JP2021513055A - マイクロ流体力学における蛍光定量化のためのｄｎａオリガミビーズ - Google Patents

マイクロ流体力学における蛍光定量化のためのｄｎａオリガミビーズ Download PDF

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Abstract

マイクロ流体システムを較正するための方法が提供され、本方法は、ＤＮＡオリガミに基づく構造を有するビーズを使用することに基づき、本構造は、所定数のフルオロフォアを含む。さらに、本明細書で提供される蛍光マイクロビーズを使用して較正されたマイクロ流体力学を使用する、抗原のレベルを決定するための方法。また、較正されたマイクロ流体システムにより血液疾患の存在または状態を決定するための方法が提供される。
【選択図】図２

Description

本発明は、フローサイトメトリーなどのマイクロ流体力学で使用するためのＤＮＡオリガミおよびフルオロフォアに基づく少なくとも１つの構造を含むビーズを開示する。
フローサイトメトリーの蛍光強度から粒子（細胞）あたりのフルオロフォアの数を定量化するために使用される、現在市場に出ている市販のキャリブレーターは、いくつかの欠点を伴う。（ａ）現在のキャリブレータービーズは、プラスチック製であり、そのため、ビーズあたり約２００〜２０００のフルオロフォアに相当する高い自己蛍光を呈する。（ｂ）市販のビーズのフルオロフォア標識の程度は、大きい変動を伴う。（ｃ）これらの較正は、ビーズあたりの数千のフルオロフォア（高い自己蛍光を含む）、したがって、より低い範囲への外挿（５０〜２．０００のフルオロフォアは、非常に高い不確実と関連している）に基づく。
顕微鏡用のＤＮＡオリガミベースの標準は、米国特許出願公開第２０１４００５７８０５号（Ａ１）に記載されている。
本発明は、ＤＮＡオリガミに基づく構造を含むビーズを提供し、構造は、フローサイトメトリーなどのマイクロ流体力学用途のための所定数のフルオロフォアを含む。ビーズは、先行技術を上回るいくつかの利点を有する。１つの利点は、ビーズが自己蛍光を呈さないか、またはほとんど呈さないことである。さらに、ＤＮＡオリガミに基づく構造に連結されるフルオロフォアの数は既知であり、かつ正確に制御できるため、ビーズを、わずか１フルオロフォアまでの異なる数のフルオロフォアで標識できるようになる。したがって、本開示の方法による較正は、非常に低いレベルで試料中に存在する抗原の定量を可能にする。
本発明の１つの利点は、オリガミ構造がマイクロ流体力学における蛍光の定量化を可能にすることにあり、ここで信号は、蛍光顕微鏡法と比較して異なって得られる。顕微鏡検査では、物体は静止しているため、物体に連結したフルオロフォアは、信号を生成するために、より多くの励起露光および放出時間を有し、一方でフローサイトメトリーなどのマイクロ流体力学では、ビーズは、検出器を通って急速に移動し、これは露出および検出時間を大幅に制限する。フローサイトメトリーシステムの較正は、特定の数のフルオロフォア（最大１５００〜３０００フルオロフォア）を含むビーズを必要とし得る。
本開示の一態様は、マイクロ流体システムを較正する方法に関し、本方法は、
ａ．ＤＮＡオリガミに基づく構造を有する少なくとも１つのビーズを提供することであって、構造が、所定数のフルオロフォアを含む、提供することと、
ｂ．少なくとも１つのビーズの蛍光を測定することと、
ｃ．ｂの蛍光測定に基づいてマイクロ流体システムを較正すること、
を含み、
これによりマイクロ流体システムの検量線を得る。
本明細書で定義される較正ビーズを使用する、フローサイトメトリー機構などのマイクロ流体システムの較正は、例えば、細胞外小胞、ウイルスおよび細菌などの小さい生物学的粒子の正確な生化学分析を可能にする。したがって、マイクロ流体システムを較正するために提供される方法は、フローサイトメトリーなどのマイクロ流体力学に基づく診断方法を含む、学術的、産業的にならびに臨床分析で有利に使用できる。
本開示の別の態様は、以下を含むマイクロ流体システムによって試料中の抗原のレベルを決定するための方法に関する
ａ．先行する請求項のいずれか一項に記載の方法に従ってマイクロ流体システムを較正し、それにより検量線を得ることと、
ｂ．少なくとも１つの抗原を含む試料を提供することであって、抗原が、細胞もしくは小胞に、またはウイルス様粒子もしくはウイルス粒子に、または細胞外小胞に連結される、提供することと、
ｃ．試料を、蛍光標識に結合された少なくとも１つのリガンド結合分子と接触させることであって、リガンドが、少なくとも１つの抗原を結合する、接触させることと、
ｄ．蛍光標識の蛍光を測定することと、
ｅ．検量線に基づいて蛍光標識の蛍光をスコアリングすることと、
ｆ．試料中の少なくとも１つの抗原のレベルを決定すること。
本開示の別の態様は、フローサイトメトリーシステムなどのマイクロ流体システムによって個体における血液疾患の存在または状態を決定するための方法に関し、この方法は、
ａ．本明細書に開示された方法に従って、マイクロ流体システムを較正し、それにより検量線を得ることと、
ｂ．少なくとも１つの血球を含む、個体からの血液試料を提供することと、
ｃ．試料を、蛍光標識に結合された少なくとも１つのリガンド結合分子と接触させることであって、リガンドが、血液疾患の存在または状態に関連している、接触させることと、
ｄ．蛍光標識の蛍光を測定することと、
ｅ．検量線に基づいて蛍光標識の蛍光をスコアリングすることと、
ｆ．血液疾患の存在または状態に関連する少なくとも１つの抗原のレベルおよび／または濃度を決定すること、
を含む。
本開示の別の態様は、ＤＮＡオリガミに基づく構造を有するビーズを含むマイクロ流体機器を較正するためのキットに関し、この構造は、所定数のフルオロフォアを含む。
フローサイトメトリー較正ビーズの考えられる設計の例である。Ａ：ＤＮＡベースのモノマービーズの側面図。Ｂ：モノマーの正面図。Ｃ：粒子全体の二量化。Ｄ：二量体ビーズ。Ｅ：二量体ビーズのＴＥＭ特性。ＴＥＭ画像は２００＊２００ｎｍである。Ｆ：二量体ビーズにおけるフルオロフォアの位置。Ｇ：Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメトリーシステムによる０、１２０個、および２４２個のＣｙ５分子で標識された二量体ビーズのフローサイトメトリーデータならびに分析。Ｈ：ビーズの外面にフルオロフォアを配置する別の方法。 ５１ｋｂ足場に基づく可能なビーズ設計の提唱である。Ａ．数字８の形状のビーズの正面図。Ｂ．構造から突出する相補的な足がかりへの蛍光色素分子鎖の連結を拡大表示。
定義
本明細書で使用される「ＤＮＡオリガミに基づく構造」という用語は、足場ＤＮＡ鎖と、ステープル鎖とも呼ばれる短いＤＮＡセグメントから形成されるＤＮＡオリガミを指し、それは足場ＤＮＡ鎖の所定の構造を形成する。足場ＤＮＡ鎖は通常、長い一本鎖ＤＮＡ分子である。足場ＤＮＡ鎖の長さは、その産生に使用されるシステムに依存する。約７．０００ヌクレオチドの足場ＤＮＡ鎖は、例えばＭ１３ｍｐ１８ファージを使用して産生され得る。約５０．０００ヌクレオチドの足場ＤＮＡ鎖は、例えば、Ｍａｒｃｈｉら（２０１４年）に記載されているλ／Ｍ１３ハイブリッドウイルスを使用して産生され得る。ＤＮＡ鎖に基づく構造は、色素、プラズモン構造、タンパク質などの生体分子、酵素、ナノ粒子、およびビオチンなどの小分子などのさらなる成分を含んでよい。あるいは、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、近年、Ｏｎｇら（２０１７年）によって記述されているように、短いＤＮＡセグメントのみからも構築できる。短いＤＮＡセグメントのみからＤＮＡオリガミに基づく構造を構築することは、ギガダルトン範囲での構造などの、大きい構造に対しても可能である。
本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖のみでなく、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の鎖、およびハイブリッド構造などの類似構造も意味すると理解される。
