JP2021511078A - 多細胞凝集体の保存及び/又は輸送 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)i)多細胞凝集体とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで前記多細胞凝集体は、アルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及びiii)多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを、水密又は気密容器にパッケージングし密封すること;によって、輸送のための多細胞凝集体を調製すること;並びに、
(b)ステップ(a)のパッケージングされた多細胞凝集体を、10〜30℃で、第1の場所から第2の場所へ輸送すること、ここで、第1の場所と第2の場所との間の距離は少なくとも1マイルである。
(c)前記第2の場所でアルギン酸塩ヒドロゲルから多細胞凝集体を放出すること。
多細胞凝集体についての命令又は要求を受領すること;並びに、
a)i)多細胞凝集体とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで、前記多細胞凝集体は、アルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及び;iii)多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを、水密又は気密の容器中にパッケージング及び密封すること;によって輸送する多細胞凝集体を調製すること;並びに、
b)輸送のためにステップ(a)のパッケージングされた多細胞凝集体を発送すること;又はステップ(a)の多細胞凝集体を、注文又は要求で指定された場所に輸送すること。
(a)i)多細胞凝集体とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで前記多細胞凝集体は、アルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及びiii)多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを、水密又は気密の容器中にパッケージング及び密封すること;によって保存のための多細胞凝集体を調製すること;並びに、
(b)ステップ(a)のパッケージングされた多細胞凝集体を、10〜30℃で少なくとも24時間保存すること。
(c)保存後に、前記アルギン酸塩ヒドロゲルから前記多細胞凝集体を放出すること。
あるいは、ステップ(a)は、前記多細胞凝集体を前記アルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーと接触させた後に、前記多細胞凝集体を輸送、発送又は保存のための容器中に配置することを含む。
あるいは、前記多細胞凝集体は、同種の細胞型を含む。
あるいは、前記多細胞凝集体は、同種の細胞型を含む。
i)組織とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;
ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された組織含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで前記組織はアルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及び
iii)多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを水密又は気密の容器中にパッケージング及び密封すること。
iii)第1の場所から第2の場所へ輸送するために、密封された容器を発送すること
をさらに含み、ここで、前記多細胞凝集体は10〜30℃の温度で第1の場所から第2の場所へ輸送され、第1の場所と第2の場所との間の距離は少なくとも1マイルである。
i)多細胞凝集体とヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;
ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有ヒドロゲルを形成すること、ここで凝集体はヒドロゲル中に捕捉又は封入される;
ここで、前記凝集体含有ヒドロゲルは、第1の場所から第2の場所への保存又は輸送のために容器中にパッケージングされ、本方法は前記凝集体含有ヒドロゲルを前記容器中に密封することを含む。
あるいは、この方法は、前記多細胞凝集体を前記ヒドロゲル形成ポリマーと接触させた後に、多細胞凝集体を保存又は輸送のための容器に配置することを含む。
(a)本明細書に記載の方法に従って、輸送のための多細胞凝集体を調製すること;
(b)ステップ(a)の多細胞凝集体を第1の場所から第2の場所に輸送すること;及び任意選択で、
(c)第2の場所でヒドロゲルから前記多細胞凝集体を放出すること。
