JP2021512892A - 核酸分子送達のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料 - Google Patents

核酸分子送達のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料 Download PDF

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Abstract

本開示は、複数回のゲルから溶液への（ゲル−ゾル）および溶液からゲルへの（ゾル−ゲル）相転移を受けることができる核酸分子（ｍｉＲＮＡなど）を含む封入ナノ粒子を含有する新規ペプチドヒドロゲル、ならびに対象への核酸分子の制御送達のためなどのそれらの使用を提供する。一部の実施形態では、ペプチドヒドロゲル内に封入されたナノ粒子を含むペプチドヒドロゲルが提供される。ナノ粒子は、アンフォールドされ、β−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドと複合体化した核酸分子を含む。ペプチドヒドロゲルは、β−ヘアピンコンフォメーションにある第２の両親媒性カチオン性ペプチドの線維ネットワークから形成される。一部の例では、第１および第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、５０アミノ酸長以下である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により組み込まれる２０１８年２月１０日に出願された米国仮出願第６２／６２８，９６１号の優先権を主張する。
本開示の分野
本出願は、複数回のゲルから溶液への（ゲル−ゾル）および溶液からゲルへの（ゾル−ゲル）相転移を受けることができる核酸分子（マイクロＲＮＡなど）を含む封入ナノ粒子を含有するペプチドヒドロゲル、ならびに例えば、対象への核酸分子の制御送達のためのそれらの使用に関する。
連邦政府により支援された研究および開発に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって授与されたプロジェクト番号ＺＩＡ ＢＣ ０１１３１３および０１１６５７の下で政府支援と共に為された。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
注射可能なヒドロゲルの使用は、封入された治療剤の組織への直接的な局部送達を可能にし、治療剤の全身分布および任意の関連するオフターゲット毒性を制限する。しかしながら、ヒドロゲル媒介性治療剤送達に関する現在の戦略は、特に、ＲＮＡ治療剤などの、核酸に基づく治療剤のための送達ビヒクルの文脈において、臨床的に実行可能となる前に克服しなければならない課題を依然として有する。
核酸分子と複合体化したペプチドのナノ粒子を含有するペプチドヒドロゲル（ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料）の実施形態が本明細書に提供される。核酸分子は、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはそのミミックおよび／もしくはミメティックであってもよい。ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、ヒドロゲル内に分散されたナノ粒子−ヒドロゲル複合材料および任意のさらなる治療剤を、例えば、標的位置で解剖学的表面を被覆するためのシリンジ注射または噴霧送達により、対象の標的位置に局部的に送達することができる、剪断減粘／回復機械特性（ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎ／ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）を示す。送達後、ナノ粒子は、ヒドロゲルマトリックスから隣接組織へと持続放出され、細胞によって取り込まれる。細胞によって内在化されたら、核酸分子は、ナノ粒子から放出され、（核酸分子に応じて）細胞機能に影響し得る。
一部の実施形態では、ペプチドヒドロゲル内に封入されたナノ粒子を含むペプチドヒドロゲルが提供される。ナノ粒子は、アンフォールドされ、β−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドと複合体化した核酸分子を含む。ペプチドヒドロゲルは、β−ヘアピンコンフォメーションにある第２の両親媒性カチオン性ペプチドの線維ネットワークから形成される。一部の例では、第１および第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、５０アミノ酸長以下である。
開示されるペプチドヒドロゲルの一部の例では、第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＬＶ−ＮＨ２に記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は、中性ｐＨで第２の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷と等しいか、またはそれより多くの正電荷を有する。例えば、中性ｐＨで、第１の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は、＋７〜＋１０（＋９など）であり、第２の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は、＋３〜＋８（＋５など）である。
一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；ｎは、３〜５である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０の正味の形式電荷を有する。
ペプチドのＣ末端は、カルボキシレートではなく、中性または正の電荷を有するペプチド改変を含む。一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、（１ｄ）ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２（ＭＡＸ１ペプチド）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；ｎは、３〜５である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８の正味の形式電荷を有する。
一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、
ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＬＶ−ＮＨ２（ＨＬＴ２ペプチド）
として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドと複合体化した核酸分子は、アンチセンス核酸分子である。一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドと複合体化した核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはそのミミックおよび／もしくはミメティックである。
ペプチドヒドロゲルは、ペプチドヒドロゲル内に封入された異種抗がん剤（化学療法剤など）をさらに含んでもよい。
また、有効量の開示されるペプチドヒドロゲルを、がんが存在するか、または存在するリスクがある対象の標的位置に投与することを含む、対象におけるがんを処置または阻害する方法も提供される。そのような方法では、ペプチドヒドロゲル中のナノ粒子は、がんを阻害する核酸分子（ｍｉＲＮＡまたはそのミミックおよび／もしくはミメティックなど）を含む。ナノ粒子を含むペプチドヒドロゲルを、対象の標的位置への直接注射または噴霧送達などの任意の好適な手段によって対象に投与することができる。一部の実施形態では、標的位置は、対象中の中皮細胞によって覆われている漿膜表面（例えば、胸膜腔などの漿膜体腔の一部）である。一部の実施形態では、がんは、悪性胸膜中皮腫などの漿膜がんである。
本開示の前記および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進めるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかとなる。
図１Ａ〜１Ｃは、ナノ粒子ヒドロゲル複合材料の設計および腫瘍切除後の胸膜腔表面などの複雑な解剖学的表面へのｍｉＲＮＡ送達のためのその適用を示す概略図である。（図１Ａ）ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を調製するための２段階プロセス。カチオン性ペプチドと、アニオン性ｍｉＲＮＡとの静電的相互作用によってβ−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性ペプチドにｍｉＲＮＡを複合体化することによって、ナノ粒子を段階Ｉにおいて最初に製剤化する。ナノ粒子をヒドロゲル中に封入するために（段階ＩＩ）、ナノ粒子懸濁液を、生理的緩衝液中で第２の両親媒性カチオン性ペプチドと混合して、β−ヘアピンのフォールディングおよび結果として生じる第２のペプチドの自己集合を誘導する。これは、ナノ粒子を均一に封入する第２のペプチドに由来する線維状複合材料ヒドロゲルネットワークの形成を引き起こす。（図１Ｂ）ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、シリンジ注射または噴霧によって適用して、ｍｉＲＮＡを複雑な解剖学的表面の細胞に局部的に送達することができる。（図１Ｃ）胸膜中皮腫腫瘍（ｐｌｕｒａｌ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ ｔｕｍｏｒ）の外科的切除後の胸膜腔へのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の適用およびその後のナノ粒子の近隣組織への放出および細胞への取込み。適用されたヒドロゲルは、複雑な切除された組織表面を覆い、ｍｉＲＮＡナノ粒子を放出し、それらはクラスリン媒介性エンドサイトーシスによって残存する腫瘍細胞中に内在化される。 同上。 同上。
図２Ａ〜２Ｄは、ペプチド／ｍｉＲＮＡナノ粒子の生物物理学的特性評価を示す図である。（図２Ａ）ペプチドのアミノ酸配列、生理的ｐＨでのそれらの電荷、および蛍光分光分析によってモニタリングされた、ペプチドとｍｉＲＮＡとの結合相互作用。固定濃度（３０ｎＭ）のＦＡＭ標識されたスクランブルｍｉＲＮＡを、様々な濃度のペプチドに対して滴定した。ｍｉＲＮＡ上のＦＡＭ標識を、４９０ｎｍで励起し、それぞれの組成物について５２０ｎｍで測定された蛍光を、遊離ＦＡＭ−ｍｉＲＮＡについてのものに対して正規化した。（図２Ｂ）ペプチド１と複合体化したｍｉＲＮＡからなるナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真。複合体化を、ペプチド１ 対 ｍｉＲＮＡについて１０：１のＮ／Ｐ比（電荷比）で、水中で実施した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して算出された粒子の直径を、差し込み図に示す（ｎ＝３０）。（図２Ｃ）水中、３７℃で記録された、様々なＮ／Ｐ比でｍｉＲＮＡと複合体化した、および複合体化していないペプチド１の円二色性スペクトル。［θ］は、平均残基楕円率を示す。（図２Ｄ）水中で異なるＮ／Ｐ比でｍｉＲＮＡと複合体化した場合のペプチド１について存在するβシートのパーセンテージ。％βシートは、１９８ｎｍでの負の楕円率の増加を測定する、図２ＣにおけるＣＤシグナルから得られる。％βシートを、水中で測定した対応する複合体のゼータ電位に対してプロットする。 同上。
図３Ａ〜３Ｆは、ヒト中皮腫細胞系Ｈ２０５２におけるペプチド１により送達されたｍｉＲＮＡの細胞トランスフェクションおよび細胞内移動を示す図である。（図３Ａ）ＦＡＭ標識されたスクランブルｍｉＲＮＡからなるナノ粒子への１時間の曝露後のＨ２０５２細胞のフローサイトメトリー分析から決定された、ペプチド１のｍｉＲＮＡトランスフェクション効率。市販のトランスフェクション試薬と比較したペプチド１のｍｉＲＮＡトランスフェクション効率。ｎ＝３、エラーバーは±ＳＤであり、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。（図３Ｂ）Ｈ２０５２細胞中でのペプチド１に由来するナノ粒子によるｍｉＲＮＡトランスフェクションのメカニズム。エンドサイトーシス阻害剤の存在下での内在化されたｍｉＲＮＡの中央蛍光強度を、阻害剤の非存在下でのものに対して正規化した。ｎ＝３、エラーバーは±ＳＤであり、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。ＦＡＭ−ｍｉＲＮＡおよびペプチド１を含有するナノ粒子で０．５時間（図３Ｃ）および４時間（図３Ｄ）にわたって処理された生きたＨ２０５２細胞の共焦点顕微鏡法画像。それぞれの時点でのＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの共局在化を、後期エンドソーム／リソソームマーカーであるリソトラッカーレッド（ＬｙｓｏＴ）について決定した。核染色を示す。（図３Ｅ）カルセインのみで４時間にわたって処理された細胞中での点状カルセイン蛍光。（図３Ｆ）カルセインおよびペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子（標識されていないスクランブルｍｉＲＮＡ）と４時間にわたって共インキュベートした細胞中での拡散カルセイン蛍光。最終ｍｉＲＮＡ濃度は、それぞれ４０ｎＭである。それぞれの画像上のスケールバーは、１０μｍである。 同上。 同上。
図４Ａ〜４Ｉは、ペプチド１がｍｉＲＮＡ−２１５をＨ２０５２細胞に機能的に送達することができ、対応するｍｉＲＮＡ複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能的ｍｉＲＮＡ送達のために自己集合性β−ヘアピンペプチドヒドロゲル内に封入することができることを示す図である。（図４Ａ）ペプチド１／ｍｉＲＮＡ−２１５ナノ粒子による処理の４８時間後のＨ２０５２細胞中での細胞周期転写物の相対レベル。遺伝子発現レベルを、スクランブルｍｉＲＮＡ処理群についてのものに対する倍率変化として示す。エラーバーは、ｎ＝３について±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＃ｐ＜０．０００１、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定。（図４Ｂ）ナノ粒子による処理の７２時間後および１２０時間後のＨ２０５２の細胞生存率。（図４Ｃ）処理の２週間後のナノ粒子で処理された細胞の増殖能力を決定するためのクローン原性アッセイ。（図４Ｄ）処理の６週間後の同様に処理された細胞の足場非依存性成長能力。対応するコロニー数の定量を、差し込み図に示す。（図４Ｅ）フローサイトメトリーＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩに基づくアポトーシスアッセイによって決定された、処理の９６ｈ後のナノ粒子によって誘導されたアポトーシス効果。（図４Ｆ）ナノ粒子が封入された０．５％（ｗ／ｖ）のペプチド３ヒドロゲルの透過型電子顕微鏡写真。（図４Ｇ）３７℃での、自己集合性ペプチド３により形成されたヒドロゲルから、無限シンク（ＨＢＳ）へのＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの累積放出。（図４Ｈ）ＦＡＭ−ｍｉＲＮＡは、２４時間にわたって別々にゲル複合材料から放出され、Ｈ２０５２細胞を４時間にわたって放出上清で処理して、放出されたＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの取込みを可視化した。細胞核を染色した。スケールバーは１０μｍである。（図４Ｉ）トランスフェクションの４８時間後の、封入されたｍｉＲＮＡ−２１５をロードしたゲル複合材料の放出上清で処理した細胞の遺伝子サイレンシング効能。エラーバーは、ｎ＝３について±ＳＤである。＊＊ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０００１、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定。 同上。 同上。 同上。
図５Ａ〜５Ｈは、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料が、ｉｎ ｖｉｖｏの組織への局部的なｍｉＲＮＡの遅い持続的送達を提供し、単回注射の際に皮下中皮腫腫瘍の腫瘍成長を低減させることを示す図である。（図５Ａ）シリンジ注射により埋め込まれたヒドロゲル複合材料からの無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスにおいて送達されたＣｙ３標識ｍｉＲＮＡ 対 皮下注射された可溶性ｍｉＲＮＡの放出のモニタリング。（図５Ｂ）超音波によってモニタリングされた場合のゲル複合材料のｉｎ ｖｉｖｏでの分解。（図５Ｃ）ｃｙ３標識ｍｉＲＮＡナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、皮下Ｈ２３７３腫瘍を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスの腫瘍周囲に注射された場合、腫瘍細胞にｍｉＲＮＡを送達する。腫瘍を、注射の２４時間後に収集した。対応するｚスタックも示す。スケールバーは１０μｍである。（図５Ｄ）ヒドロゲル複合材料の単回腫瘍周囲投与後の異なる処置群に関する皮下腫瘍成長阻害曲線（治療的ｍｉＲＮＡ処置群についてはｎ＝５、対照群についてはｎ＝４）。エラーバーは±ＳＥＭであり、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。（図５Ｅ）ヒドロゲル注射後、第４週で処置マウスから切り出された腫瘍の画像。（図５Ｆ）ヒドロゲル投与後、第１週および第２週での腫瘍組織中の細胞周期転写物の遺伝子発現プロファイル。エラーバーは、それぞれ３つ組で測定されたｎ＝３匹のマウスについて±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。腫瘍細胞増殖能力を評価するためのＫｉ６７（図５Ｇ）およびアポトーシスの潜在性を決定するためのＴＵＮＥＬ（図５Ｈ）に関する様々なヒドロゲル複合材料で処置された腫瘍の免疫組織化学的評価。腫瘍を、処置後、第４週で収集した。図５Ｇ中の核を、ＤＡＰＩで染色し、赤色に疑似着色して、可視化を補助した。それぞれの画像上のスケールバーは、１０μｍである。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図６Ａ〜６Ｈは、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料が、単回投与の際にＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスにおける同所性Ｈ２３７３（図６Ａ〜６Ｄ）およびＨ２０５２（図６Ｅ〜６Ｈ）腹膜腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を効率的に低減させることができることを示す図である。（図６Ａ）腹膜Ｈ２３７３腫瘍移植片を担持するマウスにおける腫瘍成長のモニタリング、次いで、ヒドロゲル複合材料の単回腹腔内注射の投与のタイムライン。（図６Ｂ）腫瘍組織の発光を測定することによって決定された、様々な処置群におけるマウスの腫瘍成長曲線。各時点での腫瘍周囲の放射束を、各処置群について０日目でのものに対して正規化した。エラーバーは±ＳＥＭであり、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、治療的ｍｉＲＮＡ処置群についてはｎ＝１０、対照群についてはｎ＝８）。（図６Ｃ）異なる時点でのヒドロゲル複合材料で処置されたマウスにおける腫瘍発光の生体イメージング。（図６Ｄ）ヒドロゲル複合材料で処置されたマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線（ｎ＝１０）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｌｏｇランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定。（図６Ｅ）腹膜Ｈ２０５２腫瘍移植片を担持し、ヒドロゲル複合材料の単回腹腔内注射を受けているマウスにおける腫瘍成長のモニタリングのタイムライン。（図６Ｆ）腫瘍組織の発光を測定することによって決定された様々な処置群におけるマウスの腫瘍成長曲線。エラーバーは、±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、各群ｎ＝５）。（図６Ｇ）異なる時点でのヒドロゲル複合材料で処置されたマウスにおける腫瘍発光の生体イメージング。（６Ｈ）ヒドロゲル複合材料で処置されたマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線、＊ｐ＜０．０５、Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定。 同上。 同上。 同上。 同上。
図７Ａ〜７Ｃは、ペプチド１とｍｉＲＮＡとの結合の生物物理学的調査を示す図である。（図７Ａ）ｍｉＲＮＡ上のＦＡＭ標識を、４９０ｎｍで励起し、１０：１のＮ／Ｐ比で製剤化したペプチド１のｍｉＲＮＡ複合体について５２０ｎｍで蛍光を測定した。複合体化を水中で実施し、データ取得前にヘパリンの存在下または非存在下で複合体懸濁液を無塩ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。（図７Ｂ）ヘパリン置換アッセイによって決定されたペプチド１／ｍｉＲＮＡ複合体の安定性。硫酸ヘパリン硫酸溶液を、５０μｇ／ｍＬの最終ヘパリン濃度となるように、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に希釈したペプチド１／ＦＡＭ−ｍｉＲＮＡ複合体に添加し、３７℃で１時間にわたってインキュベートし、ｍｉＲＮＡの蛍光を５２０ｎｍで測定した。（図７Ｃ）３７℃で水中で記録された、ヘパリン濃度の増加の存在下または非存在下、Ｎ／Ｐ比１０：１でｍｉＲＮＡと複合体化したペプチド１の円二色性スペクトル。［θ］は、平均残基楕円率を示す。
図８Ａ〜８Ｆは、ペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子およびリポフェクタミン／ｍｉＲＮＡ複合体の生物物理学的特性評価を示す図である。ペプチド１およびリポフェクタミンのｍｉＲＮＡ複合体の動的光散乱により決定されたサイズ分布プロファイルを、（８Ａ）に示される相関図から誘導した。２５℃で水中のペプチド１／ｍｉＲＮＡおよびリポフェクタミン／ｍｉＲＮＡ複合体に関する、（図８Ｂおよび８Ｃ）粒径分布および（図８Ｄおよび８Ｅ）ゼータ電位を示すヒストグラム。２５℃で水中のｍｉＲＮＡのみに関するゼータ電位分布を、（図８Ｆ）に示す。リポフェクタミン／ｍｉＲＮＡ複合体を、製造業者の指示に従って製剤化した。 同上。
図９Ａ〜９Ｂは、ヒト胸膜中皮腫細胞系Ｈ２０５２中でのペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子によるｍｉＲＮＡの細胞内送達を示す図である。（図９Ａ）市販のトランスフェクション試薬と比較した、ペプチド１のｍｉＲＮＡトランスフェクション効率を示す重ね合わせたフローサイトメトリーのヒストグラム。（図９Ｂ）いずれの場合も曝露後１時間にわたって送達されたｍｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ。ｎ＝３、エラーバーは±ＳＤであり、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｈ２０５２ヒト中皮腫細胞における、クラスリン依存的およびマクロピノサイトーシス経路のマーカーであるトランスフェリンおよびデキストラン（７０ｋＤ）のエンドサイトーシス取込みに対する化学的阻害剤の効果の決定を示す図である。サイトカラシンＤ、Ｄｙｎａｓｏｒｅ、ＥＩＰＡの存在下または非存在下、ローダミン標識されたトランスフェリンで１時間にわたって処理された細胞（図１０Ａ）およびサイトカラシンＤ、Ｄｙｎａｓｏｒｅ、ＥＩＰＡの存在下または非存在下、ローダミン標識されたトランスフェリンで１時間にわたって処理された細胞（図１０Ｂ）のフローサイトメトリーのヒストグラム。ナイスタチンの存在下または非存在下で１時間にわたってＦＩＴＣ標識されたデキストランで処理された細胞（図１０Ｃ）およびＦＩＴＣ標識されたデキストランで処理された細胞（図１０Ｄ）のフローサイトメトリーのヒストグラム。 同上。
図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｈ２０５２細胞中でのペプチド１に由来するナノ粒子によるｍｉＲＮＡトランスフェクションのメカニズムを示す図である。（図１１Ａ）エンドサイトーシス阻害剤の存在下および非存在下でのナノ粒子への曝露後１時間でのＦＡＭ−ｍｉＲＮＡで標識された細胞のパーセンテージ。ｎ＝３、エラーバーは±ＳＤであり、「阻害剤なし」群に関する＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。（図１１Ｂ）現在の試験において使用したエンドサイトーシス阻害剤の構造および機能、これらの濃度は本文中および本文中の対応する参考文献中で使用される。サイトカラシンＤ、Ｄｙｎａｓｏｒｅ、ＥＩＰＡまたはナイスタチンの存在下または非存在下で１時間にわたってナノ粒子で処理された細胞のフローサイトメトリーのヒストグラム。（図１１Ｃ）サイトカラシンＤ、Ｄｙｎａｓｏｒｅ、ＥＩＰＡまたはナイスタチンの存在下または非存在下で１時間にわたってナノ粒子で処理された細胞のフローサイトメトリーのヒストグラム。 同上。
図１２Ａ〜１２Ｃは、ペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子の細胞内分布を示す図である。ｃｙ３ｍｉＲＮＡを含有するナノ粒子で３０分（図１２Ａ）および４時間（図１２Ｂ）にわたって処理された生きたＨ２０５２細胞の共焦点顕微鏡法画像。それぞれの時点でのｃｙ３ｍｉＲＮＡの共局在化を、後期エンドソーム／リソソームマーカーであるリソトラッカーブルー（ＬｙｓｏＴ）について決定した。（図１２Ｃ）ＦＡＭ−ｍｉＲＮＡおよびペプチド１を含有する二重標識されたナノ粒子で４時間にわたって処理された生きたＨ２０５２細胞の共焦点顕微鏡法画像。核を、示されたように染色した。最終ｍｉＲＮＡ濃度は、それぞれのパネルにおいて４０ｎＭである。スケールバーは１０μｍである。
（図１３Ａ）Ｈ２０５２ヒト中皮腫の細胞シグナル伝達経路に対するトランスフェクトされたｍｉＲＮＡ−２１５の効果。（図１３Ｂ）ＭＴＴアッセイによって決定された、インキュベーションの４時間後の可溶性ペプチド１およびペプチド１／スクランブルｍｉＲＮＡナノ粒子で処理されたＨ２０５２細胞の生存率。（図１３Ｃ）可溶性ペプチド１および対応するナノ粒子の細胞傷害性を、インキュベーションの４時間後に乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを使用してＨ２０５２細胞中で決定した。いずれの場合も、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００を陽性対照とした。 同上。
図１４は、誘導されたアポトーシスの程度を示す、処理の９６時間後のペプチド１およびｍｉＲＮＡから構成されるナノ粒子で処理されたＨ２０５２細胞のフローサイトメトリーによるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色プロファイルを示す図である。
図１５Ａ〜１５Ｅは、ヒドロゲル複合材料の生物化学的特性評価を示す図である。（図１５Ａ）様々なヒドロゲル化ペプチドと、異なるナノ粒子形成ペプチドとからなるヒドロゲル複合材料の画像。ペプチド１は、自己集合性ペプチドとして使用した場合、ロードされたナノ粒子の性質に関係なく、集合の２４時間後にゲル状材料を形成しない。ペプチド１からなる封入されたナノ粒子を含む０．５％（ｗ／ｖ）のペプチド３ヒドロゲル（図１５Ｂ〜１５Ｄ）およびブランクの０．５％（ｗ／ｖ）のペプチド３ヒドロゲル（図１５Ｅ）の透過型電子顕微鏡写真。
図１６Ａ〜１６Ｆは、ヒドロゲル複合材料が剪断減粘性で注射可能であり、封入されたナノ粒子を時間と共にゆっくりと放出することができることを示す図である。（図１６Ａ）振動レオロジーによって決定された０．５％および１％（ｗ／ｖ）のペプチド３を含有するヒドロゲル複合材料の剪断減粘性回復能力。ヒドロゲルをトランスウェルインサート内で前日に形成させ、測定の直前にレオメーターのプレート上に移した。１０分間の時間掃引（周波数６ｒａｄ／ｓ、ひずみ（ｓｔｒａｉｎ）０．２％）の後、１０００％のひずみで３０ｓにわたって剪断減粘を行った後、ひずみを０．２％に減少させることによってさらに６０分にわたってゲルを回復させた。３７℃での、自己集合性（図１６Ｂ）ペプチド２およびペプチド３（０．５％、ｗ／ｖ、１μｇのｍｉＲＮＡをロードした）ならびに（図１６Ｃ）ペプチド３（０．５％、ｗ／ｖ、１０μｇのｍｉＲＮＡをロードした）のペプチドにより形成されたヒドロゲルから、無限シンク（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）へのＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの累積放出。それぞれの時点でヘパリン処理された上清の蛍光を測定することによって、放出を決定した。（図１６Ｄ）２および４日目にペプチド３ヒドロゲル複合材料から収集された放出上清中に存在するナノ粒子のサイズ（動的光散乱実験によって決定）。（図１６Ｅ）アガロースゲル電気泳動移動度シフトアッセイは、ペプチド３ヒドロゲル複合材料から２および４日目に放出されたナノ粒子を検出する。（図１６Ｆ）ＭＴＴアッセイによって決定されたインキュベーションの４８時間後のペプチド３ヒドロゲル複合材料で処理されたＨ２０５２細胞の生存率。 同上。
