JP2021518847A - アマニチン類抗体複合物 - Google Patents

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Abstract

二環式オクタペプチド系誘導体は、特殊な化学構造により対応する標的結合基に結合し、その構造は血漿中で安定するが、特定の生物学的環境中で有効成分の薬物に分解されることにより、標的細胞に対する殺傷性を最大化し、非標的細胞に対する有毒な副作用を最小化することができ、多種類の悪性腫瘍の治療に適用できる。【選択図】 図１

Description

本発明は、バイオ医薬品の技術分野に属し、具体的には、アマニチン類抗体複合物に関する。
アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）は、劇毒キノコから分離されたアマトキシンの一種であり、８つのアミノ酸から構成される二環式ペプチドである。分離精製された天然アマニチンには、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン（ａｍａｎｉｎ）、アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）、アマヌリン（ａｍａｎｕｌｌｉｎ）、アマヌリン酸（ａｍａｎｕｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）およびプロアマヌリン（ｐｒｏａｍａｎｕｌｌｉｎ）の９種類がある。そのうち、α−アマニチンおよびβ−アマニチンは死亡を引き起こす主な毒素である。アマニチンは、遅効性毒素であり、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写を阻害し、タンパク質欠失および細胞死を引き起こすことができる。このような毒素は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する阻害性が極めて高く、ＫＤが３ｎＭに達することができ、消化管の腸肝循環により繰り返し体内に吸収され、人体の肝臓、腎臓、心臓、肺などの臓器に継続的で深刻な損傷を引き起こす。
アマニチンは大きな生体分子担体（例えば、抗体分子）と結合した後、その毒性が大幅に低下するかまたは無毒になる。特定の生理的環境において生体分子担体が切除された後にのみ、アマニチンはその細胞毒性を示す。
近年、世界のいくつかの研究機関と企業はアマニチン分子の構造を改造して薬用価値を有する抗体−毒素複合体を製造している。例えば、ドイツのハイデルベルク製薬株式会社は、天然アマニチン分子の１−位、３−δ−位または６'−フェノール性水酸基をリンカーを介してモノクローナル抗体に結合する方法を研究した。米国のＡｇｅｎｓｙｓ社は、α−アマニチンのインドール環上のフェニル基の構造を修飾し、６'−フェノール性水酸基または７'−位でリンカーを介して抗体に結合する方法を研究した。杭州多禧生物科技有限公司は、アマニチン誘導体の５'−、７'−位を硝化してアミド構造を有するリンカーを形成し、抗体に結合する方法を研究した。韓国Ｌｅｇ℃ｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社は、６'−フェノール性水酸基および３−δ−位でリンカーを介して抗体に結合する方法を研究した。以上の合成方法において、６'−フェノール性水酸基でリンカーを導入する方法には、アマニチン分子の他の部位のヒドロキシル基に対して多段階の保護および脱保護を行う必要があり、合成経路が複雑で、ベンゼン環上の５'−、７'−位の置換反応は位置が確定しないので、製品の分離が困難で、収率が低い問題がある。
上述した従来技術に鑑み、血液循環システムにおいて安定し、標的細胞によりエンドサイトーシスされた後に切断され、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であるアマニチン誘導体を放出し、真核生物ｍＲＮＡの合成に対する特異的阻害により細胞に対する強い毒性を生じる二環式オクタペプチド類アマニチン誘導体と生体高分子との複合体を提供することを目的とする。
本発明によれば、構造式（Ｉ）の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩が提供される。
Figure 2021518847
式中、ｎ＝０、１または２であり、
Ｒ１は−Ｈまたは−ＯＨであり、
Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨであり、
Ｒ３は−Ｈ、−ＯＨまたはＣ１−６アルキル基であり、
Ｒ４は−ＮＨ２または−ＯＨであり、
Ｒ５は−Ｌ−Ａであり、
Ａは標的部位に結合される生体高分子部分であり、
Ｌはアマニチン誘導体および生体高分子に結合される任意の化学構造である。
好ましくは、前記Ｌの化学構造には、切断可能な構造または切断不可能な構造が含まれる。
好ましくは、前記Ａは、抗体またはその抗原結合断片、抗原結合ポリペプチドを含む。
好ましくは、前記Ｌと標的結合生物分子Ａとの結合箇所は、
Figure 2021518847
 を含む。
好ましくは、前記Ｌはエステルまたはエーテルにより毒素に結合される。
本発明によれば、前記毒素複合体またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含む薬物組成物がさらに提供される。
本発明によれば、抗腫瘍薬または抗がん薬の製造における前記毒素複合体またはその薬学的に許容される塩の使用がさらに提供される。
さらに、前記抗腫瘍薬または抗がん薬は、抗肺がん薬、抗腎臓がん薬、抗尿道がん薬、抗結腸直腸がん薬、抗前立腺がん薬、抗神経膠腫薬、抗卵巣がん薬、抗膵がん薬、抗乳がん薬、抗黒色腫薬、抗肝がん薬、抗膀胱がん治療薬、抗悪性リンパ腫薬、抗白血病薬、抗胃がん薬または抗食道がん薬である。
定義
この技術分野の標準的な慣行によれば、化学式および表に用いる符号
Figure 2021518847
