4β1インテグリン活性化を検出するシステムの能力を試験するために、健常ボランティアからのヘパリン処理された全血をVCAM−1基質上でLAFAを使用する前に室温(20℃)で約5分間Mn2+の有無にかかわらず処理した。複数の特定の白血球サブセットの同時検出を成し遂げるために、特定の白血球膜標識に対する複数の蛍光色で標識抗体をヒト全血に加えて、フロー分析を行う前に、約5分間室温で培養した。白血球は蛍光顕微鏡で視覚化してさまざまな白血球の亜集団を鑑別したが、例えば、さまざまな特定の蛍光色の波長に基づいてそれを実施した。
図3Aで示すように、無処置の対照と比較して、CD8細胞(p<0.05)のわずかな減少を除き、Mn2+は白血球サブセットの多くの相互作用している細胞数を有意に変化させなかったことから、細胞密度単独が正確に白血球接着機能に対するMn2+の効果を評価するために十分であるとは考えられないことを示唆している。一方、CD4(p<0.01)、CD8(p<0.01)およびCD19(p<0.01)の細胞速度は、無処置の対照と比較してMn2+処置により有意に低下した。これらの所見は、Mn2+がα4β1インテグリンリガンドの結合能力および細胞−VCAM−1相互作用を促進し、細胞遊走速度の低下をもたらすることを示している。
拡散係数、細胞動態パラメータは、ランダムウォーク過程中に細胞がどれだけ早くスタート地点から移動するかの尺度であり、細胞運動がランダムであるか(拡散係数が低値)真っすぐであるか(拡散係数が高値)を示す(Kucik、1996;Beltman、2009)。図3Cに示すように、対照と比較して、CD4、CD8、CD19およびCD4+CD25+細胞の拡散係数値はMn2+処理によって有意に低下し、細胞遊走に対するMn2+の抑制効果を示した。一貫して、CD14とCD4+CD25+細胞以外の白血球サブセットの細胞直線性(細胞転位と細胞飛跡長の間の割合と定義される)は、Mn2+の存在下で有意に減少した(図3D)。これらの所見はMn2+処理がα4β1インテグリン接着機能を活性化させ、VCAM−1によりいっそう強い細胞相互作用をもたらすことを示した。
加えて、CD15+CD16+、CD4、CD8およびCD4+CD25+細胞の滞留時間はMn2+によって増大したことから(図3E)、Mn2+が白血球α4β1インテグリンを活性化して、VCAM−1基質へのより強力な細胞結合をもたらす結果となり、続いて細胞運動を抑制するとの考えを裏づけた。一貫して、無処置の対照と比較してCD4、CD8およびCD19細胞の飛跡長はMn2+によって低下したことから(図3F)、自己抑制的な細胞運動能が示唆された。CD14細胞に対するMn2+処理の効果がないことが細胞動態パラメータで検出されたという事実は(図3A−F)、CD14細胞補充の調節でα4β1インテグリンの固有の役割を暗示する。
合わせて考慮すれば、これらの結果は、例えば、白血球サブセットの範囲で定量的にMnによって誘発されたα4β1インテグリン活性化を評価するLAFAの能力を示した。さまざまな白血球亜集団で特定の細胞動態パラメータに対するMn2+の特有の効果を検出するLAFAの能力は、LAFAの良い感度と特異性を示す。続いてLAFA(VCAM−1)は、例6〜11でα4β1インテグリンの接着機能を評価するために用いることが可能である。
例5.Mn2+はMAdCAM−1基質上でα4β7インテグリンの接着機能を活性化する
現行の例は、定量的に白血球α4β1インテグリンのMn2+誘発性の活性化を評価する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を試験することを対象とした。健常ボランティアから採取した全血中の白血球を、粘着性の基剤としてMAdCAM−1を使用してLAFAに使う前に、5mMのMncl2の有無にかかわらず処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに概説している。
現行の例は、定量的に白血球α4β1インテグリンのMn2+誘発性の活性化を評価する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を試験することを対象とした。健常ボランティアから採取した全血中の白血球を、粘着性の基剤としてMAdCAM−1を使用してLAFAに使う前に、5mMのMncl2の有無にかかわらず処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに概説している。
α4β7インテグリンの接着機能に対してMn2+の効果を特徴づけるために、一連の細胞動態パラメータを用いてMAdCAM−1基質上の細胞移動挙動を測定した。図4Aに示す通り、未処理の対照と比較してMn2+処理ではCD4およびCD8細胞数が有意に増加した。上記の結果からMn2+がCD4およびCD8細胞上のα4β7インテグリンを活性化して、α4β7インテグリン上のMn2+の既知の作用に一致するMAdCAM−1基質上への細胞結合増大をもたらすことが示唆された。
同様に、対照と比較して、CD4とCD8細胞の細胞速度と拡散係数の双方は有意に低下した一方、滞留時間はMn2+によって有意に増加した(図4B、4Cおよび4E)。これらの所見は、Mn2+α4β7インテグリンの接着機能と細胞-MAdCAM−1結合とを促進して、その結果細胞運動を抑制するとの考えを支持する。Itwas also noted that CD8細胞の直線性と飛跡長のみ(CD4は非該当)がMn2+処理により低下することも注目されたことから、細胞遊走の抑制におけるα4β7インテグリンの役割はCD4とCD8細胞とでは異なる可能性があることを示した(図4Dと4F)。Mn2+はCD15+CD16+細胞(好中球)の移動挙動に影響を及ぼさないという事実が検出されたことから(図4A−4F)、CD4とCD8細胞と比較して好中性補充の抑制ではα4β7インテグリンの異なる役割が示唆された。共に考慮すれば、これらの結果では、例えば、いくつかの異なる白血球サブセットで定量的にMnによって誘発されたα4β7インテグリン活性化を評価するLAFAの能力を明らかになった。LAFA(VCAM−1)は続いて、以下の例のいくつかで述べられているように、α4β7インテグリンの接着機能を評価する目的で用いた。
例6.基質としてVCAM−1を使用した、LAFAによるSIRS患者における白血球接着機能の評価
現行の例は、白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査して、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者の免疫反応増大を検出することを対象とする。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCαM−1基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は、白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査して、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者の免疫反応増大を検出することを対象とする。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCαM−1基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
集中治療室(ICU)に新たに入室した患者をスクリーニングすることによってSIRS患者14名をこの試験に組み入れた。炎症の原因を問わず、次の4つの基準のうち2つを超えて適合した患者を資格ありとした。
1.体温が>38℃または<36℃
2.心拍数>90/分
3.呼吸回数>20/分またはPaCO2<32mmHg
4.白血球数>12,000/mm3または<4,000/mm3または>10%バンド
1.体温が>38℃または<36℃
2.心拍数>90/分
3.呼吸回数>20/分またはPaCO2<32mmHg
4.白血球数>12,000/mm3または<4,000/mm3または>10%バンド
血液サンプルは、全身炎症反応の初回同定から48時間後に採取した。
全血球算定は、製造業者の指示に従ってMindray BC5000血液分析器を用いて血液サンプルに実施した。図5Aに示すように、健常対照者と比較して総白血球数高値がSIRS患者で観察されたが、それは主に好中球数高値が原因であった。一貫して、好中球の割合は、SIRS患者のほうが健常対照者より高かった(図5B)。加えて、リンパ球の細胞数と割合は、健常対照者と比べてSIRS患者の方が有意に低かった(図5Aと5B)。一方では、有意により高い単球数がSIRS患者に認められたが(図5A)、その差はSIRS患者と健常対照者の間の単球の割合で認められなかった(図5B)。
血液サンプルは、VCAM−1基質上でLAFAによって分析した。図6Aに示すように、健常対照者と比較して、CD15+CD16+好中球の細胞密度はSIRS患者で有意に高かったが、相互作用しているCD8細胞のわずかな減少がSIRP患者で認められた。しかし、細胞密度を適切な白血球計数値を使用して正常化した際、対照とSIRP患者との間の細胞型で違いは検出されなかった。
相互作用している全細胞の特定の白血球の割合も測定した。健常対照者と比較してCD4細胞の割合が低い一方、相互作用する好中球はSIR患者で有意に高い一方、CD4細胞の割合は低かったことが判明した(図6C)。加えて、補充される特定の白血球集団の傾向のための指標である補充因子(R因子)は、(細胞型の%)/(血流中の細胞型の%)として計算している(Ibbotson、2001)。図6Dに示すように、好中球(CD15+CD16+)とリンパ球(CD4、CD8とCD19細胞の合計)のR因子値双方は健常対照者と比べてSIRS患者で有意に高い。これらの所見は、例えば、SIRS患者で強化された好中球α4β1インテグリン接着機能を示すことから、VCAM−1基質と相互作用する好中性能力増強がもたらされる。
次に、細胞動態パラメータの範囲を用いて、SIRS患者で細胞接着機能増強を測定しれた。図6に示すように、CD15+CD16+細胞(好中球)の速度は健常対照者と比べてSIRS患者で有意に低値であったことから、SIRS好中球上でのα4β1インテグリン活性の強化が示唆された。この概念は、好中球の拡散係数と直線性がSIRS患者で低下したという事実で更に支持されたことから(図6Fと6G)、細胞運動能の抑制を示した。これらの結果は、α4β1インテグリン接着機能がSIRS患者からのCD15+CD16+細胞で異常に上昇することを示唆しており、これらの患者では免疫反応増強を測定する標識を使うことが可能である。
一方では、CD4、CD8とCD4+CD25+細胞の速度はSIRS患者で高かったことから、健康管理と比較して、SIRS患者でα4β1インテグリンの接着性機能低下が示唆された(図6E)。一貫して、CD4とCD8細胞の拡散係数と直線性がより高いと認められた一方、滞留時間は健常対照者よりSIRS患者の方が短かったことから、SIRS患者でのα4β1インテグリンの活性の低さが示唆された(図6F、6Gおよび6H)。これらの所見は、SIRS患者での炎症反応強化の調節においてCD4とCD8細胞のα4β1インテグリンが異なる役割を果たす可能性があることを示す。
考えあわせれば、これらの結果は細胞動態標識の範囲をもたらすLAFAの能力を示すが、それはSIRS患者におけるα4β1インテグリン活性化を確認する目的で用いることが可能である。
例7.基質としてVCAM−1を使用するLAFAによる感染性SIRSと非感染性SIRSの鑑別