図１７Ａ〜１７Ｃは、自己集合性β−ヘアピンペプチド４に基づくヒドロゲル内に封入された場合のペプチド１およびｍｉＲＮＡからなるナノ粒子（ペプチド分子１つあたり５の正味の負電荷を有する）がバーストで放出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍｉＲＮＡをＨ２０５２細胞に機能的に送達することができないことを示す図である。（図１７Ａ）３７℃でのペプチド４ヒドロゲル複合材料から無限シンク（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）へのＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの累積放出。（図１７Ｂ）ＦＡＭ−ｍｉＲＮＡ（１０μｇのｍｉＲＮＡをロードした）は、２４時間にわたって別々にペプチド４ゲル複合材料から放出され、Ｈ２０５２細胞を４時間にわたって放出上清で処理して、放出されたＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの取込みを可視化した。細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。スケールバーは１０μｍである。（図１７Ｃ）無視できる程度のｍｉＲＮＡ取込みを示す、裸のＦＡＭ−ｍｉＲＮＡで４時間にわたって処理されたＨ２０５２細胞のフローサイトメトリーのヒストグラム。
図１８Ａ〜１８Ｂは、ヒドロゲル複合材料製剤の細胞適合性の指標としてのマウスの体重の測定を示す図である。（図１８Ａ）皮下にボーラス注射された裸のｃｙ３ｍｉＲＮＡを受けているものと比較した、ｃｙ３ｍｉＲＮＡを封入するヒドロゲル複合材料を受けているメスのＳＣＩＤマウスに関する３週間にわたる体重のモニタリング。（図１８Ｂ）様々な経路により投与されたスクランブルｍｉＲＮＡのヒドロゲル複合材料を受けているマウスの体重。胸郭内、皮下および腹腔内投与について、それぞれ、１００、２００および４００μＬのヒドロゲル複合材料を使用した。
図１９Ａ〜１９Ｃは、生分解性ペプチド３ヒドロゲル複合材料が、無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスにおける単回皮下注射の際にｍｉＲＮＡの持続的送達を促進することを示す図である。（図１９Ａ）総放射効率を測定することによって決定された時間の関数としてのｃｙ３ ｍｉＲＮＡの放出の定量。各時点での放射効率を、各処置群について０日目でのものに対して正規化した。データ点は、ゲル複合材料を注射された群についてはｎ＝３匹の動物について、およびボーラスでｍｉＲＮＡを注射された動物についてはｎ＝２についての±ＳＤである。（図１９Ｂ）異なる時点でＶｅｖｏ ＬＡＺＲ超音波イメージングソフトウェアを使用して３Ｄグレースケールの超音波画像からゲル埋込み体の体積を算出した。データ点は、ｎ＝３匹の動物について±ＳＤである。（図１９Ｃ）ヒドロゲル分解および免疫細胞浸潤をモニタリングするための、皮下注射されたヒドロゲル複合材料を受けているマウスから異なる時点で収集された組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。Ｈ＆Ｅ画像を、１０倍および４０倍の倍率で示す。 同上。
（図２０Ａ）腫瘍細胞接種の３週間後の腹膜腔中に同所性Ｈ２０５２異種移植片を担持するメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスに由来する腹部領域。（図２０Ｂ）腫瘍移植片を担持しない比較のための対照マウスを示す。
図２１Ａ〜２１Ｃは、ペプチド１と複合体化し、１％ペプチド３ヒドロゲル内に封入されたナノ粒子として注射した場合のｃｙ３ｍｉＲＮＡのｅｘ ｖｉｖｏでの生体分布を示す図である。ヒドロゲル複合材料を、皮下Ｈ２３７３腫瘍移植片を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスの腫瘍周囲に投与した。腫瘍および重要臓器を、ＩＶＩＳ Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングシステム中でｃｙ３蛍光をイメージングするために注射の２４時間後に収集した。同じ時間にブランクのヒドロゲルを受けている対照マウスに由来する対応する画像も示す。（図２１Ｂ）ｃｙ３標識ｍｉＲＮＡナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、皮下Ｈ２３７３腫瘍移植片を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスの腫瘍周囲に注射された場合、腫瘍細胞にｍｉＲＮＡを送達する。腫瘍を注射の２４時間後に収集し、ｃｙ３の発現を、共焦点顕微鏡観察を使用して固定された腫瘍切片においてモニタリングした。核を、ＤＡＰＩを使用して標識した。対応するｚスタックも示す。スケールバーは１０μｍである。（図２１Ｃ）ブランクのヒドロゲルを注射されたマウスから収集された腫瘍切片における蛍光シグナルの非存在は、腫瘍組織の自己蛍光の可能性を除外する。 同上。
図２２Ａ〜２２Ｂは、機能的ｍｉＲＮＡ−２１５のｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクションを示すｑＰＣＲデータを示す図である。投与後、第１週（図２２Ａ）および第２週（図２２Ｂ）でｍｉＲＮＡ−２１５およびスクランブルｍｉＲＮＡを含有するゲル複合材料を注射されたマウスの皮下に成長したＨ２３７３腫瘍から単離された総ＲＮＡから、遺伝子発現を決定した。ｍＲＮＡレベルを、Ｕ６ ｓｎＲＮＡに対して正規化する。示されたデータは、それぞれ３つ組として測定された、各群でｎ＝３匹のマウスについてのものである。エラーバーは、±ＳＥＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図２３Ａ〜２３Ｂは、注射の２１日後にヒドロゲル複合材料を腹腔内投与された腹膜Ｈ２３７３（図２３Ａ）およびＨ２０５２（図２３Ｂ）腫瘍移植片を担持するマウスにおける腫瘍周囲の正規化された放射束分布を示す図である。
図２４Ａ〜２４Ｃは、折り畳まれたβ−ヘアピンペプチド１を用いて調製されたペプチド１：ｍｉＲＮＡ−２１５ナノ粒子が、ｍｉＲ−２１５標的遺伝子の発現に影響しないことを示す図であり、これらのナノ粒子がｍｉＲＮＡ−２１５を適切に送達して、ｍｉＲＮＡ−２１５応答遺伝子をサイレンシングすることができないことを示している（図２４Ａ）。ペプチド１のフォールディングがｍｉＲＮＡの表面上で開始され、全てのペプチド１分子がβ−ヘアピンコンフォメーションに留まる、ＦＡＭ−ｍｉＲＮＡとペプチド１とを１：１のＮ／Ｐ比で含有するナノ粒子で、０．５時間（図２４Ｂ）および４時間（図２４Ｃ）にわたって処理された生きたＨ２０５２細胞の共焦点顕微鏡法画像。それぞれの時点でのＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの共局在化を、後期エンドソーム／リソソームマーカーであるリソトラッカーレッド（ＬｙｓｏＴ）について決定した。核染色を示す。
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されたように、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年２月８日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」という名称のファイル（約２０ｋｂ）の形態でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。添付の配列表において：
詳細な説明
異種核酸分子（ｍｉＲＮＡなど）の投与は、治療効果を提供するために細胞活性を変更することができる。しかしながら、ｍｉＲＮＡおよび他の核酸分子の、ヒト疾患のための処置への変換は、臨床送達ビヒクルの欠如によって阻害されてきた。本明細書に記載されるのは、核酸分子（ｍｉＲＮＡなど）を標的組織部位に送達し、核酸分子の細胞中への輸送を容易にすることができる新規ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の実施形態である。ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、核酸分子と複合体化した両親媒性カチオン性ペプチド（例えば、ＭＡＸ１）を含むナノ粒子を含む。このナノ粒子は、自己集合したカチオン性両親媒性ペプチド（例えば、ＨＬＴ２）の線維ネットワークを含む剪断減粘性ペプチドに基づくヒドロゲル中に封入される。
開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の実施形態は、剪断減粘／回復機械特性を示し、ヒドロゲル内に分散されたナノ粒子−ヒドロゲル複合材料および任意のさらなる治療剤を、シリンジ注射による経皮もしくは外科的アクセスによって体腔に局部的に送達するか、または解剖学的表面を被覆するために噴霧することができる。例えば、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、中皮腫腫瘍の外科的除去後に肺の壁側胸膜と内臓側胸膜との間の空間に適用することができる（例えば、図１Ｃを参照されたい）。適用後、ナノ粒子は、ヒドロゲルマトリックスから隣接組織へと持続放出され、細胞によって取り込まれる。細胞によって内在化されたら、核酸分子はナノ粒子から放出され、細胞機能に影響する。核酸ナノ粒子に加えて、ヒドロゲルは、組合せ療法を可能にする他の生物薬剤（例えば、封入された化学療法剤）を担持することができる。
実施例で考察されるように、開示されるナノ粒子ヒドロゲル複合材料のいくつかの特色は、予想外かつ驚くべきものであった。例えば、ナノ粒子が、折り畳まれたβ−ヘアピンコンフォメーションにある第１の両親媒性カチオン性ペプチド（例えば、ＭＡＸ１）と複合体化したｍｉＲＮＡから形成される場合、得られるナノ粒子は、折り畳まれたβ−ヘアピンコンフォメーションにはない第１の両親媒性カチオン性ペプチド（例えば、ＭＡＸ１）と複合体化したｍｉＲＮＡから形成されるナノ粒子と比較して、細胞によって内在化された後に機能的ｍｉＲＮＡをあまり放出しないことが見出された。これは、少なくとも２つの理由から驚くべきことである。第１に、ＭＡＸ１ペプチドは、多くの溶液条件下でβ−ヘアピンコンフォメーションを採る強い傾向を有する。しかしながら、純水中でｍｉＲＮＡと複合体化した場合、それはアンフォールドしたままである。第２に、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれたＭＡＸ１によって形成されたｍｉＲＮＡナノ粒子は、アンフォールドしたＭＡＸ１によって形成されたナノ粒子と同様に効率的に細胞に進入したが、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれたＭＡＸ１によって形成されたナノ粒子は、対応するｍｉＲＮＡによって標的とされた遺伝子の発現に対する効果をほとんど〜全く有しなかった。対照的に、アンフォールドしたＭＡＸ１によって形成されたｍｉＲＮＡナノ粒子は、細胞に進入し、ナノ粒子中の対応するｍｉＲＮＡによって標的とされた遺伝子の発現を破壊した。
ナノ複合材料ヒドロゲルの別の驚くべき特色は、機能的ｍｉＲＮＡの送達が、負に荷電した線維ネットワークを有するヒドロゲルと比較して、正に荷電した線維ネットワークを有するヒドロゲルに関して実質的に良好であったということである。実施例に示されるように、カチオン性ペプチド：ｍｉＲＮＡナノ粒子を、負に荷電したペプチドネットワークから形成されたヒドロゲルに埋め込む場合、ナノ粒子は分解し、通常より早く、細胞に進入することができない遊離の裸のｍｉＲＮＡを放出する。負に荷電した線維ヒドロゲルネットワークがカチオン性ペプチド：ＲＮＡナノ粒子を封入するために使用される場合、カチオン性ペプチドはｍｉＲＮＡから解離し、負に荷電したヒドロゲルネットワークを有するタイトな複合体を形成すると考えられる。これは遊離ｍｉＲＮＡを溶液中に排出する。
さらに、ヒドロゲル複合材料は、それが配置された解剖学的部位に高度に局在化されたままであり、がん細胞中でのｍｉＲＮＡペイロードの特異的かつ集中的な取込みがあり、他の正常組織中では感知できるほどではなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで確立されたヒドロゲル複合材料の持続放出特性はｉｎ ｖｉｖｏで再現され、ヒドロゲル複合材料はそれ自体、対象にとって非毒性であった（この例では、実験マウスモデル）。
例示される実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、肺内膜の複雑な表面がんである悪性胸膜中皮腫を処置するために使用される。この難治性腫瘍は、一般的には、化学療法、放射線療法に対して耐性であり、完全に切除することができない。かくして、改良された悪性胸膜中皮腫の処置戦略が緊急に必要である。悪性胸膜中皮腫を超えて、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を使用して、核酸分子（ｍｉＲＮＡなど）および／または他の組合せ療法を多様な型の表面がんに送達することができる。
Ａ．用語の概要
別途指摘しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に示さない限り、単数形ならびに複数形の両方を指す。例えば、用語「ペプチド（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、単数または複数のペプチドを含み、語句「少なくとも１つのペプチド（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）」と等価であると考えることができる。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。かくして、「ペプチドを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、他の要素を排除することなく、「ペプチドを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ）」を意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、任意かつ全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、概算のものであり、別途示されない限り、便宜的に提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である多くの方法および材料を使用することができるが、特定の好適な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。様々な実施形態の概説を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。
約：別途本文が示さない限り、「約」とは、参照値のプラスまたはマイナス５％を指す。例えば、「約」１００とは、９５〜１０５を指す。
両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチド：中性のｐＨで正の静電荷を有し、２５℃で、５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合など、好適な条件下でβ−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれるペプチド。β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれた場合、ヘアピンの一方の面は主に疎水性であり、他方の面は主に親水性である。両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの非限定例は、本明細書にＨＬＴ２ペプチドとして提供される。
アンチセンス核酸分子：それがハイブリダイズする標的核酸分子（ＲＮＡ遺伝子産物など）の領域と少なくとも部分的に相補的であるオリゴマー化合物。本明細書で使用される場合、標的核酸分子「に特異的」であるアンチセンス化合物は、標的核酸分子に特異的にハイブリダイズし、その発現をモジュレートするものである。本明細書で使用される場合、「標的」核酸は、アンチセンス化合物が特異的にハイブリダイズし、発現をモジュレートするように設計された核酸分子である。
アンチセンス核酸分子の非限定例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムが挙げられる。そのため、これらの核酸分子は、一本鎖、二本鎖、環状、分枝状またはヘアピン状核酸分子として導入することができ、内部または末端突出部またはループなどの構造エレメントを含有してもよい。二本鎖アンチセンス核酸分子は、二本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズした二本鎖または完全もしくは部分的に二本鎖の核酸分子のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する一本鎖であってもよい。
β−ヘアピンコンフォメーション：ペプチドまたはタンパク質の構造コンフォメーション。β−ヘアピンコンフォメーションは、βターンによって連結された２つのβ鎖を含み、「ヘアピン」のような形状を形成する。この構造は両親媒性である；かくして、ヘアピンの一方の面は主に疎水性であり、他方の面は主に親水性である。疎水性アミノ酸の限られた数の側鎖が、ヘアピンの親水性面上に存在してもよく、その逆であってもよいが、折り畳まれた構造の全体の両親媒性を変化させるほどは多くない。β−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングされ得るペプチドの非限定例は、本明細書にＨＬＴ２として提供される。
がん：分化の喪失、成長速度の増加、周囲の組織への侵襲を示す特徴的な退形成を受けた、転移し得る悪性新生物（例えば、腫瘍）。転移性がんは、転移性がんが由来する元の（原発）がんの出現部位以外の身体中の１つまたは複数の部位でのがんである。一部の例では、がんは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡの発現が、同じ組織型の正常または健康な組織と比較して、新生物において変更される（例えば、増加または減少する）状態である。
化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患の処置において治療的有用性を示す任意の化学薬剤。そのような疾患は、腫瘍、新生物、およびがんを含む。一実施形態では、化学療法剤は、悪性胸膜中皮腫などの、漿膜新生物を処置するのに有用な薬剤である。使用することができる化学療法剤の非限定例としては、微小管結合剤、ＤＮＡ挿入剤または架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節剤、ならびに血管新生阻害剤が挙げられる。
分散する：開示されるペプチドヒドロゲルなどの媒体にわたって分布する。特定の例では、両親媒性カチオン性ペプチドと複合体化したｍｉＲＮＡから構成されるナノ粒子をペプチドヒドロゲル中に分散させ、ペプチドヒドロゲルにわたって均等に分布させる。しかしながら、ペプチドヒドロゲル中のナノ粒子の分散は、絶対的な均等な分布を必要としない。
有効量：状態または疾患と関連する１つまたは複数の兆候または症状を低減させること、または阻害することなどの、所望の応答をもたらすのに十分なものである薬剤（１つまたは複数のｍｉＲＮＡなど）の量。一部の例では、「有効量」は、腫瘍の１つまたは複数の兆候または症状を処置する、または阻害する量である。一部の例では、「有効量」は、薬剤が単独で、または１つもしくは複数のさらなる療法と共に、対象中の腫瘍のサイズ、対象中の腫瘍の数、対象中の腫瘍転移のサイズもしくは数の減少、および／または対象の生存期間（無病生存期間、無転移生存期間、または全生存期間など）の増加などの所望の応答を誘導する治療有効量である。
発現ベクター：発現させようとするヌクレオチド配列に作用的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクター。発現ベクターは、発現のための十分なｃｉｓ作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントを、宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給することができる。発現ベクターの非限定例としては、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミドおよびＤＮＡプラスミドを含む。
単離された：「単離された」生体成分（核酸分子、タンパク質、または細胞など）は、他の生体成分（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞などの、成分が天然に存在する生物の細胞もしくは組織、または生物自体中の）から実質的に分離されている、または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製されたものを含む。この用語はまた、宿主細胞中での組換え発現によって調製された核酸分子（ｍｉＲＮＡを含む）およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質も包含する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）：遺伝子発現を調節する一本鎖の小さい非コードＲＮＡ分子。ｍｉＲＮＡは、一般に、約１６〜２７ヌクレオチド長である。ｍｉＲＮＡは、典型的には、標的ｍＲＮＡの切断を促進することによって、または細胞転写物の翻訳を遮断することによって、遺伝子発現をモジュレートする（例えば、翻訳を増加または減少させる）。ｍｉＲＮＡは、プリ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として公知である一次転写物から、前駆体（プレ）−ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造へとプロセシングされ、最終的に機能的な成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つまたは複数のメッセンジャーＲＮＡ分子と部分的に相補的であり、その主な機能は、遺伝子発現を下方調節することである。本明細書で利用される場合、「ｍｉＲ核酸」または「ｍｉＲＮＡ核酸」とは、プリ−ｍｉＲＮＡ、プレ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ二重鎖、または成熟ｍｉＲＮＡのいずれかを指す。
ｍｉＲＮＡに関する命名スキームは確立されている。例えば、ｍｉＲＮＡの名称は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓについては「ｈｓａ」などの３または４文字の種の接頭辞、および「１」などの数値の接尾辞を含み、「ｈｓａ−ｍｉＲ−１」の完全な名称が得られる。１より多いヘアピン前駆体分子から発現される成熟ｍｉＲＮＡ配列は、「−１」および「−２」によって区別される（ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−１およびｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２など）。関連する成熟ｍｉＲＮＡ配列を発現する関連ヘアピン遺伝子座は、文字による接尾辞を有する（ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａおよびｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂなど）。一部の場合、それぞれ、「５ｐ」または「３ｐ」と指定される、ヘアピン前駆体の５’アームと３’アームの両方に由来する成熟ｍｉＲＮＡが同定される（ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐなど）。
多くの公知のｍｉＲＮＡ配列が公式に入手可能である。例えば、ｍｉＲＢａｓｅ（ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）は、注釈付きのｍｉＲＮＡ配列の検索可能なデータベースを含む。ｍｉＲＮＡ配列はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を含む当業者には公知の他のデータベースを介しても入手可能である。当業者であれば、例えば、ＭｉｃｒｏＣｏｓｍ Ｔａｒｇｅｔｓ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎｒｉｇｈｔ−ｓｒｖ／ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ／ｈｔｄｏｃｓ／ｔａｒｇｅｔｓ／）、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）、およびＰｉｃＴａｒ（ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ）において、公共データベースおよびアルゴリズムを利用して特異的ｍｉＲＮＡのための標的を同定することもできる。ある生物（マウスなど）に由来するｍｉＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、利用可能なデータベースを利用して、別の生物（ヒトなど）に由来する対応するｍｉＲＮＡを決定することができる。
ｍｉＲＮＡミミックまたはミメティック：ｍｉＲＮＡミメティックは、天然型または野生型ｍｉＲＮＡと同じ配列を有するが、改変骨格、改変塩基、および／または５’もしくは３’末端改変を有するｍｉＲＮＡを含む。一部の例では、ｍｉＲＮＡミメティックは、分解またはヌクレアーゼ活性の影響をあまり受けなくてもよい。ｍｉＲＮＡミミックは、少なくとも１つの配列改変を有し、天然型または野生型ｍｉＲＮＡに対する７５％またはそれより高い配列同一性を有し、また、野生型または天然型ｍｉＲＮＡと類似する親和性で同じｍＲＮＡに結合するｍｉＲＮＡである。開示されるｍｉＲＮＡはまた、ｍｉＲＮＡミメティックとｍｉＲＮＡミミックの両方であってもよく、例えば、野生型ｍｉＲＮＡに対する少なくとも１つの配列改変（例えば、７５％またはそれより高い配列同一性）を有し、また、改変骨格、塩基、および／または末端改変も有するｍｉＲＮＡであってもよい。
ナノ粒子：約１０〜１０００ｎｍのサイズの範囲である固体コロイド粒子。それらを、生分解性および生体適合性の生体材料から作製することができる。開示される実施形態において使用されるナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞中に取り込まれ得る静電相互作用によって核酸分子と複合体化したカチオン性ペプチドを含む。
核酸分子：一本鎖または二本鎖形態にあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーであり、別途限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似する様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含する。核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに上記の合成形態および混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む。別途特定されない限り、核酸分子は通常、少なくとも１０塩基長である。
ペプチド：２０〜５０アミノ酸長などの、典型的には７５アミノ酸長未満のアミノ酸の鎖。ペプチド中の残基は、グリコシル化、硫酸化またはリン酸化などの翻訳後または二次改変、ならびに化学的改変を含んでもよい。「ペプチド」は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび１つまたは複数のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーを含む天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも適用される。「残基」とは、アミド結合またはアミド結合ミメティックによってペプチド中に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸ミメティックを指す。ペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）とカルボキシ末端（Ｃ末端）とを有する。
典型的には、ペプチドを構成するアミノ酸は順番に番号付けされ、それは、アミノ末端で開始し、ペプチドのカルボキシ末端の方向に向かって増加する。かくして、あるアミノ酸が別のアミノ酸の「後」にあると言われる場合、そのアミノ酸は、前のアミノ酸よりもペプチドのカルボキシ末端に近い方に位置する。
ペプチドヒドロゲル：水性溶液が分散媒体であり、ペプチドの自己集合したネットワークが内部相である、内部相と分散媒体とを含むコロイドゲル。ヒドロゲル中のペプチドは、自己集合し、ヒドロゲルの内部相を形成する線維ネットワーク中でβ−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれる。本明細書に開示されるペプチドヒドロゲルは、２５〜３７℃で１５０ｍＭのＮａＣｌを含みｐＨ７．４である水性溶液中でβ−ヘアピンコンフォメーションを形成するペプチドを使用して作製される。かくして、２％ｗ／ｖの開示されるペプチドおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨ７．４である水性溶液は、容器中、２５〜３７℃でインキュベートした場合、ペプチドの線維ネットワークを含むペプチドヒドロゲルを形成する。ペプチドヒドロゲルは、形状を維持させる十分な弾性係数または剛性を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドヒドロゲルは、４０パスカルまたはそれより高い弾性係数を有する。β−ヘアピンコンフォメーションにある開示される自己集合したペプチドから形成されるペプチドヒドロゲルは、剪断減粘／回復の流動学的特性によって特徴付けられてもよい。ヒドロゲルは、剪断応力の印加の際にゲル−ゾル相転移を、剪断応力の除去の際にゾル−ゲル相転移を受ける。かくして、剪断応力の印加は、固体状ゲルを、流動できる粘性ゲルに変換し、剪断の停止はゲルの回復をもたらす。剪断減粘／回復の流動学的特性を有するペプチドヒドロゲルに関する一般的情報およびそれを作製する方法は、例えば、Ｓａｔｈａｙｅ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１４， １５（１１）：３８９１−３９００；Ｈｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｆａｒａｄａｙ Ｄｉｓｃｕｓｓ， １３９：２５１−４２０に提供されている。いくつかの実施形態では、ペプチドヒドロゲルは、治療剤を対象に送達するために使用するための生理学的および非毒性分散媒体を用いて調製された滅菌ヒドロゲルであってもよい。
