JP2021521823A - 方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、病原体を検出するための生物学的安全手段に関し、生物学的安全反応容器およびＰＣＲベースの病原体検出のための試料を調製する方法を提供する。

Description

本発明は、病原体検出の分野に関する。

典型的に、エボラなどの高封じ込めレベルの病原体の存在をスクリーニングするための分子的方法は、検査を実行するオペレータを保護するために、追加レベルの生物学的安全性を要求する。これらのウイルス性出血熱をスクリーニングする最初のステップは、患者から静脈血を採取することである。試料を採取する個人は、典型的には、複数の手袋、防護服、およびフェイスマスクを含む、完全な個人用保護具を着用する。血液試料を採取することに続いて、収集容器の外側は、核酸抽出が行われる前にウイルスを非感染性にするように、漂白剤中に、その後、抗ウイルス薬、例えばグアニジンチオシアン酸塩に浸すことによって殺菌される。これらの既知の方法は、複数ステップの手順を含み、したがって、訓練されたユーザー、および実験室へのアクセスを必要とする。

このような検査のための静脈吸引に使用される典型的容積は、３〜６ｍｌであり、複数の液体の伝送およびキャップの取り外しを行う必要があることを考慮すると、病原体にさらされるリスクは高い。より少量の血液など、より少量が、直接処理されることができれば、その後、この曝露のリスクは、最小限に抑えられることができ、かつ、直接分子検査が行われる反応容器が、複数の生物学的安全性特徴を所持するように、設計されることができれば、その後、病原体の放出のリスクは、大幅に最小限に抑えることができる。

より少量の試料、例えば血液が処理されると、オペレータの安全性を最大化するために、その後、感度の要件に課される負担が増加する。ＷＨＯのＲ＆Ｄの青写真（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ／ｅｎ／）は、発展途上国の低コスト診断のための検出レベルに好適であるものとして、３，０００ビリオン（ｖｉｒｉｏｎｓ）／ｍｌの全血のレベルを定義する。これは、ＨＩＶおよびＣ型肝炎を含み、かつ上で記載のウイルス性出血熱（エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルグ、リフトバレー熱、クリミアコンゴ熱、ニパ、黄熱病、デング熱など）を含む、幅広い疾患の検出を可能にする。３，０００ビリオン／ｍｌは、マイクロリットルあたり３ウイルス目標であるため、３，０００ビリオン／ｍｌの数字は、検出の下限の要求を提供し、かつ反応に直接追加される必要がある血液の容積上の案内を与える。

現在の方法および設備の改善は、最も致命的な病原体のいくつかの高い発生率に一致する、特定の第三世界の国々のように、特に安全機器へのアクセスが制限されている場合、病原体のより安全な検出を可能にするように、要求される。

血液は、容易にアクセス可能であり、診断で日常的に使用されている、潜在的な病原体の供給源に一般的に使用されている。

病原体は、ｒｔＰＣＲを含む、ＰＣＲベースの診断を介して日常的に検出されている。しかしながら、ＰＣＲは、酵素増幅処理と、ｒｔＰＣＲなどの、ＰＣＲのいくつかの形式でＰＣＲ産物の存在を検出するように使用される光学系との両方の観点から、全血の存在によって阻害される。全血は、ヘム、鉄、免疫グロブリンなど、およびＰＣＲの実行に必要なポリメラーゼ酵素、またはＲＮＡ目標からの増幅に必要な逆転写酵素を阻害する他のものを包含する。同様に、リアルタイム処理で使用される蛍光体は、血液中のヘムなどの物質によって消光され、血液自体は、独自の吸光度および放射スペクトル有し、最終的な結果として、リアルタイムＰＣＲは、高濃度の血液の存在では信頼できないと考えられる。感度の負担（特に低量の血液を使用する場合）は、血液が、必然的に、ＰＣＲの全反応容積の、より大きな割合を形成する必要があり、反応の不透明性によるリアルタイムにＰＣＲを実行することができなくなる、ポイントに到達することを意味する。

上記を考慮して、血液試料を使用するＰＣＲベースの診断は、例えば、血漿もしくは血清をＰＣＲ反応に取り入れ、病原体の核酸を抽出できるようにするため、赤血球を除去することにおいて、および／または赤血球がない状態で検出が実行できるようにするため、得られたＰＣＲ産物を抽出することにおいて、典型的に複数のステップを要求する。これらの複数のステップは、臨床医および実験室スタッフが感染しないようにするための検査機器、生物学的安全環境、ならびに安全機器を要求し、つまり、検出は、単純ではなく、かつ病原体の現場ベースの迅速な検出には好適でない。

ＰＣＲが全血の存在によって阻害されることは、十分に確立された事実であり、処理が完全に光学的に阻害される前に、反応に追加されることができる血液の量が非常に少ないため、直接採血ＱＰＣＲについての査読論文はほとんどない。追加されることができる血液の量、および記載されている方法論の量が比較的少量（＜５０ｕｌ）であることは、血液からの病原体の直接検出が、非常にまれにしか記載されていないことを意味する。標準的なＱＰＣＲの場合、Ｍｉｎｏｇｕｅら（Ｍｉｎｏｇｕｅ，Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｄ、他「Ｃｒｏｓｓ−ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＰＣＲ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ａｅｒｏｓｏｌ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔ ＤＮＡ」、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．８０、４（２０１４）、１３２２−９）は、胞子を全血に直接スパイクすることを記載したが、これは、最大４％のみであり、いずれの回転ステップについても批判的に記載していない。血液の存在下における逆転写酵素の使用に関する文献は、さらに少ないため、血液からの直接逆転写ＱＰＣＲに関する文献は、さらに少なくなっている。存在するものは、多数のリボソームＲＮＡがＰＣＲ目標として使用されることができる、マラリアのような寄生虫を中心としており、例えば、寄生虫ごとに数万のリボソームＲＮＡ転写物が存在する場合（Ｔａｙｌｏｒ ＢＪ、Ｌａｎｋｅ Ｋ、Ｂａｎｍａｎ ＳＬ、他、Ａ Ｄｉｒｅｃｔ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｍａｌａｒｉａ Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．２０１７、９７（２）、５３３−５４３）、またはウイルス力価が全血１ｍｌあたり数百万に達する可能性がある、エボラのようなウイルスが存在する場合（Ｋａｖｉｔ Ｓｈａｈ、Ｅｍｍａ Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ａｄａｍ Ｔｙｌｅｒ、Ｋｅｖｉｎ Ｓ Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｅｄ Ｗｒｉｇｈｔ、Ｌｉｎｄａ Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ、Ｄｉａｎｅ Ｌｅｅ、Ｃｌａｉｒｅ Ｃｌｅａｖｅｒ、Ｌｏｕｉｓｅ Ｕｓｈｅｒ、Ｊａｎｅ Ｅ Ｂｕｒｔｏｎ、Ｊａｍｅｓ Ｐｉｔｍａｎ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｂ Ｂｒｕｃｅ、Ｄａｖｉｄ Ｅｄｇｅ、Ｍａｒｔｉｎ Ｌｅｅ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｎａｚａｒｅｔｈ、Ｄａｖｉｄ Ａ Ｎｏｒｗｏｏｄ、Ｓｔｅｒｇｈｉｏｓ Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ Ｍｏｓｃｈｏｓ． Ｆｉｅｌｄ−ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｅｂｏｌａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ Ｂｌｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２０１７、ＤＯＩ、１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２８１Ａ）がある。全血によるＰＣＲの阻害は、ヘム化合物、免疫グロブリンを包含する鉄の存在によって、そして単にカルシウムなどの血液中の競合する陽イオンの存在によって引き起こされる多因子であることが示されている（Ｓｉｄｓｔｅｄｔ、Ｍａｊａ ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ，ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｉｎ ｄｉｇｉｔａｌ ａｎｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．４１０、１０（２０１８）、２５６９−２５８３）。

血液細胞などの、細胞を溶解する方法は、例えば、ＷＯ２０１１１５７９８９から既知である。しかしながら、ＷＯ２０１１１５７９８９の方法は、必要な凍結および解凍サイクルを可能にするように、大量のエネルギーを必要とする。このような方法は、電池式のＰＣＲマシンを使用する病原体の現場ベースの検出には好適でない。

ＷＯ２０１６１３９４４３は、血液試料に直接ＰＣＲを実行するための方法を開示している。しかしながら、この方法は、各ＰＣＲ反応で比較的少量の血液を使用することに制限されており、つまり、感度が制限され、特定の励起波長および放射波長にも制限される。ＣＹ５−ＢＨＱ２、ＨｉＬｙｔｅ６４７−ＱＸＬ６０７などの、好適である蛍光体の組み合わせが存在し、多重化の可能性を制限しているが、これらの波長は、一般的に使用される蛍光体の大部分とは相関していない。

これを考慮して、特に血液試料からの、病原体検出の単一ステップ、閉チューブＰＣＲベースの方法は、安価、かつ単純であり、電気へのアクセスが制限されている、現場使用に好適であるため、利用できない。ＢｉｏＦｉｒｅもしくはＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒなどの、全血を処理できる機器、またはアッセイは、上流での処理が必要であり、その性質上、核酸抽出処理を自動化するための絶対的な要求の効力によって、検査ごとにより複雑であり、したがって高価である。

さらに、一般的に使用されるＰＣＲ反応容器は、典型的には、フリップキャップクロージャーによって密閉されるか、またはプレートの場合は、密閉フィルムが好ましい密閉手段である。この文脈において、キャップは、密閉される反応容器の直径よりもわずかに小さい直径を有する蓋を意味し、キャップには、締まり嵌めによってキャップを所定の位置に固定する密閉フランジが提供されており、すなわち、キャップが開いて、容器内容物が解放されるのを防止する手段は提供されていない。ＰＣＲの間、概して、キャップは、致命的な汚染の可能性がある大量の物質を毎日取り扱う臨床、または研究室の作業者を保護しない、装置自体からの圧力によって開くことから防止される。

典型的には、ＰＣＲ容器は、２００μＬ（２００マイクロリットル）未満の容量である、マイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ）容量の密封可能な使い捨てウェルを備え、かつ透明なポリプロピレンで形成されており、光学的モニタリングを可能にする半透明のキャップを有する。伝統的にそれらはまた、単純であり、１０ｍｍ以下の間隔で中心に１２ｘ８の配列で９６個のこのような容器を受け入れる、長方形のホルダで使用されるために構築されている。

これらの典型的な既知の反応容器は、特にユーザーが生物学的に防護服を着用している場合でも、危険な病原体を使用した現場使用には好適でないため、彼は、反応容器を運んで少なくとも短い距離を移動している可能性があり、したがって妥協的な事件のリスクにさらされている可能性がある。追加的に、軍および応急処置を行う医療関係者など、この技術の対象ユーザーは、反応容器の生物学的安全性が最重要であるという絶対的な要件を伝えてきた。通常の実験室の状況において、エボラ出血熱などの、カテゴリー４の病原体の検査は、最初に静脈から採血することによって実行される。血液を包含している減圧式注射器は、その後、外部の任意のウイルスが確実に除染されるように、強力な漂白剤に浸され、高モル濃度（＞４）の塩化グアニジウムは、任意の存在するタンパク質を完全に変性させるように、血液自体に加えられ、このステップは、病原体を非感染性にする。