現行の例は、基質としてVCAM−1を使用して非感染性SIRSと感染性SIRSとおよび/または健常被験者を区別する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力の試験を対象とする。それらのカルテ(例8で詳述される)に基づいて、14例のSIRS患者(例6の場合のように同じコホート)の各々は、いずれかを表すかを評価するために、次のように後ろ向きに評価した。
1.「Non−infectious(非感染)」群:感染の可能性がありそうもない、または、
2.「Infectious(非感染)」群:感染証明済み(例えば細菌結果陽性)、または、
3.「Unknown(未知の)」群:感染はあり得るが照明がなされていない。
現行の例は、基質としてVCAM−1を使用して非感染性SIRSと感染性SIRSとおよび/または健常被験者を区別する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力の試験を対象とする。それらのカルテ(例8で詳述される)に基づいて、14例のSIRS患者(例6の場合のように同じコホート)の各々は、いずれかを表すかを評価するために、次のように後ろ向きに評価した。
1.「Non−infectious(非感染)」群:感染の可能性がありそうもない、または、
2.「Infectious(非感染)」群:感染証明済み(例えば細菌結果陽性)、または、
3.「Unknown(未知の)」群:感染はあり得るが照明がなされていない。
このため、上記3群の異なるα4β1インテグリン活性を続いてVCAM−1基質上でLAFAにて測定した。
図7Aに示すように、主として総好中球数の増大により、健常対照者と比較して、総白血球数はSIRS患者の3群で有意に高かった。健常対照者と比較してリンパ球数は感染群と未知の群で低値であったが、非感染群および健常群との間に差は認められなかった(図7A)。一方、健常対照者と比べて単球数は感染群と非感染群で高値であったが未知の群では高くはなかった(図7A)。
LAFAによる分析後に、すべての相互作用細胞を複数の白血球亜集団と断定した。図7Bに示すように、健常対照者と比べて相互作用する好中球の割合は感染群および未知の群で有意に高かったが、非感染群では高くないことから、好中球α4β1インテグリンは特に感染SIRS患者で活性化することが示唆された。これらの結果は、敗血症患者でVCAM−1によって異常に強化された好中性補充を示す以前の所見と一致していることから(Ibbotson、2001)、好中球上のα4β1インテグリン活性化を感染性SIRSと非感染性SIRSを区別するための標識として使用可能であることを示唆している。
相互作用するリンパ球の割合が、健常対照者と比較して、SIRSの3群で有意に低いことも注目された(図7B)。リンパ球の割合は感染群でも感染群に比べて有意に低かったが、それは感染性SIRSと非感染性SIRSを分類する標識としても使用可能である。同様に、CD4細胞の細胞密度は、リンパ球数による標準化の有無にかかわらず、感染性SIRSの方が健常対照者より低い(図7Dと7E)。
加えて、相互作用する単球の割合は、感染群の方が健常者群および非感染群より低かった(図7B)。同様に、健常対照者と比較して、標準化されたCD14細胞密度が感染群で低いと認められた(図7E)。これらの所見は、VCAM−1誘導性の単球補充減少が非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するための標識としても使用可能であることを示唆する。
複数の細胞動態パラメータも使用して、3つのSIRS群間の異なるα4β1インテグリン接着機能を決定した。図7Fに示すように、CD14、CD4、CD8とCD4+CD25+細胞の細胞速度は、健常対照者と比べて非感染性SIRS患者で有意に高値であり、そのような高値は感染性SIRS群では認められなかった。CD4とCD4+CD25+細胞の速度は、非感染性SIRS群と比べて感染性SIRS群でも有意に低値であった、(図7F)。
一貫して、CD14、CD4、CD8とCD4+CD25+細胞の拡散係数は、健常対照者と比べて、感染性SIRS群でより高いと認められたが非伝染性の群では認められなかった(図7G)。CD4、CD19とCD4+CD25+細胞の拡散係数は、非感染性のSIRSグループと比べて感染性SIRS群にも認められた(図7G)。同様に、CD4、CD8とCD4+CD25+細胞の直線性は健常対照者と比べて非感染性SIRS患者で有意に高かったが、感染性SIRS群ではそのような違いは認められなかった(図7H)。
加えて、CD19細胞の速度は、非感染性SIRS群と比べて感染性SIRS群で低値であった(図7F)。同様に、CD19細胞の拡散係数と滞留時間は、健常対照者と比べて感染性SIRS群で低かったが、そのような差は非感染性SIRSでは検出されなかった(図7Gと7I)。
考えあわせれば、これらの所見は、3つのSIRS群でα4β1インテグリンの接着を評価するための新しい標識の範囲を策定するLAFAの能力を明らかにする。LAFAは、非感染性SIRS患者と感染性SIRS患者を区別する目的で使用できる多くの役立つ細胞動態標識を特定してきた。
例8.VCAM−1基質上でLAFAによって個々のSIRS患者における特定の細胞接着機能を区別する単一細胞のプロファイルを使用する
現行の例は、個々のSIRS患者における特定の細胞接着機能を測定するための白血球接着機能アッセイ(LAFA)によって作成した単一細胞のプロファイルの使用を対象としている。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCαM−1基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は、個々のSIRS患者における特定の細胞接着機能を測定するための白血球接着機能アッセイ(LAFA)によって作成した単一細胞のプロファイルの使用を対象としている。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCαM−1基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
SIRS患者から採取した各血液サンプルに対して、標準的な微生物学的検査を実施して、感染症の潜在的陽性を決定した。カルテを組合せて、個々のSIRS患者における炎症の潜在的な原因を続いて2人の経験豊かなICU専門家がそれぞれに決定した。その結果、それぞれのSIRS患者における全身性の免疫反応の潜在的原因を表3に掲載する。それに応じて、14例のSIRS患者を次の3群に分けた。1)非感染性、2)感染性、そして、3)例7で詳述するように、不明。
血液サンプルの各々はVCAM−1基質上でLAFAによって分析し、相互作用する単一細胞のいくつかの細胞動態パラメータを続いて決定した。図8Aに示すように、レンサ球菌属G群により感染が生じた患者のSIRS−11を除いて、CD15+CD16+細胞数は、健常被検者と比べてすべてのSIRS患者で高値であった。加えて、CD4細胞の細胞速度と拡散係数の高値が非感染性SIRS患者の中に認められた一方(図8Bと9B)、健常被験者3名では低値であり、図6Eと6Fに示すデータと一致している。
相互作用するほんの少数のCD19だけが患者SIRS−04(手術後)に検出された一方(図8D)、CD4細胞密度が非常に高い(図8B)ことも注目される。加えて、他の被験者(図8Bと9B)と比較して、これらのCD4細胞の多くの部分の速度と拡散係数の双方が高いことは、この患者における独自の細胞免疫活性化を示唆する。
面白いことには、他の非感染性SIRS患者または健常被験者と比較して、CD19細胞密度は心停止を来たした2例のSIRS患者で一貫して上昇したことから(SIRS-01とSIRS−02)、これらの2例のSIRS患者の特異的なCD19応答を示唆した(図8D)。同様に、これらの2例の心停止患者のCD15+CD16+細胞の直線性は低かった一方、これらの患者のCD19細胞の直線性は他の非感染性SIRS患者と比較して高かったことから、心停止患者で類似の細胞免疫状態を示唆しており(図10Aと10D、それは心停止によって誘発されたSIRSと他の原因を区別する目的で使用できる。
考えあわせれば、これらの結果は、個々の患者で細胞接着性機能を評価する作成済みの有用な標識への単一細胞のプロファイルの能力を示す。ここで開示する結果は、単一細胞のプロファイルが個々のSIRS患者における炎症の特定の原因を区別する目的でも使用可能であることを示唆する。
例9.基質としてVCAM−1+IL−8を使用したLAFAによるSIRS患者における白血球接着機能の評価
現行の例は、基質としてVCAM−1+IL−8を使用して、白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査して、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者の免疫反応増大を検出することを対象とする。非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するためのLAFA(VCAM−1+IL−8) の能力も測定した。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCAM−1+IL−8基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
IL−8は濃度勾配を形成することによって白血球遊走をもたらすと考えられるケモカインであり、主に好中球走化性をもたらすことが示されている。IL−8の受容体であるCXCR1は、白血球の膜上で発現可能であって、白血球機能と移動挙動の調節における役割を果たす。この例では、VCAM−1と結合して、IL−8を接着性の基質として使用したことから、SIRS患者における白血球接着機能の調節におけるCXCR1の役割が細胞動態パラメータの範囲を使用して評価可能である。
図11Aで示すように、健常対照者と比較して、相互作用するCD14、CD15+CD16+とCD4+CD25+細胞数増加がSIRS患者に認められた。いったん、適切な白血球細胞数で標準正常化しても、SIRS患者におけるCD4+CD25+細胞密度の増加だけが認められた(図11B)。
相互作用しているCD4+CD25+調節性細胞の割合は、健常対照者と比べてSIRS患者で有意に高く(図11C)、基質(図6C)として単独でVCAM−1を使用するときにはそれは認められなかったことから、CD4+CD25+細胞接着機能の調節におけるCXCR1の機能的な役割が示唆される。
先に例6の図6の中で示したように、CD15+CD16+好中球の接着機能はSIRS患者で促進され、細胞速度、拡散係数および直線性の低下によって明示された。一方、VCAM−1+IL−8基質上では、細胞速度と拡散係数にそのような違いは、健常被検者およびSIRS患者の間では検出されなかった(図11Eと11F)。これらの所見は、好中球CXCR1がIL−8基質から信号を受け取ると考えられることを示唆しており、そのことは健常細胞およびSIRS細胞の双方の細胞運動能に直接的な抑制作用を及ぼしたと考えられる。その結果、健常被検者およびSIRS被験者の間の好中性運動能の差は、IL−8の存在下で隠された。
加えて、相互に作用しているCD8細胞の速度、拡散係数、滞留時間と飛跡長は、SIRS患者の方が健常対照者より有意に高いと判明した(図11E、11F、11Hおよび11I)。これらの結果は健常細胞およびSIRS CD8細胞の間に異なる細胞移動挙動を示すが、それはSIRS患者で異常な免疫反応を評価するために用いることができる。
