JP2021519923A - 糖タンパク質のための分析方法 - Google Patents

Abstract

質量単離デバイスが、プロテアーゼを使用して消化されたサンプルの前駆イオンを選択する。第１の断片化デバイスが、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して前駆イオンを断片化し、結果として生じる生成イオンが、質量分析器を使用して分析され、ＣＩＤスペクトルを生成する。理論的候補糖ペプチド配列のリストが、ＣＩＤスペクトルから決定される。質量単離デバイスは、サンプルの前駆イオンを再び選択する。第２の断片化デバイスが、電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して前駆イオンを断片化し、結果として生じる生成イオンが、質量分析器を使用して分析され、ＣＩＤスペクトルを生成する。リストの配列毎に、配列は、計算的に断片化され、理論的断片を生成し、質量対電荷比（ｍ／ｚ）値が、理論的断片に関して計算され、配列は、ｃおよびｚ断片合致ルールを使用してスコア化される。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、その内容が参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、２０１８年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６５０，２７９号の利益を主張する。

本明細書の教示は、タンデム質量分析計を動作させ、サンプル内の糖タンパク質を識別することに関する。より具体的には、システムおよび方法が、タンデム質量分析計を動作させ、電子ベースの解離（ＥｘＤ）および衝突誘発解離（ＣＩＤ）の両方を実施し、これら２つの技法のデータを組み合わせ、サンプル内の１つ以上の糖タンパク質を識別するために提供される。

本明細書のシステムおよび方法は、プロセッサ、コントローラ、または図１のコンピュータシステム等のコンピュータシステムと併せて実施されることができる。

グリカン、糖タンパク質、および糖ペプチド
一般に、グリカンは、いくつかの単純な糖または単糖から成る分子である、多糖である。糖または単糖は、炭水化物の基本構成単位である。グリコシル化として公知である生物学的プロセスでは、グリカン、またはより具体的には、多糖残留物が、生体内でタンパク質に追加される。そのようなプロセスは、一般的に翻訳後修飾（ＰＴＭ）と称される。換言すると、タンパク質が、細胞内で翻訳または作成された後にグリカンを含むように修飾される。ＰＴＭに起因するタンパク質は、糖タンパク質と称される。消化等のプロセスに起因する糖タンパク質のサブユニットまたは断片は、糖ペプチドと称される。

グリコシル化は、細胞伝達を含む、多くの方法で細胞によって使用される。癌等の多くの疾患プロセスでは、異常なグリコシル化が生じることが公知である。結果として、あるタンパク質の異常なグリコシル化の識別が、これらの疾患プロセスを診断するために使用されることができる。

しかしながら、残念なことに、体内で生成される任意の糖タンパク質の識別は、異なるグリカンの非常に多くの可能性として考えられる組み合わせによって混同される。ヒトの場合、少なくとも３００個の異なる共通グリカンが、報告されている。しかしながら、可能性として考えられる異なるグリカンの数は、共通グリカンへの糖のさらなる付着が総数を何倍にも増大させるという事実に起因して、実際に何倍も大きい。

グライコプロテオミック質量分析
糖タンパク質の研究または識別は、グライコプロテオミクスと称されることができる。タンデム質量分析は、プロテオミクスにおいてその実績がある、グライコプロテオミクスで使用するための一般的ツールである。質量分析（ＭＳ）または質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ）（本明細書ではタンデム質量分析とも称される）が、サンプル内の糖タンパク質を識別するために使用されることができる。

典型的ＭＳまたはタンデム質量分析グライコプロテオミック実験では、１つ以上の糖タンパク質を含むサンプルが、最初にトリプシン等の酵素によって消化される。結果として、糖タンパク質の消化されたペプチドのうちのいくつかは、グリカンを付着させる。付着したグリカンを有する、これらのペプチドは、グリコシル化ペプチドまたは糖ペプチドと称される。各糖ペプチドは、ペプチド部分である、アミノ酸の配列と、少なくとも１つのグリカン構造と、少なくとも１つのグリカン構造が付着されるペプチド上の修飾部位とを含む。ＭＳまたはタンデム質量分析が、次いで、ペプチド配列、グリカン構造、および修飾部位を識別するために使用される。
断片化を通したペプチド識別

タンデム質量分析は、イオンの断片化または解離を含意する。タンデム質量分析では、第１の質量分析ステップは、前駆イオンと呼ばれるイオンの選択であり、第２の質量分析ステップは、１つ以上の生成イオンへのその前駆イオンの断片化または解離である。

タンデム質量分析計システムは、断片化を通してペプチドを識別することに有用である。ペプチドは、分子の一方の端部上に位置するアミノ基と、他方の端部上に位置するカルボン酸とを有する、アミノ酸の配列である、分子である。タンデム質量分析計システム内で断片化プロセスを受けたとき、ペプチド鎖が、それらのペプチド結合において開裂され、原ペプチドの個々の断片を形成することができる。種々のタイプの断片化プロセスが、起こり得、最も一般的なものは、分子がガスと衝突する、タンデム質量分析計において一般的な衝突誘起解離（ＣＩＤ）である。とりわけ、電子捕捉解離（ＥＣＤ）および電子伝達解離（ＥＴＤ）等の他のタイプの解離プロセスも、公知である。

結果として生じる断片または生成イオンは、断片が含むアミノ酸単位（すなわち、残基）の数とともに、原ペプチドのアミノまたは酸性端（それぞれ、Ｎ末端およびＣ末端と称される）のいずれかを参照して、標識されることができる。

「ｂイオン」として公知のペプチド断片は、Ｎ末端を伴う断片である。下付き文字は、断片内に含まれる原ペプチドからのアミノ酸残基の数を表す。したがって、ｂ_４イオンは、原ペプチドのＮ末端から４つのアミノ酸残基を含有する、ペプチドの断片イオン（前駆イオン）である。同様に、「ｙイオン」は、Ｃ末端を伴う断片であり、類似性を計数される。

断片はまた、ｂイオンに関連するが、わずかに異なる場所で開裂を指定する、イオンおよびｃイオンであるものとして定義されることもできる。Ａイオンが、Ｃ＝Ｏを差し引いたｂイオンである一方で、Ｃイオンは、Ｎ−Ｈ基を加えたｂイオンである。同様に、ｚイオンが、Ｎ−Ｈ基を差し引いたｙイオンである一方で、ｘイオンは、Ｃ＝Ｏを加えたｙイオンである。

断片または生成イオンの質量は、部分的に、断片を構成する個別のアミノ酸の残留質量を合計することによって決定されることができる。したがって、解離を受けたペプチドの質量スペクトルは、ペプチドの全体的アミノ酸配列を決定するために使用され得る情報を含有する。

グリコシル化タイプ
多くの場合、出現する、２つのタイプのグリコシル化が、存在する。これらは、Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化である。Ｎグリカンが、コンセンサス配列、すなわち、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンを伴ってアスパラギン残基（Ｎ）上に付着され、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり得る。Ｏグリカンが、セリン残基（Ｓ）またはトレオニン残基（Ｔ）上に付着される。Ｏ−グリコシル化のための付加的コンセンサス配列が、存在しないため、単一残基ＳおよびＴコンセンサス配列が、本願ではＯ−グリコシル化のためのコンセンサス配列と称される。

解離技法
電子ベースの解離（ＥｘＤ）および衝突誘起解離（ＣＩＤ）が、多くの場合、タンデム質量分析糖ペプチド分析のための解離技法として使用される。ＥｘＤは、限定ではないが、ＥＣＤ（電子捕捉解離）またはＥＴＤ（電子伝達解離）を含むことができる。ＣＩＤは、質量分析計における解離のための最も従来的な技法である。ＥｘＤおよびＣＩＤは、糖ペプチド分析のための補完的技法である。ＥｘＤは、ペプチド骨格を優先的に解離するため、ペプチド配列を分析するための理想的なツールである。ＣＩＤは、他方では、グリカンを優先的に解離するため、グリカン構造を分析するための有用なツールである。

ＣＩＤを使用するグリカン分析は、ＣＩＤベースのＭＳ器具が、極めて一般的であり、本タイプの分析に長期間使用されてきたため、当業者に周知である。ペプチド骨格分析は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計におけるＥＣＤ、イオントラップにおけるＥＣＤ、およびＥＴＤ、ならびに他のデバイスを使用して、実証された。しかしながら、ＥｘＤは、一般に、以下の困難に起因して、質量分析の十分に追求された分野ではない。

例えば、ＥＣＤオプションを伴うＦＴ−ＩＣＲ質量分析計は、器具が、過剰に大きく、過剰に高価であり、動作させることが困難であるため、業界で広く使用されていない。同様に、ＥＴＤデバイスは、ペプチド骨格を開裂することが可能であり得るが、解離効率が低すぎるため、高スループットＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施することができない。加えて、イオントラップにおけるＥＣＤに関して、高解離効率が、数ｅＶ〜１０ｅＶの電子運動エネルギーが印加された、高温ＥＣＤを使用して実証された。

しかしながら、近年、無傷グリカンを伴う糖ペプチドへの高スループット高温ＥＣＤ分析が、７ｅＶの電子エネルギーを用いてＳｃｉｅｘによって開発されたキメラＥＣＤデバイスを使用して実証された。本デバイスは、同時係属米国公開特許出願第２０１６／０１２６０７６号（参照することによって本明細書に組み込まれる）に説明されている。

グリカンデータベース合致問題
従来、タンデム質量分析タンパク質識別実験は、サンプルの少なくとも１つのタンパク質をペプチドに消化すること、見出されるペプチドのそれぞれを断片化すること、およびペプチド毎に生成イオンスペクトルを生成することを伴った。見出されるペプチドの生成イオンスペクトルは、次いで、タンパク質を識別するように、タンパク質データベースと比較される。

残念ながら、上記に説明されるように、本識別の方法は、多数の可能性として考えられる異なる糖タンパク質に起因して、糖タンパク質に適用されることができない。換言すると、困難は、過剰に多く（ほぼ無限数）の異なる可能性として考えられるグリカン構造が存在するという事実に由来する。ＭＡＳＣＯＴ等の従来のデータベース検索プログラムでは、検索フィールド（またはペプチド配列を調査することの候補）もしくは計算時間が、分析スペクトルの前駆体質量情報を使用して低減される。本方法は、リン酸化またはメチル化等の仮定されるＰＴＭが単純である場合に、うまく機能する。そのような可能性として考えられる修飾の付加的な質量が、ゲノムによって与えられる候補ペプチドのリスト全体から候補ペプチド配列を選択する前に、可能性として考えられる修飾部位において数学的に付着される。残念ながら、本方法は、単に過剰に多くの候補修飾が存在するため、グリコシル化を取り扱おうとするときに困難に遭遇する。上記に説明されるように、ヒトの場合、３００個の共通グリカンが、報告されるが、実際の数は、共通グリカン上の糖のさらなる付着に起因して、ほぼ無限により大きい。

別個のＣＩＤまたはＥｘＤ解離
本困難への１つのアプローチは、質量分析の前にグリカンを削減することである。グリカンは、酵素を使用して削減される。Ｎ−グリコシル化の場合、全てのグリカンが、多くの場合、酵素（ペプチド−ＮグリコシダーゼＦ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）または（ペプチド−ＮグリコシダーゼＡ、ＰＮＧａｓｅ Ａ）によって除去される。これらの酵素を使用して、修飾アスパラギンが、アスパラギン酸塩に変換されるため、本変化は、ＣＩＤベースの質量分析によって検出されることができる。修飾部位が、決定されることができる。しかしながら、グリカン情報が、失われる。

Ｏグリカンの場合、全てのグリカンが、酵素によって除去される場合、いずれのグリコシル化の痕跡も、修飾ＳおよびＴ残基上に残留しない。これは、修飾部位の情報およびグリカンの両方が失われることを意味する。結果として、ＣＩＤは、単独でＯグリカン分析のために使用されない。

対照的に、ＥｘＤは、ペプチド骨格に効果を発し、Ｏグリカンは、解離が適用された後に骨格上に付着されたままである。しかしながら、適用され得る唯一のタイプの従来のデータベース検索は、ＭＵＣコア１（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ）、コア２（ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）、コア３（ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ）、およびコア４（ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃＧｌｃＮＡｃ）等のグリカンが非常に単純であり、ＧａｌＮＡｃがペプチドに結合されることを仮定するものである。残念ながら、本方法は、多くのタイプのＯグリカンを網羅しないため、あまり有用ではない。

複合ＣＩＤおよびＥｘＤ解離
グリカンデータベース合致問題を解決することへの１つのアプローチが、同一のサンプルに２つ以上の異なる解離技法を実施し、結果を組み合わせて、糖タンパク質を決定するように実施されてきた。例えば、Ｍａｙａｍｐｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓａｍｐｌｅｓ」（Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２０１４， ８６，４５３−４６３）と題された、その論文（以降では「Ｍａｙａｍｐｕｒａｔｈ論文」で、糖タンパク質識別が、同一の前駆イオンのＥＴＤ／ＣＩＤスペクトルを組み合わせることによって改良されたことを説明した。Ｍａｙａｍｐｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．はまた、ＣＩＤ、ＥＴＣ、および高エネルギーＣトラップ解離（ＨＣＤ）からのデータまたはスコアが、糖ペプチドを識別するように組み合わせられる、方法も説明する。Ｍａｙａｍｐｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．は、糖ペプチド候補を、それぞれ、ＣＩＤ、ＥＴＣ、およびＨＣＤスペクトルにマップすることから、別個のＣＩＤ、ＥＴＣ、およびＨＣＤスコアを計算する。糖ペプチド候補は、グリカンリストからの各Ｎグリカンを、インシリコトリプシン消化物から取得されるシークオンを含有するペプチドに付着させることによって、構築される。換言すると、本技法は、依然として、そのグリカンリスト内のグリカンの数によって限定される。