実験室、または訓練された要員を必要とせずに、現場内で使用されることができる、患者の血中のそのような病原体の分子検出のための方法があれば有利であろう。さらに、分子検査をはるかにより少量の患者血液から直接実行されることができれば、その後、検査を実行するそれらの潜在的な曝露は、大幅に減らされることができる。

したがって、当技術分野において、病原体の安全で、かつ信頼できる単純な検出を可能にする、方法およびキットを提供する必要がある。

本発明者らは、致命的である可能性のある試料などの試薬を、安全に保管、および取り扱うことができ、場合によっては、ＰＣＲ反応における直接使用に好適である、生物学的安全容器を提供した。

本発明者らはまた、全血などの、粗製試料中の病原体を検出するように、リアルタイムＰＣＲを安全に、首尾よく、かつ確実に実行する手段を発見した。さらに、本発明は、環境の態様（資源および貧弱な環境）が大きな課題を提供する、現場条件における検出が迅速に実行されるのを可能にする手段を含む。

この明細書は、改善された処理および方法、ならびに任意の（可視波長）励起および検出波長を使用する直接（逆転写）リアルタイムＰＣＲを可能にする、反応容器について記載し、したがって、同時にスクリーニングされることができる目標核酸である、目標の数を改善する。本明細書は、核酸抽出の実行に頼ることなく、単一の閉チューブ処理における粗製全血試料のように、粗製試料からウイルス性病原体の直接増幅を実行するのに必要な方法を含み、迅速で低コストの現場内診断を可能にする。記載されている反応容器は、現場における危険な病原体の識別に使用するのに特に適しており、全血などの、粗製試料が反応容器に直接追加され、したがってユーザーの生物学的安全性が、最優先される。

本出願人は、本明細書に記載の方法を使用することによって、粗製試料の量、例えば、反応に加えることができる、血液の量を大幅に増加させることが可能であることを発見した。全血の場合、この量は、３５％を超える。これは、診断感度を高めるという複合的な利点を有するが、反応の最終容積を最小限に抑えることもできるため、より迅速な熱サイクルが可能になり、ポイントオブケア現場の設定で重要な検出までの時間が短縮される。追加的に、総反応容積を減らし、それに比例して試薬のコストを削減することによって、検査あたりのコストを大幅に削減する。多数の血液感染性ウイルス感染は、ラッサ、ＣＣＨＦ、エボラなどを含む、遠隔地のリソース不足の環境で発見され、検出までの最短時間、使いやすさ、および検査あたりのコストがすべて重要である。ＷＨＯのＲ＆Ｄの青写真は、発展途上国の簡略化された分子診断が、３０００ビリオン／ｍｌの感度、および抗体ベースのアプローチと同等の検査あたりのコストを有するべきであると述べている。本発明は、これを達成し、感度を１０００ビリオン／ｍｌ未満に増加させ、側方流動免疫診断のそれよりもコストを削減する。記載された方法を使用するアッセイは、反応あたりわずか１５ビリオンを検出する可能性が示されているため、１５ｕｌの血液が追加されたと仮定すると、これが１０００ビリオン／ｍｌの最終感度になる。これは、６０％という、かなりの割合が、遠心分離のために失われても、ＷＨＯの目標を達成できることを意味する。

試料が血液試料である場合、本出願人らは、ｐＨおよび補助剤の存在などの変数に基づく、いくつかの試薬混合物が、血液に対してより変性する可能性があることを発見した。その結果は、ＷＯ２０１６１３９４４３に記載されている光学システム（全血の存在下における多重検出のための高出力レーザーベースの分光法ベースのアプローチを記載している）が、そのような状況において、その明細書（Ｋａｖｉｔ Ｓｈａｈ、Ｅｍｍａ Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ａｄａｍ Ｔｙｌｅｒ、Ｋｅｖｉｎ Ｓ Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｅｄ Ｗｒｉｇｈｔ、Ｌｉｎｄａ Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ、Ｄｉａｎｅ Ｌｅｅ、Ｃｌａｉｒｅ Ｃｌｅａｖｅｒ、Ｌｏｕｉｓｅ Ｕｓｈｅｒ、Ｊａｎｅ Ｅ Ｂｕｒｔｏｎ、Ｊａｍｅｓ Ｐｉｔｍａｎ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｂ Ｂｒｕｃｅ、Ｄａｖｉｄ Ｅｄｇｅ、Ｍａｒｔｉｎ Ｌｅｅ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｎａｚａｒｅｔｈ、Ｄａｖｉｄ Ａ Ｎｏｒｗｏｏｄ、Ｓｔｅｒｇｈｉｏｓ Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ Ｍｏｓｃｈｏｓ．Ｆｉｅｌｄ−ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ、Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｅｂｏｌａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ Ｂｌｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２０１７、ＤＯＩ、１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２８１Ａ）に記載されている最大１３％もの血中濃度のリアルタイムＰＣＲ信号を検出できなくなっていることである。この低下したパフォーマンスの理由は、より変性した試薬において、血液が赤い液体から変性タンパク質の「褐色」コロイド懸濁液に変わり、液体の不透明度が増加するためである。血液の割合が高くなると、暗褐色のコロイド懸濁液が形成され、光学データの収集が完全に防止される。本出願人らは、全血が４０％もの存在下で逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＱＰＣＲ）を実行することができる試薬を処方することができたが、光学データがもはや識別できないため、この処理は、実行不可能である。この懸濁液の形成を回避することが可能である場合、ウイルス性病原体を包含すると疑われる、より高い濃度の血液を添加することが可能であり、したがって、処理の感度を大幅に向上させることができる。

血漿および血清は、分子診断に日常的に使用される試料タイプであり、これらは両方とも、血液が血餅（血清）を形成した後、または凝固していない血液を使用した後、全血を遠心分離して赤血球を除去することによって形成される。遠心分離ステップが実行されると、２０００ｇが５〜１０分間日常的に使用されますが、全血においてなく、血漿または血清を試料として使用すると、診断感度が低下することがある。これは、病原体の一部が遠沈した細胞破片に包含されている可能性があるためであると理解されている。この実施例は、デング熱ウイルスを検出するための取り組みである（Ｋｌｕｎｇｔｈｏｎｇ Ｃ、Ｇｉｂｂｏｎｓ ＲＶ、Ｔｈａｉｓｏｍｂｏｏｎｓｕｋ Ｂ、他、「Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７、４５（８）、２４８０−５）。これは、血清または血漿が診断試料のタイプとして使用される場合を意味し、その後、赤血球、白血球、およびウイルス感染に起因する細胞性破片を含む、スピンダウンされる可能性のある、任意の他の成分を包含しなくなり、診断感度の低下の原因と考えられている。

したがって、全血を反応に加え、それでも血漿を反応容器内に形成される、閉チューブの直接ＲＴ−ＰＣＲ法は、最短時間で絶対最小相対遠心力を加えて遠心分離ステップを実行することによって、赤血球を光路から除去するが、質量が小さいために目標病原体、ならびに白血球および細胞破片が懸濁液中に取り残されたままになり、診断感度が最大になる利点がある。

第１の態様において、本発明は、
反応チャンバ部分と、
キャップが容器に係合されているとき、キャップと反応チャンバ部分との間に少なくとも２つのセキュリティポイントが存在するような方法で、キャップを取り付けるための手段を有するキャップホルダ部分と、
キャップと、を備える、容器を提供する。

一実施形態において、容器は、任意のタイプの容器であり得、任意のタイプの試料を包含するように作られ得る。例えば、容器は、液体、固体または気体を包含するのに好適あり得る。好ましい実施形態において、容器は、液体を包含するのに好適である。容器は、液体および固体の両方を包含するのに好適であり得、例えば、液体が引き続き加えられる、例えば、ＰＣＲ成分の凍結乾燥粉末を包含するのに好適であり得る。

一実施形態において、容器は、再利用可能な非使い捨て容器である。一実施形態において、容器が有害な病原体の検出に使用されるため、好ましい実施形態において、容器は、使い捨て容器である。例えば、一実施形態において、容器は、比較的安価な材料から作られる。別の実施形態において、容器は、破壊しやすい材料から作られ、例えば、材料は、潜在的に有害な病原体と共に焼却されることができる。

使い捨てとは、単回使用の意味を含む。例えば、一実施形態において、キャップが反応チャンバに取り付けられると、容器を破壊することなく取り外すことが不可能になる。別の実施形態において、キャップは、容器を破壊することなく、例えば、キャップ上に位置し得る、タブを持ち上げることによって、取り除かれることができる。単回使用とは、例えば、１つ以上の病原体を包含し得るため、単回使用後に処分されることを意図した、容器の意味を含む。

容器は、任意のタイプの好適な材料から作られ得、例えば、炭素充填ポリマーなどのポリマーから作られ得る。サーマルサイクラーが可能な、最大１１０℃の温度に耐えることが可能な射出成形可能な熱可塑性ポリマー、例えばポリプロピレンは、好適な材料であると考えられる。

容器が炭素充填ポリマーを含む場合、いくつかの実施形態において、炭素充填は、少なくとも３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％である。好ましい実施形態において、炭素充填は、６０重量％である。

好ましい実施形態において、反応チャンバは、ポリウレタンで形成され、少なくとも３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％の炭素の範囲の炭素で充填され得る。好ましい実施形態において、反応チャンバは、重量あたり６０％の炭素が充填されたポリウレタンで形成される。

一実施形態において、容器は、異なる材料を含み、例えば、キャップ部分は、反応容器部分とは異なる材料から作られ得る。

好ましい実施形態において、容器は、２ショット成形される。キャップホルダ部分は、光透過性の必要性、および断熱材として働くその能力のために、ポリプロピレンで作られ得る。一実施形態において、基部は、熱伝導性であるが、上部は、熱伝導性ではない。

一実施形態において、キャップホルダ部分および反応チャンバ部分は、単一実体であり、例えば、キャップホルダ部分は、反応チャンバ部分に形成されている。

一実施形態において、容器は、現場使用に好適である。現場使用とは、非標準実験室設定における使用の意味を含む。現場使用による一実施形態において、電気が制限されている、または電池のみで利用可能な環境における使用を意味する。同じ、もしくは異なる実施形態において、現場使用とは、臨床医、実験室の科学者、または容器を扱う他の人が、容器が使用される物質の性質に好適である安全装置を装備していない状況の意味を含む。例えば、いくつかの実施形態において、容器は、高病原性ウイルスおよび細菌を検出するために使用され、典型的には、対象からの試料、または環境試料を収容するために使用され、現場使用などの特定の状況において、容器を取り扱う人は、非常に基本的な安全装備のみが装備され得る。

一実施形態において、容器は、生物学的安全容器であると考えられる。当業者は、生物学的安全という用語が何を意味するかを理解するであろう。一実施形態において、生物学的安全手段は、容器内に包含される病原体のいずれも容器から逃れることができず、したがって、容器を取り扱う人が内部に包含されるいかなる病原体にも曝されることができないことを意味する。一実施形態において、生物学的安全容器は、ロックする蓋、またはキャップを有する。好ましくは、生物学的安全容器は、炭素充填ポリマーなどの、耐破砕性の材料で作られている。別の実施形態において、生物学的安全容器はまた、密封において２つのセキュリティポイントを有する。