それらのカルテに基づいて、例7で詳述したように、14例のSIRS患者を次の3群に分けた。すなわち、1)非感染性、2)感染性、そして、3)不明。このため、非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するためのLAFA(VCAM−1+IL−8)の能力も試験した。
図12Aで示すように、相互作用するCD4とCD8細胞の数は、感染性SIRS群では健常対照者よりも有意に少なかったが、そのような減少は非感染性SIRSでは検出されなかった。加えて、健常対照者と比較して、CD15+CD16+好中球の滞留時間は、感染性SIRS群では少なかったが、非感染性SIRS群では少なくなかった。これらの結果は、上述の新しい標識が非感染性SIRSと感染性SIRSから分けるために用いることが可能であることを示唆する。
考えあわせれば、これらの結果は、健常白血球およびSIRS白血球で白血球の接着機能の調節におけるCXCR1の機能的な役割を示す。新しい標識の範囲はVCAM−1+IL−8基質を使用したLAFAによって作成したが、それは健常白血球上およびSIRS白血球上でさまざまな白血球CXCR1活性を決定する目的で用いることができる。さらに、ここに開示した結果は、多くの新たなLAFA標識が非感染性SIRSと感染症SIRSを区別する目的で用いることが可能であることを示す。
例10.基質としてVCAM−1+SDF−1αを用いたLAFAによって、SIRS患者で白血球癒着機能を評価する
現行の例は、基質としてVCAM−1+SDF−1を使用して、白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査して、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者の免疫反応増大を検出することを対象とする。非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するためのLAFA(VCAM−1+SDF−1α)の能力も測定した。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCAM−1+SDF−1α基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は、基質としてVCAM−1+SDF−1を使用して、白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査して、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者の免疫反応増大を検出することを対象とする。非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するためのLAFA(VCAM−1+SDF−1α)の能力も測定した。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後VCAM−1+SDF−1α基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
CXCL12としても知られるSDF−1αは、濃度勾配を形成することによって白血球の移動を誘導するケモカインである。SDF−1αは、主にリンパ球走化性をもたらすことが示されている。SDF−1αの受容体である、CXCR4は、白血球の膜上で発現されると考えられ、白血球機能と移動挙動の調節における役割を果たす。この例ではVCAM−1と組み合わせて、SDF−1αを接着性の基質として使用したことから、SIRS患者における白血球接着機能の調節におけるCXCR4の役割が細胞動態パラメータの範囲を使用して評価可能である。
図13Aと図13Dに示すように、CD14単球の細胞密度とR因子は、健常被験者よりSIRS患者で有意に高い。加えて、健常被験者と比較して、CD14細胞の直線性はSIRS患者で有意により低い一方(図13D)、そのような差はSDF−1αが存在しない場合には認められなかったことから(図6G)、健常細胞と比較したSIRS CD14細胞上のCXCR4活性増大が示唆された。
相互作用する全細胞の>50%は、SIRS患者における好中球である一方、健常被験者で最も多い亜集団はCD4細胞(>30%)であることから、SIRS好中球におけるCXCR4活性の強化が示唆される(図13C)。一貫して、SIRS好中球の細胞速度は有意に早い一方(図13E)、SIRS好中球の直線性と滞留時間は健常な被験者より低値であることから(図13Gと13H)、SDF−1αへのSIRS好中球の高い反応が示唆され、細胞走化性増大がもたらされる。
カルテに基づいて例7に詳述されるように、次のように14例のSIRS患者を3群に分けた。1)非感染性、2)感染性、そして、3)不明。このため、非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するためのLAFA(VCAM−1+SDF−1α)の能力も試験した。
図14Aと図14Bに示すように、CD14細胞の細胞密度は(正常化の有無にかかわらず)、感染性SIRS群が非感染性SIRS群より有意に低い。一方、CD14細胞の細胞速度、拡散係数および直線性は、感染性SIRS群が非感染性SIRS群より有意に低値である(図14C、14Dおよび14E)。これらの結果は、細胞補充が低値にもかかわらず、相互作用する感染性SIRS患者からのCD14細胞の運動能が非感染性SIRS患者より低いことが示唆されることから、これらの標識が非感染性SIRS患者と感染性SIRS患者を分離する目的に使用可能であることを示唆する。
同様に、非感染性SIRS群と比較して、感染性SIRS患者における低いCD4細胞密度も認められた(図14A)。CD4細胞の速度、拡散係数および直線性が感染性SIRS患者でより低い点も注目される(図14C、14Dおよび14E)。
考えあわせれば、これらの結果は新たな標識の範囲がVCAM−1+SDF−1a基質を用いたLAFAによってもたらされたことを示すが、それはSIRS患者でのCXCR4活性増大を測定する目的で用いることが可能と考えられる。さらに、ここに開示した結果は、多くの新たなLAFA標識が非感染性SIRSと感染症SIRSを区別する目的で用いることが可能であることを示す。
例11.VCAM−1基質上でLAFAを使用してSIRS患者における白血球接着機能に対するMn2+の効果を評価する
現行の例は、VCAM−1基質上でSIRS患者の白血球接着機能に対するMn2+効果を評価する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の使用を対象としている。Mn2+の存在下で非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するLAFAの能力も測定した。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取して、VCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、室温で5分間5mMのMncl2で処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は、VCAM−1基質上でSIRS患者の白血球接着機能に対するMn2+効果を評価する白血球接着機能アッセイ(LAFA)の使用を対象としている。Mn2+の存在下で非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するLAFAの能力も測定した。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取して、VCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、室温で5分間5mMのMncl2で処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
汎インテグリン活性化因子であるMn2+Mn2+(汎インテグリン活性化因子)は、白血球膜のα4β1インテグリンを活性化することから、その内皮リガンドであるVCAM−1に対するα4β1インテグリン結合活性増大につながる。図15Aと図15Cに示されるように、相互作用するCD8細胞の割合は健常被検者よりもSIRS患者で双方ともに低値であることから、Mn2+存在下での健常被検者およびSIRS被験者の間のCD8細胞上のα4β1インテグリンのさまざまな活性が示唆される。
更にα4β1インテグリンの状態の特徴を描写するために、Mn2+の存在有無下でVCAM−1に結合する白血球能力の違いを用いてMn2+により誘導可能なα4β1インテグリンの「活性化能力」を生じさせる目的で用いて、どれくらいのα4β1インテグリン活性がMn2+によって誘導される可能性があるかについて示した。細胞α4β1インテグリンが非常に活性化すれば、活性化されたα4β1インテグリンの割合は高いと考えられ、そしてそれは低いMn2+活性化能力を示すと考えられる。その反対に、低い細胞α4β1インテグリン活性は、高いMn2+活性化能力を示すと考えられる。
Mn2+活性化能力を評価するために、細胞動態パラメータの範囲に対して活性化能力比率(APR)を導入する。例えば、平均細胞速度がそれぞれMn2+の存在下と非存在下でSpeedNCとSpeedMn(μm/分)である場合、速度活性化能力比(SAPR)の値はSpeedMn/SpeedNCである。この場合、SAPR値がより高いほど、より活性化能力は低いことから、α4β1インテグリンのより多くの部分が休止細胞上で活性型であることを意味する。
拡散係数活性化能力比(DCAPR)は、拡散係数Mnと拡散係数(拡散計数Mn/拡散係数NC)との間の比率と定義できる。DCAPR値が高いほど、活性化能力は低い。同じ公式(直線性Mn/直線性NC)を直線性活性化能力比(STAPR)を測定するために使用できる。STAPR値が高いほど、活性化能力は低い。同様に、追跡長活性化能力比(TLAPR)は追跡長Mn/追跡長NCの比率であり、TLAPR値が高いほど活性化能力は低い。
さらに、滞留時間活性か能力比(DTAPR)は滞留時間Mn/滞留時間NCの比率と定義できる。一方、この場合、DTAPR値が高いほど、活性化能力は高い。
このため、SAPR、DCAPR、STAPR、TLAPRおよびDTAPRを用いて特定の白血球集団または集団に対する活性化されたα4β1および/またはα4β7インテグリンの一部を測定するために用いることが可能であり、白血球α4β1および/またはα4β7インテグリンの活性化状態を評価するための半定量的なツールが提供される。次に、健常被験者およびSIRS被験者におけるα4β1インテグリンの状態を評価するために、SAPR、DCAPR、STAPR、TLARPおよびDTAPRを使用可能である。
図15Hに示すように、健常対照者と比較して、DTAPR値はSIRS患者のCD15+CD16+好中球で有意に低いことから、SIRS好中球で低いMn2+活性化能力が示唆される。一方、DTAPRは健常被験者よりSIRS CD8細胞で高いことから、SIRS CD8細胞でより大きな活性化能力が示唆される。
カルテに基づいて例7に詳述されるように、次のように14例のSIRS患者を3群に分けた。1)非感染性、2)感染性、そして、3)不明。このため、非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するSAPR、DCAPR、STAPR、TLARPおよびDTAPRの能力を検定した。