a)多細胞凝集体の注文又は要求を受け取ること;
b)本明細書に記載の方法に従って、輸送のために多細胞凝集体を調製すること;及び
c)輸送のために、ステップ(b)の多細胞凝集体を発送すること;又はステップ(b)の多細胞凝集体を、注文又は要求において指定された場所に輸送すること。
複数の隣接又は相互接続した細胞を含む多細胞凝集体が提供され、ここで、凝集体は可逆的に架橋されたヒドロゲル中に捕捉又は封入され、捕捉又は封入された凝集体は密封された容器中にパッケージングされる。
別の例では、細胞は骨髄細胞である。
本発明はまた、第1の場所から第2の場所への保存又は輸送のための複数の隣接する細胞を含む多細胞凝集体を調製する方法を提供する。この方法は、以下のステップを含む:
i)多細胞凝集体とヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;
ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有ヒドロゲルを形成すること、ここで凝集体は、ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;
ここで、前記凝集体含有ヒドロゲルは、保存又は第1の場所から第2の場所への輸送のために容器中にパッケージングされ、凝集体含有ヒドロゲルを容器に密封する。
本発明はさらに、複数の隣接する細胞を含む多細胞凝集体を第1の場所から第2の場所に輸送する方法を提供する。この方法は、以下のステップを含む:
(a)本明細書の他の箇所に記載される調製方法に従って、輸送のための多細胞凝集体を調製すること;
(b)工程(a)の多細胞凝集体を第1の場所から第2の場所に輸送すること;
(c)第2の場所でヒドロゲルから多細胞凝集体を放出すること。
a)多細胞凝集体の注文又は要求を受領すること;
b)本明細書の他の箇所に記載される調製方法に従って、輸送のための多細胞凝集体を調製すること;
c)工程(b)の多細胞凝集体を輸送のために発送すること;又は工程(b)の多細胞凝集体を、注文又は要求で指定された場所に輸送すること。
さらなる態様では、複数の隣接する細胞を含むインビトロの多細胞凝集体を、少なくとも24時間保存する方法が提供され、この方法は以下の工程を含む:
(a)以下の方法で保存のための多細胞凝集体を調製すること;
i)多細胞凝集体とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;
ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで多細胞凝集体はアルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及び
iii)多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを水密又は気密容器にパッケージングし、密封すること;並びに
(b)工程(a)のパッケージされた多細胞凝集体を、10〜30℃で少なくとも24時間保存すること。
(培養容器中の細胞層の保存)
ヒト脂肪由来間質細胞(hASC)、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来皮質ニューロン、及びヒト初代腎臓近位尿細管上皮細胞(hPTC)を、標準プロトコルを用いて培養し、保存前に単層を確立させた。培養プレートを通常の培養条件から取り出し、室温に平衡化させた後、使用済み培地を除去し、300μLの培養培地(−Hydrogel対照)又は300μLの1%(w/v)アルギン酸カルシウム複合体で細胞をコーティングしたもの、のいずれかと置き換えた。簡単に述べると、培養培地で希釈した1%(w/v)アルギン酸ナトリウムを細胞上に適用した後、0.1M塩化カルシウムを用いてゲルを20分間架橋した。全ての調製は室温で行った。培養培地で5分間洗浄した後、プレートを接着フィルムで密封した後、15℃に制御された温度のインキュベーター、又は15〜25℃に制御された室温(CRT)包装のいずれかに保存した。保存後、300μLの0.1Mクエン酸三ナトリウムを用いてゲルを溶解し、培地で置換した後、標準培養条件に戻した。
hASC由来スフェロイド及びヒト角膜実質線維芽細胞(hCSF)由来組織構築物は、培養培地を含む密封チューブ中に保存する前に、それぞれ1.2及び2.4%(w/v)アルギン酸カルシウムディスク中に封入した。−Hydrogel対照を、アルギン酸塩ヒドロゲルを含まない培養培地に懸濁した。簡単に述べると、スフェロイド及び組織構築物をアルギン酸ナトリウムに懸濁した後、0.102M塩化カルシウムを用いてゲルを8分間架橋した。次いで、ゲルを、冷蔵庫(4℃)又は温度制御インキュベーター(15℃)に保存する前に、1.5mLの培養培地を満たした2mLの低温バイアルに入れた。保存後、0.1Mクエン酸三ナトリウムを用いてゲルを溶解し、スフェロイド及び組織構築物を培養培地中に入れた後、通常の培養条件に戻した。