 は、部分または置換基として化合物構造の核心または核の結合部位との結合を示す。
この技術分野の標準的な慣行によれば、本発明のヘテロ（原子、アルキル基、アリール基、環式基）とは、炭素原子以外の他の原子を含む化学構造を指す。
略語と符号
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＰｙＢＯＰ：ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム
Ｃｉｔ：シトルリン
ＣＯ２：二酸化炭素
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝液
ＤＴＰＡ：ジエチルトリアミン五酢酸
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＡ：酢酸エチル
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ：胎児ウシ血清
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
Ｈ２Ｏ：水
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシルベンゾトリアゾール
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＥＭ：最少必須培地
ＭＴＳ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメチル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾール、内塩
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド
ＰＡＢ：ｐ−アミノベンジルオキシ
ＰＢＳ：リン酸緩衝液
Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ：ピルビン酸ナトリウム
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｖａｌ：バリン
Ｔｒｔ−Ｃｌ：トリフェニルクロロメタン
ＴＢＴＵ：Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシルベンゾトリアゾール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＢＳ−Ｃｌ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン；
ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド
Ｎａ２ＣＯ３：炭酸ナトリウム
ＥＤＣＩ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明において、アマニチンまたはその誘導体分子の２−位プロリンヒドロキシル基からバイオ医薬品に許容される連結構造により抗体分子に結合することにより、血漿中で安定し、無毒であるが、病変細胞内で切断されて毒性分子を放出できる複合体を得ることができる。また、このような結合方法は簡単で効率的であり、このような製品の大規模な工業生産の要求を満足できることが予想外に発見された。
本発明は、二環式オクタペプチド系誘導体を開示する。このような化合物は、特殊な化学構造により対応する標的結合基に結合し、その構造が血漿中で安定するが、特定の生物学的環境中で有効成分の薬物に分解され、標的細胞に対する殺傷性を最大化し、非標的細胞に対する有毒な副作用を最小化することができ、多種類の悪性腫瘍の治療に適用できる。
実施例１３の細胞系ＢＴ４７４中の実験の結果図である。 実施例１３の細胞系ＳＫＢＲ３中の実験の結果図である。 実施例１３の細胞系Ｎ８７中の実験の結果図である。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−１の合成
Figure 2021518847
Figure 2021518847
１）中間体０８の固相合成
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリンプリロード樹脂を出発原料とし、２０％ピペリジン（１ｇ樹脂に２０ｍｌの２０％ピペリジンが添加されている）で保護基Ｆｍｏｃを脱保護した後、ＤＭＦを溶液（２０ｍｌ／ｇ）とし、順にＦｍｏｃ−Ｎ−トリチル−Ｌ−アスパラギン（Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）（３ｅｑ）、ＴＢＴＵ（２．５ｅｑ）、ＨＯＢＴ（１．８ｅｑ）、ＤＩＰＥＡ（６ｅｑ）を加え、室温（２８℃）で２時間反応させた後、ＤＭＦ（毎回１ｇ樹脂あたり２０ｍｌＤＭＦ）で３回洗浄し、さらに上記操作で次のアミノ酸を結合し、完全に結合した後、１％ＴＦＡ（毎回１ｇ樹脂あたり２０ｍｌの１％ＴＦＡ ５ｍｉｎ、３回繰り返し）で樹脂から切断し、回転蒸留により溶液を除去し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加え、撹拌して晶析させ、化合物０８を得た。収率は約５４％、ＨＰＬＣ純度は７６％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１４１７．６１２３。
化合物０９の合成
１０ｇ化合物０８の粗生成物をＴＦＡ（１０ｍｌ／ｇ）で溶解させた後、室温で５時間撹拌しながら反応させ、５０℃でＴＦＡを減圧除去し、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、純粋な化合物０９を約４．３ｇ得た。収率は４３％、純度は９５．６％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７６０．２１４４。
化合物１３の合成