図16Aに示すように、健常被験者と比較して、CD4、CD8およびCD19細胞の細胞密度は感染性SIRS患者で有意に低かった一方、そのような低下は非感染性SIRS患者では認められなかった。有意に大きなDTARP値が、健常対照者と比べて非感染性患者からのCD8細胞で検出されたことから(しかし、感染性群では検出されず)(図16F)、非感染CD8細胞における高いMn2+活性化能力が示唆された。
さらに、非感染性SIRS群と比較して、CD4+CD25+細胞の細胞密度は感染性SIRS群のほうが有意に高かった(図16B)。非感染性SIRS患者におけるCD4+CD25+細胞のDCAPR値は健常対照者と比べて有意に低い一方、そのような差は感染性SIRS患者では認められなかった(図16D)。これらの結果は、上述の標識が非感染性SIRSと感染性SIRSから分けるために用いることが可能であることを示唆する。
考えあわせれば、これらの結果は、健常被検者およびSIRS被験者におけるα4β1インテグリンのさまざまな活性状態を検出するLAFAの能力を示す。また、ここに開示した結果は、SAPR、DCAPR、STAPR、TLARPおよびDTAPRが非感染性SIRSと感染症SIRSとを区別する標識として使えることも示す。
例12.基質としてP−セレクチン+E−セレクチンを用いてLAFAによって、SIRS患者における白血球癒着機能を評価する
現行の例は白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査して、基質としてP−セレクチン+E−セレクチンを用いて、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者における免疫反応増大を検出することを対象とする。血液サンプルは、健常ボランティアとSIRS患者から採取して、その後基質としてのP−セレクチン+Eセレクチン(白血球発現PSGL−1のリガンド)上でLAFAによって分析した。マイクロ流体チャネルは、それぞれ10μg/mlと0.5μg/mlの濃度のヒトP−セレクチンタンパク質とヒトEセレクチンタンパク質の組合せでプレコートした。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査して、基質としてP−セレクチン+E−セレクチンを用いて、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者における免疫反応増大を検出することを対象とする。血液サンプルは、健常ボランティアとSIRS患者から採取して、その後基質としてのP−セレクチン+Eセレクチン(白血球発現PSGL−1のリガンド)上でLAFAによって分析した。マイクロ流体チャネルは、それぞれ10μg/mlと0.5μg/mlの濃度のヒトP−セレクチンタンパク質とヒトEセレクチンタンパク質の組合せでプレコートした。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
図17Aに示すように、CD15+CD16+好中球の細胞密度が健常対照者と比べてSIRS患者で有意に高いことから、SIRS好中球上でのPSGL−1接着機能の促進が示唆される。健常対照者と比較してCD15+CD16+細胞の細胞直線性と飛跡長がSIRS患者で低値という観察結果により、この概念は支持される(図17Gおよび17I)。
健常対照者と比較して、より高いリンパ球R因子がSIRS患者で観察されたことから、SIRSリンパ球で強化されたPSGL−1活性が示唆される(図17D)。一貫して、CD4、CD8およびCD19リンパ球の速度、直線性および飛跡長の全ては健常対照者と比べてSIRS患者で有意に低かったことから(図17E、17Gおよび17I)、SIRSリンパ球におけるより強い細胞セレクチン相互作用と抑制的な細胞運動能が示唆される。
カルテに基づいて例7に詳述されるように、次のように14例のSIRS患者を3群に分けた。1)非感染性、2)感染性、そして、3)不明。このため、非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するP−セレクチン+E−セレクチン基質を用いたLAFAの能力を検定した。
図18Aに示すように、健常被験者と比較してCD15+CD16+好中球の細胞密度は非感染性SIRS患者で高値であったが、感染性SIRS群では高値ではなかった。一貫して、非感染性SIRS群と比較して好中性密度は有意に感染性SIRS群で低値であった(図18A)。同様に、非感染性細胞と比較して感染性SIRSの好中球の滞留時間も低値であった(図18F)。加えて、非感染性SIRS CD14細胞と比べて、有意に短い滞留時間が感染性SIRSCD14細胞で認められたことから、非感染性と感染性とのSIRS患者の間にCD14細胞に対する多様な細胞接着機能が示された(図18F)。
考えあわせれば、これらの結果は新しい標識の範囲がP−セレクチン+E−セレクチン基質によって策定されたことを示し、そしてそれはSIRS患者でPSGL−1活性高値を測定するために使用できる。さらに、ここに開示した結果は、多くの新たなLAFA標識が非感染性SIRSと感染症SIRSを区別する目的で用いることが可能であることを示す。
例13.P−セレクチン+E-セレクチン基質上でLAFAによって個々のSIRS患者で異なる白血球PSGL−1接着機能を区別するための単一細胞のプロファイルの使用
現行の例は、白血球接着機能アッセイ(LAFA)によって策定される単一細胞のプロファイルを使用して個々のSIRS患者におけるPSGL−1接着機能の測定を対象としている。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は、白血球接着機能アッセイ(LAFA)によって策定される単一細胞のプロファイルを使用して個々のSIRS患者におけるPSGL−1接着機能の測定を対象としている。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、P−セレクチン+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
SIRS患者から採取した各血液サンプルに対して、標準的な微生物学的検査を実施して、感染症の潜在的陽性を決定した。カルテを組合せて、個々のSIRS患者における炎症の潜在的な原因を続いて2人の経験豊かなICU専門家がそれぞれに決定した。その結果、それぞれのSIRS患者における全身性の免疫反応の潜在的原因を表3に掲載する。それに応じて、14例のSIRS患者を次の3群に分けた。1)非感染性、2)感染性、そして、3)例7で詳述するように、不明。
血液サンプルの各々はP−セレクチンとE−セレクチン基質上でLAFAによって分析し、そして、それぞれ1つの相互作用する細胞のいくつかの細胞動態パラメータを測定した。図19Dに示すように、CD19細胞の高密度が患者SIRS−03(喘息)で検出された。一方で、多くのCD19細胞のみが同じ患者におけるVCAM−1基質で認められた(図8D)。これらの結果は患者のCD19細胞上でPSGL−1が高度に活性化する一方、それらの細胞上のα4β1インテグリンの活性化促進は明らかでないことから、この患者では特定の接着分子のさまざまな活性化が明らかにされている。
患者D8 SIRS−03のCD4およびCD8の相互作用する細胞の数が少ないことも注目される(図19Bと19C)。一方、多数のCD4とCD8細胞はこの患者のSIRS−07で認められたが(腸内細菌とシュードモナス)、CD19細胞の密度は低値であった。これらの所見も、個々のSIRS患者で特定細胞の亜集団の異なる活性化状況を示唆する。
面白いことには、他の2人の健常被験者と比べて健常被験者(H−02)のうちの1人のCD4細胞の拡散係数は異常に高値である(図20B)。加えて、同じ被験者におけるCD15+CD16+細胞の拡散係数は、健常被験者の範囲内で最も低値である(図20A)。これらの所見から、さまざまな細胞型の接着機能が健常な個人間で有意に変わり得ることを示唆し、そしてそれはLAFAによって検出可能である。
図21Aにも示すように、H−02とH−03の被験者におけるCD15+CD16+好中球の直線性の大部分は0.5と1の間にある一方、好中性の直線性は非感染性SIRS患者では0−1の間にほぼ均一に分布する。さらに、患者SIRS−07、SIRS−08およびSIRS−11(感染性SIRS患者)における好中球の直線性の大部分は、0−0.5(図21A)の間にあることから、高い細胞接着機能を示唆する。同様に、0.9以下のCD8細胞の直線性の大きな部分は患者SIRS−12で検出され、それは他の健常被検者およびSIRS被験者には認められなかった(図21C)。これらの所見は細胞直線性のさまざまな分布様式を示すが、それは個々の被験者における特定の細胞活性を測定する目的で用いることができる。
図21Aにも示すように、H−02とH−03の被験者におけるCD15+CD16+好中球の直線性の大部分は0.5と1の間にある一方、好中性の直線性は非感染性SIRS患者で0−1の間にほぼ均一に分布する。さらに、患者SIRS−07、SIRS−08およびSIRS−11(感染性SIRS患者)における好中球の直線性の大部分は、0−0.5(図21A)の間にあることから、高い細胞接着機能を示唆する。同様に、0.9以下のCD8細胞の直線性の大きな部分は患者SIRS−12で検出され、それは他の健常被検者およびSIRS被験者には認められなかった(図21C)。これらの所見は細胞直線性のさまざまな分布様式を示すが、それは個々の被験者における特定の細胞活性を測定する目的で用いることができる。
例14.白血球接着機能の活性化を測定するための機械学習アルゴリズムの使用
現在の例は、白血球接着機能の活性化を決定するために機械学習(ML)アルゴリズムを使用することを対象としている。基質としてVCAM−1を使用して白血球接着剤機能アッセイ(LAFA)に使用する前に、健常ボランティアから採取した血液サンプルをMn2+あり(活性化)またはMn2+なし(対照)にて室温で5分間処理した。
対照サンプルと活性化サンプルからのデータを用いて、機械学習アルゴリズムを訓練し、
続いて盲検化した対照サンプルと活性化サンプルのデータを区別する訓練ずみアルゴリズムの能力を測定した。
現在の例は、白血球接着機能の活性化を決定するために機械学習(ML)アルゴリズムを使用することを対象としている。基質としてVCAM−1を使用して白血球接着剤機能アッセイ(LAFA)に使用する前に、健常ボランティアから採取した血液サンプルをMn2+あり(活性化)またはMn2+なし(対照)にて室温で5分間処理した。
対照サンプルと活性化サンプルからのデータを用いて、機械学習アルゴリズムを訓練し、
続いて盲検化した対照サンプルと活性化サンプルのデータを区別する訓練ずみアルゴリズムの能力を測定した。
MLは、人工知能とパターン認知から進化したコンピュータサイエンス分野であるMLアルゴリズムでは、コンピューターが人間による入力なしにデータから学習して予想することが可能である。MLの主要なアプリケーションのうちの1つはコンピュータビジョンすなわち、人間の視覚系の作業を自動化するためにデジタル画像またはビデオに対してコンピューターが訓練される分野である。
健常ボランティアおよびさまざまな疾患がある患者から既存のLAFA画像とデータ分析結果に基づいて、データベースが確立された。このデータベースでは、MLアルゴリズムの持続性最適化のために既存のデータベースに新しいLAFAデータを統合することにより拡大し続けることができる。