ポリペプチドおよびペプチド改変：本開示は、合成ペプチド、ならびに本明細書に記載のペプチドの誘導体（開示されるポリペプチド配列から出発して得られる化学的に官能化されたポリペプチド分子）およびバリアント（ホモログ）を含む。本明細書に開示されるペプチドは、天然に存在する、およびそうではない、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸を含んでもよいアミノ酸の配列を含む。
ペプチドを、様々な化学的技術によって改変して、非改変ポリペプチドと本質的に同じ活性を有し、必要に応じて、他の望ましい特性も有する誘導体を製造することができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基を、カルボキシル末端であっても、側鎖であっても、薬学的に許容されるカチオンの塩の形態で提供するか、またはエステル化して、Ｃ１〜Ｃ１６エステルを形成させるか、または式ＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立にＨもしくはＣ１〜Ｃ１６アルキルであるか、または組み合わさって、５もしくは６員環などの複素環式環を形成する）のアミドに変換することができる。ポリペプチドのアミノ基は、アミノ末端であっても、側鎖であっても、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および他の有機酸塩などの薬学的に許容される酸付加塩の形態にあってよいか、あるいはＣ１〜Ｃ１６アルキルもしくはジアルキルアミノに改変するか、またはアミドにさらに変換してもよい。
ポリペプチド側鎖のヒドロキシル基を、十分認識された技術を使用してＣ１〜Ｃ１６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ１６エステルに変換することができる。ポリペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環を、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩなどの１つもしくは複数のハロゲン原子で、またはＣ１〜Ｃ１６アルキル、Ｃ１〜Ｃ１６アルコキシ、そのカルボン酸およびエステル、もしくはそのようなカルボン酸のアミドで置換することができる。ポリペプチド側鎖のメチレン基を、相同なＣ２〜Ｃ４アルキレンに伸長させることができる。チオールを、アセトアミド基などの、いくつかの十分認識された保護基のいずれか１つを用いて保護することができる。当業者であれば、環状構造を本開示のポリペプチド中に導入して、安定性の増強をもたらす、該構造に対する立体構造制約を選択および提供するための方法も認識する。例えば、酸化された時に、ポリペプチドがジスルフィド結合を含有し、環状ポリペプチドを生成するように、ＣまたはＮ末端システインをポリペプチドに付加することができる。他のポリペプチド環化方法は、チオエーテルならびにカルボキシル末端およびアミノ末端アミドおよびエステルの形成を含む。
対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーの、生きている多細胞脊椎生物。一例では、対象はヒトである。
疾患を処置または防止すること：疾患を「防止すること」とは、例えば、がんなどの疾患の素因を有することが知られる人における、疾患の完全な発達を阻害することを指す。「処置すること」とは、疾患が生じ始めた後に疾患または病態の兆候または症状を改善する治療介入を指す。「改善すること」とは、がんなどの疾患の兆候または症状の数または重症度の減少を指す。いくつかの実施形態では、処置は、腫瘍のサイズの低下、転移の数および／もしくはサイズの減少、または腫瘍の症状の減少を指す。
腫瘍負荷：対象における、または対象の臓器における、腫瘍または複数の腫瘍の総体積、数、転移、またはその組合せ。
〜にとって十分な条件下：所望の活性を可能にする任意の環境を記載するために使用される語句。一例では、所望の活性は、腫瘍の処置である。
Ｂ．核酸送達のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料
本明細書に提供されるのは、ペプチドヒドロゲル内に分散されたコロイドペプチド−核酸分子ナノ粒子を含有するナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の実施形態である。ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、剪断減粘／回復機械特性を示し、ヒドロゲル内に分散されたナノ粒子−ヒドロゲル複合材料および任意のさらなる治療剤を、例えば、解剖学的表面を被覆するための、シリンジ注射による経皮もしくは外科的アクセス、または噴霧送達によって体腔に局部的に送達することができる。適用後、ナノ粒子は、ヒドロゲルマトリックスから隣接組織へと持続放出され、細胞によって取り込まれる。細胞によって内在化されたら、核酸分子は、ナノ粒子から放出され、（核酸分子に応じて）細胞機能に影響し得る。
ペプチド−核酸分子ナノ粒子は、β−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性ペプチドと複合体化した核酸分子を含む。ペプチドヒドロゲルは、β−ヘアピンコンフォメーションにある第２の両親媒性カチオン性ペプチドの線維ネットワークから形成される。
ヒドロゲルは、組合せ療法を可能にする他の生物薬剤（例えば、封入された化学療法剤）を担持してもよい。ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の成分の考察は、以下に提供される。
ナノ粒子
ペプチドヒドロゲル内に封入されたナノ粒子は、β−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性ペプチドと複合体化した核酸分子を含む。
第１の両親媒性カチオン性ペプチドを、そのペプチドが、核酸分子と第１の両親媒性カチオン性ペプチドとの複合体を形成するβ−ヘアピンコンフォメーションにない条件下で、核酸分子と混合する。ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料のナノ粒子成分を、例えば、ペプチド−核酸分子ナノ粒子を形成するのに十分な条件下で、水中で第１の両親媒性カチオン性ペプチドと核酸分子とを混合することによって、容易に製造することができる。水性溶液中でペプチド：核酸分子ナノ粒子を効率的に形成する、ペプチドの核酸分子に対する任意の好適な比を使用することができる。線状の第１の両親媒性カチオン性ペプチドと核酸分子とは、カチオン性ペプチドとアニオン性核酸との静電相互作用によって相互作用して、ナノ粒子を形成する（例えば、図１Ａ、段階１を参照されたい）。
ナノ粒子が形成されたら、それらを、第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドがβ−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングし、ナノ粒子を封入したペプチドヒドロゲルを形成するのに十分な条件下で、第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドと混合する（２５℃の５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌなど）。これらの条件下およびゲル化後、第１のペプチド−核酸分子複合体は、ペプチドヒドロゲル内に分散されたコロイドナノ粒子である。
ナノ粒子がペプチドヒドロゲルから放出され、細胞によって内在化されるとき、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは核酸分子から解離し、核酸分子がその生物学的作用を媒介することを可能にする。β−ヘアピンコンフォメーションにアンフォールドした第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、ナノ粒子が細胞によって内在化された後、核酸分子からのペプチドの解離を促進すると考えられる。
第１の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は、中性ｐＨで第２の両親媒性カチオン性ペプチド（ペプチドヒドロゲルを形成させるために使用される）の静電荷と等しいか、またはそれより多くの正電荷を有する。一部の実施形態では、中性ｐＨで、第１の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は、＋７〜＋１０（＋７、＋８、＋９、または＋１０など）であり、第２の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は、＋３〜＋８（＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、または＋８など）である。一部の実施形態では、中性ｐＨで、第１の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は＋９であり、第２の両親媒性カチオン性ペプチドの静電荷は＋５である。
一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（１）（ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０（＋７、＋８、＋９、または＋１０など）の正味の形式電荷を有する。
ペプチドのＣ末端は、カルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含む（例えば、Ｃ末端をアミド化してもよい）。ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれるが、水中に溶解した場合はβ−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングされない。
ペプチド（１）の一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（１ａ）（ＸＺ）ｎ ＸＤＰＰＸ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０（＋７、＋８、＋９、または＋１０など）の正味の形式電荷を有する。ペプチドのＣ末端は、カルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含む（例えば、Ｃ末端をアミド化してもよい）。ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれるが、水中に溶解した場合はβ−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングされない。
ペプチド（１）の一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（１ｂ）（ＸＺ）ｎ ＸＤＰＧＸ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０（＋７、＋８、＋９、または＋１０など）の正味の形式電荷を有する。
ペプチドのＣ末端は、カルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含む（例えば、Ｃ末端をアミド化してもよい）。ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれるが、水中に溶解した場合はβ−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングされない。
ペプチド（１）の一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（１ｃ）（ＸＺ）ｎ Ｘ ＮＧＸ（ＺＸ）ｎ（配列番号１）
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０（＋７、＋８、＋９、または＋１０など）の正味の形式電荷を有する。
ペプチドのＣ末端は、カルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含む（例えば、Ｃ末端をアミド化してもよい）。ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれるが、水中に溶解した場合はβ−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングされない。
ペプチド（１）の一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（１ｄ）ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫＶ
（１ｅ）ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＧＴＫＶＫＶＫＶＫＶ
（１ｆ）ＶＫＶＫＶＫＶＫＶ ＮＧＴＫＶＫＶＫＶＫＶ（配列番号２）
として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
ペプチドのＣ末端は、カルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含む（例えば、Ｃ末端をアミド化してもよい）。ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれるが、水中に溶解した場合はβ−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングされない。
一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドのＮ末端は、アセチル化されている。一部の実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドのＣ末端は、アミド化されている。
いくつかの実施形態では、第１の両親媒性カチオン性ペプチドは、ナノ粒子の核酸分子への結合を嫌うと考えられる、負に荷電したアミノ酸を含有しない。
ナノ粒子中に含まれる核酸分子
ナノ粒子中の核酸分子は、ナノ粒子の状況での細胞への送達のための任意の適切な核酸分子であってもよい。非限定例としては、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、長い非コードＲＮＡが挙げられる。
非限定的な実施形態では、核酸分子は、治療タンパク質（例えば、対象に投与した場合に所望の治療または予防効果をもたらすことができるタンパク質）をコードするプラスミドＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、治療タンパク質は、ワクチン抗原である。
一部の実施形態では、核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはアンチセンスｍｉＲＮＡ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックなどの、アンチセンス核酸分子である。
好ましい実施形態では、核酸分子は、ｍｉＲＮＡ、または（ｏｒ ａ ｏｒ）そのミミックおよび／もしくはミメティックである。ｍｉＲＮＡまたはそのミミックおよび／もしくはミメティックを、例えば、がんを処置するための方法において利用することができる。
ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を調節する小さい非コードＲＮＡ分子である。成熟ｍｉＲＮＡは、一般に、約１７〜２５ヌクレオチド長である。ｍｉＲＮＡは、典型的には、標的ｍＲＮＡの切断を促進することによって、または細胞転写物の翻訳を遮断することによって、遺伝子発現をモジュレートする（例えば、翻訳を増加または減少させる）。ｍｉＲＮＡは、「プリ−ｍｉＲＮＡ」として公知である一次転写物から、「前駆体（プレ）−ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる短いステムループ構造へとプロセシングされる。プレ−ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ二重鎖にプロセシングされ、最終的には、機能的な成熟一本鎖ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。ｍｉＲＮＡ二重鎖のプロセシングの間に、一方の鎖（「パッセンジャー」鎖と呼ばれる）は分解されるが、他方の鎖（「ガイド」鎖）は成熟ｍｉＲＮＡ分子である。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つまたは複数のメッセンジャーＲＮＡ分子と部分的に相補的であり、その主な機能は、遺伝子発現を下方調節することである。本明細書に開示されるように、ｍｉＲＮＡ核酸は、前駆体ｍｉＲＮＡ、ならびに（ａｓ ｗｅｌｌ）プロセシングされた、または成熟ｍｉＲＮＡ核酸を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ核酸は、プリ−ｍｉＲＮＡ、プレ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ二重鎖、または成熟ｍｉＲＮＡ核酸であってもよい。
ｍｉＲＮＡ配列は、公式に入手可能である。当業者であれば、例えば、公式に利用可能なデータベースを利用して、ｍｉＲＮＡ前駆体、ならびにプロセシングされた、または成熟ｍｉＲＮＡを同定することができる。例えば、ｍｉＲＢａｓｅ（ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）は、注釈付きのｍｉＲＮＡ配列の検索可能なデータベースを含む。ｍｉＲＮＡ配列はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を含む当業者には公知の他のデータベースを介しても入手可能である。当業者であれば、例えば、ＭｉｃｒｏＣｏｓｍ Ｔａｒｇｅｔｓ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎｒｉｇｈｔ−ｓｒｖ／ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ／ｈｔｄｏｃｓ／ｔａｒｇｅｔｓ／）、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）、およびＰｉｃＴａｒ（ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ）において、公共データベースおよびアルゴリズムを利用して特異的ｍｉＲＮＡのための標的を同定することもできる。ある生物（マウスなど）に由来するｍｉＲＮＡ配列に基づいて、当業者であれば、利用可能なデータベースを利用して、別の生物（ヒトなど）に由来する対応するｍｉＲＮＡを決定することができる。
一部の例では、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの切断または不安定化を活性化することによって機能し、これを、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＦＲＥＴ、ノーザンブロット、または配列決定によって検出することができる。また、それは標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することによっても機能し、これを、ウェスタンブロット、免疫ブロッティング、蛍光偏光アッセイ、酵素活性アッセイ、ＦＲＥＴ、免疫蛍光、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、または質量分析によって検出することができる。標的化ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの発現の得られる変化は、腫瘍成長および進行をもたらす、細胞増殖、細胞死耐性、炎症性プロセス、遊走および侵襲の増加、血管新生、免疫破壊の回避、複製による不死化、ゲノム安定性の低下、細胞エネルギー特性の調節解除、ならびに／またはエピジェネティックプロセスの調節解除を含むいくつかのがん関連表現型の抑制をもたらし得る。
一部の例では、本明細書に開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料および方法において有用なｍｉＲＮＡ核酸は、表１に列挙される成熟ｍｉＲＮＡを含む。他の例では、ｍｉＲＮＡ核酸は、そのような改変ｍｉＲＮＡが非改変ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の機能を保持する限り、表１に列挙されるものに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するもの（例えば、ｍｉＲＮＡミミック）を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ核酸は、表１に列挙されるｍｉＲＮＡの１つの核酸配列と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、またはそれからなる。開示される組成物および方法において有用なさらなるｍｉＲＮＡ核酸は、そのような改変ｍｉＲＮＡが非改変ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の機能を保持する限り、ガイドおよび／またはパッセンジャー鎖を含むｍｉＲＮＡを含む。一部の例では、表１に示されるものに対して少なくとも７５％配列同一性を有するｍｉＲＮＡは、少なくとも１個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多いなど）の天然に存在しないヌクレオチドを含む。
表１． 開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料における使用のための例示的な成熟ヒトｍｉＲＮＡ
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一部の実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる核酸分子は、表１に列挙される成熟ｍｉＲＮＡのいずれか１つ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックから選択される、ｍｉＲＮＡ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックである。一部の実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、表１に列挙される成熟ｍｉＲＮＡ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックから選択される、２個またはそれより多い（２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個など）ｍｉＲＮＡを含む異なるナノ粒子の混合物を含む。
好ましい実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３７０のいずれか１つ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックから選択されるｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３７０、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックから選択される、２個もしくはそれより多い（２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個など）ｍｉＲＮＡ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックを含む異なるナノ粒子の混合物を含む。
さらなる例では、ｍｉＲＮＡ核酸は、そのｍｉＲＮＡ核酸が、ｍｉＲＮＡ標的配列へのハイブリダイゼーションまたはｍｉＲＮＡ二重鎖の形成などの、特定のｍｉＲＮＡの機能を保持する限り、本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ核酸のいずれか１つのヌクレオチド配列よりわずかに長い、または短い。例えば、ｍｉＲＮＡ核酸は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列の５’または３’末端に、数個のヌクレオチドの欠失または付加、例えば、５’もしくは３’末端から１、２、３、４個、またはそれより多いヌクレオチドの付加もしくは欠失、またはその組合せ（一方の末端からの欠失および他方の末端への付加など）を含んでもよい。特定の例では、本明細書に記載の改変ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡパッセンジャー鎖の３’末端での１個または複数のヌクレオチド（例えば、１、２、３個、またはそれより多いヌクレオチド）の付加などの、３’末端での１個または複数のヌクレオチドの付加を含む。
また、そのような改変ｍｉＲＮＡが非改変ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の機能を保持する限り、開示されるｍｉＲＮＡ配列に対する変化を含むｍｉＲＮＡも本開示によって提供される。一部の例では、改変は、ガイド鎖−パッセンジャー鎖二重鎖の安定性の増加を提供する。一部の例では、改変は、ｍｉＲＮＡ中の１個または複数のヌクレオチド（１、２、３、４、５個、またはそれより多いヌクレオチドなど）に置換を含む。
また、１個または複数の改変ヌクレオチドまたは核酸アナログを含むｍｉＲＮＡ核酸などの、ｍｉＲＮＡミメティックも提供される。一部の実施形態では、単離されたｍｉＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼ耐性を増加させる、半減期を増強する、および／または有効性を改善するための、少なくとも１つの核酸塩基改変を含む。ｍｉＲＮＡへの適用にとって好適な核酸塩基改変は、当業界で公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９８４０７号；第２００７／０２１３２９２号；第２００６／０２８７２６０号；第２００６／００３５２５４号；第２００６／０００８８２２号；および第２００５／０２８８２４４号を参照されたい）。
一部の例では（例えば、ヌクレアーゼ耐性および／または標的核酸分子に対する結合親和性を増加させるため）、本開示のｍｉＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル、２’−フッ素、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−アミノ糖改変および／またはホスホロチオエート結合を含む。ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）（例えば、２’−４’−エチレン架橋核酸）およびある特定の核酸塩基改変の含有も、標的に対する結合親和性を増加させることができる。オリゴヌクレオチド骨格中へのピラノース糖の含有も、エンドヌクレアーゼによる切断を減少させることができる。さらなる改変としては、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、α−Ｌ−ＬＮＡ、４’−Ｃ−ヒドロキシメチル−ＤＮＡ、２’−Ｎ−アダマンチルメチルカルボニル−２’−アミノ−ＬＮＡ、２’−Ｎ−ピレン−１−イルメチル−２’−アミノ−ＬＮＡ、Ｅ２’−アミノエチル、２’−グアニジノエチル、２’−シアノエチル、２’−アミノプロピル、オキセタン−ＬＮＡ、２’，４’−炭素環式−ＬＮＡ−ロックド核酸、２’，４’−炭素環式−ＥＮＡ−ロックド核酸、２’−デオキシ−２’−Ｎ，４’−Ｃ−エチレン−ＬＮＡ、アルトリトール核酸、ヘキシトール核酸、２’−アミノエトキシメチル、および２’−アミノプロポキシメチルが挙げられる。
さらなるｍｉＲＮＡミメティックは、改変骨格または非天然ヌクレオシド間結合を有するｍｉＲＮＡを含む。改変骨格を有するオリゴマーは、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子を有しないものを含む。ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有しない改変オリゴヌクレオチドは、一般的には、当業界では核酸塩基オリゴマーと呼ばれる。改変オリゴヌクレオチド骨格を有する核酸塩基オリゴマーとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
リン原子を中に含まない改変オリゴヌクレオチド骨格を有するｍｉＲＮＡは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにその他、混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するものを有するものが挙げられる。
他の例では、改変ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡミメティック）は、１つまたは複数の置換された糖部分を含む。そのような改変としては、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−アミノプロポキシ、および２’−フルオロ改変が挙げられる。改変を、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマー上の他の位置で、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位で作製することもできる。核酸塩基オリゴマーは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖ミメティックも有してもよい。
さらなる例では、改変ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡミメティック）は、５’または３’末端に改変を含む。そのような改変は、ｍｉＲＮＡの５’末端に第一級アミノ基（例えば、アミノ−Ｃ３、アミノ−Ｃ６、またはアミノ−Ｃ１２などの炭素スペーサーを有する）を含む。さらなる末端改変としては、ＵＮＡ、メチルホスホネート、ホスフィトレート（ｐｈｏｓｐｈｉｔｈｏｒａｔｅ）、逆向き塩基、またはＮ−メチル−Ｇキャップが挙げられる。