２５０ｍｌの一口フラスコに（４Ｓ）−ヒドロキシルイソロイシン２．９４ｇ、１，４−ジオキサン４０ｍｌ、飽和炭酸ナトリウム溶液を加え、均一に撹拌し、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕをバッチで加え、１０ｍｉｎ後に、引き続き室温で１２時間撹拌しながら反応させ、原料が完全に反応した後、反応液に５０ｍｌ水を加え、５％のクエン酸溶液でＰＨを約４に調整し、酢酸エチルで３回抽出し（毎回５０ｍｌ）、有機層を収集し、飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡黄色油状物を得た。精製せずにそのまま次の反応に供した。収率＞１００％であった。
化合物１４の合成
前記化合物１３の粗生成物を４０ｍｌＤＭＦで溶解させた後、イミダゾール２．６８ｇ（２ｅｑ）を加え、ＴＢＳ−Ｃｌをバッチで加えた後、室温で１２時間撹拌し、原料が完全に反応した後、水５０ｍｌ、酢酸エチル５０ｍｌを加え、撹拌し、有機層を分離し、水層を酢酸エチルで２回抽出し（毎回５０ｍｌ）、有機層を収集し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、淡黄色油状物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＰＥ：ＥＡ＝５：１）により精製し、油状物４．５ｇを得た。二段階収率は約４６．６％であった。
化合物１５の合成
２５０ｍｌ一口フラスコに順に化合物１４、ＨＯＳｕ（１．２３ｇ，１．１５ｅｑ）、ＤＣＣ（２．２３ｇ，１．１５ｅｑ）、ＴＨＦ５０ｍｌを加え、窒素ガスの保護下で、室温で６時間撹拌し、完全に反応した後、水５０ｍｌ、酢酸エチル５０ｍｌを加え、１０ｍｉｎ撹拌した後、有機層を分離し、水層を酢酸エチルで２回抽出し（毎回５０ｍｌ）、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、淡黄色油状物を得た。分取液体クロマトグラフィーにより精製し、白色泡沫状固体約３．２４ｇを得た。収率は６０％であった。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：０．０８（ｓ，６Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），０．９８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．０６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝５．６），１．９５（ｔ，Ｊ＝１０．８），２．８３（ｓ，４Ｈ），４．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，８．０Ｈｚ），４．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ，４Ｈｚ），４．６７〜４．７３（ｍ，１Ｈ），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３４〜７．４６（ｍ，２Ｈ），７．７０〜７．７６（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１２．０），８．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）；ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋５８１．３４。
化合物１０の合成
１８０ｍｇ化合物０９を乾燥ＤＭＦ１．５ｍｌで溶解させた後、化合物１５（８２５ｍｇ，６ｅｑ）、ＤＩＰＥＡ（０．２５ｍｌ，６ｅｑ）を加え、窒素ガスの保護下で、室温で５時間反応させ、ＨＰＬＣにより反応をモニタリングし、原料０９は基本的に完全に反応した。生成物を後処理せずにそのまま次の反応に供することができる。
化合物１１の合成
前記反応液にピペリジン０．３ｍｌを加え、室温で２時間撹拌しながら反応させ、ＨＰＬＣにより原料が完全に反応したことを確認した後、反応を停止させ、分取液体クロマトグラフィー（中性、アセトニトリル／純水系）により精製し、目的ピーク留分を収集し、アセトニトリルを減圧除去した後、凍結乾燥させ、白色粉末状固体１３６ｍｇを得た。二段階収率は約５２％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１００３．５６５４。
化合物１２の合成
１３６ｍｇ化合物１１を乾燥ＤＭＦで溶解させた後、ＥＤＣＩ（１３０ｍｇ，５ｅｑ）、ＨＯＢＴ（３６７ｍｇ，２０ｅｑ）、ＤＩＰＥＡ（０．１２ｍｌ，５ｅｑ）を加え、室温で４時間撹拌した後、ＨＰＬＣにより完全に反応したことを確認した後、分取液体クロマトグラフィー（中性、アセトニトリル／純水系）により精製し、目的ピーク留分を収集し、アセトニトリルを減圧除去した後、凍結乾燥させ、白色粉末状固体６０ｍｇを得た。収率は約４５％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋９８５．５４２１。
Figure 2021518847
化合物１７の合成
５００ｍｌの丸底フラスコに３０ｇの化合物１６（４９．９２ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）を加え、さらに２４０ｍｌのＤＭＦを加え、撹拌して溶解させた後、２２．７６ｇビス（ｐ−ニトロベンゼン）カーボネート（７４．８７ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）を加え、９．６８ｇのＤＩＰＥＡ（７４．８７ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）を滴下し、室温で１．５時間撹拌しながら反応させ、ＴＬＣにより原料が完全に反応したことを確認した後、反応を停止させた。後処理：激しく撹拌しながら反応フラスコにイソプロピルエーテル１．５Ｌを加え、２時間撹拌した後、上層液体を除去し、残留物に８００ｍｌイソプロピルエーテルを加え、引き続き１時間激しく撹拌し、吸引濾過し、濾過ケーキを６００ｍｌのイソプロピルエーテルに入れ、一晩撹拌した後、吸引濾過し、黄土色粉末状固体３１．２ｇを得た。収率は８１．６％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７６７．６２。