本明細書で使用される「より短いＤＮＡセグメント」という用語は、「ステープル鎖」または「ステープルＤＮＡ鎖」とも呼ばれ、かつ足場ＤＮＡ鎖または別のより短いＤＮＡセグメントの配列に相補的な配列を有する、ヌクレオチド分子を指す。さらに、上記のより短いＤＮＡセグメントを使用して、長いＤＮＡ鎖を所定の構造に折り畳むことができる。あるいは、より短いＤＮＡセグメントは、所定の領域でＤＮＡオリガミのＤＮＡ足場鎖とハイブリダイズするものであり得る。より短いＤＮＡセグメントは、構造をフルオロフォアで装飾するために使用できる、本明細書で「粘着末端」と呼ばれる、ＤＮＡ足場鎖にハイブリダイズしない配列を含み得る。より短いＤＮＡセグメントを使用して、制御可能な方法で個々のＤＮＡオリガミ構造を一緒に大きいＤＮＡオリガミオリゴマーへと結合する／接着することもできる。
「較正」という用語は、本明細書では、１つ以上の参照試料に基づいて測定された変数を定量化すること、または感度および解像度などの装置の特性を決定することを意味すると理解される。例えば、本明細書に開示される方法は、フローサイトメーターの較正に使用され得る。
ＤＮＡオリガミに基づく構造
一態様では、本開示は、フローサイトメーターなどのマイクロ流体システムを較正する方法に関し、本方法は、ＤＮＡオリガミに基づく構造を有する少なくとも１つのビーズを提供することを含み、構造は、所定数のフルオロフォアを含む。
ＤＮＡオリガミに基づく構造は通常、ＤＮＡ足場鎖とも呼ばれる一本鎖ＤＮＡ分子を含み、これは複数のステープル鎖の助けにより、所定の構造に折り畳まれる。各ステープル鎖は、一本鎖ＤＮＡ分子上の配列の特定の部分にハイブリダイズし、それによって一本鎖ＤＮＡ分子がどのように折り畳まれるかを決定する。
ＤＮＡ足場鎖の長さに応じて、一定数のステープルＤＮＡ鎖が、足場鎖を事前に設計された構造に折り畳むために必要とされる。
したがって、特定の一実施形態では、構造は、所定数のフルオロフォア、一本鎖ＤＮＡ分子、およびステープルＤＮＡ鎖を含み、ステープルＤＮＡ鎖（Ｎｓ）の数は、以下の式のとおりである：
Ｎｓ＝Ｌｓｓ／ｎ、
式中、Ｌｓｓは、一本鎖ＤＮＡ分子の長さであり、
式中、ｎは、２６〜３４に含まれる整数である。
別の特定の実施形態では、構造は、所定数のフルオロフォア、一本鎖ＤＮＡ分子、およびステープルＤＮＡ鎖を含み、ステープルＤＮＡ鎖（Ｎｓ）の数は、以下の式のとおりである：
Ｎｓ＝Ｌｓｓ／ｎ、
式中、Ｌｓｓは、一本鎖ＤＮＡ分子の長さであり、
式中、ｎは、２８〜３２に含まれる整数である。
しかし、本発明は、上記の方程式を満たす実施形態に限定されない。実際、この方程式に従わない多くの異なるＤＮＡオリガミ構造を産生することは可能である。
ステープルＤＮＡ鎖の長さは、ステープルＤＮＡごとに異なり得る。最小の長さは、ステープルＤＮＡ鎖が室温で安定であることを可能にする長さである。
一実施形態では、ステープルＤＮＡ鎖の長さは、１２〜６０ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの範囲である。
したがって、一実施形態では、本開示は、ＤＮＡオリガミに基づく構造を有する少なくとも１つのビーズを提供することを含む、フローサイトメーターを較正する方法に関し、構造は、所定数のフルオロフォア、一本鎖ＤＮＡ分子およびステープルＤＮＡ鎖を含む。
一本鎖ＤＮＡ分子の長さは、ビーズのサイズのみでなく、ビーズが収容できるフルオロフォアの数にとっても重要である。
したがって、一本鎖ＤＮＡ分子またはＤＮＡ足場鎖は、１．５００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチドの範囲の長さ（例えば、２．０００ヌクレオチド〜６８．０００ヌクレオチド、５．０００ヌクレオチド〜６５．０００ヌクレオチド）、例えば、１０．０００ヌクレオチド〜６０．０００ヌクレオチド（１５．０００ヌクレオチド〜５５．０００ヌクレオチドなど）、好ましくは２０．０００ヌクレオチド〜５５．０００ヌクレオチド（例えば、５０．０００〜５２．０００ヌクレオチドなど）を有し得る。したがって、一本鎖ＤＮＡ分子またはＤＮＡ足場鎖は、５１．４６６ヌクレオチドの長さを有し得る。
一本鎖ＤＮＡ分子は、５，０００ヌクレオチド〜７０，０００ヌクレオチド、例えば、７．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、１０．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、１３．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、１５．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、１８．０００ヌクレオチド７０．０００ヌクレオチド、例えば、２０．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、好ましくは、２３．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、２５．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、２８．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、３０．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、好ましくは、３３．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、３５．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、３８．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、４０．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、好ましくは、４３．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、４５．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、４８．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、５０．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、好ましくは、５３．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、５５．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、５８．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、６０．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、好ましくは、６３．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、６５．０００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜６５．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜６０．０００ヌクレオチド、好ましくは、５．０００ヌクレオチド〜５５．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜５０．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜４５．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜４０．０００ヌクレオチド、好ましくは、５．０００ヌクレオチド〜３５．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜３０．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜２５．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜２０．０００ヌクレオチド、好ましくは、５．０００ヌクレオチド〜１５．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド〜１０．０００ヌクレオチド、例えば、５．０００ヌクレオチド、例えば、７，０００ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。