まず最初に、画像分類法の畳み込みニューラルネットワーク(CNN)法に基づいて機械学習アルゴリズムは開発された。このアルゴリズムは、Mn−活性化血液サンプルと健常提供者の対照血液サンプルのLAFA画像に対して訓練が実施された。CNNは中間に隠された層のカスタム番号がある入力層および出力層から成る。各層は層間の数学的関係を定義しているウェイトマトリックスを用いて他の層に数学的に相関する。このCNNを訓練するために、生の画像をさまざまな亜集団に色分けした標準偏差強度予測に加工した。このCNNアルゴリズムは現在80%までの精度で、盲検化対照とMn活性化サンプルとを区別する。増加中のデータベースで、精度は99%を超えるまで増加可能である。
2番目の例において、ランダムフォレストアンサンブル学習法に基づく機械学習アルゴリズムが開発された。Tこのアルゴリズムは、健常提供者のMn活性化サンプルおよび対照血液サンプルの単一細胞の追跡結果(例えば細胞密度、速度、拡散係数、直線性、滞留時間、飛跡長その他)に対して訓練された。ランダムフォレストは
十分なデシジョンツリーから構築され、各々がさまざまな訓練データセットのサブセット上で訓練される。平均的な複数の独立したデシジョンツリーによって、ランダムフォレストは過剰適合のリスクを低下させることから、最終的なモデルの性能を高める。現在のこのランダムフォレストアルゴリズムは80%を超える精度で対照とMn活性化サンプルとを区別する。増加中のデータベースで、精度は99.9%を超えるまで増加可能である。
十分なデシジョンツリーから構築され、各々がさまざまな訓練データセットのサブセット上で訓練される。平均的な複数の独立したデシジョンツリーによって、ランダムフォレストは過剰適合のリスクを低下させることから、最終的なモデルの性能を高める。現在のこのランダムフォレストアルゴリズムは80%を超える精度で対照とMn活性化サンプルとを区別する。増加中のデータベースで、精度は99.9%を超えるまで増加可能である。
2つのアルゴリズムを比較して、現在、精度は同程度である。ランダムフォレストアルゴリズムはより広い範囲で学ぶことが可能であるため、CNNよりも一層正確であるが(追跡パラメーターは画像も含むことができる)、追跡分析が前もって行われる必要がある場合があるため、訓練および分類に一層に時間がかかる。ほとんどデータ前処理が必要とされないことから、CNNは訓練および分類の双方がいっそう速いと考えられる。精度はランダムフォレストアルゴリズムのものより低い可能性があるが、より大きいデータベースによってアルゴリズムの各々の限定の測定が求められる。
例15.SIRS患者におけるVCAM−1基質上でLAFAを使用しているVCAM−1とは独立した白血球補充に関して、ナタリズマブの効果を評価する
この 現行の例は、SIRS患者の白血球補充に対するナタリズマブ(Biogen、MA)効果を評価するためにVCAM−1基質上で白血球接着機能アッセイ(LAFA)の使用を対象としている。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取して、VCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、室温で5分間(30μg/ml)で処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所で概説している。
この 現行の例は、SIRS患者の白血球補充に対するナタリズマブ(Biogen、MA)効果を評価するためにVCAM−1基質上で白血球接着機能アッセイ(LAFA)の使用を対象としている。血液サンプルを健常ボランティアとSIRS患者から採取して、VCAM−1基質上でLAFAによって分析する前に、室温で5分間(30μg/ml)で処理した。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所で概説している。
Biogen社がタイサブリとして市場で販売中のナタリズマブは、中和モノクローナル抗ヒトα4β1インテグリン抗体であり、最も有効な多発性硬化症(MS)療法のうちの1つである。ナタリズマブは当初は、MS患者においてα4β1インテグリン機能をブロックして、白血球接着機能を抑制するために開発され、血液脳関門全体で白血球浸潤低下をもたらした。図6と例6に示すように、α4β1インテグリンの活性化促進がSIRS患者に認められた。このため、α4β1機能とVCAM−1依存性の白血球補充に関するナタリズマブの効果については、その後SIRS患者で調査した。
図22Aに示すように、無処置の対照と比較して、ナタリズマブ治療によって健常被験者および非感染性SIRS患者で有意に多くの相互作用するCD15+CD16+好中球が減少したことから、これらの細胞においてα4β1インテグリン機能を抑制するナタリズマブの能力が示唆される。一方、ナタリズマブ治療は、感染性SIRS患者におけるそのような抑制効果を示さなかった。加えて、ナタリズマブはその既知の作用と一致して健常群とSIRSの3群では有意にCD4とCD8細胞補充を阻害した(図22Bと22C)。
考えあわせると、これらの結果から、ナタリズマブが複数の細胞の亜集団で白血球α4β1インテグリン機能を阻害して、その結果、白血球補充を抑制する可能性が示唆される。これらの所見も、生体外で白血球接着機能に対する薬効を試験するLAFAの能力を示す。LAFAからの結果に基づいて、特定薬剤/療法に対する個々の被験者の潜在的反応が予想可能であり、個々の患者のために最適化された治療の発達が促進される。
例16.SIRS患者における血清中C反応性蛋白の評価
現行の例は、SIRS患者における血清中C反応性蛋白(CRP)濃度測定を対象とし、非感染性SIRSと感染性SIRSを区別する血清中CRP濃度の能力が測定可能である。血液サンプルは健常対照者およびSIRS患者から採取した。血清(上澄み)を採取するために、各血液サンプルからの血清を4℃で10分間2,000gで遠心分離した。製造者の指示に従い(ThermoFisher Scientific社)、CRPの濃度は市販のELISAキットで測定した。
現行の例は、SIRS患者における血清中C反応性蛋白(CRP)濃度測定を対象とし、非感染性SIRSと感染性SIRSを区別する血清中CRP濃度の能力が測定可能である。血液サンプルは健常対照者およびSIRS患者から採取した。血清(上澄み)を採取するために、各血液サンプルからの血清を4℃で10分間2,000gで遠心分離した。製造者の指示に従い(ThermoFisher Scientific社)、CRPの濃度は市販のELISAキットで測定した。
SIRS患者から採取した各血液サンプルに対して、標準的な微生物学的検査を実施して、感染症の潜在的陽性を決定した。カルテを組合せて、個々のSIRS患者における炎症の潜在的な原因を続いて2人の経験豊かなICU専門家がそれぞれに決定した。その結果、それぞれのSIRS患者における全身性の免疫反応の潜在的原因を表3に掲載する。それに応じて、14例のSIRS患者を次の3群に分けた。1)非感染性、2)感染性、そして、3)例7で詳述するように、不明。
図23Aに示すように、健常被験者におけるCRP濃度はELISAキットの検出限界未満である。SIRS患者の3群間のCRP濃度の違いは検出されなかったことから(図23A)、CRPが非感染性SIRSと感染性SIRS患者を区別する適切な標識でないことが示唆された。
例17.基質としてMAdCAM−1を用いたLAFAによるSIRS患者における白血球接着機能の評価
現行の例は、基質としてMAdCAM−1を使用して、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者の免疫反応増大を検出するための白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査することを対象とする。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後MAdCAM−1基質上でLAFAによって分析した。マイクロ流体チャネルは14μg/mlの濃度のヒトMAdCAM−1タンパク質でプレコートした。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
現行の例は、基質としてMAdCAM−1を使用して、組織的炎症反応症候群(SIRS)の患者の免疫反応増大を検出するための白血球接着機能アッセイ(LAFA)の能力を検査することを対象とする。血液サンプルは健常ボランティアとSIRS患者から採取し、その後MAdCAM−1基質上でLAFAによって分析した。マイクロ流体チャネルは14μg/mlの濃度のヒトMAdCAM−1タンパク質でプレコートした。特に明記しない限り、使用するプロトコルは、方法と材料のヵ所ですでに設定している。
図24Aと24Bに示すように、適切な数値による標準化の有無を問わずCD8CD15+CD16+の相互作用する細胞に細胞密度の違いは検出されなかった。健常被験者と比較して、一方では、CD15+CD16+好中球における有意に低値の直線性がSIRS患者で観察されたことから(図24E)、健常被験者に関連したα4β7インテグリン活性が示唆された。加えて、健常被験者よりSIRS患者ではCD8細胞の滞留時間が有意に長かった(図25F)。
カルテに基づいて例7で詳述したように、14例のSIRS患者を次の3群に分けた。すなわち、1)非感染、2)感染、そして、3)不明。このため、非感染性SIRSと感染性SIRSを区別するためのLAFA(MAdCAM−1)の能力も試験した健常被験者に比べて有意に低い正常化済みCD15+CD16+好中球密度が感染性SIRS患者検出されたことから(図25B)感染性SIRS患者で低下したα4β7インテグリン接着機能が示唆された。この概念は、健常被検者および非感染性SIRS患者と比較して感染性SIRS患者における有意に短い滞留時間を示す所見によって支持されている(図25F)。加えて、CD8細胞の滞留時間は、感染性SIRS患者と比較して感染性SIRS患者で有意に短かった(25F)。これらは、非感染性SIRSを感染性SIRSから分離するための上述の新しい標識の使用への可能性を示唆する。
汎インテグリン活性化因子であるMn2+は、白血球膜の上のα4β7インテグリンを活性化することから、その内皮リガンドであるMAdCAM−1へのα4β7インテグリン結合活性が増加する。健常被検者およびSIRS被験者におけるα4β7インテグリン活性化に対するMn2+のさまざまな効果を測定するために、血液サンプルをMAdCAM−1基質上でLAFAに使う前に、室温で5分間5mMのMncl2で処理した。
Mn2+の存在下で、健常被験者と比べてSIRS患者にCD15+CD16+好中球の正常化済み細胞密度低値が認められた(図26B)。3群に分けた後に、好中性細胞密度が非感染性患者に比べて感染性SIRS患者で有意に低いことが判明した(図27A)。加えて、非感染SIRSにおけるCD4細胞の直線性は、感染性SIRSの方が非感染性SIRSより有意に低いと測定された(図27E)。
考えあわせれば、これらの所見は、例えば、健常群および3つのSIRS群でMn2+に対するさまざまなα4β7インテグリン反応を測定するための新しい標識の範囲を策定するMAdCAM−1基質上のLAFAの能力を示す。LAFAは、非感染性SIRS患者と感染性SIRS患者を区別する目的で使用できる多くの役立つ細胞動態標識を特定してきた。
例18.インフルエンザ感染の発症前検出