２つ以上のタンデム質量分析補完的解離技法を組み合わせることが、糖タンパク質または糖ペプチド識別への可能性として考えられる解決策であると考えられるが、グリカンデータベース合致問題に完全に対処する、２つ以上のタンデム質量分析補完的解離技法からのデータを組み合わせるための方法は、現在、存在していない。

その結果として、２つ以上のタンデム質量分析補完的解離技法を実施し、それらのデータを組み合わせて、サンプル内の１つ以上の糖タンパク質を識別することが可能なタンデム質量分析計を制御する、または動作させるためのシステムおよび方法の必要性が存在する。

タンデム質量分析背景
一般に、タンデム質量分析またはＭＳ／ＭＳは、化合物を分析するための周知の技法である。タンデム質量分析は、サンプルからの１つ以上の化合物のイオン化、１つ以上の化合物の１つ以上の前駆イオンの選択、断片または生成イオンへの１つ以上の前駆イオンの断片化、および生成イオンの質量分析を伴う。

タンデム質量分析は、定性的および定量的情報の両方を提供することができる。生成イオンスペクトルは、着目分子を識別するために使用されることができる。１つ以上の生成イオンの強度が、サンプルに存在する化合物の量を定量化するために使用されることができる。

ＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ背景
質量分析（ＭＳ）（または質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ））と液体クロマトグラフィ（ＬＣ）の組み合わせは、混合物内の化合物の識別および定量化のための重要な分析ツールである。概して、液体クロマトグラフィでは、分析下の流体サンプルが、（典型的には、小型固体粒子、例えば、シリカの形態の）固体吸着材料で充填されるカラムを通して通過される。固体吸着材料（典型的には、固定相と称される）との混合物の成分のわずかに異なる相互作用に起因して、異なる成分が、充塞カラムを通して異なる通過（溶出）時間を有し、種々の成分の分離をもたらし得る。ＬＣ−ＭＳでは、ＬＣカラムから退出する流出物が、溶出または残留時間の関数として、検出されるイオン強度（検出されたイオンの数、合計イオン強度、もしくは１つ以上の特定の被分析物の測定値）を描写し得る、抽出されるイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）またはＬＣピークを発生させるように、質量分光分析を連続的に受け得る。

ある場合には、ＬＣ流出物は、ＸＩＣ内のピークに対応する生成イオンの識別のために、タンデム質量分析（または質量分析／質量分析ＭＳ／ＭＳ）を受け得る。例えば、前駆イオンが、質量分析の後続の段階を受けるように、それらの質量／電荷比に基づいて選択されることができる。選択された前駆イオンは、次いで、（例えば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ）を介して）断片化されることができ、断片化されたイオン（生成イオン）は、質量分析の後続の段階を介して分析されることができる。

タンデム質量分析入手方法
多数の異なるタイプの実験入手方法またはワークフローが、タンデム質量分析計を使用して実施されることができる。これらのワークフローの３つの広義のカテゴリは、標的化入手、情報依存性入手（ＩＤＡ）またはデータ依存性入手（ＤＤＡ）、およびデータ非依存性入手（ＤＩＡ）である。

標的化入手方法では、生成イオンへの前駆イオンの１つ以上の遷移が、着目化合物に関して事前定義または把握される。サンプルが、タンデム質量分析計の中に導入されるにつれて、１つ以上の遷移は、複数の時間周期またはサイクルのうちの各時間周期またはサイクルの間に調査される。換言すると、質量分析計は、各遷移の前駆イオンを選択および断片化し、遷移の生成イオンに関して標的化質量分析を実施する。結果として、強度（生成イオン強度）が、遷移毎に生成される。標的化入手方法は、限定ではないが、多重反応監視（ＭＲＭ）および選択反応監視（ＳＲＭ）を含む。

ＩＤＡ方法では、ユーザが、サンプルがタンデム質量分析計の中に導入されている間に、生成イオンの非標的化質量分析を実施するための基準を規定することができる。例えば、ＩＤＡ方法では、前駆イオンまたは質量分析（ＭＳ）調査走査が、前駆イオンピークリストを発生させるように実施される。ユーザは、ピークリスト上の前駆イオンのサブセットに関してピークリストをフィルタ処理するための基準を選択することができる。ＭＳ／ＭＳが、次いで、前駆イオンのサブセットのうちの各前駆イオンに実施される。生成イオンスペクトルが、前駆イオン毎に生成される。ＭＳ／ＭＳは、サンプルがタンデム質量分析計の中に導入されるにつれて、前駆イオンのサブセットのうちの前駆イオンに繰り返し実施されることができる。

しかしながら、プロテオミクスおよび多くの他のサンプルタイプでは、化合物の複雑性およびダイナミックレンジは、非常に大きい。これは、従来的な標的化およびＩＤＡ方法に課題をもたらし、広範囲の被分析物の識別および定量化の両方を行うためにサンプルを深く調査するように、超高速ＭＳ／ＭＳ入手を要求する。

結果として、タンデム質量分析の第３の広義のカテゴリである、ＤＩＡ方法が、開発された。これらのＤＩＡ方法は、複雑なサンプルからのデータ収集の再現性および包括性を増加させるために使用されてきた。ＤＩＡ方法はまた、非特異的断片化方法と呼ばれることもできる。従来的なＤＩＡ方法では、タンデム質量分析計のアクションは、前駆または生成イオン走査で入手されるデータに基づいて、ＭＳ／ＭＳ走査の中でも変動されない。代わりに、前駆イオン質量範囲が、選択される。前駆イオン質量選択窓が、次いで、前駆イオン質量範囲を横断して段階的である。前駆イオン質量選択窓内の全ての前駆イオンが、断片化され、前駆イオン質量選択窓内の前駆イオンの全ての生成イオンの全てが、質量分析される。

システム、方法、およびコンピュータプログラム製品が、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するために開示される。タンデム質量分析計は、質量単離デバイスと、第１の断片化デバイスと、第２の断片化デバイスと、質量分析器とを含む。３つ全ての実施形態は、以下のステップを含む。

タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の質量単離デバイスが、プロセッサを使用して、第１のイオンビームから少なくとも１つの前駆イオンを選択するように命令される。第１のイオンビームは、プロテアーゼを使用して消化されたサンプルを受容およびイオン化するように適合される、イオン源デバイスによって生成される。衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように適合される、ＭＳ／ＭＳの第１の断片化デバイスが、プロセッサを使用して、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように命令される。ＭＳ／ＭＳの質量分析器が、プロセッサを使用して、複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第１のＣＩＤスペクトルを生成するように命令される。グリコシル化され得る、１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストが、プロセッサを使用して、第１のＣＩＤスペクトルから決定される。

質量単離デバイスは、プロセッサを使用して、サンプルからイオン源デバイスによって生成される第２のイオンビームから、少なくとも１つの前駆イオンを再び選択するように命令される。電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して、第２のイオンビームから選択された前駆イオンを断片化するように適合される、ＭＳ／ＭＳの第２の断片化デバイスが、プロセッサを使用して、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＥｘＤ生成イオンを生成するように命令される。質量分析器は、プロセッサを使用して、複数のＥｘＤ生成イオンを質量分析し、ＥｘＤスペクトルを生成するように命令される。

リストの候補配列毎に、配列は、ｃおよびｚ断片ルール（またはＥｘＤ断片化ルール）を使用して、計算的に断片化され、複数の理論的断片を生成し、質量対電荷比（ｍ／ｚ）値が、複数の理論的断片に関して計算され、理論的ｍ／ｚ値およびＥｘＤスペクトルが、比較される。ＥｘＤスペクトルと配列候補との間の尤度が、プロセッサを使用して、スコア化される。配列は、
（ａ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、配列のスコアを増分するステップと、
（ｂ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｃ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｄ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分するステップと、
によって、スコア化される。

最高スコアを伴うリストの候補配列が、プロセッサを使用して、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列として識別される。

出願者の教示のこれらおよび他の特徴が、本明細書に記載される。

当業者は、下記に説明される図面が例証目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、いかようにも本教示の範囲を限定することを意図していない。

図１は、本教示の実施形態が実装され得る、コンピュータシステムを図示するブロック図である。

図２は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、衝突誘発解離（ＣＩＤ）および電子ベースの解離（ＥｘＤ）の両方を使用して糖タンパク質識別を実施し、これら２つの補完的解離技法を使用することから取得されるデータを組み合わせるための方法を示す、例示的フローチャートである。

図３は、種々の実施形態による、単純糖タンパク質フェチュインが図２の方法のＣＩＤ分析部分を通して処理される様子の実施例を示す、例示的フローチャートである。

図４は、種々の実施形態による、単純糖タンパク質フェチュインが図２の方法のＥｘＤ分析部分を通して処理される様子の実施例を示す、例示的フローチャートである。

図５は、種々の実施形態による、フェチュインの糖ペプチドの溶出から得られた質量分析測定の例示的集合である。

図６は、種々の実施形態による、候補ペプチド配列の理論的ｃおよびｚ生成イオンｍ／ｚ値へのＥｘＤ生成イオンスペクトルの生成イオンの測定されたｍ／ｚ値の比較を示す、例示的略図である。

図７は、種々の実施形態による、図２の方法を使用して、単純糖タンパク質フェチュインの糖ペプチドのペプチド部分の配列の正当性が立証される様子、糖ペプチドのペプチド部分の実際の修飾部位が識別される様子、および糖ペプチドのグリカン部分の構造が決定される様子の実施例を示す、例示的フローチャートである。

図８は、種々の実施形態による、ＰＴＭ質量を含み得る候補ペプチド配列の理論的ｃおよびｚ生成イオンｍ／ｚ値へのＥｘＤ生成イオンスペクトルの生成イオンの測定されたｍ／ｚ値の比較を示す、例示的略図である。

図９は、種々の実施形態による、ＣＩＤおよびＥｘＤ分析が、単一の質量分析実験で実施される、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャートである。

図１０は、種々の実施形態による、ＣＩＤおよびＥｘＤ分析が、別個の質量分析実験で実施され、前駆イオンのＥｘＤ分析が、ＣＩＤ分析においてグリカン断片を見出すことに基づく、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャートである。

図１１は、種々の実施形態による、ＣＩＤおよびＥｘＤ分析が、別個の質量分析実験で実施され、ＥｘＤ分析がさらに、ＥｘＤ分析の前にグリコシル化濃縮方法を含む、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャートである。

図１２は、種々の実施形態による、第１のＣＩＤ分析、ＥｘＤ分析、および第２のＣＩＤ分析が、別個の質量分析実験で実施され、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析がさらに、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析の前にグリコシル化濃縮方法を含む、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャートである。

図１３は、種々の実施形態による、第１のＣＩＤ分析が、第１の質量分析実験で実施され、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析が、第２の質量分析実験でともに実施され、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析がさらに、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析の前にグリコシル化濃縮方法を含む、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャートである。

図１４は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するためのシステムの例示的概略図である。

図１５は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法である。

図１６は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法を実施する、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを含むシステムの概略図である。

本教示の１つ以上の実施形態が、詳細に説明される前に、当業者は、本教示が、それらの用途において、以下の詳細な説明に記載される、または図面に図示される、構造の詳細、構成要素の配列、およびステップの配列に限定されないことを理解するであろう。また、本明細書で使用される表現法および用語は、説明の目的のためであり、限定的と見なされるべきではないことを理解されたい。

コンピュータ実装システム
図１は、本教示の実施形態が実装され得る、コンピュータシステム１００を図示するブロック図である。コンピュータシステム１００は、情報を通信するためのバス１０２または他の通信機構と、情報を処理するためのバス１０２と結合されるプロセッサ１０４とを含む。コンピュータシステム１００はまた、プロセッサ１０４によって実行されるべき命令を記憶するために、バス１０２に結合されるランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他の動的記憶デバイスであり得る、メモリ１０６も含む。メモリ１０６はまた、プロセッサ１０４によって実行されるべき命令の実行の間にテンポラリ変数または他の中間情報を記憶するために使用されてもよい。コンピュータシステム１００はさらに、プロセッサ１０４のための静的情報および命令を記憶するためのバス１０２に結合される読取専用メモリ（ＲＯＭ）１０８または他の静的記憶デバイスを含む。磁気ディスクまたは光ディスク等の記憶デバイス１１０が、情報および命令を記憶するために提供され、バス１０２に結合される。