好ましい一実施形態において、本発明の容器は、増幅反応、例えば、ＰＣＲ反応における使用に好適であり、任意選択的に逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにおける使用に好適であり、任意選択的に定量（ｑ）ＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲにおける使用に好適である。このような反応における使用に好適な容器は、典型的には、厚さがおよそ０．５〜０．８ｍｍの薄い壁を有し、炭素充填ポリマーで作られている。これは、１）熱の取得および損失をより速くすること、２）反応容器ホルダ／チューブ／液体内容物間の遅れを減少すること、の２つを行う。

当業者は、ｑＰＣＲが何を意味するかを理解するであろう。この場合、反応は、目標病原体がラッサなどの、高レベルの配列異質性を有する場合の、プライマーまたはプライマーのグループ、および目的の目標に特異的な配列であるプローブを包含する。これは、５´末端が蛍光体で標識され、３´が消光部分で標識されている加水分解プローブであることができ、増幅中にプローブは、酵素によって加水分解され、そのような蛍光は、サイクルごとに増加する。励起手段は、提供され、結果として生じる放射は、いくつかの実施形態において、キャップに位置している、容器の窓を通して捕捉される。

一実施形態において、本発明の容器は、病原体、特に重篤な疾患を引き起こす可能性があると考えられる、これらの病原体の識別に好適である。例えば、一実施形態において、この容器は、オランダ国立公衆衛生環境研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＲＩＶＭ）のレターレポート２０５０８４００２の生物学的薬剤分類（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ）のカテゴリー３ならびに４に分類される、病原体の封じ込めおよび識別に好適である。

一実施形態において、病原体が、
ａ）ウイルス、細菌、真菌、寄生虫からなる群、および／または
ｂ）クラス４もしくは３の病原体、および／または病原体であって、
ｃ）マラリア、ＨＩＶ、ウイルス性肝炎、土壌伝染性蠕虫寄生虫感染、
ｄ）エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルグウイルス病、リフトバレー熱、コンゴ熱からなる群から選択されるウイルス性出血熱、および／または
ｅ）日本脳炎、デング熱、ジカ、チクングニア熱、黄熱、
ｆ）ＰＰＲＶ、ＦＭＤＶ、ＢＴＶ、ニューカッスル病、豚インフルエンザ、ＢＶＤＶを含むが、これらに限定されない、ウイルス成分を有する獣医学的疾患、からなる群から選択される疾患を引き起こす、病原体から選択されるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、容器は、ｑＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲと共に使用され得、いくつかの実施形態において、容器は、ｑＰＣＲ／ＲＴ−ｑＰＣＲに関連する蛍光体（複数可）を励起することと、結果として生じる放射光を捕捉することの両方が可能である、窓を備える。

好ましくは、窓は、半透明の窓であり、容器内に位置している蛍光体の励起、および／または蛍光体からの放射の検出に好適である。

窓は、容器内の任意の場所、例えば、キャップ内、側面または基部に位置し得る。しかしながら、好ましくは、窓が容器のキャップ部分内に位置しているので、これは、より多様な試料のタイプがＲＴ−ＰＣＲで使用されることを可能にする。例えば、血液がＰＣＲ反応で試料として使用される場合、血液は、基部に定着するか、または意図的に基部にスピンダウンして（本発明の特定の実施形態に従って）、基部を介した結果として得られるＰＣＲ産物の検出を妨げる可能性がある。

包含された試料、例えば病原体が逃れるのを防ぐために、容器は、少なくとも２つのセキュリティポイントを備えていることが重要である。当業者は、ＰＣＲ反応で使用される標準的な容器が、単一のシールしか有さないことを理解するであろう。この場合、蓋がつぶれたり、または容器が落ちたりすると、その後、内容物が容器から逃れる可能性が高くなる。好ましい一実施形態において、本発明の容器の少なくとも２つのセキュリティポイントは、容器の内容物が、少なくとも２つのセキュリティポイントを迂回して、容器から逃げるために、内容物が、ａ）少なくとも２つのセキュリティポイントを通過し、ｂ）方向を複数回変更し、およびｃ）非常に小さなスペースを通って収まるようにしなければならないように配置される。この配置は、液体などの容器の内容物が容器から出ることを不可能にする。好ましい実施形態において、容器は、少なくとも２つのセキュリティポイント、例えば、押し付けられ、かつ機能的な、少なくとも２つのシールで保つ、ロック特徴も備える。

一実施形態において、セキュリティポイントは、例えば、キャップと容器との間の締まり嵌めの結果である。別の実施形態において、セキュリティポイントの一方または両方は、ガスケットであり、例えば、Ｏリングシールである。

一実施形態において、セキュリティポイントのうちの少なくとも１つは、キャップと容器との間のシール、例えばＯリングを備える。

さらなる実施形態において、セキュリティポイントの両方、または少なくとも２つは、シールを備え、例えば、キャップと容器との間のＯリングを備える。

別の実施形態において、シールのうちの少なくとも１つは、キャップホルダ部分の上部に位置している。

同じまたは異なる実施形態において、シールのうちの少なくとも１つは、キャップの基部に位置している。

さらに別の実施形態において、容器は、キャップと容器との間に少なくとも２つのシールを備え、シールのうちの１つは、キャップホルダ部分の上部に位置しており、かつシールのうちの１つは、キャップの基部に位置している。

Ｏリングシールなどのシールに加えて、容器は、複数の点で締まり嵌めを備え得る。

上で議論したように、有利な実施形態において、容器は、反応チャンバ部分からキャップの容易な、または偶発的な分離を防止するように設計されているロック手段を備える。

好適なロック手段は、当業者に知られているであろう。キャップのホルダへのロックは、キャップ上の翼部と、例えば翼部上の、好ましくはキャップとは異なるホルダ部分上の「傾斜路および段」との間の弾性手段によって達成され得る「クリップオーバー」装置を備え得る。

キャップが容器にしっかりと嵌めることは、重要であると考えられている。これを実現する一手段は、ねじ山アセンブリを使用することである。したがって、一実施形態において、キャップは、適切である相補的なねじ山を備え、キャップをキャップホルダ部分への取り付けを可能にする、キャップホルダ部分を有するねじ山を備える。いくつかの実施形態において、ねじ山アセンブリは、要所であり、シールを加圧するのに役立ち、したがって、ポリプロピレンなどの、非脆性材料で作られるべきである。

キャップ／容器アセンブリが、相補的ねじ山を備える場合、それは、使いやすく、かつキャップを容器へしっかりと取り付けるように、最小限の労力を必要とするように、配置されるべきであることが理解されよう。したがって、一実施形態において、キャップは、キャップホルダ部分へキャップをしっかりと取り付けるように、ねじ山を５回未満、任意選択的に４、３、２、または１回未満回転させる必要がある。

キャップを容器に締め付けすぎると、容器の構造に弱点が生じるおそれがある。したがって、一実施形態において、容器は、キャップの締め過ぎを防止するように配置されている停止部を備える。

一実施形態において、容器は、ラベルを取り付けるか、またはそこに書き込むための、任意選択的に識別子ラベルを取り付ける、または識別子を書き込むための、キャップホルダ部分上の翼部などのさらに有用な特徴を含む。

一実施形態において、容器は、遠心分離機に保持されるのに好適である。この実施形態において、容器は、以下に記載される本発明の方法における使用に好適である。したがって、いくつかの実施形態において、容器は、使用中に、遠心分離を介して加えられる重力に耐えることができる。当業者は、反応容器アセンブリにおける頑強性のためのこの必要性を理解し、それに応じて好適な材料を選択することができる。

窓が容器のキャップに組み込まれている場合、容器がキャップの加熱を可能にするように構成されていれば、例えば、ｑＰＣＲで使用した場合に、蛍光体の励起／放射を妨げる凝縮が形成されないことが有利であると考えられる。増幅中にキャップを加熱する一手段は、キャップを加熱された蓋に接触させることである。したがって、一実施形態において、容器のキャップは、ヒーターとの接触を可能にするように平坦である。

反応容器は、任意のサイズまたは容量であり得る。しかしながら、容器の容量は、典型的には、ＰＣＲ／増幅機械における使用に好適であり、典型的には、１０００ｕｌ未満の、または例えば９００ｕｌ、８００ｕｌ、７００ｕｌ、６００ｕｌ、５００ｕｌ、４００ｕｌ、３００ｕｌ、２５０ｕｌ、２００ｕｌ、１５０ｕｌ、１００ｕｌ、５０ｕｌ、または２０ｕｌ未満の容量を有する。好ましい実施形態において、容器は、およそ２００ｕｌ、または２００ｕｌの容量を有する。したがって、一実施形態において、容器は、マイクロタイター容量を有する。

いくつかの実施形態において、反応容器は、長さが３〜５ｃｍであり、容器が１つの翼部、または複数の翼部を備える場合、幅がおよそ３〜４ｃｍである。

いくつかの実施形態において、容器は、ＰＣＲ反応成分を含むか、または包含し、例えば、反応成分が凍結乾燥される場合、例えば、ポリメラーゼ、またはＰＣＲプライマーのうちの１つ以上を含むか、もしくは包含する。

別の態様において、本発明は、ＰＣＲ用、任意選択的にｑＰＣＲ用、任意選択的にＲＴ ｑＰＣＲ用の試料を調製するための方法を提供し、方法は、試料を容器で遠心分離することを含み、容器は、ＰＣＲが引き続き実行されるものと同じ容器である。

本発明の方法が本発明の容器内で実行される場合、当業者に明らかであるように、潜在的に致命的な内容物への曝露のリスクの低減などの、重要な利点がある。しかしながら、本発明の容器ではない、容器内で本発明の方法を実行することは、可能である。

一実施形態において、例えば、試料が容器に加えられると、ＰＣＲの前、または最中に容器から材料が除去されない場合、ＰＣＲが実行される前に試料の一部が容器から除去されないのが好ましい。同じ、または異なる実施形態において、ＰＣＲの完了後に試料の一部が容器から除去されないことも好ましく、例えば、いくつかの実施形態において、試料が容器に追加されると、
ａ）ＰＣＴの前、および／または
ｂ）ＰＣＲの最中、および／または
ｃ）ＰＣＲの後に、材料は容器から除去されない。
例えば、好ましい実施形態において、ＰＣＲ産物の検出は、容器を開けて物質を他の場所に移す必要なしに、容器内で実行される。
これらの実施形態において、容器の内容物への曝露のリスクは、低減される。

好ましい実施形態において、試料は、粗製試料である。粗製試料とは、試料の取得後に続いて、追加のステップが適用されていない、試料の意味を含む。例えば、粗製試料は、対象から採取された、任意選択的に、目、耳、鼻または口から採取された、綿棒からの全血試料、糞便、尿、ＣＳＦ、溶出物などの、粗製生物学的試料であり得る。粗製生物学的試料は、有機体から直接採取された任意の試料であると考えられる。粗製試料はまた、粗製環境試料であり得る。粗製環境試料とは、食品試料、表面からの綿棒、および有機体から直接採取されない、他の試料タイプ（この場合、粗製生物学的試料と考えられる）などの試料の意味を含む。

粗製試料はまた、例えば現場における獣医病原体を検出するために使用する場合など、例えばオペレータへの感染性が高くない、病原体のための、全血からの血漿および血清の調製、または綿棒の洗浄からの溶出物など、試料の取得に続いて最小限の処理ステップが適用された試料であり得る。

