JP6560190B2 - 抗腫瘍作用を有する新規rna配列 - Google Patents
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Description
項1. 下記(i)又は(ii)に示すポリヌクレオチドからなるmicroRNA:
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1に示す塩基配列と70%以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチド。
項2. 前記(ii)に示すポリヌクレオチドが、配列番号1に示す塩基配列において、5'末端から1番目、14番目、20番目、及び24番目の塩基の少なくとも1つが、他の塩基に置換、又は欠失されている塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチドである、項1に記載のmicroRNA。
項3. 配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる、項1に記載のmicroRNA。
項4. 成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項1〜3のいずれかに記載のmicroRNA。
項5. 項1〜4のいずれかに記載のmicroRNAを有効成分とする、癌治療剤。
項6. 癌が固形癌である、項5に記載の癌治療剤。
項7. 項1〜4のいずれに記載のmicroRNAが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項5又は6に記載の大腸癌の癌治療剤。
項8. 下記(i)又は(ii)に示すポリヌクレオチドからなるmicroRNAの有効量を、癌患者に投与する工程を含む、癌の治療方法:
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1に示す塩基配列と70%以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチド。
項9. 下記(i)又は(ii)に示すポリヌクレオチドからなるmicroRNAの、癌の治療剤の製造のための使用:
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1に示す塩基配列と70%以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチド。
項10. 癌の治療に使用される、下記(i)又は(ii)に示すポリヌクレオチドからなるmicroRNA:
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1に示す塩基配列と70%以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチド。
本発明のmicroRNAは、下記(i)又は(ii)に示すポリヌクレオチドからなることを特徴とする:
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)配列番号1に示す塩基配列と70%以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチド。
前記microRNAは、優れた抗腫瘍効果を奏するので、癌治療剤の有効成分として使用される。即ち、前記microRNAは、癌治療用の核酸医薬として利用できる。
(炭酸アパタイト粒子)
炭酸アパタイトは、水酸アパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)の水酸基の一部をCO3で置換した構造を有し、一般式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYnで表される化合物である。ここで、Xは、炭酸アパタイトにおけるCaを部分的に置換し得る元素であり、例えば、Sr、Mn、希土類元素等が挙げられる。mは、通常0以上1以下の正数であり、好ましくは0以上0.1以下であり、より好ましくは0以上0.01以下であり、更に好ましくは0以上0.001以下である。Yは、炭酸アパタイトにおけるCO3を部分的に置換しうる基又は元素であり、OH、F、Cl等が挙げられる。nは、通常0以上0.1以下の正数であり、好ましくは0以上0.01以下であり、より好ましくは0以上0.001以下であり、更に好ましくは0以上0.0001以下である。
本発明の癌治療剤の好適な一態様では、前記microRNAと炭酸アパタイト粒子が複合化した複合粒子が使用される。このように前記microRNAを炭酸アパタイト粒子に複合化させることによって、炭酸アパタイトの作用によって生体内前記microRNAを癌細胞に効率的に集積させて、癌細胞内に前記microRNAを導入させることが可能になる。また、細胞内に導入された後に、細胞内で前記microRNAが炭酸アパタイト粒子から遊離できるので、前記microRNAによる抗腫瘍効果を効率的に発揮させることも可能になる。
24穴プレートに5×104cells/mlのヒト大腸癌細胞(DLD-1株)をD-MEM培地(10容量%FBS含有)に接種して37℃で終夜培養を行った後に、MIRTX-Star(配列番号1からなるmicroRNA、公知のポリヌクレオチド合成手法にて製造)を50nMとなるように添加してリポフェクタミンRNAIMAX 1.0μl/wellを用いて24時間、37℃で培養を行うことによりトランスフェクションさせた。次いで、D-MEM培地(10容量%FBS含有)に培地を交換して培養を行い、トランスフェクションから24、48及び72時間後に細胞数を測定した。更に、トランスフェクションから48時間後に、大腸癌細胞に対して、DAPI染色、及びKi-67に対する免疫染色を行った。なお、本試験では、コントロールとして、microRNAを導入しなかった場合(Parent)、MIRTX-Starの代わりにコントロールmicroRNA(配列番号2)を使用した場合(NC、ネガティブコントロール)、miR-34aを使用した場合(PC、ポジティブコントロール;配列番号3)、及びmiR-29b-3p(配列番号4)を使用した場合についても同様の条件で試験を行った。