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、塩基置換、ヌクレオシド間結合での改変、改変糖、または５’および／もしくは３’末端での改変から選択される２つまたはそれより多い改変などの、２つまたはそれより多い改変を含む。二重鎖ｍｉＲＮＡ分子については、改変は、ガイド鎖、パッセンジャー鎖、またはその両方に存在してもよい。
一部の例では、本明細書に開示される改変（例えば、ミミックまたはミメティック）ｍｉＲＮＡ核酸は、５’−アミノＣ６改変（５’−アミノＣ６改変パッセンジャー鎖など）などの、５’末端アミノ改変を含む。他の例では、改変（例えば、ミミックまたはミメティック）ｍｉＲＮＡ核酸は、２’改変（２’−Ｏ−Ｍｅなど）を有する１個または複数のヌクレオチド（１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれより多いヌクレオチドなど）を含む。２’改変ヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡにとって内部にあってよく（改変はいずれも５’および３’末端ヌクレオチド上にはない）、または５’および／もしくは３’末端ヌクレオチドを含んでもよい。一部の例では、ｍｉＲＮＡガイド鎖は、２’改変を有する１個または複数のヌクレオチド（３〜１０、４〜９、または５〜８ヌクレオチドなど）を含む。特定の例では、ガイド鎖は、１個または複数の内部ヌクレオチド上に２’改変を含み、一部の例では、５’または３’末端ヌクレオチド上には含まない。他の例では、ｍｉＲＮＡパッセンジャー鎖は、２’改変を有する１個または複数のヌクレオチド（３〜１０、４〜８、または５〜７ヌクレオチドなど）を含む。特定の例では、パッセンジャー鎖は、５’または３’末端ヌクレオチド上に２’改変を含むが、１個または複数の内部ヌクレオチドの２’改変も含んでもよい。
一部の実施形態では、開示されるｍｉＲＮＡ核酸または改変（例えば、ミメティックまたはミミック）ｍｉＲＮＡ核酸は、検出可能な標識と会合している。一部の例では、ｍｉＲＮＡ核酸は、蛍光標識（フルオレセインイソチオシアネート、クマリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素など）、ハプテン（ジゴキシゲニンまたはＭｙｃなど）、または放射性標識にコンジュゲートされる。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ核酸を、ｔａｔ、ＭＡＣＶ ＧＰ１、葉酸受容体、ペネトラチン、メソテリン、または表皮成長因子受容体などの、ペプチドまたはタンパク質と会合させる（例えば、標的化送達を容易にするために）。当業者であれば、特定の状況に応じて、さらなる検出可能な標識またはペプチドを選択することができる。
一部の実施形態では、ナノ粒子中に含まれる核酸分子は、１つまたは複数の開示されるｍｉＲＮＡ核酸またはそのミミックもしくはミメティックをコードするプラスミドＤＮＡ分子である。プラスミドＤＮＡ分子によってコードされるｍｉＲＮＡ核酸またはそのミミックもしくはミメティックを、発現のために任意の好適なプロモーターに作動可能に連結することができる。プラスミドからＲＮＡを発現させるための好適なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当業界における技術の範囲内にある。組換えプラスミドはまた、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物の発現のための誘導性または調節性プロモーターを含んでもよい。１つの非限定的な実施形態では、ｍｉＲＮＡ核酸は、プラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、前駆体分子は、標的細胞内で機能的または成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。ｍｉＲＮＡを発現させるための好適なプラスミドの選択、遺伝子産物を発現させるためにプラスミド中に核酸配列を挿入するための方法、および組換えプラスミドを目的の細胞に送達する方法は、当業界における技術の範囲内にある（例えば、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ９：１３２７−１３３３， ２００２；Ｔｕｓｃｈｌ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０：４４６−４４８， ２００２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｒｎｐ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３， ２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：４９７−５００， ２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １６：９４８−９５８， ２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：５００−５０５， ２００２；およびＰａｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：５０５−５０８， ２００２を参照されたい）。
ペプチドヒドロゲル
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料のペプチドヒドロゲル成分は、β−ヘアピンコンフォメーションにある第２の両親媒性カチオン性ペプチドの線維ネットワークから形成される。
ヘアピンのβ鎖領域は、折り畳まれた状態で、ペプチドの一方の面（例えば、バリンに富む面）が疎水性であり、反対の面（例えば、リシンに富む面）は正に荷電した側鎖で裏打ちされ、親水性であるように、疎水性残基（例えば、バリン）と親水性（荷電）残基（例えば、リシン）との交互の配列を含有する。この両親媒性配置は、分子間ペプチド相互作用、およびヒドロゲル形成にとって必要なフィブリル配置を容易にする。
自己集合は、折り畳まれたヘアピンの疎水性面の疎水性会合によって表面で促進され、ならびにＨ結合形成および近隣のヘアピン間の疎水性ファンデルワールス接触によって側面で促進される。これらのパラメーターの詳細な知識は、自己集合プロセスの制御、かくして、最終的なヒドロゲル材料特性の制御を可能にする。例えば、フォールディング条件下で、ペプチドは望ましい二次構造を採ってもよい（例えば、ヘアピン中のそれぞれのβ鎖の一方の面は疎水性残基で裏打ちされ、他方の面は親水性残基で裏打ちされる、両親媒性βヘアピン構造を採ってもよい）。例えば、分子内フォールディングは、フォールディングの際の親水性面上の電荷密度の軽減、分子内疎水性ファンデルワールス相互作用の形成、ヘアピン内のβ鎖間の分子内水素結合の形成、およびペプチド中に含まれるβターン配列のターン傾向によって決定付けられる。
かくして、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料のヒドロゲル成分における使用のためのペプチドを、少なくとも以下のパラメーターのうちの１つまたは複数を変化させることによって、望ましい特徴を有するように構築することができる：１）静電気：例えば、ペプチド内の電荷を変化させることによって、分子内フォールディングおよび自己集合率を変化させることができる；２）ファンデルワールス相互作用：例えば、ａ）側面および表面の分子間疎水性相互作用ならびに／またはｂ）分子内疎水性相互作用が変化するペプチドの構築は、ペプチドのフォールディングおよび自己集合ならびにヒドロゲルの材料特性を変化させる；３）水素結合：例えば、ペプチドを、ａ）分子内および／またはｂ）分子間水素結合形成を変化させて構築して、フォールディング、自己集合および最終的な材料特性を変化させることができる；ならびに４）ターン配列：例えば、本発明のペプチドのターン領域を、フォールディングを制御し、かくして、自己集合を引き起こすように設計することができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、間欠性の４残基のターン配列に隣接する高いβシート傾向の残基を含む。極性および無極性残基を、鎖領域中に逐次的に配置して、ペプチドがβ−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれる場合に両親媒性表面を得ることができる。４残基のターン配列について、ペプチドは、典型的にはＩＩ’型βターンを形成する４個の残基（ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、およびｉ＋３と呼ばれる）を含む。開示されるＭＡＸ１ペプチドにおいては、これらの４個の残基は、ＶＤＰＰＴであり、ＩＩ’型βターンは、ターン配列のＤＰＰ部分（「Ｄ」は、最初のプロリン残基のＤ立体化学を示す）が採る二面角（ファイおよびプサイ）によって定義される。ＩＩ’型ターンを定義する好ましいファイおよびプサイ二面角（度）は、残基ｉ＋１（６０、−１２０）；残基ｉ＋２（−８０、０）である。しかしながら、これらの値は、＋／−２０度ずつ変化してもよく、ペプチドは、適切なβターン構造を依然として形成することができる。
１つの特定の実施形態では、２０残基のペプチドであるＨＬＴ２は、ＩＩ’型βターン構造を採るように設計された間欠的テトラペプチド−ＶＤＰＰＴ−に隣接する高いβシート傾向のバリン、グルタミン酸、およびセリン残基から構成される。ヘアピン構造を安定化するために部分デザイン要素を組み込むことに加えて、自己集合した状態でβ−ヘアピン形成を促進するように交互様式でβターンに隣接する極性および無極性残基を配置することによって、非局所効果も考慮した。さらに、β分枝状残基を、ターンのｉ位に置いて、ｉ＋１位でのｔｒａｎｓプロリルアミド結合形状を強化した。この設計エレメントは、フォールディング条件下で、モノマーヘアピンの分子内フォールディングが、自己集合の前に促進されることを確保する。それに対して設計される、ｃｉｓプロリル結合は、伸長したコンフォメーションで各モノマー内での個々のβ鎖の提示をもたらすことができる。ｃｉｓとｔｒａｎｓの両方の配座異性体を採ることができるペプチドは、伸長し、正確に折り畳まれたモノマーの無差別な自己会合を受け、それに対して積極的に設計することができる。
一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（２）（ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８（＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、または＋８など）の正味の形式電荷を有する。
ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれる。
ペプチド（２）の一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（２ａ）（ＸＺ）ｎ ＸＤＰＰＸ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８（＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、または＋８など）の正味の形式電荷を有する。
ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれる。
ペプチド（２）の一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（２ｂ）（ＸＺ）ｎ ＸＤＰＧＸ（ＺＸ）ｎ
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８（＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、または＋８など）の正味の形式電荷を有する。
ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれる。
ペプチド（２）の一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（２ｃ）（ＸＺ）ｎ Ｘ ＮＧＸ（ＺＸ）ｎ（配列番号９４）
（式中、Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；ｎは、３〜５（３、４または５など）である）として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そのペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８（＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、または＋８など）の正味の形式電荷を有する。
ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれる。
ペプチド（２）の一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、
（２ｄ）ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＬＶ
（２ｅ）ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＧＴＫＶＥＶＫＶＬＶ
（２ｆ）ＶＬＴＫＶＫＴＫＶ ＮＧＴＫＶＥＶＫＶＬＶ（配列番号８２）
として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
ペプチドは、２５℃で５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に２．０％ｗ／ｖで溶解した場合、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれる。
一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドのＮ末端は、アセチル化されている。一部の実施形態では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドのＣ末端は、アミド化されている。
第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、適切な条件下で（例えば、２５℃で、５０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、２．０％ｗ／ｖのペプチド）、βターン、２つのβ鎖、疎水性面、および親水性面を含むβ−ヘアピンコンフォメーションにフォールディングされ得る。適切な条件下で、第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、ペプチドが線維状態でβ−ヘアピンコンフォメーションで折り畳まれる線維ネットワークに自己集合する。
β−ヘアピンコンフォメーション（β−ｈａｉｒｐｉｎ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）にある第２の両親媒性カチオン性ペプチドに基づくペプチドヒドロゲルを含むナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、本明細書に開示される１つまたは複数の第２の両親媒性カチオン性ペプチド（ＨＬＴ２など）およびナノ粒子（ＭＡＸ１：ｍｉＲＮＡ粒子など）を含む水性溶液を調製すること、ならびにヒドロゲルが形成される溶液の１つまたは複数の特徴を変更することによって容易に作製することができる。変更される特徴は、その変更の際にヒドロゲルの形成をもたらす任意の特徴であってもよい。好適な例としては、限定されるものではないが、イオン強度、温度、特定のイオンの濃度、およびｐＨが挙げられる。特定の実施形態では、変更される特徴は、溶液のｐＨであってもよい。第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、約７またはそれより高いｐＨでヒドロゲルを形成する。ｐＨの増加およびイオン強度の増加は両方とも、ヒドロゲル形成を刺激し、この２つの効果は大まかには付加的である。かくして、ｐＨが低いほど、ヒドロゲル形成にとって必要な塩濃度は高い。一部の実施形態では、ヒドロゲルを、容器（シリンジなど）、例えば、密閉容器中で形成させることができる。
一部の実施形態では、溶液の１つまたは複数の特徴の変更は、約５０〜約３００ｍＭ、約１００〜約２００ｍＭ、または約１５０ｍＭなどの、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭの塩濃度をもたらす。任意の塩、例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＦ、ＭｇＳＯ４などを使用することができる。一実施形態では、塩は、ＮａＣｌであってもよい。一部の実施形態では、溶液は、所望のｐＨ、例えば、約７〜約９のｐＨ、約７．５〜約８．５のｐＨ、約７．０〜約８．０のｐＨ、または約７．４のｐＨを有してもよく、ヒドロゲルの形成の際に同じままであるか、または変化してもよい。
１つの非限定的な例では、ヒドロゲルは、５０ｍＭのビストリスプロパン（ＢＴＰ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で形成される。リン酸バッファはβ−ヘアピンペプチドを沈澱させることが公知であるため、リン酸に基づく緩衝系以外の任意の緩衝系を使用することができる。したがって、例えば、適切なイオン強度のバッファを、アンフォールドしたペプチドの水性溶液に添加すること；得られた溶液をシリンジ中に吸い込むこと；およびシリンジ中で直接的にそれを２５℃でゲル化させることによって、第２の両親媒性カチオン性ペプチドを含むペプチドヒドロゲルを簡単に形成させることができる。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、良好に水和された固体材料であり、０．２％のひずみで貯蔵弾性率Ｇ’によって測定された場合、４０パスカル（Ｐａ）より高い剛性を有する。およそ４０Ｐａより上では、材料は自立型固体ゲル材料である。剛性は、より高いペプチド濃度では１０，０００Ｐａより高くに達してもよい。ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、典型的には、水性媒体中に少なくとも０．５ｗｔ％の第２の両親媒性カチオン性ペプチドを含有する。例えば、開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、様々な量の第２の両親媒性カチオン性ペプチド材料を有してもよい。例えば、約０．２５％ｗ／ｖ〜約４．０％ｗ／ｖ、約０．２５％ｗ／ｖ〜約３．０％ｗ／ｖ、約０．２５％ｗ／ｖ〜約２．０％ｗ／ｖ、約０．２５％ｗ／ｖ〜約１．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ〜約４．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ〜約３．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ〜約２．０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ〜約１．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ〜約４．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ〜約３．０％ｗ／ｖ、約１．０％ｗ／ｖ〜約２．０％ｗ／ｖ、約２．０％ｗ／ｖ〜約４．０％ｗ／ｖ、または約２．０％ｗ／ｖ〜約３．０％ｗ／ｖの重量パーセントの第２の両親媒性カチオン性ペプチドを含むナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を形成させることができる。
一態様では、第２の両親媒性カチオン性ペプチドの重量およびゲル化の動態を変化させて、所望の弾性率（剛性）を有するナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を製造することができる。本発明のヒドロゲルは、約４０パスカル（Ｐａ）〜約５０，０００Ｐａ、約４０Ｐａ〜約２５，０００Ｐａ、約４０Ｐａ〜約１０，０００Ｐａ、約４０Ｐａ〜約５，０００Ｐａ、約４０Ｐａ〜約１，０００Ｐａ、約４０Ｐａ〜約５００Ｐａ、約４０Ｐａ〜約１００Ｐａ、約１００Ｐａ〜約５０，０００Ｐａ、約１００Ｐａ〜約２５，０００Ｐａ、約１００Ｐａ〜約１０，０００Ｐａ、約１００Ｐａ〜約５，０００Ｐａ、約１００Ｐａ〜約２，０００Ｐａ、約１００Ｐａ〜約１，０００Ｐａ、約１００Ｐａ〜約５００Ｐａ、または約１００Ｐａ〜約２５０Ｐａの弾性率を有してもよい。
得られるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、機械的に剛性であり、剪断減粘／回復挙動を示す。この特徴は、剪断の適用中には自由流動する懸濁液を提供し、剪断の停止後はゲルネットワークの完全な再形成（自己修復）を提供する。剪断減粘と自己修復（ｓｅｌｆ−ｈｅａｌｉｎｇ）とのこの組合せにより、空間的に分解された様式での材料形成が可能となる。例えば、一部の実施形態では、当業者であれば、予め形成されたナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、それが自己修復し、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を再形成する対象の標的位置に注射または噴霧することができる（剪断減粘）。剪断応力は、ゲルを、より低い粘度の流動性の流体に変換する。剪断応力は、流体がシリンジまたは噴霧ノズルを出て、ゲルが急速に自己修復するときに緩和され、その元の機械的剛性を回復する。この剪断減粘／回復メカニズムにより、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、シリンジまたは噴霧によって対象の標的位置に容易に送達することができる。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料中のペプチドのさらなる説明
開示される実施形態における使用のための第１および第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、それぞれ、核酸分子とナノ粒子複合体を形成するのに、およびペプチドヒドロゲルを形成するのに適切な任意の長さであってもよい。一部の例では、第１および第２のペプチドは、約２０〜約７５残基、例えば、約２０〜約５０残基、約２０〜約４０残基、約２０〜約３０残基、約２０〜約２５残基、約２０〜約５０残基、約２０〜約４０残基、約２０〜約３０残基、または約２０〜約２５残基である（「約」とは、プラスまたはマイナス２残基を指す）。一部の実施形態では、開示される実施形態における使用のためのペプチドは、２０〜７５残基（例えば、２０〜５０残基、２０〜４０残基、２０〜３０残基、２０〜２５残基、２０〜５０残基、２０〜４０残基、２０〜３０残基、または２０〜２５残基）であってもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、３０残基以下または２０残基以下などの、５０残基以下であってもよい。さらなる実施形態では、ペプチドは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０残基の長さであってもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、２０アミノ酸長であってもよい。
開示される実施形態における使用のための第１および第２の両親媒性カチオン性ペプチドを、自動化固相手順などの任意の適切な技術を使用して合成することができる。第１および第２の両親媒性カチオン性ペプチドは、１つまたは複数の改変アミノ酸残基（例えば、Ｄアミノ酸、天然に存在するアミノ酸のホモログ、改変側鎖を有するアミノ酸など）を組み込んでもよい。固相合成のための例示的な技術および手順は、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｂｙ Ｅ． Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ． Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９に記載されている。あるいは、アペリン−３６（４２−５７）ペプチドを、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３７：９３３−９３６， １９９６；Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７：１８８１−１８８７， １９９５；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４５：２０９−２１６， １９９５；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ａｎｄ Ｋｅｎｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：２２１−２２５， １９９２；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６：４１４９−４１５３， １９９４；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｔａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：６５８４−６５８８， １９９４；およびＹａｍａｓｈｉｒｏ ａｎｄ Ｌｉ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３１：３２２−３３４， １９８８に記載されるような、セグメント縮合により調製することができる。本開示のアペリン−３６（４２−５７）ペプチドを合成するのに有用な他の方法は、Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０７：７０８７−７０９２， １９８５に記載されている。
ペプチド合成のためのさらなる例示的な技術は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ｍ． ａｎｄ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， Ａ．， Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４；およびＪｏｎｅｓ， Ｊ．， Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００２によって教示されている。ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＪｏｎｅｓの参考文献は、アミノ酸およびアミノ酸誘導体を活性化し、カップリングするためのパラメーターおよび技術を詳述している。さらに、これらの参考文献は、様々な有用な官能基および保護基を選択、使用および除去する方法を教示している。また、本開示のペプチドの配列を用いて供給品が提供されたら、そのペプチドを合成ペプチドの商業的供給業者から容易に購入することもできる。そのような供給業者としては、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、およびＣｅｌｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）が挙げられる。
合成後、ペプチド精製のための例示的な技術としては、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびゲル電気泳動が挙げられる。特定のペプチド、またはその改変形態を精製するために使用される実際の条件は、部分的には、合成戦略ならびに正味電荷、疎水性、および親水性などの因子に依存する。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料内に封入されるさらなる薬剤
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、ヒドロゲル内に分散された１つまたは複数の異種薬剤を含む。
例えば、一部の実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、ヒドロゲル内に分散された１つまたは複数の異種抗がん剤を含む。抗がん剤の非限定例としては、サイトカイン、ケモカイン、抗体、または化学療法剤が挙げられる。サイトカインは、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターフェロン（ＩＦＮ）βなどのインターフェロンであってもよい。一部の実施形態では、抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａなどの、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体などのＰＤ−１アンタゴニストである。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料中に含めることができる化学療法剤の非限定例としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチン；代謝拮抗物質、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド、およびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍性抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、およびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、およびトラスツズマブ；光増感剤、例えば、アミノレブリン酸、メチルアミノレブリン酸、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペガスパルガーゼ、およびトレチノインが挙げられる。