粗製試料は、典型的には、いくつかの実施形態において、蛍光体の励起および／または放射波長の捕捉を妨害すると考えられ得、好適である蛍光体の選択を妨害し得る、粒子状もしくは細胞性物質を含む。例えば、試料が血液である場合、蛍光体の選択は、本発明以前には限定されていた。遠心分離ステップを実行することによって、粗製試料、例えば血液は、光路から除去され、好適である光学システムが利用されている場合、より広い範囲の蛍光体を検出するように、それが可能になる。遠心分離なしでは、例えば、光学的消光は、信号の最大９０％であるため、フルオレセインなどの緑色色素を使用することが不可能である。遠心分離後の清澄化された最上層において、これは、３０％の領域に減少するため、現在の方法および容器を使用して、すべての波長色素によってリアルタイムＰＣＲが可能である。

試料が得られ、容器（本発明による容器であっても、なくてもよい）に直接加えられると、安全の観点から好ましいと考えられる。当業者は、当然のことながら、試料を取得した後、試料が、反応容器に加える前に、例えば低温で、一定期間保存され得ることを理解するであろう。

典型的には、上で議論したように、試料は、１つ以上の病原体を含み得、任意選択的に、例えば、１つ以上の細菌種、ウイルス、真菌、寄生虫を含み得る試料（粗製、またはその他）である。病原体の選好は、本発明の容器との関連で、上で記載されており、ここで適用される。

ウイルス性病原体などの病原体に感染した患者の粗製試料、例えば粗製全血試料は、血液の所与の容積で同一濃度のウイルスを有しない。これは、一部の疾患では、病原体、例えばウイルスが、試料中、例えば遊離血液中で遊離しているのではなく、細胞片と関連され得るためである。したがって、直接ＲＴ−ＰＣＲ法における最大可能容積の患者の血液を処理することには利点があり、存在する目標病原体の量を最大化することによってだけでなく、患者の血液内の病原体のランダムな分布の影響を最小化することができる効力によっても、より大きな試料は、代表的な力価を包含する見込みが高くなる。

一実施形態において、バックグラウンド蛍光がかなり上昇し、データの信号対雑音比が低下するため、２００ｕｌよりもより大容積で直接法を操作することは有利であるとは考えられず、さらに、病原体ＲＮＡ／ｕｌの実際の濃度は、より大容積の効力によって減少する。

本出願人は、ビリオンおよび白血球を上部溶液に残したまま、試料、例えば赤血球を反応容器の底部へ運ぶ処理が、処理、全血の存在によって引き起こされる酵素処理阻害の減少に、追加の利点を有することを発見した。試料のペレット、例えば赤血球は、ＰＣＲの熱変性ステップの下で、圧縮された塊としてそうすることで、「調理」し、全血懸濁液中に個々の遊離浮遊細胞の形で存在する場合と比較して、反応に放出される阻害化合物の量を減らす。

ＲＴもしくはＰＣＲの前または最中に試料を遠心分離することによって、試料は、両方の窓（励起／放射用）の邪魔にならないように引き出されると考えられ、かつ反応を阻害し得る、ＰＣＲ混合物中に成分を浸出することができる、試料の量を減らすと考えられる。例えば、加熱すると、血球は、阻害物質を放出すると考えられる。しかしながら、遠心分離に続いて、阻害物質を混合物中に放出すると考えられるのは、血球の最上層、すなわち、ＰＣＲ混合物と接触しているもののみである。したがって、遠心分離ステップは、ａ）もはや血液が励起／放射を阻害しないため、およびｂ）血液から放出される少量の阻害物質のため、使用される、反応量あたりの大量の試料、例えば、大量の血液が可能になる。

したがって、一実施形態において、試料は、ＰＣＲを阻害する、物質を含むか、または物質を放出し、例えば加熱すると物質を放出する。

粗製またはその他の、しかし特に粗製試料の試料は、増幅反応ではほとんど役に立たないと考えられる、特定の／細胞性物体の両方を含むと予想されるが、目標病原体、例えば細菌またはウイルスも含む。したがって、一実施形態において、遠心分離ステップは、病原体を上澄みに残しながら、特定の／細胞性材料をペレット化するような、速度および持続時間で実行される。当業者は、関連する成分のサイズ、重量および密度に基づいて、これらのパラメータを如何に選択するのかを理解するであろう。

したがって、いくつかの実施形態において、遠心分離は、上澄み中に試料の第２の画分を残しながら、試料の第１の画分をペレット化する結果となるような、速度、および持続時間で実行される。

白血球は、１．０８０ｇ／ｍｌの密度を有するが、赤血球は、１．１１０ｇ／ｍｌでより高密度であり、これは、それらの大きなサイズと組み合わせられて、それらが遠心分離下で白血球よりもさらに衰弱されることを確実にする。したがって、血液を包含する試料が遠心分離されると、低密度の白血球が、赤血球の層、これはバフィーコート層と呼ばれる、の上に静止することが十分に確立されている。多くのウイルス性病原体、例えば人間のチクングニア、および動物のＰＰＲＶは、実際には、それらの複製部位として宿主の白血球を使用する。これは、希釈血漿および（処理）抑制性赤血球を除去しながら、感染した白血球を包含しているので、一部のウイルスを検出するために、このバフィーコート層が実際に最適な試料タイプである、という事実によって証明されている。（Ｍａｄａｎｉ，Ｔ．Ａ．、Ａｂｕｅｌｚｅｉｎ，ＥＴ．Ｍ．Ｅ．、Ａｚｈａｒ，Ｅ．Ｉ．、他、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ、（２０１２）、１５７、８１９、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００７０５−０１２−１２３７−７）光学的および酵素的に阻害性の赤血球が、容器の基部に回転し得るが、それでもかなりの割合の白血球が血漿中に懸濁液中に取り残され得るため、チクングニア熱などの白血球内で複製が発生するウイルスの感度が最大になるように、本出願人らは、遠心分離ステップを実行するように、白血球が赤血球よりも密度が低いこと、ならびに、それらがウイルス目標（特定の病原体の場合）を包含することができることの、これら２つの事実を操作することが可能であることを、実証することができた（Ｗｉｋａｎ，Ｎｉｔｗａｒａ、ほか、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｆｅｖｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｖｅｒｉｔｉｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１２ ９６．１１ Ａｐｒ．２０１４，ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７９−５８７６−１２−９６）。

さらに、ビリオンは、赤または白血球のいずれかよりも密度が高く、１．２〜１．４ｇ／ｍｌの範囲であるが、重要なことに、それらは、赤および白血球のサイズの１０００分の１未満である。遠心力下での移動は、粒子の密度およびサイズという２つの主な要因によって左右され、粒子が小さいほど、重力によって密度勾配を下に移動するのに時間がかかる。これは、比較的低速での遠心分離が、白血球（低密度の効力によって）、およびビリオン（それらの小さいサイズの効力によって）を懸濁液中に取り残しながら、赤血球を衰弱できることを意味する。したがって、白血球は、閉チューブ反応容器に残っているので、赤血球の存在に起因する光学的阻害を除去し、酵素処理の阻害を低減すると同時に、血清または血漿を試料入力として使用した場合に失われる診断感度を最大化することが可能である。

したがって、本質的に、閉反応容器内で血漿を作り、次にその上で直接ＲＴ−ＱＰＣＲを実行する、この方法は、新興感染症の発生状況で必要な時点でウイルス感染の存在について患者を検査するための、閉チューブの抽出遊離方法を可能にする。

短時間３０秒間の回転で５００ｇの電界強度（ＲＣＦ）（ここで記載されるように、他のＲＣＦおよび期間も、もちろん許容可能である）は、実験的に検査され、白血球の大部分を懸濁液中に取り残しながら、赤血球を回転沈殿させるのに十分であることがわかった。本質的に、これは、光学的および酵素的阻害赤血球を除去するが、白血球および患者の血漿を増幅反応の本体に残す、血液からのウイルス性病原体の直接検出のための閉チューブ方法を提供する。分離は、遠心力場と時間の両方の関数であり、したがって、本明細書で記載されるように、白血球およびビリオンを懸濁液中に取り残しながら、いくつかの組み合わせが赤血球の必要な除去をもたらすことが想定される。

試料が全血である場合、第１の画分が、赤血球を含み、第２の画分が、試料中に存在する任意のウイルスまたは細菌などの任意の目標病原体とともに、白血球を含む場合に有用であると考えられる。これは、一部の病原体が、白血球を目標とすることが知られているためである。白血球は、増幅反応への阻害が少なく、上澄み中に存在する可能性があるとともに、それらが保有する可能性のある任意の潜在的な病原体とともに、増幅試薬にアクセスできるようにすることで反応の感度を改善すると考えられる。

いくつかの実施形態において、遠心分離は、血漿の形成をもたらすような、速度および持続時間で実行される。

ＰＣＲの前の遠心分離は、増幅試薬が反応容器の基部にあることを確認するためによく使用されるが、これは上で記載された以外の任意の技術的な理由で実行されない。ＰＣＲが完了した後に遠心分離ステップを必要とする、血液からの直接ＰＣＲをカバーする論文があるが、それは、透明な上澄みを電気泳動などの二次処理に移すことができるようにするためであり、例として、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｕｒｅｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキットのマニュアルでは、ＰＣＲ後に５分間の高ｒｃｆ遠心分離を推奨しているため、透明な上澄みをゲル上で泳動されることができる。血液からのリアルタイムＰＣＲに関しては、背景技術は、乏しい。本出願人らは、高濃度の血液でリアルタイムＰＣＲを実行するように、光学的アプローチを記載している（ＷＯ２０１６１３９４４３）。これにおいて、全血の存在が特定の波長で最大９０％の蛍光阻害をもたらすこと、およびこれが部分的に全血を包含する試料における直接リアルタイムＰＣＲの現場における発表の欠如を説明することを示すデータが提供される。病原体を検出する血液からの直接ＲＴ−ＰＣＲは、光学的阻害、処理阻害（ヘム、免疫グロブリン、ならびに血液中の過剰なカルシウム、ならびにその他のミネラルの存在から）、および病原体核酸を最初に増幅可能にする必要があるため、実行されない。本出願人らは、光学的問題、および全血試料に包含される病原体核酸を増幅可能にする方法の開発の両方を解決している（ＷＯ２０１１１５７９８９、Ｋａｖｉｔ Ｓｈａｈ、Ｅｍｍａ Ｂｅｎｔｌｅｙ、Ａｄａｍ Ｔｙｌｅｒ、Ｋｅｖｉｎ Ｓ Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｅｄ Ｗｒｉｇｈｔ、Ｌｉｎｄａ Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ、Ｄｉａｎｅ Ｌｅｅ、Ｃｌａｉｒｅ Ｃｌｅａｖｅｒ、Ｌｏｕｉｓｅ Ｕｓｈｅｒ、Ｊａｎｅ Ｅ Ｂｕｒｔｏｎ、Ｊａｍｅｓ Ｐｉｔｍａｎ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｂ Ｂｒｕｃｅ、Ｄａｖｉｄ Ｅｄｇｅ、Ｍａｒｔｉｎ Ｌｅｅ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｎａｚａｒｅｔｈ、Ｄａｖｉｄ Ａ Ｎｏｒｗｏｏｄ、Ｓｔｅｒｇｈｉｏｓ Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ Ｍｏｓｃｈｏｓ．Ｆｉｅｌｄ−ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ、Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｅｂｏｌａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＵｎｐＲＯＣＥＳＳＥＤ Ｂｌｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２０１７、ＤＯＩ、１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２８１Ａ）。