化合物１８の合成
５００ｍｌの一口フラスコに３１．２ｇの化合物１７（４０．７３ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）を加え、さらに１５０ｍｌのＤＭＦを加え、撹拌して溶解させ、５０ｍｌのＤＭＦで溶解した８．１ｇメチル（２−（メチルアミノ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３６．６６ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）を加え、室温で３．５時間撹拌しながら反応させ、ＴＬＣにより化合物１７が完全に反応したことを確認した後、反応を停止させた。後処理：反応液に２Ｌイソプロピルエーテルを加え、撹拌し、フラスコ壁に粘稠な油状物が析出した後、上清液を除去し、１Ｌのイソプロピルエーテルを加え、激しく撹拌し、再度上清液を除去し、５００ｍｌのイソプロピルエーテルを加え、一晩撹拌し、吸引濾過し、２７．２ｇ黄土色粉末状固体を得た。収率は８１．９％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８１６．７３。
化合物１９の合成
５００ｍｌの丸底フラスコに２０ｇ化合物１８（２４．５３ｍｍｏｌ）を加え、さらに１００ｍｌのＤＭＦを加えて溶解させ、氷浴で１０分間内で２０ｍｌジエチルアミンを滴下し、その後、室温で２時間撹拌しながら反応させ、ＴＬＣにより原料化合物１８が完全に反応したことを確認した後、反応を停止させた。後処理：減圧濃縮してＤＭＦおよびジエチルアミンを除去し、使用まで保存した。製品を精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物２０の合成
５００ｍｌの丸底フラスコに１５０ｍｌのＤＭＦを加え、前のステップで得られた化合物１９の粗生成物を溶解し、さらに１１．７ｇの６−マレイミドヘキサン酸スクシンイミジル（３７．９８ｍｍｏｌ，１．５５ｅｑ）を加え、次いで８．４ｍｌのＤＩＥＡ（５０．６３ｍｍｏｌ，２．０６ｅｑ）を滴下し、その後、室温で２時間撹拌しながら反応させ、ＴＬＣにより原料化合物１９が完全に反応したことを確認した後、反応を停止させた。後処理：反応液に１．５Ｌイソプロピルエーテルを加え、撹拌して晶析させ、固体およびフラスコ壁に付着した類油状粘稠物が析出した後、上清液を除去し、さらに５００ｍｌメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルおよび５００ｍｌｍｌイソプロピルエーテルを加え、それぞれ１回撹拌しながら洗浄し、吸引濾過し、濾過ケーキを４５℃の真空乾燥オーブン中で減圧乾燥させ、２０ｇ黄土色粉末状固体の粗生成物を得た。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７８７．６３。
化合物２１の合成
０．４ｇ化合物２０を２ｍｌの５０％ＴＦＡジクロロメタン溶液で溶解させた後、室温下で２時間撹拌し、ＴＬＣにより完全に反応したことを確認した後、回転蒸留により溶液を除去し、使用まで保存し、精製せずにそのまま次の反応に供した。
Figure 2021518847
化合物２２の合成
２０ｍＬ褐色フラスコに１００ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）化合物１２、ビス（ｐ−ニトロベンゼン）カーボネート３０４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ，１０ｅｑ）、ＤＭＦ ３ｍＬを加え、完全に溶解した後、ＤＩＰＥＡ（２６０ｍｇ，２０ｅｑ）を加え、Ｎ２保護下で２８℃に昇温して２４時間反応させ、ＨＰＬＣにより反応をモニタリングし、原料０１２、ＮＰＣが完全に反応した後、粗生成物を処理せずにそのまま次の反応に供した。
化合物２３の合成
化合物２２の反応液に化合物２１の粗生成物を加え、適量のＤＩＰＥＡを加え、反応液をＰＨ８〜９に保持し、窒素ガスの保護下で、室温で３時間撹拌し、ＨＰＬＣにより完全に反応したことを確認した後、分取液体クロマトグラフィーにより目的製品を精製し、淡黄色固体３０ｍｇを得た。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１６９７．９１５０。
化合物ａｍａ−１の合成
４ｍＬ褐色フラスコに１５ｍｇ化合物２３を加え、１ｍｌの５％ＴＦＡ／ＭｅＯＨを加えて溶解させ、窒素ガスの保護下で、２８℃に昇温し１時間させ、ＨＰＬＣ（純水）により原料２３が完全に反応したことを確認した後、溶媒を窒素パージして乾燥させた後、セミ分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル濃度：約３５％）により精製し、凍結乾燥させ、白色固体１１ｍｇを得た。収率Ｙ＝４２％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５８３．７５３２。
実施例２：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−２の合成
Figure 2021518847
ａｍａ−１約６ｍｇをジクロロメタンで溶解させた後、１．０ｅｑのｍＣＰＢＡのジクロロメタン溶液（０．０５ｇ／μｌ）１３ｍｌを加え、室温で２時間撹拌し、ＨＰＬＣにより原料が完全に反応したことを確認した後、分取ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させ、白色粉末状固体約３ｍｇを得た。収率は４９．５％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５９９．８４５０。