コンピュータシステム１００は、情報をコンピュータユーザに表示するために、バス１０２を介して陰極線管（ＣＲＴ）または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のディスプレイ１１２に結合されてもよい。英数字または他のキーを含む、入力デバイス１１４が、情報およびコマンド選択をプロセッサ１０４に通信するためにバス１０２に結合される。別のタイプのユーザ入力デバイスは、方向情報およびコマンド選択をプロセッサ１０４に通信するため、かつディスプレイ１１２上のカーソル移動を制御するためのマウス、トラックボール、またはカーソル方向キー等のカーソル制御１１６である。本入力デバイスは、典型的には、本デバイスが平面内の位置を規定することを可能にする、２つの軸、すなわち、第１の軸（すなわち、ｘ）および第２の軸（すなわち、ｙ）において２つの自由度を有する。

コンピュータシステム１００は、本教示を実施することができる。本教示のある実装と一致して、結果が、プロセッサ１０４がメモリ１０６内に含有される１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行することに応答して、コンピュータシステム１００によって提供される。そのような命令は、記憶デバイス１１０等の別のコンピュータ可読媒体からメモリ１０６に読み込まれてもよい。メモリ１０６内に含有される命令のシーケンスの実行は、プロセッサ１０４に、本明細書に説明されるプロセスを実施させる。代替として、配線回路が、本教示を実装するために、ソフトウェア命令の代わりに、またはそれと組み合わせて、使用されてもよい。したがって、本教示の実装は、ハードウェア回路とソフトウェアのいずれの具体的組み合わせにも限定されない。

本明細書で使用されるような用語「コンピュータ可読媒体」は、実行のために命令をプロセッサ１０４に提供することに関与する、任意の媒体を指す。そのような媒体は、限定ではないが、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体を含む、多くの形態をとってもよい。不揮発性媒体は、例えば、記憶デバイス１１０等の光または磁気ディスクを含む。揮発性媒体は、メモリ１０６等の動的メモリを含む。伝送媒体は、バス１０２を備えるワイヤを含む、同軸ケーブル、銅線、および光ファイバを含む。

コンピュータ可読媒体の一般的形態は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、または任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）ディスク、任意の他の光学媒体、サムドライブ、メモリカード、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、もしくはコンピュータが読み取り得る任意の他の有形媒体を含む。

コンピュータ可読媒体の種々の形態が、実行のために１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサ１０４に搬送することに関与し得る。例えば、命令は、最初に、遠隔コンピュータの磁気ディスク上で搬送されてもよい。遠隔コンピュータは、命令をその動的メモリの中にロードし、モデムを使用して、電話線を経由して命令を送信することができる。コンピュータシステム１００にローカルのモデルが、電話線上でデータを受信し、赤外線伝送機を使用して、データを赤外線信号に変換することができる。バス１０２に結合される赤外線検出器が、赤外線信号内で搬送されるデータを受信し、バス１０２上にデータを設置することができる。バス１０２は、メモリ１０６にデータを搬送し、そこから、プロセッサ１０４が、命令を読み出し、実行する。メモリ１０６によって受信される命令は、随意に、プロセッサ１０４による実行の前または後のいずれかに記憶デバイス１１０上に記憶されてもよい。

種々の実施形態によると、方法を実施するためにプロセッサによって実行されるように構成される命令が、コンピュータ可読媒体上に記憶される。コンピュータ可読媒体は、デジタル情報を記憶するデバイスであり得る。例えば、コンピュータ可読媒体は、ソフトウェアを記憶するための当技術分野内で公知であるようなコンパクトディスク読取専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）を含む。コンピュータ可読媒体は、実行されるように構成される命令を実行するために好適なプロセッサによってアクセスされる。

本教示の種々の実装の以下の説明が、例証および説明の目的のために提示された。これは、包括的ではなく、本教示を開示される精密な形態に限定しない。修正および変形例が、上記の教示を踏まえて可能である、または本教示の実践から入手され得る。加えて、説明される実装は、ソフトウェアを含むが、本教示は、ハードウェアとソフトウェアの組み合わせとして、またはハードウェア単独で実装され得る。本教示は、オブジェクト指向および非オブジェクト指向プログラミングシステムの両方を用いて実装され得る。

ＣＩＤおよびＥＸＤ解離糖タンパク質分析方法の詳細な説明
タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するためのシステムおよび方法の実施形態が、本発明の本詳細な説明に説明される。本詳細な説明では、解説の目的のために、多数の具体的詳細が、本発明の実施形態の徹底的な理解を提供するように記載される。しかしながら、当業者は、本発明の実施形態が、これらの具体的詳細を伴わずに実施され得ることを理解するであろう。他の事例では、構造およびデバイスが、ブロック図形態で示される。さらに、当業者は、方法が提示および実施される具体的配列が、例証的であり、配列が、変動され、依然として、本発明の実施形態の精神および範囲内に留まり得ることが検討されることを容易に理解することができる。

上記に説明されるように、従来のタンデム質量分析タンパク質識別実験は、サンプルの少なくとも１つのタンパク質をペプチドに消化すること、見出されるペプチドのそれぞれを断片化すること、およびペプチド毎に生成イオンスペクトルを生成することを伴う。見出されるペプチドの生成イオンスペクトルは、次いで、タンパク質を識別するように、タンパク質データベースと比較される。

残念ながら、本識別の方法は、多数の可能性として考えられる異なる糖タンパク質に起因して、糖タンパク質に適用されることができない。換言すると、糖タンパク質データベースを構築し、実験スペクトルをそのデータベースに合致させることは、多数の可能性として考えられる異なる糖タンパク質に起因して実用的ではない。本問題は、上記ではグリカンデータベース合致問題と称される。

グリカンデータベース合致問題に対処する１つの提案される方法は、２つ以上の補完的解離技法を使用して、タンデム質量分析識別実験を実施することである。しかしながら、上記に説明されるように、現在、グリカンデータベース合致問題に完全に対処する、２つ以上の補完的解離技法を使用して取得されるデータを組み合わせる実用的な方法は、存在しない。

種々の実施形態では、タンデム質量分析計を動作させ、２つの補完的解離技法を使用して糖タンパク質識別実験を実施し、２つの技法を使用することから取得されるデータを組み合わせる方法が、グリカンデータベース合致問題に完全に対処する。より具体的には、タンデム質量分析計を動作させ、衝突誘発解離（ＣＩＤ）および電子ベースの解離（ＥｘＤ）の両方を使用して、糖タンパク質識別実験を実施する方法が、グリカンデータベース合致問題に対処する。ＣＩＤ断片化からのデータが、糖タンパク質の糖ペプチドのペプチド部分の候補配列のリストを生成するために使用される。ＥｘＤ断片化からのデータが、実験糖ペプチドのペプチド候補配列を識別するために、リストの候補配列と比較される。候補配列と実験糖ペプチドとの間の質量差が、実験糖ペプチドのグリカン質量を識別するために使用される。候補配列、グリカン、および実験糖ペプチドの修飾の部位から、糖タンパク質全体が、再構築される。

図２は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施し、これらの２つの補完的解離技法を使用することから取得されるデータを組み合わせるための方法を示す、例示的フローチャート２００である。ステップ２１０では、サンプルの１つ以上の糖タンパク質が、例えば、プロテアーゼを使用して、消化される。消化は、１つ以上の糖タンパク質毎に１つ以上の糖ペプチドを生成する。これらの糖ペプチドは、タンデム質量分析計の中に導入される。例えば、糖ペプチドは、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）カラムを使用して、タンデム質量分析計の中に導入され、異なる残留時間においてカラムからタンデム質量分析計の中に溶出する。

タンデム質量分析計のイオン源が、溶出糖ペプチドをイオン化し、糖ペプチド前駆イオンのイオンビームを生成する。タンデム質量分析計は、上記に説明される分析技法のうちの１つを使用して、前駆イオンを分析する。情報依存性入手（ＩＤＡ）型方法では、例えば、前駆イオンまたは質量分析（ＭＳ）調査走査が、前駆イオンピークリストを発生させるように実施される。ピークリスト上の前駆イオンがそれぞれ、選択および断片化され、前駆イオン毎に生成イオンスペクトルを生成する。

図２に示されるように、糖タンパク質識別のための方法では、各前駆イオンが、下記に説明されるように、２つの異なる質量分析実験において選択および断片化される。ステップ２２０では、前駆イオンが、ＣＩＤを使用して断片化され、ＣＩＤ生成イオンが、分析され、ＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。ステップ２３０では、ステップ２２０の実験の前または後に、同一の前駆イオンが、ＥｘＤおよびＥｘＤを使用して断片化され、ＥｘＤ生成イオンが、分析され、ＥｘＤ生成イオンスペクトルを生成する。

ＣＩＤ分析
上記に説明されるように、ＣＩＤは、グリカンを優先的に解離する。結果として、ＣＩＤは、ＣＩＤが糖ペプチドに適用されるときに、グリカンの部分またはペプチド全体を伴うグリカンの部分を有する、グリカン断片を生成する。ＣＩＤが、サンプル内の未修飾ペプチドに適用されるとき、データベースとの比較によって配列決定され得る、ペプチド断片を生成する。糖タンパク質は、プロテアーゼ消化によって、グリコシル化ペプチドおよび未修飾ペプチドの両方を生成する。グリコシル化は、消化によって無傷であり、消化されたペプチド上に留まる。糖ペプチドのペプチド配列および未修飾ペプチドは、タンパク質の異なる部分であるため異なる。

結果として、ステップ２２１に示されるように、未修飾ペプチドのＣＩＤ生成イオンスペクトルは、標準タンパク質データベース２２２と比較されることができる。本比較またはデータベース検索の結果は、ステップ２２３に示されるように、サンプル内の糖タンパク質ならびに非グリコシル化タンパク質を含む、候補タンパク質のリストである。

ステップ２２４では、ステップ２２３において見出される候補タンパク質のリストの各候補タンパク質が、インシリコで消化される。換言すると、各候補タンパク質が、可能性として考えられるペプチドのリストを生成するように計算的に断片化される。本計算的または理論的消化に適用される開裂ルールは、ステップ２１０で使用される実際のプロテアーゼの同一の開裂ルールである。

種々の実施形態では、ステップ２２５が、実施される。ステップ２２５では、候補ペプチドのリストは、ＮおよびＯグリコシル化のためのコンセンサス配列を伴うペプチドを含むように改正される。上記に説明されるように、Ｎグリカンが、コンセンサス配列、すなわち、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンを伴ってアスパラギン残基（Ｎ）上に付着され、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり得る。Ｏグリカンが、セリン残基（Ｓ）またはトレオニン残基（Ｔ）に付着される。Ｏ−グリコシル化のための付加的コンセンサス配列が、存在しないため、単一残基ＳおよびＴコンセンサス配列が、本願ではＯ−グリコシル化のためのコンセンサス配列と称される。各糖タンパク質上の既知のグリコシル化パターンについての利用可能な情報が存在する場合、そのような情報もまた、含まれることができる。

ステップ２２６では、候補糖ペプチドのペプチド部分の候補配列のリストが、提供される。

フェチュインのＣＩＤ分析
図３は、種々の実施形態による、糖タンパク質フェチュインが図２の方法のＣＩＤ分析部分を通して処理される様子の実施例を示す、例示的フローチャート３００である。ステップ２１０では、フェチュインが、トリプシンを使用して消化され、例えば、１つ以上の糖ペプチドおよび未修飾ペプチドを生成する。ステップ２２０では、グリカンを伴う／伴わないペプチドが、ＣＩＤを使用して断片化され、ＣＩＤ生成イオンが、分析され、ＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。

ステップ２２１に示されるように、フェチュインのＣＩＤ生成イオンスペクトルが、ＭＡＳＣＯＴ等のデータベース検索プログラムを使用して、Ｓｗｉｓｓ Ｐｌｏｔ等のタンパク質データベース２２２と比較される。ここでは、フェチュイン消化物内の未修飾ペプチドが識別されるように、ペプチドがグリコシル化されないことを仮定しない。本比較またはデータベース検索は、ステップ２２３に示されるように、サンプル内のタンパク質（グリコシル化および非グリコシル化の両方、ならびに標的および汚染の両方）のリストを提供する。データベース検索によって識別される候補タンパク質３１０のリストは、例えば、ＦＥＴＵＡ＿ＢＯＶＩＮおよびＡ２ＭＧ＿ＢＯＶＩＮを含む。

ステップ２２４では、ステップ２２３において見出される包含タンパク質のリストの各候補タンパク質が、インシリコで消化される。換言すると、各タンパク質が、可能性として考えられるペプチドのリストを生成するように計算的に断片化される。トリプシンの使用の場合、それらの隣接物がプロリンである、すなわち、ｘｘｘＫＰｘｘおよびｘｘｘＲＰｘｘの場合を除いて、Ｋ（リシン）およびＲ（アルギニン）のＣ末端側が、主に開裂される。

種々の実施形態では、ステップ２２５が、実施される。ステップ２２５では、計算的に発生された候補ペプチドのリストが、ＮおよびＯグリカンに関するコンセンサス配列を伴うペプチドのみを含むように改正される。これらのコンセンサス配列は、ＯおよびＮ型グリカンの修飾部位に関するルール３２０を使用して見出される。例えば、Ｏグリカン修飾部位は、ＳおよびＴ残基を含む。Ｎグリカン修飾部位は、ｘがＰに等しくない、ＮｘＴおよびＮｘＳ配列を含む。