いくつかの実施形態において、例えば、試料が血液試料である場合、遠心分離は、１０００ｇ未満、任意選択的に１００ｇ〜１０００ｇ、２００ｇ〜９００ｇ、３００ｇ〜８００ｇ、４００ｇ〜７００ｇ、任意選択的に５００ｇ〜６００ｇで実行される。同じ、または異なる実施形態において、遠心分離は、６０秒未満、任意選択的に５〜６０秒、任意選択的に１０〜５５、１５〜５０、２０〜４５、２５〜４０、３０〜３５秒間実行され得る。好ましい実施形態において、例えば、試料が全血試料である場合、遠心分離は、５００ｇで３０秒間実行されている。相対遠心力が高すぎるか、もしくは長すぎる遠心分離は、赤血球の一部を溶解するか、または白血球もしくは目標病原体を懸濁液から引き上げるように、十分であるため、処理感度を低下することができる。５００ｇで３０秒間は、損傷することなく、赤血球を反応容器の基部に押しやると考えられている一方、目標病原体、例えば、質量がはるかに小さい目標ビリオンは、懸濁液中に残したままであり、したがって、直接ＲＴ−ＰＣＲ検出の影響を受けやすい。

同じ結果を得るように、相対遠心力、および／または時間の異なる組み合わせが適用されることができることが、当業者によって想定されることができる。しかしながら、本出願人らは、実験的に、５００ｇで３０秒間が、目標病原体を懸濁液中に取り残したまま、赤血球の分離が達成されることができる、最短時間（迅速な診断に不可欠）であり、したがってこの方法によってＲＴ−ＰＣＲベースの検出に服するべきであると判断する。

遠心分離は、試料、例えば、粗製試料、例えば、血液が容器に加えられてはいるが、混合処理の後、例えば、自動混合処理の後に実行することができる。

遠心分離ステップに続いて、オプションの凍結融解サイクルは、目標病原体を直接増幅可能にするように、実行され得る（ＥＰ２５８５５８１）。任意の別個の核酸抽出ステップを必要としない閉チューブ処理で、粗製試料から目的の目標的病原体に対してＲＴ−ＱＰＣＲを直接実行する。

いくつかの好ましい実施形態において、試料を加える前に、容器は、ＰＣＲ反応成分を含み得、任意選択的に、任意の１つ以上のポリメラーゼ、および／またはＰＣＲプライマーを含む。これは、試料が追加されるとすぐに容器が密閉されることができ、曝露のリスクを低減することを意味するので、有利であると考えられる。

現場内使用の場合、遠心分離、例えば５００ｇで３０秒間は、ＲＴおよび／またはＰＣＲ処理が始まる前に行うことが好ましく、これは、専門家でないオペレータのための最小限処理ステップに抑える。溶解後の回転、ＲＴ、または最初の数サイクルは、反応容器が装置から除去され、遠心機内に置かれるべきである、という欠点を有する。さらに、褐色のコロイド懸濁液が形成される状況において、この懸濁液は、それを容器の基部に回転させるのに必要なはるかに高い相対遠心力を有する。追加的に、赤血球が溶解するため、ＰＣＲ阻害剤の濃度がより高くなる。本出願人らは、褐色のコロイド懸濁液を回転沈殿するのに最適なＲＣＦが２０００ｇで３０秒間であり、処理開始前の回転よりも約１５００ｇ多いが、正しい時間を利用すれば任意の遠心力が好適であることを発見した。

したがって、一実施形態において、遠心分離は、ＲＴおよびＰＣＲの開始前に行われる。

他の実施形態において、遠心分離は、ＲＴおよび／またはＰＣＲの最中に行われており、任意選択的に、遠心分離が、
ａ）ＲＴステップの後（存在する場合）ではあるが、ＰＣＲの前に、または
ｂ）ＲＴの後、およびＰＣＲの１〜５サイクル後に行われる。

例えば、病原体がＲＮＡ目標核酸を含む特定の実施形態において、例えば、病原体がＲＮＡウイルスである場合、定量方法のために、ウイルスが溶解され、ウイルスＲＮＡゲノムから、より安定したｃＤＮＡが作成された後に遠心分離が行われることが好ましくあり得る。同様に、この逆転写ステップ、およびＰＣＲの最初の数サイクルの後に遠心分離を行うことができ、試料を遠心分離機に移す前に大量の安定したＤＮＡが作成されるという利点がある。

別の実施形態において、遠心分離は、ＰＣＲの開始前、およびＰＣＲの最中に行われる。

上で記載されたように、特に有利な実施形態において、方法は、本発明による容器内で行われる。

本発明はまた、試料が、上で記載されたように、本発明に従って調製される、ＲＴ、ＰＣＲ、またはＲＴ−ＰＣＲを実行する方法を提供する。ＰＣＲのタイプ、試料タイプ、およびその他のすべての特徴のための選好は、上で記載された通りである。

いくつかの実施形態において、ＰＣＲは、ｑＰＣＲであるか、またはＲＴ−ＰＣＲは、ＲＴ−ｑＰＣＲである。ｑＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲのいくつかの実施形態において、ｑＰＣＲに関連する蛍光体を励起するように使用されている励起波長は、６３０ｎｍ〜６４５ｎｍであり、任意選択的に６３３ｎｍ〜６４２ｎｍであり、および／または放射光は、６５０ｎｍ〜７５０ｎｍの波長で収集されている。当業者は、どの蛍光体がこれらのパラメータでの使用のために適切であるかを理解するであろう。一実施形態において、ＰＣＲは、４７５ｎｍおよび６３５ｎｍでのＬＥＤ励起、ならびに５２０〜５８０ｎｍおよび６６０〜７５０ｎｍの窓を有するデュアルバンドパスフィルタを使用する４００〜９００ｎｍでの放射の収集を伴う２色システムを使用する。

本発明はまた、試料が本発明に従って調製される、ＰＣＲを実行する閉チューブ法を提供する。この方法の特徴の選好は、上に記載されており、例えば、方法は、本発明による容器内で、例えば、上で定義されたような粗製試料上で実行され得る。

一実施形態において、閉チューブ法は、複数の液体移送ステップを除去し、分析を実行するのにかかる時間を短縮すると同時に、オペレータの病原体への曝露を低減する。一実施形態において、方法は、本質的に、閉チューブ内でプラズマを作り、その後、プラズマから直接増幅するための方法である。上で議論したように、このやり方は、核酸は試料から除去されず、すべての病原体、例えばビリオンまたは細菌が反応容器内にあり、溶解し、関連する核酸を増幅および続く検出に利用できるようにする。

本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、試料、例えば全血の粗製試料は、ＰＣＲ反応容積の少なくとも最大５重量％、任意選択的に、少なくとも６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、１６重量％、１７重量％、１８重量％、１９重量％、２０重量％、２１重量％、２２重量％、２３重量％、２４重量％、２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３１重量％、３２重量％、３３重量％、３４重量％または３５重量％以上の反応容積で構成し得る。一実施形態において、試料は、反応容積の１３重量％を構成する。

本発明はまた、例えば本発明の方法または容器のいずれかを使用することによる、病原体検出の方法を提供する。一実施形態において、方法は、増幅産物の存在の検出を含む。さらなる実施形態において、増幅産物の検出は、病原体の存在を示す。

本発明はまた、目標病原体に感染しているとして対象を診断するための方法を提供し、ここで、方法は、本発明の方法のいずれかを含む。

本発明はまた、感染について対象を治療する方法を提供し、ここで、対象は、本発明の方法のいずれかによって感染を有するとして診断されている。

当業者は、本発明の様々な態様が、キット、または部品のキットとして提供されるのに役立つことを理解するであろう。したがって、本発明は、本発明の任意の態様を実施するためのキットを提供する。例えば、一実施形態において、キットは、本発明による反応容器と、
ＰＣＲプライマー、
ポリメラーゼ、
再懸濁緩衝液、
陽性および／または陰性制御試料、
ピペット、のうちのいずれか１つ以上と、を備える。

本発明はまた、血液試料から直接病原体核酸を検出するための閉チューブリアルタイム増幅処理を提供し、
目的の病原体を包含すると疑われる特定容積の全血を、目的の目標のための試薬を包含する反応容器内に置くことと、
蓋を反応容器に密封することと、
実質的に光学的に透明な液体の層から赤血球を大部分分離するように、試料を回転することと、
溶液中に遊離ＲＮＡを提供するように、試料を溶解処理に供されることと、
試料で生成された任意の光を光学的に記録（観察）しながら、リアルタイム増幅を実行することと、を含む。

試料は、逆転写が行われる前、この時点で任意選択的に回転されることができ（まだそうでない場合）、欠点は、ＲＮＡが不安定であるが、より低い阻害剤濃度でＲＴが可能になる（赤血球が回転沈殿されているので）ことである。
好ましくは、ＰＣＲの２サイクルは、遠心分離の前に、二本鎖ＤＮＡを作成する第１のサイクル、およびＤＮＡ目標の量を２倍にする２番目が実行される。
必要な遠心分離の範囲は、１〜２０００ｇで３０秒〜１分であるが、ＲＴ−ＱＰＣＲを一時停止し、任意の時間／重力場の強度で回転させることが、この方法によって想定されている。（必要な時間および電界強度は、血液が変性され、したがって、この時点によって、より大容積を占めるゲルに変わるため、より高くなる）。
当該増幅の開始前に増幅反応の遠心分離、目的は、試料に包含される白血球および任意の病原体の大部分を懸濁液中に取り残したまま、赤血球を懸濁液から取り除くように、十分な遠心力で反応を回転させることである。
−これは、
周期的に凍結、および解凍すること、および／または試料を７０℃超過、好ましくは、これは９５℃で１秒間加熱すること、を含むことができる。このステップは、オプションの混合ステップを含むことができる（ＰＣＴＧＢ２０１８００００１１）。

本発明はまた、現場におけるヒトおよび動物からの鼻、眼、上咽頭、経口および類似の綿棒試料からのウイルス性病原体の検出のための方法を提供する。容器（例えば、本発明の容器）は、抽出緩衝液を包含するユーザーに提供され、これが提供されない場合、これは、任意選択的に追加されることができる。綿棒試料は、浸出したビリオンを綿棒に収集するために、患者から採取される。綿棒は、端部を壊す／切断することによって、反応容器内に直接追加される。綿が使用されているが、これは、ナイロンフロック綿棒であることが好ましい。綿棒は、ビリオンを溶解して、ウイルスを放出するように、７０〜８２℃の範囲の加熱ステップに供され、この動作は、緩衝液によって促進される。任意選択的に、容器内容物は、溶解されたビリオンの画分を増加するために、周期的に凍結／解凍されることができる。一実施形態において、抽出緩衝液は、実際には、増幅試薬、例えば、ｒｔ−ｑＰＣＲ混合物を含む。鼻の綿棒などの他の目標の場合、試料は、処理を阻害する可能性があるため、緩衝液が界面活性剤を包含するｐＨ安定化溶液である場合は、２ステップのアプローチが必要であり、ビリオンはこれに溶解され、その後、少量が最終検査を実行するための増幅試薬を包含する２番目の容器に移される。