特定の例では、悪性胸膜中皮腫の処置における使用のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料について、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる異種抗がん剤は、ペメトレキセド、シスプラチン、ベバシズマブ、カルボプラチン、ゲムシタビン、ビノレルビン、またはその２つもしくはそれより多くの組合せを含む。
特定の例では、子宮頸がんの処置における使用のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料について、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる異種抗がん剤は、シスプラチン、フルオロウラシル、パクリタキセル、ベバシズマブ、トトテカン、カルボプラチン、ゲムシタビン、またはその２つもしくはそれより多くの組合せを含む。
特定の例では、胸腺腫または胸腺癌の処置における使用のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料について、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる異種抗がん剤は、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、プレドニゾン、ビンクリスチン、エトポシド、イホスファミド、パクリタキセル、またはその２つもしくはそれより多くの組合せを含む。
特定の例では、卵巣がんの処置における使用のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料について、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる異種抗がん剤は、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ベバシズマブ、またはその２つもしくはそれより多くの組合せを含む。
特定の例では、非小細胞肺がんの処置における使用のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料について、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる異種抗がん剤は、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ベバシズマブ、ペメトレキセド、エトポシド、ゲムシタビン、ビノレルビン、またはその２つもしくはそれより多くの組合せを含む。
特定の例では、非小細胞肺がんの処置における使用のためのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料について、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料に含まれる異種抗がん剤は、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、ベバシズマブ、ペメトレキセド、エトポシド、ゲムシタビン、ビノレルビン、またはその２つもしくはそれより多くの組合せを含む。
本明細書に開示される両親媒性ペプチドは、カチオン性である。したがって、ペプチドヒドロゲル内に封入された異種薬剤を含む典型的な実施形態では、異種薬剤は、薬剤のヒドロゲルマトリックスへの結合を防止するために中性電荷または正味の正電荷を有する。薬剤に応じて、中性電荷または正味の正電荷は、ペプチドヒドロゲル中での保持時間の変化をもたらし得る。
異種薬剤を含むペプチドヒドロゲルを、異種薬剤（化学療法剤など）ならびに本明細書に開示される第２の両親媒性β−ヘアピンペプチド（ＨＬＴ２など）およびナノ粒子（ＭＡＸ１：ｍｉＲＮＡ粒子など）を含む水性溶液を調製すること、ならびにヒドロゲルが形成される溶液の１つまたは複数の特徴を変更することによって、容易に製造することができる。上で考察されたように、変更される特徴は、イオン強度、温度、特定のイオンの濃度、およびｐＨなどの、その変更の際にヒドロゲルの形成をもたらす任意の特徴であってもよい。一部の実施形態では、異種薬剤を含むヒドロゲルを、容器（シリンジなど）、例えば、密閉容器中で形成させることができる。
封入された異種薬剤を含むペプチドヒドロゲルを、任意の好適な目的のために使用することができる。例えば、封入された異種薬剤を有するペプチドヒドロゲルを、それを必要とする対象に投与することができる（例えば、対象中の標的位置への注射によって）。
Ｃ．がんの処置および防止
ＨＬＴ２に基づくヒドロゲルおよびＭＡＸ１：ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５ナノ粒子を含む開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の実施形態の投与は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の成長および転移を阻害することが本明細書に示される。この観察は、がんの処置および阻害（ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ）のための治療剤としての開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の使用を支持する。
したがって、有効量の開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を対象に投与することによって、対象におけるがんを処置または阻害するための方法が本明細書に開示される。複合材料中のナノ粒子は、細胞中に導入されたときに、抗がん効果を有する核酸分子を含む。例えば、核酸分子は、抗がん活性を有する、ｍｉＲＮＡ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティック、あるいは抗がん活性を有する、ｍｉＲＮＡ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックをコードするプラスミドＤＮＡベクターであってもよい。特定の例では、方法は、対象におけるがんを処置または阻害するために、がんを有する対象に、がんにおいて下方調節される１つまたは複数のｍｉＲＮＡを含有するナノ粒子を含む有効な（ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｏｆ）ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を投与することを含む。別の例では、方法は、対象におけるがんを処置または阻害するために、がんを有する対象に、がんにおいて上方調節されるｍｉＲＮＡに特異的に結合する１つまたは複数の抗ｍｉＲ（ｍｉＲＮＡ阻害剤）を含有するナノ粒子を含む有効なナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を投与することを含む。
一部の実施形態では、方法は、対象における存在するがんを処置することを含む。さらなる実施形態では、対象におけるがんの転移を防止するために使用される方法が本明細書に開示される。
開示される方法から利益を得ることができる対象としては、ヒトおよび獣医学的対象が挙げられる。医師であれば、好適な投与形式を、それぞれの対象のために個別に決定することができる。
例えば、対象が漿膜新生物（例えば、悪性胸膜中皮腫）などのがんを有するかどうかを決定するために、開示される療法を開始する前に対象をスクリーニングすることができる。対象におけるがんの存在は、そのがんを本明細書に提供される方法を使用して処置することができることを示す。対象におけるがんの存在を、当業界で公知の方法によって決定することができ、典型的には、細胞学的評価、形態学的評価、または分子に基づく評価を含む。がんは、確立された腫瘍を含むものであってもよい。スクリーニングされるがんの細胞は、生検から得られた細胞を含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのものであってもよい。一部の実施形態では、がん、漿膜新生物（例えば、悪性胸膜中皮腫）を有する、有すると疑われる、または発症するリスクがある対象を、処置のために選択することができる。
本明細書に開示される方法によって処置されるがんは、限定されるものではないが、漿膜新生物（例えば、悪性胸膜中皮腫）を含む、任意の目的のがんであってもよい。開示される方法を使用して処置することができるがんの非限定例としては、皮膚がん、乳がん、脳がん、子宮頸癌、精巣癌、頭頸部がん、消化管がん、泌尿生殖器系がん、婦人科系がん、内分泌系がん、軟部組織および骨の肉腫、中皮腫、黒色腫、ならびに中枢神経系の新生物が挙げられる。一部の実施形態では、がんは、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺、および傍神経節腫のがんなどの、頭頸部がんである。他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんなどの肺がんである。さらなる実施形態では、がんは、食道、胃、膵臓、肝臓、胆道系、小腸、結腸、直腸および肛門領域のがんなどの消化管のがんであってもよい。さらに他の実施形態では、がんは、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎および精巣のがんなどの泌尿生殖器系のがんであってもよい。一部の実施形態では、がんは、子宮頸部、膣、外陰部、子宮体部、妊娠性絨毛性疾患、卵巣、卵管、腹膜、または乳房のがんなどの婦人科がんである。他の実施形態では、がんは、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎皮質がん、膵内分泌がん、カルチノイドがんおよびカルチノイド症候群などの内分泌系がんである。がんは、軟部組織および骨の肉腫、中皮腫、皮膚のがん、皮膚黒色腫および眼内黒色腫を含む黒色腫、中枢神経系の新生物、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、神経線維腫症、神経芽腫、ユーイング肉腫ファミリーのがん、横紋筋肉腫を含む小児がんであってもよい。がんは、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、およびホジキン病を含むリンパ腫であってもよい。がんは、形質細胞新生物、未知の原発部位のがん、腹膜癌腫症、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連原発性中枢神経系リンパ腫、ＡＩＤＳ関連ホジキン病およびＡＩＤＳ関連肛門性器がん、肝臓への転移がん、骨への転移がん、悪性胸水および心膜滲出液ならびに悪性腹水であってもよい。特定の非限定例では、がんは、漿膜新生物（例えば、悪性胸膜中皮腫）である。
一部の非限定的な実施形態では、方法は、対象中の中皮細胞によって覆われている漿膜表面（例えば、漿膜体腔の部分）に存在する、または存在するリスクがあるがんを処置または阻害することを含む。一部の非限定的な実施形態では、方法は、胸膜腔、心膜腔、前縦隔腔、後縦隔腔、腹膜腔、または精巣鞘膜腔などの、対象中の漿膜体腔に存在する、または存在するリスクがあるがんを処置または阻害することを含む。一部の実施形態では、がんは、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、胸腺上皮がん（すなわち、胸腺腫、胸腺癌）、卵巣癌、子宮頸がん、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、または虫垂がんなどの漿膜新生物である。
好ましい実施形態では、開示される方法は、対象における悪性胸膜中皮腫を処置するために使用される。悪性胸膜中皮腫の処置は、対象における悪性胸膜中皮腫の症状を軽減することができる。症状としては、咳、喀血、喘鳴および／もしくは息切れなどの呼吸器症状、体重減少、発熱、もしくは疲労などの全身症状、または胸痛、骨痛、もしくは嚥下困難などの局部圧迫による症状が挙げられる。一般に、方法は、悪性胸膜中皮腫を有する対象を選択すること、および治療有効量の開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を対象に投与することを含む。悪性胸膜中皮腫の処置は、一般に、がんの診断後に開始される。任意のステージの悪性胸膜中皮腫を有する対象を、本明細書に開示される方法を使用して処置することができる。悪性胸膜中皮腫の存在を、胸部Ｘ線、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ＭＲＩおよび／または気管支内超音波などの当業界で公知の方法によって決定することができる。肺機能検査を使用することもできる。悪性胸膜中皮腫を、１つまたは複数の生検を取得し、生検中の細胞を評価することによって診断することもできる。
がんの処置は、一般には、がんの診断の後に、または前駆状態（化生または異形成など）の開始後に開始される。処置を、がんの初期ステージで開始することができ、例えば、ステージＩの診断中または異形成が診断された時点などの、対象が状態の症状を示す前に開始することができる。しかしながら、処置を、限定されるものではないが、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよびステージＩＶのがんなどの、疾患の任意のステージの間に開始することができる。一部の例では、処置は、悪性腫瘍またはさらには転移性腫瘍に変換し得る前がん性腫瘍を有する対象に投与される。
悪性がんなどの状態の発生後に開始される処置は、状態の１つの症状の重症度の低下、または症状の完全な除去、または転移、腫瘍体積もしくは腫瘍数の減少をもたらし得る。一部の例では、がんは、処置後に検出不可能になる。
本開示の一態様では、転移などの、処置される対象中での腫瘍の形成が遅延、防止または減少する。別の態様では、処置される対象中の原発腫瘍のサイズが減少する。さらなる態様では、腫瘍の症状が減少する。さらに別の態様では、腫瘍体積が減少する。
異形成または初期（良性）前駆状態の検出の際の処置などの、状態の発生前の処置は、本明細書では状態を発症する「リスクがある」対象の処置と呼ばれる。がんが「存在するリスクがある」対象中の標的位置への投与とは、好適な時間枠内（１年以内など）での、がんが正式に検出されていないが、現在はがんの可能性がある、または現在はがんを発症する可能性がある対象中の標的位置への投与を指す。これは、異形成もしくは初期（良性）前駆状態の部位、および／またはがんの術前、術中、もしくは術後の外科的処置（腫瘍切除など）、例えば、がんが外科的手順によって完全に除去されていないかもしれないとの懸念がある部位を含む。
一部の例では、本明細書に開示される方法を使用する処置は、対象の生存期間を延長する（例えば、療法の非存在下と比較して少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも２年、少なくとも３年、またはさらには少なくとも５年、生存期間を増加させる）。
当業者であれば、例えば、処置される腫瘍の型、疾患進行の程度、対象の年齢、健康および性別、対象のサイズ（例えば、体重および／または身長）、ならびに投与経路などの因子を考慮に入れて、対象に投与されるべき開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の有効量を容易に決定することができる。例えば、有効量は、処置される対象のおよその体重に基づくものであってもよい。そのような有効量を、任意の好適な経路によって投与することができる。一部の実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の有効量は、治療的核酸分子を含有するナノ粒子−ヒドロゲル複合材料内に分散されたナノ粒子の量／濃度に基づくものであってもよい。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の有効量は、症状（複数可）の自覚的な緩和または臨床医もしくは他の資格のある観察者によって指摘される客観的に同定可能な改善を提供するものである。一実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の有効量は、腫瘍成長（肺腫瘍の成長など）、腫瘍の転移を阻害するのに必要な量、または腫瘍の兆候もしくは症状を低減するのに有効な量である。投与される薬剤の有効量は、所望の効果および処置される対象に応じて変化してもよい。一部の例では、有効量は、患者の腫瘍負荷を除去する、もしくは減少させる、または転移細胞の成長を防止する、もしくは減少させる量である。
一部の例では、開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の有効量は、約１００μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約４０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇなどの、約５μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重のｍｉＲＮＡ核酸（またはｍｉＲＮＡ核酸の組合せ）を含む。１つの非限定的な例では、投与される量は、約５ｍｇ／ｋｇのｍｉＲＮＡ核酸（またはｍｉＲＮＡ核酸の組合せ）である。
主治医であれば、症例の詳細事項（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、および処置が予防的であるかどうか）を考慮に入れて、特定の投与様式および投薬量レジメンを選択することができる。ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、正確な投薬量の個別的投与にとって好適な単位剤形中で製剤化することができる。投与される活性化合物（複数可）の量は、処置される対象、苦痛の重症度、および投与の様式に依存し、処方する臨床医の判断に委ねられるべきである。これらの範囲内で、投与されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、処置される対象において所望の効果を達成するのに有効な量の、ある分量の活性成分（複数可）を含有する。慢性的な投与が達成されるような、毎日、隔週、毎週、隔月または毎月などの、規定の時間間隔にわたるなど、複数回の処置が想定される。投与は、処置する医師によって決定される適切なときにいつでも開始してよい。
開示されるナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、任意の好適な手段を使用して処置を必要とする対象に投与することができる。投与の方法としては、限定されるものではないが、腺管内、皮内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、皮下、経膣、直腸、鼻内、吸入が挙げられる。当業者であれば、治療剤、処置される状態、対象の健康および処置歴、ならびに他の関連する臨床因子に応じて、適切な投与経路を選択することができる。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、剪断減粘／回復機械特性を示し、ヒドロゲル内に分散されたナノ粒子−ヒドロゲル複合材料および任意のさらなる治療剤を、例えば、解剖学的表面を被覆するための、シリンジ注射による経皮もしくは外科的アクセス、または噴霧送達によって体腔に局部的に送達することができる。適用後、ナノ粒子は、ヒドロゲルマトリックスから隣接組織へと持続放出され、細胞によって取り込まれる。細胞によって内在化されたら、核酸分子は、ナノ粒子から放出され、（核酸分子に応じて）細胞機能に影響し得る。
悪性胸膜中皮腫の場合、ナノ粒子ヒドロゲル複合材料を、この疾患の外科的切除または診断の遂行中に、携帯型デバイスにより、または侵襲性が最小限の手術器具の先端を介して噴霧することができる。外科的手法としては、開胸術、ＶＡＴＳ（ビデオ補助胸腔鏡下手術）、および／またはロボット補助胸腔鏡下手術が挙げられる。複合材料の壁側および臓側体表面への投与を、計画された腫瘍の外科的切除の前または外科的切除の後に行うことができる。臨床シナリオに応じて、ナノ粒子ヒドロゲル複合材料を、この様式で反復的に適用することができる。
一部の実施形態では、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料は、がんが存在するか、または存在するリスクがある対象中の漿膜表面（例えば、漿膜体腔の部分）に、直接的なシリンジ注射または噴霧送達によって送達される。例えば、漿膜表面は、対象中の胸膜腔、心膜腔、前縦隔腔、後縦隔腔、腹膜腔、または精巣鞘膜腔の一部であってもよい。この方法でのナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の投与は、がんが存在するか、または存在するリスクがある対象中の漿膜表面の全部または一部を被覆する。
本開示はまた、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料（治療的核酸分子を含有する）と、がんの処置において有用な１つまたは複数の他の薬剤との組合せを用いて対象を処置する方法も含む。例えば、ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、ヒドロゲル内に分散された有効用量の１つまたは複数の異種抗がん剤（化学療法剤または抗がんタンパク質など）と組み合わせて投与することができる。技術のある臨床医であれば、処置される腫瘍の型、対象の病歴、全体的な状態、および他の因子に基づいて療法の適切な組合せを選択することができる。
以下の実施例は、ある特定の実施形態の特定の特色を例示するために提供されるものであるが、特許請求の範囲は、例示されるこれらの特色に限定されるべきではない。
（実施例１）
ナノ複合材料ペプチドヒドロゲルネットワーク内でのマイクロＲＮＡ鋳型ペプチド集合
本実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの複雑な解剖学的表面への治療剤の局部送達のために使用することができるナノ粒子／ヒドロゲル複合材料を例示する。ナノ粒子／ヒドロゲル複合材料は、（ｉ）それが、複雑な組織表面のトポロジーを有効に覆うためにシリンジ注射可能であり、かつ噴霧可能であること、（ｉｉ）それを使用して、持続可能な様式で組織に核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）を送達することができること、（ｉｉｉ）それが、送達される核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）の細胞内輸送を容易にすること、（ｉｖ）それが生分解性であること、および（ｖ）それが患者のコンプライアンスを改善するために単回投与で有効であり得ることを含む複数の利益を提供する。
いくつかの例では、ナノ粒子／ヒドロゲル複合材料は、がんまたは複雑な解剖学的表面の処置のための治療的ｍｉＲＮＡの送達にとって有用である。胸膜腔または腹膜腔などの解剖学的表面にアクセスするがんは、治癒的介入が限られている困難な臨床シナリオの代表である。胸腺腫による胸膜浸潤、腹骨盤領域中の播種性後期卵巣がん、または結腸がん腹膜癌症は、有効な療法がない表面悪性腫瘍のいくつかの一般的な例である。全く顕著なことに、表面がんは、現代の腫瘍ケアのますます広がってきている状況の代表である。これらの多様ながんの一貫して統一的な特色は、治療介入を回避する生物学的挙動に寄与する複雑な解剖学的表面の関与である。
転移によって生じる表面悪性腫瘍と対照的に、悪性中皮腫などの大きい表面を占有する原発がんは、より手ごわい課題の代表である。中皮腫は、体腔表面（胸膜または腹膜）を覆う中皮細胞から生じる不応性の、アスベスト関連悪性腫瘍である。予測に反して、胸膜中皮腫の世界における発生率は、数十万もの将来の症例が予想されながら上昇し続けている。予後は悪く、このがんの転移は稀であるにもかかわらず、中央生存期間は１２〜１８ヶ月であり、５年生存率は５％未満である。胸膜中皮腫は、ａ）本質的には化学療法抵抗性であり（部分的には、ポリクローナリティによって駆動される）、過去１５年間でいかなる新しいＦＤＡ承認薬もなく、腫瘍応答率は最大で３０％である、ｂ）現在の片側胸郭放射線療法は、安全ではあるが、重要臓器に対する毒性によって妨害され、依然として調査中である、およびｃ）根治手術は複雑な解剖学的表面のため断端陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｒｇｉｎ）を達成することができないため、依然として不治の病である。最適な治療モダリティは議論の余地があるが、最近のメタ分析は、外科的切除が非外科的手法（放射線療法および／または化学療法）に対して全生存期間を改善することを示している。しかしながら、肉眼的な完全切除の主な制限は、多様な外科手術に基づく療法を完了する７５％またはそれより多い患者における疾患の局部再発である。これは、切除手順から残された残存する顕微鏡的腫瘍病巣の再成長に起因する。さらに、加熱化学療法および光線力学光などのアジュバント術中スキームは、広く採用されることなく依然として実験的である。
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写物との塩基対形成相互作用によって複数の遺伝子および経路の首尾一貫した調節に関係する重要な生物学的プロセスに関与する短い非コードＲＮＡである。原理的には、治療剤として別の目的で使用されるｍｉＲＮＡは、腫瘍細胞適応耐性になりにくいが、状況特異的環境（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）中での発現または抑制の際に細胞内表現型を大きく変化させることができる。全身性ｍｉＲＮＡ送達系を生成するために膨大な量の研究が行われてきたが、中皮腫および他の表面がんは、局所領域的様式で核酸を解剖学的に複雑な組織トポロジーに送達することができるデバイスを必要とする。胸膜内層または腹膜内層などの組織表面からの腫瘍切除は、有効な送達を妨げる入り組んだ複雑な外部を残す。
操作されたヒドロゲルの特色は、細胞膜を通る送達バリアを克服するための負に荷電したｍｉＲＮＡのナノ粒子中での予備縮合を含む。ヒドロゲルマトリックスを構成する自己集合性ペプチドを利用することは別にして、可溶型の正に荷電したペプチドを用いて、ｍｉＲＮＡをナノ微粒子中で縮合させた（図１）。ナノ粒子を構成するペプチド内に吸収される正電荷の量は、ｍｉＲＮＡの効率的な複合体化において役割を果たす。さらに、ヒドロゲルマトリックス中のペプチドと、ナノ粒子中のペプチドとの生物物理学的属性の相互作用は、全体的なｍｉＲＮＡ送達効率を調整することができる。この生分解性ヒドロゲル複合材料が、複数の前臨床モデルによる中皮腫のいくつかの異なる微小環境中での単回投与に関して持続的な治療効果をもたらす能力を証明する証拠が本明細書に提供される。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を調製するために、カチオン性ペプチドとアニオン性ＲＮＡとの静電相互作用により、ｍｉＲＮＡを線状ペプチド１（ＭＡＸ１、ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２）と複合体化させることにより、ナノ粒子を最初に製剤化した（図１Ａ、段階１を参照されたい）。ｍｉＲＮＡ−２１５、ｍｉＲＮＡ−２０６および他のｍｉＲＮＡについて、ペプチド１のｍｉＲＮＡに対するモル比を、複合体化したＲＮＡの量に関係なく、５０：１に維持した。しかしながら、この比は、ｍｉＲＮＡの実体によって異なり得る。特定例として、ｍｉＲＮＡ−２１５を複合体化するために、ＲＮａｓｅ非含有水中の１２．５μＬの３００μＭのペプチド１（ＭＡＸ１）溶液を、ＲＮａｓｅ非含有水中の１２．５μＬの６μＭのｍｉＲＮＡ−２１５の溶液に添加した。得られた懸濁液を、一定に撹拌しながら３７℃で３０分にわたってインキュベートして、ペプチド１／ＭＡＸ１：ＲＮＡナノ粒子を形成させた（図２Ｂ中のナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を参照されたい）。ＲＮＡの複合体化と関連するペプチド１（ＭＡＸ１）の特定の特色は以下の通りである：１）ペプチド１（ＭＡＸ１）が中性の溶液ｐＨで（＋９）の形式電荷を有し、これがＲＮＡの中程度の（あまりにタイト過ぎるものではないが）結合を確保し、その結果、粒子は無傷のままである（ペプチド１（ＭＡＸ１）／ＲＮＡが分離しない）が、細胞取込み中にペプチドヒドロゲル中に封入される。しかしながら、細胞によって内在化されたら、ｍｉＲＮＡはペプチド１（ＭＡＸ１）ペプチドから放出される。２）ペプチド１（ＭＡＸ１）は、アンフォールドした状態のままであるが、ＲＮＡと複合体化する。これは、細胞によって内在化されたら、ペプチドがＲＮＡから解離するのを助ける。３）ペプチド１（ＭＡＸ１）は、その配列中に負に荷電したアミノ酸を含有せず、それは、静電反発力によってＲＮＡ結合を嫌う。
ナノ粒子をヒドロゲル中に封入するために（図１Ａ、段階２）、２５μＬのナノ粒子懸濁液を、２５μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）と混合した。次いで、得られた懸濁液を、ペプチド３（ＨＬＴ２、ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＬＰＴＫＶＥＶＫＶＬＶ−ＮＨ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中の３．５ｍＭ）の溶液５０μＬに添加した。これは、ＨＬＴ２ペプチドの線維ネットワークへの自己集合を引き起こし、ゲル化をもたらす。ゲル化を３７℃で１８時間にわたって進行させて、ＭＡＸ１：ＲＮＡナノ粒子を含有する０．５ｗｔ％のＨＬＴ２ゲルを含む最終的なナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を得た。１ｗｔ％のペプチド３（ＨＬＴ２）ゲルもうまく使用した。図４ＦのＴＥＭ顕微鏡写真は、ペプチド３（ＨＬＴ２）の線維ヒドロゲルネットワーク内に封入されたペプチド１：ＲＮＡナノ粒子を示す。ペプチド１／ＭＡＸ１−ｍｉＲＮＡナノ粒子を封入するために関連するペプチド３（ＨＬＴ２）ゲルの特定の特色は、以下の通りである：１）低いｗｔ％（０．５〜１．０）で、それは１００〜５００ｎｍのメッシュサイズによって特徴付けられる線維ネットワークに集合し、１５０〜２００ｎｍのＭＡＸ１：ＲＮＡナノ粒子の遅い持続放出を可能にする。２）カチオン性ＨＬＴ２の自己集合により形成される線維ネットワークは、正に荷電しており、封入されたナノ粒子のための安定な環境を提供する。ＭＡＸ１：ＲＮＡナノ粒子は、負に荷電したヒドロゲルネットワーク内に封入された場合は安定ではなく、急速に分解して、遊離の裸のＲＮＡを溶液に放出し、細胞による内在化は不十分である。
ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料を、複雑な解剖学的表面を完全に被覆するために剪断減粘シリンジ送達または（ｏｆ）噴霧送達により送達することができる（例えば、図１Ｂを参照されたい）。これにより、表面がんと関連することが多い複雑な組織環境中の適用ポイントで局部的にｍｉＲＮＡを細胞に送達することができる。
ヒドロゲルネットワークの周囲に分布したナノ粒子は、それがゲル集合体から放出されると、ｍｉＲＮＡトランスフェクションの主なメディエーターである。これらのナノ粒子の生物物理学的パラメーターおよびｍｉＲＮＡトランスフェクション効率を特徴付けた。４残基のＩＩ’型βターン促進領域−ＶＤＰＰＴ−および様々な正電荷（生理的ｐＨで＋９〜＋５）をそれぞれ有する３つの異なるペプチドを最初に使用して、ｍｉＲＮＡを縮合させた（図２Ａ）。これらのペプチドは、親水性および疎水性残基を交互に有する２つのβ鎖からなる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １２４（５０）： １５０３０−１５０３７， ２００２）。ペプチド２（＋７）は、１５位にグルタミン酸を含有して、ペプチド１（＋９）中に存在する１個のリシンを置き換える（Ｈａｉｎｅｓ−Ｂｕｔｔｅｒｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １０４（１９）： ７７９１−７７９６， ２００７）。３位のバリンの置換と共に、２位および１９位のさらに２個のリシン残基をロイシンにより置き換えると、ペプチド３（＋５）が生成される。水性溶液中で、または低イオン強度で、これらのペプチドは、正に荷電したリシン残基間の鎖内静電反発力のため、無作為なコンフォメーションの集団にとどまる（Ｓｉｎｔｈｕｖａｎｉｃｈ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ３３（３０）： ７４７８−７４８８， ２０１２）。生理的に関連するイオン強度の溶液中に入ったら、塩イオンは、リシンにより担持された正電荷を静めるのを助け、ペプチドの表面的に両親媒性のβ−ヘアピン構造へのフォールディングをもたらす。ナノ粒子を製剤化するために本明細書で研究されたペプチドを、水の存在下、低マイクロモル濃度で使用して、自己集合構造の形成を回避した。
ペプチドとｍｉＲＮＡとの結合相互作用を、蛍光測定を使用して試験した。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン、５’末端）で標識されたスクランブルｍｉＲＮＡ（ヒトにおける全ての可能なｍＲＮＡとミスマッチした配列）を、０．３１２５〜１０００の範囲のペプチド：ｍｉＲＮＡのモル比を有するペプチドと混合した。複合体化を最初に水中で実施した後、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で複合体を希釈して、全てのペプチド濃度にわたって懸濁液のｐＨを未変更のまま保持した。モル比の増加と共に、ＦＡＭ蛍光は徐々にクエンチされ、これは、ペプチド媒介性縮合に起因した。クエンチングの程度は、ペプチド１について最大であることがわかった（図２Ｂ、７Ａ）。予想通り、より低い正電荷のペプチド２および３は、ｍｉＲＮＡの有意な縮合を促進することができなかった。最大のクエンチングを誘導するペプチド１の濃度は、ペプチド１とｍｉＲＮＡとの間で５０：１のモル比に近かったが、これは１０：１のＮ／Ｐ比（電荷比）に対応する。したがって、Ｎ／Ｐ比としての１０：１の比を、さらなる評価のために使用した。
ｍｉＲＮＡの放出の測定は、ナノ粒子をロードしたヒドロゲル複合材料のｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性を決定するための重要なステップである。ｍｉＲＮＡを、負に荷電した細胞表面プロテオグリカンであるヘパリンの添加によってナノ粒子から放出させることができる（図７Ａ〜７Ｃ）。ヘパリンは、正に荷電したペプチドを隔離し、ｍｉＲＮＡの放出を助け、以前にクエンチされた蛍光の回復をもたらす。図７Ａ〜７Ｂに示されるように、ペプチド１／ｍｉＲＮＡのナノ粒子懸濁液へのヘパリンの添加は、定量的な量のｍｉＲＮＡを放出し、回復した蛍光から明らかである。全てのｍｉＲＮＡを放出させるためには、わずか５μｇ／ｍＬ程度のヘパリンの添加で十分であったが、それにもかかわらず、この濃度はペプチド１における有意な構造変化を誘導するには十分ではなかった。これは、ペプチド１のみに関するβシート構造の進化が５０μｇ／ｍＬのヘパリン濃度で開始する図７Ｃに報告されるＣＤスペクトルから明らかである。したがって、ｍｉＲＮＡの放出を決定するために、最終ヘパリン濃度として５０μｇ／ｍＬを選択して、ナノ複合材料ヒドロゲルの放出上清に添加した。
ペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子のサイズおよびゼータ電位を、広く使用されている商業的に入手可能なトランスフェクション試薬であるリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸのｍｉＲＮＡ複合体と比較した。対応する複合体は、−３９．９±７．８ｍＶのゼータ電位で大きい凝集体を形成した（図８Ａ、８Ｃ）。ゼータ電位は、Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７， １０３７６， ２０１６）に記載されている。ペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子に関する明確に定義された相関曲線は、０．０８のその多分散性指数と等しかった（図８Ａ、８Ｂ）。これらのナノ粒子のゼータ電位は、裸のｍｉＲＮＡに関する−４５．６±８．８ｍＶ（図８Ｇ）と比較して、約１５．６±０．５ｍＶ（図８Ｄ）であることが観察された。
ペプチド１で構成されるナノ粒子の流体力学直径は、２６３ｎｍであった（図９Ａ）。ペプチドナノ粒子の正の表面電荷は、ｍｉＲＮＡの十分な遮蔽を示していた。これらのナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を、図２Ｂに示す。差し込み図に示されるＴＥＭから算出されるサイズ分布は、各セットの粒子について、約２００ｎｍのサイズを示す。
ナノ粒子中のペプチドのフォールディング傾向を理解するために、円二色性（ＣＤ）スペクトルを記録した。ここで、複合体化を水中で実施し、ＣＤスペクトルを記録する前に水を使用して粒子をさらに希釈した。１０：１のＮ／Ｐ比で、ｍｉＲＮＡの負電荷は、ペプチド１（ＭＡＸ１）のβ−ヘアピン構造への有意なフォールディングを誘導するのに十分ではなかったが（図２Ｃ）、それにもかかわらず、可溶性ペプチドと比較して約２００ｎｍの負の楕円率の減少が観察された。興味深いことに、Ｎ／Ｐ比の低下は、２１８ｎｍで負の楕円率値を徐々に増加させてヘアピン構造の進化を促進した。Ｎ／Ｐ比を１：１を超えて低下させても、楕円率値をさらに変更させなかったが、これは完全な程度のフォールディングが既に達成されたことを示している（図２Ｃおよび２Ｄ）。これらのＮ／Ｐ比にわたって、形成される複合体のゼータ電位値と、ペプチド１のフォールディング挙動との間で明確な傾向が観察された。複合体の表面電荷は、より多くのペプチド１の添加と共に増加し、ペプチドのフォールディング傾向を減少させる（図２Ｄ）。Ｎ／Ｐ比が増加と、より多くのペプチド１が、ｍｉＲＮＡの表面上でペプチド１の大きくアンフォールドした状態を引き起こすそれぞれ個々のペプチド１分子に接近可能な負電荷の量を減少させる複合体化媒体に添加される。
ｍｉＲＮＡをヒト中皮腫細胞Ｈ２０５２（類上皮サブタイプ）に細胞内送達するペプチドの能力を、ＦＡＭ標識されたスクランブルｍｉＲＮＡを使用して評価した。市販のトランスフェクション試薬と比較した場合、ペプチド１／ｍｉＲＮＡから生成されたナノ粒子の有効性は、リポフェクタミンのものよりもわずかに低いにもかかわらず有望と思われた（図３Ａ、９Ａ、９Ｂ）。そのようなｍｉＲＮＡトランスフェクションのメカニズムをより深く理解するために、トランスフェクションの有効性に対するエンドサイトーシス経路の化学的阻害剤の効果を、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡観察を使用して精査した。ＥＩＰＡはＨ２０５２細胞中のミクロピノサイトーシスの選択的阻害剤であることが観察されたが、サイトカラシンＤおよびＤｙｎａｓｏｒｅは、クラスリン依存的経路の阻害剤であると考えられた（図１０Ａ〜１０Ｄ）。そのような機械的効果を考慮すると、ＭＡＸ１／ｍｉＲＮＡナノ粒子は、フローサイトメトリーデータにより示されるように主にクラスリン依存的経路によってＨ２０５２細胞に明らかに内在化した（図３Ｂ、１１Ａ〜１１Ｃ）。
ペプチド１を使用して送達されるｍｉＲＮＡの細胞内分布を理解するために、共焦点顕微鏡観察を生きたＨ２０５２細胞上で実施した。ｍｉＲＮＡの細胞内局在化を評価するために、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを使用して共局在化試験を実施した。ナノ粒子と共にインキュベートした３０分後に取得された画像により、内在化されたｍｉＲＮＡ（ＦＡＭ）は、蛍光の合体により証明されるように、酸性エンドソーム区画に主に局在化したままであることが示された（図３Ｃ）。興味深いことに、インキュベーションの４時間後に標識間で明確な分離が観察されたが、これは、ｍｉＲＮＡがエンドソームを脱出することができたことを示している（図３Ｄ）。特に、４時間で、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ染色の程度は、かなり低下したが、これはおそらく、ナノ粒子のエンドソーム分解挙動を一部示すものである。これと一致して、図３Ｅ〜３Ｆに示されるカルセイン放出試験は、ナノ粒子との共インキュベーションが、細胞質にアクセスするためにエンドソームからのカルセインの放出を容易にすることを検証するものである（図３Ｅ中のエンドソームに局在化された点状蛍光は図３Ｆ中の細胞質に流れ込む）。細胞をｃｙ３標識ｍｉＲＮＡと共にインキュベートし、その共局在化をＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅで追跡した場合も同様の結果が観察された（図１２Ａ〜１２Ｂ）。図１２Ｃは、細胞を二重標識されたナノ粒子と共に４時間にわたってインキュベートした場合、ｍｉＲＮＡペイロードが対応するペプチドと共に局在化したままであることを示す。
送達されたペイロードの治療有効性に対するそのような異なる細胞内ｍｉＲＮＡ分布パターンの関与を精査するために、ペプチド１を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨ２０５２細胞中にｍｉＲ−２１５を送達した。中皮腫細胞へのｍｉＲ−２１５−５ｐのｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションは、ｐ５３の主な調節因子であるＭＤＭ２をサイレンシングすること、ならびに複数の細胞周期関連遺伝子、例えば、ＣＤＣ７、ＬＭＮＢ２、およびＭＡＤ２Ｌ１をサイレンシングすることを介してアポトーシスを誘導することによって細胞増殖を軽減することが示された（図１３Ａ）。一致して、ｍｉＲ−２１５−５ｐを送達するナノ粒子は、ｑＰＣＲを用いて転写物レベルで観察した場合、これらの同じ標的遺伝子を有意にサイレンシングした（図４Ａ）。
非特異的遺伝子サイレンシングに対するナノ粒子の細胞傷害性の寄与の可能性を評価するために、トランスフェクション後４時間の期間にわたりナノ粒子を細胞と共にインキュベートし、ＭＴＴ（図１３Ｂ）およびＬＤＨアッセイ（図１３Ｃ）を使用して、細胞生存率および細胞傷害性パラメーターを評価した。可溶性ペプチドは陽性対照のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００と比較して２０％の細胞傷害性を有することが見出されたが、ｍｉＲＮＡとの複合体化は、リシンにより担持された正電荷のスクリーニングに起因して完全に細胞適合性のナノ粒子をもたらした（図１３Ｃ）。
同等のリポフェクタミン複合体の遺伝子サイレンシングの有効性は、図１４Ａ〜１４Ｂに記載される。ナノ粒子の遺伝子サイレンシング能力は、リポフェクタミンのものよりもわずかに良好であることがわかった（図１４Ａ）。毒性がよく説明されたリポフェクタミンは、スクランブルｍｉＲＮＡと複合体化した細胞中で処理した場合、インキュベーションの４８時間後に細胞形態を変更させた（図１４Ｂ）。強力な遺伝子サイレンシング効果は、細胞の増殖能力の劇的な低下をもたらした。曝露の７２時間および１２０時間後でのＭＴＴアッセイの結果（４時間の直接インキュベーション、次いで、追跡）は、ｍｉＲ−２１５−５ｐを担持するナノ粒子で処理した細胞について、細胞増殖の減少と共に生存率の５０％の低下（図４Ｂ）を示した。また、２Ｄコロニー形成アッセイに示されるように、処理した細胞のクローン形成潜在能力の実質的な低下（図４Ｃ）およびＨ２０５２細胞の足場非依存性成長の有意な減少（図４Ｄ）もあった。また、ｍｉＲ−２１５で処理した細胞は、アポトーシスを増加させることによってその生存能力を失うことも観察された（図４Ｅおよび１４Ｃ）。
ナノ粒子の生物物理学的および細胞学的挙動（異常ペプチドに結合したｍｉＲＮＡ）を認識して、それらを、ヒドロゲル複合材料を操作することによって局部ｍｉＲＮＡ送達系の設計において利用した。一連の自己集合性β−ヘアピンペプチドによって形成された線維ネットワークにナノ粒子を封入することによって、ゲルを取得した。第１に、粒子を、ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３を用いて構成されたヒドロゲルネットワーク中に封入した（図１５Ａ）。ヒドロゲル化ペプチドを、ペプチドがランダム構造に留まる低イオン強度緩衝液中に最初に溶解する。ナノ粒子懸濁液と混合したら（生理的条件に調整された浸透圧）、媒体中に存在する塩イオンは、ペプチドをβ−ヘアピン構造に折り畳んだ後、ナノ粒子が線維ネットワークを通して均一に分布したままであるヒドロゲル複合材料中で自己集合する。自己集合性ペプチド３により形成されたヒドロゲル複合材料の構造を、図４Ｆおよび１５Ｂ〜１５Ｄに示す。適切に折り畳まれ、自己集合したペプチド３の線維ネットワークに加えて、ナノ粒子がここで明確に観察される。対照としてのブランクペプチド３ヒドロゲルのＴＥＭ画像を、図１５Ｅに示す。
ゲルネットワークの特徴をより深く理解するために、振動レオロジーをペプチド３ゲル複合材料上で実施した（図１６Ａ）。ゲルをトランスウェルインサート中で２４時間にわたって形成させ、レオメーターのプレート上に移した。最初の１０分間にわたって、貯蔵弾性率（Ｇ’）を、時間の関数としてモニタリングする。次の段階で、ゲルを剪断減粘し、回復させ、シリンジ注射によるｉｎ ｖｉｖｏでの投与中にゲルが供される条件と同様の条件を適用する。両方のゲル複合材料は、剪断減粘後に急速に回復するが、１％のペプチド３ゲルは２１２Ｐａの最終貯蔵弾性率に達する。図１６Ｂに示されるように、ｍｉＲＮＡの放出プロファイルを、それぞれ、０．５％（ｗ／ｖ）で使用されるペプチド２およびペプチド３からなるヒドロゲル複合材料間で比較する。ほぼ類似する放出プロファイルの原因となる、ペプチド３ヒドロゲル複合材料を、その後の実験のために使用した。ペプチド３ヒドロゲル複合材料は、剪断減粘および回復特性を示し、シリンジ注射のためのこれらのゲルの実現可能性を示していた。
図４Ｇおよび図１６Ｂ〜１６Ｃは、ペプチド２およびペプチド３ヒドロゲル複合材料からのナノ粒子の放出をモニタリングするためのアッセイの結果を示す。それぞれのヒドロゲルからの上清を、時間の関数として単離し、ヘパリンを用いて解離させて、遊離ｍｉＲＮＡを放出させ、その蛍光を測定する。図４Ｇに示されるように、ヒドロゲル化ペプチドとして０．５％（ｗ／ｖ）のペプチド３を含有するペプチド３ヒドロゲル複合材料は、１０日間かけて全ての封入されたｍｉＲＮＡの約２５〜３０％を放出した。放出速度は、１％（ｗ／ｖ）のペプチド３を使用する際にヒドロゲルマトリックスのメッシュサイズを減少させる場合、さらに遅くなる可能性がある。
アガロースゲル電気泳動アッセイを実施して、遊離ｍｉＲＮＡおよびゲル集合体中にローディングする前にナノ粒子中に存在するｍｉＲＮＡについてのものと比較した場合、放出上清中に存在するｍｉＲＮＡの電気泳動移動度を可視化した。１μｇのロードされたｍｉＲＮＡを含有する新鮮に調製されたナノ粒子は、２％アガロースゲル中で２つの異なるバンドを示す（図１６Ｅ）。裸のｍｉＲＮＡについての移動度と同様の移動度を有するバンドは、電界中で解離したかもしれない低分子量の複合体の存在を示し得る。蛍光に基づく結合実験において証明されたように（図２Ａ）、１０：１のＮ／Ｐ比でペプチドに結合したｍｉＲＮＡに関する蛍光消光の程度の飽和は、裸のｍｉＲＮＡを有する可能性を除外する。同様のパターンは、２日目および４日目に収集された放出媒体についても明らかであった。低強度のバンドは、当然のことながら、ゲルから放出されたごく少数のナノ粒子を示す。
ゲルネットワークへの封入は、ｍｉＲＮＡトランスフェクションおよび遺伝子サイレンシングの潜在能力をナノ粒子に失わせない。図４Ｈは、ゲルから放出されたナノ粒子が、ｍｉＲＮＡを細胞内に送達するのにその天然の対応物と同等に強力であることを示し、これはトランスフェクトされたＦＡＭ−ｍｉＲＮＡの蛍光から明らかである。同様に、ｍｉＲ−２１５−５ｐをロードしたゲルも、その全ての標的遺伝子をサイレンシングするために活性なままである機能的なナノ粒子を放出する（図４Ｉ）。これらのナノ複合材料ゲルは、細胞適合性である（図１６Ｆを参照されたい）。
興味深いことに、ゲル複合材料からのｍｉＲＮＡの放出は、マトリックス中にヒドロゲル化ペプチドと、ナノ粒子を構成するために使用されるペプチドとの競合的相互作用によって決定付けられる。自己集合性ペプチドである、モノマー１つあたり５の負電荷を有するペプチド４（生理的ｐＨで）および４残基のβターン−ＶＤＰＰＴ−を使用してゲル複合材料を構成させた場合、ｍｉＲＮＡは数時間以内に迅速に放出され、得られたゲルは本質的にはｍｉＲＮＡをトランスフェクトする能力はなかった（図１７）。かくして、ペプチド４ゲルネットワーク中に封入されたペプチド１：ＲＮＡナノ粒子は不安定である。カチオン性ペプチド１−ＲＮＡ複合体は迅速に解離し、カチオン性ペプチド１はアニオン性ペプチド４ゲルネットワークに強烈に結合する。これは、細胞に進入することができない、ヒドロゲルからの遊離の裸のＲＮＡの放出をもたらす。対照的に、ペプチド３ヒドロゲル複合材料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効な遺伝子サイレンシングのための機能的なナノ粒子を安定に封入し、それをゆっくりと放出することができる（図４Ｆ〜４Ｉおよび１６〜１７）。
ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでのヒドロゲル複合材料の有効性は、ゲルがｉｎ ｖｉｖｏでｍｉＲＮＡの送達を持続させることができるかどうかの精査を促した。図１８に示されるように、ゲルはｉｎ ｖｉｖｏで生体適合性である。設計された材料の安全性プロファイルを理解するために、ヒドロゲル複合材料を受けるマウスの体重をモニタリングした。図１８Ａに示されるように、ｃｙ３ｍｉＲＮＡが封入された異なるヒドロゲル複合材料を受けているマウスおよびｍｉＲＮＡボーラス用量を注射されたマウスのうちで体重差はなかった。同様に、皮下、胸郭および腹腔内様式により投与されたスクランブルｍｉＲＮＡのヒドロゲル複合材料は、マウスの体重に影響しなかった（図１８Ｂ）が、これは、ゲル複合材料の見かけの全身毒性がないことを示している。
無胸腺ヌードマウスにおけるｍｉＲＮＡペイロードの放出をモニタリングするために、ｃｙ３とコンジュゲートしたｍｉＲＮＡを、０．５％および１％（ｗ／ｖ）のペプチド３から構成されるゲルネットワーク中にロードした。複合材料ゲルは、皮下注射された場合、投与点に局在化したままであり、２週間を超えてＣｙ３標識ｍｉＲＮＡを組織に局部的に送達することができる（図５Ａ）。対照的に、ボーラスとして送達されたｍｉＲＮＡは、１日以内に急速に消失する。より遅い放出速度の原因となる、１％のゲル複合材料をその後のｉｎ ｖｉｖｏでの実験のために使用した。ｍｉＲＮＡの放出がヒドロゲルの生分解をも伴うかどうかを理解するために、ヒドロゲル複合材料の分解速度を、２Ｄ超音波を使用してモニタリングした（図５Ｂ）（２Ｄ超音波の説明については、Ｌｅｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ， １１（３）： ８２２−８３０， ２０１７を参照されたい）。２Ｄ超音波を使用してヒドロゲルの生分解をモニタリングする間、ゲルと周囲の組織との間のエコー源性の差異は、十分なコントラストを提供したが、ヒドロゲルを、明確に定義された境界と共に可視化することができた。注射の直後、ゲルは低エコーまたは低レベルのグレーであるように見えたが、エコー源性は１日目で増加し、これはおそらく剪断減粘送達後の集合体の固化を示している。３Ｄ埋込み体の体積は時間と共に徐々に減少したが、これは、ゲルがｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも１８日間にわたって持続したことを示している（図１９Ｂ）。そのような観察は、皮下投与後、１、７、１５および１８日目での注射部位の周囲の単離された組織のヘマトキシリンおよびエオシン染色の結果と相関する（図１９Ｃ）。ゲル複合材料は、少なくとも１８日間にわたって注射部位で持続する（図１９）。かくして、ヒドロゲル複合材料は、少なくとも２週間にわたってｍｉＲＮＡペイロードを放出する局在化されたｍｉＲＮＡデポーとして作用し、その後、ゲルは生体に再吸収される。
腫瘍成長の低下を、ヒドロゲルにより送達されるｍｉＲＮＡによって処置された皮下および同所性中皮腫モデルにおいて評価した。肉腫様サブタイプの中皮腫細胞系Ｈ２３７３を、皮下異種移植実験において使用したが、Ｈ２３７３およびＨ２０５２細胞系を、同所性腫瘍実験において使用した（図２０）。あらかじめ、ヒドロゲル複合材料と共に送達されたｍｉＲＮＡの生体分布プロファイルを評価した。ゲル複合材料の腫瘍周囲注射によって処置された皮下異種移植片を有するマウスにおいて、ｃｙ３発現は、２４時間で専ら腫瘍組織中にあることが見出された（図２２Ａ）。この時点で他の重要臓器に蓄積は観察されなかった。同様の時点で収集された異種移植片の横断面に由来する共焦点顕微鏡法画像は、腫瘍塊にわたる腫瘍細胞中でのｃｙ３ｍｉＲＮＡの局在化を示したが（図５Ｃおよび２１Ｂ）、ｍｉＲＮＡをロードしたナノ粒子は、ヒドロゲル複合材料から局部的に放出され、その近くの腫瘍細胞中に移動することを示している。意外なことに、この結果は、ヒドロゲル複合材料を介して送達された場合、腫瘍塊へのナノ粒子ペイロードの比較的深い浸透を例示している。
ナノ粒子ヒドロゲル複合材料の治療有効性を、ＭＰＭ関連機能的腫瘍抑制因子ｍｉＲＮＡ（アポトーシス促進性ｍｉＲ−２１５−５ｐまたは抗増殖性ｍｉＲ−２０６−５ｐ（Ｘｕ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｓｔ， １４４（５）： １６３２−１６４３， ２０１３））の送達による特異的遺伝子標的化を示すことによって証明した。ヒドロゲル複合材料を、腫瘍周囲に注射して、Ｈ２３７３皮下異種移植片を担持するマウスを処置した。単回注射後、腫瘍体積は、対照と比較してｍｉＲ−２１５またはｍｉＲＮＡ−２０６処置群において有意に小さかった（図５Ｄ〜５Ｅ）。注射後、第１週の異種移植片において、高レベルのｍｉＲ−２１５−５ｐが検出され（図２２Ａ）、さらに１週間持続した（図２２Ｂ）。重要なことに、特定の標的遺伝子は、第１週で処置された異種移植片において抑制され（図５Ｆ）、同様に、その後の観察の週で持続した（図５Ｆ）。第４週での異種移植片の免疫組織化学分析（図５Ｇ）により、いずれかのｍｉＲＮＡ処置に関して、増殖マーカーであるＫｉ−６７の低い発現が示された。アポトーシス細胞は、ｍｉＲ−２１５処置腫瘍において主に観察されたが、その同様でない分子メカニズムから予測されるように、ｍｉＲ−２０６で処置された腫瘍においては観察されなかった（図５Ｈ）。まとめると、これらの結果は、本発明者らのヒドロゲル複合材料が特定のｍｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞中にうまく送達することができることを立証するものである。
潜在的な臨床性能をモデリングするために、本発明者らは、同所性中皮腫モデルにおいて腫瘍退縮を分析した（図６）。腹腔内中皮腫異種移植片の成長（１週間の平均時間）を、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞（Ｈ２３７３またはＨ２０５２）の発光によってモニタリングした（それぞれ、図６Ａ〜６Ｃおよび６Ｅ〜６Ｇ）。別の群のマウスに、ｍｉＲ−２１５−５ｐまたはｍｉＲ−２０６−５ｐを担持するヒドロゲル複合材料の単回腹腔内注射を投与し、３週間にわたってモニタリングした（図６Ｂ〜６Ｃおよび６Ｆ〜６Ｇ）。観察期間にわたって、有意な腫瘍成長遅延効果が、対照群に対して全ての処置群において実証された。ｍｉＲ−２１５とｍｉＲ−２０６処置の間の腫瘍抑制の絶対的な規模は、臨床応答に影響する固有の分子不均一性を反映する。ｍｉＲＮＡによって示された抗腫瘍効果は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析によって、処置マウスにおける有意に改善された生存に言い換えられた（図６Ｄ〜６Ｈ）。これらの前臨床の結果は、非常に有望であり、さらなるトランスレーショナルな開発のための論拠を提供する。
結論
本明細書に提供されるデータは、より良好な療法を必要とする治療抵抗性の表面悪性腫瘍である中皮腫などのがんを処置するための新規ｍｉＲＮＡ結合性ナノ粒子−ヒドロゲル複合材料送達ビヒクルの効力を証明する。ｍｉＲＮＡは非悪性腫瘍細胞中では内因性であるため、抗がん剤としてのそれらの使用は従来の化学療法と比較して、幅広い治療域を有し、副作用がより少ない。ｍｉＲＮＡの腫瘍細胞への有効な送達に関して、本明細書に提供される戦略は、特定のメカニズムまたは単一の治療標的だけでなく、複数の遺伝子経路を一貫して調節するｍｉＲＮＡの独特の特性を利用する。ヒドロゲルプラットフォームは、複数の利点を可能にした：（ｉ）剪断減粘は、送達される体積に応じて、大きい表面積を被覆するシリンジ注射が容易な、または同様に噴霧可能である配置経路を容易にする；（ｉｉ）局所領域送達は、オフターゲット効果ならびに全身毒性を最小化する；（ｉｉｉ）微調整可能なヒドロゲル組成物は、治療ペイロードの放出速度の大きな可撓性ならびにしたがって、任意の型の核酸、タンパク質および他のそのような生物製剤を単独で、または相乗的な組合せで取り扱う適合性を提供する；ならびに（ｉｖ）ゲルの生分解性はｉｎ ｖｉｖｏでの安全性を増強し、除去の必要性を取り除き、必要な場合、さらなる適用を可能にする。ヒドロゲル材料の局所領域送達は、卵巣癌などの他の表面がんまたは脳グリオーマのような断端陰性となるまで徹底的に切除することができないことが多い他のがんの利益となるはずである。
方法
ペプチドの合成。ＲＩＮＫアミド樹脂およびＨＣＴＵ活性化を用いる伝統的なＦｍｏｃに基づく固相ペプチド合成戦略を使用した。樹脂に結合した乾燥ペプチドを切断し、アルゴン雰囲気下で２時間にわたって、ＴＦＡ／チオアニソール／エタンジチオール／アニソール（９０：５：３：２）の切断カクテルを使用して、側鎖保護基を除去した。ジエチルエーテル沈澱後、未精製のペプチド１、２および３を、８ｍＬ／分の流量で分取Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ペプチドカラムを使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。標準物Ａ（水中の０．１％ＴＦＡ）および標準物Ｂ（９０％アセトニトリル、９．９％水、０．１％ＴＦＡ）を、溶離剤として使用した。精製されたペプチドを、ヒドロゲル化のために使用する前に、水から３回凍結乾燥した。ペプチド４を同様に合成し、未精製のペプチドを、８ｍＬ／分の流量で分取ポリマーＸ １０μ ＲＰ−１カラムを使用して精製した。この場合、標準物Ｃ（２０ｍＭの重炭酸アンモニウム）および標準物Ｄ（８０：２０のアセトニトリル／水、ｖ／ｖ中の２０ｍＭの重炭酸アンモニウム）を、溶離剤として使用した。
ナノ粒子の調製および特性評価。精製されたペプチドを、ＲＮａｓｅ非含有水に溶解した。アミノ酸分析により決定された、モル吸光係数ε＝１５７５０Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、２２０ｎｍでＵＶ吸収（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３ ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を測定して、ストックの濃度を決定した。ｍｉＲＮＡストック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＲＮａｓｅ非含有水を使用して再構成させた。
蛍光に基づく結合アッセイを使用して、ペプチドとｍｉＲＮＡとの相互作用を決定した。必要量のＦＡＭ標識されたスクランブルｍｉＲＮＡを水中に希釈し、０．３１２〜２００の範囲のモル比（ペプチド対ｍｉＲＮＡ）でペプチドの水性溶液と混合した。懸濁液を、一定に撹拌しながら、３７℃で３０分にわたってインキュベートした。複合体を、３０ｎＭの最終ｍｉＲＮＡ濃度を有するようにＨＥＰＥＳ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）緩衝液でさらに希釈した。ｍｉＲＮＡ上のＦＡＭフルオロフォアを４９０ｎｍで励起し、５２０ｎｍでの放射を、２０ｎｍのバンドパスフィルターを有するマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００）を使用して記録した。ＰＴＩ蛍光計を使用して、５００〜７００ｎｍの放射範囲でＮ／Ｐ比１０：１のペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子（５０：１のモル比、ペプチド１対ｍｉＲＮＡ）について蛍光スペクトルを記録した。