一本鎖ＤＮＡ分子は、少なくとも５．０００ヌクレオチド、例えば、少なくとも７．０００ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１０．０００ヌクレオチド（少なくとも１５．０００ヌクレオチドなど）、例えば、少なくとも２０．０００ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも２５．０００ヌクレオチド（少なくとも３０．０００ヌクレオチドなど）、例えば、少なくとも３５．０００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０．０００ヌクレオチド（少なくとも４５．０００ヌクレオチドなど）、例えば、少なくとも５０．０００ヌクレオチドの長さを有し得る。
一実施形態では、一本鎖ＤＮＡ分子は、ファージを使用して産生されてよく、５．０００ヌクレオチド〜１０．０００ヌクレオチドの長さを有する。
一実施形態では、一本鎖ＤＮＡ分子は、ハイブリッドウイルスを使用して産生されてよく、５．０００ヌクレオチド〜５５．０００ヌクレオチドの長さを有する。
長い一本鎖ＤＮＡ分子（少なくとも３０．０００ヌクレオチドの長さを有する一本鎖ＤＮＡ分子など）を産生することは有益であり得る。なぜなら、これらの長い分子は、５．０００〜１０．０００ヌクレオチド（最大で３０．０００ヌクレオチドなど）の範囲内の長さを有する一本鎖ＤＮＡ分子と比較して、より多くの数のフルオロフォアを運ぶことができるためである。
例えば、７．０００〜１２．０００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子を含むビーズは、１〜２００のフルオロフォアを収容し得る；４０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子を含むビーズは、１〜１５００のフルオロフォアを収容し得る。
ビーズに含まれるフルオロフォアの数を増やす別の方法は、疎水性相互作用および水素結合相互作用による三量体構造などの、二量体を産生することである。
したがって、一実施形態では、ビーズは、ＤＮＡオリガミに基づく二量体構造を含む。別の実施形態では、ビーズは、ＤＮＡオリガミに基づく三量体構造を含む。しかし、より大きいオリゴマー構造（四量体、五量体、六量体、七量体および／またはより大きい多重オリゴマー構造など）を産生することも可能である。
ＤＮＡオリガミに基づく構造は、いかなる形状を有してもよく、それは平面であっても湾曲していてもよい。特定の幾何構造が、他の幾何構造よりも好まれる場合がある。例えば、フルオロフォア間の可能性のある疎水性相互作用による構造の望ましくないオリゴマー化を防ぐために、構造内のフルオロフォアを隠す幾何構造が好ましい場合がある。したがって、一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、球、六角形、バレル、チューブ、またはこれらの構造の組み合わせであり得る。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、球であってよい。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、バレルまたはチューブであってよい。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、六角形であってよい。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、提唱されている幾何構造の組み合わせであってよい。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、位置決めドメイン、蛍光ドメインおよび／またはトリガードメインを含む。
位置決めドメインは、フルオロフォアが構造上に配置されるドメインである。このドメインは、足場鎖に完全に相補的であるステープル鎖の１つであり得るか、または足場鎖に相補的でない一本鎖オーバーハング配列を有し得る。オーバーハングは、オーバーハングに相補的であるフルオロフォアで標識されたオリゴを結合するために使用される。
蛍光ドメインは、フルオロフォアが連結されるドメインである。したがって、蛍光ドメインは、所定数のフルオロフォアを含む。さらに、各ビーズは、２つ以上の異なるタイプのフルオロフォアを含んでよく、例えば、各ビーズは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個の異なるフルオロフォアまたは蛍光ドメインなどの、２つ以上の異なるフルオロフォアまたは蛍光ドメインを含んでよい。好ましい実施形態では、ビーズは１〜４の異なるフルオロフォアまたは蛍光ドメインを含む。
別の実施形態では、ＤＮＡに基づくオリガミ構造は、トリガードメインを含む。
トリガードメインは、異なるタイプのフルオロフォアまたはナノ粒子が連結され得るドメインである。金または銀のナノ粒子などのナノ粒子は、光を効率的に拡散できる。それにより、トリガードメイン中のこれらのフルオロフォアまたはナノ粒子を使用して、較正ビーズの検出を引き起こすことができる。
ＤＮＡオリガミに基づく構造を含むビーズを使用する利点は、正確なかつ既知の数のフルオロフォアを構造に連結でき、そのため測定装置（この場合は、フローサイトメーター）の正確な較正が可能であることである。
一実施形態では、蛍光ドメインは粘着末端を含み、フルオロフォアは、この粘着末端に相補的であるＤＮＡ断片にコンジュゲートされ、これにより、フルオロフォアは、相補的ＤＮＡ断片を介して粘着末端に連結される。
本開示のビーズは、所定数のフルオロフォアを含む。ＤＮＡオリガミに基づく構造の長さおよび設計に基づいて、ビーズは、特定の最大数のフルオロフォアを含み得る。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、１〜５０のフルオロフォア、例えば、１〜８０のフルオロフォアなど、１〜１００のフルオロフォアなど、１〜１５０のフルオロフォアなど、１〜２００のフルオロフォアなど、１〜３００のフルオロフォアなど、１〜４００のフルオロフォアなど、１〜５００のフルオロフォアなど、１〜６００のフルオロフォアなど、１〜７００のフルオロフォアなど、１〜８００のフルオロフォアなど、１〜９００のフルオロフォアなど、好ましくは最大１０００のフルオロフォア、最大で１２００のフルオロフォアなど、最大で１５００のフルオロフォアなど、最大で１８００のフルオロフォアなど、最大で２０００のフルオロフォアなど、最大で２２００のフルオロフォアなど、最大で２５００のフルオロフォアなど、最大で２７００のフルオロフォアなど、最大で３０００のフルオロフォアなどを含む。
一実施形態では、ビーズはＤＮＡオリガミに基づく二量体または三量体構造を含み、各モノマーは１〜１８００のフルオロフォアを含む。
一実施形態では、ビーズは、ＤＮＡオリガミに基づくモノマー構造を含み、構造は、１〜９００のフルオロフォア、例えば１〜１５００のフルオロフォア、好ましくは１〜１８００のフルオロフォア、１〜２７００のフルオロフォア、好ましくは最大で３０００のフルオロフォアを含む。