本発明はまた、血液から直接のウイルス性病原体を検出する方法を提供する。
特定の試薬セットの血液は、変性して、濃い褐色のゼラチン状沈殿物を形成することができる。明らかに、これは、試料の光学的調査を妨害する。本出願人らは以前に、６００ｎｍを超える高出力遠赤色励起に基づく光学的検出手法、および多重検出が血液の存在下で実行されることができるような、分光法に基づく収集システムについて記載した。比較的低い相対遠心力、例えば１０ｇは、ＰＣＲの４５サイクルの過程で、上で記載された褐色の沈殿物が容器の基部に移動するように、反応に適用されることができる。これは、血液が邪魔にならないように回転すると、容器の上部で結果として透明な液体の中心にある効力によって、容器に調査するように、光学システムが水平に置かれることを可能にする。この処理を実行するためには、容器は、ＰＣＲの過程の最中に連続的に回転されなければならない。実際には、これは、ステッピングモーターに取り付けられたアーム上に容器ホルダを有することによって達成される。容器の重量は、釣り合いが取れており、容器は、継続的に回転して、１０〜５０ｇの範囲の重力場を生成して、これは、ＰＣＲのサイクル２１によって、沈殿物を容器の基部に確実に引き寄せることができ、正の予想される範囲は、２５〜３５サイクルであり、そのため、ＰＣＲが開始する前に、蛍光の安定したベースラインのために十分な時間である。

代替のアプローチは、処理が開始する前に、血液を容器の基部に引き寄せるように、小さな遠心分離機を使用する、検査がされているため、沈殿物は、容器の基部で自動的に形成される。このアプローチの利点は、反応中に溶解する赤血球の割合が大幅に減少するため、同時に放出される阻害剤のレベルが低くなることである。結果として、処理を阻害することなく、より多くの割合の血液が追加されることができ、回転させることなく、反応で許容される最大値は、１５％の血液であり、回転すると、これは、３５％にもなる。例えば、チクングニアなどの一部のウイルス性病原体では、より大容積の血液が追加されている場合でも、このアプローチによって実際に感度が低下され得ることに注意するべきである。その理由は、このウイルスが実際に白血球で複製し、これらは、赤血球で遠沈し、よってすべてのビリオンが溶解および増幅の影響を受けにくくなるためである。この分野において、実験室でより困難な血液試料を処理する必要をなくすために、試料入力として血漿または血清のいずれかを使用するのが一般的である。血清は、血液試料を室温で凝固させた後、血餅を容器の基部まで回転させることによって形成され、血漿は、試料を直接遠心分離することによって分離され、通常これは、２０００ｇで５分間行われる。血球は、容器の底部に回転され、その後、血清または血漿の上澄みは、核酸抽出に使用され、ウイルス性病原体の場合、これはＲＮＡ抽出になる。本出願人らは、上で記載された閉チューブ法が、事実上、血漿を作製し、続いてウイルス性病原体を直接増幅する、閉チューブの、組み合わせた方法であることを発見し、これは、核酸抽出のための必要性を完全に除去し、血漿または血清を作るのに固有であることが知られている、複数の液体取り扱いステップ、または力価損失のための必要性を除去する。

一実施形態において、本発明の方法は、以下のステップを含む。
１．配列特異的増幅反応の成分が以前に凍結乾燥されている反応容器を取る−これは、酵素、配列特異的プライマーとプローブ、および好適な緩衝液などのすべての成分を含む
２．乾燥した反応を特定容積の水で再懸濁する
３．血液試料を直接容器に加える
４．反応を、好ましくはボルテックスで混合する
５．反応容器上に蓋を密封する
６．反応容器を５００ｇ程度で３０秒間回転させる
７．反応容器を機器内に置く
８．ウイルスは、反応容器内で直接溶解および増幅され、これは、凍結融解処理を含むか、または試薬自体によって駆動される
９．正のリアルタイムＰＣＲによって、ウイルス性病原体配列の存在を特定する

本発明はまた、反応容積に基づいて光学位置を適合する方法を提供する。
記載された方法は、血液を容器の底に引き寄せ、したがって光学的調査のための透明層を残す。最小量（この場合は５０ｕｌ）と最大容積（この場合は２２〜２５０ｕｌ）との間のすべての可能な反応容積を網羅するために、透明層の容器内の物理的高さが最終反応容積に応じて変化することは明らかである。その結果、光学収集手段のメカニズムまたは自動再配置が提供される。これは、収集ファイバーが取り付けられることができる、トラックが固着された、ブラケットを備え、直線運動によって、必要に応じて高さが増減される。

本発明はまた、血液試料から直接病原体核酸を検出するための閉チューブリアルタイム増幅処理を提供し、
目的の病原体を包含すると疑われる特定容積の全血を、目的の目標のための試薬を包含する反応容器内に置くことと、
蓋を反応容器に密封することと、
実質的に光学的に透明な液体の層から赤血球を大部分分離するように、試料を回転することと、
溶液中に遊離ＲＮＡを提供するように、試料を溶解処理に供されることと、
試料で生成された任意の光を光学的に記録（観察）しながら、リアルタイム増幅を実行することと、を含む。

試料は、逆転写が行われる前、この時点で任意選択的に回転されることができ（まだそうでない場合）、欠点は、ＲＮＡが不安定であるが、より低い阻害剤濃度でＲＴが可能になる（赤血球が回転沈殿されているので）ことである。

好ましくは、ＰＣＲの２サイクルは、遠心分離の前に、二本鎖ＤＮＡを作成する第１のサイクル、およびＤＮＡ目標の量を２倍にする２番目が実行される。

必要な遠心分離の範囲は、１〜２０００ｇで３０秒〜１分であるが、ＲＴ−ＱＰＣＲを一時停止し、任意の時間／重力場の強度で回転させることが、この方法によって想定されている。
当該増幅の開始前に増幅反応の遠心分離、目的は、試料に包含される白血球および任意の病原体の大部分を懸濁液中に取り残したまま、赤血球を懸濁液から取り除くように、十分な遠心力で反応を回転させることである。
−これは、
ａ）周期的に凍結、および解凍すること、
ｂ）および／または試料を７０℃超過、好ましくは、これは９５℃で１秒間加熱することを含むことができる。
ｃ）このステップは、オプションの混合ステップを含むことができる（ＰＣＴＧＢ２０１８００００１１）。

本発明はまた、以下の番号が付けられた実施形態を提供する。

Ａ．全血試料から病原体核酸を検出するための閉チューブ処理であって、処理の前または最中の試料の遠心分離で構成される。
１．危険な病原体のリアルタイム識別で使用するための使い捨ての、現場使用する、生物学的安全反応容器であって、容器が、
炭素充填ポリマーで形成された反応チャンバ部分と、
その間に少なくとも２つの失敗点が存在するように、キャップを取り付けるための手段を有するキャップホルダ部分と、
半透明窓を有し、ホルダ部分に密封可能に取り付け可能なキャップと、を備える。
２．「少なくとも２つの失敗点」が、キャップと容器との間に少なくとも２つの連続するシールを備える、実施形態１に記載の反応容器。
３．少なくとも２つの連続する密封手段が、一方がホルダの上部に、他方がキャップの基部に位置している、実施形態２に記載の反応容器。
４．シールが、Ｏリングシールを備える、実施形態２または３に記載の反応容器。
５．協働傾斜路、およびキャップ閉じて固定するように構成された段手段を備えるロックデバイスを組み込んでいるため、ユーザーが指だけを使用してキャップをロック解除するのがかなり困難になる、実施形態１〜４に記載の反応容器。
６．キャップホルダ部分が、ポリプロピレンで形成され、反応チャンバ部分に形成されている、実施形態１〜５に記載の反応容器。
７．ホルダおよびキャップは、一方を他方に取り付けることを可能にするねじ山配置を有する、実施形態１〜６に記載の反応容器。
８．ねじ山が、キャップホルダ部分へのキャップの３回以下の回転を必要とする、実施形態６に記載の反応容器。
９．キャップの締め過ぎを防止するように配置されている停止部を備える、実施形態１〜８に記載の反応容器。
１０．識別コードが、そこに付着、またはそれに刻印するためのキャップホルダ部分上に翼部を有する、実施形態１〜９に記載の反応容器。
１１．遠心分離機に保持されるように構築されている、実施形態１〜１０に記載の反応容器。
１２．キャップの加熱を可能にするように構成されている、実施形態１〜１１に記載の反応容器。
１３．反応チャンバが、マイクロタイター容量のものである、実施形態１〜１２に記載の反応容器。
１４．反応チャンバ部分の炭充填量が、６０重量％程度のものである、実施形態１〜１３に記載の反応容器。
１５．反応チャンバが、６０重量％の炭素が充填されたポリウレタンから形成されている、実施形態１４に記載の反応容器。
１６．密封容器の全体の寸法が、長さが３〜５ｃｍであり、１つの翼部、または複数の翼部を有し、幅が３〜４ｃｍである、実施形態１〜１５に記載の反応容器。

本明細書で明らかに先に公表された文献のリストまたは議論は、その文献が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものと必ずしも解釈されるべきではない。

本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータのための選好および選択肢は、特に文脈に示されない限り、本発明のすべての他の態様、特徴、およびパラメータにおける任意のおよびすべての選好および選択肢と組み合わせて開示されているよう見なされるべきである。例えば、本発明は、ＲＴ−ｑＰＣＲのために血液試料を調製する方法を提供し、この方法は、ＲＴステップの後に試料を遠心分離することを含む。本発明はまた、ＰＣＲ用の糞便試料を調製する方法を提供し、この方法は、ＲＴ−ＰＣＲの前に試料を遠心分離することを含む。本発明はまた、対象をクラス４病原体に感染していると診断する方法を提供し、この方法は、対象から採取され、本発明の容器に直接加えられる血液試料を遠心分離することを含む。