hASC由来スフェロイドを1%(w/v)アルギン酸ナトリウム中に懸濁した後、2.1に記載のように、96ウェル培養プレート中でゲル化した。プレートを密封し、ゲル溶解前に温度制御されたインキュベーター中で15℃にて保存し、通常の培養条件に戻した。−Hydrogel対照は、300μLの培養培地で満たされたウェルで構成された。
保存して通常の培養条件に戻した後に、生存細胞回収率、細胞生存率、及び細胞形態を評価した。AlamarBlue代謝活性を用いて生存細胞数を計数し、非保存対照に対する生存細胞回収率(%)を示した。生存率及び形態は、カルセイン−AM/エチジウムホモダイマー−1(生細胞/死細胞)染色により評価し、蛍光顕微鏡により撮像した。
(96ウェル培養プレートに保存された保存ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ASC))
図1は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護の有無での、96ウェルプレート中での細胞単層の保存後のヒト脂肪由来間質細胞(hASC)の細胞回収、生存率及び形態を示す。hASCを96ウェルプレートに播種し、24時間培養した。保存前に、培養培地を除去し、300μLの培養培地(−Hydrogel)又は300μLのアルギン酸カルシウムヒドロゲル複合体(+Hydrogel)と交換した後、プレートを密封し、15℃で保存した(aに示すプレート)。3日間保存後、プレートを通常の培養条件に2時間戻し、AlamarBlue代謝活性試薬による生存細胞回収率(%)(b)、及びカルセイン−AM(生細胞指示薬;緑色)/EthD−1(死細胞指示薬;赤色)染色(c)による生存率及び形態を評価した。アルギン酸塩ヒドロゲル保護なしでは、hASCの回収率が実験的セットアップ間で非常に変動したが、アルギン酸塩ヒドロゲル保護の場合、ASC単層の生存性及び完全性が維持された。hASCは、アルギン酸塩ヒドロゲル保護を用いて同じ様式で調製され、そしてプレートを通常の培養条件に一晩戻す(d)前に、長期間(1週間及び2週間)保存した。長期の保存期間にわたってさえ、良好なレベルの生細胞回収が観察され、細胞は正常な紡錘形の形態を示した。結果は、保存されていない培養物に対する細胞回収率(%)の平均±SDで表される。
図2は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護の有無での、96ウェルプレート中での保存及び輸送後の成熟皮質ニューロンの細胞回収、生存率及び形態を示す。ヒトiPSC由来分化ニューロン(31〜36日間成熟)は、300μLの神経維持培地(−Hydrogel)で、又は300μLのアルギン酸カルシウムヒドロゲル複合体(+Hydrogel)でコーティングした状態で、密封96ウェルプレートで保存及び輸送された。15℃で一晩保存した後、プレートを15〜25℃に制御された室温(CRT)包装で返送された(全保存時間:3日間;到着温度: 19℃)。プレートを通常の培養条件に5日間戻した後、AlamarBlue(a)によって生存細胞回収を評価した。その後、セルはカルセイン−AM(生細胞指標;緑)とエチジウムホモダイマー−1(死細胞指標;赤)(b)で染色した。アルギン酸塩ヒドロゲル保護なしの保存及び輸送は生存細胞数のかなりの損失をもたらし、一方、培養物をアルギン酸塩でコーティングした場合、細胞回収は維持された。さらに、培養物はそれらの形態及び軸索接続性を維持し、アルギン酸塩ヒドロゲルが室温保存の間に細胞を保護し、そして輸送の間に誘導される機械的ストレスに対して保護し得ることを実証した。成績は、非保存培養と比較した%回収率の平均±SDで表す。
図3は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護の有無での、96ウェルプレート中で保存した後の、初代ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞(hPTC)の細胞回収、生存率及び形態を示す。2人のドナーからのhPTCを96ウェルプレートに播種し、コンフルエントに達するまで7日間培養した。細胞を、300μLの培養培地(−Hydrogel)又は300μLのアルギン酸カルシウムヒドロゲル複合体(+Hydrogel)でコーティングした密封96ウェルプレート中、15℃で3日間又は5日間保存した後、通常の培養条件に戻した。24時間後、アルギン酸塩ヒドロゲル保護なしでは、付着した生存細胞の証拠はほとんどなかった(a)。逆に、アルギン酸塩ヒドロゲルで覆われた培養物は、かなりの数の生存細胞の回収を示した。3〜4日間(3日間保存細胞)及び7〜8日間(5日間保存細胞)の回復培養期間後、AlamarBlue代謝活性アッセイによって評価されるように、培養物は完全な%細胞回復を取り戻した(b)。回収されたhPTC培養物はカルセイン−AM(生指標;緑色)及びエチジウムホモダイマー−1(死指標;赤色)染色によって評価されるように、高い生存率%を有する密な上皮培養物を形成した。成績は、非保存培養物と比較した%回収率の平均±SDで表す。