一実施形態では、ビーズはＤＮＡオリガミに基づく構造を含み、構造は、少なくとも３０．０００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１〜１０００のフルオロフォアを含む。
一実施形態では、ビーズはＤＮＡオリガミに基づく構造を含み、構造は、少なくとも５０．０００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子を含み、１〜１８００のフルオロフォアを含む。
フローサイトメトリーに好適であるあらゆるフルオロフォアを使用できる。しかし、好ましいフルオロフォアは、小さい有機分子から選択される。
一実施形態では、小さい有機分子は５ｎｍ未満である。
一実施形態では、フルオロフォアは、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５６６ｎｍ（Ｃｙ３）、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６７０ｎｍ（Ｃｙ５）、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、１２０個のフルオロフォア、例えば１２０個のＣｙ５蛍光分子を含む。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、２４２個のフルオロフォア、例えば２４２個のＣｙ５蛍光分子を含む。
好適なフルオロフォアは、当業者には公知であり、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡＴＴＯ ４８８およびＡＴＴＯ ５３２および５／６カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、６−カルボキシフルオレセイン （６−ＦＡＭ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、ＤＹ−４１５、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＦＬ、フルオレセインイソチオシアネート、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）、５’−テトラクロロ−フルオレセイン、ＡＴＴＯ ５２０、６−カルボキシ−４’、５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（商標）ｄｙｅｓ、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）５３０／５５０、ヘキサクロロフルオレセイン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＤＹ−５４９、Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）ＴＭＲ−Ｘ、シアニンホスホロアミダイト （シアニン３、シアニン３．５、シアニン ５、シアニン５．５）、ＡＴＴＯ ５５０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）、ＡＴＴＯ５６５、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（スルホローダミン１０１酸塩化物）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０、ＡＴＴＯ５９４、ＤＹ−４８０−ＸＬ、ＤＹ−６１０、ＡＴＴＯ６１０、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ６４０、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０、ＡＴＴＯ ６３３、Ｂｏｄｉｐｙ６５０／６６５、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、ＤＹ−６４９、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６７０、ＡＴＴＯ ６８０、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ ７０５、ＤＹ−６８２、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７４０、ＤＹ−７８２、ＩＲＤ７００及びＩＲＤ ８００、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４０ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５２２ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ ５４４ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５６０ｎｍ、 ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５３８ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ ５５９ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５９０ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５６９ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５９１ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ５９０ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０ｎｍ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６３５ｎｍ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５７０ｎｍ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５４８ｎｍ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５６６ｎｍ（Ｃｙ３）、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６７０ｎｍ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６４７ｎｍ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６７０ｎｍ（Ｃｙ５）、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）７０５ｎｍ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６９０ｎｍ、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）７０５ｎｍ（Ｃｙ５．５）、Ｐｕｌｓａｒ（登録商標）６５０ Ｄｙｅｓ、ＳｕｐｅｒＲｏｘ（登録商標）Ｄｙｅｓを含む。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、５０．０００〜５２．０００ヌクレオチド、例えば５１．４６６ヌクレオチドの長さのＤＮＡ足場、１０００〜２０００の、例えば１５００〜１６００の多数のステープル鎖（好ましくは１５５０）、および５０〜１８００のフルオロフォアを含む。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、５０．０００〜５２．０００ヌクレオチド、例えば５１．４６６ヌクレオチドの長さのＤＮＡ足場、１０００〜２０００の、例えば１５００〜１６００の多数のステープル鎖（好ましくは１５５０）、および５０〜９００のフルオロフォアを含む。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、５０．０００〜５２．０００ヌクレオチド、例えば５１．４６６ヌクレオチドの長さのＤＮＡ足場、１０００〜２０００の、例えば１５００〜１６００の多数のステープル鎖（好ましくは１５５０）、および５０〜１８００のフルオロフォア、例えば８０のフルオロフォア、例えば１６０のフルオロフォア、例えば９００のフルオロフォア、例えば１８００のフルオロフォアを含む。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、５０．０００〜５２．０００ヌクレオチド、例えば５１．４６６ヌクレオチドの長さのＤＮＡ足場、１０００〜２０００の、例えば１５００〜１６００の多数のステープル鎖（好ましくは１５５０）、および８０のフルオロフォア、例えば８０個のＣｙ５蛍光分子を含む。