２５℃でＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用して、複合体の流体力学直径およびゼータ電位を決定した。水中で希釈したペプチド１を、１０：１のＮ／Ｐ比でスクランブルｍｉＲＮＡの水性ストックと混合した。１μｇのｍｉＲＮＡを、複合体化のために使用した。複合体を、２５℃での測定の前に１ｍＬの最終体積となるように水でさらに希釈した。製造業者の指示に従って、リポフェクタミン複合体を調製した。強度に基づくサイズ分布を、Ｍａｌｖｅｒｎソフトウェアに内蔵された分析アルゴリズムを使用して、相関曲線から得た。Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用して、ゼータ電位値を算出した。
円二色性分光分析。添加されたｍｉＲＮＡの存在下または非存在下でのペプチド１の二次構造を、円二色性（ＣＤ）分光分析を使用して決定した。水中でＣＤスペクトルを記録するために、ペプチド１の水性溶液に由来する１５０μＬを、スクランブルｍｉＲＮＡの水性溶液の１５０μＬと混合して、１０：１、５：１、２：１および１：１のペプチド対ｍｉＲＮＡのＮ／Ｐ比を維持した。これらのＮ／Ｐ比は、それぞれ、５０：１、２５：１、１０：１および１：１のペプチド対ｍｉＲＮＡのモル比に対応する。総体積３００μＬのナノ粒子および可溶性ペプチドを、撹拌しながら３７℃で３０分にわたって平衡化させた。ｍｉＲＮＡの最終濃度を、５μＭに維持した。試料を経路長１ｍｍの石英セルに移し、すぐにデータ収集を開始した。１ｎｍのステップサイズおよび３〜５スキャンのセットを使用して、３７℃で１９０〜２６０ｎｍの波長範囲にわたって、楕円率を測定した。生データを、試料の吸光度をｍｉＲＮＡの吸光度から減算することによって補正し、式：［θ］＝θｏｂｓ／（１０＊ｌ＊ｃ＊ｒ）（式中、θｏｂｓは測定された楕円率（ｍｄｅｇ）であり、ｌは経路長（０．１ｃｍ）であり、ｃはペプチドの濃度（２２０ｎｍでのＵＶ吸光度から決定される）であり、ｒはペプチド中のアミノ酸残基の数に対応する）を使用して、平均残基楕円率に変換した。
ヘパリンの存在下での複合体中のペプチド１の二次構造（Ｎ／Ｐ比１０：１で形成される）の変更を、ｍｉＲＮＡおよびペプチド１の濃度を一定に保ちながら、水中の増加濃度のヘパリン硫酸（０〜１００μｇ／ｍＬ）を添加することによって、ＣＤ分光計中で測定した。懸濁液を、データ取得の直前に、３７℃で１時間にわたってヘパリン硫酸と共にインキュベートした。試料の吸光度を、ｍｉＲＮＡおよびヘパリンの吸光度から減算することにより、生データを補正した。
透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。構造を決定するために、ペプチドとｍｉＲＮＡとのモル比を５０：１に維持しながら、最終ペプチド濃度が、５０μＭとなるように、ナノ粒子を水中で調製した。試料（約４μＬ）を、２００メッシュカーボン被覆銅グリッド上に置き、５分間にわたって接着させた。過剰の試料を、濾紙を用いて除去した。酢酸ウラニル（５μＬ）を使用して、グリッドを３０秒間にわたって染色した。グリッドを５分間にわたって乾燥した。Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２透過型電子顕微鏡を使用して、画像を取得した。粒子直径を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析し、２５〜３０個の粒子の平均として報告した。
ナノ粒子の細胞内在化
フローサイトメトリー。ナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍｉＲＮＡトランスフェクション効率を、ヒト中皮腫細胞Ｈ２０５２（ＡＴＣＣ）を使用して決定した。フローサイトメトリーのために、１．２×１０５個の細胞を、処理の２４時間前に６ウェルプレート上に播種し、通常の培養条件下で成長させた。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン、５’末端）標識されたスクランブルｍｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、上記のプロトコールに従って、１０：１のＮ／Ｐ比でペプチド１と複合体化した。得られたナノ粒子をｏｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で希釈して、４０ｎＭの最終ｍｉＲＮＡ濃度を維持した。市販のトランスフェクション剤（Ｉｎ ｖｉｖｏ−ｊｅｔ ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎおよびＤｈａｒｍａＦＥＣＴ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）と等価量のｍｉＲＮＡとの複合体を、製造業者の指示に従って調製した。細胞取込みのメカニズムを決定するために、細胞を、無血清培地中で一連の標準的なエンドサイトーシス阻害剤と共にインキュベートした。いずれの場合も、細胞を阻害剤と共に１時間にわたって予備インキュベートした後、さらに１時間にわたってナノ粒子と共インキュベートした。冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１５分間にわたってトリプシン処理（０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いる）して、内在化されていない細胞表面に接着したナノ粒子の消化を確保した。細胞ペレットを遠心分離によって収集し、冷ＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した後、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターを用いて分析した。Ｈ２０５２細胞中のそれぞれのエンドサイトーシス経路に対する阻害剤の特異性を決定するために、阻害剤の存在下および非存在下でのローダミンまたはＦＩＴＣ標識されたトランスフェリン（クラスリン媒介性取込みのマーカー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびローダミンまたはＦＩＴＣ標識されたデキストラン（７０ｋＤ、ミクロピノサイトーシスのマーカー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の細胞内在化を、フローサイトメトリーを用いて分析した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０を使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。ゲートされた生細胞集団の中央蛍光強度（ＭＦＩ）を、それぞれの阻害剤で処理された細胞について決定して、阻害剤で処理しない試料に対して正規化した。
共焦点顕微鏡観察。共焦点顕微鏡観察のために、５×１０４個のＨ２０５２細胞を、トランスフェクションの４日前に３５ｍｍのガラス底ペトリ皿上に播種した。ＦＡＭまたはｃｙ３で標識されたスクランブルｍｉＲＮＡを、上記のプロトコールに従って、１０：１のＮ／Ｐ比（ペプチド対ｍｉＲＮＡ）でペプチド１と複合体化した。ナノ粒子をｏｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で希釈して、４０ｎＭの最終ｍｉＲＮＡ濃度を維持した。細胞を３７℃で４時間にわたってインキュベートし、完全培地で洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。画像を、洗浄の直後（０時間）または２４時間後に取得した。細胞を、それぞれの時点でイメージングの直前に３０分にわたって２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２と共にインキュベートした。ペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子の細胞内分布を決定するために、上記のように処理された細胞を、イメージングの直前に３０分にわたってＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（１００ｎＭの最終濃度）と共にインキュベートした。Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ ＲｅｄおよびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅを、それぞれ、ＦＡＭ標識されたｍｉＲＮＡおよびｃｙ３標識ｍｉＲＮＡで処理された細胞のために使用した。細胞を、６３倍の油浸対物レンズを使用して可視化した。レーザーおよびバンドパス放射フィルターを、４０５ｎｍのレーザー；３９０ｎｍ〜４６５ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔチャネル）、４８８ｎｍのレーザー；５００ｎｍ〜５５０ｎｍ（緑色チャネル）および５６１ｎｍのレーザー；５７０ｎｍ〜６００ｎｍ（赤色チャネル）として使用した。平面およびｚスタック画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して処理した。
ペプチド１／ｍｉＲＮＡ複合体の存在下または非存在下でのカルセインの細胞内分布を決定するために、最終ｍｉＲＮＡ濃度が４０ｎＭに維持されるように、ｏｐｔｉＭＥＭ中で４時間にわたって、細胞を、カルセインおよびスクランブルｍｉＲＮＡ（未標識）複合体と共に共インキュベートした。カルセインのみとインキュベートした細胞を、陰性対照と考えた。カルセインを、１００μＭの最終濃度で使用した。細胞を洗浄し、完全培地中で２時間にわたってインキュベートした後、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いてイメージングした。４８８ｎｍのレーザー光線および５００〜５５０ｎｍのバンドパスフィルターを使用して、カルセイン蛍光を検出した。
ナノ粒子中に存在するペプチド１およびｍｉＲＮＡの細胞内局在化を評価するために、最終合計ペプチド濃度を２μＭに維持しながら、１ｍｏｌ％のテトラメチルローダミンコンジュゲート化ペプチド１中でドーピングすることによって、複合体を調製した。１０：１のＮ／Ｐ比（すなわち、５０：１のモル比）を維持するために、ｍｉＲＮＡを、４０ｎＭの最終濃度に保持した。細胞を３７℃で４時間にわたってインキュベートし、完全培地で洗浄し、上記と同様にイメージングした。
ｑＰＣＲを用いた遺伝子サイレンシングの評価。ｍｉＲＮＡの中皮腫細胞への機能的送達に関するペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子の有効性を決定するために、ｍｉＲＮＡ−２１５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、以前に記載された手順に従ってペプチド１と複合体化させた。ヒト遺伝子との配列類似性が知られていないスクランブルｍｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、陰性対照としての同様のナノ粒子を調製した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入したｍｉＲＮＡの配列を、以下の表に提供する。
Figure 2021512892
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２×１０５個の細胞を、処理の２４時間前に６ウェルプレート上に播種し、通常の培養条件下で成長させた。細胞を、ｏｐｔｉＭＥＭ（最終ｍｉＲＮＡ濃度４０ｎＭ）で希釈した複合体と共に４時間にわたってインキュベートし、洗浄し、さらに４４時間にわたって新鮮な完全培地と共にインキュベートした。リポフェクタミンと、等価量のｍｉＲＮＡとの複合体を、製造業者の指示に従って調製し、同様の方法で細胞に対して処理した。標準的なプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、全ＲＮＡを細胞から単離した。簡単に述べると、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（商標）溶液を使用して、それぞれのウェル中で細胞を溶解した。収集した懸濁液を、０．２ｍＬのＨｄＰＬＣ等級のクロロホルムと混合し、４℃で２０分間にわたって、１２，０００ｇにて遠心分離し、透明な上層を収集した。０．５ｍＬの分子生物学等級のイソプロパノールと共に１５分間にわたってインキュベートした後、４℃で２０分間にわたって、１２，０００ｇにて遠心分離することによって、上の水性層からＲＮＡを沈澱させた。単離されたＲＮＡを、７０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ非含有水中に再懸濁した。ＲＮＡの濃度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ中で決定した。それぞれの処理群に由来するｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成し、ＣＤＣ７、ＬＭＮＢ２、ＭＤＭ２およびＭＡＤ２Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、対応するＴＡＱ−ＭＡＮプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用するＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で測定した。それぞれの試料に関する平均ＣＴ値を、ハウスキーピング遺伝子としてのβ−アクチンについてのものに対して正規化した。データを、スクランブルｍｉＲＮＡで処理された試料中での遺伝子発現に対する倍率変化として表す。
細胞増殖およびアポトーシス。ペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子の生体適合性を決定するために、１×１０４個のＨ２０５２細胞を、トランスフェクションの２４時間前に９６ウェルプレート上に播種した。スクランブルｍｉＲＮＡを用いて調製されたナノ粒子を、ｏｐｔｉＭＥＭ中で４時間にわたって、細胞と共にインキュベートして、いずれの場合にも最終ｍｉＲＮＡ濃度を４０ｎＭに維持した。細胞を洗浄し、新鮮な培養培地と共にさらに４４時間にわたってインキュベートした。細胞の生存率を、ナノ粒子の添加の４時間後および４８時間後に決定した。１０μＬのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、細胞を３７℃で４時間にわたってインキュベートした。上清を廃棄し、１００μＬのＤＭＳＯを添加して、紫色のホルマザン結晶を溶解した。ＵＶプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、５５０ｎｍで吸光度を測定した。それぞれの試料の吸光度を、ブランク（ＭＴＴ溶液を含まない）から減算し、式：（吸光度処理／吸光度未処理）×１００を使用して生存率パーセントを算出した。
ＬＤＨアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ペプチド１／ｍｉＲＮＡナノ粒子および可溶性ペプチド１のあらゆる可能な細胞傷害性を決定した。細胞上清を、４時間の処理後に採取し、ジアフォラーゼ／ＮＡＤ＋／塩化ヨードテトラゾリウム／乳酸ナトリウムを含有する反応混合物を、製造業者の指示に従って添加して、放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）を検出した。最終濃度のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００を最大放出可能なＬＤＨの高対照（ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用したが、未処理の細胞を、自発的ＬＤＨ放出の低対照とした。３７℃での５分間のインキュベーション後に、４９０ｎｍで吸光度を測定した。細胞傷害性を、式：
（吸光度処理−吸光度低対照／吸光度高対照−吸光度低対照）×１００
を使用して算出した。
細胞内に送達されたｍｉＲＮＡ−２１５の抗増殖能力を評価するために、トランスフェクションの１日前に２．５×１０３の密度でプレーティングされたＨ２０５２細胞を、同様に処理した。それぞれの試料を、４０ｎＭの最終ｍｉＲＮＡ濃度でｏｐｔｉＭＥＭ中で４時間にわたってインキュベートし、洗浄し、さらに７２時間または１２０時間にわたって完全培地と共にインキュベートした。細胞の生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定し、４９０ｎｍで吸光度を測定した。
アポトーシスアッセイのために、１．５×１０５個の細胞を処理の２４時間前に６ウェルプレート上に播種した。細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ（最終ｍｉＲＮＡ濃度１００ｎＭ）で希釈したナノ粒子と共に４時間にわたってインキュベートし、洗浄し、さらに９０時間にわたって新鮮な完全培地と共にインキュベートした。アポトーシス誘導の程度を決定するために、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム染色キット（Ｓｉｇｍａ）を、製造業者の指示に従って使用した。簡単に述べると、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離した。細胞ペレットを１倍の結合緩衝液中に懸濁し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムと共に室温で１５分間にわたってインキュベートした。細胞に結合したＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムの蛍光強度を、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターを用いて測定した。ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ６ Ｆｌｏｗ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｉｏｎソフトウェアを使用して、データを分析した。
クローン原性アッセイ。トランスフェクトされたｍｉＲＮＡ−２１５のクローン形成の潜在能力を、２Ｄコロニー形成アッセイおよび３Ｄソフトアガーアッセイを用いて決定した。２．５×１０３個のＨ２０５２細胞を、トランスフェクションの２４時間前に９６ウェルプレート上に播種し、ナノ粒子で処理した。それぞれの試料を、４０ｎＭの最終ｍｉＲＮＡ濃度で、ｏｐｔｉＭＥＭ中で４時間にわたってインキュベートし、洗浄し、一晩、完全培地と共にインキュベートした。細胞をトリプシン処理し、血球計下で計数し、１×１０３個のトランスフェクトされた細胞を１２ウェルプレート上に播種した。細胞を、通常の培養条件下で４週間にわたって、接着および増殖させた。コロニーをクリスタルバイオレット（０．５％ｗ／ｖ、２５％メタノール）で染色し、イメージングした。
足場非依存性細胞成長を決定するために、ソフトアガーアッセイを、予めトランスフェクトされた細胞を用いて１２ウェルプレート上で実施した。Ｈ２０５２細胞を、上記のプロトコールに従って９６ウェルプレート上に播種し、処理した。トランスフェクトされた細胞を１２ウェルプレート上に移す前に、ベース寒天層を、０．４％アガロース（完全培地中でのｗ／ｖ）を用いて構築し、室温で固化させた。トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理し、計数し、１×１０３個の細胞を、０．３５％アガロースを含有する完全培地中に再懸濁し、これを使用して、上部寒天層を構成させた。細胞を、通常の培養条件下、３Ｄ中で６週間にわたって成長させ、イメージングし、計数した。
ヒドロゲル複合材料の調製および特性評価。必要量のｍｉＲＮＡを水中で希釈し、１０：１のＮ／Ｐ比でペプチド１の水性溶液と混合して、２５μＬの最終体積を維持した。懸濁液を、一定に撹拌しながら、３７℃で３０分にわたってインキュベートし、得られたナノ粒子を２５μＬの冷やした２×ＨＢＳ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）と混合した。ヒドロゲル化ペプチド（ペプチド１、２、３および４）の１％（ｗ／ｖ）溶液５０μＬを、冷やした２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で調製し、等体積のナノ粒子懸濁液と混合し、３７℃で一晩インキュベートして、０．５ｗｔ％のヒドロゲル複合材料を得た。１％のヒドロゲル化ペプチドを含有するゲル複合材料も同様に調製した。ゲル複合材料の透過型電子顕微鏡観察のために、約４μＬの試料を２００メッシュカーボン被覆銅グリッド上に置き、３０秒間にわたって接着させた。過剰の試料を、濾紙を用いて除去した。酢酸ウラニル（５μＬ）を使用して、グリッドを３０秒間にわたって染色した。グリッドを２〜３分間にわたって乾燥した。Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２透過型電子顕微鏡を使用して、画像を取得した。
ヒドロゲル複合材料の流動学的特性。予め形成させたヒドロゲル複合材料の流動学的特性評価を、０．５ｍｍのギャップ高さで８ｍｍのステンレススチール製平行ジオメトリを使用して、３７℃でＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＲ−Ｇ２レオメーター上で行った。レオロジーのためのヒドロゲル試料を、トランスウェルインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、８μｍ孔径）中で調製した。底部の膜を穿刺し、１００μＬのヒドロゲル試料をプレート（３７℃で予め平衡化させた）の中心に移し、上部形状を０．５ｍｍのギャップ高さまで低下させた。動的時間掃引実験を実施して、３７℃、６ｒａｄ／ｓの一定の角周波数および０．２％のひずみで１０分間にわたって、時間の関数として貯蔵弾性率および損失弾性率を測定した。剪断減粘の際の回復能力を決定するために、試料を１０００％の剪断に３０秒間にわたって（６ｒａｄ／ｓの周波数で）かけた後、１時間の動的時間掃引（６ｒａｄ／ｓｅｃ、０．２％のひずみ）に供した。
ヒドロゲル複合材料からのｍｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出。ヒドロゲル複合材料（ペプチド２またはペプチド３を含有する）を、以前に記載されたように円筒状ガラスバイアル中で調製したところ、上部表面だけが放出のためにバッファに曝露していた。それぞれの試料に、１μｇのＦＡＭ標識されたスクランブルｍｉＲＮＡをロードした。１ｍＬのＨＢＳ（ｐＨ７．４）を、ゲルの上部に添加し、バイアルを３７℃で撹拌した（５０ｒｐｍ）。計画した時点で、上清全体を除去し、１ｍＬの新鮮なＨＢＳで置き換えた。放出されたナノ粒子からのｍｉＲＮＡの解離を確保するために、それぞれの時点で、５０μｇ／ｍＬの最終濃度でヘパリンを、除去された上清に添加した。上清中の放出されたｍｉＲＮＡの濃度を、除去されたアリコートの蛍光を測定することによって決定した。ｍｉＲＮＡ上のＦＡＭフルオロフォアを４９０ｎｍで励起し、５２０ｎｍの放射強度をＰＴＩ蛍光計上で記録した。ｍｉＲＮＡ濃度を、標準曲線に基づいて算出した。
ヒドロゲルから放出されたナノ粒子の完全性を、動的光散乱を用いて粒径をモニタリングし、アガロースゲル電気泳動アッセイを用いて電気泳動移動度を測定することによって評価した。０．５％のペプチド３ヒドロゲル複合材料を、１０μｇの未標識のスクランブルｍｉＲＮＡを含有するナノ粒子を用いて調製した。０．４ｍＬのＨＢＳを、ゲルの上部に添加し、バイアルを３７℃で撹拌した（５０ｒｐｍ）。上清全体を２日目および４日目に除去し、０．４ｍＬの新鮮なＨＢＳで置き換えた。試料を、３μＬの１倍ローディング緩衝液と混合し、臭化エチジウムを含有する２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上にロードし、トリス酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中、８０Ｖで１時間にわたって電気泳動した。１μｇの裸のｍｉＲＮＡを含有する試料および等価量のｍｉＲＮＡを含有する新鮮に調製されたナノ粒子も、同時に電気泳動した。画像を、Ｂｉｏ−Ｒａｄゲルイメージャー中で取得した。
ヒドロゲルから放出されたナノ粒子を用いた細胞トランスフェクションおよび遺伝子サイレンシング。ヒドロゲル複合材料から放出されたナノ粒子のトランスフェクション能力を決定するために、０．５％（ｗ／ｖ）のペプチド３またはペプチド４を含有するゲルに、１０μｇのＦＡＭ標識されたスクランブルｍｉＲＮＡからなるナノ粒子をロードした。１ｍＬのｏｐｔｉＭＥＭをゲルの上部に添加し、バイアルを３７℃で２４時間にわたって撹拌した（５０ｒｐｍ）。放出上清を収集し、Ｈ２０５２細胞と共に４時間にわたってインキュベートした。細胞を、ガラス底ペトリ皿上に５×１０４個の密度で処理の４日前に播種した。細胞を洗浄し、完全培地に移し、ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いるイメージングの前に３０分にわたって２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。
放出されたナノ粒子の遺伝子サイレンシング能力を評価するために、０．５％（ｗ／ｖ）のペプチド３を含有するゲルに、ｍｉＲＮＡ−２１５およびスクランブルｍｉＲＮＡを含有するナノ粒子を別々にロードした。１ｍＬのｏｐｔｉＭＥＭをゲルの上部に添加し、バイアルを３７℃で２４時間にわたって撹拌した（５０ｒｐｍ）。放出上清を収集し、Ｈ２０５２細胞と共に４時間にわたってインキュベートした。細胞を、６ウェルのガラスプレートの１ウェルあたり２×１０５個の密度で処理の２４時間前に播種した。４時間後、培地を新鮮な完全培地で置きかえ、細胞をさらに４４時間にわたって成長させた。全ＲＮＡを単離し、遺伝子発現を、以前に記載されたプロトコールに従ってｑＰＣＲを使用して分析した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの試験。無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスを、特定の病原体を含まない環境から取得し、その中で育てた。全ての動物試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＮＩＨによって認可されたものであった。
ｉｎ ｖｉｖｏでのｍｉＲＮＡデポーとしてのヒドロゲル複合材料の評価。ｉｎ ｖｉｖｏでの試験のために、精製されたペプチド１およびペプチド３を、ＬＡＬ発色性内毒素定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して内毒素レベルについて試験した。内毒素レベルは、いつも、検出限界未満であることがわかった。ｉｎ ｖｉｖｏでのｍｉＲＮＡ保持試験のために、０．５ｗｔ％および１ｗｔ％（ｗ／ｖ）のペプチド３を含有するナノ複合材料ヒドロゲルに、１０μｇのｃｙ３標識スクランブルｍｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から構成されるナノ粒子をロードした。それぞれの試料を、滅菌２７Ｇシリンジに移し、３７℃で２４時間にわたって、ゲル化を受けさせた。１００μＬのヒドロゲルを、それぞれのマウス（ｎ＝３）の腰部に皮下投与した。ＨＢＳ中の等価量の裸のｍｉＲＮＡ溶液を、対照として同様に投与した（ｎ＝２）。
光学イメージング。Ｃｙ３蛍光を、ＩＶＩＳスペクトルイメージャー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて縦方向にモニタリングした（１時間、５ｈ、２、３、７、９、１１、１４および２４日目）。イメージャー特異的なＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（バージョン４．３．１）を、画像取得および分析のために使用した。全て３７℃に維持した、麻酔誘導チャンバー、イメージングテーブル、および手順後の回復ケージの下に配置した加熱パッドを用いて、手順の間にマウスの体温を一定に保持した。全てのマウスを、１リットル／分の流量で３〜４分間にわたって、濾過された（０．２μｍ）空気を含む３％イソフルランで、誘導チャンバー中で麻酔した後、イメージングのために、１リットル／分の流量の、Ｏ２をキャリアとして含む２％に変更した。静止２Ｄ画像を、以下のパラメーターを用いて腹臥位で取得した：励起フィルター５７０±１５ｎｍ、放射フィルター６２０±１０ｎｍ、ｆ／ｓｔｏｐ２、培地ビニング（８×８）および自動露出（典型的には、１〜６０秒）。環状の関心領域（ＲＯＩ）を注射部位で描いて、ヒドロゲル分解を評価した（合計放射効率（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン／ｍＷ））。
超音波イメージング。Ｂモードの超音波イメージングを、Ｖｅｖｏ２１００スキャナー（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＣＡ）を使用して実施して、ヒドロゲルの分解を連続的に評価した（時点を提供する）。３Ｄ体積を取得するために、複数の２ＤのＢモード画像を、動物を腹臥位に保持しながら、０．０７６ｍｍのステップサイズを有するＭＳ ５５０Ｓ（４０ＭＨｚ）線状アレイトランスデューサーを使用して捕捉した。動物の体温を３７℃に維持し、光学イメージングのセクションに記載されたのと同じ麻酔プロトコールに従った。ヒドロゲルの体積（立方ミリメートル）を、各時点でＶｅｖｏ ＬＡＢソフトウェア１．７．１（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＣＡ）内の平行輪郭アルゴリズムを使用して測定した。
Ｈ＆Ｅ染色。特定の時点でのＵＳイメージングの後、マウスをＣＯ２窒息によって安楽死させ、ヒドロゲル注射の近くの領域から皮膚組織を収集した。収集された組織を１０％中性緩衝化ホルマリン中で２４時間にわたって固定し、７０％エタノールに移した。パラフィン包埋組織から５μｍの厚さの切片を生成した後、組織病理学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