図7は、96ウェル培養プレートにおけるヒト皮膚ケラチノサイト上皮細胞の生存率及び形態の保存を示す。3人のドナーからのケラチノサイトを96ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。次いで、細胞を300μLのアルギン酸カルシウムヒドロゲル複合体をオーバーレイし、15℃で5日間保存した。ゲル除去後、細胞を一晩正常培養条件に戻し、生存率及び形態をライブ/デッド(CAM/EthD−1)染色及び蛍光顕微鏡によって評価した。細胞は、保存後、高い細胞生存率及び正常な形態を維持した。
図8は、96ウェル培養プレートにおけるヒト皮膚線維芽細胞の生存率及び形態の保存を示す。3人のドナーからの皮膚線維芽細胞を96ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。次いで、細胞を300μLのアルギン酸カルシウムヒドロゲル複合体をオーバーレイし、15℃で5日間保存した。ゲル除去後、細胞を一晩通常の培養条件に戻し、生存率をMTTアッセイ(a)及び蛍光顕微鏡によるライブ/デッド(CAM/EthD−1)染色(b)によって評価した。細胞は、保存後、高い細胞生存率及び正常な形態を維持した。
図9は、HEK−293及び一過性にトランスフェクトされたHEK−293細胞の薬学的応答性の保存を示す。HEK−293細胞を96ウェルプレート、384ウェルプレートのいずれかに24時間播種し、アルギン酸カルシウム複合体をオーバーレイした。次いで、細胞を、制御された室温で遠隔地(1マイルを超)に発送し、そしてゲルを、保存の5日後に除去した。細胞は、一晩通常の培養条件に戻し、サイクリックAMP応答エレメントベースのルシフェラーゼアッセイ(a)を用いてフォルスコリンに対する、及びカルシウム流ベースのFLIPRアッセイ(b)を用いてATPに対する薬学的応答性を評価した。EC50値は非保存細胞と機能の損失がないことを示している非保存細胞との間で類似していた。また、HEK−293細胞は5日間にわたる封入、保存及び出荷の前に、DDR1キナーゼ配列をコードするcDNAで一過的にトランスフェクションされた。通常の培養条件に一晩戻した後、細胞をダサチニブで処理し、リガンド結合活性をBRETによって評価した。細胞はcDNAの一過性発現を保持し、ダサチニブに匹敵するEC50を示した。
(クライオバイアル中に懸濁したヒトASCスフェロイドの保存)
図4は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護の有無での、密封チューブ中での保存後のhASC由来スフェロイドの生存率を示す。5×104のhASCからなる球状体を24時間培養した後、保存培地(−Hydrogel)に懸濁するか、又は1.2%(w/v)アルギン酸カルシウム(+Hydrogel)に封入した。スフェロイドを、保存媒体を含む密封バイアルに入れ、4℃で72時間保存した。スフェロイドは、通常の培養条件に戻る前に、保存からの解放された後の生存率について評価した。a:アルギン酸に埋め込まれたhASCスフェロイドの画像; b:保存後のスフェロイドのカルセイン−AM/エチジウムホモダイマー−1(ライブ/デッド)染色; c:保存後のスフェロイドのカルセイン−AM/エチジウムホモダイマー−1(ライブ/デッド)染色; c:24時間又は72時間の通常の培養状態に戻った後のスフェロイドの相対的代謝活動; d:培養72時間後の保存されたスフェロイドの画像。封入なしの場合、スフェロイドは膨潤したように見え、正常な培養条件に戻しても、付着し、代謝活性を回復することができなかった。アルギン酸塩封入はこれを妨げ、hASC由来スフェロイドの生存性及び完全性を保存した。結果を平均±SDとして表す。
図5は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護の有無での、96ウェルプレート中での保存後のhASC由来スフェロイドの生存率を示す。7×104のhASCからなる球状体を24時間培養した後、保存培地(−Hydrogel)中に懸濁するか、又はアルギン酸カルシウム(+Hydrogel)中に封入して、密封した96ウェルプレート中に入れた(aに示すように)。培養プレートを、アルギン酸塩ヒドロゲルを除去せずに、15℃で7日間保存し、その後通常の培養条件に戻した。24時間の培養後、封入されていないスフェロイドは、カルセイン−AM(生指標;緑)及びエチジウムホモダイマー−1(死指標;赤)染色(b)を評価したところ、非常に劣る生存率を示した。反対に、アルギン酸塩保護を有するスフェロイドは生存維持していた。
図6は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護の有無での、密封チューブ中のヒト角膜実質線維芽細胞(hCSF)構築物の生存率及び完全性を示す。hCSF由来組織構築物を、保存培地(−Hydrogel)中に懸濁するか、又はアルギン酸カルシウム(+Hydrogel)中に封入した。組織を、保存培地を含む密封チューブに入れ、15℃で72時間保存した。保存から放出した後の組織の生存率について、カルセイン−AM/エチジウムホモダイマー−1(ライブ/デッド)染色によって評価した。封入なしの場合は、生細胞が同定され得ず、そして総細胞数は低かったが、保存の間の封入した場合は細胞生存性及び組織完全性を維持した。