一実施形態では、ＤＮＡオリガミに基づく構造は、５０．０００〜５２．０００ヌクレオチド、例えば５１．４６６ヌクレオチドの長さのＤＮＡ足場、１０００〜２０００の、例えば１５００〜１６００の多数のステープル鎖（好ましくは１５５０）、および１６０のフルオロフォア、例えば１６０個のＣｙ５蛍光分子を含む。
マイクロ流体システムの較正方法
マイクロ流体システムは、非常に少量の流体を使用する機構を含み、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体力学の原理を利用し、これにより、液体および気体の物理的および化学的特性をマイクロスケールで活用できる。それらのコンパクトなサイズおよび実験時間の短縮のおかげで、優れたデータ品質をさらに提供しながら、多くの操作を同時に実行できる。
本発明は、マイクロ流体システムの較正においてＤＮＡオリガミを使用するための方法に関する。
したがって、本開示の一態様は、マイクロ流体デバイスを較正する方法に関し、本方法は、
ａ．ＤＮＡオリガミに基づく構造を有する少なくとも１つのビーズを提供することであって、構造が、所定数のフルオロフォアを含む、提供することと、
ｂ．少なくとも１つのビーズの蛍光を測定することと、
ｃ．ｂの蛍光測定に基づいてマイクロ流体デバイスを較正すること、
を含み、
これによりマイクロ流体デバイスの検量線を得る。
本開示の別の態様は、マイクロ流体力学技術によって試料中の抗原のレベルを決定するための方法に関し、本方法は、
ａ．本明細書に開示された方法に従って、マイクロ流体デバイスを較正し、それにより検量線を得ることと、
ｂ．少なくとも１つの抗原を含む試料を提供することであって、抗原が、細胞もしくは小胞に、またはウイルス様粒子もしくはウイルス粒子に、または細胞外小胞に連結される、提供することと、
ｃ．試料を、蛍光標識に結合された少なくとも１つのリガンド結合分子と接触させることであって、リガンドが、少なくとも１つの抗原を結合する、接触させることと、
ｄ．蛍光標識の蛍光を測定することと、
ｅ．検量線に基づいて蛍光標識の蛍光をスコアリングすることと、
ｆ．試料中の少なくとも１つの抗原のレベルを決定すること、
を含む。
好ましい実施形態では、マイクロ流体システムは、フローサイトメーターシステムであり、ここで構造はＤＮＡオリガミに基づき、構造は、所定数のフルオロフォアを含み、較正に使用される。以下を参照のこと。しかし、フローサイトメーターシステムに関して本明細書で以下に記載される任意の特定の実施形態はまた、一般にマイクロ流体システムに適用され得る。
フローサイトメーターを較正する方法
したがって、本開示の一態様は、フローサイトメーターを較正する方法に関し、
ａ．ＤＮＡオリガミに基づく構造を有する少なくとも１つのビーズを提供することであって、構造が、所定数のフルオロフォアを含む、提供することと、
ｂ．少なくとも１つのビーズの蛍光を測定することと、
ｃ．ｂの蛍光測定に基づいてフローサイトメーターを較正すること、
を含む。
一実施形態では、フローサイトメーターを較正する方法は、それぞれが異なる所定数のフルオロフォアを含む一連のビーズを提供することを含む。例えば、少なくとも２つのビーズ、例えば少なくとも３つのビーズ、好ましくは少なくとも４つのビーズ、さらにより好ましくは少なくとも５つのビーズが提供され得、各ビーズは異なる所定数のフルオロフォアを含む。
例えば、それぞれ５０および１００のフルオロフォアを含む一連の２つのビーズが提供されてよい。好ましくは、それぞれ５０、１００、２００のフルオロフォアを含む一連の３つのビーズが提供されてよい。好ましくは、それぞれ５０、１００、２００および５００のフルオロフォアを含む一連の４つのビーズが提供されてよい。好ましくは、それぞれ５０、１００、２００、５００および１０００のフルオロフォアを含む一連の５つのビーズが提供されてよい。例えば、それぞれ５０、１００、２００、５００、１０００および１５００のフルオロフォアを含む一連の６つのビーズが提供されてよい。
したがって、各ビーズの蛍光は、上記の方法のステップｂに従って測定される。
本明細書に開示されるＤＮＡオリガミに基づく構造を有する２つのビーズのみを使用することにより、本開示の方法でフローサイトメーターを較正することが可能であるが、３つ以上のビーズを使用することが好ましい。実際に、較正精度は、使用するビーズの数と共に上昇する。
フローサイトメーターを較正する方法が、それぞれが異なる所定数のフルオロフォアを含む一連のビーズを提供することを含む場合、少なくとも１つのビーズが、方法の感度に可能な限り近い複数のフルオロフォアを含むことが、有益であり得る。
例えば、第１のビーズは、１〜５０の複数のフルオロフォアを含んでよい。第２のビーズは、５１〜１００の複数のフルオロフォアを含んでよい。第３のビーズは、１０１〜１５０の複数のフルオロフォアを含んでよい。第４のビーズは、１５１〜３００の複数のフルオロフォアを含んでよい。第５のビーズは、３０１〜５００の複数のフルオロフォアを含んでよい。この例のように、複数のフルオロフォアを含む一連のビーズを使用する場合には、より多くの数のフルオロフォアのデータが容易に推定され得る。
例えば、第１のビーズは、１〜５０の複数のフルオロフォアを含んでよい。第２のビーズは、５１〜１００の複数のフルオロフォアを含んでよい。第３のビーズは、１０１〜３００の複数のフルオロフォアを含んでよい。第４のビーズは、３０１〜７５０の複数のフルオロフォアを含んでよい。第５のビーズは、７５１〜１５００の複数のフルオロフォアを含んでよい。第６のビーズは、１５０１〜２７００の複数のフルオロフォアを含んでよい。
一実施形態では、フローサイトメーターを較正する方法は、提供された少なくとも２つのビーズ、例えば、提供された少なくとも３つのビーズ、好ましくは提供された少なくとも４つのビーズ、さらにより好ましくは提供された少なくとも５つのビーズなどの蛍光を測定することを含む。
一実施形態では、フローサイトメーターを較正する方法は、提供された少なくとも２つのビーズ、例えば、提供された少なくとも３つのビーズ、好ましくは提供された少なくとも４つのビーズ、さらにより好ましくは提供された少なくとも５つのビーズなどの蛍光測定に基づいて、フローサイトメーターを較正することを含む。
本明細書に開示される方法によるフローサイトメーターの較正は、機器の感度の正確な決定および検量線の作成を可能にする。検量線は、所定のフルオロフォアの対象エンティティ上の蛍光分子（フルオロフォア）の数を蛍光強度と相関させることを可能にする。
本開示の較正方法の１つの利点は、ＤＮＡオリガミおよび所定数のフルオロフォアに基づく構造を含むビーズを使用することにより、蛍光を正確に決定でき、蛍光と発蛍光団の数の間の線形相関が決定され、ゼロ点を確立することができることである。ゼロ点は基準値であり、これはバックグラウンド蛍光、例えば、使用されるバッファーの自己蛍光の測定値として機能する。
このゼロ点のおかげで、様々なフローサイトメーターシステムで実行された測定値を比較できる。ゼロ点は、検量線と共に、蛍光シグナルに基づく値の正確な外挿も可能にする。