ステップ２２６では、候補糖ペプチドのペプチド部分の配列３３０のリストが、提供される。リスト３３０のコンセンサス配列内で、Ｏグリカン修飾部位が、下線付きであり、Ｎグリカン修飾部位が、下線付き、イタリック体、および太字であることに留意されたい。候補配列３３０のリストは、これらの候補配列のみがステップ２２５で選定されたため、ＮおよびＯグリカンコンセンサス配列を伴うペプチドのみを含む。

ＥｘＤ分析
図２に戻ると、ステップ２３０では、ＣＩＤを用いて断片化された同一の前駆イオン（サンプルから消化される）がまた、ＥｘＤを使用して断片化され、ＥｘＤ生成イオンが、分析され、ＥｘＤ生成イオンスペクトルを生成する。上記に説明されるように、ＥｘＤが、ペプチド骨格を優先的に解離し、グリカンが、無傷でペプチド断片上に留まるため、これは、ペプチド配列を分析するための理想的なツールである。換言すると、ＥｘＤ生成イオンスペクトルは、特に、グリコシル化アミノ酸残基を決定するために非常に適している。

結果として、ステップ２３１では、ＥｘＤ生成イオンスペクトルが、糖ペプチドのペプチド部分を決定するように、候補配列の計算的に決定された生成イオンと比較される。ステップ２２６において見出されるペプチド候補は、ＥｘＤ解離ルールに従ってステップ２２７においてインシリコで断片化され、ｃおよびｚ断片を生成する。低い電子エネルギー（０〜約３ｅＶ）によるＥＣＤの場合、プロリンのＮ末端側が、例外として開裂されない。より高い電子エネルギー（＞３ｅＶ）による高温ＥＣＤの場合、プロリンのＮ末端側も、開裂される。結果として生じる理論的ｃおよびｚ生成イオン候補配列は、次いで、ｍ／ｚ値に変換される。これらのｍ／ｚ値は、最終的にステップ２３１においてＥｘＤ生成イオンスペクトルの生成イオンの測定されたｍ／ｚ値と比較される。

より具体的には、各ＥｘＤスペクトルは、断片または生成イオンピークを含有し、断片タイプは、ｃ（Ｎ末端断片）およびｚ（Ｃ末端断片）である。生成イオンピークの実験的に取得された質量対電荷比（ｍ／ｚ）は、ステップ２２７において理論的に計算された候補断片配列の計算されたｍ／ｚ値と比較される。合致の程度を評価するために、「スコア」が、ステップ２２６において計算される候補ペプチド配列毎に計算される。より高いスコアは、本実施例では、より良好な合致を意味する。

多くのスコア化ポリシが、可能性として考えられる。そのようなスコア化ポリシは、糖ペプチドに関するだけではなく、ペプチド全般に関するものであり得る。これらのスコア化方法は、ペプチドスコア化と称されることができる。例えば、ペプチドスコアが、生成イオンピークの実験的に取得されたｍ／ｚ値が、理論的に計算された候補断片配列の計算されたｍ／ｚ値と比較される程度に基づいて、候補ペプチド配列毎に計算されてもよい。

種々の実施形態では、特に、糖ペプチドに関して、ステップ２２６において計算される各候補ペプチド配列は、コンセンサス配列ルールを満たすアミノ酸残基上に付着される、グリコシル化の質量が、把握されていないため、候補ペプチド配列のＮ末端側に合致するｃ断片およびコンセンサス配列グリコシル化修飾部位までの候補ペプチド配列のＣ末端側に合致するｚ断片に基づいてスコア化される。本スコアは、初期ペプチドスコアと称されることができる。

ステップ２３１において提供される、付加糖ペプチドスコア化に基づいて、スコアが、ステップ２２６において計算された候補ペプチド配列毎に決定される。ある事前決定された最小閾値を上回る最高スコアを伴う候補ペプチドが、ステップ２３２においてサンプルの糖ペプチドとして識別される。前駆イオンｍ／ｚおよび電荷、残留時間、ならびに最高スコアを伴う候補ペプチドのペプチド配列もまた、ステップ２３２において決定される。

フェチュインのＥｘＤ分析
図４は、種々の実施形態による、フェチュイン消化物が図２の方法のＥｘＤ分析部分を通して処理される様子の実施例を示す、例示的フローチャート４００である。ステップ２１０では、フェチュインが、例えば、トリプシンを使用して消化され、１つ以上の糖ペプチドを生成する。ステップ２３０では、ＣＩＤ測定において標的化された、消化されたフェチュイン内の同一の糖ペプチドが、ＥｘＤを使用して断片化され、ＥｘＤ生成イオンが、分析され、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０を生成する。

種々の実施形態では、ステップ２３０において、フェチュインの糖ペプチドが、例えば、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）カラムから溶出される。結果として、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０は、フェチュインの糖ペプチドに関して取得される多くのＥｘＤ生成イオンスペクトルのうちの１つである。

図５は、種々の実施形態による、フェチュインの糖ペプチドの溶出から得られた質量分析測定の例示的集合５００である。例えば、プロット５１０は、フェチュインの糖ペプチドのＭＳまたは前駆イオンクロマトグラムのプロットである。プロット５１０は、経時的に測定されるフェチュインの糖ペプチドの前駆イオンの強度を示す。フェチュインの糖ペプチドの前駆イオンのクロマトグラフピークは、具体的糖ペプチドの残留時間を示す。例えば、前駆イオンピーク５１１は、約１１．４６分の残留時間を有する。

加えて、フェチュインの糖ペプチドの前駆イオンピークまたはその近傍で、前駆イオンが、タンデム質量分析またはＭＳ／ＭＳを使用して、選択および断片化される。図２を参照して説明されるように、本タンデム質量分析は、ＣＩＤおよびＥｘＤ断片化の両方を使用して実施される。例えば、プロット４１０は、時間１１．４６分に存在する前駆イオンのＥｘＤ断片化からの生成イオンスペクトルを示す。

図４に戻ると、例えば、プロット４１０における生成イオンスペクトルが、ステップ２３１において糖ペプチドのペプチド部分を決定するために使用される。フェチュインの候補糖ペプチドのペプチド部分の候補配列３３０のリストが、ステップ２２６において前もってＣＩＤ断片化から見出されたことを想起されたい。これらの候補配列３３０は、ｃおよびｚ断片化に関して公知であるルールに従って、ステップ２２７においてインシリコで、または計算的に、さらに断片化された。

ステップ２３１では、ステップ２２７において計算される理論的ｃおよびｚ生成イオンｍ／ｚ値が、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンの測定されたｍ／ｚ値と比較される。上記に説明されるように、本比較は、合致する糖ペプチドを決定するようにスコア化される。

糖ペプチドスコア化
より具体的には、糖ペプチドスコア化は、候補ペプチド配列が、糖ペプチドの修飾部位のためのコンセンサス配列を含有しないかどうかを決定することによって開始する。候補ペプチド配列が、コンセンサス配列を含有しない場合、最終スコアは、ゼロに設定される。換言すると、候補ペプチド配列は、無視される。本ステップは、図２のステップ２２５と同一であることに留意されたい。したがって、これは、ステップ２２５が実施される場合、必要とされない。ステップ２２５は、各候補ペプチド配列がグリコシル化修飾部位のためのコンセンサス配列を含むことを確認することを想起されたい。

各候補ペプチド配列が、コンセンサス配列を含む場合、４つのステップが、候補ペプチド配列毎に実施される。１．配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、候補ペプチド配列のスコアを増分する。２．配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、候補ペプチド配列のスコアを増分しない。３．配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、候補ペプチド配列のスコアを増分しない。４．配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、候補ペプチド配列のスコアを増分する。

これらの４つのステップは、本質的に、Ｎ末端側からグリコシル化修飾部位までのｃ断片およびＣ末端側からグリコシル化修飾部位までのｚ断片を合致させようとする。これらのタイプの合致が行われる場合、スコアは、増加される。ｃまたはｚ断片の任意の他の合致が行われる場合、スコアは、増加されない。グリカンが、修飾部位においてペプチドに付着されたままであり、断片が、修飾部位を越えて合致しないであろうため、合致は、グリコシル化修飾部位までのみに行われる。

図６は、種々の実施形態による、糖ペプチドのＥｘＤ生成イオンスペクトルを示す、例示的略図６００である。

図８は、種々の実施形態による、付着したグリカンの有無別の候補糖ペプチド配列の理論的ｃおよびｚ生成イオンｍ／ｚ値を示す、例示的略図８００である。

種々の実施形態では、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０が、付着したグリカンを伴わない配列である、図８の候補糖ペプチド配列８１０と比較される。可能性として考えられる修飾部位（すなわち、Ｎ）におけるグリカンの構造および質量は、本時点では不明であることに留意されたい。システインにおけるカルバミドメチル化等の固定修飾が、候補配列内に含まれるべきである。

上記に説明されるように、比較スコア化は、図８の候補ペプチド配列８１０が、グリコシル化修飾部位のためのコンセンサス配列を含有しないかどうかを決定することによって開始する。Ｏグリカン修飾部位は、ＳおよびＴ残基を含むことを想起されたい。Ｎグリカン修飾部位は、ｘがＰに等しくない、ＮｘＴおよびＮｘＳ配列を含む。結果として、候補糖ペプチド配列８１０は、実際に、コンセンサス配列を含む。例えば、候補糖ペプチド配列８１０は、Ｎグリカンのためのコンセンサス配列ＮＤＳと、Ｏグリカンノンためのコンセンサス配列Ｓとを含む。

上記に説明される４つの糖ペプチドスコア化ステップは、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークの実験的に取得されたｍ／ｚ値のうちの１つ以上のものに適用される。例えば、上記に説明される４つの糖ペプチドスコア化ステップは、ＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークの１つ以上のｍ／ｚ値に適用される。

糖ペプチドスコア化ステップ１に関して、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピーク４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、および４１７のｍ／ｚ値は、それぞれ、図８の候補糖ペプチド配列８１０の理論的断片８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、および８１７のｍ／ｚ値に合致する。候補糖ペプチド配列８１０の理論的断片８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、および８１７は、候補糖ペプチド配列８１０のＮ末端側からのｃ断片である。それらはまた、コンセンサス配列場所（ＮＤＳ）の前の断片である。結果として、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピーク４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、および４１７のｍ／ｚ値は、図８の候補糖ペプチド配列８１０のためのステップ１の条件を満たす。結果として、候補糖ペプチド配列８１０のスコアは、合致毎に事前決定された値だけ増分される（より高いスコアを与える）。

図８の候補糖ペプチド配列８１０のスコアは、スコア化ステップ２または３で行われる任意の合致に関して増加されない。

しかしながら、図８の候補糖ペプチド配列８１０のスコアは、糖ペプチドスコア化ステップ４の条件を満たす。候補糖ペプチド配列８１０は、Ｃ末端側からのｚ断片（断片８４１）を含む。加えて、本断片は、コンセンサス配列ＮＤＳの前にある。断片８４１のｍ／ｚ値はまた、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピーク４４１のｍ／ｚ値に合致する。結果として、図８の候補糖ペプチド配列８１０のスコアは、事前決定された値だけ再び増分される（より高いスコアを与える）。

図４に戻ると、ステップ２３１では、候補配列３３０のリストの候補糖ペプチド配列８１０が、最高スコアを伴うＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０に合致することが見出される。結果として、ステップ２３２では、候補糖ペプチド配列８１０が、サンプルの糖ペプチドとして識別される。種々の実施形態では、ステップ２３２では、糖ペプチドのｍ／ｚ、電荷、および残留時間が、例えば、図５を参照して説明されるように、実験ＭＳまたは前駆イオン測定から決定される。ステップ２３２において決定されるペプチド配列は、候補ペプチド配列から把握される。

ステップ２３２において不明のままであるものは、候補ペプチド配列が複数のコンセンサス配列を有する場合におけるペプチドの実際の修飾部位である。また、ステップ２３２では、グリカンの構造も不明である。

立証、修飾部位識別、およびグリカン再構築
図２に戻ると、付加的ステップが、糖ペプチドのペプチド部分の配列を検証し、糖ペプチドのペプチド部分の実際の修飾部位を識別し、糖ペプチドのグリカン部分の構造を決定するように、実施されることができる。ステップ２４１では、グリカンの質量または翻訳後修飾（ＰＴＭ）質量が、計算される。ＰＴＭ質量は、測定された前駆イオンと候補ペプチド配列の理論的質量との間の質量差から計算される。

ステップ２４２では、配列の正当性を立証し、糖ペプチドのペプチド部分の実際の修飾部位を識別するために、ＰＴＭ質量が、ステップ２３２において見出される候補配列のコンセンサス配列によって与えられる修飾部位に理論的に付加される。候補配列は、次いで、修飾候補配列理論的断片を測定されたＥｘＤ断片と比較することによって再びスコア化される。スコアが、理論的断片へのＰＴＭ質量の追加に起因して改良される場合には、候補配列は、ステップ２４３において正当性を立証され、再び識別される。修飾部位もまた、本比較によって決定され、ステップ２４３において識別される。

グリカンの構造を決定するために、ステップ２４４では、ＥｘＤ生成イオンスペクトルに対応するＣＩＤ生成イオンスペクトルが、ステップ２３２において見出される糖ペプチドの前駆イオンのｍ／ｚ、電荷、および残留時間を使用して見出される。ＣＩＤ生成イオンスペクトルから、グリカン断片が、見出される。これらのグリカン断片およびステップ２４１において見出されるＰＴＭ質量から、グリカンが、ステップ２４５において再構築される。ステップ２４３では、グリカン構造が、報告される。