実施例３：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−３の合成
Figure 2021518847
 化合物２４の合成：化合物０９の合成を参照し、白色固体約１．２ｇを得た。収率は２５．７％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋７９０．４２５４。
化合物２５の合成：文献Ｌｉａｎｇ Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｍａｎｉｔｉｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．ＣｈｅｍＢｉｏｎｃｈｅｍ ２０１５，１６，１４２０−１４２５に記載の方法により合成した。
化合物２６の合成：化合物１０の合成方法を参照し、化合物２４を３００ｍｇ投入し、精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物２７の合成：化合物１１の合成方法を参照し、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥させ、白色固体１９５ｍｇを得た。２段階の総収率は４４．１％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１６３．６３４１。
化合物２８の合成：化合物１２の合成方法を参照し、化合物２７を１５０ｍｇ投入し、目的化合物である白色固体約９６ｍｇを得た。収率は６５％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１４５．６１２４。
化合物２９の合成：化合物２２の合成を参照し、化合物２８を８０ｍｇ投入し、主な点が明らかであることを確認した後、精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物３０の合成：化合物２３の合成を参照し、分取精製した後、淡黄色固体約５９ｍｇを得た。収率は４５．４％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１８５７．９８１３。
化合物ａｍａ−３の合成：化合物ａｍａ−１の合成を参照し、化合物３０を４０ｍｇ投入し、分取精製した後、淡黄色固体約８．４ｍｇを得た。収率は２４％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１６２９．８０２１。
実施例４：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−４の合成
Figure 2021518847
 化合物３０の合成
化合物２９（そこに、化合物２８を５００ｍｇまで新たに累積し、今回１３０ｍｇ投入し、精製せず、収率１００％で計算）の反応液に４９ｍｇのＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１，６−ジアミノヘキサン（２ｅｑ）を加え、適量のＤＩＰＥＡを滴下し、溶液ｐＨを８〜９に保持し、窒素ガスの保護下で、室温で４時間撹拌し、ＨＰＬＣにより化合物２９が完全に反応したことを確認した後、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、目的ピーク留分を収集し、有機溶媒を回転蒸留により除去した後、凍結乾燥させ、白色固体約８３．４ｍｇを得た。収率は約５３％であった。［Ｍ＋Ｈ］＋１３８７．７５４１。
化合物３１の合成
８０ｍｇ化合物３０を１ｍｌの２０％ＴＦＡのジクロロメタン溶液で溶解させた後、窒素ガスの保護下で、室温で２時間撹拌し、ＨＰＬＣにより化合物３０が完全に反応したことを確認した後、有機溶媒を減圧回転蒸留により除去し、使用まで保存した。
化合物３２の合成
化合物３１の粗生成物をＤＭＦ ２ｍＬで溶解させた後、ＤＩＰＥＡでｐＨを８〜９に調節し、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル３８ｍｇ（２ｅｑ）を加え、窒素ガスの保護下で、室温で６時間撹拌し、ＨＰＬＣにより化合物３０が完全に反応したことを確認した後、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、目的ピーク留分を収集し、有機溶媒を回転蒸留により除去した後、凍結乾燥させ、白色固体約４６ｍｇを得た。収率は５４％であった。［Ｍ＋Ｈ］＋１４８０．７８４１。
化合物ａｍａ−４の合成
化合物ａｍａ−３の合成を参照し、化合物３２を４４ｍｇ投入し、凍結乾燥させ、目的化合物２１ｍｇを得た。収率は５６．４％であった。［Ｍ＋Ｈ］＋１１５２．５４３１。
実施例５：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−５の合成
Figure 2021518847
１２ｍｇのａｍａ−４をジクロロメタンで溶解させた後、５．０ｅｑのｍＣＰＢＡのジクロロメタン溶液（０．０５ｇ／ｍｌ）１６５μｌを加え、室温で２時間撹拌し、ＨＰＬＣにより原料が完全に反応したことを確認した後、分取ＨＰＬＣにより分取精製し、凍結乾燥させ、黄色粉末状固体約４ｍｇを得た。収率は３２．９％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２６８．５８２１。
実施例６低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−６の合成
Figure 2021518847
化合物３３の合成：化合物１０の合成を参照し、化合物０９を３００ｍｇ投入し、精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物３４の合成：化合物１１の合成を参照し、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥させ、白色固体約２４８．９ｍｇを得た。収率は５５．６％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１３３．６３４８。