抗原のレベルを決定するための方法
本明細書に記載されるとおり較正ビーズを使用して実行されるフローサイトメーター機構の較正は、小さい生物学的粒子、例えば細胞外小胞、ウイルスおよび細菌の正確な生化学分析を可能にする。こうした分析は、学術的、産業的に、および臨床的設定に適用できる。
細胞外小胞としては、エキソソームおよび微小胞が挙げられ、これらはほとんどすべての細胞から分泌される。細胞外小胞は、そのサイズが小さいため、一般に、単一粒子レベルで特徴を明らかにすることは困難である。エキソソームは、サイズが３０〜１５０ｎｍの最小のエンティティである。これらは、大きい多胞エンドソームの成熟中にエンドソーム膜の内向きの出芽によって形成される。多胞エンドソームと原形質膜との融合により、エキソソームが細胞外空間に放出される。マイクロベシクルはより大きく、サイズは５０〜５００ｎｍである。これらは、細胞膜から直接外向きに出芽することにより、細胞外空間に放出される。細胞外小胞の積荷は非常に不均一であり、核酸、タンパク質、および脂質を含み得る。これらの細胞外小胞は、細胞間コミュニケーションを媒介する重要な役割を果たす。これらのエキソソーム中に埋め込まれた表面タンパク質は、それらの細胞内起源、プロデューサーおよびレシピエント細胞の型を明らかにできる。単一粒子レベルでこれらの小胞の特徴を明らかにすることは、細胞間コミュニケーションコードを理解するのに役立つが、腫瘍の発生および進行などの診断も可能にする。
本開示の一態様は、フローサイトメトリーなどの、マイクロ流体システムによって試料中の抗原のレベルを決定するための方法に関し、本方法は、
ａ．本明細書に開示される方法に従ってフローサイトメーターなどのマイクロ流体システムを較正し、それにより検量線を得ることと、
ｂ．少なくとも１つの抗原を含む試料を提供し、抗原が、細胞、または小胞、またはウイルス様粒子もしくはウイルス粒子、またはエキソソームに連結される、提供することと、
ｃ．試料を、蛍光標識に結合された少なくとも１つのリガンド結合分子と接触させることであって、リガンドが、少なくとも１つの抗原を結合する、接触されることと、
ｄ．蛍光標識の蛍光を測定することと、
ｅ．検量線に基づいて蛍光標識の蛍光をスコアリングすることと、
ｆ．試料中の少なくとも１つの抗原のレベルを決定すること、
を含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるフローサイトメトリーにより試料中の抗原のレベルを決定するための方法は、提供された試料中のわずか一つの単一抗原を検出できる。
一実施形態では、試料は、少なくとも１つの抗原、例えば少なくとも１０個の抗原、例えば少なくとも２５個の抗原、好ましくは少なくとも５０個の抗原を含み、抗原（複数可）は、１つ以上の細胞および／または小胞および／またはウイルス様粒子および／またはウイルス粒子および／またはエキソソームに連結される。
血液疾患の診断のための方法
本開示の一態様は、フローサイトメトリーなどのマイクロ流体システムによって、個体における血液疾患の存在または状態を決定するための方法に関し、この方法は、
ａ．本明細書に開示される方法に従ってフローサイトメーターなどのマイクロ流体システムを較正し、それにより検量線を得ることと、
ｂ．少なくとも１つの血球を含む個体からの流体試料を提供することと、
ｃ．試料を、蛍光標識に結合された少なくとも１つのリガンド結合分子と接触させることであって、リガンドが、血液疾患の存在または状態に関連している、接触させることと、
ｄ．蛍光標識の蛍光を測定することと、
ｅ．検量線に基づいて蛍光標識の蛍光をスコアリングすることと、
ｆ．血液疾患の存在または状態に関連する少なくとも１つの抗原のレベルおよび／または濃度を決定すること、
を含む。
一実施形態では、流体は、血液、骨髄、脊髄液、気管支肺胞洗浄液および漿液性滲出液からなる群から選択される。
一実施形態では、個体はヒトである。
一実施形態では、フローサイトメトリーによる血液疾患の診断のための方法は、血球上の少なくとも１つの抗原のレベルおよび／または濃度をカットオフ値と比較するステップをさらに含み、
カットオフ値が、血液疾患を呈していない個体などの健康な個体における少なくとも１つの抗原の濃度範囲から決定され、
カットオフ値よりも低いまたは高いレベルおよび／または濃度が、血液疾患の有無を示す。
流体試料は、血液試料であり得、血液試料は、全血であり得るが、より好ましくは血漿、血清、無細胞または少なくとも１つの血球もしくは血球由来の微小胞を含む試料である。
例えば、本明細書に開示される方法は、上記の流体試料のいずれかの細胞上で発現する特定のマーカーのレベルを決定することによるなどの、流体試料の免疫表現型分類を行うことにより、白血病またはリンパ腫を診断するために使用できる。
例えば、以下の白血病およびリンパ腫は、本明細書に開示される方法を使用して診断され得る：急性骨髄性白血病（または急性骨髄性白血病）、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性または骨髄性白血病、Ｂ細胞およびＴ細胞非ホジキンリンパ腫、赤白血病（ＲＢＣ白血病）、巨赤芽球性白血病（血小板）、および多発性骨髄腫。
一実施形態では、以下の抗原のいずれか１つのレベルを決定できる：ＺＡＰ−７０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴｄＴ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１１７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、免疫グロブリン重鎖（ガンマ、アルファ、ミューまたはデルタ）および軽鎖（カッパまたはラムダ）、ＣＤ１０（ｐｒｅ−Ｂ細胞ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ６６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ６１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１０３。当業者は、異なるタイプの血液細胞によっていずれの抗原が発現するか、および白血病またはリンパ腫に罹患している個体においていずれのレベルが予想されるかについて認識しているであろう。例えば、Ｍｏｒｉｃｅｅｔら、２００４年；Ｊａｆｆｅ １９８７年；Ｈａｎｓｏｎら、１９９９年；Ｌａｎｇｅｒａｋら、２００１年を参照されたい。
フローサイトメトリー機器の較正用キット
本開示の一態様は、ＤＮＡオリガミに基づく構造を有する少なくとも１つのビーズを含むフローサイトメトリー機器などの、マイクロ流体機器の較正のためのキットに関し、構造は、所定数のフルオロフォアを含む。
本開示の一実施形態では、少なくとも１つのビーズは、本明細書の「ＤＮＡオリガミに基づく構造」の項で開示されるとおりである。
本開示の一実施形態では、キットは、少なくとも２つのビーズ、例えば少なくとも３つのビーズ、例えば少なくとも４つのビーズ、好ましくは少なくとも５つのビーズを含み、各ビーズは、「ＤＮＡオリガミに基づく構造」の項に記載されるとおり、異なる所定数のフルオロフォアを含む。
実施例
実施例１。六角形ダブルバレル。
較正ビーズの組み立て
較正ビーズは、設計された構造の環状一本鎖足場鎖（８０６４ｂｐ）および２１１の短い一本鎖ステープルＤＮＡ鎖に自己組織化される。足場鎖を、Ｔｉｌｉｂｉｔ ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ステープル鎖を、統合ＤＮＡテクノロジーによって化学的に生成する。ステープル鎖は、（Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ ２００６年）に記載されているように、足場鎖の足場鎖部分に結合し、それをあらかじめ設計された構造に折り畳ませる。