反応容器アセンブリの側面図である。 反応容器アセンブリの等角側面図である。 反応容器アセンブリの平面図である。 反応容器アセンブリの等角断面図である。 本発明による容器のさらなる画像。 本発明による容器のさらなる画像。 回転なしのＰＣＲ前後の標準ＱＰＣＲ試薬Ａ）ＱＰＣＲの前に１５％の反応で追加された血液を示し、Ｂ）ＱＰＣＲの後、反応がますます不透明になっている。回転されていない、試料からのデータを図８に示し、リアルタイムＰＣＲがこの血液の割合では確実に実行できないことを示す。 ＱＰＣＲの前後に回転した標準ＱＰＣＲ試薬標準試薬を使用した場合に、ＱＰＣＲの前（Ａ）および後（Ｂ）に１５％で追加された血液を示す。この場合、試料は、ｑＰＣＲの前に回転されている。回転された、試料からのデータを図８に示し、リアルタイムＰＣＲがこの血液の割合で確実に実行できるようになる。 レーンＡおよびＢは、１５％の全血での１０６ｂｐエボラアンプリコンのＲＴ−ＰＣＲであり、回転あり（Ａ）および無し（Ｂ）である。レーンＣおよびＤは、同じやり方で処理された２２％の全血での同じＲＴ−ＰＣＲである。レーンＥおよびＦは、ＲＴ−ＰＣＲの前に回転された、３２％の全血の複製である。レーンＧは、ＲＴ−ＰＣＲの前に回転されていない、同一の反応である。レーンＨは、５０ｂｐラダーである。回転することは、回転が反応を実行するが、回転されないことが失敗する、３２％の血液で抑制を減らした。また、ウイルスおよび白血球が懸濁液中に残っているので、回転から生じる結果となる感度の低下に注意されたい。 エボラゲノムから１０６ｂｐのアンプリコンを検出する２２％の全血でのＲＴ−ＱＰＣＲ。Ａ）反応前に５００ｇで３０秒間回転された、２つの複製を示し、Ｂ）回転されていない、２つの複製を示す。複数のサイクルのオフセット、一部は溶解した赤血球からの阻害によるものであるが、大部分は光信号の９０％の減少によるものである。以前のゲルは、ＲＴ−ＰＣＲの結果が類似していることを示すが、Ｑ−ＰＣＲが、溶解した赤血球の割合が高いために、光学的阻害および増加した阻害のために、実行できないことを示す。

実施例１
以下は、本発明の方法を実行する例示的な一方法を提供する。
１．ユーザーは、目的の目標のための凍結乾燥試薬を包含する反応容器が提供され、反応容器またはそのための蓋のいずれかに光学窓がある。
２．ユーザーは、供給された再懸濁緩衝液で凍結乾燥試薬を再懸濁する
３．ユーザーは、特定容積の全血を追加する（例えば、全反応容積１００ｕｌに２０ｕｌ）
４．蓋は、反応容器の上に戻され、不可逆的に密閉される
５．いくつかの標的病原体がペレットに除去されたとしても、反応に必要な阻害剤の量を最小限に抑えるために、試料は、この時点で任意選択的に遠心分離されることができる。この段階での遠心分離は、所望の分離を達成するように、３０秒間５００ｇ程度の遠心力を必要とする。
６．試料は、溶解処理を受ける。これは、
ａ）周期的に凍結、および解凍すること、
ｂ）および／または試料を７０℃超過、好ましくは、これは９５℃で１秒間加熱すること、を含むことができる。
ｃ）このステップは、オプションの混合ステップを含むことができる（ＰＣＴＧＢ２０１８００００１１）。
７．この時点で、ウイルス性病原体は、溶解され、溶液中に遊離ＲＮＡが存在する。
８．試料は、逆転写が行われる前、この時点で任意選択的に回転されることができ（まだそうでない場合）、欠点は、ＲＮＡが不安定である（よりも？）が、より低い阻害剤濃度でＲＴが可能になる（赤血球が回転沈殿されているので）ことである。
９．好ましくは、ＰＣＲの２サイクルは、遠心分離の前に、二本鎖ＤＮＡを作成する第１のサイクル、およびＤＮＡ目標の量を２倍にする２番目が実行される。
１０．必要な遠心分離の範囲は、１〜２０００ｇで３０秒〜１分であるが、ＲＴ−ＱＰＣＲを一時停止し、任意の時間／重力場の強度で回転させることが、この方法によって想定されている。

実施例２
図１〜図４は、例えば、粗製試料から直接の、検出処理であり、閉チューブの一部として、本発明の方法と組み合わせて使用されることができる、本発明の例示的な容器を示す。容器の生物学的安全性を確保するために、Ｏリングで密封されたねじキャップ付きの蓋が特徴である。これは、２ショット射出成形処理によって形成されており、それによって、主壁が、炭素充填ポリプロピレン（５０〜６０％）から形成され、副壁が、片側に透明なポリプロピレン窓を包含する。この透明な窓および容器の上部は、第１のショットであり、炭素充填ポリマーは、第２のショットである。

１＝炭素充填ポリマーで作られた反応容器チャンバ（２が１の上部にオーバーモールドされていることに注意されたい）
２＝ねじ山特徴および第２の０リングの位置決め手段（１０）、保持および書き込みのための平らな面（４）、およびロック特徴の下部（５）を包含する第２のショット射出
３＝透明な熱可塑性プラスチックから一部として成形された、持ちやすいキャップセクションは、窓（７）およびロック特徴の上部部分（６）を包含する
４＝手袋をはめた手で容器を保持して、バーコードを運ぶ／書けるようにするための平らな「あなたがそれを呼んだと私は信じる翼部」
５＝ロック特徴の下部
６＝ロック特徴の上部
７＝光学読み取り値を取得するための透明な／研磨窓セクション
８＝第２のショット（２）の射出成形ねじ山
９＝ねじ山の上部のキャップの内側に入る、より小さなＯリング／ガスケット
１０＝部品２上のねじ山（８）の基部に置かれた、より大きなガスケット

キャップは、ゴム製Ｏリングが置かれた、別個の単発アイテムである。

図５は、以下の番号が付けられた特徴を有する、本発明による容器の同じ、または代替の実施形態のさらなる画像を示す。

図中に示された反応容器は、反応チャンバ部分１０、キャップホルダ部分２０およびキャップ３０を備えている。

反応チャンバ部分１０は、マイクロタイター容量のテーパー付きシリンダー１０ａ、およびキャップホルダ部分２０が成形される、マンドレル１０ｂを備えている。反応チャンバ部分１０は、炭素充填ポリウレタンで形成されている。

キャップホルダ部分２０は、直円柱カラー部分２１、およびロック／停止翼部２２で形成されたキャップ取り付け部分、ラベル翼部２３、およびねじ山付きマニホールド２４を備えている。マニホールド２４は、キャップ３０を３回巻いて同じに固定するように配置されている。

ロック／停止翼部２２は、傾斜路２５、それに続く落下段２６、および停止部２７を有する。

キャップホルダ部分２０は、ポリウレタンで形成されており、反応チャンバ部分１０よりも熱伝導性が低く、後者からの熱損失を制限する。
キャップ３０は、ロック翼部３２および内部補強３３を有する、刻み付きの内部ねじ付き本体３１を備える。キャップ３０の屋根には、窓３４がある。ロック翼部３２は、段３６を有する傾斜路３５がその上に形成されている。傾斜路３５および段３６は、ロック／停止翼部２２上の傾斜路２５および落下段２６と協働するように構成されている。ロック翼部３２はさらに、段３６が落下段２６に当接したときに、停止部２７に当接するように配置された縁部３７を有する。キャップ３０はまた、ポリウレタンで形成されている。

Ｏリングシール３８および３９は、キャップホルダ部分２０の上端およびマニホールドの下端で、それぞれキャップホルダ部分２０とキャップ３０との間をシールするために、提供されている。

反応容器は製造され、したがって反応チャンバ部分１０は、射出成形される。その後、キャップホルダ部分２０は、マンドレル部分１０ｂ上に成形される。適切であるＯリングシール３６は、キャップ３０に嵌められ、シール３９は、ねじ山の基部でキャップホルダ２０に嵌め込まれる。

使用中、反応容器は、好適なホルダに立てられて、保持される。試料および試薬は、反応容器に充填される。その後、キャップ３０は、停止部２６および３６が係合し、縁部３７が停止部２７に当接するまで、ホルダにねじ込まれる。その後、容器および内容物は、指定された処理において、さらなる段階のために準備される。

要所となる特徴
光学的および熱的使用のために２ショットが要求
別個のねじ蓋−生物学的安全特徴
２つのＯリング−生物学的安全特徴
蓋のクリックシール−セルフロック式の蓋閉鎖は、締めすぎを防止し、蓋が正しく装着されている／密閉されていることをユーザーに視覚的に示ように、停止する。−物学的安全特徴
蓋の上部にある透明な光学窓−光学的調査に最適
病原体の放出を防止するための複数の失敗点−６気圧で検査された容器−生物学的安全特徴
炭素含浸ポリプロピレン壁−高熱伝導率
容積５０〜２２０ｕｌ
平らな光学表示窓−改善された光学系
蓋が装着されている間、チューブをホルダに保持する回転防止特徴−生物学的安全特徴
容器は手渡されるので、器具に正しい方法でのみ配置されることができる−実用的
透明な蓋を単純に成形することによる上部光学部品のオプション（蓋金型の研磨部分）。−改善された光学部品
チューブ患者ＩＤ表記オプションのタブ。−試料ＩＤ
全高３５ｍｍ（蓋が装着されている）最も広い点（提案されたＩＤタブの後ろからロック特徴の前まで）３３ｍｍ、および中央領域の最大直径１４．７ｍｍ。−コンパクトな容器

実施例３
図６および図７は、１５％の全血試料を有するＰＣＲ反応を包含するチューブを示す。試料が遠心分離されている場合、上澄みが一連の蛍光体の検出にはるかに好適であることがはっきりとわかる。

図８は、試料が異なる量の血液を含み、試料が遠心分離されているか、またはされていない、一連の試料のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。

図９は、エボラゲノムから１０６ｂｐのアンプリコンを検出するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示し、これは、試料が遠心分離されている場合には、ｑＰＣＲが実行されることができるが、試料が遠心分離されていない場合には、実行されることができないことを示す。

Claims (58)