皮下中皮腫腫瘍モデル。生体分布。２×１０６個のＨ２３７３細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスに皮下投与した。マウスを、腫瘍成長について継続的にモニタリングした。それぞれの時点で、マウスの毛を剃り、ノギスを使用して、腫瘍の長さおよび幅を測定した。腫瘍体積を、０．５×長さ×幅２として算出した。送達されたｍｉＲＮＡの組織分布を決定するために、合計２０μｇのｃｙ３標識スクランブルｍｉＲＮＡをロードした２００μＬのヒドロゲル複合材料を、腫瘍が約２５０ｍｍ３の平均体積に達した時、腫瘍周囲に注射した。ブランクヒドロゲルを同様に注射したマウスを対照とし、組織自己蛍光について補正した。注射の２４時間後に全身画像を取得して、ｃｙ３蛍光をモニタリングした。次いで、動物を屠殺した；腫瘍および重要臓器を収集し、イメージングした。注射されたｃｙ３ ｍｉＲＮＡの腫瘍内局在化を評価するために、凍結した腫瘍を使用して、５μｍの厚さの切片を生成し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを用いて固定した。ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１〜２滴添加して核を染色し、ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用して切片をイメージングした。
腫瘍成長阻害。腫瘍成長阻害試験のために、マウスを４つの処置群（それぞれｎ＝４〜５）に無作為に分割した。腫瘍が約２５０ｍｍ３の平均体積に達したとき、２００μＬのブランクヒドロゲルならびにヒドロゲル複合材料（それぞれ２０μｇのｍｉＲＮＡをロードした）を腫瘍周囲に投与した。１％（ｗ／ｖ）のペプチド３を使用して、全てのヒドロゲル試料を製剤化した。単回注射のみを実施した。各群に由来する１匹の動物を第４週に屠殺し、腫瘍を切り出し、イメージングしたが、残りの動物を、対照群の平均腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達するまで別の週にわたってモニタリングした。腫瘍をホルマリンで固定し、免疫組織化学分析のために切片化した。いずれかの腫瘍が潰瘍化し始め、マウスが瀕死になったとき、または腫瘍成長が摂食、排尿もしくは排便を妨げた場合、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。
免疫組織化学分析。異なる製剤によって誘導されたアポトーシスの程度を決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。簡単に述べると、パラフィン包埋切片を、キシレンで脱パラフィン化し、エタノール勾配を使用して再水和した。製造業者の指示に従って切片をＴＵＮＥＬ酵素ミックスと共に１時間にわたってインキュベートし、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを使用して核を染色した。
抗増殖性タンパク質ｋｉ６７の発現を、免疫組織化学分析を使用してモニタリングした。再水和した腫瘍切片を、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に浸し、９５℃で２０分にわたって加熱して、抗原を回収した。切片を、ヤギ血清（トリス緩衝食塩水中の１０％）を使用してブロックし、ラット抗マウスＫｉ６７（クローンＳｏｌＡ１５）抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ブロッキング緩衝液中で１：１００）と共に１時間にわたってインキュベートした後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ラット二次抗体（トリス緩衝食塩水中の１：５００）と共に３０分インキュベートした。核を、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを使用して染色した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子発現分析のためのｑＰＣＲ。別の実験において、約２５０ｍｍ３の平均体積を有する皮下Ｈ２３７３腫瘍を担持するマウスに、それぞれ、スクランブルｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ−２１５を含有する２００μＬのヒドロゲル複合材料（それぞれ２０μｇのｍｉＲＮＡをロードした）を腫瘍周囲に投与した。各群に由来する３匹の動物を第１週に屠殺し、残りの３匹の動物を第２週に屠殺した。腫瘍を切り出し、標準的なプロトコールを使用して全ＲＮＡを単離した。遺伝子発現を、以前に記載されたようなｑＰＣＲを使用して分析した。Ｕ６ ｓｎＲＮＡを内因性対照として使用して、ｍｉＲＮＡ−２１５のｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクションを決定した。ｍｉＲＮＡ−２１５標的、例えば、ＬＭＮＢ２、ＣＤＣ７、ＭＤＭ２およびＭＡＤ２Ｌ１の遺伝子発現を分析するための対照としてβ−アクチンを使用した。
同所性中皮腫腫瘍モデル。同所性腫瘍成長阻害試験のために、ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現する１×１０６個のＨ２３７３細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウス（６〜８週齢）に腹腔内投与した。細胞に、ルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ４．５１［ｌｕｃ２／ＣＭＶ／Ｎｅｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）を予めトランスフェクトした。ルシフェラーゼリポーターおよびネオマイシン耐性遺伝子を発現するトランスフェクトされた細胞を、Ｇ４１８順化培地下で選択した。腫瘍細胞接種の１週間後、マウスを４つの処置群（それぞれｎ＝８〜１０）に無作為に分割した。４００μＬのブランクペプチド３ヒドロゲルならびに異なるナノ粒子製剤を含有するヒドロゲル複合材料（それぞれ４０μｇのｍｉＲＮＡを含む）を、腹腔内投与した。１％（ｗ／ｖ）のペプチド３を使用して、全てのヒドロゲル試料を製剤化した。腹膜腔でのルシフェラーゼシグナルを、イメージングの直前に２００μＬのＤ−ルシフェリンカリウム塩溶液（Ｒｅｇｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の腹腔内投与によって３週間にわたって毎週モニタリングし、マウスを継続的に観察して、生存を追跡した。５匹の動物をそれぞれの処置群に入れた、腹腔内投与されたＨ２０５２細胞を用いて確立された同所性腫瘍モデルについても同様のプロトコールに従った。
統計分析。平均±ＳＥＭを使用した腫瘍成長阻害関連実験を除いて、データを平均±ＳＤとして表す。２群間のデータを比較するための統計分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアのいずれかと共に、両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して実施した。細胞取込みメカニズムを精査する実験において、一元配置分散分析、次いで、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を使用して、複数の群間を比較した。ｐ＜０．０５を、統計的に有意と考えた。有意性を、ｐ＜０．０５については＊、ｐ＜０．０１については＊＊、ｐ＜０．００１については＊＊＊およびｐ＜０．０００１については＃と示す。マウスを群に無作為に分割した。盲検は使用しなかった。
（実施例２）
ペプチドコンフォメーションはｍｉＲＮＡナノ粒子の機能性を変更する
ｍｉＲＮＡナノ粒子を形成させるために使用されるペプチドのコンフォメーション状態は、最終的なナノ粒子−ヒドロゲル複合材料の適切な機能にとって重要である。アンフォールドした（ランダムコイル）ペプチドとｍｉＲＮＡとの複合体化は、細胞によって効率的に取り込まれるナノ粒子をもたらす。
対照的に（および驚くべきことに）、ｍｉＲＮＡと複合体化したペプチドを、ナノ粒子を形成させるためのｍｉＲＮＡとの複合体化の前にβ−ヘアピンコンフォメーションに折り畳ませる場合、得られるナノ粒子は機能的ｍｉＲＮＡを細胞に送達する点で無効である。図２４は、β−ヘアピンコンフォメーションにあるＭＡＸ１によって形成されるＭＡＸ１：ｍｉＲＮＡ−２１５ナノ粒子は、ｍｉＲＮＡ−２１５応答遺伝子をサイレンシングすることができないことを示す。ＲＮＡと複合体化したＭＡＸ１のコンフォメーションは、遺伝子サイレンシング活性に対する効果を有しないと経験的に予測されなかったため、これは予想外の挙動であり、自明ではない。
自然に折り畳まれたβ−ヘアピンＭＡＸ１を使用して調製されたＭＡＸ１：ｍｉＲＮＡナノ粒子の遺伝子サイレンシング能力を決定するために、ＨＢＳ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の１５０μＭのＭＡＸ１溶液２５μＬを、ＨＢＳ中のｍｉＲＮＡの３μＭの溶液２５μＬに添加する。得られる懸濁液を、一定に撹拌しながら３７℃で３０分にわたってインキュベートして、ＭＡＸ１ペプチドがβ−ヘアピンコンフォメーションのままであるＭＡＸ１：ｍｉＲＮＡナノ粒子を形成させる。２×１０５個のＨ２０５２細胞を、処理の１日前に６ウェルプレート上に播種し、通常の培養条件下で成長させた。ナノ粒子をｏｐｔｉＭＥＭで希釈して、４０ｎＭの最終ｍｉＲＮＡ濃度にした。細胞をナノ粒子と共に４時間にわたってインキュベートし、培地を廃棄し、新鮮な完全培地を添加して、通常の培養条件下でさらに４８時間にわたって細胞を成長させた。標準的なプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、全ＲＮＡを細胞から単離した。簡単に述べると、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（商標）溶液を使用して、それぞれのウェル中で細胞を溶解した。収集した懸濁液を、０．２ｍＬのクロロホルム（ＨＰＬＣ等級）と混合し、４℃で２０分間にわたって、１２，０００ｇにて遠心分離し、透明な上層を収集した。０．５ｍＬの分子生物学等級のイソプロパノールと共に１５分間にわたってインキュベートした後、遠心分離することによって、上の水性層からＲＮＡを沈澱させた。単離されたＲＮＡを、７０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ非含有水中に再懸濁した。ＲＮＡの濃度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００分光光度計中で決定した。それぞれの処理群に由来するｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成し、ＣＤＣ７、ＬＭＮＢ２、ＭＤＭ２およびＭＡＤ２Ｌ１に関するｍＲＮＡ発現レベルを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で対応するＴＡＱ−ＭＡＮプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。各遺伝子の平均値を、ハウスキーピング対照としてのβ−アクチンに対して正規化した。
記載された方法または組成物の正確な詳細を、記載された実施形態の精神から逸脱することなく変化させるか、または改変することができることが明らかである。本発明者らは、以下の特許請求の範囲の範囲および精神の中にある全てのそのような改変および変形形態を特許請求する。

Claims (41)

  1. ペプチドヒドロゲルであって、
    前記ペプチドヒドロゲル内に封入されたナノ粒子を含み、前記ナノ粒子が、アンフォールドされ、β−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドと複合体化した核酸分子を含み、
    前記ペプチドヒドロゲルが、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれた第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの線維ネットワークから形成され；
    前記ペプチドヒドロゲルが、剪断応力の印加の際に剪断減粘を受け、前記剪断応力の除去の際に流動学的回復を受け；
    前記核酸分子が、アンチセンス核酸分子であり；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの正味の静電荷が、中性ｐＨで前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの正味の静電荷と等しいか、またはそれより多くの正電荷を有し；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、
    （ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ−ＮＨ２
    （式中、
    Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；
    Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；
    ｎは３〜５であり；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドのＣ末端はカルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含み；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０の正味の形式電荷を有する）
    として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；
    前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、
    （ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ
    （式中、
    Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから個別に選択され；
    Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；
    ｎは３〜５であり；
    前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８の正味の形式電荷を有する）
    として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、ペプチドヒドロゲル。
  2. ペプチドヒドロゲルであって、
    前記ペプチドヒドロゲル内に封入されたナノ粒子を含み、前記ナノ粒子が、アンフォールドされ、β−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドと複合体化した核酸分子を含み、
    前記ペプチドヒドロゲルが、β−ヘアピンコンフォメーションにある第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの線維ネットワークから形成される、ペプチドヒドロゲル。
  3. 前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；
    前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＬＶ−ＮＨ２として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２に記載のペプチドヒドロゲル。
  4. 前記第１および第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが長さ５０アミノ酸以下である、請求項２または３に記載のペプチドヒドロゲル。
  5. 前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの正味の静電荷が、中性ｐＨで前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの正味の静電荷と等しいか、またはそれより多くの正電荷を有する、請求項２から４のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  6. 中性ｐＨで、前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの前記正味の静電荷が＋７〜＋１０であり、前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの前記正味の静電荷が＋３〜＋８である、請求項５に記載のペプチドヒドロゲル。
  7. 中性ｐＨで、前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの前記正味の静電荷が＋９であり、前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの前記正味の静電荷が＋５である、請求項６に記載のペプチドヒドロゲル。
  8. 前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、
    （ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ−ＮＨ２
    （式中、
    Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；
    Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；
    ｎは３〜５であり；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドのＣ末端はカルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含み；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０の正味の形式電荷を有する）
    として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２から７のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  9. 前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、
    （ＸＺ）ｎ ＸＤＰＰＸ（ＺＸ）ｎ；
    （ＸＺ）ｎ ＸＤＰＧＸ（ＺＸ）ｎ；または
    （ＸＺ）ｎ Ｘ ＮＧＸ（ＺＸ）ｎ（配列番号１）
    （式中、
    Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；
    Ｚはそれぞれ、Ｈ、Ｋ、オルニチン、およびＲのいずれか１つから個別に選択され；
    ｎは３〜５であり；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドのＣ末端はカルボキシレートではなく、中性電荷または正電荷を有するペプチド改変を含み；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、中性ｐＨで＋７〜＋１０の正味の形式電荷を有する）
    として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２から８のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  10. 前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２から９のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  11. 前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、
    （ＸＺ）ｎ Ｘ−［ＤＰＰ、ＤＰＧ、またはＮＧ］−Ｘ（ＺＸ）ｎ
    （式中、
    Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹのいずれか１つから個別に選択され；
    Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；
    ｎは３〜５であり；
    前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８の正味の形式電荷を有する）
    として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２から１０のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  12. 前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、
    （ＸＺ）ｎ ＸＤＰＰＸ（ＺＸ）ｎ；
    （ＸＺ）ｎ ＸＤＰＧＸ（ＺＸ）ｎ；または
    （ＸＺ）ｎ Ｘ ＮＧＸ（ＺＸ）ｎ（配列番号９４）
    （式中、
    Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹから個別に選択され；
    Ｚはそれぞれ、任意のアミノ酸から個別に選択され；
    ｎは３〜５であり；
    前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドは、中性ｐＨで＋３〜＋８の正味の形式電荷を有する）
    として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２から１１のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  13. 前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＬＶ−ＮＨ２として記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２から１２のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  14. 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である、請求項２から１３のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  15. 剪断応力の印加の際に剪断減粘を受け、前記剪断応力の除去の際に流動学的回復を受ける、請求項２から１４のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  16. 前記第１および／または第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドのＮ末端がアセチル化されている、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  17. 前記第１および／または第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドのＣ末端がアミド化されている、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  18. 前記核酸分子がマイクロＲＮＡまたはそのミミックおよび／もしくはミメティックである、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  19. 前記核酸分子が、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７７、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４７２−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−８０７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９６ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５２４ａ、もしくはｈｓａ−ｍｉｒ−４５２４ｂのいずれか１つ；または
    そのミミックおよび／もしくはミメティックである、請求項１８に記載のペプチドヒドロゲル。
  20. 前記ペプチドヒドロゲル内に分散された異種抗がん剤をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  21. 前記異種抗がん剤が化学療法剤である、請求項２０に記載のペプチドヒドロゲル。
  22. 剪断の非存在下で４０パスカルより大きい貯蔵弾性率を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  23. 約１０ｍＭ〜約４００ｍＭのＮａＣｌおよび約７．０〜約９．０のｐＨを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  24. 約１５０ｍＭのＮａＣｌおよび約７．４のｐＨを含む、請求項２３に記載のペプチドヒドロゲル。
  25. 約０．２５％〜約４．０％ｗ／ｖの前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲル。
  26. 約０．５％〜約２．０％ｗ／ｖの第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドを含む、請求項２５に記載のペプチドヒドロゲル。
  27. ペプチドヒドロゲルであって、
    前記ペプチドヒドロゲル内に封入されたナノ粒子を含み、前記ナノ粒子が、アンフォールドされ、β−ヘアピンコンフォメーションにない第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドと複合体化したアンチセンス核酸分子を含み、
    前記ペプチドヒドロゲルが、β−ヘアピンコンフォメーションに折り畳まれた第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドの線維ネットワークから形成され；
    前記ペプチドヒドロゲルが、剪断応力の印加の際に剪断減粘を受け、前記剪断応力の除去の際に流動学的回復を受け；
    前記第１の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、ＶＫＶＫＶＫＶＫＶＤＰＰＴＫＶＫＶＫＶＫＶ−ＮＨ２として記載されるアミノ酸配列からなり；
    前記第２の両親媒性カチオン性β−ヘアピンペプチドが、ＶＬＴＫＶＫＴＫＶＤＰＰＴＫＶＥＶＫＶＬＶ−ＮＨ２として記載されるアミノ酸配列からなる、ペプチドヒドロゲル。
  28. 前記請求項のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲルを含有するシリンジ。
  29. 核酸分子を対象に投与する方法であって、請求項１から２７のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲルを、前記対象中の標的位置に投与することを含む、方法。
  30. 前記ペプチドヒドロゲルを前記対象に投与することが、前記ペプチドヒドロゲルの前記対象中の前記標的位置への注射または噴霧送達を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 対象におけるがんを処置または阻害する方法であって、
    有効量の請求項１から２７のいずれか一項に記載のペプチドヒドロゲルを、前記がんが存在するか、または存在するリスクがある前記対象中の標的位置に投与すること
    を含み、
    前記核酸分子が前記がんを阻害する、方法。
  32. 前記核酸分子が、前記がんを阻害するマイクロＲＮＡ、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記標的位置が、前記がんが存在するか、または存在するリスクがある前記対象中の中皮細胞によって覆われている漿膜表面である、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
  34. 前記漿膜表面が前記対象における漿膜体腔の一部である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記漿膜体腔が、胸膜腔、心膜腔、前縦隔腔、後縦隔腔、腹膜腔、または精巣鞘膜腔である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記がんが漿膜新生物である、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記漿膜新生物が、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、胸腺上皮がん、卵巣癌、子宮頸がん、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、虫垂がん、またはグリオーマのいずれか１つである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記漿膜新生物が、前記対象中の漿膜表面に転移した原発腫瘍の転移性成長を含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記ペプチドヒドロゲルを前記対象に投与することが、前記がんが存在するか、または存在するリスクがある前記対象中の前記漿膜表面の全部または一部を被覆するための、前記ペプチドヒドロゲルの注射または噴霧送達を含む、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記がんが悪性胸膜中皮腫であり；
    前記ペプチドヒドロゲルを前記対象に投与することが、前記胸膜中皮腫が存在するか、または存在するリスクがある前記対象における胸膜腔中の胸膜表面を被覆するための前記ペプチドヒドロゲルの注射または噴霧送達を含み；
    前記マイクロＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１０、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３６７７のうちの１つまたは複数である、請求項３１から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ペプチドヒドロゲル内に封入された異種抗がん剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の方法。
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