フェチュイン立証、修飾部位識別、およびグリカン再構築
図７は、種々の実施形態による、図２の方法を使用して、フェチュインの糖ペプチドのペプチド部分の配列の正当性が立証される様子、糖ペプチドのペプチド部分の実際の修飾部位が識別される様子、および糖ペプチドのグリカン部分の構造が決定される様子の実施例を示す、例示的フローチャート７００である。ステップ２４１では、ＰＴＭ質量が、計算される。ＰＴＭまたはグリカン質量は、ステップ２３２において見出される前駆イオンの実験質量（ｍ／ｚ×ｚ）から、ステップ２３２において見出される候補ペプチド配列の理論的質量を減算することによって見出される。例えば、２２２２．８１ａｍｕのＰＴＭ質量が、ステップ２３２において見出される前駆イオンの実験質量（９８７．１６×４）から、ステップ２３２において見出される候補配列の理論的質量を減算することによって、フェチュインの糖ペプチドに関してステップ２４１において見出される。

ステップ２４２では、ＰＴＭ質量が、候補ペプチド配列をスコア化するために使用される。本付加的スコア化は、４つのステップを含む。（１）ＰＴＭ質量が、候補ペプチド配列の理論的断片のコンセンサス配列のグリコシル化修飾部位（Ｎ、Ｓ、およびＴ）のそれぞれに追加され、付加的な理論的断片を生成する。（２）ＥｘＤ生成イオンスペクトルの生成イオンピークの実験的に取得されたｍ／ｚ値が、ここではＰＴＭ質量を含む、付加的な理論的断片のｍ／ｚ値を含む、候補ペプチド配列の理論的断片のｍ／ｚ値と再び比較される。（３）ここで、ＥｘＤ生成イオンスペクトルの生成イオンピークのうちの１つ以上のものに関して、各生成イオンピークが、候補ペプチド配列全体のｃ断片の理論的ｍ／ｚに合致するとき、スコアが、増分される（より高いスコアを与えられる）。同様に、ＥｘＤ生成イオンスペクトルの生成イオンピークのうちの１つ以上のものに関して、各生成イオンピークが、候補ペプチド配列全体のｚ断片の理論的ｍ／ｚに合致するとき、スコアが、増分される（より高いスコアを与えられる）。（４）候補ペプチド配列のスコアがここで、以前よりも高い場合には、候補ペプチド配列およびＰＴＭ質量の正当性が、立証される。加えて、生成イオンピークが、特定の修飾部位におけるＰＴＭ質量を含む、理論的ｍ／ｚ断片に合致する場合には、候補ペプチド配列の修飾部位が、見出される。

図８に戻ると、（１）ＰＴＭ質量が、候補ペプチド配列の理論的断片のコンセンサス配列のグリコシル化修飾部位（Ｎ、Ｓ、およびＴ）のそれぞれに追加される場合、候補糖ペプチド配列８２０はここで、コンセンサス配列ＮＤＳの修飾部位ＮにおいてＰＴＭ（グリカン７２０）を含む。（２）例えば、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークの実験的に取得されたｍ／ｚ値が、ここではＰＴＭ質量を含む、付加的な理論的断片のｍ／ｚ値を含む、図８の現在の候補ペプチド配列８２０の理論的断片のｍ／ｚ値と再び比較される。

結果として、（３）ここで、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピークのｍ／ｚ値が、図８の候補ペプチド配列８２０の理論的断片に合致されるとき、より多くの合致が存在する。例えば、Ｎ末端側から、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピーク４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、および４１７のｍ／ｚ値は、依然として、それぞれ、図８の候補糖ペプチド配列８２０の理論的断片８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、および８２７のｍ／ｚ値に合致する。しかしながら、ここで、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピーク４１８、４１９、および４２０のｍ／ｚ値は、加えて、それぞれ、図８の候補糖ペプチド配列８２０の理論的断片８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、および８２７のｍ／ｚ値に合致する。

同様に、Ｃ末端側から、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピーク４４１のｍ／ｚ値は、依然として、図８の候補糖ペプチド配列８２０の理論的断片８５１のｍ／ｚ値に合致する。しかしながら、ここで、図６のＥｘＤ生成イオンスペクトル４１０の生成イオンピーク４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、および４４７のｍ／ｚ値は、加えて、それぞれ、図８の候補糖ペプチド配列８２０の理論的断片８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、および８５７のｍ／ｚ値に合致する。結果として、候補糖ペプチド配列８２０のスコアは、合致毎に再び増分される（より高いスコアを与えられる）。本スコア化は、断片がＮ末端側またはＣ末端側に由来するかどうかに依存しないことに留意されたい。

（４）候補糖ペプチド配列８２０のスコアが、ここでは以前よりも高いため、候補糖ペプチド配列８２０およびＰＴＭ質量の正当性が、立証される。加えて、実験生成イオンピークが、コンセンサス配列ＮＤＳの修飾部位ＮにおいてＰＴＭ質量を含む理論的ｍ／ｚ断片に合致したため、候補糖ペプチド配列８２０の修飾部位は、コンセンサス配列ＮＤＳの部位Ｎとして識別される。

図７に戻ると、ステップ２４２において付着されたＰＴＭ質量を伴う候補糖ペプチド配列８２０の合致は、ステップ２４３において候補糖ペプチド配列８２０の立証をもたらす。加えて、ステップ２４２における本合致を通して、修飾部位は、ステップ２４３においてコンセンサス配列ＮＤＳの部位Ｎとして識別される。

グリカン構造再構築
修飾部位におけるグリカン７２０の構造もまた、ステップ２４３に示される。種々の実施形態では、グリカン構造７２０は、ステップ２４１において計算されるＰＴＭ質量から見出される。ＰＴＭ質量を使用する、一実施形態では、グリカン構造７２０は、１つ以上のグリカンデータベースを使用して推定される。例えば、グリカン構造７２０は、実験ＰＴＭ質量の事前決定された質量閾値内のグリカン質量を有するグリカンを１つ以上のグリカンデータベース内で見出すことによって、見出される。

ＰＴＭ質量を使用する、別の実施形態では、前の請求項において計算されるＰＴＭ質量を使用して、グリカン構造７２０は、構成糖のリストの任意の組み合わせから合致する質量を見出すことによって推定される。本構成糖のリストは、限定ではないが、Ｇａｌ、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡＣ、ＧａｌＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、およびＮｅｕ５Ａｃを含むことができる。

種々の実施形態では、グリカン構造７２０は、ステップ２４１において計算されるＰＴＭ質量から、およびＣＩＤ生成イオンスペクトル内に出現するグリカン断片から見出される。ＥｘＤ生成イオンスペクトルに対応するＣＩＤ生成イオンスペクトルは、ステップ２３２において見出される糖ペプチドの前駆イオンのｍ／ｚ、電荷、および残留時間を使用して、ステップ２４４において見出される。ＣＩＤ生成イオンスペクトルから、グリカン断片７１０が、見出される。一実施形態では、グリカン断片７１０およびステップ２４１において見出される実験ＰＴＭ質量から、理論的グリカン構造７２０が、ステップ２４５において見出され、ステップ２４３において報告される。

グリカン断片７１０およびステップ２４１において見出される実験ＰＴＭ質量を使用する、別の実施形態では、適切なグリカン構造が、１つ以上のグリカンデータベースを使用して推定される。例えば、グリカン構造７２０が、実験ＰＴＭ質量の事前決定された質量閾値内のグリカン質量を有し、サブユニット合致グリカン断片７１０を有する、グリカンを１つ以上のグリカンデータベース内で見出すことによって、ステップ２４５において見出される。

図２−８は、サンプルの少なくとも１つの糖ペプチドを識別するための方法を説明する。糖タンパク質が、１つ以上の糖ペプチドから識別され得ることが当業者に周知である。換言すると、上記に説明されるステップは、糖ペプチドを識別するために、２つ以上の糖ペプチドを見出すように反復して実施されることができる。

ＣＩＤおよびＥｘＤサンプル導入ならびに分析方法
図２に戻ると、種々の実施形態では、ステップ２２０において実施されるＬＣ−ＣＩＤ測定およびステップ２３０において実施されるＬＣ−ＥｘＤ測定は、同一のサンプルに関して別個に実施される。換言すると、ステップ２２０および２３０において実施される測定は、同一の消化されたサンプル２１０に実施される別個の質量分析実験である。ステップ２２０および２３０における別個のＣＩＤおよびＥｘＤ質量分析実験はそれぞれ、例えば、従来のＩＤＡタンデム質量分析ワークフローを使用することができる。

図９は、種々の実施形態による、ＣＩＤおよびＥｘＤ分析が、単一の液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳＭＳ）実験で実施される、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャート９００である。ステップ２１０では、サンプルの１つ以上の糖タンパク質が、例えば、プロテアーゼを使用して、消化される。

ステップ９２０では、消化されたサンプル糖ペプチドのＣＩＤおよびＥｘＤ分析が、単一の質量分析実験で実施される。種々の実施形態では、糖ペプチドの前駆イオンが、ＣＩＤを使用して選択および断片化される。ＣＩＤ生成イオンが、分析され、ＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。表記９２１に説明されるように、グリカン断片が、ＣＩＤ生成イオンスペクトル内で検出される場合、同一の前駆イオンが、同一のＬＣ−ＭＳＭＳ実験においてＥｘＤ断片化を使用して、再び選択および断片化される。同一の質量分析実験においてＣＩＤ分析によってトリガされる、そのようなＥｘＤ分析を実施するために、従来のＩＤＡタンデム質量分析ワークフローが、例えば、修正される。

残りのステップ２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、および２３１は、図２に関して説明されるものと同一の機能を果たす。ステップ２２０および２３０を除く、図２の他のステップは、図９の方法を使用して実施されることができる。換言すると、図９のステップ９１０は、図２のステップ２２０および２３０に取って代わる。

図１０は、種々の実施形態による、ＣＩＤおよびＥｘＤ分析が、別個の質量分析実験で実施され、前駆イオンのＥｘＤ分析が、ＣＩＤ分析においてグリカン断片を見出すことに基づく、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャート１０００である。ステップ２１０では、サンプルの１つ以上の糖タンパク質が、消化される。

ステップ２２０では、前駆イオンが、ＣＩＤを使用して断片化され、ＣＩＤ生成イオンが、分析され、ＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。図１０の方法では、ＣＩＤ生成イオンスペクトルはここでは、ＥｘＤ分析のための前駆イオンを決定するために使用される。結果として、本方法は、ステップ１０３５を含む。ステップ１０３５では、ＣＩＤ生成イオンスペクトルがグリカン断片を含むかどうかが決定される。これが該当する場合、グリカン断片を生成した前駆イオンは、ステップ１０３６の包含リストに追加される。ＣＩＤ質量分析実験が、ＥｘＤ質量分析実験のための前駆イオンリストを構築するために使用されるため、これは、ＥｘＤ質量分析実験の前に起こらなければならない。

ステップ２３０では、ステップ２２０の実験後、ステップ１０３６において作成される前駆イオン包含リストの前駆イオンのみが、選択され、次いで、ＥｘＤを使用して断片化される。ＥｘＤ生成イオンが、分析され、ＥｘＤ生成イオンスペクトルを生成する。

図２の方法と比較して、図１０の方法の追加されたステップ１０３５および１０３６は、糖ペプチドを識別するために必要とされるＥｘＤ測定の数を削減する。結果として、図１０の方法は、糖タンパク質以外の化合物を含む、より複雑なサンプルのための図２の方法よりも有利である。

残りのステップ２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、および２３１は、図２に関して説明されるものと同一の機能を果たす。図２の他のステップもまた、図１０の方法を使用して実施されることができる。

図１１は、種々の実施形態による、ＣＩＤおよびＥｘＤ分析が、別個の質量分析実験で実施され、ＥｘＤ分析がさらに、ＥｘＤ分析の前にグリコシル化濃縮方法を含む、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャート１１００である。再び、ステップ２１０では、サンプルの１つ以上の糖タンパク質が、消化される。

ステップ２２０では、前駆イオンが、ＣＩＤを使用して断片化され、ＣＩＤ生成イオンが、分析され、ＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。タンパク質の広い検索に関して、濃縮されていないサンプルは、ＣＩＤ測定のためのものである。結果として、ＣＩＤを使用して断片化される前駆イオンは、ステップ２１０の消化されたサンプルから直接取得される。

対照的に、ＥｘＤ測定に関して、グリコシル化ペプチド濃縮方法が、ＥｘＤ分析の前にサンプルに適用される。例えば、ステップ２１０の消化されたサンプルはさらに、ＬＣ注入の前にステップ１１３５のレクチンカラムを使用して、グリコシル化ペプチド濃縮を受ける。ＥｘＤが、ＣＩＤよりも低感度であり得るため、サンプルを濃縮することは、より少ないＥｘＤ標的および各標的前駆イオンのより多くの分子を生成するため、感度を増加させる。ステップ２３０では、濃縮された標的前駆イオンが、ＥｘＤを使用して断片化され、ＥｘＤ生成イオンが、分析され、ＥｘＤ生成イオンスペクトルを生成する。図１１の方法は、例えば、より糖ペプチド特異的なＥｘＤ分析を提供する。