1. 容器であって、
   反応チャンバ部分と、
   前記キャップが前記容器に係合されているときに、前記キャップと前記反応チャンバ部分との間に少なくとも２つのセキュリティポイントが存在するような方法で、キャップを取り付けるための手段を有するキャップホルダ部分と、
   キャップと、を備える、容器。
2. 前記容器が、使い捨て容器である、請求項１に記載の容器。
3. 前記容器が、現場使用に好適である、請求項１または２に記載の容器。
4. 前記容器が、生物学的安全容器である、請求項１〜３のいずれかに記載の容器。
5. 前記容器が、ＰＣＲ反応における使用に好適であり、リアルタイムＰＣＲにおける使用に任意選択的に好適である、請求項１〜４のいずれかに記載の容器。
6. 前記ＰＣＲが、病原体の識別のためであり、
   任意選択的に、病原体が、
   ａ）ウイルス、細菌、真菌、寄生虫からなる群、および／または
   ｂ）クラス４もしくは３の病原体、および／または病原体であって、
   ｃ）マラリア、ＨＩＶ、ウイルス性肝炎、土壌伝染性蠕虫寄生虫感染、
   ｄ）エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルグウイルス病、リフトバレー熱、コンゴ熱からなる群から選択されるウイルス性出血熱、および／または
   ｅ）日本脳炎、デング熱、ジカ、チクングニア熱、黄熱、
   ｆ）ＰＰＲＶ、ＦＭＤＶ、ＢＴＶ、ニューカッスル病、豚インフルエンザ、ＢＶＤＶを含むが、これらに限定されない、ウイルス成分を有する獣医学的疾患、からなる群から選択される疾患を引き起こす、病原体から選択される、請求項５に記載の容器。
7. 前記反応チャンバが、炭素充填ポリマーから形成されており、ポリプロピレンから任意選択的に形成されている、最大１１０℃の温度に耐えることができる、ポリマーから任意選択的に形成されている、請求項１〜６のいずれかに記載の容器。
8. 前記容器が、窓、任意選択的に半透明の窓を備え、任意選択的に、前記半透明の窓が、前記容器内に位置している蛍光体の励起、および／または蛍光体からの放射の検出に好適である、請求項１〜７のいずれかに記載の容器。
9. 前記窓が、前記容器の前記キャップ部分内に位置している、請求項８に記載の容器。
10. 前記セキュリティポイントのうちの少なくとも１つが、前記キャップと前記容器との間のシールを備える、請求項１〜９のいずれかに記載の反応容器。
11. 前記セキュリティポイントのうちの少なくとも２つが、前記キャップと前記容器との間のシールを備える、請求項１〜９のいずれかに記載の反応容器。
12. 前記シールのうちの少なくとも１つが、前記キャップホルダ部分の上部に位置している、請求項１０または１１に記載の反応容器。
13. 前記シールのうちの少なくとも１つが、前記キャップの基部に位置している、請求項１０〜１２のいずれかに記載の反応容器。
14. 前記容器が、前記キャップと前記容器との間に少なくとも２つのシールを備えており、前記シールのうちの１つが、前記キャップホルダ部分の上部に位置しており、かつ前記シールのうちの１つが、前記キャップの基部に位置している、請求項１０〜１３のいずれかに記載の反応容器。
15. 少なくとも２つのシールのうちの一方または両方が、
    ａ）締まり嵌め、および／または
    ｂ）ガスケット、任意選択的にＯリングシール、を備える、請求項１０〜１４のいずれかに記載の反応容器。
16. 前記容器が、前記反応チャンバ部分から前記キャップの容易な、または偶発的な分離を防止するように設計されているロック手段を備える、請求項１〜１５のいずれかに記載の反応容器。
17. 前記ロック手段が、協働傾斜路、および段を備える、請求項１６に記載の反応容器。
18. 前記キャップホルダ部分および前記反応チャンバ部分が、単一実体であり、任意選択的に、前記キャップホルダ部分が、前記反応チャンバ部分に形成されている、請求項１〜１７のいずれかに記載の反応容器。
19. 前記キャップホルダ部分が、ポリプロピレンで形成されている、請求項１〜１８のいずれかに記載の反応容器。
20. 前記キャップホルダ部分および前記キャップが、前記キャップホルダ部分への前記キャップの取り付けを可能にする相補的ねじ山を備える、請求項１〜１９のいずれかに記載の反応容器。
21. 前記キャップが、前記キャップホルダ部分へ前記キャップをしっかりと取り付けるように、前記ねじ山を５回未満、任意選択的に４、３、２、または１回未満回転させる必要がある、請求項２０に記載の反応容器。
22. 前記容器が、前記キャップの締め過ぎを防止するように配置されている停止部を備える、請求項２０または２１に記載の反応容器。
23. 前記容器が、そこにラベルを取り付けるか、または刻印するため、任意選択的に、識別子ラベルを取り付けるか、または識別子を刻印するために、前記キャップホルダ部分上に翼部を備える、請求項２０〜２２のいずれかに記載の反応容器。
24. 前記容器が、遠心分離機に保持されるのに好適である、請求項１〜２６のいずれかに記載の容器。
25. 前記容器が、前記キャップの加熱を可能にするように構成されている、請求項１〜２４のいずれかに記載の容器。
26. 前記反応チャンバが、マイクロタイター容量のものであり、任意選択的に１０００ｕｌ未満の、任意選択的に９００ｕｌ、８００ｕｌ、７００ｕｌ、６００ｕｌ、５００ｕｌ、４００ｕｌ、３００ｕｌ、２５０ｕｌ、２００ｕｌ、１５０ｕｌ、１００ｕｌ、５０ｕｌ、または２０ｕｌ未満の容量を有し、前記容器が、約２００ｕｌ容積である、請求項１〜２５のいずれかに記載の容器。
27. 前記反応チャンバ部分が、炭素充填ポリマーで形成されており、かつ前記炭素充填が、少なくとも３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％である、請求項１〜２６のいずれかに記載の反応容器。
28. 前記反応チャンバが、ポリウレタンで形成されており、任意選択的に少なくとも３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％の炭素で充填されたポリウレタンで形成されている、請求項１〜２７のいずれかに記載の容器。
29. 前記容器が、長さが３〜５ｃｍであり、前記容器が、１つの翼部、または複数の翼部を備え、幅がおよそ３〜４ｃｍである、請求項１〜２８のいずれかに記載の反応容器。
30. 逆転写（ＲＴ）、ＰＣＲ、またはＲＴ−ＰＣＲのための、任意選択的にｑＰＣＲのための、任意選択的にＲＴ ｑＰＣＲのための試料を調製するための方法であって、前記方法が、閉容器内で前記試料を遠心分離することを含み、前記容器が、前記ＰＣＲが引き続き実行されるものと同じ容器である、方法。
31. 前記試料のいかなる部分も、
    ａ）ＰＣＲが実行される前、および／または
    ｂ）ＰＣＲが実行された後、前記容器から除去されず、
    任意選択的に、前記試料が前記容器に追加されると、材料が、
    ａ）ＰＣＴの前、および／または
    ｂ）ＰＣＲの最中、および／または
    ｃ）ＰＣＲの後、前記容器から除去されない、請求項３０に記載の方法。
32. 前記試料が、粗製試料である、請求項３０または３１に記載の方法。
33. 前記試料が、粗製生物学的試料、または粗製環境試料である、請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法。
34. 前記試料が、
    ａ）綿棒、および／または
    ｂ）綿棒の洗浄から採取された溶出物である、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
35. 前記試料が、１つ以上の病原体を含み得る、任意選択的に、
    ａ）ウイルス、細菌、真菌からなる群、および／または
    ｂ）クラス４もしくは３の病原体、および／または
    病原体であって、
    ｃ）エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルグウイルス病、リフトバレー熱、コンゴ熱、および黄熱からなる群から選択されるウイルス性出血熱、ならびに／または
    ｄ）日本脳炎、デング熱、ジカ、チクングニアからなる群から選択される疾患を引き起こす、病原体から選択される病原体を含み得る、試料である、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
36. 前記試料が、粒子状または細胞性物体を含む、請求項３０〜３５のいずれかに記載の方法。
37. 前記試料が、ＰＣＲを阻害する、物質を含むか、または物質を放出し、任意選択的に、加熱するとＰＣＲを阻害する、物質を放出する、請求項３０〜３６のいずれかに記載の方法。
38. 前記試料が、対象から採取された、任意選択的に、目、耳、鼻、または口から採取された、綿棒からの血液、糞便、尿、血漿、血清、ＣＳＦ、溶出物を含む群から選択される、請求項３０〜３７のいずれかに記載の方法。
39. 前記遠心分離が、上澄み中に前記試料の第２の画分を残しながら、前記試料の第１の画分をペレット化する結果となるような、速度、および持続時間で実行されている、請求項３０〜３７のいずれかに記載の方法。
40. 前記試料が血液である場合、前記第１の画分が、赤血球を含み、前記第２の画分が、白血球および前記試料中に存在する任意のウイルスまたは細菌を含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記遠心分離が、１０００ｇ未満、任意選択的に２００ｇ〜１０００ｇ、３００ｇ〜９００ｇ、４００ｇ〜８００ｇ、５００ｇ〜７００ｇ、任意選択的に６００ｇで実行されており、かつ前記遠心分離が、６０秒未満、任意選択的に５〜６０秒、任意選択的に１０〜５５、１５〜５０、２０〜４５、２５〜４０、３０〜３５秒間実行されており、
    任意選択的に、前記遠心分離が、５００ｇで３０秒間実行されている、請求項３０〜４０のいずれかに記載の方法。
42. 前記容器が、ＰＣＲ反応成分を含み、任意選択的に、ポリメラーゼ、および／またはＰＣＲプライマーの任意の１つ以上を含み、任意選択的に、前記試薬が、凍結乾燥されている、請求項３０〜４１のいずれかに記載の方法。
43. 前記遠心分離が、ＲＴおよびＰＣＲの開始前に行われる、請求項３０〜４２のいずれかに記載の方法。
44. 前記遠心分離が、ＲＴおよび／またはＰＣＲの最中に行われており、任意選択的に、前記遠心分離が、
    ａ）前記ＲＴステップの後（存在する場合）ではあるが、ＰＣＲの前に、または
    ｂ）ＲＴの後、およびＰＣＲの１〜５サイクル後に行われる、請求項３０〜４１のいずれかに記載の方法。
45. 前記遠心分離が、ＰＣＲの開始前、およびＰＣＲの最中に行われる、請求項３０〜４４のいずれかに記載の方法。
46. 前記方法が、請求項１〜２９のいずれかに定義されているような容器内で実行される、請求項３９〜４５のいずれかに記載の方法。
47. ＲＴ、ＰＣＲ、またはＲＴ−ＰＣＲを実行する方法であって、前記試料が、請求項３０〜４６のいずれかに従って調製される、方法。
48. 前記ＰＣＲが、ｑＰＣＲであるか、または前記ＲＴ−ＰＣＲが、ＲＴ−ｑＰＣＲであり、任意選択的に、前記ｑＰＣＲに関連する前記蛍光体を励起するように使用されている励起波長が、６３０ｎｍ〜６４５ｎｍであり、任意選択的に６３３ｎｍ〜６４２ｎｍであり、および／または放射光が、６５０ｎｍ〜７５０ｎｍの波長で収集されている、請求項４７に記載の方法。
49. 前記蛍光体が、およそ４７５ｎｍおよび／または６３５ｎｍの波長で励起されており、および／または前記放射光が、およそ５２０〜５０ｎｍおよび６６０〜７５０ｎｍの波長で収集されている、請求項４７および４８のいずれかに記載の方法。
50. ＰＣＲを実行する閉チューブ法であって、前記試料が、請求項３０〜４６のいずれかに従って調製されており、任意選択的に、前記ＰＣＲ産物の存在が、前記容器から任意の材料を除去することなく検出されている、方法。
51. 前記容器が、請求項１〜２９のいずれかに定義されているような容器である、請求項５０に記載の方法。
52. 前記試料が、前記ＰＣＲ反応容積の少なくとも５％、任意選択的に少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％または３５％以上を含み、任意選択的に、前記反応容積の１３％を含む、請求項４７〜５１のいずれかに記載の方法。
53. 病原体を検出するための方法であって、前記方法が、請求項３０〜５２のいずれかに記載の方法を含む、方法。
54. 前記方法が、増幅産物の存在の検出を含む、請求項５３に記載の方法。
55. 前記増幅産物の検出が、前記病原体の存在を示す、請求項５４に記載の方法。
56. 対象が目標病原体に感染していると診断するための方法であって、前記方法が、請求項３０〜５５のいずれかに記載の方法を含む、方法。
57. 前記容器が、ＰＣＲ反応成分を含み、任意選択的に、ポリメラーゼ、またはＰＣＲプライマーのうちの任意の１つ以上を含み、任意選択的に、前記反応成分が、凍結乾燥されている、請求項１〜２９のいずれかに記載の容器。
58. キットであって、請求項１〜２９または５３のいずれかに記載の容器と、
    ＰＣＲプライマー、
    ポリメラーゼ、
    再懸濁緩衝液、
    陽性、および／または陰性制御試料、
    ピペット、のうちのいずれか１つ以上と、を備える、キット。

Images