この場合は、設計されたビーズは六角形のバレル（図１ＡおよびＢ）へと組み立てられる。このバレルは、ホモ二量体構造（図１Ｃ）の組み立てを制御する自己相補的側面（図１Ａ）を有し、長い六角形のバレル（図１ＤおよびＥ）をもたらす。この構造は、約４２＊４５＊７０ｎｍのサイズを有する。透過型電子顕微鏡写真のサイズは２００＊２００ｎｍである。
ステープル鎖のいくつかは、フルオロフォアで標識される（図１Ｆ）。オリゴマー化を回避するために、構造はバレル内に存在するフルオロフォアと共に設計され、そのためフルオロフォアは、この構造によって環境から保護され、望ましくないオリゴマー化を防ぐ。Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメトリーシステム（図１Ｇ）を使用する０、１２０個および２４２個のＣｙ５フルオロフォアのビーズの分析は、いかなるフルオロフォアでも標識されていない構造が、バッファーのみと比較して、なんらかの有意な蛍光を呈さないことを示している。１２０個および２４２個のＣｙ５を追加することにより、蛍光強度が段階的に増加した。
実施例２。８の字型ＤＮＡオリガミ構造
較正ビーズの組み立て
較正ビーズは、環状一本鎖足場鎖（５１．４６６ｂｐ）および１５５０の短い一本鎖ステープルＤＮＡ鎖から、設計された構造に自己組織化される。足場鎖を（Ｍａｒｃｈｉ，Ｓａａｅｍら、２０１４年）に記載されているとおりに生物学的に産生し、ステープル鎖を化学的に産生する。（Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ ２００６年）に記載されているように、ステープル鎖は、足場鎖の相補部分に結合し、それをあらかじめ設計された構造に折り畳ませる。
この場合は、設計されたビーズは２つの六角形の構造に組み立てられ、数字の８を形成する（図２Ａ）。この構造は、約１２８＊２２０＊６０ｎｍのサイズを有した。
構造を標識する別の方法：ステープル鎖のいくつかは、足場鎖と相補性のない追加のＤＮＡ配列を含む。これは、フルオロフォアで標識されたＤＮＡ鎖のドッキング配列として機能する、いわゆる粘着末端である。したがって、フルオロフォアで標識された鎖は、粘着末端に相補的な配列を有し、フルオロフォアで標識される（図２Ｂ）。
フルオロフォアの連結
フルオロフォアで標識された鎖を、フルオロフォアをＤＮＡ鎖に化学的に連結させその後高圧液体クロマトグラフィーを使用してコンジュゲートを精製することによって産生する。粘着末端を含む構造中の鎖の数が、アニールされたフルオロフォア鎖の数を決定し、これは、ビーズ上のフルオロフォアの数に等しく、１〜４０００の範囲であり得る。標識されたフルオロフォア鎖は、構造内に向く相補的な粘着末端にドッキングする（図２Ｂ）。このようにして、構造は、環境からフルオロフォアをスクリーニングし、疎水性フルオロフォア相互作用によりいくつかのビーズの望ましくないオリゴマー化（これは不明確な数のフルオロフォアを有するオリゴマーをもたらし得る）を防止する。
あるいは、粘着末端の代わりに、構造中の鎖を、対象のフルオロフォアに直接コンジュゲートできる。
構造の組み立て。
ＤＮＡオリガミ較正ビーズの設計および組み立て。ＣａｄＮａｎｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ(http://cadnano.org/)を、ステープル鎖配列の生成に使用し、ＡｕｔｏＣＡＤＭａｙａ（http://www.autodesk.com/）を、３Ｄ形状の評価および完全に組み立てられたビーズへと二量化のための形状相補ドメインの設計に使用した。ＤＮＡオリガミ構造の自己組織化を、一本鎖足場ＤＮＡ（ｐ８０６４、ｔｉｌｉｂｉｔ ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１０倍過剰のステープル鎖／１００μＬＴＡＥ／Ｍｇ２＋バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓａｃｅｔａｔｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．３、１２ｍＭ Ｍｇ２＋）と混合することによって実施した。ステープル鎖のアニーリングを、次のランプを使用して行った：６５℃で５分間、その後温度を５０℃に急速に低下させ、５０から４３℃へと１℃ごとに２００分間徐冷し、その後２０℃に急冷した。フルオロフォアと共に組み立てられた構造では、フルオロフォア鎖を、５’末端でフルオロフォアとコンジュゲートした。組み立てられた構造は、過剰なステープル鎖ゲル抽出から精製した。精製された構造を、透過型電子顕微鏡によって特徴づけ、フローサイトメトリー分析に直接使用した。
結果
Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）サイトメトリーシステムを使用して、上記の実施例１の説明に従って組み立てられ標識なし、１２０個および２４２個のＣｙ５蛍光分子で標識された、較正ビーズを試験した。Ｃｙｔｏｆｌｅｘシステムは、それぞれ、標識されていないもの、１２０個のＣｙ５蛍光分子で標識されたもの、および２４２個のＣｙ５蛍光分子で標識されたものから得た蛍光信号間の有意差を示した。注目すべきことに、標識されていない較正ビーズはいかなる自己蛍光も有さず、得られた蛍光信号はバッファーの信号と等しい。これは、データセットの外挿の必要なしに、「０」点を実際の点として定義することを可能にする。これは、豊富でない抗原のフローサイトメトリー出力信号の正確な定量を可能にするフローサイトメトリーシステム用の検量線を作成することを可能にする。
実施例１のビーズと比較してより大きなビーズは、実施例２に記載されるより長い足場鎖を使用することにより、または疎水性相互作用を介してビーズを二量体または三量体に組織化することのいずれかにより、組み立てられる。これは、各ビーズが、最大１５００、１８００、２０００、２５００、２７００のフルオロフォアなどの、より多くの数のフルオロフォアを収容することを可能にし、そのため、較正用から選択するためのより多様なビーズの貯留を可能にする。
合成したビーズの品質を、クライオＴＥＭおよびアガロースゲルによって評価する。
参考文献
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表
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Claims (28)

  1. マイクロ流体システムを較正する方法であって、
    ａ．ＤＮＡオリガミに基づく構造を有する少なくとも１つのビーズを提供することであって、前記構造が、所定数のフルオロフォアを含む、提供することと、
    ｂ．前記少なくとも１つのビーズの蛍光を測定することと、
    ｃ．ｂの前記蛍光測定に基づいて前記マイクロ流体システムを較正すること、
    を含み、
    これにより前記マイクロ流体システムの検量線を得る、方法。
  2. 前記マイクロ流体システムが、フローサイトメーターである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記構造が、所定数のフルオロフォア、一本鎖ＤＮＡ分子およびステープルＤＮＡ鎖を含み、ステープルＤＮＡ鎖（Ｎｓ）の数が、式Ｉ
    Ｎｓ＝Ｌｓｓ／ｎ、
    （式中、Ｌｓｓは、一本鎖ＤＮＡ分子の長さであり、かつ