化合物３５の合成：化合物１２の合成を参照し、原料３４を２２０ｍｇ投入し、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥させ、白色固体約１３７．３ｍｇを得た。収率は６３．４％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１１１５．６１４７．
化合物３６の合成：化合物２２の合成を参照し、原料３５を１２０ｍｇ投入し、精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物３７の合成：化合物２３の合成を参照し、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、有機相を回転蒸留により除去し、凍結乾燥させ、白色固体約１１２．４ｍｇを得た。収率は：５７．１％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１８２７．９８５７．
化合物ａｍａ−６の合成：化合物ａｍａ−１の合成を参照し、化合物３７を２０ｍｇ投入し、分取精製した後、凍結乾燥させ、淡黄色固体約７ｍｇを得た。収率は４０％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１５９９．８３２４。
実施例７：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−７の合成
Figure 2021518847
 化合物３８の合成：化合物０７の合成を参照し、そのｌｏａｄｉｎｇを計算した結果、約０．３２ｍｍｏｌ／ｇであった。
化合物３９の合成：化合物０８の合成を参照し、回転蒸留により乾燥させ、褐色油状物を得た。精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物４０の合成：化合物０９の合成を参照し、分取精製し、凍結乾燥させ、淡黄色固体約５２６．４ｍｇを得た。収率は、化合物３８の計算量から約３４％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋８６６．３５１２。
化合物４１の合成：化合物１０の合成を参照し、化合物４０を５００ｍｇ投入し、目的ピーク留分を凍結乾燥させ、類白色固体約５３１．６ｍｇを得た。収率は約６３％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１４６１．６６２４。
化合物４２の合成：化合物１１の合成を参照し、化合物４１を５２５ｍｇ投入し、分取精製し、目的ピーク留分を収集し、凍結乾燥させ、淡黄色固体約３６８．５ｍｇを得た。収率は約８２．８％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２３９．５７６４。
化合物４３の合成：化合物１２の合成を参照し、化合物４２を３５０ｍｇ投入し、凍結乾燥させ、目目的ピーク留分を収集し、淡黄色固体約２２３．４ｍｇを得た。収率約は６４．７％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２２１．５７４８。
化合物４４の合成：化合物２２の合成を参照し、化合物４３を２２０ｍｇ投入し、精製せずにそのまま次の反応に供した。
Figure 2021518847
化合物４５の合成：化合物３０の合成を参照し、分取精製し、凍結乾燥させ、類白色固体約１３０．２ｍｇを得た。収率は約４９．４％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１４６３．７５２４。
化合物４６の合成：化合物４５を約１２５ｍｇ取り、１ｍｌメタノールで溶解させた後、１２．５ｍｇの１０％のＰｄ／Ｃを加え、外部温度４０℃、０．５Ｍｐａで１２時間水素化還元反応させ、ＨＰＬＣにより完全に反応したことを確認した後、Ｐｄ／Ｃを濾過して除去し、濾液を収集し、濃縮し、褐色油状物を得た。精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物４７の合成：化合物４６の粗生成物を１ｍｌの１０％ＴＦＡのジクロロメタン溶液で溶解させた後、窒素ガスの保護下で、室温で１時間撹拌しながら反応させた後、ＨＰＬＣにより完全に反応したことを確認した後、回転蒸留により溶液を除去し、精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物４８の合成：化合物３２の合成を参照し、前のステップの収率が１００％であるとして計算し、分取精製した後、目的ピーク留分を凍結乾燥させ、淡黄色固体約２０．６ｍｇを得た。３段階総収率は約１６％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１４６６．７４３６。
化合物ａｍａ−７の合成：化合物ａｍａ−１の合成を参照し、原料４８を１０ｍｇ投入し、分取精製した後、目的ピーク留分を収集し、凍結乾燥させ、類白色固体約３．２ｍｇを得た。収率は３７．９％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１２３８．６５１２。
実施例８：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−８の合成
Figure 2021518847
化合物４９の合成
α−Ａｍａｎｉｔｉｎ ３０ｍｇを取り、１ｍｌＤＭＦで溶解させた後、９ｍｇ炭酸カリウム（３ｅｑ）を加え、室温で１時間撹拌した後、ヨウ化メチル１３ｕｌ（１０ｅｑ）を加え、室温で１２時間撹拌した後、分取ＨＰＬＣにより分離して精製し、凍結乾燥させ、目的化合物約９．１ｍｇを得た。収率は３０％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋９３３．４０３１。