ヒト大腸癌細胞として、SW480株を使用したこと以外は、前記実施例1と同条件で試験を行った。
ヒト大腸癌細胞として、HCT116株を使用したこと以外は、前記実施例1と同条件で試験を行った。
ヒト大腸癌細胞として、HT29株を使用したこと以外は、前記実施例1と同条件で試験を行った。
ヒト膵癌細胞(MIAPaCa-2株)を使用したこと以外は、前記実施例1と同条件で試験を行った。
ヒト膵癌細胞(Panc-12株)を使用したこと以外は、前記実施例1と同条件で試験を行った。
マトリゲル(BD Biosciences, San Jose, CA)と培地を容量比1:1で含む培地/マトリゲル溶液100μL当たりヒト大腸癌細胞(HT29株)細胞を2.5×106 cellsとなるように混合し、これをメスヌードマウス(NIHON CLEA, Tokyo, Japan)の左右両の背部の下側部分に皮下注入(左右に各200μL)した。HT29癌細胞を投与した時点を0日目として、0、2、4、7、9、12、14、及び16日目に、下記で得られたMIRTX-Starと炭酸アパタイト粒子の複合粒子(sCa- MIRTX)を含む製剤を、1回投与当たりMIRTX-Starが40μgとなるように、尾静脈に注入した。なお、本試験では、比較として、MIRTX-Starと炭酸アパタイト粒子の複合粒子を導入しなかった場合(Parent)、MIRTX-Starの代わりにコントロールmicroRNA(配列番号2)を使用した場合(sCa-control-miR)についても同様の条件で試験を行った。
100mlの蒸留水に、0.37gのNaHCO3、90μlのNaH2PO4・2H2O(1M)、及び180μlのCaCl2(1M)をこの順に添加して溶解させ、1NのHClでpHを7.5に調整した。これを直径0.2μmのフィルターでろ過した。得られたバッファー1ml当たりに2μgのMIRTX-Star、4μlのCaCl2(1M)を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした。その後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを生理食塩水に分散させ、MIRTX-Starを炭酸アパタイト粒子に内包させた複合粒子の分散液を得て、これを10分間超音波振動処理にかけることにより、MIRTX-Starを包含した炭酸アパタイトナノ粒子からなる複合体を含む製剤を得た。なお、超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、20℃に設定した水に、プラスチック容器に収容した前記分散液を浮かべ、高周波出力55W、発振周波数38kHzの条件で10分間行った。斯して得られた製剤は、直ちに、前記試験に使用した。また、斯して得られた製剤は、MIRTX-Starを包含した炭酸アパタイトナノ粒子からなる複合体の平均粒径が50nm以下であることが、走査型プローブ顕微鏡を用いた測定において確認されている。
MIRTX-Starの安全性を評価するために、以下の試験を行った。メスヌードマウス(NIHON CLEA, Tokyo, Japan)に、実施例7で使用したMIRTX-Starと炭酸アパタイト粒子の複合粒子を含む製剤を、1回投与当たりMIRTX-Starが40μgとなるように、1、2、4、7、9、12、14、及び16日目に尾静脈に注入した。なお、本試験では、比較のために、比較として、MIRTX-Starと炭酸アパタイト粒子の複合粒子を導入しなかった場合(Parent)、MIRTX-Starの代わりにコントロールmicroRNA(配列番号2)を使用した場合(sCa-control-miR)についても同様の条件で試験を行った。経時的にヌードマウスの体重を測定し、18日目に血液化学検査及び臓器のHE(Hematoxylin and Eosin)染色を行った。
Claims (5)
- 配列番号1に示す塩基配列において、5'末端から1番目、14番目、20番目、及び24番目の塩基の少なくとも1つが、他の塩基に置換されている塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチドからなるmicroRNA。
- 成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、請求項1に記載のmicroRNA。
- 下記(i)又は(ii)に示すポリヌクレオチドからなるmicroRNAを有効成分とする、癌治療剤。
(i)配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(ii)配列番号1に示す塩基配列において、5'末端から1番目、14番目、20番目、及び24番目の塩基の少なくとも1つが、他の塩基に置換されている塩基配列を含み、配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチドと同等の抗腫瘍効果を示すポリヌクレオチド。 - 癌が固形癌である、請求項3に記載の癌治療剤。
- 前記microRNAが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、請求項3又は4に記載の大腸癌の癌治療剤。
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