残りのステップ２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、および２３１は、図２に関して説明されるものと同一の機能を果たす。図２の他のステップもまた、図１１の方法を使用して実施されることができる。

図１２は、種々の実施形態による、第１のＣＩＤ分析、ＥｘＤ分析、および第２のＣＩＤ分析が、別個の質量分析実験で実施され、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析がさらに、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析の前にグリコシル化濃縮方法を含む、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャート１２００である。再び、ステップ２１０では、サンプルの１つ以上の糖タンパク質が、消化される。

ステップ２２０では、前駆イオンが、第１のＣＩＤ分析において断片化され、ＣＩＤ生成イオンが、分析され、第１のＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。タンパク質の広い検索に関して、濃縮されていないサンプルは、ＣＩＤ測定のためのものである。結果として、ＣＩＤを使用して断片化される前駆イオンは、ステップ２１０の消化されたサンプルから直接取得される。

対照的に、第２のＣＩＤ分析およびＥｘＤ分析に関して、グリコシル化ペプチド濃縮方法が、第２のＣＩＤ分析およびＥｘＤ分析の前にサンプルに適用される。例えば、ステップ２１０の消化されたサンプルはさらに、ＬＣ注入の前にステップ１２３５のレクチンカラムを使用して、グリコシル化ペプチド濃縮を受ける。ＥｘＤが、ＣＩＤよりも低感度であり得るため、サンプルを濃縮することは、より少ないＥｘＤ標的および各標的前駆イオンのより多くの分子を生成するため、感度を増加させる。ステップ２３０では、濃縮された標的前駆イオンが、ＥｘＤを使用して断片化され、ＥｘＤ生成イオンが、分析され、ＥｘＤ生成イオンスペクトルを生成する。

ステップ１２３６における第２のＣＩＤ分析もまた、濃縮されたサンプルに適用される。ステップ１２３６における第２のＣＩＤ分析は、第２のＣＩＤ生成イオンスペクトル内のグリカン断片のためのより良好な信号対雑音（Ｓ／Ｎ）測定を提供し、本測定は、ここではステップ２２０からの測定の代わりにステップ２４４で使用される。結果として、これらのグリカン断片からのグリカン構造の再構築が、より高い信頼度で実施される。図１２の方法は、例えば、より糖ペプチド特異的なＣＩＤおよびＥｘＤ分析を提供する。

残りのステップ２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３１、および２３２は、図２に関して説明されるものと同一の機能を果たす。図２の他のステップもまた、図１２の方法を使用して実施されることができる。

図１３は、種々の実施形態による、第１のＣＩＤ分析が、第１の質量分析実験で実施され、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析が、第２の質量分析実験でともに実施され、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析がさらに、ＥｘＤ分析および第２のＣＩＤ分析の前にグリコシル化濃縮方法を含む、タンデム質量分析計を動作させ、ＣＩＤおよびＥｘＤの両方を使用して糖タンパク質識別を実施するための方法の初期ステップを示す、例示的フローチャート１３００である。再び、ステップ２１０では、サンプルの１つ以上の糖タンパク質が、消化される。

ステップ２２０では、前駆イオンが、第１のＣＩＤ分析において断片化され、ＣＩＤ生成イオンが、分析され、第１のＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。タンパク質の広い検索に関して、濃縮されていないサンプルは、ＣＩＤ測定のためのものである。結果として、ＣＩＤを使用して断片化される前駆イオンは、ステップ２１０の消化されたサンプルから直接取得される。

対照的に、第２のＣＩＤ分析およびＥｘＤ分析に関して、グリコシル化ペプチド濃縮方法が、第２のＣＩＤ分析およびＥｘＤ分析の前にサンプルに適用される。例えば、ステップ２１０の消化されたサンプルはさらに、ＬＣ注入の前にステップ１２３５のレクチンカラムを使用して、グリコシル化ペプチド濃縮を受ける。ＥｘＤが、ＣＩＤよりも低感度であり得るため、サンプルを濃縮することは、より少ないＥｘＤ標的および各標的前駆イオンのより多くの分子を生成するため、感度を増加させる。第２のＣＩＤ分析は、第２のＣＩＤ生成イオンスペクトル内のグリカン断片のためのより良好な信号対雑音（Ｓ／Ｎ）測定を提供し、本測定は、ここではステップ２２０からの測定の代わりにステップ２４４で使用される。結果として、これらのグリカン断片からのグリカン構造の再構築が、より高い信頼度で実施される。

ステップ１３３６では、第２のＣＩＤ分析およびＥｘＤ分析が、ここでは同一のＬＣ−ＭＳＭＳ実験で実施される。濃縮された標的前駆イオンが、選択され、次いで、ＣＩＤを使用して断片化され、ＣＩＤ生成イオンが、分析され、第２のＣＩＤ生成イオンスペクトルを生成する。同一の濃縮された標的前駆イオンが、選択され、次いで、ＥｘＤを使用して断片化され、ＥｘＤ生成イオンが、分析され、ＥｘＤ生成イオンスペクトルを生成する。図１３の方法は、好ましい実施形態である。しかしながら、図９の方法のように、図１３の方法は、修正されたＩＤＡタンデム質量分析ワークフローを用いて実施される。

残りのステップ２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３１、および２３２は、図２に関して説明されるものと同一の機能を果たす。図２の他のステップもまた、図１３の方法を使用して実施されることができる。

糖ペプチドのペプチド配列を識別するためのシステム
図１４は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するためのシステムの例示的概略図１４００である。図１４のシステムは、イオン源デバイス１１０と、質量単離デバイスまたはフィルタ１１５と、第１の断片化デバイス１２０と、第２の断片化デバイス１２５と、質量分析器１３０と、プロセッサ１４０とを含む。

イオン源デバイス１１０は、当技術分野で公知である任意のイオン源デバイスであり得る。種々の実施形態では、好適なイオン源は、限定ではないが、エレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）、電子衝撃源および高速原子衝撃源、大気圧化学イオン化源（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）源、またはマトリクス支援レーザレーザ脱離源（ＭＡＬＤＩ）を含むことができる。イオン化源は、好ましくは、糖ペプチドをイオン化するように選定されることができる。好ましい実施形態では、エレクトロスプレーイオン化が、利用される。

質量単離デバイス１１５は、従来的に、ＲＦおよびＤＣ電圧をそれに印加させ、イオンをフィルタ処理するその能力が、マシュー方程式によってモデル化される、四重極フィルタである。好ましい実施形態では、質量単離デバイス１１５は、四重極ロッドのセットを備えるが、用語「質量単離デバイス」は、イオンをフィルタ処理し、イオンを単離する効果を生成することが可能である、任意の質量分析計型デバイスを網羅することを意図していることを理解されたい。例えば、質量単離デバイスは、イオンを捕獲し、あるｍ／ｚ値を有するイオンを走査して出すように機能する、イオントラップデバイスを備えてもよい。

第１の断片化デバイス１２０は、ＥｘＤデバイスまたはイオンガイドのいずれかとして動作することが可能である。イオンガイドとして動作するとき、多極イオンガイド１２０からＥｘＤデバイス１２５に進入するイオンが、反応を伴わずにＥｘＤデバイス１２５の出口まで通過される。ＥｘＤデバイス１２５としてデバイスを動作させるとき、利用されている電子は、所望される電子関連解離反応のタイプに応じて、エネルギーが約１ｅＶ〜１５ｅＶに及び得る。ＥｘＤデバイス１２５内で生じる電子ベースの反応は、ペプチド断片を発生させ、グリカンの環を跨いだ開裂を実施するように機能することができる。

第２の断片化デバイス１２５は、タンデム質量分析計のＱ２領域のように動作し、衝突セルとして動作する、任意の多極ガイドの形態をとってもよい。衝突セルは、ガスで充填され、親イオンを断片に分解するイオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ）を誘発する、複数の低エネルギー衝突が生じるように、十分に高い圧力および電圧において維持される。衝突セルに提供されるエネルギーおよび利用されるガスに応じて、本発明のある実施形態では、多極イオンガイド１２０は、ペプチドからグリカンを分離し、ペプチドを断片に分解し、および／またはグリカンをその構成糖に分解するように動作する。

種々の実施形態では、レンズ電極１２１が、第２の断片化デバイス１２５と第１の断片化デバイス１２０との間に設置されてもよい。レンズ１２１は、例えば、第１の断片化デバイス１２２および通過フィルタリングによって捕獲されるイオンを抽出するように構成される。また、種々の実施形態では、第２の断片化デバイス１２５、レンズ１２１、および第１の断片化デバイス１２０は、単一の断片化デバイス１１９と考えられてもよい。

質量分析器１３０は、任意のタイプの質量分析計であり得る。ある実施形態では、最終質量単離デバイス（Ｑ３）は、タンデム質量分析計内の四重極フィルタおよび検出器から成る。他の実施形態では、本最後の分光計は、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計またはイオントラップであってもよい。好ましい実施形態では、本最後の段階は、ＴＯＦデバイスである。

種々の実施形態では、質量単離デバイス１１５、第２の断片化デバイス１２５、第１の断片化デバイス１２０、および質量分析器１３０は、タンデム質量分析計１５０の構成要素である。種々の代替実施形態では、イオン源デバイス１１０もまた、タンデム質量分析計１５０の構成要素と見なされてもよい。

プロセッサ１４０は、限定ではないが、コントローラ、コンピュータ、マイクロプロセッサ、図１のコンピュータシステム、または制御信号およびデータをタンデム質量分析計１５０の構成要素に送信ならびに受信し、データを処理することが可能な任意のデバイスであり得る。プロセッサ１４０は、少なくとも、質量単離デバイス１１５、第２の断片化デバイス１２５、第１の断片化デバイス１２０、および質量分析器１３０と通信する。

種々の実施形態では、図１４のシステムはさらに、例えば、ＤＣ電力供給源１４１およびＲＦ電力供給源１４２を含む、１つ以上の電力供給源を含む。１つ以上の電力供給源は、ＲＦ、ＡＣ、および／またはＤＣ成分を伴う電位を、種々の構成要素の電極に印加し、協調様式で、ならびに／もしくは種々の異なる動作モードのために、タンデム質量分析計１５０の要素を構成するように、プロセッサ１４０によって制御されることができる。

イオン源デバイス１１０は、プロテアーゼを使用して消化されたサンプル１０５を受容およびイオン化し、イオンビームを生成するように適合される。タンデム質量分析計１５０またはＭＳ／ＭＳ１５０の質量単離デバイス１１５は、イオン源デバイス１１０のイオンビームから前駆イオンを選択するように適合される。ＭＳ／ＭＳ１５０の第２の断片化デバイス１２５は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように、かつ生成イオンを生成するように適合される。ＭＳ／ＭＳ１５０の第１の断片化デバイス１２０は、電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように、かつ生成イオンを生成するように適合される。ＭＳ／ＭＳ１５０の質量分析器１３０は、第２の断片化デバイス１２５または第１の断片化デバイス１２０から生成イオンを質量分析し、生成イオンスペクトルを生成するように適合される。

プロセッサ１４０は、一連のステップを実施する。ステップ（ｉ）では、プロセッサ１４０は、第１のイオンビームから少なくとも１つの前駆イオンを選択するように質量単離デバイス１１５に命令する。ステップ（ｉｉ）では、プロセッサ１４０は、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように第２の断片化デバイス１２５に命令する。ステップ（ｉｉｉ）では、プロセッサ１４０は、複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第１のＣＩＤスペクトルを生成するように質量分析器１３０に命令する。ステップ（ｉｖ）では、プロセッサ１４０は、第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを決定する。

ステップ（ｖ）では、プロセッサ１４０は、サンプルからイオン源デバイスによって生成される第２のイオンビームから、少なくとも１つの前駆イオンを再び選択するように質量単離デバイス１１５に命令する。ステップ（ｖｉ）では、プロセッサ１４０は、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＥｘＤ生成イオンを生成するように第１の断片化デバイス１２０に命令する。ステップ（ｖｉｉ）では、プロセッサ１４０は、複数のＥｘＤ生成イオンを質量分析し、ＥｘＤスペクトルを生成するように質量分析器１３０に命令する。

ステップ（ｖｉｉｉ）では、１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストの候補配列毎に、プロセッサ１４０は、ｃおよびｚ断片ルールを使用して、配列を計算的に断片化し、複数の理論的断片を生成し、複数の理論的断片に関して質量対電荷比（ｍ／ｚ）値を計算し、
（ａ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、配列のスコアを増分するステップと、
（ｂ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｃ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｄ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分するステップと、
によって、配列をスコア化する。

最後に、ステップ（ｉｘ）では、プロセッサ１４０は、最高スコアを伴う１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストの候補配列を、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列として識別する。

種々の実施形態では、グリカン修飾部位のコンセンサス配列は、Ｏグリカンコンセンサス配列ＳまたはＴ、もしくはＮグリカンコンセンサス配列ＮｘＴまたはＮｘＳを含み、ｘ≠Ｐ、およびＳ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｎ＝アスパラギン、ならびにＰ＝プロリンである。