化合物５０の合成
前記化合物４９を取り、１ｍｌＤＭＦで溶解させた後、炭酸Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジル２５ｍｇ（１０ｅｑ）、トリエチルアミン０．１４ｍｌ（２０ｅｑ）を加え、室温で１２時間撹拌した後、原料が完全に反応した後、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、目的ピーク留分を収集し、凍結乾燥させ、白色固体約５．６ｍｇを得た。収率は５９．９％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋９５９．４５０１。
化合物５１の合成：化合物２２の合成を参照し、前記５．６ｍｇ化合物５０の全部を反応させ、精製せずにそのまま次の反応に供した。
化合物ａｍａ−８の合成：化合物２３の合成を参照し、分取精製した後、凍結乾燥させ、白色固体約３．２ｍｇを得た。収率は３２．８％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１６７１．７２１１。
実施例９：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−９の合成
Figure 2021518847
化合物ａｍａ−８を約２ｍｇ取り、０．５ｍｌジクロロメタンで溶解させた後、０．６ｍｇ（３ｅｑ）ｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）を加え、室温で３時間撹拌しながら反応させた後、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、目的ピーク留分を収集し、凍結乾燥させ、白色固体約０．８ｍｇを得た。収率は３９．６％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１６８７．７１４２。
実施例１０：低分子ｐａｙｌｏａｄ ａｍａ−１０の合成
Figure 2021518847
化合物ａｍａ−６を約４ｍｇ取り、０．５ｍｌジクロロメタンで溶解させた後、０．５ｍｇ（１．２ｅｑ）ｍ−クロロペルオキシ安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）を加え、室温で２時間撹拌しながら反応させた後、分取液体クロマトグラフィーにより精製し、目的ピーク留分を収集し、凍結乾燥させ、白色固体約１．２ｍｇを得た。収率は２９．７％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋１６１５．７３２０。
実施例１１
本実施例では以下の化合物を製造した。
Figure 2021518847
Figure 2021518847
Figure 2021518847
Figure 2021518847
実施例１２：抗体−薬物複合体の製造
１）一般的な結合方法
予備精製されたモノマー比が９５％超えの抗体分子を、限外濾過用遠沈管によりＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）に移す。抗体モル数の１０倍のＴＣＥＰを加え、室温で２時間反応させる。限外濾過用遠沈管によりｐＨ６．５のリン酸緩衝液に移し、抗体モル数の１０倍のＤＨＡＡを加え、室温で２時間反応させた。そして、抗体モル数の３倍のｐａｙｌｏａｄを加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、カットオフ分子量が３０ＫＤａの限外濾過用遠沈管によりＰＢＳに移し、未結合のｐａｙｌｏａｄを除去した。
２）抗体−薬物結合ＤＡＲの検出
モノマー比の検出条件
サンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、注入して分析する。
装置：Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５（２４８９ＵＶ／Ｖｉｓ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ，５μｍ）
移動相Ａ：５０ｍＭ ＰＢ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ａｒｇ，５％ＩＰＡ，ｐＨ６．５
移動相Ａ：３０ｍｉｎイソクラティック溶離，流速：０．７１４ｍｌ／ｍｉｎ，カラム温度２５℃，検出波長：２８０ｎｍ。
ＤＡＲ検出条件
サンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、注入して分析する。
装置：Ｗａｔｅｒｓ Ｈ−ｃｌａｓｓ（ＴＵＶ）
カラム：Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ ＨＩＣＢｕｔｙｌ−ＮＰ５（４．６×３５ｍｍ，５μｍ）
移動相Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム，０．０２５Ｍ無水リン酸ナトリウム，ｐＨ７．０
移動相Ｂ：０．０２５Ｍ無水リン酸ナトリウム，２５％ＩＰＡ，ｐＨ７．０
移動相Ａでカラムを平衡化し、移動相Ａ、Ｂでイソクラティック溶離し、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度２５℃、検出波長：２１４ｎｍ。
Ａ０３０１の構造式は以下の通りである。
Figure 2021518847
３）結果
表１から分かるように、ヒドロキシプロリン部位で結合して得られた抗体複合物は、良好なモノマー比および高ＤＡＲを有する。構造が類似するため、化合物１−化合物１４も良好なモノマー比及び高ＤＡＲを有する。
Figure 2021518847
１）実験材料
細胞：中国科学院細胞バンク
腫瘍細胞培地：Ｇｉｂｃｏ
ＦＢＳ：ＢＩＯＷＥＳＴ
２）培地の調製