図10は、96ウェルプレート中に新たに収集された腹部皮膚生検の保存を示す。新鮮な皮膚生検材料を分離し、解剖して、96ウェルプレートに入れた後、アルギン酸カルシウム複合体をオーバーレイした。皮膚を15℃で5日間保存した後、ゲルを除去し、4時間培養に戻した。続いて、組織の完全性をH&E及びコラーゲン染色(a)によって調べ、生存率をalamarBlue(b)による相対代謝活性を調べることによって調べた。5日間保存した組織は、構造又は完全性に変化はなく、生存率の低下も示さなかった。
図11は、アルギン酸カルシウムヒドロゲルビーズ中に懸濁されたiPSC由来血管芽細胞の保存を示す。血管芽細胞をアルギン酸ナトリウムに懸濁させた後、ビーズの形態でカルシウムと架橋させた。完全培地中に懸濁したビーズを、制御された室温で5日間にわたって遠隔地に輸送した。血管芽細胞をアルギン酸塩ビーズから回収し、20日間培養に戻し、その間にマクロファージ前駆細胞を回収し、表現型について評価した。封入は、血管芽細胞が典型的な系統マーカーを発現するマクロファージ前駆細胞を産生する能力を保持した。
図12は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護によるヒト皮膚3D構築物の保存を示す。3Dカルチャーインサート中の皮膚ケラチノサイト及び線維芽細胞からなる3D組織構築物を保存し、アルギン酸塩ヒドロゲル保護を用いて、制御された室温で5日間及び7日間にわたって輸送した。ゲルを除去し、一晩インキュベートした後、細胞生存率を評価した。生細胞(CAM陽性;緑色)は5日目及び7日目の保存及び輸送後のスキャフォールド全体に見られ、死細胞の証拠はほとんどなかった。皮膚モデルの相対代謝活性は5日目及び7日目の両方の保存後で維持された(非保存対照の約90%)。
図13は、アルギン酸塩ヒドロゲル保護を伴う96ウェルプレート中での保存後の結腸直腸癌オルガノイドの維持された生存率及び形態を示す。結腸直腸癌オルガノイドを、96ウェルプレート中で培養して確立した。次いで、オルガノイドを150μLのアルギン酸カルシウムヒドロゲル複合体で覆い、15℃で5日間保存した。ゲル除去後、細胞を一晩通常の培養条件に戻し、生存率及び形態を、蛍光顕微鏡及び明視野顕微鏡によるライブ/デッド(CAM/EthD−1)染色によって評価した。オルガノイドは、保存後も、高い細胞生存率及び正常な形態を維持した。
ここで提示されたデータは、保存及び/又は輸送中の細胞及び単純な組織の保存のための層又はコーティングとしてのアルギン酸の使用を記述したものである。それは、in situ(すなわち、それらが播種及び/又は増殖される培養容器中)での細胞層の保存を提示する。このようにして保存された細胞には、間質細胞、上皮細胞及びニューロン細胞が含まれる。また、単純な多細胞スフェロイド及び単純な3D組織構築物の保存を記載するデータも提示する。データは、アルギン酸塩ヒドロゲルコーティングが室温保存の間、細胞生存率及び培養/組織完全性を保存し、並びに輸送の間、機械的保護を提供する能力を実証する。
Claims (20)
- 隣接する複数の細胞を含むインビトロ多細胞凝集体を第1の場所から第2の場所に輸送する方法であって、以下のステップを含む方法:
(a)i)多細胞凝集体とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーとを接触させること;ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで前記多細胞凝集体は、前記アルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及び;iii)前記多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを水密又は気密容器にパッケージングし密封すること;によって輸送のための多細胞凝集体を調製すること;並びに、
(b)ステップ(a)のパッケージングされた前記多細胞凝集体を、第1の場所から第2の場所に10〜30℃で輸送すること、ここで、前記第1の場所と前記第2の場所との間の距離が少なくとも1マイルである。 - 以下のステップをさらに含む、請求項1記載の方法
(c)前記第2の場所で、前記アルギン酸塩ヒドロゲルから前記多細胞凝集体を放出すること。 - 隣接する複数の細胞を含むインビトロ多細胞凝集体についての注文又は要求を満たすための方法であって、
多細胞凝集体の注文又は要求を受領すること;並びに、
a)i)前記多細胞凝集体とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで、前記多細胞凝集体は、前記アルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及び、iii)前記多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを、水密又は気密の容器中にパッケージング及び密封すること;によって輸送する細胞凝集体を調製すること;並びに、