    式中、ｎは、２６〜３４に含まれる整数である）のとおりである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記一本鎖ＤＮＡ分子が、１．５００ヌクレオチド〜７０．０００ヌクレオチドの、好ましくは２０００ヌクレオチド〜６８．０００ヌクレオチドの、５．０００〜６５．０００ヌクレオチドなどの、例えば１０．０００ヌクレオチド〜６０．０００ヌクレオチドの、１５．０００ヌクレオチド〜５５．０００ヌクレオチドなどの、好ましくは２０．０００ヌクレオチド〜５５．０００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記一本鎖ＤＮＡ分子が、少なくとも５．０００ヌクレオチドなど、少なくとも７．０００ヌクレオチドなど、少なくとも１０．０００ヌクレオチドなど、少なくとも１５．０００ヌクレオチドなど、少なくとも２０．０００ヌクレオチドなど、少なくとも２５．０００ヌクレオチドなど、少なくとも３０．０００ヌクレオチドなど、少なくとも３５．０００ヌクレオチドなど、少なくとも４０．０００ヌクレオチドなど、少なくとも４５．０００ヌクレオチドなど、少なくとも５０．０００ヌクレオチドなど、少なくとも２．０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 各ステープルＤＮＡ鎖が、１２ヌクレオチド〜６０ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記構造が、
    ａ．位置決めドメイン、
    ｂ．蛍光ドメインおよび／または
    ｃ．トリガードメイン
    を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記蛍光ドメインが、前記所定数のフルオロフォアを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記フルオロフォアが、前記ステープルＤＮＡ鎖に連結される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ステープルＤＮＡ鎖の少なくとも一部が、粘着末端を含み、前記フルオロフォアが、前記粘着末端に相補的なＤＮＡ断片にコンジュゲートされ、かつ前記フルオロフォアが、前記相補的ＤＮＡ断片を介して前記粘着末端に連結される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ビーズが、ＤＮＡオリガミに基づく二量体構造を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ビーズが、ＤＮＡオリガミに基づく三量体構造を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記構造が、球、バレル、チューブ、六角形、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記構造が、少なくとも５０のフルオロフォアなど、少なくとも１００のフルオロフォアなど、少なくとも２００のフルオロフォアなど、少なくとも３００のフルオロフォアなど、少なくとも４００のフルオロフォアなど、少なくとも９００のフルオロフォアなど、少なくとも１２００のフルオロフォアなど、少なくとも１５００のフルオロフォアなど、少なくとも１８００のフルオロフォアなど、少なくとも２０００のフルオロフォアなど、少なくとも２７００のフルオロフォアなど、少なくとも１フルオロフォアを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 各ビーズが、２つ以上の異なるタイプのフルオロフォアまたは蛍光ドメインを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記フルオロフォアが、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）５６６ｎｍ（Ｃｙ３）、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６７０ｎｍ（Ｃｙ５）、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 少なくとも２つのビーズ、好ましくは少なくとも３つのビーズが、提供され、かつ各ビーズが、異なる所定数のフルオロフォアを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのビーズの前記蛍光を測定することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのビーズの前記蛍光測定に基づいてフローサイトメーターなどの前記マイクロ流体システムを較正することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. マイクロ流体システムによって試料中の抗原のレベルを決定するための方法であって、
    ａ．請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法に従ってマイクロ流体システムを較正し、それにより検量線を得ることと、
    ｂ．少なくとも１つの抗原を含む試料を提供することであって、前記抗原が、細胞にまたは小胞にまたはウイルス様粒子にもしくはウイルス粒子にまたは細胞外小胞に連結される、提供することと、
    ｃ．蛍光標識に結合された少なくとも１つのリガンド結合分子と前記試料を接触させることであって、前記リガンドが、前記少なくとも１つの抗原を結合する、接触させることと、
    ｄ．前記蛍光標識の前記蛍光を測定することと、
    ｅ．前記検量線に基づいて前記蛍光標識の前記蛍光をスコアリングすることと、
    ｆ．前記試料中の前記少なくとも１つの抗原の前記レベルを決定すること、
    を含む、方法。
  21. 抗原の前記レベルが、フローサイトメトリーによって決定される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記試料が、少なくとも１つの抗原、少なくとも１０の抗原など、例えば少なくとも２５の抗原、好ましくは少なくとも５０の抗原を含み、前記抗原（複数可）が、１つ以上の細胞および／または小胞および／またはウイルス様粒子および／またはウイルス粒子および／またはエキソソームに連結される、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. マイクロ流体システムによって個体における血液疾患の存在または状態を決定するための方法であって、
    ａ．本明細書に開示された方法に従ってマイクロ流体システムを較正し、それにより検量線を得ることと、
    ｂ．少なくとも１つの血球を含む個体からの流体試料を提供することと、
    ｃ．蛍光標識に結合された少なくとも１つのリガンド結合分子と前記試料を接触させることであって、前記リガンドが、前記血液疾患の存在または状態と関連する、接触させることと、
    ｄ．前記蛍光標識の前記蛍光を測定することと、
    ｅ．前記検量線に基づいて前記蛍光標識の前記蛍光をスコアリングすることと、
    ｆ．前記血液疾患の存在または状態と関連する前記少なくとも１つの抗原のレベルおよび／または濃度を決定すること、
    を含む、方法。
  24. 前記流体試料が、血液、骨髄、脊髄液、気管支肺胞洗浄液および漿液性滲出液からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. カットオフ値と前記少なくとも１つの抗原の前記レベルおよび／または濃度を比較するさらなるステップを含み、
    前記カットオフ値が、血液疾患を呈していない個体などの、健康な個体における前記少なくとも１つの抗原の前記濃度範囲から決定され、かつ
    前記カットオフ値よりも低いまたは高いレベルおよび／または濃度が、前記血液疾患の有無を示す、
    請求項２３または２４に記載の方法。
  26. ＤＮＡオリガミに基づく構造を有するビーズを含むマイクロ流体機器の較正のためのキットであって、前記構造が、所定数のフルオロフォアを含む、キット。
  27. 前記ビーズが、請求項２〜１４のいずれか一項に定義される通りである、請求項２６に記載のキット。
  28. 前記キットが、少なくとも２つのビーズ、例えば少なくとも３つのビーズ、少なくとも４つのビーズなど、好ましくは少なくとも５つのビーズを含み、各ビーズが、異なる所定数のフルオロフォアを含む、請求項２６または２７に記載のキット。
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