健常成人被験者(CIN−001)は、健常対照者サンプル提供目的で本試験に補充した。木曜日(検査当日)に初回血液サンプルの収集のために現れた時に、この被験者は健常と報告して、ウイルス感染の症状を呈していなかった。同じ日の夕方に、最初の血液サンプルが採取したあと、被験者にのどの痛み(咽頭炎)が生じた。その翌日(1日目)に、被験者は咳嗽と呼吸困難からなるインフルエンザ感染の典型的症状を呈し始めた。2回目の血液サンプルはインフルエンザ症状がいっそう重度であった時である5日目(火曜日)に採取して、LAFAアッセイ用に使用した。同じ日(5日目)に、被験者は開業医(GP)によって、インフルエンザの疑いと診断された。インフルエンザの症状は約2週持続した。この後、被検者は完全に回復して、健常状態を維持した。3番目の血液サンプルは、2回目の血液サンプルが採取された11週後の火曜日に採取して、LAFAによって分析した。このため、3番目の血液サンプルを健常状態のベースラインサンプルとして使った。
健常成人被験者(CIN−001)は、健常対照者サンプル提供目的で本試験に補充した。木曜日(検査当日)に初回血液サンプルの収集のために現れた時に、この被験者は健常と報告して、ウイルス感染の症状を呈していなかった。同じ日の夕方に、最初の血液サンプルが採取したあと、被験者にのどの痛み(咽頭炎)が生じた。その翌日(1日目)に、被験者は咳嗽と呼吸困難からなるインフルエンザ感染の典型的症状を呈し始めた。2回目の血液サンプルはインフルエンザ症状がいっそう重度であった時である5日目(火曜日)に採取して、LAFAアッセイ用に使用した。同じ日(5日目)に、被験者は開業医(GP)によって、インフルエンザの疑いと診断された。インフルエンザの症状は約2週持続した。この後、被検者は完全に回復して、健常状態を維持した。3番目の血液サンプルは、2回目の血液サンプルが採取された11週後の火曜日に採取して、LAFAによって分析した。このため、3番目の血液サンプルを健常状態のベースラインサンプルとして使った。
表4に示すように、総白血球数(WBC)の段階的増加が検出され、インフルエンザ症状が重度のときにWBCは3番目の血液サンプルで最高値となった。類似の増加は、リンパ球を除いて多くの白血球のサブセットで見られた。最も高値のリンパ球数は培養時(2番目の血液サンプル)に検出され、1回目および3回目の血液サンプルのリンパ球数は同等であった。
血液サンプルがP+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析されたとき、相互作用するCD4とCD8の速度と拡散係数は(図28Aと28B)、双方の細胞はベースラインの健康な血球と比較して2回目と3回目の血液サンプルで減少したことから、これらの適応可能な免疫細胞でウイルスによって誘発されたセレクチンPリガンド(PSGL−1)活性化が示された。細胞速度、拡散係数、直線性飛跡長と排気量の減少が検出された時に、CD14とCD15+CD16+細胞上のPSGL−1の類似活性化は2回目と3回目の血液サンプルにも検出された(図28)。これらの所見は、潜伏期間と徴候的なインフルエンザ期間に自然免疫細胞および適応免疫細胞の活性化を示す。
ベースライン時の細胞と比較して、CD15+CD16+好中球の細胞直線性は培養時に有意に低値であり(2番目の血液サンプル)、インフルエンザの症状が重度であった時(3番目の血液サンプル)には検出されなかった(図28C)。これらのデータは、感染者において潜在的ウイルス感染を確認するユニークなLAFA標識としてCD15+CD16+直線性が使える可能性を示すが、明らかなインフルエンザ症状がまだない場合は明らかではない。
血液サンプルが基質としてVCAM−1を使用してLAFAにより解析した時には、低下した速度、拡散係数、直線性および相互作用するCD4およびCD8の転位(図29)が、ベースライン細胞と比較して2番目の血液サンプル(潜伏期間)に検出されたことから、ウイルス感染によるα4β1インテグリンの活性化が示唆された。インフルエンザ症状が重度であった3番目の血液サンプルでは、リンパ球数が1回目および3回目の血液サンプル間で同等であってさえ、相互作用するCD4およびCD8の細胞数は減少してほぼ0となった(図29)。これらの結果は3回目の血液サンプルのCD4とCD8細胞がほぼ完全にα4β1インテグリン機能を失ったことを示すが、これはおそらくウイルスによって誘発される免疫活性を緩和する目的で免疫系によって誘発される抗炎症性反応が原因と考えられる。Α4β1インテグリンの喪失が潜伏期間に起こらなかったという事実は、免疫系の状態がインフルエンザ症状のない潜伏期間とインフルエンザ症状が観察された期間の間で有意に異なることを示す。
考えあわせれば、これらのデータは、LAFAの能力が免疫系に対するウイルス感染の効果だけでなく、さまざまな感染段階の病原体に対する免疫系のさまざまな反応も検出することを示す。このため、LAFA生物マーカーは潜伏期間中に感染症の初期徴候を検出する事が可能であるが、それは通常は他の日常的血液検査によっては検出できない。さらに、同じ者はさまざまな病原体に別々に反応できるが、他者も同じ異質病原体に別々に応えることもできる。LAFAはそのような差を検出するために理想的であり、感染の早期発見を可能として、個々の患者で互いに異なる免疫状態に基づく最適治療の発達を促進する。
例19.粘着性基質としてP+Eセレクチン上で白血球接着機能のLAFA測定によって全身性炎症反応症候群(SIRS)を評価すること。
P+Eセレクチン接着基質の白血球接着機能のLAFA測定を患者サンプルからSIRSを評価するために用いた。感染性SIRSおよび非感染性SIRSを区別するLAFAの能力も評価した。例12では、14名のSIRS患者からの血液サンプルをP+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。現行の例では、さらに14名のSIRS患者からのサンプルを分析して、データ分析に含めた。この例で提示するデータは28名のSIRS患者を含む。患者のカルテ(表5)に基づいて、新しい14名のSIRS患者の各々を次のいずれかを表すかを決定するために、後ろ向きに評価した。
1.「Non−infectious(非感染)」群:感染の可能性がありそうもない、または、
2.「Infectious(非感染)」群:感染証明済み(例えば細菌結果陽性)、または、
3.「Unknown(未知の)」群: 感染はあり得るが照明がなされていない。
P+Eセレクチン接着基質の白血球接着機能のLAFA測定を患者サンプルからSIRSを評価するために用いた。感染性SIRSおよび非感染性SIRSを区別するLAFAの能力も評価した。例12では、14名のSIRS患者からの血液サンプルをP+Eセレクチン基質上でLAFAによって分析した。現行の例では、さらに14名のSIRS患者からのサンプルを分析して、データ分析に含めた。この例で提示するデータは28名のSIRS患者を含む。患者のカルテ(表5)に基づいて、新しい14名のSIRS患者の各々を次のいずれかを表すかを決定するために、後ろ向きに評価した。
1.「Non−infectious(非感染)」群:感染の可能性がありそうもない、または、
2.「Infectious(非感染)」群:感染証明済み(例えば細菌結果陽性)、または、
3.「Unknown(未知の)」群: 感染はあり得るが照明がなされていない。
図30Iに示すように、健常被験者(n=14)と比べてSIRS患者は総白血球数が有意に高く、それは主に好中球数増加に起因する。リンパ球数は健常被験者と非感染性の患者と比較して、感染性SIRS患者で有意に低い。非感染性患者では単球数が健常被験者より多かった。
相互作用するCD4とCD8細胞の数は、健常被験者と非感染性の患者と比較して、リンパ球数が少ない可能性があることから(図30I)、感染性SIRS患者(図30A)では有意に低値であった。感染性SIRS患者のCD4相互作用細胞の直線性と転位は健常被験者と非感染性の患者と比較して有意に低く、感染患者におけるPSGL−1活性化を示した。一貫して、感染性CD4細胞の滞留時間は、健常被験者と非感染性患者と比べて有意に長かった。これらの所見はPSGL−1活性化が感染性SIRS患者におけるユニークな標識であることを示し、そして、それは感染性と非感染性のSIRS患者を区別する目的で使用可能である。さらに、他の群と比べて有意に多くのCD4+CD25+相互作用する細胞が感染性患者で認められた一方、細胞移動挙動はすべての群で同様であった。
健常被験者と比較して、相互作用するCD15+CD16+細胞(好中球)の直線性(図30E)、飛跡長(図30G)および転位(図30H)は、すべてのSIRS患者群で低値であった(非感染、感染および不明を含む)。これらの結果は、SIRS患者におけるPSGL−1活性化の増強を示唆しており、全身炎症反応を検出する標識として使用可能である。
追加したSIRS患者から採取した各血液サンプルに対して、標準的な微生物学的検査を実施して、感染症の潜在的陽性を決定した。カルテを組合せて、個々のSIRS患者における炎症の潜在的な原因を続いて2人の経験豊かなICU専門家がそれぞれに決定した。その結果、それぞれのSIRS患者における全身性の免疫反応の潜在的原因を表5に掲載する。それに応じて、14例のSIRS患者を次の3群に分けた。1)非感染性、2)感染性、そして、3)上述のように、不明。
これらの血液サンプルでは(6人の新規健常被験者と28名のSIRS患者を含む)、単一細胞のプロファイルが特定の白血球サブセットに対して策定されるように、多くの細胞動態パラメータ(例えば細胞密度、速度、拡散係数、直線性、滞留時間、飛跡長および転位)を1つの相互作用する細胞に対して測定した。図31Aに示すように、CD4細胞の直線性の平均は健常被験者と非感染性SIRS患者で高い一方(1に近い)、大部分の感染性患者のCD4直線性値は低いことから、感染性患者と非感染性患者とを区別するために役立つLAFA標識が提供されている。SIRS患者のSIRS-25では、感染性の病原体のエビデンスが見つからなかった場合であっても、2名双方のICU専門医は可能性を伴う感染症としてこの患者を記録した。CD4の直線性低値が患者のSIRS-25(図31A)で検出されたと想定すれば、患者SIRS-25は感染患者の可能性が高い。同じ理由から、患者SIRS-13は、感染患者である可能性がある。
さらに、図31Bに示すように、健常者の血液サンプル中の相互作用するCD15+CD16+細胞の数は、SIRS患者サンプルより少ない。健常被験者のCD15+CD16+細胞の直線性の平均値は、SIRS患者の値より高値である。これらの結果から、これらのLAFA標識が健常被験者とSIRS患者を区別するために使用できることが示唆される。
考えあわせれば、これらの結果は、全身炎症反応を検出するだけでなく、感染性SIRS患者と非感染性患者も区別するためにセレクチン基質上で役立つLAFA標識をもたらすLAFAの能力を明らかにしている。これらのLAFA標識の組合せは、SIRSまたは敗血症の診断検査法として、LAFAアッセイの精度と感度を向上させ得る。LAFAによる免疫系活性化の正確な評価は、個人ベースでどのように免疫系が炎症性刺激に反応するかに関する役立つ情報を提供でき、最適化された治療の発達を促進する。
例20.粘着性基質としてVCAM−1上で白血球接着機能のLAFA測定によって全身性炎症反応症候群(SIRS)を評価すること。
例20.粘着性基質としてVCAM−1上で白血球接着機能のLAFA測定によって全身性炎症反応症候群(SIRS)を評価すること。
例6では、14名のSIRS患者からの血液サンプルをVCAM−1基質(白血球α4β1インテグリンのリガンド)上でLAFAによって分析した。現行の例では、さらに14名の新しいSIRS患者を同分析に採用した。感染性SIRSおよび非感染性SIRSを区別するLAFAの能力を続いて評価した。この例で提示するデータは、28名すべてのSIRS患者(当初の14名と追加14名の患者)を含む。患者のカルテ(表5)で基づき、さらに14名のSIRS患者を後ろ向きに評価してSIRSが1)非感染性、2)感染性または3)不明のいずれかを決定した。