種々の実施形態では、図３に示されるように、プロセッサ１４０は、ＣＩＤスペクトルをタンパク質データベースに合致させることによって、第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを決定する。より具体的には、プロセッサ１４０は、第１のＣＩＤスペクトルを使用して、タンパク質データベースを検索し、タンパク質のリストを生成する。プロセッサ１４０は、実際の消化で使用されるプロテアーゼの開裂ルールを使用して、タンパク質リストのうちの各タンパク質を計算的に消化し、理論的ペプチド配列のリストを生成する。プロセッサ１４０は、グリカン修飾部位のコンセンサス配列を含むペプチド配列リストから各理論的糖ペプチド配列を選択し、１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを生成する。

種々の実施形態では、図５を参照すると、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）デバイス等の分離デバイスが、糖ペプチド配列識別と併せて使用される。より具体的には、図１４のシステムはさらに、経時的に消化されたサンプルのペプチドを分離し、分離されたペプチドをイオン源デバイス１１０に導入するように適合される、分離デバイス（図示せず）を含む。プロセッサ１４０は、複数の時間ステップにおいて前駆イオンの質量範囲を選択するように質量単離デバイス１１５に命令する。プロセッサ１４０は、複数の時間ステップにおいて前駆イオンの質量範囲を質量分析し、前駆イオンの質量範囲の前駆イオン毎に、経時的に前駆イオンｍ／ｚ、電荷、および強度値のクロマトグラムを生成するように質量分析器１３０に命令する。プロセッサ１４０は、クロマトグラムから少なくとも１つの前駆イオンを選択し、少なくとも１つの前駆イオンのｍ／ｚ、電荷、および強度値は、クロマトグラムから把握される。

種々の実施形態では、図７のステップ２４１を参照すると、プロセッサ１４０はさらに、識別された糖ペプチド配列に関して翻訳後修飾（ＰＴＭ）質量を計算する。プロセッサ１４０は、少なくとも１つの前駆イオンのｍ／ｚおよび電荷から見出される少なくとも１つの前駆イオンの実験質量から、識別された候補配列の理論的に計算された質量を減算する。

種々の実施形態では、図７のステップ２４２を参照すると、プロセッサ１４０はさらに、識別された候補配列の正当性を立証する。プロセッサ１４０は、ＰＴＭ質量を識別された候補配列の１つ以上のコンセンサス配列グリカン修飾部位のそれぞれに追加し、１つ以上の修飾候補配列を生成する。プロセッサ１４０は、１つ以上の修飾候補配列のそれぞれを理論的に断片化する。プロセッサ１４０は、
（ａ）配列全体からのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、配列のスコアを増分するステップと、
（ｂ）配列全体からのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、配列のスコアを増分するステップと、
によって、１つ以上の修飾候補配列のそれぞれをスコア化する。

プロセッサ１４０は、修飾候補配列のスコアが、識別された候補配列のスコアを超える場合に、識別された候補配列の正当性を立証する。さらに、修飾候補配列のスコアが、識別された候補配列のスコアを超える場合、プロセッサ１４０は、修飾候補配列の修飾部位を識別された候補配列の修飾部位として識別する。

種々の実施形態では、図７のステップ２４５を参照すると、プロセッサ１４０はさらに、ＰＴＭ質量を使用して、グリカン構造およびそれらの質量のデータベースを検索することによって、サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定する。別の実施形態では、プロセッサ１４０は、グリカン構造およびそれらの質量のデータベースを検索し、ＰＴＭ質量を各グリカン構造の各質量と比較し、第１のＣＩＤスペクトルのグリカン断片を各グリカン構造のサブユニットと比較することによって、サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定する。別の実施形態では、プロセッサ１４０は、ＰＴＭ質量を構成糖のリストの任意の組み合わせの質量と比較することによって、サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定する。構成糖のリストは、例えば、Ｇａｌ、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡＣ、ＧａｌＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、およびＮｅｕ５Ａｃを含むことができる。

種々の実施形態では、図２のステップ２２０および２３０を参照すると、プロセッサ１４０は、サンプルに適用される第１のタンデム質量分析実験においてステップ（ｉ）−（ｉｖ）、および同一のサンプルに適用される第２のタンデム質量分析実験においてステップ（ｖ）−（ｉｘ）を実施する。

種々の実施形態では、図１０のステップ１０３５および１０３６を参照すると、プロセッサ１４０は、第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上のグリカン断片を識別し、グリカン断片を含むため、ＥｘＤ分析のために少なくとも１つの前駆イオンを前駆イオン包含リストに追加する。プロセッサ１４０は、包含リストから第２のタンデム質量分析実験における厳選した前駆イオンのみを選択するように質量単離デバイス１１５に命令する。

種々の実施形態では、図１１のステップ１１３５を参照すると、グリコシル化ペプチド濃縮方法がさらに、第２のタンデム質量分析実験の前に消化されたサンプルに適用され、濃縮される消化されたサンプルを生成する。第２のタンデム質量分析実験は、濃縮される消化されたサンプルを使用して実施される。グリコシル化ペプチド濃縮は、例えば、レクチンカラムを使用して適用される。

種々の実施形態では、図１２のステップ１２３６および２４４を参照すると、プロセッサ１４０はさらに、以下のステップを実施する。ステップ（ｘ）では、プロセッサ１４０は、第３のイオンビームから同一の少なくとも１つの前駆イオンを選択するように質量単離デバイス１１５に命令する。ステップ（ｘｉ）では、プロセッサ１４０は、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、第２の複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように第２の断片化デバイス１２５に命令する。ステップ（ｘｉｉ）では、プロセッサ１４０は、第２の複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第２のＣＩＤスペクトルを生成するように質量分析器１３０に命令する。ステップ（ｘｉｉｉ）では、プロセッサ１４０は、グリカン構造およびそれらの質量のデータベースを検索し、第２のＣＩＤスペクトルのグリカン断片を各グリカン断片のサブユニットと比較することによって、サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定する。プロセッサ１４０は、濃縮される消化されたサンプルに適用される第３のタンデム質量分析実験においてステップ（ｘ）−（ｘｉｉｉ）を実施する。

種々の実施形態では、図１３のステップ１３３６を参照すると、第２のイオンビームおよび第３のイオンビームは、同一のイオンビームであり、プロセッサ１４０は、濃縮される消化されたサンプルに適用される第２のタンデム質量分析実験においてステップ（ｖ）−（ｉｘ）およびステップ（ｘ）−（ｘｉｉｉ）を実施する。

種々の実施形態では、図９のステップ９２０を参照すると、第１のイオンビームおよび第２のイオンビームは、同一のイオンビームであり、プロセッサ１４０は、サンプルに適用される同一のタンデム質量分析実験においてステップ（ｉ）−（ｉｖ）およびステップ（ｖ）−（ｉｘ）を実施する。

糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法
図１５は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法１５００である。

方法１５００のステップ１５１０では、タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の質量単離デバイスが、プロセッサを使用して、第１のイオンビームから少なくとも１つの前駆イオンを選択するように命令される。第１のイオンビームは、プロテアーゼを使用して消化されたサンプルを受容およびイオン化するように適合される、イオン源デバイスによって生成される。

ステップ１５２０では、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように適合される、ＭＳ／ＭＳの第１の断片化デバイスが、プロセッサを使用して、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように命令される。

ステップ１５３０では、ＭＳ／ＭＳの質量分析器が、プロセッサを使用して、複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第１のＣＩＤスペクトルを生成するように命令される。

ステップ１５４０では、１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストが、プロセッサを使用して、第１のＣＩＤスペクトルから決定される。

ステップ１５５０では、質量単離デバイスは、プロセッサを使用して、サンプルからイオン源デバイスによって生成される第２のイオンビームから、少なくとも１つの前駆イオンを再び選択するように命令される。

ステップ１５６０では、電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して、第２のイオンビームから選択された前駆イオンを断片化するように適合される、ＭＳ／ＭＳの第２の断片化デバイスが、プロセッサを使用して、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＥｘＤ生成イオンを生成するように命令される。

ステップ１５７０では、質量分析器は、プロセッサを使用して、複数のＥｘＤ生成イオンを質量分析し、ＥｘＤスペクトルを生成するように命令される。

ステップ１５８０では、リストの候補配列毎に、配列は、ｃおよびｚ断片ルールを使用して、計算的に断片化され、複数の理論的断片を生成し、質量対電荷比（ｍ／ｚ）値が、複数の理論的断片に関して計算され、配列は、プロセッサを使用してスコア化される。配列は、
（ｃ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、配列のスコアを増分するステップと、
（ｄ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｃ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｄ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分するステップと、
によって、スコア化される。

ステップ１５８０では、最高スコアを伴うリストの候補配列が、プロセッサを使用して、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列として識別される。

糖ペプチドのペプチド配列を識別するためのコンピュータプログラム製品
種々の実施形態では、コンピュータプログラム製品は、そのコンテンツが、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法を実施するように、プロセッサ上で実行されている命令を伴うプログラムを含む、非一過性の有形コンピュータ可読記憶媒体を含む。本方法は、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを含む、システムによって実施される。

図１６は、種々の実施形態による、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法を実施する、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを含むシステム１６００の概略図である。システム１６００は、制御モジュール１６１０と、分析モジュール１６２０とを含む。

制御モジュール１６１０は、第１のイオンビームから少なくとも１つの前駆イオンを選択するようにタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の質量単離デバイスに命令する。イオンビームは、プロテアーゼを使用して消化されたサンプルを受容およびイオン化するように適合される、イオン源デバイスによって生成される。制御モジュール１６１０は、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように適合されるＭＳ／ＭＳの第１の断片化デバイスに命令する。制御モジュール１６１０は、複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第１のＣＩＤスペクトルを生成するようにＭＳ／ＭＳの質量分析器に命令する。

分析モジュール１６２０は、第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを決定する。

制御モジュール１６１０は、サンプルからイオン源デバイスによって生成される第２のイオンビームから、少なくとも１つの前駆イオンを再び選択するように質量単離デバイスに命令する。制御モジュール１６１０は、少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＥｘＤ生成イオンを生成するように、電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して、第２のイオンビームから選択された前駆イオンを断片化するように適合されるＭＳ／ＭＳの第２の断片化デバイスに命令する。制御モジュール１６１０は、複数のＥｘＤ生成イオンを質量分析し、ＥｘＤスペクトルを生成するように質量分析器に命令する。

リストの候補配列毎に、分析モジュール１６２０は、ｃおよびｚ断片ルールを使用して、配列を計算的に断片化し、複数の理論的断片を生成し、複数の理論的断片に関して質量対電荷比（ｍ／ｚ）値を計算し、分析モジュール１６２０は、配列をスコア化する。分析モジュール１６２０は、
（ａ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、配列のスコアを増分するステップと、
（ｂ）配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｃ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分しないステップと、
（ｄ）配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する、ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、スコアを増分するステップと、
によって、配列をスコア化する。

分析モジュール１６２０は、最高スコアを伴うリストの候補配列を、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列として識別する。

本教示は、種々の実施形態と併せて説明されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されない。対照的に、本教示は、当業者によって理解されるであろうように、種々の代替物、修正、および均等物を包含する。

さらに、種々の実施形態を説明する際に、本明細書は、ステップの特定のシーケンスとして、方法および／またはプロセスを提示している場合がある。しかしながら、方法またはプロセスが本明細書に記載されるステップの特定の順序に依拠しない限りにおいて、方法またはプロセスは、説明されるステップの特定のシーケンスに限定されるべきではない。当業者が理解するであろうように、ステップの他のシーケンスも、可能であり得る。したがって、本明細書に記載されるステップの特定の順序は、請求項上の限定として解釈されるべきではない。加えて、方法および／またはプロセスを対象とする請求項は、書かれる順序でのそれらのステップの実施に限定されるべきではなく、当業者は、シーケンスが変動され、依然として、種々の実施形態の精神および範囲内に留まり得ることを容易に理解することができる。

Claims (21)

1. タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するためのシステムであって、
   イオン源デバイスであって、前記イオン源デバイスは、プロテアーゼを使用して消化されたサンプルを受容およびイオン化し、イオンビームを生成するように適合される、イオン源デバイスと、
   タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の質量単離デバイスであって、前記質量単離デバイスは、前記イオン源デバイスのイオンビームから前駆イオンを選択するように適合される、質量単離デバイスと、
   前記ＭＳ／ＭＳの第１の断片化デバイスであって、前記第１の断片化デバイスは、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように、かつ生成イオンを生成するように適合される、第１の断片化デバイスと、
   前記ＭＳ／ＭＳの第２の断片化デバイスであって、前記第２の断片化デバイスは、電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように、かつ生成イオンを生成するように適合される、第２の断片化デバイスと、
   前記ＭＳ／ＭＳの質量分析器であって、前記質量分析器は、前記第１または第２の断片化デバイスから生成イオンを質量分析し、生成イオンスペクトルを生成するように適合される、質量分析器と、
   前記タンデム質量分析計と通信するプロセッサであって、
   （ｉ）第１のイオンビームから少なくとも１つの前駆イオンを選択するように前記質量単離デバイスに命令することと、
   （ｉｉ）前記少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように前記第１の断片化デバイスに命令することと、
   （ｉｉｉ）前記複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第１のＣＩＤスペクトルを生成するように前記質量分析器に命令することと、
   （ｉｖ）前記第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを決定することと、
   （ｖ）前記サンプルから前記イオン源デバイスによって生成される第２のイオンビームから、前記少なくとも１つの前駆イオンを再び選択するように前記質量単離デバイスに命令することと、
   （ｖｉ）前記少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＥｘＤ生成イオンを生成するように前記第２の断片化デバイスに命令することと、
   （ｖｉｉ）前記複数のＥｘＤ生成イオンを質量分析し、ＥｘＤスペクトルを生成するように前記質量分析器に命令することと、
   （ｖｉｉｉ）前記リストの候補配列毎に、ｃおよびｚ断片ルールを使用して、前記配列を計算的に断片化し、複数の理論的断片を生成し、前記複数の理論的断片に関して質量対電荷比（ｍ／ｚ）値を計算し、
   （ｅ）前記配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記配列のスコアを増分することと、
   （ｆ）前記配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分しないことと、
   （ｇ）前記配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分しないことと、
   （ｈ）前記配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分することと
   によって、前記配列をスコア化することと、
   （ｉｘ）最高スコアを伴う前記リストの候補配列を、前記サンプルの糖ペプチドのペプチド配列として識別することと
   を行う、プロセッサと
   を備える、システム。
2. グリカン修飾部位のコンセンサス配列は、Ｏグリカンコンセンサス配列ＳまたはＴ、または、Ｎグリカンコンセンサス配列ＮｘＴまたはＮｘＳを含み、ｘ≠Ｐであり、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｎ＝アスパラギン、およびＰ＝プロリンである、請求項１に記載のシステム。
3. 前記プロセッサは、
   前記第１のＣＩＤスペクトルを使用して、タンパク質データベースを検索し、タンパク質のリストを生成することと、
   前記プロテアーゼの開裂ルールを使用して、前記タンパク質リストのうちの各タンパク質を計算的に消化し、理論的ペプチド配列のリストを生成することと、
   グリカン修飾部位のコンセンサス配列を含む前記ペプチド配列リストから各理論的糖ペプチド配列を選択し、前記１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを生成することと
   によって、前記第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを決定する、請求項１に記載のシステム。
4. 分離デバイスであって、経時的に前記消化されたサンプルのペプチドを分離し、前記分離されたペプチドを前記イオン源デバイスに導入するように適合される、分離デバイス
   をさらに備え、前記プロセッサはさらに、
   複数の時間ステップにおいて前駆イオンの質量範囲を選択するように前記質量単離デバイスに命令することと、
   前記複数の時間ステップにおいて前記前駆イオンの質量範囲を質量分析し、前記前駆イオンの質量範囲の前駆イオン毎に、経時的に前駆イオンｍ／ｚ、電荷、および強度値のクロマトグラムを生成するように前記質量分析器に命令することと、
   前記クロマトグラムから前記少なくとも１つの前駆イオンを選択することであって、前記少なくとも１つの前駆イオンのｍ／ｚ、電荷、および強度値は、前記クロマトグラムから把握される、ことと
   を行う、請求項１に記載のシステム。
5. 前記プロセッサはさらに、前記少なくとも１つの前駆イオンのｍ／ｚおよび電荷から見出される前記少なくとも１つの前駆イオンの実験質量から、前記識別された候補配列の理論的に計算された質量を減算することによって、翻訳後修飾（ＰＴＭ）質量を計算する、請求項４に記載のシステム。
6. 前記プロセッサはさらに、最高スコアを伴う前記識別された候補配列の正当性を立証し、前記立証することは、
   前記ＰＴＭ質量を前記識別された候補配列の１つ以上のコンセンサス配列グリカン修飾部位のそれぞれに追加し、１つ以上の修飾候補配列を生成し、前記１つ以上の修飾候補配列のそれぞれを理論的に断片化することと、
   前記１つ以上の修飾候補配列のそれぞれをスコア化することであって、前記スコア化することは、
   （ｃ）配列全体からのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記配列のスコアを増分することと、
   （ｄ）配列全体からのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記配列のスコアを増分することと
   による、ことと、
   修飾候補配列のスコアが、前記識別された候補配列のスコアを超える場合に、前記識別された候補配列の正当性を立証することと
   による、請求項５に記載のシステム。
7. 修飾候補配列のスコアが、前記識別された候補配列のスコアを超える場合、前記プロセッサは、前記修飾候補配列の修飾部位を前記識別された候補配列の修飾部位として識別する、請求項６に記載のシステム。
8. 前記プロセッサはさらに、前記ＰＴＭ質量を使用して、グリカン構造およびそれらの質量のデータベースを検索することによって、前記サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定する、請求項５に記載のシステム。
9. 前記プロセッサはさらに、グリカン構造およびそれらの質量のデータベースを検索し、前記ＰＴＭ質量を各グリカン構造の各質量と比較し、前記第１のCIDスペクトルのグリカン断片を各グリカン構造のサブユニットと比較することによって、前記サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定する、請求項５に記載のシステム。
10. 前記プロセッサはさらに、前記ＰＴＭ質量を構成糖のリストの任意の組み合わせの質量と比較することによって、前記サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定する、請求項５に記載のシステム。
11. 前記構成糖のリストは、Ｇａｌ、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡＣ、ＧａｌＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、およびＮｅｕ５Ａｃを含むことができる、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記プロセッサは、前記サンプルに適用される第１のタンデム質量分析実験においてステップ（ｉ）−（ｉｖ）、および前記サンプルに適用される第２のタンデム質量分析実験においてステップ（ｖ）−（ｉｘ）を実施する、請求項１に記載のシステム。
13. 前記プロセッサはさらに、
    前記第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上のグリカン断片を識別し、グリカン断片を含むため、ＥｘＤ分析のために前記少なくとも１つの前駆イオンを前駆イオン包含リストに追加することと、
    前記包含リストから前記第２のタンデム質量分析実験における厳選した前駆イオンのみを選択するように前記質量単離デバイスに命令することと
    を行う、請求項１２に記載のシステム。
14. グリコシル化ペプチド濃縮方法がさらに、前記第２のタンデム質量分析実験の前に前記消化されたサンプルに適用され、濃縮される消化されたサンプルを生成し、前記第２のタンデム質量分析実験は、前記濃縮される消化されたサンプルを使用して実施される、請求項１２に記載のシステム。
15. 前記グリコシル化ペプチド濃縮は、レクチンカラムを使用して適用される、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記プロセッサはさらに、
    （ｘ）第３のイオンビームから同一の少なくとも１つの前駆イオンを選択するように前記質量単離デバイスに命令することと、
    （ｘｉ）前記少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、第２の複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように前記第１の断片化デバイスに命令することと、
    （ｘｉｉ）前記第２の複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第２のＣＩＤスペクトルを生成するように前記質量分析器に命令することと、
    （ｘｉｉｉ）グリカン構造およびそれらの質量のデータベースを検索し、前記第２のＣＩＤスペクトルのグリカン断片を各グリカン断片のサブユニットと比較することによって、前記サンプルの糖ペプチドのグリカン構造を決定することと
    を行う、請求項１４に記載のシステム。
17. 前記プロセッサは、前記濃縮される消化されたサンプルに適用される第３のタンデム質量分析実験においてステップ（ｘ）−（ｘｉｉｉ）を実施する、請求項１６に記載のシステム。
18. 前記第２のイオンビームおよび前記第３のイオンビームは、同一のイオンビームであり、前記プロセッサは、前記濃縮される消化されたサンプルに適用される前記第２のタンデム質量分析実験においてステップ（ｖ）−（ｉｘ）およびステップ（ｘ）−（ｘｉｉｉ）を実施する、請求項１６に記載のシステム。
19. 前記第１のイオンビームおよび前記第２のイオンビームは、同一のイオンビームであり、前記プロセッサは、前記サンプルに適用される同一のタンデム質量分析実験においてステップ（ｉ）−（ｉｖ）およびステップ（ｖ）−（ｉｘ）を実施する、請求項１に記載のシステム。
20. タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法であって、
    プロセッサを使用して、第１のイオンビームから少なくとも１つの前駆イオンを選択するようにタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の質量単離デバイスに命令することであって、前記第１のイオンビームは、プロテアーゼを使用して消化されたサンプルを受容およびイオン化するように適合されるイオン源デバイスによって生成される、ことと、
    前記プロセッサを使用して、前記少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように適合される前記ＭＳ／ＭＳの第１の断片化デバイスに命令することと、
    前記プロセッサを使用して、前記複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第１のＣＩＤスペクトルを生成するように前記ＭＳ／ＭＳの質量分析器に命令することと、
    前記プロセッサを使用して、前記第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを決定することと、
    前記プロセッサを使用して、前記サンプルから前記イオン源デバイスによって生成される第２のイオンビームから、前記少なくとも１つの前駆イオンを再び選択するように前記質量単離デバイスに命令することと、
    前記プロセッサを使用して、前記少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＥｘＤ生成イオンを生成するように、電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して、前記第２のイオンビームから選択された前駆イオンを断片化するように適合される前記ＭＳ／ＭＳの第２の断片化デバイスに命令することと、
    前記プロセッサを使用して、前記複数のＥｘＤ生成イオンを質量分析し、ＥｘＤスペクトルを生成するように前記質量分析器に命令することと、
    前記リストの候補配列毎に、前記プロセッサを使用して、ｃおよびｚ断片ルールを使用して、前記配列を計算的に断片化し、複数の理論的断片を生成し、前記複数の理論的断片に関して質量対電荷比（ｍ／ｚ）値を計算し、
    （ａ）前記配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記配列のスコアを増分することと、
    （ｂ）前記配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分しないことと、
    （ｃ）前記配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分しないことと、
    （ｄ）前記配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分することと
    によって、前記配列をスコア化することと、
    前記プロセッサを使用して、最高スコアを伴う前記リストの候補配列を、前記サンプルの糖ペプチドのペプチド配列として識別することと
    を含む、方法。
21. コンピュータプログラム製品であって、前記コンピュータプログラム製品は、非一過性の有形コンピュータ可読記憶媒体を備え、前記非一過性の有形コンピュータ可読記憶媒体は、そのコンテンツが、命令を伴うプログラムを含み、前記命令は、タンデム質量分析計を動作させ、サンプルの糖ペプチドのペプチド配列を識別するための方法を実施するように、プロセッサ上で実行され、
    システムを提供することであって、前記システムは、１つ以上の明確に異なるソフトウェアモジュールを備え、前記明確に異なるソフトウェアモジュールは、制御モジュールと、分析モジュールとを備える、ことと、
    前記制御モジュールを使用して、第１のイオンビームから少なくとも１つの前駆イオンを選択するようにタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）の質量単離デバイスに命令することであって、前記イオンビームは、プロテアーゼを使用して消化されたサンプルを受容およびイオン化するように適合されるイオン源デバイスによって生成される、ことと、
    前記制御モジュールを使用して、前記少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＣＩＤ生成イオンを生成するように、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を使用して、選択された前駆イオンを断片化するように適合される前記ＭＳ／ＭＳの第１の断片化デバイスに命令することと、
    前記制御モジュールを使用して、前記複数のＣＩＤ生成イオンを質量分析し、第１のＣＩＤスペクトルを生成するように前記ＭＳ／ＭＳの質量分析器に命令することと、
    前記分析モジュールを使用して、前記第１のＣＩＤスペクトルから１つ以上の理論的候補糖ペプチド配列のリストを決定することと、
    前記制御モジュールを使用して、前記サンプルから前記イオン源デバイスによって生成される第２のイオンビームから、前記少なくとも１つの前駆イオンを再び選択するように前記質量単離デバイスに命令することと、
    前記制御モジュールを使用して、前記少なくとも１つの前駆イオンを断片化し、複数のＥｘＤ生成イオンを生成するように、電子ベースの解離（ＥｘＤ）を使用して、前記第２のイオンビームから選択された前駆イオンを断片化するように適合される前記ＭＳ／ＭＳの第２の断片化デバイスに命令することと、
    前記制御モジュールを使用して、前記複数のＥｘＤ生成イオンを質量分析し、ＥｘＤスペクトルを生成するように前記質量分析器に命令することと、
    前記リストの候補配列毎に、前記分析モジュールを使用して、ｃおよびｚ断片ルールを使用して、前記配列を計算的に断片化し、複数の理論的断片を生成し、前記複数の理論的断片に関して質量対電荷比（ｍ／ｚ）値を計算し、
    （ａ）前記配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記配列のスコアを増分することと、
    （ｂ）前記配列のＮ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分しないことと、
    （ｃ）前記配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｃ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分しないことと、
    （ｄ）前記配列のＣ末端側からグリカン修飾部位のコンセンサス配列までの前記複数の理論的断片のうちのｚ断片のｍ／ｚ値に合致する前記ＥｘＤスペクトルの生成イオンピークのｍ／ｚ値毎に、前記スコアを増分することと
    によって、前記配列をスコア化することと、
    前記分析モジュールを使用して、最高スコアを伴う前記リストの候補配列を、前記サンプルの糖ペプチドのペプチド配列として識別することと
    を含む、コンピュータプログラム製品。

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