b)輸送のためのステップ(a)のパッケージングされた前記多細胞凝集体を発送すること;又は、ステップ(a)の多細胞凝集体を、注文又は要求で指定された場所に輸送すること
を含む方法。 - 前記多細胞凝集体が、前記第1の場所から前記第2の場所へ10〜30℃で輸送され、前記第1の場所と前記第2の場所との間の距離が少なくとも1マイルである、請求項3に記載の方法。
- 隣接する複数の細胞を含むインビトロ多細胞凝集体を少なくとも24時間保存する方法であって、
(a)i)多細胞凝集体とアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーを接触させること;ii)該ポリマーを重合させて、可逆的に架橋された凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを形成すること、ここで前記多細胞凝集体は、前記アルギン酸塩ヒドロゲル中に捕捉又は封入される;及びiii)前記多細胞凝集体含有アルギン酸塩ヒドロゲルを、水密又は気密の容器中にパッケージング及び密封すること;によって、保存のための多細胞凝集体を調製すること;並びに、
(b)ステップ(a)のパッケージングされた前記多細胞凝集体を、10〜30℃で少なくとも24時間保存すること
を含む方法。 - 以下のステップをさらに含む、請求項5記載の方法
(c)前記保存後に前記アルギン酸塩ヒドロゲルから前記多細胞凝集体を放出すること。 - ステップ(a)が、前記多細胞凝集体をアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーと接触させる前に、前記多細胞凝集体を輸送、発送又は保存のための容器中に配置することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記多細胞凝集体をアルギン酸塩ヒドロゲル形成ポリマーと接触させた後に、前記多細胞凝集体を輸送、発送又は保存のための容器中に配置することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器が、密封された保存バイアル又は輸送チューブであるか、又は前記容器が細胞培養容器である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養容器が、細胞培養チューブ、細胞培養フラスコ、細胞培養皿又は複数のウェルを含む細胞培養プレートから選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記複数のウェルを含む細胞培養プレートが、4、6、8、12、24、48、96、384、及び1536ウェル細胞培養プレートから選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記ヒドロゲル形成ポリマーが、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ストロンチウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸マグネシウム又はアルギン酸ナトリウムを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルギン酸塩が、0.5%(w/v)〜5.0%(w/v)の量のアルギン酸カルシウムである、請求項12に記載の方法。
- 前記多細胞凝集体が、組織、細胞層、スフェロイド、オルガノイド、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多細胞凝集体が、異種の細胞型を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多細胞凝集体が、同種の細胞型を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多細胞凝集体が、ヒト細胞を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多細胞凝集体が、ヒト脂肪由来間質細胞(hASC)、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来皮質ニューロン、ヒト初代腎臓近位尿細管上皮細胞(hPTC)、又はヒト角膜実質線維芽細胞(hCSF)を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 重合が化学剤によって誘発される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 化学重合剤が、塩化カルシウムである、請求項19に記載の方法。
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