図32Aに示すように、健常被験者と非感染性SIRSと比較すると、VCMA−1基質の相互作用するCD4とCD8細胞の数は感染性SIRS患者で有意に低値であった。一方、細胞密度が対応する白血球数によって標準化した後では、そのような差は検出されなかった(図32B)。
相互作用するCD19細胞の速度(図32C)と拡散係数(図32D)は、健常被験者と非感染性SIRS患者と比較して感染性SIRS患者で低値であったことから、感染性患者からのCD19細胞に対する特異的なα4β1インテグリン活性化が示唆される。CD15+CD16+細胞の速度(図32C)と直線性(図32D)は、健常被験者と比較して非感染性と感染性のSIRS患者で低値であった。CD15+CD16+細胞の飛跡長は健常被験者と感染性患者の間で同等であったが、有意に長かった(図32G)。同様に、健常被験者と感染性患者と比べてCD14細胞の有意に長い飛跡長が非感染性SIRS患者に認められた(図32G)。これらの所見は、上記のLAFA標識がSIRS患者を特定視するか、感染性SIRSと非感染性患者を区別するために組合せて使用できることを示す。LAFA標識の他の組合せもSIRS患者を特定するか、感染性SIRSと非感染性患者を区別するために有用であることを示す。
血液サンプルの白血球サブセットの単一細胞のプロファイルも製作した。図33Aに示すように、健常群および非感染性群と比較して、感染性SIRS患者における大多数のCD19細胞速度は低値である。さらに、SIRS患者(図33B)と比較して、健常被験者のCD15+CD16+細胞の直線性はその大部分が高値である(1に近い)。
考えあわせれば、これらの結果は、全身炎症反応を検出するだけでなく、感染性SIRS患者と非感染性患者も区別するためにVCAM−1基質上で役立つLAFA標識をもたらすLAFAの能力を明らかにしている。これらのLAFA標識の組合せは、SIRSまたは敗血症の診断検査法として、LAFAアッセイの精度と感度を向上させ得る。LAFAによる免疫系活性化の正確な評価は、個人ベースでどのように免疫系が炎症性刺激に反応するかに関する役立つ情報を提供でき、最適化された治療の発達を促進する。
例21.粘着性の基質としてVAM−1+IL−8に加えてVCAM−1+SDF−1αを使用してLAFAで測定したような白血球接着機能に対するSIRSの効果
現行の例は、VCAM−1+IL−8またはVCAM−1+SDF−1αの基質を使用してLAFAで測定したような白血球接着機能に対するSIRSの効果の検出を対象としている。例9と例10では、14名のSIRS患者をそれぞれVCAM−1+IL−8およびVCAM−1+SDF−1αを使用してLAFAによって分析した。現行の例では、さらに14名のSIRS患者を同分析に採用した。感染性SIRSおよび非感染性SIRSを区別するLAFAの能力を続いて評価した。この例で提示するデータは、28名のSIRS患者(当初の14名と追加14名の患者)を含む。
現行の例は、VCAM−1+IL−8またはVCAM−1+SDF−1αの基質を使用してLAFAで測定したような白血球接着機能に対するSIRSの効果の検出を対象としている。例9と例10では、14名のSIRS患者をそれぞれVCAM−1+IL−8およびVCAM−1+SDF−1αを使用してLAFAによって分析した。現行の例では、さらに14名のSIRS患者を同分析に採用した。感染性SIRSおよび非感染性SIRSを区別するLAFAの能力を続いて評価した。この例で提示するデータは、28名のSIRS患者(当初の14名と追加14名の患者)を含む。
血液サンプルをVCAM−1+SDF−1α基質上でLAFAによって分析したとき、SIRS患者において相互作用するCD15+CD16+細胞の直線性は、健常被験者と比べて(図34E)有意に低かったことから、SIRSCD15+CD16+細胞でのCXCR1の活性化を示している。一貫して、SIRS患者におけるCD15+CD16+細胞の滞留時間は健常被験者より有意に低値であった一方、感染性SIRS患者におけるCD15+CD16+細胞の滞留時間も非感染性患者より有意に低値であった(図34F)。
血液サンプルをVCAM−1+SDF−1α基質上でLAFAによって分析したとき、相互作用するCD4細胞の数は、健常被験者と非伝染性の患者(図35A)と比較して感染性患者で有意に低値であった。感染性CD4細胞の滞留時間は健常被験者より有意に低値であり、感染性CD4細胞におけるCXCR4のいっそうの活性を示す(図F)。さらに、感染性および非感染性のSIRS患者からのCD15+CD16+細胞の速度は、健常細胞より有意に高値であったが、感染性SIRS患者からのCD15+CD16+細胞の直線性は、健常細胞および非感染性の細胞より有意に低値であった(図E)。これらの結果は、感染性CD15+CD16+に対するCXCR4の異なる活性を示し、健常細胞および非感染性細胞と比べて細胞運動能の低下をもたらす。同様に、感染性CD15+CD16+細胞の滞留時間と転位は、健常細胞および非感染性細胞より有意に低値であった(図35Fと35H)。
考えあわせれば、これらの所見は、健常被験者、非感染性および感染性のSIRS患者におけるCXCR1とCXCR4の異なる活性を示す。このため、これらのLAFA標識は、SIRS患者で全身性炎症を確認するだけでなく、感染性SIRS患者と非感染性患者も区別するために使用できる。これらのLAFA標識の組合せは、SIRSまたは敗血症の診断検査法として、LAFAアッセイの精度と感度を向上させ得る。LAFAによる免疫系活性化の正確な評価は、個人ベースでどのように免疫系が炎症性刺激に反応するかに関する必須の情報を提供でき、最適化された治療の発達を促進する。
例22.LAFA標識
現行の例は、LAFAアッセイの分析からもたらされ得るLAFA標識の非排他的リストを提供する。
現行の例は、LAFAアッセイの分析からもたらされ得るLAFA標識の非排他的リストを提供する。
1つ以上の画像を画像分析ソフトウェアによって分析したが、それは例3に記載している。続いて細胞の位置をソフトウェアによって、1つ以上のフレームで測定した(例3)。この細胞位置データを使用して、LAFA標識を算出する。
この例では、LAFA標識は、粘着性の基質(表2の例1で述べられるように)、活性化の状態(例えばMn2+の有無にかかわらず、例4と5)と測定カテゴリー(表6)によって分類する。すべてのLAFA細胞マーカーを表7と8に掲載している。すべてのLAFA標識は、それぞれの白血球サブセット(例1で表1で述べられるように)に対して決定可能である。
表8に掲載した標識は細胞の瞬間速度に由来する。特定の実施例において、瞬間速度は、特定の細胞の1つのフレームから次のフレームとの間に記録されたそれぞれの動作距離として定義できる。例えば、100のフレームに記録された細胞は、99の瞬間速度をもたらす。細胞数と標準化された細胞数は別として、特定の白血球集団のすべての細胞からの標識の平均値を表7と表8に掲載したすべてのパラメータに対して計算可能である。
例23.感染性SIRS患者と非感染性SIRS患者を区別する機械学習の使用
患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)が伝染性であるか非伝染性の原因によるか否かを決定するために、現行の例は機械学習(ML)の使用を対象とする。例7と例20で述べるように、感染性および非感染性のSIRS患者からの血液サンプルを採取して、基質としてVCAM−1を用いた白血球接着機能アッセイ(LAFA)に使用した。感染性および非感染性の血液サンプルからのデータを機械学習アルゴリズムを訓練するために用いて、未知のサンプルを予測するために訓練されたアルゴリズムの能力を続いて測定した。
患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)が伝染性であるか非伝染性の原因によるか否かを決定するために、現行の例は機械学習(ML)の使用を対象とする。例7と例20で述べるように、感染性および非感染性のSIRS患者からの血液サンプルを採取して、基質としてVCAM−1を用いた白血球接着機能アッセイ(LAFA)に使用した。感染性および非感染性の血液サンプルからのデータを機械学習アルゴリズムを訓練するために用いて、未知のサンプルを予測するために訓練されたアルゴリズムの能力を続いて測定した。
MLは、人工知能とパターン認知から進化したコンピュータサイエンス分野である。MLアルゴリズムでは、コンピュータが人間による入力なしにデータから学習して予想することが可能である。
現行の機械学習アルゴリズムは、ランダムフォレストアンサンブル学習方法に基づく。このアルゴリズムは、感染性および非感染性のSIRS患者の血液サンプルからの多くのLAFA標識(例22で述べるように)を使用して訓練した。ランダムフォレストは十分なデシジョンツリーから構築され、各々がさまざまな訓練データセットのサブセット上で訓練される。平均的な複数の独立したデシジョンツリーによって、ランダムフォレストは過剰適合のリスクを低下させることから、最終的なモデルの性能を高める。
現行のランダムフォレストアルゴリズムは、3つの感染性SIRSからの血液サンプルと3つの非感染性SIRSの血液サンプルからのデータを用いて訓練したが、その全ては患者のカルテと血液培養結果に基づいて2人のICU専門医が測定した(例7)。
この後、感染性SIRSと非感染性SIRSを区別する訓練済みアルゴリズムの能力を検定した。
この後、感染性SIRSと非感染性SIRSを区別する訓練済みアルゴリズムの能力を検定した。
感染性患者2名および非感染性患者2名の血液サンプルからのLAFAデータを、訓練済みアルゴリズムを検査するために「未知」のサンプルとして使用した。検定のために使用した4つのサンプルすべての病理学的原因を(感染性か非感染性)ICU専門医が事前に決定した(例7)。アルゴリズムは4つのサンプルすべての病理学的原因を良好に予測して、100%の精度を提供した。訓練のために増加した患者サンプル数を用いれば、MLアルゴリズムの正確さを維持するために必要な最も識別に長けたLAFA標識を特定できる。このため、既存のMLアルゴリズムは最も役立つLAFA標識を用いて最適化され、構築され得る。
現在の開示の幅広い一般的な範囲から離れることなく、多数のバリエーションおよび/または修正が上記の実施例に実施可能な技術に熟練した者によって高く評価されることになる。現行の実施例は、従って、あらゆる点で実例となり、制限的ではないと考慮され得る。
ここで論じて、参考にした双方か、いずれかのすべての刊行物はすべてこの中に組み込んでいる。
現在のアプリケーションはAU2018901305に優先権を主張しており、その全内容はすべてこの中に組み込んでいる。
現行の仕様に含まれる文書、議定書、材料、機器、論文またはその種のものについての検討は、単に現行の発明の脈絡を提供するためであった。この申請書の各請求項の優先権日以前に存在したことから、それはこれらの事項のいずれもまたは全てが先行技術ベースの一部またはすべてを形成するか、現行の発明に関連する分野に共通かつ一般的な知識であったとは了解されない。
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Claims (50)
- 被験者における感染性と非感染性の炎症性免疫反応を分類する方法であって、