増殖培地（１０％ＦＢＳ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）を含有）
検出培地（１％ＦＢＳ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）を含有）
３）操作
生物学的安全キャビネットのＵＶランプを３０ｍｉｎ早くオンにして照射し、その後、換気を３ｍｉｎオンにした。増殖培地、検出培地、Ｄ−ＰＢＳおよびパンクレアチンを３７℃恒温水槽中で予熱し、その後、アルコールで表面を消毒し、生物学的安全キャビネットに置いた。コンフルエンス率が約８０％の細胞を選択し、生物学的安全キャビネットに置き、古い培地を吸い取って除去し、Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、吸引して廃棄し、トリプシンで２〜３ｍｉｎ消化した後、増殖培地に加え、１２００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離した。遠心上清を吸い取り、４ｍｌの検出培地で均一に混合し、１００ｕｌを取ってカウントした（５０ｕｌ細胞液を取り出し、５０ｕｌのＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎを加え、均一に混合した後、カウントした）。所定の細胞数でプレートをコーティングし、８０ｕｌ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、ウェルＥ１１、Ｆ１１、Ｇ１１に８０ｕｌ検出培地のみを加え、周りのウェルに１５０ｕｌのＤＰＢＳを加えた。
抗体溶液の希釈
検出培地を用い、Ｖ型９６ウェルプレートの第１列において初期濃度が５ｕＭのテストソリューション３００ｕｌを調製し、次の第２から１０列にそれぞれ２１０ｕｌの検出培地を加え、均一に混合された第１列から３０ｕｌを取って第２列に加え、ピペットで１０回均一に上下混合し、ピペットチップを廃棄し、次の７つの濃度について順番に操作した。プレートコーティング２４時間後に、１ウェル／２０ｕｌで希釈抗体を加え、対照群を作り、第１１列に２０ｕｌの検出培地のみを加え、各濃度について２回繰り返し、細胞渦発振器で均一に混合した（５５０ｒｐｍ，３ｍｉｎ）。
４）検出
４日後、ＭＴＳ試薬を取り出し、常温、暗所で解凍した後、十分に均一に混合した後、生物学的安全キャビネットに置き、ウェルの側壁に沿って１００μＬ細胞培地あたり２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎ ＭＴＳ試薬を加え、プレート面を軽く叩いてＭＴＳ溶液を均一に混合した後、細胞培養インキュベーターに入れ、暗所で２時間インキュベートした。反応終了後、９６ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダー中でＯＤ４９０ｎｍでの吸光度を測定し、データを記録、整理、記憶した。
５）結果
表２、図１−３に示すように、細胞系ＢＴ４７４／ＳＫＢＲ３／Ｎ８７は優れた抗腫瘍活性を示した。構造が類似するため、化合物１−化合物１４も優れた抗腫瘍活性を有する。
Figure 2021518847
以上、実施例により本発明の実施形態を詳しく説明することにより、如何に本発明の技術手段により技術的問題を解決し、技術的効果を達成するかを十分で明確に説明した。なお、矛盾がない限り、本発明の各実施形態および各実施形態の各特徴は互いに組み合わせることができ、形成される技術的解決策はすべて本発明の保護範囲内に含まれる。

Claims (8)

  1. 構造式（Ｉ）の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩。
    Figure 2021518847
     （式中、ｎ＝０，１または２であり、Ｒ１は−Ｈまたは−ＯＨであり、Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨであり、Ｒ３は−Ｈ、−ＯＨまたはＣ１−６アルキル基であり、Ｒ４は−ＮＨ２または−ＯＨであり、Ｒ５は−Ｌ−Ａであり、Ａは標的部位に結合される生体高分子部分であり、Ｌはアマニチン誘導体および生体高分子に結合される任意の化学構造である。）
  2. 前記Ｌの化学構造には、切断可能または切断不可能な構造が含まれる請求項１に記載の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩。
  3. 前記Ａは、抗体またはその抗原結合断片、抗原結合ポリペプチドを含む請求項１に記載の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩。
  4. 前記Ｌと標的結合生物分子Ａの結合箇所は、
    Figure 2021518847
     の構造を含む請求項１に記載の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩。
  5. 前記Ｌは、エステルまたはエーテルにより毒素に結合される請求項１に記載の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩。
  6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩を含む薬物組成物。
  7. 抗腫瘍薬または抗がん薬の製造における請求項１から５のいずれか１項に記載の毒素複合体またはその薬学的に許容される塩の使用。
  8. 前記抗腫瘍薬または抗がん薬は、抗肺がん薬、抗腎臓がん薬、抗尿道がん薬、抗結腸直腸がん薬、抗前立腺がん薬、抗神経膠腫薬、抗卵巣がん薬、抗膵がん薬、抗乳がん薬、抗黒色腫薬、抗肝がん薬、抗膀胱がん治療薬、抗悪性リンパ腫薬、抗白血病薬、抗胃がん薬または抗食道がん薬である請求項７に記載の使用。
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