被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に一部基づいて、被験者が感染性の炎症性免疫反応か非感染性の炎症性免疫反応を呈するか否かを究明することを含む、方法。 - 定量的および/または半定量的に少なくとも1件のLAFAが白血球補充、接着および/または遊走を評価する、請求項1に記載の方法。
- 被験者からの血液サンプルを採取することから成る請求項1または2に記載の方法。
- VCAM−1、MAdCAM−1、IL−8、SDF−1α、E−セレクチン、P−セレクチンおよびICAM−1から1つ以上の内皮細胞分子を選択する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の内皮細胞分子がVCAM−1、MAdCAM−1、IL−8、SDF−1α、E−セレクチン、P−セレクチンおよびICAM−1の2つ以上から成る、請求項4に記載の方法。
- 1つ以上のLAFAが以下のパラメータ:検出された回転する白血球細胞の定量化、検出された接着白血球細胞の定量化、検出された遊走白血球細胞の定量化、検出された個々の白血球細胞の平均速度、検出された個々の白血球細胞の平均直線性、検出された個々の白血球細胞の平均的移動および検出された個々の細胞の平均滞留時間の1つ以上を測定する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 被験者の血液サンプルからの1件以上のLAFAが、少なくとも1つ以上のインデックスを生成するために使う1つ以上のパラメータを生成するための参考レベルとして使用する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 健常血液サンプルの少なくとも1つ以上からのLAFAの結果を1つ以上のインデックスを生成することに使われる1つ以上のパラメータを生成するための参考レベルとして使用する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 被検者の血液の活性化電位比率は、被験者のMn2+治療をうけた血液サンプルから少なくとも1つのLAFAの結果によって分けた被験者の血液から少なくとも1つのLAFAの結果に基づいて作成されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の白血球細胞の表面標識をさらに検出することからなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の白血球細胞の標識をCD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19およびCD25から選択した、請求項10に記載の方法。
- 被験者が全身性炎症反応症候群(SIRS)に罹患しているかその疑いがある、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 白血球補充、接着および/または遊走を白血球補充、接着および/または遊走の参考レベルと比較することから成る、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 白血球補充、接着および/または遊走の参考レベルが設定したデータセットに由来する、請求項13に記載の方法。
- 確立したデータセットは、感染性の炎症性免疫反応を呈することが知られている被験者の集団および/または非感染性の炎症性免疫反応を呈することが知られている被験者の集団の白血球補充、接着および/または遊走の測定値から成る、請求項14に記載の方法。
- 感染性の炎症性免疫反応を有することが知られる被験者集団が敗血症を有することが知られている、請求項15に記載の方法。
- 感染性の炎症性免疫反応を有することが知られる被験者集団がSIRSに罹患することが知られている、請求項15に記載の方法。
- LAFAの結果が
i)補充された白血球および/または接着性白血球の高値または低値、
ii)補充された白血球および/または接着性好中球の割合高値または低値、高値または低値、
iii)補充された単球および/または接着性単球のより高値または低値、参考レベルと比較すると敗血症を示し、ここでは参考レベルは非感染性SIRSを呈することが知られている被験者集団に由来する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。 - 被験者に感染性の炎症性免疫反応があり、被験者に抗菌製剤か抗ウイルス製剤を投与することから成る、請求項1〜16および18のいずれか一項に記載の方法。
- 被験者が非感染性の炎症性免疫反応を呈すことを見つけ出し、被験者に抗炎症製剤を投与することから成る、請求項1〜15、17および18のいずれか一項に記載の方法。
- 被験者が非感染性の炎症性免疫反応を呈すことを見つけ出し、被験者に白血球補充、接着および/または遊走を変容させる能力のある薬剤を投与することから成る、請求項1〜15、17、18および20のいずれか一項に記載の方法。
- 薬剤が内皮細胞分子への白血球接着分子の結合に干渉する抗体である、請求項21に記載の方法。
- 1つ以上の請求項1〜16、18および19のいずれか一項に記載の方法を実行し、
被験者が感染性の炎症性免疫反応を呈すると確定しており、
感染性の炎症性免疫反応を治療するために被験者を治療する方法から成る、被験者の感染性の炎症性免疫反応を治療する方法。 - 被験者が敗血症を有する、請求項23に記載の方法。
- 被験者の敗血症の治療は、患者を1剤以上の抗生物質、昇圧剤および副腎皮質ステロイドの薬剤以上で治療することから成る、請求項24に記載の方法。
- 感染症治療にふさわしい薬剤への被験者の反応または潜在的反応を評価する方法であって、
被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象として、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1つのLAFAの1つ以上の結果に一部基づいて、感染症治療薬剤に対して患者の反応または潜在的な反応を評価する、方法。 - 炎症性免疫性反応を呈している被験者の白血球のサブセットを検出する方法であり、
少なくとも1回の白血球機能アッセイで(LAFA)被験者からの血液サンプルを提出し、
そこではLAFAは、白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
1つ以上の白血球細胞表面マーカーを検出して、
少なくとも1つ以上のLAFAの結果と1つ以上の白血球細胞表面マーカーの検出に基づいて、炎症性免疫反応と関連した白血球のサブセットを究明する、方法。 - 被検者が炎症性疾患または感染疾患に罹患している、請求項27に記載の方法。
- 被検者がSIRSに罹患しているかその疑いがある、請求項27または28に記載の方法。
- 被験者が敗血症を有する、請求項29に記載の方法。
- 被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)に提出することから成る方法であり、
そこではLAFAは、白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走を評価し、そして
少なくとも1回のLAFAの1つ以上の結果に基づいて、被験者の炎症の原因を究明する、方法。 - 1つ以上の白血球細胞表面マーカーを検出することを更に含む、請求項31に記載の方法。
- 1つ以上の白血球細胞の標識をCD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19およびCD25から選択する、請求項32に記載の方法。
- 被験者における炎症の原因が感染性の炎症原因であると確定する、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 感染性の炎症原因が細菌、ウイルスまたは寄生虫感染である、請求項34に記載の方法。
- 細菌感染が腸内細菌、セラチア属、シュードモナス属、大腸菌および黄色ブドウ球菌の1つ以上に起因する感染症から選択されている、請求項35に記載の方法。
- 被験者における炎症の原因が非感染性の炎症原因であると確定する、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 非感染性の炎症原因は、心筋梗塞、喘息、出血、動脈瘤および/または間質性肺炎から選択される、請求項37に記載の方法。
- 1つ以上の請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法に基づく少なくとも1回のLAFAを行うためのシステム。
- 1つ以上の請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法に基づく少なくとも1回のLAFAを行う装置。
- 被験者において感染性および非感染性の炎症性免疫反応を区別する方法であって、
すなわち、被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)の対象とするが、ここではLAFAが白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走のビデオデータを撮影し、そして
被験者が感染性の炎症性免疫反応か非感染性の炎症性免疫反応を呈するか否かを決定するために機械学習をビデオデータに適用する、方法。 - ビデオデータが複数の画像から成り、ビデオデータへの機械学習の適用から成り、
複数の画像を1つの画像に結合し、そして、
機械学習を1つの画像に適用する、請求項41に記載の方法。 - 複数画像の組み合わせが複数の画像を1つの像に結合するための最大値投影法の実施から成る、請求項42に記載の方法。
- 機械学習を適用することが畳み込みニューラルネットワークを1つの像に適用することから成る、請求項42または43に記載の方法。
- 畳み込みニューラルネットワークを1つの画像に適用することが、感染性および非感染性の炎症性免疫反応で複数の訓練サンプルのそれぞれに1つの訓練画像を使用して畳み込みニューラルネットワークを訓練することおよび検査を受けている被験者の1つの画像に訓練済みの畳み込みニューラルネットワークを適用することから成る、請求項44に記載の方法。
- さらに細胞追跡パラメータ値を測定するために細胞追跡を行うことおよび機械学習を細胞追跡パラメータ値に適用することから成る、請求項41〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 機械学習をパラメータ値の追跡に適用することは、ランダムフォレストを細胞追跡パラメータに適用することから成る、請求項46に記載の方法。
- 細胞追跡パラメータがランダムフォレストの木のノードによって示される、請求項47に記載の方法。
- ランダムフォレストを1つの画像に適用することが、感染性および非感染性の炎症性免疫反応を呈する複数の訓練検体の各々に1つの訓練画像を使用してランダムフォレストを訓練すること、および検査を受けている被験者の1つの画像に訓練済みの畳み込みニューラルネットワークを適用することから成る、請求項48または49に記載の方法。
- 被検者の炎症の原因を決定する方法であり、
それは被験者からの血液サンプルを少なくとも1回の白血球機能アッセイ(LAFA)に提出して、そこではLAFAは、白血球補充、少なくとも1つの内皮細胞分子への接着および/または遊走のビデオデータをキャプチャーし、そして
被験者の炎症の原因を決定するために機械学習をビデオ・データに適用する、方法。
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